JP2021532829A - ガンマ−デルタｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の治療的調製物ならびに製造および使用する方法 - Google Patents

ガンマ−デルタｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の治療的調製物ならびに製造および使用する方法 Download PDF

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Abstract

ガンマ．デルタ（γδ）Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含有する自然免疫細胞組成物を作製する方法、ならびにがんおよび感染性疾患の治療に使用するための、得られた組成物および関連する製品およびキットを提供する。本明細書に提供する方法は、広く多様ながんおよび感染性疾患に対する細胞治療のために組成物中のガンマ．デルタ（γδ）Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の相対量を調整することを可能にする。得られた組成物をさらに使用して、免疫細胞治療のためにＮＫ細胞単独またはガンマ．デルタＴ細胞単独のいずれかを含有する組成物を生成することができる。

Description

関連する特許出願
本特許出願は、Ｃｏｎｃｅｔｔａ ＱＵＩＮＴＡＲＥＬＬＩらを発明者とし、代理人整理番号６４７４−１３１４００によって示される、タイトル「ガンマ−デルタＴ細胞およびナチュラルキラー細胞の治療的調製物ならびにそれらを作製および使用する方法（ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＰＲＥＰＡＲＡＴＯＮＳ ＯＦ ＧＡＭＭＡ−ＤＥＬＴＡ Ｔ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＮＡＴＵＲＡＬ ＫＩＬＬＥＲ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥＭ）」の２０１８年７月２６日に出願された米国特許仮出願第６２／７０３，６５４号の利益を主張する。全ての本文、表、および図面を含む前述の出願の全内容は、全ての目的に関して参照により本明細書に組み入れられる。
分野
本技術は、一部には治療のための自然免疫細胞組成物、ならびにそのような組成物を作製および使用する方法に関する。
抗原提示病原体および他の外来抗原提示実体に対する免疫応答は、自然のおよび適応性の防御を含む。自然免疫応答は、宿主において活性で持続的に機能的である第一線の免疫防御である。自然免疫細胞、例えばＮＫ細胞およびガンマ．デルタ（γδ）Ｔ細胞は、古典的なＨＬＡ抗原を認識しない。適応免疫応答は、抗原提示物質、例えば異物、細胞、または微生物に特異的に適合させる応答であり、しばしば、成熟するまでに数日を要し得る。免疫療法は、天然のまたは改変された（例えば、ＣＡＲ改変）適応免疫細胞（例えば、アルファ．ベータ（αβ）Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ）を使用する。例えば、αβＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原提示物質上のリガンドに結合すると拡大する（expand）が、これは数日をまたは数週間をも要し得る。同様に、αβＴ細胞の結合は、ＨＬＡ遺伝子複合体によってコードされるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩリガンドを認識するＣＤ４、ＣＤ８、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む１つまたは複数のＴ細胞表面分子または分子の複合体を通して起こる（Miceli et al., Semin.Immunol., 3(3):133-141 (1991)。
Miceli et al., Semin.Immunol., 3(3):133-141 (1991)
概要
本明細書において、免疫学および医学に関する組成物、そのような組成物を作製する方法、およびそのような組成物を使用する処置の方法を提供する。ある特定の態様では、様々な細胞治療のために、ガンマデルタＴ細胞（γδ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、または２つの組合せを含む、製品およびキットを含む組成物ならびに方法を提供する。同様に、これらの治療に使用するために遺伝子変更することができるガンマデルタＴ細胞（γδ）およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を作製する方法も提供する。代替の態様では、遺伝子変更されたガンマデルタＴ細胞（γδ）およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または外因性もしくは異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように改変し、これを使用して任意の細胞表面分子、例えばがん細胞または感染細胞上のマーカーを直接または間接的に標的とすることができる。
ある特定の態様では、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含有する組成物を製造する方法が提供される。本明細書に提供される方法のある特定の態様では、ドナーから得た試料（例えば、健康な対象または細胞の集団によって処置される患者である対象からの組織、臓器、または血液試料）を、（ａ）細胞接着ポリペプチドに免疫特異的に結合する少なくとも１種の外因性ポリペプチド、および（ｂ）細胞接着ポリペプチドとは異なるポリペプチドに免疫特異的に結合し、試料の１種または複数種の細胞の表面上に発現される少なくとも１種の外因性ポリペプチドを含む活性化条件に曝露し、試料を少なくとも１種の補助的ポリペプチドに接触させることを含む拡大条件に曝露し、それによってＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含有する組成物を生成する。試料は時に、活性化条件の次に拡大条件に逐次的に曝露される。本明細書に提供される方法は、集団における細胞の約３０％から約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれより多くの間、または集団における細胞の少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多く、最大１００％の高レベルの活性化をもたらし得る。
本明細書に提供される方法に使用される外因性ポリペプチドおよび補助的ポリペプチドは、一部には利用可能な核酸およびアミノ酸配列、ならびに細胞接着分子および他の免疫細胞分子および受容体に関する他の知識に基づいて、容易に同定および単離、合成することができるか、または商業的供給源由来を含むそれ以外の方法で得ることができる。ある特定の態様では、外因性ポリペプチドはヒトである。一部の態様では、外因性ポリペプチドは単離されている。ある特定の態様では、補助的ポリペプチドはヒトである。一部の態様では、補助的ポリペプチドは単離されている。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、試料は、アルファ．ベータＴ細胞を枯渇させた後に、活性化および拡大条件に曝露され、次いで得られた枯渇細胞集団は、時に活性化および拡大条件に曝露される。ある特定の態様では、上記の（ａ）の外因性ポリペプチド、上記の（ｂ）の外因性ポリペプチド、または（ａ）の外因性ポリペプチドおよび上記の（ｂ）の外因性ポリペプチドの両方が可溶性である。一部の態様では、（ａ）の外因性ポリペプチドまたは（ｂ）の外因性ポリペプチドは、固相基質に結合している。
本明細書に提供される方法の一部の態様では、少なくとも１種の補助的ポリペプチドは、集団におけるガンマ．デルタＴ細胞の量と比較したＮＫ細胞の量が、少なくとも１種の補助的ポリペプチドの量および／またはタイプに依存的であるように選択される。ある特定の態様では、補助的ポリペプチドは、枯渇細胞集団を少なくとも１種の補助的ポリペプチドに接触させた後、細胞の集団におけるガンマ．デルタＴ細胞と比較してＮＫ細胞の量を増加または減少させる。ある特定の態様では、試料またはアルファ．ベータＴ細胞枯渇試料を拡大条件に曝露する期間は、所望のＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する比が得られるように選択される。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、活性化条件は非ヒト動物由来の血清を含まない。本明細書に提供される方法の一部の態様では、拡大条件は、非ヒト動物由来の血清を含まない。
本明細書に提供される方法では、高いパーセンテージの細胞が、しばしばフィーダー細胞を使用することなく活性化される。時に、集団における細胞の少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多く、最大１００％がフィーダー細胞を使用することなく活性化される。このように、本明細書に提供される方法のある特定の態様では、活性化条件はフィーダー細胞を含まない。本明細書に提供される方法の一部の態様では、拡大条件はフィーダー細胞を含まず、時に活性化条件および拡大条件の両方がフィーダー細胞を含まない。
任意の供給源の免疫細胞を、本明細書に提供される方法において試料として使用することができる。ある特定の態様では、試料は、骨髄、末梢血、肝組織、上皮組織、および臍帯血から選択される。本明細書に提供される方法の一部の態様では、試料は、胚供給源に由来しない。本明細書に提供される方法のある特定の態様では、試料は末梢血であり、一部の態様では、末梢血試料は、本明細書に提供される方法におけるアルファ．ベータＴ細胞枯渇に供される前に処理される、処理された試料である。例えば、末梢血試料を、密度勾配遠心分離によって処理し、白血球、血小板、顆粒球等を含有するバフィーコートを分離および／または単離することができ、次にこれを本明細書に提供される方法に従ってアルファ．ベータＴ細胞枯渇に供することができる。ある特定の態様では、さらにバフィーコートにＦｉｃｏｌｌ密度勾配分離を行って単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることができ、次にこれを本明細書に提供される方法におけるアルファ．ベータＴ細胞枯渇に供することができる。一部の態様では、末梢血試料にアフェレーシスを行って、血漿を細胞から分離することができ、次いで時に細胞を、本明細書に提供される方法におけるアルファ．ベータＴ細胞枯渇に供する。本明細書に提供される方法のある特定の態様では、試料は臍帯血であり、時に臍帯血は、本明細書に提供される方法におけるアルファ．ベータＴ細胞枯渇に供される前に処理される、処理された臍帯血である。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、（ｂ）の外因性ポリペプチドは、ＮＫ細胞活性化受容体、ガンマ．デルタＴ細胞活性化受容体、または両方に免疫特異的に結合する。そのような受容体には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＡＲ受容体、ＫＩＲ受容体、ＳＩＧＬＥＣ−７、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３Ｄ５１、ＫＩＲ２ＤＬ１（抗体：１１ＰＢ６）、ＤＮＡＭ１、ＮＴＢＡ、ＨＬＡ−ＤＲ等が挙げられるがこれらに限定されない。一部の態様では、受容体はＮＫｐ４６である。本明細書に提供される方法のある特定の態様では、（ａ）の外因性ポリペプチドはＣＤ２に免疫特異的に結合する。一部の態様では、（ａ）もしくは（ｂ）、または（ａ）および（ｂ）の外因性ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片である。本明細書の目的に関して、「抗体」の列挙は、全長の抗体および抗体断片を含むその一部を含む。抗体断片には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ダイアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、または上記のいずれかの抗原結合性断片が挙げられるがこれらに限定されない。抗体はまた、合成抗体、組換えにより産生された抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびイントラボディも含む。抗体は、任意の免疫グロブリンタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）のメンバーを含み得る。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、活性化条件は、試料または枯渇細胞集団を、少なくとも２種の外因性ポリペプチドに接触させることを含む。一部の態様では、第１の外因性ポリペプチドはＣＤ２に免疫特異的に結合し、第２の外因性ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する。一部の態様では、活性化条件は、ＣＤ２に免疫特異的に結合する第１の外因性ポリペプチド、およびＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する第２の外因性ポリペプチドからなるか、またはそれから本質的になる。ある特定の態様では、ＣＤ２に免疫特異的に結合する外因性ポリペプチド、ＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する外因性ポリペプチド、またはＣＤ２に免疫特異的に結合する外因性ポリペプチドおよびＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する外因性ポリペプチドの両方が、可溶性である。ある特定の態様では、第１の外因性ポリペプチドおよび／または第２の外因性ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片である。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、拡大条件は、サイトカインである少なくとも１種の補助的ポリペプチド、および／またはガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチド、および／またはガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するその一部を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。ある特定の態様では、サイトカインはインターロイキン、例えばＩＬ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ００８６７８．１を参照されたい）、ＩＬ−２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７７８３４．１を参照されたい）、ＩＬ−４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０７０１２３．１を参照されたい）、ＩＬ−７（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０４７６９８．１を参照されたい）、ＩＬ−９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０６６２８５．１を参照されたい）、ＩＬ−１５（（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ１００９６２．１；１００９６３．１；１００９６１．１を参照されたい）、ＩＬ−２１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＬＣ１３３２５６．１を参照されたい）、またはその任意の組合せである。本明細書に提供される方法の一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、またはその組合せである。ある特定の態様では、拡大条件は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。ある特定の態様では、ガンマ．デルタＴ細胞上の受容体はＣＤ３である。一部の態様では、ガンマ．デルタＴ細胞上のＣＤ３受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片であり、ある特定の態様では、抗体はＯＫＴ３である。ある特定の態様では、拡大条件は、試料または枯渇細胞集団を、（ａ）ＩＬ−２ポリペプチド；（ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチド；（ｃ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＩＬ−１５ポリペプチド；（ｄ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体；または（ｅ）ＩＬ−２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチド、およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体に接触させることを含む。一部の態様では、ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体は、ＯＫＴ３である。
ある特定の態様では、拡大条件は、試料（例えば、供給源試料またはアルファ．ベータＴ細胞が枯渇された試料細胞集団）を１つより多くの条件セットに逐次的に曝露することを含む。一部の態様では、試料は、２つの拡大条件セットに曝露される。複数の態様では、第１の拡大条件セットに曝露された細胞の集団を洗浄した後、第２の拡大条件セットに曝露する。ある特定の態様では、（ａ）第１の条件セットはＩＬ−２を含み、第２の条件セットはＩＬ−１５を含む；（ｂ）第１の条件セットはＩＬ−１５を含み、第２の条件セットはＩＬ−２を含む；（ｃ）第１の条件セットはＩＬ−２およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体を含み、第２の条件セットはＩＬ−１５を含む；または（ｄ）第１の条件セットはＩＬ−１５およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体を含み、第２の条件セットはＩＬ−２およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体を含む。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、１種または複数種の補助的ポリペプチドを含む第１の拡大条件セットはしばしば、ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する第１の比を含む第１の細胞集団をもたらし、次にこれを第２の拡大条件セットを使用してＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する所望の最終的な比となるように微調整することができ、第１の条件セットは第２の条件セットとは異なる。
本明細書に提供される方法では、細胞集団を、活性化条件および拡大条件に同時にまたは任意の順序で逐次的に曝露することができる。さらに、外因性ポリペプチド（複数可）は、補助的ポリペプチド（複数可）として機能することができ、および／またはその逆も起こり得る。
本明細書に提供される方法によって得た免疫細胞組成物は、天然（例えば、生体液または組織）における免疫細胞の組成物と比較して、自然免疫細胞であるＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化されている。天然において、適応免疫細胞であるアルファ．ベータＴ細胞は、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞よりかなり多量に見出される。一方、本明細書に提供される組成物では、アルファ．ベータＴ細胞は、存在しないか、または無視できる量から少量で存在し、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞が主な免疫細胞構成要素である。
拡大条件に応じて、本明細書に提供される方法によって得られた自然免疫細胞に関して富化された組成物は、ガンマ．デルタＴ細胞と比較して異なる量のＮＫ細胞を含有することができる。ある特定の非制限的な例では、（ｉ）補助的ポリペプチドがＩＬ−２である場合、得られたＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団は、しばしば約２５〜３０％のＮＫ細胞および約７０〜７５％のガンマ．デルタＴ細胞を含有し；（ｉｉ）補助的ポリペプチドがＩＬ−１５である場合、得られたＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団は、しばしば約８０〜９９％のＮＫ細胞および約１〜２０％のガンマ．デルタＴ細胞を含有し；（ｉｉｉ）補助的ポリペプチドがＩＬ−２およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体、例えばＯＫＴ３である場合、得られたＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団は、しばしば約４０〜４５％のＮＫ細胞および約５５〜６０％のガンマ．デルタＴ細胞を含有し；（ｉｖ）補助的ポリペプチドが拡大条件の２０日目までＩＬ−２であり、その後３０日目までＩＬ−１５に切り替えた場合、ＩＬ−２単独による処置と比較して、ガンマ．デルタＴ細胞のパーセンテージはしばしば約５０％から約７０％に増加し、しばしばそれに対応してＮＫ細胞のパーセンテージが減少し；ならびに（ｖ）補助的ポリペプチドが拡大条件の２０日目までＩＬ−１５であり、その後３０日目までＩＬ−２に切り替えた場合、ＩＬ−１５単独による処置と比較して、ＮＫ細胞のパーセンテージはしばしば約８０％から約９０％に増加し、しばしばそれに対応してガンマ．デルタＴ細胞のパーセンテージが減少する。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、試料または枯渇細胞集団は、ＮＫ細胞またはガンマ．デルタＴ細胞について選択する条件に曝露されない。一部の態様では、試料または枯渇細胞集団は、アルファ−ベータＴ細胞以外の細胞を枯渇させる条件に曝露されない。
本明細書に提供される方法によって調製される組成物の細胞は、外因性ポリヌクレオチドを、例えば腫瘍壊死因子受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、骨髄分化一次応答タンパク質または自然免疫シグナル伝達アダプターなどを発現するようにさらに遺伝子改変することができる。細胞はまた、１種もしくは複数種のポリペプチドを変異させるように、または１種もしくは複数種のポリペプチドを枯渇させるように改変することもできる。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、ガンマ．デルタ細胞およびＮＫ細胞を含有する組成物を、それによってＮＫ細胞またはガンマ．デルタ細胞からなる、またはそれから本質的になる組成物が得られる処置に供することができる。処置は、枯渇、例えば抗ＣＤ３抗体を使用して全てのガンマ．デルタ（ＣＤ３＋）細胞を枯渇させることによってＮＫ細胞を得ること、または正の選択、例えば抗ＣＤ３抗体を使用してガンマ．デルタＴ細胞について選択することであり得る。一部の態様では、抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３抗体を、固相に結合させることができる。
