CN113166211A - 改善的丝状真菌宿主细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离的变体Ire1多肽，其包含(a)SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)与SEQ IDNO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％但小于100％的序列同一性。本发明还涉及一种包含编码该变体Ire1多肽的突变ire1基因以产生分泌的异源目的多肽的重组丝状真菌宿主细胞、一种用于产生重组丝状真菌宿主细胞中分泌的异源目的多肽的方法、和一种改善重组丝状真菌宿主细胞中分泌的异源目的多肽的生产力或产率的方法。
Description
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及一种丝状真菌宿主细胞，其包含改善目的多肽的生产力和/或产率的变体Ire1多肽。
背景技术
丝状真菌可用作宿主细胞，用于重组产生具有生物活性的异源多肽，例如酶和其他有价值的蛋白质。在工业和商业目的中，此类丝状真菌宿主细胞的蛋白生产力是生产成本的重要因素。
未折叠蛋白应答信号转导物Ire1p促进酵母中异源蛋白的分泌(Howard等人1995,J.Cell.Biochem.Suppl.[细胞生物化学杂志增刊]第19B卷,第209页)。Ire1p是所有真核生物中的内质网(ER)应激传感器，且催化酵母中hac1 mRNA、植物中bZIP60和后生动物中xbp1的剪接。Hac1及其直系同源物充当用于转录未折叠蛋白应答(UPR)相关基因的转录激活子，这些基因不仅在有效表达内源蛋白中起重要作用，还在有效表达外源或重组蛋白中起重要作用。
WO 2018/015443披露了一种突变黑曲霉ireA基因，其编码在位置81和84处包含氨基酸取代的变体IreA多肽。
在本领域中存在对增加丝状真菌宿主细胞中异源蛋白分泌的替代品的需求。
本发明提供了一种变体Ire1多肽，其提高丝状真菌宿主细胞分泌的异源目的多肽的生产力和/或产率。
发明内容
本发明涉及一种分离的变体Ire1多肽，其包含(a)SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％但小于100％的序列同一性。
本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其包含编码变体Ire1多肽的突变ire1基因，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％但小于100％的序列同一性。
本发明还涉及一种重组丝状真菌宿主细胞，其包含和表达编码异源目的多肽的第一多核苷酸和包含编码变体Ire1多肽的突变ire1基因的第二多核苷酸，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％但小于100％的序列同一性。
本发明还涉及一种产生分泌的异源目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在适于产生和分泌该异源多肽的条件下，培养这种重组丝状真菌宿主细胞；以及，任选地
(b)回收该分泌的异源目的多肽。
本发明进一步涉及一种改善丝状真菌宿主细胞中分泌的异源目的多肽的生产力或产率的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞包含和表达编码Ire1多肽的ire1基因；以及
(b)突变该ire1基因，以提供编码变体Ire1多肽的突变ire1基因，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％但小于100％的序列同一性，其中改善了分泌的异源目的多肽的生产力或产率。
附图说明
图1示出质粒pJfyS207的图谱。
图2示出质粒pSaMF123的图谱。
图3示出质粒pSaMF128的图谱。
图4示出质粒pAMFS210的图谱。
定义
根据此详细描述，以下定义适用。注意，单数形式“一种/个(a/an)”以及“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。
本文提及“约”值或参数包括针对该值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。
除非另外定义或由上下文明确指示，否则本文所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于编码多肽的多核苷酸的表达为必要的核酸序列。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸而言可以是天然的(即，来自相同基因)或异源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是天然的或异源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”意指涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
异源：对于宿主细胞，术语“异源”意指多肽或核酸不是天然存在于宿主细胞中。对于多肽或核酸，术语“异源”意指控制序列(例如多肽或核酸的启动子或结构域)不与该多肽或核酸天然地相关联，即，控制序列是来自编码多肽的基因以外的基因。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指其中引入了包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体的任何微生物细胞。引入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、电穿孔、接合和转导。在一些实施例中，宿主细胞是分离的重组宿主细胞，其与至少一种其他组分(包括但不限于例如蛋白质、核酸、细胞等)部分或完全分离。
肌醇需求酶1(Ire1)：术语“肌醇需要酶1(inositol-requiring enzyme 1)”或“Ire1”或“Ire1多肽”是一种跨膜蛋白激酶，其在内质网(ER)中充当不正确折叠(错误折叠)蛋白质的传感器，并触发称为未折叠蛋白应答(UPR)的细胞内信号传导途径。UPR是一种从酵母到哺乳动物都是保守的ER应激反应，并且激活参与降解错误折叠蛋白质、调节蛋白质合成并且激活分子伴侣的基因，以恢复ER的稳态(Sidrauski等人,1998,TrendsCell.Biol.[细胞生物学趋势]8:245-249；Kauman,1999,Genes Dev.[基因与发育]13:1211-1233；Welihinda等人,1999,Gene Expr.[基因表达]7:293-300)。IRE1包含：ER管腔结构域，其参与错误折叠蛋白质的识别；和细胞质内切核糖核酸酶和激酶结构域，其参与下游途径的激活(Sidrauski和Walther,1997,Cell[细胞]90:1031-1039)。激活的IRE1特异性地介导酵母和丝状真菌中应激反应转录因子Hac1的非常规剪接和激活，进而调节ER伴侣和其他靶基因的表达(Cox等人,1993,Cell[细胞]73:1197-1206；Kawahara等人,1997,Mol.Biol.Cell[分子生物学细胞杂志]8:1845-1862；Saloheimo等人,2003,Mol.Microbiol.[分子微生物学]47(4):1149-1161)。
分离的：术语“分离的”意指多肽、核酸、细胞或其他特定材料或组分，其与在自然界中发现的与其天然相关联的至少一种其他材料或组分(包括但不限于，例如，其他蛋白质、核酸、细胞等)分离。分离的多肽包括但不限于含有分泌的多肽的培养液。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在N-末端加工(例如，信号肽的去除)后处于其成熟形式的多肽。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。
天然的：术语“天然的”意指天然存在于宿主细胞中的核酸或多肽。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
重组：当用于提及细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”意指已经从其天然状态经修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或与在自然界中发现的相比，以不同水平表达或在不同条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列的差异在于一个或多个核苷酸和/或与异源序列(例如，表达载体中的异源启动子)可操作地连接。重组蛋白与天然序列的差异可以在于一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码多肽的核酸的载体是重组载体。术语“重组”与“遗传修饰的”和“转基因的”同义。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,同上)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个多核苷酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指具有生物活性的、在一个或多个(例如，几个)位置处包含人为突变(即取代、插入和/或缺失(例如截短))的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。
野生型：关于氨基酸序列或核酸序列的术语“野生型”意指该氨基酸序列或核酸序列是天然或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中未发现的任何物质(例如，在实验室中产生的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
变体命名惯例
出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中披露的Ire1多肽用以确定另一种Ire1多肽中的相对应的氨基酸残基。将另一种Ire1多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的Ire1多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中披露的Ire1多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(EMBOSS的BLOSUM62版)取代矩阵。
可以通过使用几种计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种Ire1多肽中的对应氨基酸残基的鉴别，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；3.5版本或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-2797)，MAFTT(6.857版本或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)。
当另一种Ire1多肽与SEQ ID NO:2的Ire1多肽相背离，使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可以使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，有几种工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有目的结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的取代的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。相应地，将在位置153的丙氨酸被苏氨酸取代指定为“Ala153Thr”或“A153T”。
具体实施方式
在一方面，本发明涉及一种分离的变体Ire1多肽，其包含(a)SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包含编码变体Ire1多肽的突变ire1基因，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在另一方面，本发明涉及一种改善丝状真菌宿主细胞中分泌的异源目的多肽的生产力或产率的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞包含和表达编码Ire1多肽的ire1基因；以及