本明細書に提供される方法の態様では、活性化条件、拡大条件、または活性化および拡大条件は、試料または枯渇細胞集団の、フィーダー細胞フリー培地中での約１時間、２時間、５時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、または数日間、例えば１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２５日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間、５０日間、５５日間、もしくは６０日間、もしくはそれより多くの日数、または数週間、例えば約２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、もしくは１０週間のインキュベーションを含む。ある特定の態様では、活性化条件は、約１時間、５時間、１０時間、１２時間、１５時間、または２０時間から約１日、２日、３日、４日、５日、６日、または１週間までの期間である。一部の態様では、活性化条件は、約１２時間、２４時間、３６時間、もしくは２日から約３日、４日、５日、６日、もしくは１週間までの期間、または約２日から約４日もしくは５日まで、または約３日から約４日までの期間である。ある特定の態様では、拡大条件は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、または１週間の期間である。ある特定の態様では、拡大条件は、連続サイクルで実施され、各サイクルは独立して約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、または１週間、２週間、３週間、もしくはそれより長い期間実施される。一部の態様では、拡大サイクルの数は、１より大きく、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、またはさらに１０サイクルである。ある特定の態様では、各拡大サイクルは約７日間である。一部の態様では、拡大サイクルの数は３である。
一部の態様では、拡大ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された拡大した細胞の集団は、疲弊した細胞を含まない。ある特定の態様では、拡大ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された拡大した細胞の集団は、拡大条件の６０日後に疲弊した細胞を含まない。
ある特定の態様では、本明細書に提供される方法によって得られたＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団は、８０％またはそれより多くの自然免疫細胞を含有する。一部の態様では、細胞の約８０％から約１００％の間、または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれより多く、最大１００％が自然免疫細胞である。
本明細書に提供される方法の一部の態様では、活性化条件、拡大条件、または活性化条件および拡大条件の両方は、ビスホスホネートを含まない。例示的なビスホスホネートの例には、クロドロネート、エチドロネート、アレンドロネート、パミドロネート、ゾレドロネート（ゾレドロン酸）、ネリドロネート等が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、本明細書に提供される方法によって得られた組成物は、Ｖ．デルタ．１およびＶ．デルタ．２発現に関してポリクローナルであるガンマ．デルタＴ細胞を含有する。Ｖ．デルタ．１およびＶ．デルタ．２細胞の相対量は、拡大条件、例えばビスホスホネートの非存在、補助的ポリペプチドの選択、および試料または枯渇細胞集団を拡大条件に供する期間のうちの１つまたは複数によって調整することができる。ある特定の非制限的な例では、拡大条件がＩＬ−２およびＣＤ３に免疫特異的に結合するポリペプチド（例えば、ＯＫＴ３）を含む場合、（ｉ）Ｖ．デルタ．１細胞は、ガンマ．デルタＴ細胞の約７５％から約９５％の間、時にガンマ．デルタＴ細胞の約８０％から約９０％の間であり得、（ｉｉ）Ｖ．デルタ．２細胞は、ガンマ．デルタＴ細胞の約１０％から約２５％の間、時にガンマ．デルタＴ細胞の約１０％から約１５％の間、または２０％であり得る。ある特定の態様では、拡大条件がＩＬ−２を含む（例えば、ＩＬ−１５を含まず、ＣＤ３に免疫特異的に結合するポリペプチドを含まない）場合、（ｉ）Ｖ．デルタ．１細胞はガンマ．デルタＴ細胞の約３０％から約６０％の間、時にガンマ．デルタＴ細胞の約３５％から約５５％の間であり得、（ｉｉ）Ｖ．デルタ．２細胞は、ガンマ．デルタＴ細胞の約３５％から約６０％の間、時にガンマ．デルタＴ細胞の約４０％から約５０％の間、または５５％であり得る。ある特定の態様では、拡大条件がＩＬ−１５を含む（例えば、ＩＬ−２を含まず、ＣＤ３に免疫特異的に結合するポリペプチドを含まない）場合、（ｉ）Ｖ．デルタ．１細胞は、ガンマ．デルタＴ細胞の約１０％から約３０％の間、時にガンマ．デルタＴ細胞の約２０％から約２５％の間であり得、（ｉｉ）Ｖ．デルタ．２細胞は、ガンマ．デルタＴ細胞の約６５％から約８０％の間、時にガンマ．デルタＴ細胞の約７０％から約７５％の間、または８０％であり得る。
本明細書において、ある特定の態様では、複数のＮＫ細胞および複数のガンマ．デルタＴ細胞を含み、アルファ．ベータＴ細胞が枯渇されている細胞集団を含有する組成物を提供する。一部の態様では、組成物はフィーダー細胞を含まない。同様にある特定の態様では、本明細書において、複数のＮＫ細胞および複数のガンマ．デルタＴ細胞を含み、アルファ．ベータＴ細胞が枯渇されており、フィーダー細胞を含まない細胞集団を含有する組成物を提供する。ある特定の態様では、細胞の集団は、改変された末梢血細胞の集団である。一部の態様では、本明細書に提供される組成物は、（ｉ）約２５％から約４５％の間のＮＫ細胞および約５５％から約７５％の間のガンマ．デルタＴ細胞；（ｉｉ）約２５％から約３０％の間のＮＫ細胞および約７０％から約７５％の間のガンマ．デルタＴ細胞；（ｉｉｉ）約８０％から約９９％の間のＮＫ細胞および約１％から約２０％の間のガンマ．デルタＴ細胞；または（ｉｖ）約４０％から約４５％の間のＮＫ細胞および約５５％から約６０％の間のガンマ．デルタＴ細胞を含有する。
ある特定の態様では、本明細書に提供される組成物中の細胞の３０％またはそれより多くが活性化される。一部の態様では、集団における細胞の約３０％から約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれより多くの間、または集団における細胞の少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれより多く、最大１００％。
一部の態様では、本明細書に提供される組成物は、集団における細胞の総数のパーセンテージとして以下の活性化マーカーの１つまたは複数を含む細胞の集団を含有する：（ａ）集団における細胞の９０％またはそれより多くがＫＩＲ５を発現する；（ｂ）集団における細胞の１０％またはそれより多くがＳＩＧＬＥＣ−７を発現する；（ｃ）集団における細胞の６０％またはそれより多くがＫＩＲ３Ｄ５１を発現する；（ｄ）集団における細胞の１０％またはそれより多くがＫＩＲ２ＤＬ１を発現する；（ｅ）集団における細胞の２５％またはそれより多くがＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、および／またはＮＫｐ４６を発現する；（ｆ）集団における細胞の３５％またはそれより多くがＮＫＧ２Ｄを発現する；（ｇ）集団における細胞の９０％またはそれより多くがＤＮＡＭ１を発現する；（ｈ）集団における細胞の８５％またはそれより多くがＮＴＢＡを発現する；ならびに（ｉ）集団における細胞の９５％またはそれより多くがＣＤ２を発現する。
ある特定の態様では、本明細書に提供される組成物は、８０％またはそれより多くの自然免疫細胞を含有する。一部の態様では、組成物は、ＣＤ５６＋である活性化細胞傷害性細胞に関して富化されており；ある特定の態様では、細胞の約８０％から約１００％の間、または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％がＣＤ５６＋である。一部の態様では、本明細書に提供される組成物は、ＣＤ５７−である活性化細胞傷害性細胞に関して富化されている。ある特定の態様では、本明細書に提供される組成物は、ＣＤ５６＋ＣＤ５７−である活性化細胞傷害性細胞に関して富化されている。一部の態様では、細胞の約１０％から約４０％の間、または少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、もしくは４０％がＣＤ１６＋である。ある特定の態様では、本明細書に提供される組成物中の細胞の５％未満、４％未満、３％未満、または２％未満がＣＤ５７＋である。
ある特定の態様では、本明細書に提供される組成物は、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞以外の細胞を実質的に含まない。一部の態様では、本明細書に提供される組成物は、約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．９％もしくはそれ未満、約０．８％もしくはそれ未満、約０．７％もしくはそれ未満、約０．６％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．４％もしくはそれ未満、約０．３％もしくはそれ未満、約０．２％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、もしくはそれより少ないＮＫＴ細胞、および／または約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．９％もしくはそれ未満、約０．８％もしくはそれ未満、約０．７％もしくはそれ未満、約０．６％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．４％もしくはそれ未満、約０．３％もしくはそれ未満、約０．２％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、もしくはそれより少ないアルファ．ベータＴ細胞を含有する。ある特定の態様では、組成物中のＮＫ細胞のサブセットは、ＣＤ１６＋細胞である。一部の態様では、ガンマ．デルタＴ細胞の大多数、またはＮＫ細胞の大多数、またはガンマ．デルタＴ細胞およびＮＫ細胞の両方の大多数がＣＤ５７−細胞である。
ある特定の態様では、本明細書に提供される組成物のガンマ．デルタＴ細胞は、Ｖ．デルタ．１およびＶ．デルタ．２発現に関してポリクローナルである。一部の態様では、本明細書に提供される組成物のガンマ．デルタＴ細胞集団は：（ｉ）約７５％から約９５％の間のＶ．デルタ．１細胞、例えば約８０％から約９０％の間のＶ．デルタ．１細胞；および約５％から約２５％の間のＶ．デルタ．２細胞、例えば約１０％から約１５％もしくは２０％の間のＶ．デルタ．２細胞；または（ｉｉ）約３０％から約６０％の間のＶ．デルタ．１細胞、例えば約３５％から約５５％の間のＶ．デルタ．１細胞、および約３５％から約６０％の間のＶ．デルタ．２細胞、例えば約４０％から約５０％もしくは５５％の間のＶ．デルタ．２細胞；または（ｉｉｉ）約１０％から約３０％の間のＶ．デルタ．１細胞、例えば約２０％から約２５％の間のＶ．デルタ．１細胞、および約６５％から約８０％の間のＶ．デルタ．２細胞、例えば約７０％から約７５％もしくは８０％の間のＶ．デルタ．２細胞を含有する。
ある特定の態様では、本明細書に提供される組成物のＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の約５０％から約９９％もしくはそれより多くの間、または約５０％より多くのもしくはそれに等しい、約５１％より多くのもしくはそれに等しい、約５２％より多くのもしくはそれに等しい、約５３％より多くのもしくはそれに等しい、約５４％より多くのもしくはそれに等しい、約５５％より多くのもしくはそれに等しい、約５６％より多くのもしくはそれに等しい、約５７％より多くのもしくはそれに等しい、約５８％より多くのもしくはそれに等しい、約５９％より多くのもしくはそれに等しい、約６０％より多くのもしくはそれに等しい、約６１％より多くのもしくはそれに等しい、約６２％より多くのもしくはそれに等しい、約６３％より多くのもしくはそれに等しい、約６４％より多くのもしくはそれに等しい、約６５％より多くのもしくはそれに等しい、約６６％より多くのもしくはそれに等しい、約６７％より多くのもしくはそれに等しい、約６８％より多くのもしくはそれに等しい、約６９％より多くのもしくはそれに等しい、約７０％より多くのもしくはそれに等しい、約７１％より多くのもしくはそれに等しい、約７２％より多くのもしくはそれに等しい、約７３％より多くのもしくはそれに等しい、約７４％より多くのもしくはそれに等しい、約７５％より多くのもしくはそれに等しい、約７６％より多くのもしくはそれに等しい、約７７％より多くのもしくはそれに等しい、約７８％より多くのもしくはそれに等しい、約７９％より多くのもしくはそれに等しい、約８０％より多くのもしくはそれに等しい、約８１％より多くのもしくはそれに等しい、約８２％より多くのもしくはそれに等しい、約８３％より多くのもしくはそれに等しい、約８４％より多くのもしくはそれに等しい、約８５％より多くのもしくはそれに等しい、約８６％より多くのもしくはそれに等しい、約８７％より多くのもしくはそれに等しい、約８８％より多くのもしくはそれに等しい、約８９％より多くのもしくはそれに等しい、約９０％より多くのもしくはそれに等しい、約９１％より多くのもしくはそれに等しい、約９２％より多くのもしくはそれに等しい、約９３％より多くのもしくはそれに等しい、約９４％より多くのもしくはそれに等しい、約９５％より多くのもしくはそれに等しい、約９６％より多くのもしくはそれに等しい、約９７％より多くのもしくはそれに等しい、約９８％より多くのもしくはそれに等しい、約９９％より多くのもしくはそれに等しい、約８０％より多くのもしくはそれに等しい、約８１％より多くのもしくはそれに等しい、約８２％より多くのもしくはそれに等しい、約８３％より多くのもしくはそれに等しい、約８４％より多くのもしくはそれに等しい、約８５％より多くのもしくはそれに等しい、約８６％より多くのもしくはそれに等しい、約８７％より多くのもしくはそれに等しい、約８８％より多くのもしくはそれに等しい、約８９％より多くのもしくはそれに等しい、約９０％より多くのもしくはそれに等しい、約９１％より多くのもしくはそれに等しい、約９２％より多くのもしくはそれに等しい、約９３％より多くのもしくはそれに等しい、約９４％より多くのもしくはそれに等しい、約９５％より多くのもしくはそれに等しい、約９６％より多くのもしくはそれに等しい、約９７％より多くのもしくはそれに等しい、約９８％より多くのもしくはそれに等しい、約９９％より多くのもしくはそれに等しい、またはその端数、最大１００％が、ＣＤ８＋である。一部の態様では、ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の２％未満がＣＤ４＋である。複数の態様では、ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の２％未満がＣＤ８＋ＣＤ４＋である。ある特定の態様では、ＮＫ細胞の約１５％から約３０％の間および／またはガンマ．デルタＴ細胞の約５５％から８５％の間の端数がＣＤ８−ＣＤ４−である。
本明細書に提供される組成物のある特定の態様では、集団における細胞の約３０％から約９９％もしくはそれより多くの間、または少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはその端数、最大１００％が、外因性ポリヌクレオチド、変異ポリヌクレオチド、欠失ポリヌクレオチド、またはその組合せを含む遺伝子改変をさらに含む。一部の態様では、遺伝子改変は外因性ポリヌクレオチドを含む。外因性ポリヌクレオチドは、時にレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター中にあり、時に外因性ポリヌクレオチドは、改変された細胞集団の１種または複数種の細胞のゲノムに組み込まれる。
外因性ポリヌクレオチドは、ある特定の態様では外因性または異種Ｔ細胞受容体、腫瘍壊死因子受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、骨髄分化一次応答タンパク質、および自然免疫シグナル伝達アダプター、または目的の他のタンパク質もしくはポリペプチドをコードすることができ、一部の態様では、プロモーターまたは遺伝子発現の他の調節因子を含むことができる。一部の態様では、外因性ポリヌクレオチドは、調節性配列、例えばプロモーターまたはエンハンサーである。
ある特定の態様では、外因性ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、組成物中の細胞はＣＡＲを含む。ＣＡＲは、抗原結合機能およびＴ細胞活性化機能の両方を提供する組換え受容体である（例えば、Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4):388-398 (2013)を参照されたい）。免疫細胞、例えばＴ細胞がＣＡＲを発現するように操作（遺伝子改変）されている場合、これは免疫細胞に、目的のタンパク質または抗原を標的とする新規のおよび／または改善された能力を提供する。目的の標的タンパク質または抗原は、ある特定の態様では、がん抗原または感染性疾患抗原であり得、そのいくつかは当技術分野で公知であり、および／または同定可能である。一部の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ１９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨ００５４２１．２を参照されたい）、ＧＤ２（ジシアロガングリオシド；例えば、Schulz et al., Cancer Res., 44(12):5914-5920 (1984)を参照されたい）、ＨＥＲ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３４３０９．１を参照されたい）、Ｂ７Ｈ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０６２５８１．１を参照されたい）、ＣＤ１２３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３５４０７．１；ＢＸ２９６５６３．３を参照されたい）、またはＣＤ３０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８３５５４．１；ＡＹ４９８８６０．１を参照されたい）のうちの１つまたは複数に免疫特異的に結合する結合分子部分を含有する。
本明細書に提供される任意の組成物を、ガンマ．デルタＴ細胞またはＮＫ細胞のいずれかを除去するようにさらに処置し、それによって実質的に全てのＮＫ細胞または実質的に全てのガンマ．デルタＴ細胞を含有する組成物を生成することができる。例えば、本明細書に提供される組成物を、抗ＣＤ３抗体によって処置し、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞の混合物からガンマ．デルタＴ細胞を枯渇させて、実質的に全てもしくは全てのＮＫ細胞を含有する組成物を残すか、または代替的に抗ＣＤ３抗体を使用して、混合物から実質的に純粋なガンマ．デルタＴ細胞集団を単離することができる。
ある特定の態様では、複数のガンマデルタＴ細胞（γδ）；複数のナチュラルキラー細胞（ＮＫ）；またはγδおよびＮＫ細胞の組合せを含む細胞の治療的組成物（または治療的組合せ）が提供される。ある特定の態様では、γδおよび／またはＮＫ細胞は、組換えによって操作されるかまたは遺伝子改変されており、この場合必要に応じてγδおよび／もしくはＮＫ細胞は、外因性もしくは異種タンパク質を細胞外に発現するように組換えによって操作されているかもしくは遺伝子改変されており、必要に応じて外因性、異種、もしくはキメラタンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もしくは外因性もしくは異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、必要に応じて外因性、異種、もしくはキメラタンパク質、もしくはＣＡＲは、がん細胞もしくは腫瘍マーカーもしくは感染細胞に対して特異的であり（特異的に結合することができ）、または外因性、異種、もしくはキメラタンパク質もしくはＣＡＲは、がん細胞もしくは腫瘍マーカー、もしくは感染細胞、もしくは任意の疾患関連抗原を特異的に標的としてこれに結合することができる抗体に対して特異的である（特異的に結合することができる）。
一部の態様では、γδおよび／またはＮＫ細胞は、ヒト細胞または動物細胞である。ある特定の態様では、治療的組成物（または治療的組合せ）は、静脈内（ＩＶ）、髄腔内、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、もしくは腫瘍内（ＩＴ）投与、関節腔内へのために製剤化されるか、またはがんもしくは感染症の部位もしくはその近傍に注射もしくは埋め込まれ、または必要に応じて約１０２から１０１２個の間の細胞を含む単位剤形で製剤化され、
または筋肉内（ＩＭ）投与として製剤化され、または必要に応じて約１０２から１０１２個の間の細胞を含む単位剤形で製剤化される。
一部の態様では、γδおよび／またはＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ供給源から単離される。一部の態様では、γδおよび／またはＮＫ細胞は、培養において拡大されるか、またはｉｎ ｖｉｖｏ供給源から単離され、培養において拡大される。ある特定の態様では、γδおよび／またはＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ供給源から単離され、培養においていかなるフィーダー細胞も使用することなく、またはフィーダー細胞層を使用することなく拡大され、それによってフィーダー細胞を欠如する拡大されたγδおよび／またはＮＫ細胞の集団を生成する。一部の態様では、γδおよび／またはＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ供給源から単離され、培養においてフィーダー細胞またはフィーダー細胞層を使用して拡大され、必要に応じてフィーダー細胞が実質的に除去および／または殺滅され、フィーダー細胞を実質的に欠如する拡大されたγδおよび／またはＮＫ細胞の集団を生成する。
ある特定の態様では、γδおよび／またはＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ供給源は、自己供給源（必要に応じてγδおよび／またはＮＫ細胞のレシピエントとなる個体に由来）、または外因性、異種、もしくは同種異系供給源に由来する。
同様に本明細書において、ある特定の態様では、本明細書に提供される組成物のいずれかおよび薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物も提供される。
ある特定の態様では、本明細書において、外因性ポリヌクレオチドを本明細書に提供される組成物に添加すること、本明細書に提供される組成物の１種または複数種の細胞においてポリヌクレオチドを変異させること、または本明細書に提供される組成物の１種または複数種の細胞においてポリヌクレオチドを欠失させることによって、遺伝子改変免疫細胞を作製する方法が提供される。一部の態様では、遺伝子改変は、外因性ポリヌクレオチドである。本明細書に提供される組成物を製造するために使用される方法はしばしば、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス形質導入による外因性ポリヌクレオチドの導入を容易にする高い活性化状態の細胞をもたらす。ある特定の態様では、本明細書に提供される遺伝子改変免疫細胞を作製する方法はしばしば、細胞の約３０％から約９９％もしくはそれより多くの間、または少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその端数、最大１００％が遺伝子改変を含む組成物をもたらす。