(b)突变该ire1基因，以提供编码变体Ire1多肽的突变ire1基因，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性，其中改善了分泌的异源目的多肽的生产力或产率。
在针对上述每个方面的实施例中，变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代，或由其组成。SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸被精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、或缬氨酸(Val)取代。在针对上述每个方面的优选实施例中，SEQ IDNO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸被Thr取代。在针对上述每个方面的另一个优选实施例中，SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸是Ala，其被Thr取代。
在针对上述每个方面的另一个实施例中，变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153相对应的位置处的氨基酸取代或由其组成，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gly、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代。在针对上述每个方面的优选实施例中，与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153相对应的位置处的氨基酸被Thr取代。在针对上述每个方面的另一个优选实施例中，与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153相对应的位置处的氨基酸是Ala，其被Thr取代。
在针对上述每个方面的另一个实施例中，变体Ire1多肽进一步包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置150处的Thr或与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置150相对应的位置处的Thr。
在针对上述每个方面的另一个实施例中，突变ire1基因的核苷酸序列与里氏木霉ire1核苷酸序列(SEQ ID NO:1中示出)或其cDNA序列(SEQ ID NO:3中示出)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
本文的实例证明了里氏木霉SaMF128-2A11-1(ire1 Ala153Thr突变体)产生作为分泌的异源多肽的来自匹斯特斯多孔菌(Polyporus pinsitus)的漆酶，其中与里氏木霉FRT4New-8G4A(天然ire1)相比，里氏木霉SaMF128-2A11-1中的匹斯特斯多孔菌(P.pinsitus laccase)漆酶的生产力或产率通过ire1基因的单一突变导致氨基酸取代Ala153Thr而显著且出人意料地提高。
目的多肽
目的多肽可以是任何与丝状真菌宿主细胞异源(外源)的分泌的多肽。该多肽可以由单个基因或两个或更多个基因编码。术语“编码多肽的多核苷酸”应理解为涵盖涉及该多肽产生的一个或多个(几个)基因。术语“异源多肽”在本申请中定义为对于丝状真菌宿主细胞而言不是天然的多肽；已进行结构修饰以改变天然多肽(例如，天然多肽的蛋白质序列)的天然多肽；或由于通过重组DNA技术(例如，较强的启动子、编码多肽的DNA的多拷贝)操纵多核苷酸或宿主菌株使其表达发生数量上变化的天然多肽。因此，本发明术语“异源多肽”的范围还涵盖了天然多肽的重组产生，其程度使得此种表达涉及使用对于丝状真菌宿主细胞并非天然的遗传元件，或使用经操纵以宿主细胞中非天然发生的方式起作用的天然元件。
该多肽可以是具有目的生物活性的任何多肽。术语“多肽”在本文中不意在是指特定长度的编码产物，并且因此，涵盖肽、寡肽和蛋白。术语“多肽”还涵盖组合以形成编码产物的两个或更多个多肽。多肽还包括融合多肽，其包含自至少两种不同多肽(其中一个或多个(几个)多肽对于丝状真菌宿主细胞可以是异源的)获得的部分或完整多肽序列的组合。多肽进一步包括上述多肽和杂合多肽天然存在的等位基因变异和工程变异。
在一个实施例中，多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫调节剂(immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白或转录因子。
在另一个实施例中，多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。
在另一个实施例中，多肽是乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、氨肽酶、α-淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、香豆酸酯酶、环糊精糖基转移酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、溶解性多糖单加氧酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、α-1,6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
在另一个实施例中，多肽是内切葡聚糖酶。在另一个实施例中，多肽是纤维二糖水解酶。在另一个实施例中，多肽是β-葡糖苷酶。在另一个实施例中，多肽是溶解性多糖单加氧酶(AA9或GH61多肽)。在另一个实施例中，多肽是木聚糖酶。在另一个实施例中，多肽是β-木糖苷酶。在另一个实施例中，多肽是乙酰木聚糖酯酶。在另一个实施例中，多肽是阿魏酸酯酶。在另一个实施例中，多肽是阿拉伯呋喃糖苷酶。在另一个实施例中，多肽是葡糖醛酸糖苷酶。在另一个实施例中，多肽是乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个实施例中，多肽是阿拉伯聚糖酶。在另一个实施例中，多肽是香豆酸酯酶。在另一个实施例中，多肽是半乳糖苷酶。在另一个实施例中，多肽是葡萄糖醛酸酯酶。在另一个实施例中，多肽是甘露聚糖酶。在另一个实施例中，多肽是甘露糖苷酶。在另一个实施例中，多肽是漆酶。在另一个实施例中，多肽是过氧化氢酶。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体(例如，编码分泌的目的多肽、或包含编码变体Ire1多肽的突变ire1基因的多核苷酸)，其中该多核苷酸优选地可操作地连接至一个或多个控制序列，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
可用许多方式操纵多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因中获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已用来自曲霉属磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延伸因子。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以含有对于该编码序列是异源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要异源信号肽编码序列。可替代地，异源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的N-末端。
还可以希望的是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸(例如，编码分泌的目的多肽的多核苷酸、或包含编码变体Ire1多肽的突变ire1基因的第二多核苷酸)、启动子、和转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)，fcyA(胞嘧啶脱氨酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、fcyA、hph、和pyrG基因。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一个实施例中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
丝状真菌宿主细胞
在另一方面，本发明涉及一种重组丝状真菌宿主细胞，其包含和表达编码异源目的多肽的第一多核苷酸和包含编码变体Ire1多肽的突变ire1基因的第二多核苷酸，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一些实施例中，重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸的至少两个拷贝，例如三个、四个或五个。
宿主细胞可以是任何丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉胞菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管霉(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑根毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉胞菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、埃默森篮状菌、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
在优选的实施例中，丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。
在更优选的实施例中，木霉属细胞是哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
在最优选实施例中，木霉属细胞是哈茨木霉细胞。在最优选实施例中，木霉属细胞是康宁木霉细胞。在最优选实施例中，木霉属细胞是长枝木霉细胞。在最优选实施例中，木霉属细胞是里氏木霉细胞。在最优选实施例中，木霉属细胞是绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。
产生方法
本发明还涉及一种产生分泌的异源目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在适于产生和分泌异源多肽的条件下，培养本发明的丝状真菌宿主细胞；以及，任选地
(b)回收该分泌的异源目的多肽。
宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。
可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从发酵培养基回收多肽。在一个实施例中，回收包含多肽的全发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化该多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
菌株
里氏木霉BTR213描述于WO 2013/086633中。
里氏木霉菌株FRT4New-8G4A是一种ku70被破坏且副胞菌素合成酶(parS)基因缺失的里氏木霉BTR213菌株，并且具有FRT位点(FRT-F和FRT-F3)，将这些FRT位点插入这四个基因座的每个处，以使用酿酒酵母翻转酶(FLP)和翻转酶识别序列FRT-F和FRT-F3对表达盒进行位点特异性靶向整合，如WO 2012/160093和US2018/0037897所述。在四个基因座的每个处的FRT-F和FRT-F3位点之间插入黑曲霉胞嘧啶脱氨酶(fcyA)基因，以用作5-氟胞嘧啶(5FC)的反选择。
培养基和溶液
CIM培养基由以下构成：20g的纤维素、10g的玉米浆固体、1.45g的(NH4)2SO4、2.08g的KH2PO4、0.28g的CaCl2、0.42g的MgSO4·7H2O、0.42ml的木霉痕量金属溶液、1至2滴消泡剂、以及去离子水补足至1升，pH调节至6.0。木霉痕量金属溶液由以下构成：216g的FeCl3·6H2O、58g的ZnSO4·7H2O、27g的MnSO4·H2O、10g的CuSO4·5H2O、2.4g的H3BO3、336g的柠檬酸、以及去离子水补足至1升。
COVE板由以下构成：342.30g的蔗糖、25g的诺布尔琼脂(Noble agar)、20ml的COVE盐溶液、10mM乙酰胺、15mM氯化铯、以及去离子水补足至1升。
COVE2板由以下构成：30g的蔗糖、20ml的COVE盐溶液、10ml的1M乙酰胺、25g的诺布尔琼脂、以及去离子水补足至1升。
COVE盐溶液由以下构成：26g的KCl、26g的MgSO4·7H2O、76g的KH2PO4、50ml的COVE痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。
COVE痕量金属溶液由以下构成：0.04g的Na2B4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、0.7g的MnSO4·H2O、0.8g的Na2MoO2·2H2O、10g的ZnSO4·7H2O、以及去离子水补足至1升。
发酵分批培养基(Fermentation batch medium)由以下构成：24g的右旋糖、40g的大豆粉、8g的(NH4)2SO4、3g的K2HPO4、8g的K2SO4、3g的CaCO3、8g的MgSO4·7H2O、1g的柠檬酸、8.8ml的85％磷酸、1ml的消泡剂、14.7ml的痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。痕量金属溶液由以下构成：26.1g的FeSO4·7H2O、5.5g的ZnSO4·7H2O、6.6g的MnSO4·H2O、2.6g的CuSO4·5H2O、2g的柠檬酸、以及去离子水补足至1升。
LB+Amp培养基由以下构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的氯化钠、50mg的氨苄青霉素(过滤灭菌并且在高压灭菌之后添加)、以及去离子水补足至1升。
PDA板由以下构成：39g的马铃薯右旋糖琼脂(Difco)、以及去离子水补足至1升。通过高压灭菌来为溶液灭菌。
PEG缓冲液由以下构成：去离子水中的50％聚乙二醇(PEG)4000、10mM Tris-HCl(pH 7.5)和10mM CaCl2。
摇瓶培养基由以下构成：20g的甘油、10g的大豆粉、1.5g的(NH4)2SO4、2g的KH2PO4、0.2g的CaCl2、0.4g的MgSO4·7H2O、0.2ml的痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。痕量金属溶液由以下构成：26.1g的FeSO4·7H2O、5.5g的ZnSO4·7H2O、6.6g的MnSO4·H2O、2.6g的CuSO4·5H2O、2g的柠檬酸、以及去离子水补足至1升。
SOC培养基由以下构成：20g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、0.5g的NaCl、10ml的250mM KCl、以及去离子水补足至1升。
STC由以下构成：去离子水中的1M山梨醇、10mM Tris(pH 7.5)和10mM CaCl2。
TAE缓冲液由以下构成：4.84g的Tris碱、1.14ml的冰醋酸、2ml的0.5M EDTA(pH8.0)、以及去离子水补足至1升。
TBE缓冲液由以下构成：10.8g的Tris碱、5g的硼酸、4ml的0.5M EDTA(pH 8)、以及去离子水补足至1升。
木霉属基本培养基(TrMM)板由以下构成：30g的蔗糖、20ml的COVE盐溶液、0.6g的CaCl2.2H2O、6g的(NH4)2SO4、25g的诺布尔琼脂、以及去离子水补足至1升。
2XYT+Amp板由以下构成：16g的胰蛋白胨、10g的酵母提取物、5g的NaCl、15g的细菌培养用琼脂(Bacto agar)、1ml的氨苄青霉素(100mg/ml)、以及去离子水补足至1升。
YP培养基是由去离子水中的1％酵母提取物和2％蛋白胨构成的。
实例1：从里氏木霉提取基因组DNA
使这些里氏木霉在补充有在250ml带挡板的摇瓶中的2％葡萄糖(w/v)的50ml的YP培养基中、在28℃下伴随着以200rpm的搅拌生长2天。使用衬有
(EMD化学品公司(EMD Chemicals Inc.))的漏斗收集来自培养物的菌丝体，挤压干燥，然后转移至预冷的研钵和研杵中。每个菌丝体制剂磨成细粉，并且用液氮保持冷冻。将总共1-2克的粉末转移到50ml管中，并且使用
植物Maxi试剂盒(凯杰有限公司(QIAGENInc.))从研磨菌丝体粉末中提取基因组DNA。将预热至65℃的5ml的AP1缓冲液(凯杰有限公司)添加到50ml管中，随后添加10μl的RNA酶A 100mg/ml原液(凯杰有限公司)，并且在65℃下孵育2-3小时。添加总共1.8ml的AP2缓冲液(凯杰有限公司)，并以3000-5000x g离心5分钟。将上清液倾析到置于50ml收集管中的QIAshredder大核酸纯化柱(凯杰有限公司)中，并且在室温(15℃-25℃)下在甩平式转子中以3000-5000x g离心5分钟。将收集管中的流过液体转移到新50ml管中，同时不干扰沉淀。将1.5ml体积的AP3/E缓冲液(凯杰有限公司)添加到澄清的裂解液中，并且通过涡旋振荡立即混合。将包括可能已经形成的任何沉淀的样品(最多15ml)，吸移到置于50ml收集管中的
大核酸纯化柱(凯杰有限公司)中，并且在室温(15℃-20℃)下在甩平式转子中以3000-5000x g离心5分钟。弃去流过液体。将12ml的AW缓冲液(凯杰有限公司)添加到
大核酸纯化柱中，并以3000-5000xg离心10分钟，以将膜干燥。弃去流过液体和收集管。将
大核酸纯化柱转移到新50ml管中。将预热至65℃的0.5ml的AE缓冲液(凯杰有限公司)直接吸移到
大核酸纯化柱膜中，在室温(15℃-25℃)下孵育5分钟，然后以3000-5000x g离心5分钟以洗脱基因组DNA。基因组DNA的浓度和纯度通过在260nm和280nm处测量吸光度确定。
实例2：里氏木霉原生质体的产生与转化
使用与Penttila等人,1987,Gene[基因]61:155-164类似的方案进行里氏木霉的原生质体制备与转化。简而言之，将里氏木霉在25ml的补充有2％(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的YP培养基中、在27℃下伴随着以90rpm进行的轻轻搅拌培养17小时。将菌丝体通过使用真空驱动一次性过滤系统(密理博公司(Millipore))过滤来收集，并且用去离子水洗涤两次并用1.2M山梨醇洗涤两次。通过在34℃下伴随90rpm的轻轻振荡使洗涤的菌丝体悬浮于100ml含有5mg/ml的YATALASETM酶(美国宝生物工程株式会社(Takara Bio USA,Inc.))和0.36单位的壳多糖酶(西格玛化工有限公司)/ml的1.2M山梨醇中60-75分钟来产生原生质体。将原生质体通过以834x g离心7分钟来收集，并且用冷的1.2M山梨醇洗涤两次。使用血细胞计数器对原生质体计数，并且使其重新悬浮至最终浓度为1x 108个原生质体/ml的STC。
将大约1-10μg的DNA添加至100μl的原生质体溶液中并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(3ml)，并且将反应混合，然后涂布在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育6-11天。
实例3：质粒pJfyS207的构建
质粒pJfyS207含有作为选择标记的构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因，和侧翼为234bp镶片镰孢pyrG重复以促进标记切除的人单纯疱疹病毒1胸苷激酶基因(HSV-1tk)基因。
使用以下引物产生含有构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因的PCR片段：
正向引物1213884：
AAAGACAAGGCCTAGTTGGAGTATTTGGAAACGCAACCCTGAAGG(SEQ ID NO:4)
反向引物1213885：
AGTAGTCGGCCAAGGGCGAATTCTCTACGCCAGGACCGAGCAA(SEQ ID NO:5)
PCR由以下构成：10ng的pMJ09(WO 2005/056772)、10mM dNTP、50pmol的正向引物1213884、50pmol的反向引物1213885、1X
HF缓冲液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.))、和2.5单位的
热启动(Hot Start)DNA聚合酶(赛默飞世尔科技公司)，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；30个循环，各在95℃下持续20秒、57℃下持续20秒、以及72℃下持续2分钟；1个循环，在72℃下持续2分钟；以及在10℃下保持。将所得2766bp PCR片段通过使用TBE缓冲液中的0.9％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶切离，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒(PCR Clean-up Kit)(马歇雷-纳格尔公司(Macherey Nagel))进行提取。
使用以下引物产生含有234bp的镶片镰孢pyrG基因的PCR片段：
正向引物1213882：
GGCCTTTTGCTCACATGGTTTAAACGGCGCGCCCGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCA(SEQ ID NO:6)
反向引物1213883：
AATACTCCAACTAGGCCTTGTCTTT(SEQ ID NO:7)
PCR由以下构成：10ng的pJfyS1579-41-11(WO 2011/075677)、10mM dNTP、50pmol的正向引物1213882、50pmol的反向引物1213883、1X
HF缓冲液、以及2.5单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；30个循环，各在95℃下持续20秒、57℃下持续20秒、以及72℃下持续40秒；1个循环，在72℃下持续2分钟；以及在10℃下保持。将所得250bp PCR片段通过使用TBE缓冲液中的0.9％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶切离，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。
使用
热启动DNA聚合酶和以下所示的DNA片段特异性正向引物和反向引物，通过重叠延伸(SOE)PCR进行剪接，从以上单独的PCR产物中产生单个DNA片段。
正向引物1213882：
GGCCTTTTGCTCACATGGTTTAAACGGCGCGCCCGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCA(SEQ ID NO:8)
反向引物1213885：
AGTAGTCGGCCAAGGGCGAATTCTCTACGCCAGGACCGAGCAA(SEQ ID NO:9)
SOE PCR由以下构成：1μl的每种上述经凝胶纯化的PCR产物、10mM dNTP、10pmol的正向引物1213882、10pmol的反向引物1213885、1X
HF缓冲液、以及2.5单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在95℃下持续20秒、57℃下持续20秒、以及72℃下持续2分钟；1个循环，在72℃下持续2分钟；以及在10℃下保持。将所得2991bp PCR片段通过使用TBE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶切离，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。
使用
克隆试剂盒(克罗泰克实验有限公司(ClontechLaboratories Inc.))，将2991bp DNA片段插入到Eco RI和Asc I酶切的pJfyS1579-41-11(WO 2011/075677)中。反应由以下构成：在10μl反应体积中的Eco RI和Asc I酶切的pJfyS1579-41-11、75ng的2991bp SOE PCR片段、以及1X