ある特定の態様では、本明細書において、本明細書に提供される組成物または医薬組成物のいずれか、必要に応じて使用のための指示、および必要に応じてサイトカインを含有するキットを提供する。本明細書に提供される組成物、医薬組成物、またはキットは、保存および／または輸送の必要に応じて、冷蔵温度、例えばセ氏１０度またはそれより低い温度、例えばセ氏９度、８度、７度、６度、５度、４度、３度、２度、１度、マイナス４度またはそれより低い温度まで、または凍結温度（例えば、マイナス１５度、マイナス２０度、マイナス２５度、マイナス３０度、マイナス３５度、マイナス４０度、マイナス４５度、マイナス５０度、マイナス５５度、マイナス６０度、マイナス６５度、マイナス７０度、マイナス７５度、マイナス８０度、マイナス８５度またはそれより低い温度）で保存することができる。ある特定の態様では、キットは、細胞約１×１０５個から細胞約１×１０１２個の間、例えば細胞約１×１０６個、細胞１×１０７個、細胞１×１０８個、細胞１×１０９個、または細胞１×１０１０個を含有する。ある特定の態様では、本明細書に提供されるキットは、サイトカインを含み得る。一部の態様では、サイトカインは、ＴＮＦ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＪ８９２２９０．１；ＡＹ２１４１６７．１を参照されたい）、ＩＦＮγ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００２１９．１を参照されたい）、インターロイキンＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１６７２０．１を参照されたい）、ＩＬ−１２（例えば、ＩＬ−１２Ａに関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４０４７７３．１；例えば、ＩＬ−１２Ｂに関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５１２６８６．１を参照されたい）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ００７４６１．１；ＢＣ００７００７．１を参照されたい）、ＩＬ−２１、ＣＣＬ４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＲ５４２１１９．１；ＫＪ９０１７２７．１；ＫＪ９０１７２６．１を参照されたい）、ＲＡＮＴＥＳ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＱ５０４０１１．１を参照されたい）、およびＴＧＦβ（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）受託番号ＮＭ＿０００６６０．７を参照されたい）のうちの１つまたは複数から選択される。ある特定の態様では、キットは、本明細書に提供される組成物または医薬組成物を単位剤形で含有する。
ある特定の態様では、本明細書に提供される細胞の治療的組合せを含む、本明細書に提供される方法を実践するための製品およびキットを提供する。ある特定の態様では、製品およびキットは、本明細書に提供される方法を実践するための指示をさらに含む。一部の態様では、製品およびキットは、がん関連、または腫瘍関連、感染症関連、または疾患関連抗原に特異的に結合することが可能な抗体をさらに含む。本明細書に提供される製品は、本明細書に提供される細胞の治療的組合せを含む埋込物を含み得る。
同様にある特定の態様では、本明細書において、がんまたは感染症を処置する方法であって、それを必要とする対象に、がんまたは感染症を処置するために有効な量の本明細書に提供される組成物、医薬組成物、またはキットのいずれか１つを投与することによる、方法が提供される。処置は、自己由来の状況または同種異系の状況で投与することができる。一部の態様では、そこから組成物、医薬組成物、またはキットが産生される試料のドナーは、処置のレシピエントである。ある特定の態様では、処置は、２日またはそれより多くの別々の日に投与することができ、ある特定の態様では、処置を複数回投与で投与することができる。ある特定の態様では、処置は、約１単位投薬量から約３６またはそれより多くの単位投薬量の間で、約２週間から約４週間の間の間隔で投与される。一部の態様では、処置は、単一単位投薬量として毎日１回、２回、３回、４回、もしくは最大５回、または数日、数週間、もしくは数ヶ月間の間に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回、もしくはそれより多くの回数、または２日毎、または週に１回、２回、３回、４回、５回、もしくは６回投与される。処置は、静脈内（ＩＶ）、髄腔内、または筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、胸膜内、関節腔内に投与することができ、またはがんもしくは感染症の部位もしくはその近傍に、対象の体重１キログラムあたり細胞約１０４から約１０１０個の間、または対象あたり細胞約１０６から約１０１２個の間の単位投薬量で注射されるかもしくは埋め込まれる。ある特定の態様では、単位投薬量は、対象あたり細胞約１０１０個、または対象の体重１キログラムあたり細胞約１０８個である。
本明細書に提供される処置の方法のある特定の態様では、処置はがんのためである。一部の態様では、がんは、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、白血病もしくはリンパ腫、ホジキンリンパ腫もしくは小児急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、肥満細胞腫もしくは肥満細胞腫瘍、卵巣がんもしくは癌、膵臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝細胞癌、網膜芽腫、乳腺腫瘍、結腸直腸癌、白血病、リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）もしくは急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、組織球肉腫、脳腫瘍、星状細胞腫、膠芽腫、神経腫、結腸癌、子宮頸癌、肉腫、膀胱腫瘍、細網内皮組織の腫瘍、ウィルムス腫瘍、骨がん、骨肉腫、腎臓がん、または頭頸部がん、口腔がん、喉頭がん、転移疾患、または口腔咽頭がんから選択される。
本明細書に提供される処置の方法のある特定の態様では、第２の薬剤は、組成物、医薬組成物、またはキットと共投与される。一部の態様では、第２の薬剤は、がん関連抗原に免疫特異的に結合する抗体である。ある特定の態様では、がん関連抗原は、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に対して特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂ７−Ｈ３、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ−５）、ＣＥＡＣＡＭ−６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素症誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＧＤ２、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓がんムチン、ＰＤ１受容体、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−Ｒ、Ｌ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムソン−フリードライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、ならびにＫｒａｓからなる群から選択される。
ある特定の態様では、本明細書に提供される組成物の細胞は、がん関連抗原に結合する抗体を発現するように操作することができる。一部の態様では、抗体は、第２の薬剤と共投与される。ある特定の態様では、がん関連抗原は、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、ＫＣ４（抗ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二特異性抗体、ＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ−５）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ−６）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ−６）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ）、ジヌツキシマブ（抗ＧＤ２）、インフリキシマブ（抗ＴＮＦ−α）、セルトリズマブペゴル（抗ＴＮＦ−α）、アダリムマブ（抗ＴＮＦ−α）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ムロモナブ−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、ＢＷＡ−３（抗ヒストンＨ２Ａ／Ｈ４）、ＬＧ２−１（抗ヒストンＨ３）、ＭＲＡ１２（抗ヒストンＨ１）、ＰＲ１−１（抗ヒストンＨ２Ｂ）、ＬＧ１１−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）、およびＬＧ２−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）から選択される。
本明細書に提供される処置の方法のある特定の態様では、処置は感染症のためである。一部の態様では、感染症は、細菌病原体、真菌病原体、ウイルス病原体、または原虫病原体の存在によって特徴付けられる。本明細書に提供される処置の方法の態様では、感染症は、ヘルペス、エボラ、ウエストナイルウイルス、ワクシニアウイルス、エプスタインバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＨＨＶ−６、ＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ、リケッチア細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｔｅｔａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ等）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ等）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｇｅｎｕｓ Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（ｍｕｃｏｒ、ａｂｓｉｄｉａ、ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、蠕虫寄生生物（鉤虫、条虫、吸虫、扁形動物（例えば、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａ）、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ、ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ Ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉからなる群から選択される。
一部の態様では、本明細書においてがん、腫瘍、機能障害細胞、または感染細胞を処置する方法であって、（ａ）それを必要とする個体に、本明細書に記載される細胞の治療的組成物の治療有効量を投与すること、または（ｂ）（ｉ）本明細書に記載される（describes herein）細胞の治療的組成物を提供するまたは提供したこと；および（ｉｉ）それを必要とする個体に、細胞の治療的組成物の治療有効量を投与するまたは投与したことを含む方法を提供する。
本明細書に提供される処置の方法のある特定の態様では、それを必要とする個体は、ヒトまたは動物である。一部の態様では、γδおよび／またはＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ供給源から単離され、必要に応じてγδおよび／またはＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ供給源は、同系または自己供給源（必要に応じて、γδおよび／またはＮＫ細胞のレシピエントとなる個体に由来）、または外因性、異種、もしくは同種異系供給源、またはその組合せに由来する。本明細書に提供される方法の態様では、細胞の治療的組成物または組合せは、静脈内（ＩＶ）、髄腔内、または筋肉内（ＩＭ）に投与され、またはがん、腫瘍、機能障害もしくは感染細胞内またはその近傍（付近）に注射または埋め込まれ、必要に応じて細胞の治療的組成物は、埋込物またはゲルとして送達され、必要に応じてゲルはハイドロゲルである。
本明細書に提供される処置の方法の一部の態様では、細胞の治療的組成物または組合せは、単位剤形で投与され、必要に応じて単位投薬量は、細胞約１０２から１０１２個の間、または細胞１０４から１０１０個の間を含み；または１日投与量は、細胞約１０２から１０１２個の間、または細胞１０４から１０１０個の間を含む。ある特定の態様では、細胞の治療的組成物または組合せまたは単位剤形は、数日間、数週間、もしくは数ヶ月間の間に、それを必要とする個体に数回（複数回）、または２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回、もしくはそれより多くの回数投与され、必要に応じて、複数の単位剤形の各々は、毎日、２日毎、週に２回、３回、４回、５回、もしくは６回、または週に１回投与される。
本明細書に提供される処置の方法のある特定の態様では、処置を必要とする個体は、最初に、それを必要とする個体に、がん関連または腫瘍関連、感染症関連または疾患関連抗原に対する非コンジュゲート抗体を予め投与し、その後本明細書に記載される細胞の治療的組成物を投与することによって、がん、感染症、または疾患に対する免疫応答を開始するように誘導され、細胞の治療的組成物の少なくとも一部は、非コンジュゲート抗体に特異的に結合するポリペプチド、必要に応じてＣＡＲをその細胞表面上に発現する。一部の態様では、それを必要とする個体は、がん関連または腫瘍関連、感染症関連または疾患関連抗原に特異的に結合することができる抗体を投与され、その後本明細書に記載される細胞の治療的組成物を投与され、細胞の治療的組成物の少なくとも一部はその細胞表面上に、抗体に特異的に結合するポリペプチド、必要に応じてＣＡＲを発現し、必要に応じて抗体は、細胞の治療的組成物の投与の前に、それと共に、またはその後に投与される。
本技術のある特定の実施形態の詳細を添付の図面および以下の説明に記載する。本技術の他の特色、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。
本明細書において引用した全ての刊行物、特許、特許出願は、全ての目的に関して参照により本明細書に明確に組み込まれている。
図面は、本技術のある特定の実施形態を例証するものであって、制限するものではない。例証を明快かつ容易にするために、図面は縮尺通りに記載されておらず、一部の例では様々な態様は、特定の実施形態の理解を容易にするために、誇張または拡大して示され得る。
図１は、培養１０日目で解析した場合の、細胞を抗体によって活性化してフィーダーフリー培養条件で拡大させた日数の関数としてのαβＴＣＲｎｅｇ単核細胞の拡大を示す図である。 図２は、活性化して拡大したαβＴＣＲｎｅｇ単核細胞集団（本明細書において、ＩＮＮＡＴＥ−ＫまたはＢＩＮＡＴＥ細胞集団と呼ぶ）の組成物の解析を示す。 図３は、フローサイトメトリーによって解析した場合のフィーダーフリーの培養で拡大した活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞の１０日目の試料におけるγδ ＴＣＲ＋細胞上のＴ細胞系列マーカー、ＣＤ４（ヘルパー）およびＣＤ８（細胞傷害性）の頻度および分布を示す図である。 図４は、１０日間のＣＡＲ．１９ ＩＮＮＡＴＥ−Ｋ細胞の拡大速度の解析を示す図である。 図５は、ＩＮＮＡＴＥ−Ｋ細胞およびＩＮＮＡＴＥ−ＣＡＲ．１９細胞を、ＣＤ１９＋白血病（２２１）またはＣＤ１９＋リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）細胞株と共培養した共培養細胞傷害アッセイからのデータを示す図である。 図６は、プレートにおいて長期間ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した拡大したＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞集団の総数を示す図である。 図７は、プレートと、バイオリアクターで拡大させたＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ集団の総細胞数の比較を示す図である。 図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ拡大の異なる時点でのサブセット細胞組成を示す図である。 図９は、長期間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養におけるＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ細胞におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子発現を示す図である。 図１０は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ集団の拡大後の活性化および細胞溶解分子の発現を示す図である。 図１１は、フィーダーフリーで拡大させたＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞およびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ細胞における疲弊の欠如を示す図である。 図１２は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫまたはＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９および４つの腫瘍細胞株による細胞傷害性共培養アッセイを示す図である。列Ａ：２２１、ＣＤ１９＋白血病細胞株；列Ｂ：Ｄａｕｄｉ、ＣＤ１９＋リンパ腫細胞株；列Ｃ：ＢＶ１７３、ＣＤ１９＋（を多様に発現する）プレ−Ｂ腫瘍細胞株；および列Ｄ：ＫＡＲＰＡＳ、ＣＤ１９−腫瘍細胞株。 図１３および図１４は、種々の試験実行におけるＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞およびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞集団の両方に関するエフェクター（Ｅ）の標的（Ｔ）に対する比の関数としての原発性腫瘍細胞の％特異的溶解を示す図である。 図１３および図１４は、種々の試験実行におけるＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞およびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞集団の両方に関するエフェクター（Ｅ）の標的（Ｔ）に対する比の関数としての原発性腫瘍細胞の％特異的溶解を示す図である。 図１５は、原発性ＣＤ１９＋白血病芽球をエフェクター細胞の非存在下で蒔いた対照条件と比較した場合の、エフェクター細胞（ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞およびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞集団）との共培養後のパーセンテージ残存原発性ＣＤ１９＋腫瘍を示す図である。 図１６は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞を投与した動物の生存曲線を示す図である。 図１７は、経時的な総細胞数によって表記した総ＢＩＮＡＴＥ拡大を示す図である（すなわち、フラスコにおけるＩＬ−２またはＩＬ−１５のいずれかを補充したＢＩＮＡＴＥ培地中の活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞の拡大、およびバイオリアクターにおける活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団のＩＬ−１５による拡大）。 図１８は、経時的な総細胞数によって表記した総ＢＩＮＡＴＥ拡大を示す図である（すなわち、フラスコにおけるＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２／ＯＫＴ３、ＩＬ−２／ＩＬ−１５、またはＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＯＫＴ３のいずれかを補充したＢＩＮＡＴＥ培地中での活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞の拡大）。 図１９は、ＩＬ−１５による拡大条件に関するマーカータイプ（活性化、細胞傷害性、および疲弊／未成熟）毎の表現型解析を示す図である。 図２０は、ＩＬ−２による拡大条件に関するマーカータイプ（活性化、細胞傷害性、および疲弊／未成熟）毎の表現型解析を示す図である。 図２１は、ＩＬ−２／ＯＫＴ３拡大条件に関するマーカータイプ（活性化、細胞傷害性、および疲弊／未成熟）毎の表現型解析を示す図である。 図２２は、ＢＩＮＡＴＥおよびＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲＧＤ２集団に関して記録したおよそ７日毎の細胞数を示す図である。 図２３は、マウス血液およびマウス肝臓の両方におけるヒトＢＩＮＡＴＥ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの維持を示す図である。 図２４は、純粋なＮＫ細胞集団を単離するおよび／または純粋なγδＴ（ｇｄ）細胞集団を単離するプロセスの例としての変形形態を例証するフローチャートを示す図である。
ある特定の態様では、本明細書において免疫細胞の有意な数または免疫細胞の大多数が自然免疫細胞である治療的免疫細胞組成物を提供する。そのような組成物は、投与後の対象において自然免疫応答を生成することができる。自然免疫系は、宿主において活性で絶えず機能的であり、迅速に応答し（感染後数分から数時間以内）、非特異的に応答して、より広い患者集団に対して「オフザシェルフの（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）」免疫療法として使用される可能性を提供する。自然免疫細胞、例えばＮＫ細胞およびガンマ．デルタ（γδ）Ｔ細胞は、古典的なＨＬＡ抗原を認識せず、したがって移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を軽減しつつオフザシェルフの（同種異系の）状況で使用することができる。自然免疫細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大させることができ、それによってサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を回避することができる。構成要素（例えば、ＮＫ細胞、ガンマ．デルタ（γδ）Ｔ細胞）および構成要素の量を調整することができる自然免疫細胞組成物を利用して、固形腫瘍および血液のがんを含む多様ながん、感染症等に対する一連の相乗的な攻撃を提供することができる。