HD酶预混物。将混合物在50℃下培育15分钟后，将2μl的反应转化到50μl的STELLARTM化学感受态大肠杆菌细胞(克罗泰克实验公司(Clontech Laboratories))中。将这些细胞在42℃下热振荡45秒，然后添加100μl的SOC培养基，并且将总体积涂布在150mm 2XYT+Amp板上并且在37℃下孵育过夜。将所得大肠杆菌转化体单独地接种到在14ml圆底聚丙烯管中的3ml的LB+Amp培养基中，并且在37℃下伴随200rpm的振荡而孵育过夜。使用
9600(凯杰有限公司)分离质粒DNA。使用Model 377XL自动DNA测序仪(应用生物系统有限公司(AppliedBiosystems Inc.))，用染料终物化学(dye-terminator chemistry)(Giesecke等人,1992,J.Virol.Methods[病毒学方法杂志]38:47-60)通过DNA测序确认插入。一个转化体被鉴定为含有无PCR错误的插入，并且将质粒指定为pJfyS207(图1)。
实例4：构建pSaMF128以在里氏木霉ire1基因中整合Ala153Thr突变
构建质粒pSaMF128，以将单个单核苷酸突变整合到里氏木霉FRT4New-8G4A菌株天然ire1基因(针对基因组DNA序列为SEQ ID NO:1，针对推导的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，以及针对cDNA序列为SEQ ID NO:3)中，从而引起氨基酸改变Ala153Thr。质粒pSaMF128含有里氏木霉ire1启动子区域(5'侧翼)、里氏木霉ire1突变基因(Ala153Thr)、和200bp里氏木霉ire1终止子区域(3'侧翼重复)、随后是构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因和人单纯疱疹病毒1胸苷激酶基因(HSV-1tk)基因。amdS和HSV-1tk基因位于ire1基因的3'侧翼重复区域(如上)和ire1基因的1500bp 3’侧翼区域之间。如下所述的构建质粒pSaMF128。
最初，将质粒pSaMF123构建为质粒pJfyS207的衍生物(实例3)，其中amdS基因和HSV-1tk基因位于234bp镶片镰孢pyrG重复之间。
使用以下引物产生PCR产物(DNA片段1)，其含有里氏木霉ire1基因的5'侧翼区域和引入Ala153Thr突变的ire1基因的一部分，并且含有里氏木霉ire1基因的3'侧翼区域：
DNA片段1：
正向引物：
CACATGGTTTAAACGGCGCGCCCGTCTGGTCCTCTCTTTTGT(SEQ ID NO:10)
反向引物：
TGTGGTGTTCGGACGGTCTGAGCCGGAGCTAAAGTTGCGA(SEQ ID NO:11)
DNA片段1在由以下构成的反应中经PCR扩增：约75ng的里氏木霉BTR21基因组DNA、10μl的10mM dNTP、50pmol的正向引物、50pmol的反向引物、1X
HF缓冲液、以及2单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒、65℃下持续30秒、以及72℃下持续2.5分钟；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在10℃下保持。将所得3,570bp PCR片段通过使用TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶切离，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。
使用以下引物产生PCR产物(片段2)，其含有引入Ala153Thr突变的里氏木霉ire1基因的一部分和ire1基因的200bp的3'侧翼区域：
DNA片段2；
正向引物：
CAGACCGTCCGAACACCACACACCTCACGACATCACTGGC(SEQ ID NO:12)
反向引物：
CCCTTCAGGGTTGCGTTTCCACAACAGAAGCTGAAACAATT(SEQ ID NO:13)
DNA片段2在由以下构成的反应中经PCR扩增：约75ng的里氏木霉BTR213基因组DNA、10mM dNTP、50pmol的正向引物、50pmol的反向引物、1X
HF缓冲液、以及2单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒、65℃下持续30秒、以及72℃下持续2.5分钟；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在10℃下保持。将所得3,570bp PCR片段通过使用TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶切离，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。
使用以下引物产生PCR产物(片段3)，其含有里氏木霉ire1基因的3'侧翼区域：
DNA片段3：
正向引物：
CTTCCTTGAACTCTCAGATCTCCCGGGAAGAAAGAAAAGGAAGAGAA(SEQ ID NO:14)
反向引物：
CCATATTTAAATCCTGCAGGCTCGACATATCGCCAGGGAG(SEQ ID NO:15)
DNA片段3在由以下构成的反应中经PCR扩增：约75ng的里氏木霉BTR213基因组DNA、10mM dNTP、50pmol的正向引物、50pmol的反向引物、1X
HF缓冲液、以及2单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒、60℃下持续30秒、以及72℃下持续1分钟；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在10℃下保持30秒，并且在72℃下保持3分钟；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在10℃下保持。将所得1,547bp PCR片段通过使用TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶切离，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。
使用以下引物从质粒pJfyS207产生PCR产物(DNA片段4)，其含有amdS基因和HSV-1tk基因：
DNA片段4：
正向引物：
AATTGTTTCAGCTTCTGTTGTGGAAACGCAACCCTGAAGG(SEQ ID NO:16)
反向引物：
TCTTTCTTCCCGGGAGATCTGAGAGTTCAAGGAAGAAACA(SEQ ID NO:17)
DNA片段4在由以下构成的反应中经PCR扩增：约75ng的质粒pJfyS207 DNA、10mMdNTP、50pmol的正向引物、50pmol的反向引物、1X
HF缓冲液、以及2单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒、65℃下持续30秒、以及72℃下持续2.5分钟；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在10℃下保持。将所得3,201bp PCR片段通过使用TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶切离，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。
使用以下引物从pJfyS207产生PCR产物(DNA片段5)，其含有大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性标记：
DNA片段5：
正向引物：
CTCCCTGGCGATATGTCGAGCCTGCAGGATTTAAATATGGC(SEQ ID NO:18)
反向引物：
CAAAAGAGAGGACCAGACGGGCGCGCCGTTTAAACCATGTGAGCA(SEQ ID NO:19)
DNA片段5在由以下构成的反应中经PCR扩增：约75ng的质粒pJfyS207 DNA、10mMdNTP、50pmol的正向引物、50pmol的反向引物、1X
HF缓冲液、以及2单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒、65℃下持续30秒、以及72℃下持续2.5分钟；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在10℃下保持。将所得3,201bp PCR片段通过使用TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶切离，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。
根据制造商的说明，使用
HiFi DNA组装克隆试剂盒(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))将DNA片段1-5连接在一起。反应在50℃下进行60分钟，在-20℃下冷冻，然后在室温下孵育48小时。将1μl反应混合物转化到STELLARTM化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化体涂布在2XYT+Amp板上，并且在37℃下孵育过夜。使用
旋转迷你制备型试剂盒(Spin Miniprep Kit)(凯杰有限公司)，将质粒DNA从几个转化体中纯化。通过用Xba I、Nru I和Xho I进行限制性酶切，随后通过使用TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳来筛选适当连接的质粒DNA。鉴定了一个质粒并指定为pSaMF123(图2)。
如下所述，DNA片段1和2分别在由以下构成的反应中从质粒pSaMF123经PCR扩增：约115ng的质粒pSaMF123 DNA、10mM dNTP、50pmol的正向引物、50pmol的反向引物、1X
HF缓冲液、以及2单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒、65℃下持续30秒、以及72℃下持续2分钟；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在10℃下保持。
DNA片段1：使用以下引物产生PCR产物，其含有里氏木霉ire1基因的部分5'侧翼区域和引入Ala153Thr突变的ire1基因的一部分：
正向引物：
AAGCGGTTTCCGTTGCCTTCGAATTCGACAGAGCTGCGA(SEQ ID NO:20)
反向引物：
TGTGGTGTTCGGACGGGCTGAGCCGGAGCTAAAGTTGCGA(SEQ ID NO:21)
DNA片段1在由以下构成的反应中经PCR扩增：约115ng的质粒pSaMF123 DNA、10μl的10mM dNTP、50pmol的正向引物、50pmol的反向引物、1X
HF缓冲液、以及2单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒、65℃下持续30秒、以及72℃下持续2分钟；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在10℃下保持。将所得792bpPCR片段通过使用TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶切离，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行萃取。
DNA片段2；使用以下引物产生PCR产物，其含有延长至Bst BI位点的、引入Ala153Thr突变的里氏木霉ire1基因的一部分：
正向引物：
CAGCCCGTCCGAACACCACACACCTCACGACATCACTGGC(SEQ ID NO:22)
反向引物：
AGATTGTAGTTGCCCTTTCGAATGTTCACCTCCCGCATAT(SEQ ID NO:23)
DNA片段2在由以下构成的反应中经PCR扩增：约115ng的质粒pSaMF123 DNA、10μl的10mM dNTP、50pmol的正向引物、50pmol的反向引物、1X