これに対し、本明細書に記載される方法によって生成されないある特定の免疫細胞組成物は、自然免疫細胞の代わりに適応免疫細胞の大多数を含む。細胞の大多数が適応免疫細胞である免疫細胞組成物を利用する場合、認識はＨＬＡ抗原を通して行い、特に免疫療法において使用される適応免疫細胞が同種異系供給源に由来する場合、ＧｖＨＤの有意なリスクが存在する。したがって、そのような組成物において利用される適応免疫細胞は最もしばしば患者／対象（自己）に由来するかまたは指定された「マッチした」ドナーに由来し、このことは、免疫療法のレパートリー、すなわち大規模な患者集団において「オフザシェルフ」の様式でそれを使用する能力を制限する。そのような組成物を利用するほとんどの細胞治療は、自己であるか、または特異性が最も低いドナーに由来する。このことは、各患者の用量をその患者に合わせて個別に調整しなければならないことを意味する。このように、現行のＴ細胞に基づく治療的組成物、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または外因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（αβＴ細胞として）を使用する細胞治療は、「オフザシェルフ」で使用することができない。製造プロセスは６週間またはそれより長い期間を要し、その間に患者の疾患、例えばがんまたは感染症が進行し得る。同様に、これらの患者特異的製造実行の一部は、全般的な製造の失敗のみならず、化学療法または放射線療法後の患者ドナー免疫系の枯渇状態による特定の失敗を含む様々な理由により失敗している。加えて、αβＴ細胞（またはＣＡＲ改変、「ＣＡＲ−Ｔ」細胞）のｉｎ ｖｉｖｏでの拡大は、時に血液中へのサイトカインの大量の急速な放出を引き起こし、重度であり得るかまたは生命を脅かし得るＣＲＳをもたらす。
したがって、本明細書に記載される治療的免疫細胞組成物は、大多数の適応免疫細胞を含む細胞組成物に対して利点を提供する。本明細書に記載される治療的免疫細胞組成物はまた、対象から得た天然に存在する生物試料と比較して改変または変化している。治療的免疫細胞組成物、製造方法、および治療的使用を、以下に詳細に説明する。
自然免疫細胞組成物を製造する方法
本明細書において、自然免疫細胞組成物を製造する方法を提供する。本明細書に提供される方法によって製造される組成物はしばしば、２つの活性化された自然免疫細胞集団：ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびガンマ．デルタＴ細胞の混合物を含有する。
本明細書に提供される方法によって得られる免疫細胞組成物は、天然（例えば、生体液および組織）における免疫細胞の組成物と比較して、自然免疫細胞であるＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化されている。天然では、適応免疫細胞であるアルファ．ベータＴ細胞は、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞よりかなり多量に見出される。一方、本明細書に提供される組成物では、アルファ．ベータＴ細胞は、存在しないかまたは無視できる量から少量で存在し、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞が主な免疫細胞構成要素である。
例えば、ヒト末梢血では、健康なヒトドナーの末梢血において、（ｉ）年齢４０歳未満の個体の場合、ＰＢＭＣ中のＮＫ細胞のパーセンテージの中央値は５％であり、Ｔ細胞（ＣＤ８＋およびＣＤ４＋集団を合わせたもの、ガンマ．デルタＴ細胞が典型的にはＣＤ８−ＣＤ４−であることから、これはアルファ．ベータＴ細胞を表す）のパーセンテージの中央値は５３％であり；ならびに（ｉｉ）年齢４０歳より高い個体に関しては、ＰＢＭＣ中のＮＫ細胞のパーセンテージの中央値は１０％であり、Ｔ細胞（ＣＤ８＋およびＣＤ４＋集団を合わせたもの）のパーセンテージの中央値は３７％（Lepone et al., J. Circ. Biomark., 5(5):1-17 (2016)）であることが認められている。このように、末梢血において、年齢４０歳より高い個体では、循環中のＮＫ細胞１個毎におおよそほぼ４個の循環中のアルファ．ベータＴ細胞が存在し、年齢４０歳未満の個体では、循環中のＮＫ細胞１個毎におおよそほぼ１０個のアルファ．ベータＴ細胞が存在する。したがって、循環血液中のＮＫ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比は、約１：４から約１：１０の範囲である。一方、本明細書に提供される組成物では、ＮＫ細胞は組成物の２０％またはそれより多く、最大９９％を構成するが、アルファ．ベータＴ細胞は、実際には存在せず、組成物の２％未満を構成し、一般的には組成物のほぼ０％または０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満を構成する。このように、本明細書に提供される組成物において、ＮＫ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比は、少なくとも１０：１であり、一般的には１０：１よりかなり高く、例えば約１５：１もしくはそれより高く、約２０：１もしくはそれより高く、約２５：１もしくはそれより高く、約３０：１もしくはそれより高く、約３５：１もしくはそれより高く、約４０：１もしくはそれより高く、約４５：１もしくはそれより高く、約５０：１もしくはそれより高く、約５５：１もしくはそれより高く、約６０：１もしくはそれより高く、約６５：１もしくはそれより高く、約７０：１もしくはそれより高く、約７５：１もしくはそれより高く、約８０：１もしくはそれより高く、約８５：１もしくはそれより高く、約９０：１もしくはそれより高く、約９５：１もしくはそれより高く、約１００：１もしくはそれより高く、約１５０：１もしくはそれより高く、約２００：１もしくはそれより高く、約２５０：１もしくはそれより高く、約３００：１もしくはそれより高く、約３５０：１もしくはそれより高く、約４００：１もしくはそれより高く、約４５０：１もしくはそれより高く、約５００：１もしくはそれより高く、約５５０：１もしくはそれより高く、約６００：１もしくはそれより高く、約６５０：１もしくはそれより高く、約７００：１もしくはそれより高く、約７５０：１もしくはそれより高く、約８００：１もしくはそれより高く、約８５０：１もしくはそれより高く、約９００：１もしくはそれより高く、約９５０：１もしくはそれより高く、または約１０００：１もしくはそれより高い。このように、アルファ．ベータＴ細胞は、天然ではＮＫ細胞と比較して多量に存在するが、本明細書に提供される組成物では、ＮＫ細胞集団はアルファ．ベータＴ細胞集団と比較して大きく増加している。
例えば末梢血中のガンマ．デルタＴ細胞に関して、Ｔ細胞の約１０％未満、一般的にはＴ細胞の約５％がガンマ．デルタＴ細胞であるが、残りはアルファ．ベータＴ細胞である（Esin et al., Scand. J. Immunol., 43(5):593-596 (1996); Radestad et al., J. Immunol. Res., Article ID 578741 (2014)）。したがって、循環血中のガンマ．デルタＴ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比は、約１：１０から約１：２０の範囲である。一方、本明細書に提供される組成物では、ガンマ．デルタＴ細胞は、組成物の１％またはそれより多くを構成し、一般的には組成物の２％またはそれより多くから最大７０〜７５％の間を構成するが、アルファ．ベータＴ細胞は実際には存在せず、組成物の２％未満を構成し、一般的には組成物のほぼ０％または０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、もしくは０．１％未満を構成する。このように、本明細書に提供される組成物では、ガンマ．デルタＴ細胞が１％で存在し、アルファ．ベータＴ細胞が２％で存在する組成物を仮定しても、ガンマ．デルタＴ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比は少なくとも０．５：１である。一般的に、本明細書に提供される組成物中のガンマ．デルタＴ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比はかなり高く、例えば約５：１もしくはそれより高く、約１０：１もしくはそれより高く、約１５：１もしくはそれより高く、約２０：１もしくはそれより高く、約２５：１もしくはそれより高く、約３０：１もしくはそれより高く、約３５：１もしくはそれより高く、約４０：１もしくはそれより高く、約４５：１もしくはそれより高く、約５０：１もしくはそれより高く、約５５：１もしくはそれより高く、約６０：１もしくはそれより高く、約６５：１もしくはそれより高く、約７０：１もしくはそれより高く、約７５：１もしくはそれより高く、約８０：１もしくはそれより高く、約８５：１もしくはそれより高く、約９０：１もしくはそれより高く、約９５：１もしくはそれより高く、約１００：１もしくはそれより高く、約１５０：１もしくはそれより高く、約２００：１もしくはそれより高く、約２５０：１もしくはそれより高く、約３００：１もしくはそれより高く、約３５０：１もしくはそれより高く、約４００：１もしくはそれより高く、約４５０：１もしくはそれより高く、約５００：１もしくはそれより高く、約５５０：１もしくはそれより高く、約６００：１もしくはそれより高く、約６５０：１もしくはそれより高く、約７００：１もしくはそれより高く、または約７５０：１もしくはそれより高い、またはそれより高い。
本明細書において使用される用語「富化された」は、本明細書に提供される組成物中の以下の２つの比：（ｉ）ガンマ．デルタＴ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比、および（ｉｉ）ＮＫ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比が、天然における、例えば末梢血などの生物試料中のこれらの比より高いことを意味する。一般的に本明細書で使用される場合、「富化された」は、本明細書に提供される組成物中のガンマ．デルタＴ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比が、生物試料、例えば組織、臍帯血、または末梢血中の比と比較して、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、または７５０倍、またはそれより大きく増加していることを意味する。ＮＫ細胞の場合、一般的に本明細書で使用される場合、「富化された」は、本明細書に提供される組成物中のＮＫ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比が、生物試料、例えば組織、臍帯血、または末梢血中の比と比較して、少なくとも４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、または１０００倍、またはそれより大きく増加していることを意味する。ある特定の態様では、用語「富化された」は、本明細書に提供される組成物が、１より大きいＮＫ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比、およびガンマ．デルタＴ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比を有することを意味する（この比は、一般的に天然では１未満である）。
末梢血において、適応免疫細胞であるＢ細胞およびアルファ．ベータＴ細胞は、リンパ球の大多数を構成する。一方、本明細書に提供される方法によって製造される組成物は、自然免疫細胞、すなわちＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化されている。用語アルファ．ベータＴ細胞およびαβＴ細胞は、本明細書において互換的に使用され、適応免疫Ｔ細胞を指すが、用語ガンマ．デルタＴ細胞およびγδＴ細胞は、本明細書において互換的に使用され、自然免疫Ｔ細胞を指す。
自然免疫細胞で構成される免疫療法の組成物は、多様な理由から適応免疫細胞を含有する組成物と比較して有利である。自然免疫応答は、非特異的であり、感染後数分から数時間以内に目的の標的（例えば、がんまたは感染性疾患）に対して開始される。自然免疫細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大させることができる。本明細書に提供される方法では、拡大条件は、拡大後６０日間もの間疲弊しないＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞の組成物をもたらすことができ、これは長期間の保存（在庫保存および必要な場合再投与に適している）を可能にし、複数回投与を費用効果的に投与することを可能にする。一方、適応免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで標的抗原に結合すると、抗原特異的免疫応答を開始し、拡大するが、これは数日をまたは数週間をも要し得る。さらに、自然免疫とは異なり、適応免疫応答は、ＨＬＡ抗原に依存することから、ＧｖＨＤ（移植片対宿主病）を最小限または回避するためには、細胞が自己であるかまたはレシピエント患者／対象に「マッチ」する必要がある。本明細書に提供される方法によって作製された組成物中の自然免疫細胞、例えばＮＫ細胞およびガンマ．デルタ（γδ）Ｔ細胞を含有する組成物は、殺滅を媒介するためにＨＬＡ抗原認識を必要とせず、したがって、より広範囲のオフザシェルフ（同種異系）の状況でＧｖＨＤを回避しつつ使用することができる。適応免疫細胞はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで拡大させると大量のサイトカインを産生し得て、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）をもたらし得るが、自然免疫細胞はｅｘ ｖｉｖｏで拡大させることができ、それによってＣＲＳを最小限にするかまたは回避する。
本明細書に提供される方法では、細胞、例えば末梢血または臍帯血を含有する試料は対象から得られる。対象は一般的に、健康なドナーであるが、本明細書に提供される方法によって作製された免疫療法組成物による処置を必要とする患者でもあり得る。ある特定の態様では、試料が末梢血である場合、末梢血のユニバーサルドナーバンクを、試料の供給源として使用することができる。試料は時に、活性化条件に供され、これは試料を、（ａ）細胞接着ポリペプチドに免疫特異的に結合する少なくとも１種の外因性ポリペプチド、および（ｂ）細胞接着ポリペプチドとは異なるポリペプチドに免疫特異的に結合し、試料集団の１種または複数種の細胞の表面上に発現される少なくとも１種の外因性ポリペプチドに接触させることを含む。細胞接着ポリペプチドの例には、ＣＤ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＪ９０５１６１．１；ＫＪ８９６５５８．１を参照されたい）、ＬＦＡ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ００５８６１．２を参照されたい）、ＬＦＡ−３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ００５９３０．１を参照されたい）、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８Ａに関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨ００３２１５．２；ＡＹ０３９６６４．１を参照されたい；例えば、ＣＤ８Ｂに関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＪ８９６５６２．１；ＢＣ１００９１１．１；ＢＣ１００９１２．２；ＢＣ１００９１３．１；ＢＣ１００９１４．１を参照されたい）、およびＣＤ４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３５１６０．１；ＤＱ８９２０５２．２を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。試料集団の１種または複数種の細胞、例えばＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタ細胞の表面上に発現されるポリペプチドの例には、ＣＤ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＪ９０５１６１．１；ＫＪ８９６５５８．１を参照されたい）、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３γに関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ５８３１６２．１を参照されたい；例えば、ＣＤ３εに関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ５８３１３９．１を参照されたい；例えば、ＣＤ３δに関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨ００２６１２．２を参照されたい）、ＣＤ５６（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６３０４１．１；ＢＣ０４７２４４．１；ＢＣ０２９１１９．１を参照されたい）、ＮＫｐ３０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０５５８８１．１を参照されたい）、ＮＫｐ４４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ１６６６４７．１を参照されたい）、ＮＫｐ４６（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０６４８０６．１；ＡＹ３４６３７３．１を参照されたい）、ＮＫＧ２Ａ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４６１８１２．１；ＢＣ０５３８４０．１を参照されたい）、ＰＤ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２７４４０．１を参照されたい）、ＮＫＧ２Ｃ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０９３６４４．１；ＢＣ１１２０３９．１を参照されたい）、ＮＫＧ２Ｄ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４６１８１１．１；ＢＣ０３９８３６．１を参照されたい）、ＫＡＲ受容体、ＫＩＲ受容体、ＳＩＧＬＥＣ−７（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１９３４４１．１；ＡＦ１７０４８５．１を参照されたい）、ＫＩＲ３ＤＳ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ１５６１７５．１を参照されたい）、ＫＩＲ２ＤＬ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＬＴ９８４７９０．１；ＬＴ９８４７９１．１；抗体：１１ＰＢ６を参照されたい）、ＤＮＡＭ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０７４７８７．２；Ｕ５６１０２．１を参照されたい）、ＮＴＢＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ１１４４９５．１；ＢＣ１１３８９３．１を参照されたい）、ＨＬＡ−ＤＲ（例えば、αに関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨ００１５０６．２；βに関してはＡＨ００２８２４．２を参照されたい）等が挙げられるがこれらに限定されない。細胞の活性化は、一般的に本明細書に提供される組成物の細胞において自然免疫応答を開始し、これを使用してそのような疾患の処置を必要とする対象における疾患、例えばがんまたは感染性疾患を標的とすることができる。
ポリペプチドは、それが代替のエピトープと比較してそのエピトープに対してより頻繁に、より迅速に、より長い期間および／またはより高い親和性で反応または会合する場合、別の分子の領域（すなわちエピトープ）に免疫特異的に結合する。例えば、第１のエピトープに免疫特異的に結合するポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、第２のエピトープまたは他のエピトープにそれが結合するより高い親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い期間、この第１のエピトープに結合する抗体である。第１の標的に免疫特異的に結合するポリペプチドは、第２の標的に特異的または優先的に結合してもしなくてもよく、免疫特異的結合は必ずしも排他的結合ではない。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、活性化条件は、試料を、少なくとも２種の外因性ポリペプチドに接触させることを含む。一部の態様では、第１の外因性ポリペプチドは、ＣＤ２に免疫特異的に結合し、第２の外因性ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する。一部の態様では、活性化条件は、ＣＤ２に免疫特異的に結合する第１の外因性ポリペプチド、およびＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する第２の外因性ポリペプチドからなるか、またはそれから本質的になる。語句「から本質的になる」は、本明細書で使用される場合、列挙した構成要素以外の構成要素が存在しても、列挙した構成要素の活性を実質的に変化させないことを意味する。このように、例えば上記の活性化条件の文脈において、活性化条件は、ＣＤ２に免疫特異的に結合する第１の外因性ポリペプチド以外、およびＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する第２の外因性ポリペプチド以外の、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドの活性を実質的に変化させない１種または複数種の構成要素を含んでもよい。ある特定の態様では、第１の外因性ポリペプチドおよび／または第２の外因性ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片である。
また、試料はしばしば、試料を少なくとも１種の補助的ポリペプチドに接触させ、それによってＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物を生成することを含む拡大条件に供される。本明細書に提供される方法のある特定の態様では、拡大条件は、サイトカインである少なくとも１種の補助的ポリペプチドおよび／またはガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドを含む。ある特定の態様では、サイトカインは、インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはその任意の組合せである。本明細書に提供される方法の一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、またはその組合せである。複数の態様では、拡大条件は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。ある特定の態様では、ガンマ．デルタＴ細胞上の受容体はＣＤ３である。一部の態様では、ガンマ．デルタＴ細胞上のＣＤ３受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片であり、ある特定の態様では、抗体はＯＫＴ３である。ある特定の態様では、拡大条件は、試料を、（ａ）ＩＬ−２ポリペプチド；（ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチド；（ｃ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＩＬ−１５ポリペプチド；（ｄ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体；または（ｅ）ＩＬ−２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチド、およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体に接触させることを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の態様では、ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体は、ＯＫＴ３である。
一部の態様では、活性化条件は、試料を、ＣＤ２に免疫特異的に結合する第１の外因性ポリペプチドおよびＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する第２の外因性ポリペプチドに接触させることからなるか、またはそれから本質的になり、拡大条件は、試料を、（ａ）ＩＬ−２ポリペプチド；（ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチド；（ｃ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＩＬ−１５ポリペプチド；（ｄ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体；または（ｅ）ＩＬ−２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチド、およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体に接触させることからなるか、またはそれから本質的になる。一部の態様では、ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体はＯＫＴ３である。
ある特定の態様では、組成物を製造するための本明細書に提供される方法には、活性化および拡大前に、試料からアルファ．ベータＴ細胞を枯渇させ、それによって枯渇された細胞集団を生成し、次にそれらに活性化および拡大を行うことが含まれる。例えば、アルファ．ベータＴ細胞は、アルファ．ベータＴ細胞受容体、例えばアルファ．ベータＴＣＲに免疫特異的に結合する抗体を使用して試料から枯渇させることができる。用語「枯渇された」は、本明細書で使用される場合、枯渇される構成要素（例えば、アルファ．ベータＴ細胞）の実質的に全てが試料から除去されている、例えば枯渇される構成要素の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより多く、最大約１００％が試料から除去されていることを意味する。一般的に、用語「枯渇細胞集団」は、本明細書で使用される場合、試料からアルファ．ベータＴ細胞を枯渇させた後の試料に由来する細胞の集団を指す。ある特定の態様では、試料は、例えばＢ細胞受容体に免疫特異的に結合するポリペプチド、例えばＣＤ１９を使用してＢ細胞をさらに枯渇させる。
例えば、試料が末梢血試料である場合、試料を、密度勾配遠心分離によって処理し、白血球細胞、血小板、顆粒球等を含有するバフィーコートを分離および／または単離することができ、次にこれを本明細書に提供される方法に従ってアルファ．ベータＴ細胞枯渇に供することができる。ある特定の態様では、さらにバフィーコートにＦｉｃｏｌｌ密度勾配分離を行って単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることができ、次にこれを本明細書に提供される方法におけるアルファ．ベータＴ細胞枯渇に供することができる。一部の態様では、末梢血試料にアフェレーシスを行って、血漿を細胞から分離することができ（例えば、Ｔｅｒｕｍｏ Ｏｐｔｉａ機器を使用して）、ある特定の態様では、次に細胞を、本明細書に提供される方法におけるアルファ．ベータＴ細胞枯渇に供する。アルファ．ベータＴ細胞枯渇は、当業者に公知の方法によって実施することができる。ある特定の態様では、アルファ．ベータＴ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムを使用して枯渇させることができる。一部の態様では、アフェレーシス産物に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｃｌｉｎｉｍａｃｓ分離デバイスを使用してアルファ．ベータＴ細胞枯渇を行うことができる。枯渇させた細胞集団を、必要な場合、または望ましい場合、凍結保存（例えば、セ氏マイナス７０度、マイナス７５度、マイナス８０度、マイナス８５度またはそれより低い温度）することができ、活性化および拡大するまで保存することができる。活性化および拡大のための培養条件の非制限的な例には、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタ細胞を含有する細胞集団に関して本明細書の実施例の節に記載される活性化および拡大条件、または５％ＡＢ血清を補充したＮＫ ＭＡＣＳ（商標）培地（＃１３０−１０７−８７９（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）または当技術分野で使用される他の培地（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）が挙げられる。
ある特定の態様では、細胞集団は、本明細書に記載される活性化および拡大条件の前に、ＮＫ細胞について正に選択する条件にも、ガンマ．デルタＴ細胞について正に選択する条件にも曝露されない。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、試料または枯渇細胞集団は、（ａ）の外因性ポリペプチド、（ｂ）の外因性ポリペプチド、または（ａ）の外因性ポリペプチドおよび（ｂ）の外因性ポリペプチドの両方が可溶性である活性化条件に供される。複数の態様では、（ａ）の可溶性の外因性ポリペプチド、（ｂ）の可溶性の外因性ポリペプチド、または（ａ）および（ｂ）の両方の可溶性の外因性ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片である。本明細書において構成要素、例えばポリペプチドに関連して使用される用語「可溶性」は、構成要素が固相や支持体に結合せず、培養条件（例えば、活性化条件、拡大条件）において均一な単一相または乳液の状態であることを意味する。一部の態様では、（ａ）または（ｂ）の外因性ポリペプチド、例えば抗体は、固相または支持体に結合する。固相支持体の例には、シリカ、ガラス（例えば、ガラス、孔制御ガラス（ＣＰＧ））、ナイロン、Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｒｅｓｉｎ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、セルロース、磁気ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、金属表面（例えば、スチール、金、銀、アルミニウム、シリコン、および銅）、プラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ））が挙げられるがこれらに限定されない。固相支持体は、ビーズ、チップ、キャピラリー、プレート、膜、ウェーハ、コーム、ピン、実質的に平坦な表面、ピットまたはナノリットルウェルのアレイ、ならびに当業者に公知の他の幾何模様および形状を含むがこれらに限定されない任意の所望の形態であり得る。固相支持体に結合したポリペプチドではなく可溶性の外因性ポリペプチドを使用することは、方法のスケーラビリティを増加させながら（例えば、ＧＭＰ製造のための）立体障害を軽減することができる。ある特定の態様では、第１の外因性ポリペプチドは可溶性抗ＣＤ２抗体であり、第２のポリペプチドは可溶性抗ＮＫｐ４６抗体である。ある特定の態様では、抗ＣＤ２抗体または抗ＮＫｐ４６抗体のいずれかは固相支持体に結合している。
抗体、例えばポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、標準的な方法を使用して調製することができる（例えば、Kohler et al., Nature 256:495-497 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976)；およびＷＯ０２／４６４５５を参照されたい）。例えば、ポリクローナル抗体を生成するために、宿主動物において目的の抗原に対する免疫応答を誘発する。次に宿主動物から血液を収集し、分泌された抗体を含有する血清画分を、当業者に公知の方法を使用して細胞画分から分離する。モノクローナル抗体を生成するために、動物を標準的な方法によって免疫し、抗体分泌体細胞を産生する。次に、これらの細胞を、免疫した動物から取り出して骨髄腫細胞と融合させる。抗体を産生することができる体細胞、特にＢ細胞を、骨髄腫細胞株と融合させるために使用することができる。これらの体細胞は、プライミングした動物のリンパ節、脾臓、および末梢血に由来し得る。ハイブリドーマ産生融合技法において使用するための特殊な骨髄腫細胞株が、リンパ性腫瘍から作製されている（Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976); Shulman et al., Nature, 276:269-282 (1978); Volk et al., J. Virol., 42:220-227 (1982)）。これらの細胞株は３つの有用な特性を有する。第１は、ハイブリドーマの成長を支持する選択培地中で成長できないようにする酵素欠損を有することによって、非融合の同様に無限に自己繁殖する骨髄腫細胞からの融合ハイブリドーマの選択をそれらが容易にすることである。第２は、それらが抗体産生能を有し、内因性の軽鎖や重鎖免疫グロブリンを産生できないことである。第３の特性は、それらが他の細胞と効率的に融合することである。ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を産生する他の方法は、当業者に周知である。任意のポリペプチド、例えば免疫細胞集団上の抗原性マーカーに対する抗体を産生することは慣例的である。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、活性化条件、拡大条件、または活性化条件および拡大条件の両方は、フィーダー細胞フリーである。用語「フリー」は、本明細書において使用される場合（例えば、フィーダー細胞を含まないまたはフィーダー細胞フリー、血清フリー、非ヒト動物からの血清を含まない、疲弊した細胞を含まない）は、条件が、構成要素（すなわち、フィーダー細胞、血清、疲弊した細胞、または本明細書において言及される他の構成要素）を実質的に含まない、すなわち少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、一般的に９５％またはそれより多く、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多く、最大で１００％含まないことを意味する。本明細書に提供される方法のある特定の態様では、試料、活性化条件、拡大条件、または活性化および拡大条件、または前述の全ては、外因性の細胞を含まない、外因性のフィーダー細胞を含まない、放射線照射細胞を含まない、および／または放射線照射フィーダー細胞を含まない。外因性の細胞および外因性のフィーダー細胞は一般的に、試料細胞が得られ、活性化および／または拡大条件に供される対象または対象の部分と比較して、異なる対象に由来する細胞であるか、または対象の異なる部分に由来する細胞である。非制限的な例では、（ｉ）試料細胞は第１の種の対象に由来し、外因性細胞は第２の種の対象に由来する（例えば、試料細胞はヒトに由来し、外因性細胞は非ヒト動物、例えば齧歯類またはサルに由来する）、および（ｉｉ）試料細胞はヒト対象の末梢血に由来し、外因性細胞は同じ対象の異なる部分に由来する（例えば、同じ対象の臍帯血もしくは臓器に由来するか、または異なるヒト対象に由来する）。組成物は一般的に、試料が以下：活性化および／または拡大前の処理、活性化、ならびに拡大の１つまたは全ての間にある特定の構成要素に接触していない場合、その構成要素を「含まない」。
Ｋ５６２細胞などのフィーダー細胞に依存することは、細胞を培養する場所および方法を制限し得、細胞を培養する費用を有意に増加させ得る。フィーダー細胞の使用はまた、フィーダー細胞に由来する定義されない生物学的因子によって引き起こされる細胞培養のばらつきのために問題となり得る。加えて、フィーダー細胞は、望まれない作用物質（agent）（例えば、レトロウイルス、他の病原体、および免疫原性の非ヒトシアル酸、例えばＮｅｕ５Ｇｃ）を、本明細書に提供される方法によって作製される組成物に導入する可能性を有し、このことは、例えば移植などのある特定の応用にとって不都合であり得る。理論に拘束されたくはないが、本明細書に提供される方法では、細胞接着ポリペプチドに免疫特異的に結合する外因性ポリペプチドが、「内因性のフィーダー細胞様の層」を生成することができ、それによって外因性のフィーダー細胞を必要とすることなく、有意に活性化して拡大した細胞集団を生成することができる。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、拡大条件における補助的ポリペプチド（複数可）および／または拡大時間の選択は、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞の所望の相対量に合わせて調整することができる。例えば、相対的により多くのＮＫ細胞および相対的により少ないガンマ．デルタＴ細胞を含有する組成物は、一般的に固形腫瘍に対してより大きい適用性を有するが、相対的により多くのガンマ．デルタＴ細胞および相対的により少ないＮＫ細胞を含有する組成物は一般的に、血液悪性疾患に対してより大きい適用性を有する。補助的ポリペプチド（複数可）を選択することができ、ならびに／または拡大反応は、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞の所望の比率を有する組成物を得ることを容易にする時間、実施することができる。ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する所望の比率は、特定の拡大条件の選択によって得ることができ、組合せの非制限的な例は、以下の通りである：（ｉ）補助的ポリペプチドがＩＬ−２である場合、得られたＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団はしばしば、約２５〜３０％のＮＫ細胞および約７０〜７５％のガンマ．デルタＴ細胞を含有し；（ｉｉ）補助的ポリペプチドがＩＬ−１５である場合、得られたＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団はしばしば、約８０〜９９％のＮＫ細胞および約１〜２０％のガンマ．デルタＴ細胞を含有し；（ｉｉｉ）補助的ポリペプチドがＩＬ−２およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体、例えばＯＫＴ３である場合、得られたＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団はしばしば、約４０〜４５％のＮＫ細胞および約５５〜６０％のガンマ．デルタＴ細胞を含有し；（ｉｖ）補助的ポリペプチドが拡大条件の２０日目までＩＬ−２であり、その後３０日目までＩＬ−１５に切り替えた場合、ＩＬ−２単独による処置と比較してガンマ．デルタＴ細胞のパーセンテージはしばしば約５０％から約７０％へと増加し、これに対応してＮＫ細胞のパーセンテージは減少し；ならびに（ｖ）補助的ポリペプチドが拡大条件の２０日目までＩＬ−１５であり、その後３０日目までＩＬ−２に切り替えた場合、ＩＬ−１５単独による処置と比較して、ＮＫ細胞のパーセンテージはしばしば約８０％から約９０％へと増加し、これに対応してガンマ．デルタＴ細胞のパーセンテージは減少する。
拡大条件の期間（例えば、１２日間と２５日間の比較）もまた、本明細書に提供される方法によって作製された組成物中のＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞の相対量を制御することができる。例えば、拡大条件下でのフィーダー細胞フリー培地中の試料または枯渇細胞集団のインキュベーションの長さは、約７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２５日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間、５０日間、５５日間、もしくは６０日間もしくはそれより多くの日数、または約２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、もしくは１０週間であり得る。本明細書に提供される方法のある特定の態様では、組成物は、疲弊した細胞を含まず、一部の態様では、組成物は、拡大条件の少なくとも６０日後、疲弊した細胞を含まない。疲弊した細胞を実質的に含まない細胞組成物を調製することは、拡大した細胞傷害性細胞組成物のｅｘ ｖｉｖｏでの利用能の増加により、多くの現行の免疫療法（例えば、アルファ．ベータＴ細胞を使用するＣＡＲ−Ｔ）のわずかな費用での即時の処置および複数回投与を可能にする。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、活性化、または拡大、または活性化および拡大条件は、ビスホスホネートを含まず、Ｖ．デルタ．１およびＶ．デルタ．２ガンマ．デルタＴ細胞のポリクローナル集団をもたらす。ビスホスホネート、例えばゾレドロネートおよびパミドロネートの使用は、他の集団よりガンマ．デルタＴ細胞の１つのクローン性集団にとって好都合であり得るが、これはある特定の腫瘍および感染症に対する組成物のレパートリーを制限し得る。一部の態様では、本明細書に提供される方法にビスホスホネートが存在しないことにより、ガンマ．デルタＴ細胞に関してポリクローナルである組成物が生成され、それによってそれらを免疫療法として投与することができるがんおよび感染性疾患の範囲を増加させる。
本明細書に提供される方法を行うためのステップの概要の非制限的な例は以下の通りである：
（１）ドナーからの試料（例えば、ドナーから直接のまたは血液バンクからの末梢血）を必要に応じて融解し、培養する；（２）望ましい場合、培養物をアルファ．ベータＴ細胞枯渇、必要に応じてＢ細胞枯渇に供する；（３）試料または枯渇後に残っている細胞（枯渇細胞集団）を、活性化条件に３〜４日間供し、活性化細胞を生成する；（４）望ましい場合、活性化細胞に、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用して外因性ポリヌクレオチドを形質導入する；（５）（３）における活性化後または（４）における形質導入後、細胞を、７日サイクルの拡大条件に供し、サイクル間で洗浄し、一般的に２〜３サイクル行い、それによって拡大した細胞を生成し、これを時に直ちに使用するか、またはあるときには冷蔵する、氷中で維持するか、または免疫療法のために必要となるまで輸送および／または保存のために凍結保存する。ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞の比率は、望ましい場合、７日間サイクルの間の補助的ポリペプチドの切り替えを含む、拡大の間に使用する補助的ポリペプチド（複数可）の選択によって、および拡大時間を制御することによって、調整することができる。
ある特定の態様では、活性化および拡大条件に曝露される試料細胞集団に起因する組成物は、以下の特徴：
（ｉ）１より大きい（例えば、約１．５もしくはそれより大きい、２もしくはそれより大きい、３もしくはそれより大きい、４もしくはそれより大きい、または５もしくはそれより大きい比；約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、またはそれより大きい比）ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する比；または
（ｉｉ）１未満（例えば、約０．８またはそれ未満、０．７またはそれ未満、０．６またはそれ未満、０．５またはそれ未満、０．１またはそれ未満、０．０５またはそれ未満、０．０１またはそれ未満の比；約０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２、０．００１またはそれ未満の比）のＮＫ細胞のガンマ−デルタＴ細胞に対する比；
を有し、必要に応じて以下の特徴：
（ｉｉｉ）２より大きい、３より大きい、４より大きい、５より大きい、６より大きい、７より大きい、８より大きい、９より大きい、１０より大きい、２０より大きい、３０より大きい、４０より大きい、５０より大きい、６０より大きい、７０より大きい、８０より大きい、９０より大きい、１００より大きい、２００より大きい、３００より大きい、４００より大きい、５００より大きい、６００より大きい、７００より大きい、８００より大きい、９００より大きい、１０００より大きい、またはそれより大きい、ＮＫ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比；
（ｉｖ）２より大きい、３より大きい、４より大きい、５より大きい、６より大きい、７より大きい、８より大きい、９より大きい、１０より大きい、２０より大きい、３０より大きい、４０より大きい、５０より大きい、６０より大きい、７０より大きい、８０より大きい、９０より大きい、１００より大きい、２００より大きい、３００より大きい、４００より大きい、５００より大きい、６００より大きい、７００より大きい、８００より大きい、９００より大きい、１０００より大きい、またはそれより大きい、ガンマ−デルタＴ細胞のアルファ．ベータＴ細胞に対する比；
（ｖ）２０％またはそれより大きいＮＫ細胞の総細胞に対するパーセンテージ；
（ｖｉ）２％、３％、４％、５％、またはそれより大きい、ガンマ．デルタＴ細胞の総細胞に対するパーセンテージ；
（ｖｉｉ）ガンマ．デルタＴ細胞の約７５％から約９５％（例えば、ガンマ．デルタＴ細胞の約８０％から約９０％（例えば、約８５％））がＶ．デルタ．１を発現すること；
（ｖｉｉｉ）ガンマ．デルタＴ細胞の約１０％から約２５％（例えば、約１０％から約２０％（例えば、ガンマ．デルタＴ細胞の約１５％）がＶ．デルタ．２を発現すること；
（ｉｘ）ガンマ．デルタＴ細胞の約３０％から約６０％（ガンマ．デルタＴ細胞の約３５％から約５５％）がＶ．デルタ．１を発現すること；
（ｘ）ガンマ．デルタＴ細胞の約３５％から約６０％（例えば、ガンマ．デルタＴ細胞の約４０％から約５０％または５５％）がＶ．デルタ．２を発現すること；
（ｘｉ）ガンマ．デルタＴ細胞の約１０％から約３０％（例えば、ガンマ．デルタＴ細胞の約２０％から約２５％）がＶ．デルタ．１を発現すること；
（ｘｉｉ）ガンマ．デルタＴ細胞の約６５％から約８０％（例えば、約７０％から約８０％（例えば、ガンマ．デルタＴ細胞の約７５％）がＶ．デルタ．２を発現すること；
（ｘｉｉｉ）総細胞の約８０％またはそれより多く（例えば、細胞の約９０％またはそれより多く）がＫＩＲ５を発現すること；
（ｘｉｖ）総細胞の約５％またはそれより多く（例えば、細胞の約１０％またはそれより多く）がＳＩＧＬＥＣ−７を発現すること；
（ｘｖ）総細胞の約５０％またはそれより多く（例えば、細胞の約６０％またはそれより多く）がＫＩＲ３Ｄ５１を発現すること；
（ｘｖｉ）総細胞の約５％またはそれより多く（例えば、細胞の約１０％またはそれより多く）がＫＩＲ２ＤＬ１を発現すること；
（ｘｖｉｉ）総細胞の約２０％またはそれより多く（例えば、細胞の約２５％またはそれより多く）がＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６を発現すること；
（ｘｖｉｉｉ）総細胞の約２５％またはそれより多く（例えば、細胞の３５％またはそれより多く）がＮＫＧ２Ｄを発現すること；
（ｘｉｘ）総細胞の約８０％またはそれより多く（例えば、細胞の約９０％またはそれより多く）がＤＮＡＭ１を発現すること；
（ｘｘ）総細胞の約７５％またはそれより多く（例えば、細胞の約８５％またはそれより多く）がＮＴＢＡを発現すること；
（ｘｘｉ）総細胞の約８５％またはそれより多く（例えば、細胞の約９５％またはそれより多く）がＣＤ２を発現すること；
（ｘｘｉｉ）総細胞の約８０％から約１００％（例えば、細胞の少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）がＣＤ５６を発現すること；
（ｘｘｉｉｉ）総細胞の約５１％から約１００％（例えば、細胞の少なくとも約５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）がＣＤ５７を発現しないこと；