HF缓冲液、以及2单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒、65℃下持续30秒、以及72℃下持续2分钟；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在10℃下保持。将所得2,811bpPCR片段通过使用TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶切离，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。
将质粒pSaMF123用Bst BI进行酶切，并且通过使用TAE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中将11,809bp片段从凝胶切离，并且使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。根据制造商的说明书，通过使用IN-FUSIONTM HD克隆试剂盒，将11,809bp片段连接到792bp和2,811bp的PCR片段上。将反应在50℃下进行15分钟。将1μl反应混合物转化到STELLARTM化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化体涂布在2XYT+Amp板上，并且在37℃下孵育过夜。使用
旋转迷你制备型试剂盒，将质粒DNA从几个转化体中纯化。使用2X 150bp输出模式的NEXTSEQTM 500系统(依诺米那公司(Illumina Inc.))，通过下一代测序将来自几个克隆的质粒DNA进行测序。鉴定了一个质粒并指定为pSaMF128(图3)。
实例5：用pSaMF128转化里氏木霉菌株FRT4New-8G4A以整合内源ire1基因中的Ala153Thr突变。
根据实例2，产生里氏木霉FRT4New-8G4A原生质体，并且将其用4.75μg的Pme I和Swa I-线性化的pSaMF128(实例4)转化。获得十九个转化体，并且将每个转化体挑出并转移到25mm COVE2板，并且在30℃下孵育5天。
将使用PHIRETM植物直接PCR试剂盒(Plant Direct PCR Kit)(赛默科技公司(Thermo Scientifi))的真菌孢子PCR方法用于筛选转化体，以使用如下所示的正向引物和反向引物对5'重组或3'重组进行Pme I和Swa I-线性化pSaMF128的位点特异性整合。
5'重组：
正向引物1221836：
TGTCGAGGATGTGCTGGAGG(SEQ ID NO:24)
反向引物1221835：
ACCTGCCGTAGAACCGAAGA(SEQ ID NO:25)
3'重组：
正向引物1220100：
CTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCC(SEQ ID NO:26)
反向引物1221837：
GACTCGCATAAGATGGCGAC(SEQ ID NO:27)
通过用无菌1μl接种环收集孢子并将它们转移到在0.6ml管中的20μl稀释缓冲液(PHIRETM植物直接PCR试剂盒)中来完成孢子PCR。将孢子悬浮液用作PCR中的模板，以筛选ire1基因座处的pSaMF128的整合。反应由以下构成：在20μl反应中的1.5μl的孢子悬浮液、12.5pmol的每个引物、10μl的2X PHIRETM植物PCR缓冲液(PHIRETM植物直接PCR试剂盒)、以及0.4μl的PHIRETM热启动IIDNA聚合酶(PHIRETM植物直接PCR试剂盒)。
反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续5分钟；40个循环，各在98℃下持续10秒、66℃下持续10秒、以及72℃下持续2分钟；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在4℃下保持。通过使用TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳来分析完成的PCR。
在里氏木霉ire1基因座的5’端的成功靶向整合产生5630bp的条带，而在里氏木霉ire1基因座的3’端的成功整合产生4707bp的条带。孢子PCR的结果表明，十九个转化体中有十七个在里氏木霉ire1基因座的5’和3’端都已成功整合。
ire1替代构建体(replacement construct)pSaMF128含有侧翼为直接重复的amdS基因和HSV-1tk基因作为选择性标记。插入直接重复以促进amdS和HSV-1tk基因的固化，并且产生具有Ala153Thr突变的干净的ire1基因座。里氏木霉菌株SaMF128-1、SaMF128-2和SaMF128-4在PDA板上在28℃下生长7天。使用0.01％
从板收集孢子，并且将这些孢子涂布到含有1.5μM 5-氟-2'-脱氧尿苷(FdU)的TrMM板上并且在30℃下孵育5天。将十五个分离株传代培养到PDA板上并且在30℃下孵育5天。然后通过在COVE2板上生长，筛选出不存在amdS选择标记基因的分离株。三个分离株显示在COVE2板上没有生长，表明amdS和HSV-1tk选择标记基因可能丢失。
在PDA板上进行一轮单孢子分离后，对每个分离株进行如上所述的真菌孢子PCR，以扩增ire1基因座。PCR筛选由以下构成：在20μl反应中的1.5μl的孢子悬浮液、12.5pmol的引物1222084、12.5pmol的引物1222085、10μl的2X PHIRETM植物PCR缓冲液、以及0.4μl的PHIRETM热启动II DNA聚合酶。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续5分钟；40个循环，各在98℃下持续10秒、以及在72℃下持续29秒；1个循环，在72℃下持续10分钟；以及在10℃下保持。将所得PCR片段用ExoSAP-ITTM(应用生物系统有限公司(Applied Biosystems Inc.))处理，并且用Model377XL自动DNA测序仪、使用染料终止物化学(Giesecke等人,1992,同上)进行测序，以验证里氏木霉ire1基因中的Ala153Thr突变的整合。如实例1所述制备基因组DNA，并且在NEXTSEQTM500(依诺米那公司(Illumina Inc.))中使用2X 150bp化学进行测序。测序鉴定转化体SaMF128-2A11-1含有在里氏木霉ire1基因中的Ala153Thr突变并且不存在amdS和HSV-1tk选择标记基因。
实例6：构建Flp/FRT整合质粒pAMFS210以表达匹斯特斯多孔菌漆酶
构建表达质粒pAMFS210，以使用酿酒酵母翻转酶(FLP)和翻转酶识别序列FRT-F和FRT-F3在里氏木霉中四个基因座的每个处整合匹斯特斯多孔菌漆酶基因(针对cDNA序列为SEQ ID NO:28，针对推导的氨基酸序列为SEQ ID NO:29)。设计如下所示的两个合成寡核苷酸引物，以从质粒pAMFS200(WO 2016/090059)经PCR扩增匹斯特斯多孔菌漆酶基因并引入侧翼区域用于插入到表达载体pJfyS165(US 2018/0037897)中。粗体字母代表编码序列，并且剩余序列与质粒pJfyS165的插入位点同源。
正向引物1210173：
ACCGCGGACTGCGCACCATGTCGAGGTTTCACTC(SEQ ID NO:30)
反向引物1210174：
GCCACGGAGCTTAATTACTACTGGTCGCTCGGGT(SEQ ID NO:31)
PCR由以下构成：200ng的质粒pAMFS200 DNA、10μl的10mM dNTP、50pmol的引物1210173、50pmol的引物1210174、1X
HF缓冲液、以及2单位的
热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中进行：1个循环，在98℃下持续30秒；30个循环，各在98℃下持续10秒，62℃下持续10秒、以及72℃下持续1.5分钟；以及1个循环，在72℃下持续10分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳纯化，其中从凝胶切离1.5kb片段，并且使用
凝胶提取试剂盒(凯杰有限公司)提取琼脂糖。
将匹斯特斯多孔菌漆酶编码序列的1.5kb基因片段和酶切的载体在反应中连接在一起，得到由以下构成的表达质粒pAMFS210：在里氏木霉cbh1启动子的转录控制下的匹斯特斯多孔菌漆酶编码序列、用于有效靶向的FRT识别位点、以及在里氏木霉cbh2启动子控制下的酿酒酵母翻转酶编码序列。连接反应(10μl)由以下构成：1XIN-FUSIONTM HD酶混合物、200ng的用Nco I和Pac I酶切的pJfyS165、以及68ng的纯化的匹斯特斯多孔菌漆酶基因PCR产物。将反应在50℃下孵育15分钟。将2μl体积的反应转化到ONE
TOP10感受态细胞(英杰公司(Invitrogen))中。将转化体接种到在14ml圆底聚丙烯管中的3ml的LB+Amp培养基中，并且在37℃下伴随200rpm的振荡而孵育过夜。使用
9600分离质粒DNA。使用染料终止物化学(Giesecke等人,1992,同上)，用Model377XL自动DNA测序仪，通过DNA测序确认插入。鉴定了一个含有无PCR错误的插入的转化体，并且将质粒指定为pAMFS210(图4)。
实例7：pAlLo104的构建
将质粒pJfyS165和pDM313(U.S.2018/0037897)分别用限制性酶Bst XI进行酶切，并通过使用TAE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切离来自质粒pJfyS165的8.2kb DNA条带和来自质粒pDM313的1.2kb DNA条带，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。使用QUBITTM 2.0荧光计和dsDNA广谱测定试剂盒(dsDNA Broad Range Assay Kit)(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))定量纯化的DNA片段。
使用Thermo ScientificTM快速连接试剂盒(Rapid Ligation Kit)，用载体:插入摩尔比为1:3组装质粒pAlLo104。使用一微升的连接反应转化50μl的STELLARTM化学感受态大肠杆菌细胞。将这些细胞在42℃下热振荡45秒，然后添加100μl的SOC培养基。然后将转化在37℃下进行孵育，同时以200rpm进行恒定振荡60分钟。然后将转化的100μl等分试样涂布在150mm 2XYT+Amp板上，并且在37℃下孵育过夜。将二十四个所得大肠杆菌转化体单独地接种到在14ml圆底聚丙烯管中的3ml的LB+Amp培养基中，并且在37℃下伴随300rpm的振荡而孵育过夜。使用
9600分离质粒DNA。通过使用Bst XI进行限制性酶切，以分析推定的重组克隆。选择具有正确限制性样式的克隆之一，并将其指定为质粒pAlLo104。为了进一步确认pAlLo104的序列，使用2X 150bp输出模式的NEXTSEQTM 500系统(依诺米那公司(Illumina Inc.))，通过下一代测序对全质粒进行测序。
实例8：pAlLo105的构建
向酿酒酵母翻转酶中添加猿猴病毒40(SV40)T抗原核定位序列(SV40-NLS)，将来自pAlLo104的840bp Pae I/Psr I限制性片段通过限制性酶切和凝胶纯化去除。在紧邻酿酒酵母翻转酶终止密码子(TGA)之前，将840bp片段的计算机模拟(in-silico)模型分裂成两部分，然后将包含SV40-NLS的以下序列添加至裂解片段的右侧和左侧。
CCCAAGAAGAAGCGCAAGGTC(SEQ ID NO:32)
PKKKRKV(SEQ ID NO:33)
然后，用这些计算机模拟模型产生PCR引物，以用新添加的SV40-NLS来扩增840bp片段，并将其克隆回Pae I/Psr I酶切的pAlLo104主链中。
左侧的引物：
正向引物：
GAACGCCCCCTACTCCATCTTCGCCATCAAGAACGGCCCCAA(SEQ ID NO:34)
反向引物：
GACCTTGCGCTTCTTCTTGGGGATGCGGCGGTTGATGTAGG(SEQ ID NO:35)
粗体序列代表新添加的SV40-NLS核苷酸序列。
右侧的引物：
正向引物：
CCCAAGAAGAAGCGCAAGGTCTGAGTCGAGATTATCCAAGG(SEQ ID NO:36)
反向引物：
GTTTAAACTCTAGGATGCATGCAAGTGAGGCTATTGCCTAT(SEQ ID NO:37)
粗体序列代表新添加的SV40-NLS核苷酸序列。