（ｘｘｉｖ）総細胞の約１０％から約４０％（例えば、細胞の少なくとも約１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、または４０％）がＣＤ１６を発現すること；
（ｘｘｖ）総細胞の約１０％またはそれ未満（例えば、細胞の約５％またはそれ未満、４％またはそれ未満、３％またはそれ未満、２％またはそれ未満）がＣＤ５７を発現すること；
（ｘｘｖｉ）総細胞の約５０％またはそれより多く（例えば、細胞の約５５％またはそれより多く）がＫＩＲ３ＤＳ１を発現すること；
（ｘｘｖｉｉ）総細胞の約５％またはそれ未満（例えば、約４％またはそれ未満、３％またはそれ未満、２％またはそれ未満、１％またはそれ未満、０．９％またはそれ未満、０．８％またはそれ未満、０．７％またはそれ未満、０．６％またはそれ未満、０．５％またはそれ未満、０．４％またはそれ未満、０．３％またはそれ未満、０．２％またはそれ未満、０．１％またはそれ未満）がＮＫＴ細胞であること；
（ｘｘｖｉｉｉ）総細胞の約５％またはそれ未満（例えば、約４％またはそれ未満、３％またはそれ未満、２％またはそれ未満、１％またはそれ未満、０．９％またはそれ未満、０．８％またはそれ未満、０．７％またはそれ未満、０．６％またはそれ未満、０．５％またはそれ未満、０．４％またはそれ未満、０．３％またはそれ未満、０．２％またはそれ未満、０．１％またはそれ未満）がアルファ．ベータＴ細胞であること；
（ｘｘｉｘ）ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタ細胞の約５０％またはそれより多く（例えば、ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の約５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその端数、最大１００％）がＣＤ８を発現すること；
（ｘｘｘ）ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の約５％またはそれ未満（例えば、ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、または約１％もしくはそれ未満）がＣＤ４を発現すること；
（ｘｘｘｉ）ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の約５％またはそれ未満（例えば、ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、または約１％もしくはそれ未満）がＣＤ８およびＣＤ４を発現すること；
（ｘｘｘｉｉ）ＮＫ細胞の約１５％から約３５％（例えば、ＮＫ細胞の１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％）がＣＤ８およびＣＤ４を発現しないこと；ならびに
（ｘｘｘｉｉｉ）ガンマ．デルタＴ細胞の約５５％から約８５％（例えば、ガンマ．デルタＴ細胞の約５６％、５８％、６０％、６２％、６３％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％）がＣＤ８もＣＤ４も発現しないこと
のうちの１つまたは複数を有する。
自然免疫細胞組成物
本明細書に記載される製造方法によって調製されるある特定の組成物は、ＢＩＮＡＴＥ組成物と呼ばれる。ＢＩＮＡＴＥ組成物は、２つの自然細胞タイプ、すなわちＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞を含有し、これらの２つの細胞タイプの相対量は、その使用順序および拡大条件の期間を含む適した補助的ポリペプチドまたは複数のポリペプチドを選択することによって、固形腫瘍、血液のがん、または感染性疾患を処置するために調整することができる。
一部の態様では、ＢＩＮＡＴＥ組成物は、フィーダー細胞を含有せず、しばしばこれらの組成物はフィーダー細胞を含まない（例えば、外因性のフィーダー細胞および／または放射線照射フィーダー細胞を含まない）。ある特定の態様では、活性化および拡大条件は、ビスホスホネートを含まず、それによってポリクローナルガンマ．デルタＴ細胞は、腫瘍および感染性疾患に対してより広いレパートリーの活性を有するようになる（すなわち、Ｖ．デルタ．１およびＶ．デルタ．２ガンマ．デルタＴ細胞に関してポリクローナル）。この自然免疫細胞プラットフォームは、本明細書において互換的にＢＩＮＡＴＥ細胞、ＩＮＮＡＴＥ細胞、またはＩＮＮＡＴＥ−Ｋ細胞と呼ばれ、包括的に腫瘍シグナルおよび受容体の両方に結合することができ、固形腫瘍、血液のがん、および感染症に関して容易に利用可能な汎用性が高い治療を提供する。自然免疫療法の安全性が改善されたことにより、コミュニティホスピタルでの使用が可能となり、医療費を低減させ、より多くの患者に有効な処置をもたらすことができる。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるＢＩＮＡＴＥ細胞組成物をさらに処置して、目的の細胞集団について積極的に選択する、または望ましくない細胞集団を除去するマーカーを使用して、実質的に全てのＮＫ細胞（本明細書において「ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ」と呼ばれる）または実質的に全てのガンマ．デルタＴ細胞を含有する組成物を生成することができる。
本明細書に提供されるＢＩＮＡＴＥ組成物は、固形腫瘍および血液の悪性疾患の両方を標的化するために、ａ）移植後または他の状況／適応における非遺伝子改変細胞；ｂ）他の治療剤、例えばがんの処置のための市販の抗体と組み合わせて投与される非遺伝子改変細胞；またはｃ）例えば内因性のポリヌクレオチドを変異させることによる、内因性のポリヌクレオチドを欠失させることによる、もしくは外因性の変異ポリヌクレオチド（野生型は非改変細胞にある）を付加することによる、もしくは異種性質の外因性ポリヌクレオチド、例えばＣＡＲポリヌクレオチド（ＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ）を付加することによる遺伝子改変細胞として開発することができる。ＣＡＲ改変ＩＮＮＡＴＥ−Ｋ（ＢＩＮＡＴＥと同じ）またはＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ集団は、本明細書において以下の用語のいずれかによって示される。
一般的にＣＡＲによって改変された免疫細胞の場合、細胞は、ピリオドまたはハイフンの後に「ＣＡＲ」接尾子が付いた、例えばＩＮＮＡＴＥ−ＣＡＲ、ＩＮＮＡＴＥ−Ｋ．ＣＡＲ、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ．ＣＡＲ、およびＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲと呼ばれる；ならびに
特定のＣＡＲ、例えばＣＤ１９を標的とするＣＡＲによって改変された免疫細胞の場合、細胞は、ピリオドまたはハイフンの後に「ＣＤ１９」、「ＣＡＲ１９」、または「ＣＡＲ．ＣＤ１９」接尾子が付いた、例えばＢＩＮＡＴＥ．ＣＤ１９、ＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ１９、またはＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１９と互換的に呼ばれる。
本明細書に提供される製造方法は、集団における細胞の約３０％から約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれより多くの間、または集団における細胞の少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い、最大１００％の高レベルの活性化を有するＢＩＮＡＴＥ細胞集団をもたらす。比較すると、ｉｎ ｖｉｖｏで自然免疫応答を誘発すると、１０％またはそれ未満の細胞が活性化される。
これらの活性化された細胞は非常に細胞傷害性であり、有意な比率のＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞（例えば、本明細書に提供される組成物中のＮＫ細胞集団の約４０％がＣＤ５６＋ＣＤ１６＋であり得る）を有する。本明細書において使用される場合、細胞上の細胞マーカーの説明に関連する「＋」記号、または用語「プラス」は、マーカーが細胞において（または細胞表面上に）発現されることを示しているが、細胞上の細胞マーカーの説明に関連して「−」記号、または用語「マイナス」は、マーカーが存在しないまたは検出されないことを示している。
本明細書に提供される組成物のＢＩＮＡＴＥ細胞の細胞傷害性は高いが、大多数の細胞のＣＤ５７マーカーレベルが低い（高いＣＤ５７マーカーレベルは、細胞傷害性（cytoxicity）を示しているが、同様に細胞が老化により近いことも示しており、したがってより短い寿命を有する（Kared et al., Cancer Immunol. Immunotherap., 65(4):441-452 (2016)を参照されたい））ことからその成熟度は低い（すなわち、それらは老化からより離れている）。本明細書において使用される用語「大多数」は、集団における細胞の５０％より多く、一般的に５０．５％またはそれより多く、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその端数、最大１００％を意味する。本明細書に提供される製造方法によって作製されたＢＩＮＡＴＥ細胞組成物はまた、低レベルの疲弊マーカー、例えばＰＤ−１およびＴＩＭ−３を有する。本明細書に提供される製造方法に従って異なる拡大条件下で得られたＢＩＮＡＴＥ組成物に関する活性化／細胞傷害性／疲弊マーカー表現型の非制限的な例を、以下に要約する。
Figure 2021532829
ある特定の態様では、本明細書に提供されるＢＩＮＡＴＥ組成物の細胞を遺伝子改変することができる。遺伝子改変のある特定の非制限的な例には、（ｉ）所望の活性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを付加すること、（ｉｉ）内因性ポリヌクレオチドを変化させるかもしくは付加する、または所望の活性を有する内因性ポリペプチドの発現を調節する外因性の調節性ポリヌクレオチド（例えば、プライマーまたはエンハンサー）を付加すること、（ｉｉｉ）所望の活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドを変化させるおよび／または妨害すること（例えば、挿入変異誘発）、（ｉｖ）所望の活性を有するポリペプチドの発現を調節する調節性ポリヌクレオチドを部分的もしくは完全に欠失させて、それによってその調節を妨害すること、ならびに／または（ｖ）所望の活性を有するポリペプチドをコードするコード配列を部分的もしくは完全に欠失させて、それによって活性を減弱または除去すること（例えば、ノックアウト変異誘発）が挙げられる。
一部の態様では、ＢＩＮＡＴＥ組成物は、外因性（調節性またはコード配列）ポリヌクレオチドを付加することによって遺伝子改変される。ＢＩＮＡＴＥ組成物の高度に活性化された細胞を、高い効率で、しばしば集団における細胞の８０％またはそれより高く、一般的には少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはその端数、最大１００％を形質導入することができる。この形質導入率は、適応免疫細胞（例えば、アルファ．ベータＴ細胞では約９％）についてしばしば認められる率よりかなり高い。
ある特定の態様では、外因性ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、組成物中の細胞はＣＡＲを含む（「ＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ細胞」と呼ぶ）。一部の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＧＤ２、ＨＥＲ３、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１２３、またはＣＤ３０のうちの１つまたは複数に免疫特異的に結合する結合分子部分を含有する。
本明細書に提供されるＢＩＮＡＴＥ細胞およびＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ細胞を使用して、多様ながんおよび感染性疾患（例えば、ＧＤ２／ＨＥＲ３／Ｂ７Ｈ３：肺／気管支、前立腺、乳房、結腸、膵臓、卵巣；ＣＤ１２３：白血病；ＣＤ３０：非ホジキンリンパ腫；肝臓および肝臓内胆管がん、食道がん、膀胱がん、腎臓および腎盂がん、子宮がん、脳／神経系がんを含む他のがん）を標的とすることができる。ＧＤ２、ジシアロガングリオシドもまた、神経外胚葉起源の腫瘍細胞の表面上に発現されることが見出されている。ＧＤ２発現を有する腫瘍は、高い死亡率を有する（小児腫瘍−神経芽腫、網膜芽腫、肉腫；成人腫瘍−黒色腫、非小細胞肺がん、乳がん）。現在、治療として試験されているモノクローナル抗体は、神経因性疼痛の毒性により制限を有する。ＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ．ＧＤ２構築物による最初の試験は、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞の両方において同等の高レベルの形質導入を示す（ＮＫ細胞では約８０％、ガンマ．デルタＴ細胞では約４０〜６０％）；発現は、ＢＩＮＡＴＥ培養期間において安定であり、維持される。加えて、固形腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅が観察された（実施例１８）。
医薬組成物およびキット
本明細書に提供される組成物のいずれも、薬学的に許容される担体と共に医薬組成物として製剤化することができる。組成物と同様に、本明細書に提供される医薬組成物は、がんおよび感染性疾患を処置するために使用することができる。同様に、本明細書において、本明細書に提供される組成物または医薬組成物、および必要に応じて使用のための指示を含有するキットも提供される。ある特定の態様では、本明細書に提供されるキットは、サイトカインを含み得る。自然免疫細胞は、一部には過多のサイトカインおよびケモカインを放出して他の細胞と連携させ、それによって免疫応答を統合することによって、広範囲のウイルス病原体、真菌病原体、細菌病原体、および寄生生物病原体による日和見侵襲を制御する。
医薬組成物またはキットは時に、治療細胞の特定の投薬量を含み、時に医薬組成物またはキットは、治療細胞の単位投薬量を提供する。ある特定の態様では、単位投薬量は、意図される対象の体重１キログラムあたり細胞約１０４から約１０１０個、または対象あたり細胞約１０６から約１０１２個の間（例えば、対象あたり細胞約１０１０個または意図される対象の体重１キログラムあたり細胞約１０８個）である。
医薬組成物またはキットは、薬学的に許容される担体を含み得る。用語「薬学的に許容される」は、動物、より詳しくはヒトにおいて使用するために、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識された薬局方に収載されていることを意味する。用語「担体」は、それと共に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全および不完全）、賦形剤、またはビヒクルを指す。組成物が注入によって投与される場合、これは滅菌の製薬等級の水または食塩水を含有する注入ボトルに分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。
医薬組成物は時に、本明細書に記載の方法によって調製された細胞の治療的組成物を単独でまたはそのような薬学的に許容される担体と共に充填した、１つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットとして提供される。加えて、疾患の処置にとって有用な１種または複数種の他の予防剤または治療剤もまた、薬学的パックまたはキットに含めることができる。薬学的パックまたはキットは、本明細書に記載される医薬組成物の１種または複数種の成分を充填した１つまたは複数の容器を含み得る。必要に応じて、医薬品または生物製剤の製造、使用、または販売を規制する政府当局によって規定された書式の通知（notice）をそのような容器（複数可）に関連付けることができ、その通知はヒトでの投与のための製造、使用、または販売に関する当局の承認を反映する。薬学的パックまたはキットは時に、１つまたは複数の容器に疾患の処置にとって有用な１種または複数種の他の予防剤および／または治療剤を含む。
細胞をｅｘ ｖｉｖｏで拡大させた後に免疫療法として投与する場合、細胞は時に、単独ではサイトカインの十分量を産生しない。本明細書に提供されるキットに必要に応じて追加され得るサイトカインには、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、インターロイキン類、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＣＣＬ４／ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＧＦβが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の態様では、本明細書に提供される医薬組成物および／またはキットは、必要に応じて、本明細書に提供される組成物と共投与するための第２の薬剤を含む。用語「共投与する（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、「共投与する（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｓ）」、「共投与」等は、本明細書において使用される場合、薬剤が、本明細書に提供される自然細胞組成物の前、後、または併せて投与されることを意味する。
一部の態様では、第２の薬剤はがん細胞抗原または感染病原体を標的とする抗体である。本明細書に提供される組成物、医薬組成物、およびキットは、保存または輸送のため適宜、マイナス４℃またはそれ未満、または約マイナス７５℃から約マイナス８０℃で維持することができる。
遺伝子改変された自然細胞組成物を作製する方法
本明細書に提供される自然細胞組成物は、適した様式で（例えば、遺伝子または調節性配列である外因性ポリヌクレオチドを付加することによって、内因性遺伝子を変異させることによって、または内因性遺伝子を欠失させることによって）遺伝子改変することができる。遺伝子改変は、最終組成物を得た後、活性化および拡大に続いて実施することができるか、または活性化後で細胞に拡大を行う前に実施することができる。様々な遺伝子改変を作製する方法の非制限的な例を以下に記載する：
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９標的化抑制（永続的な遺伝子／遺伝子座の欠失）
細胞に、ＣＡＳ９タンパク質および目的の遺伝子に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の両方を発現するＤＮＡプラスミドをトランスフェクトすることができる。ゲノムにおけるｇＲＮＡ−ＣＡＳ９媒介性の切断は、ドナーＤＮＡプラスミドを使用して修復することができ、これは標的遺伝子の特異的欠失および遺伝子コードタンパク質の永続的かつ完全な喪失を引き起こす。タンパク質発現の喪失は、ＰＣＲ（ＤＮＡレベル）、ノザンブロット／ＦＩＳＨ（ＲＮＡレベル）、または任意のタンパク質アッセイ、例えばウエスタンブロットもしくはフローサイトメトリーを使用して検証することができる。
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９標的化発現（永続的な遺伝子／遺伝子座の挿入）
この方法を使用して、細胞ゲノムの特定の位置に目的の遺伝子を挿入することができる。細胞に、特異的挿入位置に対して特異的なＣＡＳ９タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の両方を発現するＤＮＡプラスミドをトランスフェクトすることができる。ゲノムにおけるｇＲＮＡ−ＣＡＳ９媒介性の切断は、ＤＮＡ切断（cut）／二本鎖切断（break）の位置の両側で細胞ゲノムの配列に挟まれた挿入された目的の遺伝子を有するドナーＤＮＡプラスミドを使用して修復することができ、ランダムではない特異的ゲノム位置における目的の遺伝子の相同組換え媒介挿入を引き起こす。挿入の成功およびタンパク質発現は、ＰＣＲ（ＤＮＡレベル）、ノザンブロット／ＦＩＳＨ（ＲＮＡレベル）、または任意の適したタンパク質アッセイ、例えばウエスタンブロットもしくはフローサイトメトリーを使用して検証することができる。
（ｃ）ｓｈＲＮＡ／マイクロＲＮＡのレトロウイルス／レンチウイルス／トランスポゾン媒介形質導入によるＲＮＡ干渉（永続的な遺伝子抑制）
目的の特異的遺伝子／タンパク質を標的とするｓｈＲＮＡ／マイクロＲＮＡを設計し、細胞ゲノムに安定に組み込むためにレトロウイルス／レンチウイルス／トランスポゾンベクターにおいてクローニングすることができる。細胞にベクターを形質導入し、形質導入に成功した細胞を、ベクターがコードする選択マーカーを使用して選択することができる。目的の遺伝子のｓｈＲＮＡ媒介抑制を、例えばノザンブロットおよびタンパク質アッセイを使用して評価することができる。
（ｄ）レンチウイルス／γ−レトロウイルス媒介ランダム／多重コピー遺伝子挿入
目的の特異的遺伝子／タンパク質を設計し、および／または細胞ゲノムへの安定なランダム組み込みのためにレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターにおいてクローニングすることができる。細胞にウイルスベクターを形質導入し、形質導入に成功した細胞を、ベクターがコードする選択マーカーを使用して選択することができる。目的の遺伝子のｓｈＲＮＡ媒介抑制は、ノザンブロットおよび任意の適したタンパク質アッセイ、例えばウエスタンブロット、フローサイトメトリー等を使用して評価することができる。
（ｅ）トランスポゾン媒介ランダム／多重コピー遺伝子挿入
目的の特異的遺伝子／タンパク質を設計、および／または哺乳動物トランスポゾンベクター系、例えばＰｉｇｇｙＢａｃ（ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または等価物においてクローニングした。細胞に、末端逆位反復（ＩＴＲ）配列に挟まれた目的の遺伝子（ｃＤＮＡ）を有するトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼベクターを共トランスフェクトすることができる。トランスポザーゼ酵素は、目的の遺伝子のＴＴＡＡ染色体組み込み部位への移入を媒介することができる。形質導入に成功した細胞を必要に応じて、ベクターコード選択マーカーを使用して選択することができる。挿入の成功およびタンパク質の発現は、ＰＣＲ（ＤＮＡレベル）、ノザンブロット／ＦＩＳＨ（ＲＮＡレベル）、または任意の適したタンパク質アッセイ、例えばウエスタンブロットもしくはフローサイトメトリーを使用して検証することができる。
（ｆ）直接トランスフェクション
目的の遺伝子／タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞に直接トランスフェクトすることができる。トランスフェクションは、任意の確立された方法論、例えば塩化カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、Ｘｆｅｃｔ、電気穿孔、ソノポレーション、およびｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ（例えば、ｓｉＲＮＡを導入する）を使用して実施することができる。
処置の方法
同様に、がんまたは感染症を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書においてがんまたは感染症を処置するために有効な量の本明細書に提供される組成物、医薬組成物、またはキットのいずれかを投与することによる、方法も提供される。処置は、自己由来の状況または同種異系の状況で投与することができる。組成物、医薬組成物、またはキットが作製される試料のドナーは、処置のレシピエントであり得る。しばしば、組成物、医薬組成物、またはキットは、１人の対象由来の試料から調製され、処置は異なる対象に投与される。ある特定の態様では、処置は、２日またはそれより多くの別々の日に投与することができ、ある特定の態様では、処置を複数回投与で投与することができる。ある特定の態様では、処置は約２週間から約４週間の間の間隔で約１単位投薬量から約３６単位またはそれより多くの投薬量の間で投与される。一部の態様では、処置は、単一単位投薬量として毎日１回、２回、３回、４回、もしくは最大５回、または数日間、数週間、もしくは数ヶ月間の間に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回、もしくはそれより多い回数、または２日毎、または週に１回、２回、３回、４回、５回、もしくは６回投与される。処置は、静脈内（ＩＶ）、髄腔内、または筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、胸膜内、関節腔内に投与することができ、またはがんもしくは感染症の部位もしくはその近傍に、対象の体重１キログラムあたり細胞約１０４から約１０１０個の間、または対象あたり細胞約１０６から約１０１２個の間の単位投薬量で、注射されるかもしくは埋め込まれる。ある特定の態様では、単位投薬量は、対象あたり細胞約１０１０個、または対象の体重１キログラムあたり細胞約１０８個である。
本明細書に提供される処置の方法のある特定の態様では、処置はがんのためである。一部の態様では、がんは固形腫瘍である。複数の態様では、がんは血液のがんである。ある特定の態様では、がんは血液のがんであり、ガンマ．デルタＴ細胞のＮＫ細胞に対する比は１より大きい。一部の態様では、がんは固形腫瘍であり、ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する比は１より大きい。本明細書に提供される処置の方法のある特定の態様では、第２の薬剤は、組成物、医薬組成物、またはキットと共投与される。一部の態様では、第２の薬剤は、がん関連抗原に免疫特異的に結合する抗体である。
本明細書に提供される処置の方法のある特定の態様では、処置は感染症のためである。一部の態様では、感染症は細菌病原体、真菌病原体、ウイルス病原体、または原虫病原体の存在によって特徴付けられる。
本明細書に提供される方法のある特定の態様では、組成物、医薬組成物、またはキットは、ガンマ．デルタＴ細胞（例えば、Ｖ．デルタ．１およびＶ．デルタ．２ガンマ．デルタＴ細胞に関してポリクローナル）のポリクローナル集団を含有する。
本技術を、本明細書に記載される実施例を参照してさらに説明する。しかし、本技術はそのような実施例に限定されないと理解すべきである。
以下に記載の実施例は、ある特定の実施形態を例証するが、本技術を制限するものではない。
以下の材料を、以下に記載されるある特定の方法に（例えば、活性化条件、拡大条件、表現型解析）おいて使用した。
以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｏ Ｂａｍｂｉｎｏ Ｇｅｓｕ（ＯＰＢＧ）、“Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｔｕｍｏｒ”研究所において生成された：
ｃ２１８（ＩｇＧ１、抗ＣＤ５６）、ｃ１２７（ＩｇＧ１、抗ＣＤ１６）、ＡＺ２０およびＦ２５２（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗ＮＫｐ３０）、ＢＡＢ２８１およびＫＬ２４７（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗ＮＫｐ４６）、Ｚ２３１（ＩｇＧ１、抗ＮＫｐ４４）、ＥＣＭ２１７およびＢＡＴ２２１（それぞれＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ１、抗ＮＫＧ２Ｄ）、ＫＲＡ２３６、ＧＮ１８およびＦ５（それぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＭ、抗ＤＮＡＭ−１）、ＥＡ４（ＩｇＧ２ａ、抗ＣＤ１８）、ＭＡＲ２０６、ＭＡ２５８およびＱＡ１９６（それぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＭ、抗ＣＤ２）、ＭＡ１２７およびＯＮ５６（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ、抗ＮＴＢ−Ａ）、ＰＰ３５、ＳＴ３９およびＣＯ５４（それぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ１ａおよびＩｇＭ、抗２Ｂ４）、ｚ２７（ＩｇＧ１、抗ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１）、ＡＺ１５８（ＩｇＧ２ａ、抗ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｌ２／Ｓ１）、ｚ２７０、ｚ１９９およびＹ９（それぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＭ、抗ＮＫＧ２Ａ）、６Ａ４およびＡ６／１３６（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗ＨＬＡ−クラスＩ）、Ｄ１／１２（ＩｇＧ２ａ、抗ＨＬＡ−ＤＲ）、５Ａ１０（ＩｇＧ１、抗ＰＶＲ）、Ｌ１４（ＩｇＧ２ａ、抗ネクチン−２）、ＢＡＭ１９５（ＩｇＧ１、抗ＭＩＣＡ）。
Ｆ２７８（ＩｇＧ１、抗ＣＤ８５ｊ）ｍＡｂは、Ｄｒ．Ｄａｎｉｅｌａ Ｐｅｎｄｅ、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｇｉａｎｎｉｎａ Ｇａｓｌｉｎｉ、Ｇｅｎｏａ、Ｉｔａｌｙによって寄贈された（同様に例えば、Costa et al., Aids, 15:965-974 (2001)も参照されたい）。抗ＮＫＧ２Ｃ（ＩｇＧ２ｂ、１３４５２２クローン）、抗ＵＬＢＰ−１（ＩｇＧ２ａ、１７０８１８クローン）、抗ＵＬＢＰ−２（ＩｇＧ２ａ、１６５９０３クローン）、抗ＵＬＢＰ−３（ＩｇＧ２ａ、１６６５１０クローン）、抗ＣＤ３４−ＡＰＣ（ＩｇＧ１、ＱＢＥｎｄ１０クローン）、ＩｇＧ−ＡＰＣアイソタイプ対照（ＩｇＧ１クローン１１７１１）および抗ＫＩＲ２ＤＬ１−ＦＩＴＣまたは非コンジュゲート（ＩｇＧ１、１４３２１１クローン）ｍＡｂは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から購入した。抗ＫＩＲ２ＤＬ１／Ｓ１−Ｖｉｏｂｌｕｅまたは−ＰＥ（ＩｇＧ１、１１ＰＢ６クローン）、抗ＮＫＧ２Ｃ−ＶｉｏｂｒｉｇｈｔＦＩＴＣ（ＲＥＡ２０５クローン）、抗ＫＩＲ３ＤＬ１−ビオチンまたは−ＦＩＴＣ（ＩｇＧ１、ＤＸ９クローン）、抗ＣＤ３−Ｖｉｏｇｒｅｅｎ（ＩｇＧ２ａ、ＢＷ２６４／５６クローン）、抗ＣＤ５７−Ｖｉｏｂｌｕｅ（ＩｇＭ、ＴＢ０３クローン）、抗ＳＩＧＬＥＣ−７−Ｖｉｏｂｌｕｅ（ＲＥＡ２１４クローン）、抗ＮＫｐ３０−ＰＥ（ＩｇＧ１、ＡＦ２９−４Ｄ１２クローン）、抗ＮＫｐ４６−ＰＥ（ＩｇＧ１、９Ｅ２クローン）、抗ＮＫｐ４４−ＰＥ（ＩｇＧ１、２．２９クローン）、抗ビオチン−ＰｅｒＣＰＶｉｏ７００（ＲＥＡ７４６クローン）、ＲＥＡ対照ＶｉｏＢｒｉｇｈｔ ＦＩＴＣ（クローンＲＥＡ２９３）、抗ＰＤ−１（ＩｇＧ２ｂ、ＰＤ１．３．１．３クローン）ｍＡｂは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。抗ＣＤ３４（ＩｇＧ１、ＱＢＥｎｄ１０クローン）、抗ＮＫＧ２Ａ−ＰＣ７（ｚ１９９クローン）、抗ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１−ＰＥ（ｚ２７クローン）、抗ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３／Ｓ２−ＰＥ（ＧＬ１８３クローン）、抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ＩｇＧ１、Ｊ３−１１９クローン）、抗ＣＤ５６−ＰＣ７（ＩｇＧ１、Ｎ９０１クローン）、ＩｇＧ１−ＰＣ７または−ＰＥまたは−ＦＩＴＣアイソタイプ対照（６７９．１Ｍｃ７クローン）ｍＡｂは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。抗ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３−Ｓ２−ＦＩＴＣまたは非コンジュゲート（ＩｇＧ２ｂ、ＣＨＬ−クローン）、抗ＣＤ１０７−ＰＥ（ＩｇＧ１、Ｈ４Ａ３クローン）、抗ＣＤ８５ｊ（ＩｇＧ２ｂ、ＧＨＩ／７５クローン）、抗ＣＤ１６−ＰｅｒＣｐＣｙ５．５（ＩｇＧ１、３Ｇ８クローン）、抗ＣＤ５６−ＢＶ５１０（ＩｇＧ２ｂ、ＮＣＡＭ１６．２クローン）、ＩｇＧ１−ＰＥアイソタイプ対照（クローンＭＯＰＣ−２１）ｍＡｂおよびＢｒｉｌｌａｎｔ Ｓｔａｉｎバッファは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得た。抗ＨＬＡ−Ｂｗ６−ＦＩＴＣおよび抗ＨＬＡ−Ｂｗ４−ＦＩＴＣ ｍＡｂは、ＯＮＥ ＬＡＭＢＤＡ ＩＮＣ（Ｃａｎｏｇａ Ｐａｒｋ、ＣＡ）から購入した。抗ヒトＨＬＡ−Ｅ（ＩｇＧ１、３Ｄ１２クローン）および抗ヒトＨＬＡ−Ｇ（ＩｇＧ１、ＭＥＭ−Ｇ／９クローン）ｍＡｂはそれぞれ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＡｂｎｏｖａ（Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）から購入した。抗ＮＫＧ２Ｄ（ＩｇＧ２ａ、５Ｃ６クローン）および抗ＨＬＡ−Ｃ（ＩｇＧ１、Ｃ−８クローン）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）から購入した。
拡大条件の場合、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびＯＫＴ３は、ビーズに架橋させたまたは結合させた抗ＣＤ２および抗ＮＫｐ４６抗体と同様にＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。
（実施例１）
αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団由来の特定の自然細胞溶解性免疫細胞（ＩＮＮＡＴＥ−Ｋ）集団の富化および拡大
本実施例は、フィーダーフリー培養条件で、免疫グロブリンサブファミリー表面分子の１種または複数種に対する抗体によって活性化された、出発のαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団から主にＮＫおよびγδＴＣＲ＋Ｔ細胞からなる特定の自然細胞溶解性免疫細胞集団（本明細書においてＩＮＮＡＴＥ−ＫまたはＢＩＮＡＴＥ細胞集団と呼ぶ）を、富化および拡大させるプロセスを記載する（この拡大したＴ細胞集団の組成の解析に関しては図２を参照されたい；用語ＩＮＮＡＴＥ−ＫおよびＢＩＮＡＴＥは本明細書において互換的に使用されてもよく、ＮＣＲ抗体（例えば、抗ＮＫｐ４６）およびＬＦＡ抗体（例えば、抗ＣＤ２）の組合せによって活性化され、ＮＫ細胞およびγδＴ細胞の混合物を含有する本明細書において考察される細胞集団を指す）。
１．大規模ロイコフェレーシスを、Ｇ−ＣＳＦによって動員されている正常で健常なドナーについて実施した；あるいは、大規模ロイコフェレーシスを、動員を行っていない正常で健常なドナーについて実施するかまたはバフィーコートを使用する。
２．Ｆｉｃｏｌｌ（商標）による密度勾配細胞分離を、ＳＥＰＡＸ（商標）デバイス（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ ＤＥ）によって実施し、赤血球、血小板、および顆粒球を除去し、単核細胞浮遊液を得た；Ｆｉｃｏｌｌ（商標）勾配分離を実施する代替の方法は、ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＰＲＯＤＩＧＹ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）または遠心分離器による手動での分離を含む。
３．単核細胞を、臨床規模のＭＩＬＴＥＮＹＩ ＣＬＩＮＩＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して製造元の指示に従ってαβＴ細胞枯渇に供したか、または実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離に供した。
４．得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、フィーダーフリーの培養条件に置き、抗ＣＤ２および抗ＮＫｐ４６ビーズ（ＮＫ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ））ならびに５００ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって製造元の指示に従って活性化した。
５．活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５％ＡＢ血清および５００ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）を補充したＮＫ ＭＡＣＳ（商標）培地（＃１３０−１０７−８７９（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ））を用いるフィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた後、Ｔ７５フラスコに移した；代替の培養容器は、バイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ（商標）２５ｍｌ、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ ＭＮ）を含み得る。
６．培地交換をおよそ３日毎に新鮮な培地および新鮮なＩＬ−２によって、＃５に記載の濃度で行い、細胞を０．２５から０．５×１０６個／ｍｌの濃度で播種した。方法のある特定の変形形態では、培地交換はおよそ４日毎に行う。バイオリアクターに播種する場合、培地交換は、目標用量に達するまでおよそ６日または７日毎に行ってもよい。
７．拡大の開始後任意の時間で、得られた富化された特異的自然免疫細胞溶解集団（ＮＫおよびγδＴＣＲ＋Ｔ細胞）を、望ましくない集団のＣＤ３＋枯渇またはＣＤ５６＋枯渇をそれぞれ使用して純粋なＮＫまたはγδＴＣＲ＋Ｔ細胞のいずれかに関してさらに富化して純粋な細胞集団を得ることができ、ステップ＃５と同様にさらに培養した。
８．拡大の終わりに、ＩＮＮＡＴＥ−Ｋ細胞を、１０％ＤＭＳＯ溶液を含有する無血清凍結培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ ＷＡ）中で凍結保存する。
図１は、培養１０日目で解析した場合の、細胞を抗体によって活性化してフィーダーフリー培養条件で拡大させた日数の関数としてのαβＴＣＲｎｅｇ細胞の拡大を例証する。グラフは、細胞がおよそ１週間で対数的拡大を達成し始め、拡大し続け、オフザシェルフ治療の成功にとって適した多数の細胞を生じたことを示している。図１では、活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞を、フィーダーフリー培養条件で培養拡大させた。拡大の日毎の培養物の総細胞数を示し、拡大の有意な増加は培養６日後に認められる。
図２は、７０％のＮＫ細胞および２８％のγδＴＣＲ＋Ｔ（ＧＤ）細胞を示し、この比率は治療産物にとって適している。細胞をさらに拡大させるとシフトが起こり得る；これらの２つの細胞タイプは、フィーダー細胞培養がなくとも他の細胞が混入することなく多数得られた。図２は、製造プロセスの以下の実施例の様々なステップにおける特定の自然免疫細胞溶解性細胞（ＩＮＮＡＴＥ−Ｋ）、ＮＫ、およびγδＴＣＲ＋Ｔ細胞、ならびにＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞および適応免疫αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の富化および表現型を例証する。
ａ）Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配分離後の単核細胞画分における細胞の頻度は、８％＋１２％のＮＫ細胞および０．１％＋１％のγδＴＣＲ＋Ｔ細胞、６％のＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞および７３％のαβＴＣＲ＋Ｔ細胞であった。
ｂ）αβＴＣＲ＋Ｔ細胞枯渇ステップ後の細胞の頻度は、２５％＋１５％のＮＫ細胞および３．２％＋１．２％のγδＴＣＲ＋Ｔ細胞（そのうち０．５％がＣＤ５６−ＣＤ３＋および２．７％がＣＤ５６＋ＣＤ３＋）および１％またはそれ未満のαβＴＣＲ＋Ｔ細胞であった。
ｃ）活性化およびフィーダーフリー培養拡大の１０日後、ＮＫ細胞頻度は、６８％＋２３％へと実質的に富化され、γδＴＣＲ＋Ｔ細胞は、１５．７％＋５％へと実質的に富化された（そのうち１２．２％がＣＤ５６−ＣＤ３＋および３．５％がＣＤ５６＋ＣＤ３＋）。無視できるレベルのＣＤ３＋適応免疫細胞が検出された：αβＴＣＲ＋Ｔ細胞は０．３％＋０．５％、およびＮＫＴ細胞は、０．２％＋０．３％で検出された。
ＣＤ５６（ＮＫ）表面抗原、ＣＤ１６、およびＣＤ５７を共発現する細胞の１０日目でのフローサイトメトリー解析（蛍光活性化セルソーター、またはＦＡＣＳ解析）を実施した。ＣＤ１６は、ＦＣγ受容体ＩＩＩであり、このようにＩｇＧ抗体のＦＣ部分に結合することができ、抗体結合標的細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することができる。ＣＤ１６は、ＮＫ細胞媒介自発的細胞傷害性において役割を有する。ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋サブセットは、最も細胞傷害性のサブセットであると考えられ、ＮＫ細胞の大多数を構成する（例えば、生理的条件下で）。ＣＤ５７は、不良な増殖能を有するＮＫ細胞のマーカーであり得る。ＩＬ−２による刺激後または標的細胞との共培養後のＮＫ細胞上のＣＤ５７の獲得は、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞サブセットの成熟と相関する。この分化は機能的変化を伴い、ＣＤ５７−細胞と比較すると、ＣＤ５７＋ＮＫ細胞は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に応答する増殖が不良であり、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８に応答してより少ないＩＦＮ−γを産生する。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の場合、３７％がＣＤ１６＋であり、６３％がＣＤ１６−であった；ＣＤ５６＋ＣＤ１６−細胞の場合、１３％がＣＤ５７＋であり、８７％がＣＤ５７−であった；ならびにＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞の場合、１５％がＣＤ５７＋であり、８５％がＣＤ５７−であった。フローサイトメトリー表現型の結果は、細胞組成物が、ＣＤ５６（ＮＫ）およびＣＤ１６の共発現によって証明されるように、拡大したαβＴＣＲｎｅｇ細胞において高度に細胞傷害性のＮＫ細胞である富化されたＮＫ細胞を含有するが、なおもＣＤ１６＋およびＣＤ１６−ＮＫ細胞の両方におけるＣＤ５７を発現しないＮＫ細胞の数によって証明されるように、さらにより応答性で細胞傷害性の細胞へとｉｎ ｖｉｖｏで成熟する潜在性を有する未成熟表現型を有する細胞も含有することを示した。
フローサイトメトリーによって解析した、フィーダーフリーの培養拡大活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞の１０日目の試料の異なるγδＴ細胞サブセットの頻度の分布を測定した。γδＴ細胞は、ＭＨＣ拘束αβＴ細胞とは対照的に、多様ながんをＭＨＣ非拘束性に認識および溶解することが可能であり、オフザシェルフの同種異系免疫療法に関するその潜在性を強調している。ヒトγδＴ細胞は、δ鎖の発現に基づいて３つの主な集団に分割することができる。健康なヒト成人における循環中のγδＴリンパ球の大多数、最大５０％〜９０％が、γδ２鎖を発現する。γδ１鎖を発現するγδＴ細胞は、粘膜表面の上皮内層において最も顕著であり、それらはそこで損傷、感染症、または形質転換に直面した場合の上皮組織の完全性の維持に関係しているが、それらはまた末梢血にも出現し得る。γδ３Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４−ＣＤ８−サブセットを含む循環中のＴ細胞の約０．２％を構成する。末梢血ではまれであるが、γδ３Ｔ細胞は通常、肝臓においてより高度に発現される。１０日目でのγδＴＣＲ＋Ｔ細胞の分布のパーセンテージ（４１％のγδ１、５０％のγδ２、７％の他のγδ）は、繁殖したγδＴ細胞が、それがＶδ１、Ｖδ２、およびＶδ１ｎｅｇＶδ２ｎｅｇサブセットを発現することから、ポリクローナルであったことを明らかに示している。このポリクローナル性は、腫瘍、変化した細胞、または感染症の自然殺滅における繁殖したγδＴ細胞の関与を確実にする。
図３は、フローサイトメトリーによって解析した場合の、フィーダーフリーの培養拡大活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞の１０日目の試料におけるγδＴＣＲ＋細胞上のＴ細胞系列マーカー、ＣＤ４（ヘルパー）、およびＣＤ８（細胞傷害性）の頻度および分布を例証する。γδ１Ｔ細胞のほとんどはＣＤ４もＣＤ８も発現しなかったが、小さいパーセンテージ（１９％）が細胞傷害性ＣＤ８系列マーカーを発現し、これは最大の腫瘍および感染症の殺滅に関して記載され、望ましい自然細胞溶解性免疫集団と一致する。γδ２＋細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかを少量発現したが、主にγδ３Ｔ細胞で構成される「他のγδＴＣＲ＋細胞」のほぼ半数が、細胞傷害性ＣＤ８系列マーカーを発現した。
さらに８日目のフローサイトメトリー表現型解析データが得られ、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．のαβＴ細胞枯渇試薬によって枯渇されているフィーダーフリーの培養拡大活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞からγδＴ細胞を得た。大規模の枯渇細胞に関して、８日目の培養ＣＤ３＋Ｔ細胞は、主にγδＴ細胞受容体（αβＴＣＲ＋細胞は＜０．０５％）を発現した。表現型解析を実施して、γδＴ細胞上のマーカーの共発現を解析した。細胞は全てＣＤ３＋であり、３１．８％がＣＤ１６＋であった。ＣＤ３＋γδＴ細胞上のＣＤ５７およびＣＤ１６の共発現が観察された。１０．７％がＣＤ５７およびＣＤ１６マーカーを共発現し、このように最も成熟した細胞であった。大多数は、ＣＤ５７−およびＣＤ１６−（５７％）であり、このように未成熟な細胞を表した。阻害性および活性化リガンド受容体の発現を解析した。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞表面上の活性化受容体である。ＮＫＧ２Ａは、ＣＤ９４と二量体を形成して阻害性受容体を作製する。細胞は、ＮＫＧ２Ｃの発現を欠如し、細胞の５５％がＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄを共発現した。表現型解析を実施してγδＴ細胞上のマーカーの共発現を、ＣＤ５６の共発現に関連して解析した。ＣＤ３＋およびＣＤ５６＋を発現した全てのγδ細胞のうち、２９％がＣＤ１６を共発現した。ＣＤ５７およびＣＤ１６の共発現は、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋γδＴ細胞において観察された。５％がＣＤ５７およびＣＤ１６マーカーを共発現し、このように最も成熟した細胞であった。大多数はＣＤ５７−およびＣＤ１６−（６７％）であり、このように未成熟な細胞を表した。阻害性および活性化リガンド受容体の発現を解析した。細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞上でＮＫＧ２Ｃの発現を欠如し、大多数の細胞（８２％）がＮＫＧ２Ａを発現し、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の８０％がＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄを共発現し、これらの細胞がＮＫ細胞に最も一般的に関連する表現型マーカーを発現したこと、および活性な自然免疫細胞集団を示したことを示している。