左侧和右侧PCR由以下构成：15ng的质粒pJfyS165 DNA、200μM dNTP、0.5μM引物、1X
反应缓冲液(赛默飞世尔科技公司)、以及2单位的
高保真(High Fidelity)DNA聚合酶(赛默飞世尔科技公司)，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中进行：1个循环，在98℃下持续2分钟；30个循环，各在98℃下持续5秒、60℃下持续10秒、以及72℃下持续30秒；以及1个循环，在72℃下持续5分钟。将反应通过使用TAE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切离424bp条带(左侧片段)和470bp条带(右侧片段)，并且使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。使用QUBITTM 2.0荧光计和dsDNA广谱测定试剂盒(dsDNA Broad Range Assay Kit)定量纯化的DNA。
pAlLo104的Psr I/Pae I限制性酶切以产生克隆主链是在顺序酶切中完成的，以解释限制性缓冲液不相容性。
Psr I限制性酶切由以下构成：5μg的质粒pAlLo104、1X SibY限制性缓冲液(西酶科技有限公司(SibEnzyme Ltd.))1X BSA、5单位的Psr I限制性酶、以及水补足至200μl。将反应在30℃下孵育过夜，然后在65℃下孵育20分钟使酶热失活，然后如上所述进行凝胶纯化。
Pae I限制性酶切由以下构成：40μl的Pae I限制性酶切、1X快速绿色缓冲液(FastGreen buffer)(赛默飞世尔科技公司)、4单位的Pae I、以及水补足至100μl。将反应在37℃下孵育60分钟，然后如上所述进行凝胶纯化。
用
HiFi DNA组装试剂盒进行含有SV40-NLS的片段的克隆。反应由以下构成：质粒pAlLo105主链、和比率为1:2(0.07pmol:0.14pmol)的左片段和右片段(总质量为0.21pmol)、以及1X HiFi主混合物，总体积为20μl。将反应在50℃下孵育30分钟，然后置于冰上2分钟。使用二微升的HiFi反应转化NEB5-ALPHATM感受态细胞(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))。将这些细胞在42℃下热振荡30秒，然后添加950μl的SOC培养基。然后将转化在37℃下进行孵育，同时以200rpm进行恒定振荡60分钟。然后将转化的100μl等分试样涂布在150mm2XYT+Amp板上，并且在37℃下孵育过夜。随机选取八个菌落，并且用
9600制备质粒DNA。通过用Bcg I进行限制性酶切，以分析推定的重组克隆。随机选择一个具有正确限制性样式的克隆，并将其指定为质粒pAlLo105。为了进一步确认pAlLo105的正确组装，使用用于PCR扩增此区域(SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:38)的相同的引物对质粒进行桑格(Sanger)测序。用
4.0版本(SnapGene)进行序列分析。桑格读段与pAlLo105的计算机模拟模型进行比对，显示SV40-NLS已成功添加到翻转酶基因的末端。
实例9：pAlLo106的构建
将质粒pAlLo5(实例8)用Xba I和Kfl I进行酶切以去除含有cbh1启动子、cbh1终止子、和约1.8kb的amdS基因3’端的片段。限制性酶切反应由以下构成：5μg的质粒pAlLo105DNA、1X快速绿色缓冲液(赛默飞世尔科技公司)、5单位的Xba I和5单位的Kfl I、以及水补足至100μl。将反应在37℃下孵育60分钟，然后如实例8所述进行凝胶纯化。用以下引物从质粒pJfyS143(US 2018/0037897)PCR扩增含有cbh2启动子和终止子以及约1.8kb的amdS基因3’端的替代片段。
CTATTCCGAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAATTCTAGGCTAGGTATGC(SEQ IDNO:38)
ATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCC(SEQ ID NO:39)
PCR由以下构成：20ng的质粒pJfyS143 DNA、200μM dNTP、0.5μM引物、1X
反应缓冲液、以及2单位的
高保真DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中进行：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续5秒，68℃下持续10秒、以及72℃下持续3分钟；以及1个循环，在72℃下持续5分钟。将反应通过用TAE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切离2819bp的条带，并且使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。使用
HiFi DNA组装试剂盒进行新载体的组装。反应由以下构成：质粒pAlLo105主链、和比率为1:3(0.023pmol:0.07pmol)的替代片段(总质量为0.21pmole)、以及1X HiFi主混合物，总体积为20μl。将反应在50℃下孵育30分钟，然后置于冰上2分钟。
使用两微升的HiFi反应转化SOLOPACKTM超感受态细胞((安捷伦科技公司(AgilentTechnologies))。将这些细胞在42℃下热振荡30秒，然后添加250μl的SOC培养基。然后将转化在37℃下进行孵育，同时以200rpm进行恒定振荡60分钟。然后将转化的100μl等分试样涂布在150mm 2XYT+Amp板上，并且在37℃下孵育过夜。随机选取十六个菌落，并且用
9600制备质粒DNA。通过用Xba I和Kfl I进行限制性酶切，以分析推定的重组克隆。观察到克隆9和15具有正确限制性样式，并且选择用于如实例7所述通过Illumina技术进行测序。用CLC Genomics Workbench 11.0.0版本(凯杰有限公司)进行序列分析。使用具有高严格度设置的读段映射至参考值(Map Reads to Reference)模块，将读段映射至预期的pAlLo106序列的计算机模拟模型。在191,566读段中总共有180,627读段被成功映射，从而产生了100％模型覆盖率，其读取深度为4485±354。使用基本变体检测器模块(Basic Variant Detector Module)对9号克隆进行分析，显示其在位置318处具有单核苷酸多态性。弃去此克隆。对克隆15的分析显示，在192,552读段中总共有187,208读段被成功映射，从而产生了100％模型覆盖率，其读取深度为4,791±418。基本变体检测器显示克隆15具有质粒pAlLo106的预期序列。将克隆15重新命名为质粒pAlLo106。
实例10：质粒pAlLo108的构建
质粒pAlLo108是质粒pAlLo106的衍生物，其中酿酒酵母翻转酶基因由构巢曲霉gpdA启动子而不是里氏木霉gpdA启动子驱动。
将质粒pAlLo106用Bst XI进行酶切，以去除1.2kb的含有里氏木霉gpdA启动子的片段和264bp的酿酒酵母翻转酶基因的片段。将该1.2kb的片段用含有原始264bp酿酒酵母翻转酶基因片段的片段和1.2kb的含有构巢曲霉gpdA启动子的片段替代。
使用以下引物，从构巢曲霉基因组DNA经PCR扩增含有构巢曲霉gpdA启动子的DNA片段。
ATAGGAACTTCAGATATCCATCACACTGGGAGTACCATTTAATTCTATTTGTGTTTGATCGAGAC(SEQID NO:40)
CGAACTGGGGCATGGTGATGTCTGCTCAAGCGG(SEQ ID NO:41)
PCR由以下构成：180ng的构巢曲霉基因组DNA、200μM dNTP、0.5μM引物、1X
反应缓冲液、以及2单位的
高保真DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中进行：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续5秒，60℃下持续10秒、以及72℃下持续3分钟；以及1个循环，在72℃下持续5分钟。将反应通过用TAE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切离1267bp的DNA条带，并且使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。
使用以下引物，从质粒pAlLo105经PCR扩增修复酿酒酵母翻转酶基因的DNA片段。
GCAGACATCACCATGCCCCAGTTCGATATCCTCT(SEQ ID NO:42)
CTTCTTGAGGGAGGCCTCCAGGATGGTGGCCTTCTGG(SEQ ID NO:43)
PCR由以下构成：10ng的质粒pAlLo105 DNA、200μM dNTP、0.5μM引物、1X
反应缓冲液、以及2单位的
高保真DNA聚合酶，最终体积为50μl。反应在编程为如下的热循环仪中进行：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，各在98℃下持续5秒，60℃下持续10秒、以及72℃下持续3分钟；以及1个循环，在72℃下持续5分钟。将反应通过用TAE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中从凝胶切离297bp的DNA条带，并且使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行提取。
用
HiFi DNA组装试剂盒进行pAlLo108的组装。反应由以下构成：100ng的Bst XI酶切的pAlLo106、6.9ng的264bp的酿酒酵母翻转酶基因片段、29.8ng的1.2kb的构巢曲霉gpdA启动子片段、以及1X HiFi主混合物，总体积为20μl。将反应在50℃下孵育30分钟，然后置于冰上2分钟。
将两微升的反应转化到SOLOPACKTM超感受态细胞中。将这些细胞在42℃下热振荡30秒，然后添加250μl的SOC培养基。然后将转化在37℃下进行孵育，同时以200rpm进行恒定振荡60分钟。然后将转化的100μl等分试样涂布在150mm 2XYT+Amp板上，并且在37℃下孵育过夜。随机选取十二个菌落/质粒，并且用
9600制备质粒DNA。通过用ScaI进行限制性酶切，以分析推定的重组克隆。
如实例7所述，针对每个质粒选择两个具有正确限制性样式的克隆通过Illumina技术进行测序。用CLC Genomics Workbench 11.0.0版本(凯杰有限公司)进行序列分析。使用具有高严格度设置的读段映射至参考值模块，将读段映射至预期的pAlLo108序列的计算机模拟模型。总共有103,574读段被成功映射，从而产生了100％的pAlLo106模型覆盖率，其平均读取深度为2640±321。对基本变体检测器模块的分析显示克隆108-15具有质粒pAlLo108的预期序列。
实例11：Flp/FRT整合“空”质粒pNJOC381的构建
质粒pNJOC381是“空”质粒，其含有非功能性amdS基因，并且缺乏匹斯特斯多孔菌漆酶表达盒。构建该质粒，以使用酿酒酵母翻转酶(FLP)和翻转酶识别序列FRT-F和FRT-F3在里氏木霉中四个基因座的每个处进行整合。
通过使用缺乏amdS基因的启动子和起始密码子ATG的截短的amdS盒替代amdS基因，从pAlLo108(实例10)构建质粒pNJOC381。该质粒由两个PCR产物组装。分别使用如下所示的引物组NJ91和NJ92以及引物组NJ93和NJ94，将pAlLo108质粒主链和截短的amdS盒从pAlLo108进行PCR扩增。
引物NJ91：
caagggcgaattctgcattg(SEQ ID NO:44)
引物NJ92：
gaagttcctatactttctagagaataggaactcggaataggaacttcaagatgaattcgc(SEQ IDNO:45)
引物NJ93：
ctagaaagtataggaacttcAAGCTTtggaaacgcaaccctgaag(SEQ ID NO:46)
引物NJ94：
caatgcagaattcgcccttgcctcaatcctgggaagaactg(SEQ ID NO:47)
PCR由以下构成：5ng的质粒pAlLo108 DNA(用作模板)、1XHF缓冲液、200μM的每种dNTP、500nM的正向引物、500nM的反向引物、和1单位的
热启动II DNA聚合酶。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续3分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒，55℃下持续30秒、以及72℃下持续2分钟；以及1个循环，在72℃下持续5分钟。热循环后，使用TBE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳来分离PCR产物，其中从凝胶分别切离对应于pAlLo108主链和截短的amdS盒的5770bp和2117bp条带，并使用
凝胶和PCR清洁试剂盒进行纯化。
将两个PCR产物使用总体积为20μl的
HiFi DNA组装克隆试剂盒(由1X
HiFi组装主混合物和0.05pmol的各PCR产物构成)连接在一起。将反应在50℃下孵育15分钟，然后置于冰上。使用1μl的反应以转化60μl的STELLARTM化学感受态大肠杆菌细胞。将转化反应涂布到两个2XYT+Amp板上，并且在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板分离，并且使用
旋转迷你制备型试剂盒从每种中制备质粒DNA，并且针对用Pvu II酶切的片段的适当插入进行筛选。DNA测序确认了产生所需条带大小(3439bp、2364bp、和2044bp)的质粒是正确的，并将其指定为pNJOC381。
实例12：过表达匹斯特斯多孔菌漆酶的菌株的产生
在作为宿主的里氏木霉FRT4New-8G4A(天然ire1基因)和里氏木霉SaMF128-2A11-1(ire1 Ala153Thr突变体)中过表达匹斯特斯多孔菌漆酶基因的菌株按照以下程序构建。
产生里氏木霉FRT4New-8G4A和里氏木霉SaMF128-2A11-1原生质体，并且针对根据实例2的每个转化反应与5μg的质粒pAMF210(实例5)和3μg的质粒pNJOC381(实例11)共转化，以产生具有1、2、3和/或4-拷贝的匹斯特斯多孔菌漆酶基因的菌株。将转化涂布在COVE板上，并且在30℃下孵育直至转化体出现。使用WhatmanTM150mm无菌滤纸(英国通用电气医疗有限公司(GE Healthcare UK Limited))，将来自每个COVE板的转化体的孢子复制铺板至含有75μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司(Sigma Chemical Co.))的TrMM板上，并在30℃下孵育6天。将来自里氏木霉FRT4New-8G4A的三十五个5-FC抗性分离株和来自里氏木霉SaMF128-2A11-1的二十八个5-FC抗性转化体传代培养到含有75μg/ml 5-FC的新TrMM板上。
将使用PHIRETM植物直接PCR试剂盒的真菌多重孢子PCR方法用于筛选5-FC抗性转化体，以确定匹斯特斯多孔菌漆酶基因拷贝数。使用如下所示的靶向amdS基因起点的通用正向引物和一组反向引物(每个基因座一个)进行PCR。
正向引物NJ100：
gttcttcccaggattgagg(SEQ ID NO:48)
反向引物NJ101：
ggtactgggatacacgaagagc(SEQ ID NO:49)
反向引物NJ102：
atcagtacagccatgttgcac(SEQ ID NO:50)
反向引物NJ103：
gagaagactttggacgcagtg(SEQ ID NO:51)
反向引物NJ104：
atgatacctactgataccgacaacc(SEQ ID NO:52)
通过将基因座特异性反向引物放置在距amdS基因不同距离处来控制不同基因座的PCR产物大小。与含有缺乏amdS启动子和起始密码子的空构建体pNJOC381的基因座相比，含有pAMFS210表达构建体的基因座将产生更长的PCR产物大小(表1)。因此，PCR策略允许同时验证在cbh1、cbh2、eg1和/或xyn2基因座处的匹斯特斯多孔菌漆酶基因整合，并充当简单的拷贝数确定方法。
表1：真菌多重孢子PCR的预期PCR产物大小
通过用无菌1μl接种环收集孢子并将它们转移到在0.6ml管中的20μl稀释缓冲液(PHIRETM植物直接PCR试剂盒)中来进行多重孢子PCR。反应由以下构成：在20μl反应中的0.5μl的孢子悬浮液，2pmol的通用正向引物NJ100，各0.5pmol的反向引物NJ101、NJ102、NJ103、和NJ104，5μl的2X PHIRETM植物PCR缓冲液、以及0.2μl的PHIRETM热启动II DNA聚合酶。反应在编程为如下的热循环仪中孵育：1个循环，在98℃下持续5分钟；40个循环，各在98℃下持续5秒、55℃下持续5秒、以及72℃下持续40秒；1个循环，在72℃下持续2分钟；以及在4℃下保持。通过使用TAE缓冲液中的1.5％琼脂糖凝胶电泳来分析完成的PCR。
多重孢子PCR的结果鉴定了在作为宿主的里氏木霉FRT4New-8G4A(天然ire1基因)中仅具有1-拷贝和2-拷贝的匹斯特斯多孔菌漆酶基因的转化体，以及在作为宿主的里氏木霉SaMF128-2A11-1(Ala153Thr ire1突变体)中具有2-、3-和4-拷贝的匹斯特斯多孔菌漆酶基因的转化体。菌株是在COVE板上分离的单孢子，并且如上所述再次进行多重孢子PCR，以验证匹斯特斯多孔菌漆酶基因拷贝数。
实例13：漆酶活性测定
培养物上清液适当地稀释于0.1M乙酸钠、0.01％TRITONTMX-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)pH 5.0缓冲液(样品缓冲液)中，随后将稀释的样品从0倍连续稀释至1/3倍至1/9倍。用样品缓冲液适当地稀释漆酶标准品，并将其添加到样品中。将总共20μl的每种稀释液和标准样品转移至96孔平底微量滴定板的孔中。向每个孔中添加200μl的ABTS(2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))底物溶液(0.1M乙酸钠pH 5.0+0.275mg/ml ABTS+0.01％TRITONTM X-100)，并且然后在环境温度下孵育30分钟。孵育期间，针对96孔板，使用
读板器(分子器件有限公司(Molecular Devices,LLC.))在光密度为405nm下测量反应速率。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。
实例14：比较里氏木霉FRT4New-8G4A(天然ire1)和里氏木霉SaMF128-2A11-1(ire1 Ala153Thr突变体)中的匹斯特斯多孔菌漆酶生产力
在WhatmanTM24孔聚丙烯圆底微板中，在含有2％乳糖和0.25mM CuSO4·5H2O的2mlCIM培养基中，在30℃下伴随250rpm的振荡，将单孢子分离的表达匹斯特斯多孔菌漆酶的菌株(实例12)培养3天。生长3天后，如实例13所述针对匹斯特斯多孔菌漆酶活性来测定液体培养基。在具有2-拷贝的匹斯特斯多孔菌漆酶基因的菌株中，匹斯特斯多孔菌漆酶表达量在里氏木霉SaMF128-2A11-1(ire1Ala153Thr突变体)中与在里氏木霉FRT4New-8G4A(天然ire1)中相比相对改善1.6倍。
实例15：匹斯特斯多孔菌漆酶表达改善的实验室规模2升发酵确认
将产生自里氏木霉FRT4New-8G4A(天然ire1)和里氏木霉SaMF128-2A11-1(ire1Ala153Thr突变体)的二-拷贝的匹斯特斯多孔菌漆酶基因菌株在2升发酵液中进行评估。使各菌株在30℃下在PDA板上生长4-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自PDA板的两个塞子接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以250rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。
使用总共160ml的各种子培养物接种含有1.6升发酵分批培养基的3-升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司(Applikon Biotechnology))。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用Applikon1030控制系统将pH控制在3.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5L/min的速率添加到容器中，并用以1100rpm旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。将由右旋糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至10g/L/小时的速率给予165小时。在发酵运行的第3、4、5、6和7天取样，并且在3000x g离心以去除生物质。将上清液储存在5℃至10℃下。
如实例13所述，在上清液样品中确定匹斯特斯多孔菌漆酶表达水平。与含2-拷贝的匹斯特斯多孔菌漆酶基因的野生型ire1的菌株相比，观察到含2-拷贝的匹斯特斯多孔菌漆酶基因的A153T ire1突变的菌株中匹斯特斯多孔菌漆酶活性增加2.82X(表2)。将漆酶基因拷贝增加到3或4不会导致A153T ire1突变菌株中漆酶更高表达。
表2：比较野生型ire1和A153T ire1变体宿主在7天的相对漆酶活性
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
通过以下编号的段落进一步定义本发明：
段落1.一种分离的变体Ire1多肽，其包含(a)SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％但小于100％的序列同一性。
段落2.如权利要求1所述的变体Ire1多肽，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的该取代是Thr。
段落3.如权利要求1所述的变体Ire1多肽，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的Ala被Thr取代。
段落4.如权利要求1至3中任一项所述的变体Ire1多肽，其进一步包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置150处的Thr或与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置150相对应的位置处的Thr。
段落5.如权利要求1至4中任一项所述的变体Ire1多肽，其中该变体Ire1多肽与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
段落6.一种分离的多核苷酸，其包含编码变体Ire1多肽的突变ire1基因，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％但小于100％的序列同一性。
段落7.如权利要求6所述的多核苷酸，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的该取代是Thr。
段落8.如权利要求6所述的多核苷酸，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的Ala被Thr取代。
段落9.如权利要求6至8中任一项所述的多核苷酸，其中该变体Ire1多肽进一步包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置150处的Thr或与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置150相对应的位置处的Thr。
段落10.如权利要求6至9中任一项所述的多核苷酸，其中该变体Ire1多肽与SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
段落11.一种核酸构建体，其包含如权利要求6至10中任一项所述的多核苷酸。
段落12.一种表达载体，其包含权利要求11所述的核酸构建体。
段落13.一种变体Ire1多肽，其由如权利要求6至10中任一项所述的多核苷酸编码。
段落14.一种重组丝状真菌宿主细胞，其包含和表达编码分泌的异源目的多肽的第一多核苷酸和包含编码变体Ire1多肽的突变ire1基因的第二多核苷酸，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％但小于100％的序列同一性。
段落15.如权利要求14所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的该取代是Thr。
段落16.如权利要求14所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的Ala被Thr取代。
段落17.如权利要求14至16中任一项所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中该变体Ire1多肽进一步包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置150处的Thr或与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置150相对应的位置处的Thr。
段落18.如权利要求14至17中任一项所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中该变体Ire1多肽与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
段落19.如权利要求14至18中任一项所述的重组丝状真菌宿主细胞，该重组丝状真菌宿主细胞属于选自由以下组成的组的属：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉胞菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。
段落20.如权利要求14至18中任一项所述的重组丝状真菌宿主细胞，其是木霉属细胞。
段落21.如权利要求20所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中该木霉属细胞是哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
段落22.如权利要求20所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中该木霉属细胞是里氏木霉细胞。
段落23.如权利要求14至22中任一项所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中该异源目的多肽是选自由以下组成的组的酶：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶。
段落24.如权利要求14至22中任一项所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中该异源目的多肽是乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、氨肽酶、α-淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、香豆酸酯酶、环糊精糖基转移酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、溶解性多糖单加氧酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、α-1,6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
段落25.一种产生分泌的异源目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适于产生和分泌该异源多肽的条件下，培养如权利要求14至24中任一项所述的重组丝状真菌宿主细胞；以及，任选地(b)回收该分泌的异源目的多肽。
段落26.一种改善丝状真菌宿主细胞中分泌的异源目的多肽的生产力或产率的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞包含和表达编码Ire1多肽的ire1基因；和(b)突变该ire1基因，以提供编码变体Ire1多肽的突变ire1基因，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％但小于100％的序列同一性。
段落27.如权利要求26所述的方法，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的该取代是Thr。
段落28.如权利要求26所述的方法，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的Ala被Thr取代。
段落29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中该变体Ire1多肽进一步包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置150处的Thr或与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置150相对应的位置处的Thr。
段落30.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中该变体Ire1多肽与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
段落31.如权利要求26至30中任一项所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞属于选自由以下组成的组的属：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉胞菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。
段落32.如权利要求26至30中任一项所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。
段落33.如权利要求32所述的方法，其中该木霉属细胞是哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
段落34.如权利要求32所述的方法，其中该木霉属细胞是里氏木霉细胞。
段落35.如权利要求26至34中任一项所述的方法，其中该异源目的多肽是选自由以下组成的组的酶：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶。
段落36.如权利要求26至34中任一项所述的方法，其中该异源目的多肽是乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、氨肽酶、α-淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、香豆酸酯酶、环糊精糖基转移酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、溶解性多糖单加氧酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、α-1,6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
Claims (20)
1.一种分离的变体Ire1多肽，其包含(a)SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
2.如权利要求1所述的变体Ire1多肽，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的该取代是Thr。
3.如权利要求1所述的变体Ire1多肽，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的Ala被Thr取代。
4.如权利要求1至3中任一项所述的变体Ire1多肽，其进一步包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置150处的Thr或与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置150相对应的位置处的Thr。
5.一种分离的多核苷酸，其包含编码变体Ire1多肽的突变ire1基因，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的该取代是Thr。
7.如权利要求5所述的多核苷酸，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的Ala被Thr取代。
8.如权利要求5至7中任一项所述的多核苷酸，其中该变体Ire1多肽进一步包含SEQ IDNO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置150处的Thr或与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置150相对应的位置处的Thr。
9.一种核酸构建体，其包含如权利要求5至8中任一项所述的多核苷酸。
10.一种重组丝状真菌宿主细胞，其包含和表达编码分泌的异源目的多肽的第一多核苷酸和包含编码变体Ire1多肽的突变ire1基因的第二多核苷酸，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
11.如权利要求10所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的该取代是Thr。
12.如权利要求10所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的Ala被Thr取代。
13.如权利要求10至12中任一项所述的重组丝状真菌宿主细胞，其中该变体Ire1多肽进一步包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置150处的Thr或与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置150相对应的位置处的Thr。
14.如权利要求10至13中任一项所述的重组丝状真菌宿主细胞，其属于选自由以下组成的组的属：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉胞菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。
15.一种产生分泌的异源目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在适于产生和分泌该异源多肽的条件下，培养如权利要求10至14中任一项所述的重组丝状真菌宿主细胞；以及，任选地
(b)回收该分泌的异源目的多肽。
16.一种改善丝状真菌宿主细胞中分泌的异源目的多肽的生产力或产率的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞包含和表达编码Ire1多肽的ire1基因；以及
(b)突变该ire1基因，以提供编码变体Ire1多肽的突变ire1基因，其中(a)该变体Ire1多肽包含SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置153处的氨基酸取代；或(b)该变体Ire1多肽包含与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置153相对应的位置处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
17.如权利要求16所述的方法，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的该取代是Thr。
18.如权利要求16所述的方法，其中在位置153或与位置153相对应的位置处的Ala被Thr取代。
19.如权利要求16至18中任一项所述的方法，其中该变体Ire1多肽进一步包含SEQ IDNO:2的里氏木霉Ire1多肽中位置150处的Thr或与SEQ ID NO:2的里氏木霉Ire1中位置150相对应的位置处的Thr。
20.如权利要求16至19中任一项所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞属于选自由以下组成的组的属：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉胞菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。
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