（実施例２）
αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団由来の形質導入された特異的自然細胞溶解性免疫細胞（ＩＮＮＡＴＥ−ＣＡＲ）の拡大
本実施例は、αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団のフィーダーフリー培養条件での活性化培養から拡大された、ＮＫおよびγδＴＣＲ＋Ｔ細胞を含む形質導入された特異的自然細胞溶解性免疫細胞（ＩＮＮＡＴＥ−ＣＡＲ）集団の拡大および産生について記載する。
１．実施例１ステップ＃５に記載された活性化され、培養により拡大されたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団からの細胞のアリコートを４日目に採取し（あるいは、アリコートは５〜１５日の間に採取することができる）、ヒトフィブロネクチンコーティングプレート上に０．２５×１０６個／ｍｌの濃度で５００ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５の存在下で播種し（あるいは、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ）コーティングプレートもしくはＶＥＣＴＯＦＵＳＩＮ−１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）形質導入エンハンサーを使用することができた）、細胞形質導入のマーカーとして使用されるＣＤ３４表面抗原の非機能的断片を含有するＣＤ＋１９キメラ抗原受容体の構築物を含有するガンマレトロウイルス上清によって形質導入した。
２．３日後、細胞を剥離させて、５％ＡＢ血清および５００ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）を補充したＮＫ ＭＡＣＳ（商標）培地（＃１３０−１０７−８７９（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ））中で、２４ウェルプレートまたはＴ７５において０．２５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度でさらに拡大させた；代替の培養容器は、バイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ（商標）２５ｍｌ、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ ＭＮ）を含み得る。
３．培地交換は３日毎に新鮮な培地および新鮮なＩＬ−２によって、実施例１の＃６に記載の濃度で行い、細胞を０．２５〜０．５×１０６個／ｍＬの濃度で播種した；バイオリアクターに播種する場合、培地交換は、目標の用量を達成するまで７日毎に行う。
４．１４日目以降のいつでも、ＩＮＮＡＴＥ−ＣＡＲ集団を、ＮＫ−ＣＡＲまたはγδ−ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかに関してさらに富化し、それぞれ望ましくない集団のＣＤ３＋枯渇またはＣＤ５６＋枯渇を使用して純粋な細胞集団を得ることができ、これをステップ＃３と同様にさらに培養した。
５．拡大の終わりに、細胞を、１０％ＤＭＳＯ溶液を含有する血清フリーの凍結培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）中で凍結保存する。
図４は、１０日間のＣＡＲ．１９ ＩＮＮＡＴＥ−Ｋ細胞の拡大速度の解析を例証する。拡大した非遺伝子改変集団と同様に、培養物は、およそ１週間で始まる対数的拡大を証明し、オフザシェルフのＩＮＮＡＴＥ−ＣＡＲ産物のロバストな拡大の可能性を表す。図４では、活性化されたＩＮＮＡＴＥ−Ｋ細胞を、フィーダーフリー培養条件で培養により拡大し、４日目に、ＣＤ１９ ＣＡＲおよび非機能的ＣＤ３４マーカーを含有するガンマレトロウイルスを形質導入した。
ＩＮＮＡＴＥ−ＣＡＲ集団、ＮＫ細胞、およびγδＴＣＲ＋Ｔ細胞の形質導入を比較した（３つの異なる産物で）。具体的には、％ＣＡＲ．ＣＤ１９発現を、ＣＡＲ分子に組み込まれたＣＤ３４マーカーを使用して、これらの細胞集団の各々において比較した。明言された細胞サブセットにおけるＣＤ３４マーカーの解析によって証明されるように、ＮＫおよびγδＴＣＲ＋Ｔ集団の両方が、ＣＡＲ．ＣＤ１９レトロウイルスベクターによる有意な形質導入を示した。形質導入効率は、ＮＫおよびγδＴＣＲ＋Ｔ細胞に関してそれぞれ、平均で３３％および３０％であった。フローサイトメトリー解析（蛍光活性化セルソーター、またはＦＡＣＳ解析）を、１０日間拡大させてＣＡＲ．ＣＤ１９を有するレトロウイルスベクターを形質導入していないフィーダーフリーのＮＫ細胞について実施したところ、ＣＤ５６＋細胞上でのＣＤ３４＋染色の特異性を示した。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析を、ＣＡＲ．ＣＤ１９を有するレトロウイルスベクターによって活性化プロセスから４日目に遺伝子改変し、１０日間拡大させたフィーダーフリーのＮＫ細胞について実施した。結果は、ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージおよび発現の平均蛍光強度の両方に関して、形質導入後にＣＤ５６＋細胞におけるＣＡＲ発現レベルが有意であることを示した。両方の特色は、非常に効率的な腫瘍の認識に関連する。同じ知見がまた、形質導入して拡大させたＩＮＮＡＴＥ集団に存在するフィーダーフリーのγδＴＣＲ Ｔ細胞の状況についても有効であった。実際に、γδＴＣＲＴ細胞構成要素は、γδＴＣＲ Ｔ細胞におけるＣＤ３４発現解析によって評価した場合、有意に形質導入された。
ＩＮＮＡＴＥ−ＣＡＲプラットフォームは、腫瘍の認識および除去において非常に効率的であり、自然活性とＣＡＲ媒介機能性との間に強い相乗性を有する。実際に、図５は、ＩＮＮＡＴＥ細胞およびＩＮＮＡＴＥ−ＣＡＲ．ＣＤ１９細胞をＣＤ１９＋白血病（２２１）またはＣＤ１９＋リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）細胞株と共培養した共培養細胞傷害性アッセイからのデータをグラフで例証する。異なる細胞エフェクターに関して培養後の％残存腫瘍を上記のグラフに表す。非形質導入ＮＫ細胞（ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ）は、白血病およびリンパ腫腫瘍細胞をそれぞれ、４０および２９％殺滅したが、ＮＫおよびγδＴＣＲ Ｔ細胞の組合せ集団によって特徴付けられるＩＮＮＡＴＥ−Ｋ細胞は、腫瘍細胞をそれぞれ８８．４％および９６．１％殺滅した。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞にＣＡＲ．ＣＤ１９を形質導入すると（ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．ＣＤ１９）、腫瘍細胞の９３％および８４％の除去を可能にしたが、ＩＮＮＡＴＥ−ＣＡＲ．ＣＤ１９の組合せ集団は、ほぼ全ての腫瘍細胞（９７％および９９％）を殺滅した。
（実施例３）
ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞の代替の富化
本実施例は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞の富化プロセスを記載する：
１．ＮＫ細胞を、ＮＫ ＤＥＰＬＥＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）によってバフィーコートから単離した。
２．ＮＫ細胞を、ＮＫ Ｃｅｌｌ ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ／ＥＸＰＡＮＳＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）および組換えヒトＩＬ−２（５００Ｕ／ｍｌ）によって活性化した。
３．０日目、活性化後、ＮＫ細胞を、５％ＡＢ血清富化培地（ＮＫ ＭＡＣＳ（商標）培地（＃１３０−１０７−８７９ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）において培養した。
４．４から１５日目、細胞のアリコートを、ヒトフィブロネクチンコーティングプレートにおいて０．２５×１０６個／ｍｌの濃度で５００ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）の存在下での形質導入に供した。
５．３日後、細胞を剥離させて５％ＡＢ血清富化培地および５００ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）中、細胞播種濃度０．２５×１０６個／ｍｌでさらに拡大させた。
６．形質導入後、ＮＫ細胞を２４ウェルプレートに蒔いた後、Ｔフラスコまたはバイオリアクターに蒔いた。
７．培地交換は、３日毎に新鮮な培地および新鮮なＩＬ−２によって行い、目標細胞数に達するまで細胞を０．２５〜０．５×１０６個／ｍＬ（それらがプレートにある場合）の濃度で播種した。バイオリアクター培養は７日毎に交換した。
８．＋１４日目、５％より多くのＴ細胞混入がある場合、純粋なＮＫ細胞を得るために、非形質導入およびＣＡＲ形質導入ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞を、ＣＤ３＋細胞に関して再度枯渇させ、ステップ＃７と同様にさらに培養した。
自然免疫細胞が９０％より多い（＞９０％）例示的な高度富化ＮＫ集団を、図６〜８にグラフで例証するようにプレートおよびバイオリアクターの両方においてロバストに拡大させた。図６は、プレートにおいて数日間拡大させたＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞集団の総数を示す。図７は、プレートとバイオリアクターで拡大させたＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ集団の総細胞数を比較する。図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大の異なる時点でのサブセット細胞組成を示し、９５％より多くのＮＫ細胞および無視できる存在量のＣＤ３＋Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞によって表されるＩＮＮＡＴＥ−ＮＫの有意な純度レベルを示す。
ＣＡＲ形質導入効率のレベルを、ＣＡＲ．ＣＤ１９分子に含まれるＣＤ３４マーカーを評価するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析を使用して実証した。フィーダーフリーで拡大させた非形質導入ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞は、ＣＤ３４マーカーを発現しない。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞は、ＣＡＲ．ＣＤ１９を有するレトロウイルスベクターによって４日目に遺伝子改変した。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ細胞は、有意に形質導入され、ＮＫ集団（ＣＤ５６＋）におけるＣＡＲ＋細胞のパーセンテージは高かった。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ細胞におけるＣＡＲ分子の発現は、図９に示すように長期間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の間安定であった。
ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ集団の拡大後の活性化および細胞溶解性分子の発現の増加を図１０に例証し、ここではそれぞれ、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞のフローサイトメトリー解析からのデータをグラフで示す。解析は、自然細胞の活性化および成熟に関連するいくつかのＮＫマーカーの評価を含んだ。特に、ＣＤ１６は、高い細胞溶解活性を有するが低い増殖能を有するより成熟したＮＫサブグループに関連していることから、成熟解析の基本的マーカーとして含めた；ＣＤ２、ＬＦＡ−１、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、およびＮＫｐ４６、およびＤＮＡＭ−１を含む、ＮＫ集団の活性化および増殖のためのシグナル伝達分子および共刺激分子を含めた。これらのマーカーは全て、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ．ＣＡＲ．１９細胞の両方の拡大した集団において有意に増加し、細胞が循環中の末梢血ＮＫ細胞と比較して活性化されることを示している。
図１１は、フィーダーフリーの拡大したＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞およびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ細胞における疲弊の欠如をグラフで例証する。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞を、実施例３に記載されるように生成および拡大させ、２０日目および６０日目にフローサイトメトリー解析を実施して、細胞の成熟性および疲弊に関するマーカーを評価した。ＬＩＲ−１は、自然細胞阻害活性のマーカーであり、２０日目ではＮＫ集団においてごくわずかな増加を示し、６０日目では両方の集団の増加を示した；ＮＫＧ２ｃは、シグナル特異的活性および成熟のマーカーであり、培養期間の間、変化しなかった；ＣＤ５７は、成熟のマーカーであり、増殖能の減少に関連し、このように健康なドナーの末梢血に由来する循環中のＮＫ集団上に発現される。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大の２０日目および６０日目でのフィーダーフリーで拡大したＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞は、有意に低いパーセンテージのＣＤ５７＋ＮＫ細胞を示し、これらの細胞がｉｎ ｖｉｖｏでの注入の際になおも増殖能を有することを示唆している。プログラム細胞死１分子（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞における細胞の潜在性の減少および「疲弊」のマーカーであるのみならず、最近ではＮＫ細胞においてもチェックポイントインヒビターとして記載された。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ細胞のいずれの集団も、２０日目または６０日目のいずれかでの、ＰＤ−１＋細胞サブセットの存在を示さず、細胞は長期間のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養後に疲弊しないことを示した。
図１２は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫまたはＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９、ならびに４つの腫瘍細胞株による細胞傷害性共培養アッセイをグラフで例証する：列Ａ：２２１、ＣＤ１９＋白血病細胞株；列Ｂ：Ｄａｕｄｉ、ＣＤ１９＋リンパ腫細胞株；列Ｃ：ＢＶ１７３、ＣＤ１９＋（可変発現）プレＢ腫瘍細胞株；ならびに列Ｄ：ＫＡＲＰＡＳ、ＣＤ１９−腫瘍細胞株。図１２のパネル１は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ（左のサブパネル）またはＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ．ＣＡＲ．１９（右のサブパネル）細胞とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養後のＣＤ１９＋細胞の低減を示す。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫのパネルにおける左上の区画（枠で囲んだ区画）は、非改変ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞との共培養後のＣＤ１９＋腫瘍集団を強調する。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ．ＣＡＲ．１９パネルにおける左上の区画（枠で囲んだ区画）はＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ．ＣＡＲ．１９細胞との共培養後の残存ＣＤ１９＋腫瘍集団を強調する。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ．ＣＡＲ．１９細胞は、ＣＤ１９＋２２１およびＤＡＵＤＩ腫瘍標的に対して有意な腫瘍コントロールを発揮することが可能であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養の５日後、残存する腫瘍は無視できる量であった。ＢＶ１７３は、認識および除去に対してより高い抵抗性を示したが、ＣＡＲ．ＣＤ１９によるＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞の遺伝子改変は、非改変ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞と比較して抗腫瘍活性を有意に増加させることができた。１０の異なる実験で観察された残存腫瘍の平均値を、共培養実験の各々に関して図１２、パネル２に示す。脱顆粒（ｉｎ ｖｉｔｒｏで３時間の短期共培養後のＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａの発現によって解析した）は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲエフェクター細胞の細胞溶解活性を表し、これを図１２、パネル３（列Ａ〜Ｄ）に示す。全ての例において、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ．ＣＡＲ．１９細胞は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞より大きい細胞溶解活性を発現し；ＫＡＲＰＡＳ共培養条件によって表される陰性対照では、いずれの集団もＣＤ１０７ａ脱顆粒マーカーを発現しなかった。図１２、パネル４および５は、リンパ球細胞溶解活性の場合に一般的に産生される調節性サイトカインの産生を示す。これらのサイトカインはいずれも、ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞投与の間に非常に上昇しており、サイトカイン放出症候群においておそらく役割を果たすと考えられる。ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対するＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ活性の場合、ＩＦＮαおよびＴＮＦαの両方のサイトカイン産生は、２０〜１５０ｐｇ／ｍｌ／細胞１０６個の範囲であり、適応Ｔ細胞殺滅のそれより何倍も小さかった。たとえ高い標的殺滅を有する場合であってもサイトカイン分泌の程度は、ＣＡＲ−Ｔについて認められたものほど大きくなく（典型的には、１００から１，０００倍またはそれより高い）、したがっておそらくより毒性が低い治療を表す。
図１３〜１５は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ−細胞が、原発性Ｂｃｐ−ＡＬＬ芽球に対して有意な抗腫瘍活性を発揮できることをグラフで例証する。図１３および１４は、異なる実験試行におけるＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞およびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞集団の両方に関するエフェクター（Ｅ）の標的（Ｔ）に対する比の関数としての原発性腫瘍細胞の％特異的溶解をグラフで例証する；ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞集団は、Ｅ：Ｔ範囲の全てにわたってより有効であった。図１５は、原発性ＣＤ１９＋白血病芽球をエフェクター細胞の非存在下で蒔いた対照条件と比較して、エフェクター細胞（ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞およびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞集団）との共培養後のパーセンテージ残存原発性ＣＤ１９＋腫瘍をグラフで例証する。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞との共培養は、およそ１８％の残存腫瘍細胞をもたらし、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞集団との共培養は、およそ５％の残存腫瘍細胞をもたらした。
一例のｉｎ ｖｉｖｏ ＣＤ１９＋リンパ腫マウスモデルでは、各ＮＧＳマウスに、生体蛍光解析によって解析することができるように、ホタルルシフェラーゼによって遺伝子改変した腫瘍細胞０．２５×１０６個のＩＶ投与を行った。３日後、注射したマウスにおいて、白血病が確立していることが示され、マウスを５×１０６個のＩＮＮＡＴＥ−ＮＫまたはＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９のＩＶ注入を受けるマウスの処置コホートに無作為化した。動物を、実験の過程においてルシフェラーゼ＋腫瘍細胞の存在に関して解析した。データを、同じ設計の別の実験からのデータと比較したが、この実験では、動物に５×１０６個の非改変適応Ｔ細胞を投与した。
（実施例４）
ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ試験
本実施例は、遺伝子改変を伴わないＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞の１用量が、適応Ｔ細胞の同じ用量と比較して動物が死亡するまでの時間を延長させることができたことを示すデータを記載する。腫瘍細胞０．２５×１０６個をＩＶ投与し、３日間拡大させた。５×１０６個のＩＮＮＡＴＥ−ＮＫまたはＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲをＩＶ投与し、データを５Ｍ適応Ｔ細胞による実験からのデータと比較した。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ．１９を投与したマウスでは、腫瘍コントロールは完全であり、１１日目以降に腫瘍の生体蛍光は検出されず、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ１９が７２日目（実験の終了日）まで再発することなく腫瘍を根絶したことを実証した。重要なことに、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞はまた、異種応答（ＣＡＲ Ｔ細胞の場合、過去にこの時点で認められた）を実証しなかった。データはまた、遺伝子改変を伴わないＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞の１用量が、適応Ｔ細胞の同じ用量と比較して動物の全生存を延長させることができたことを示した（それぞれ、５０日目と２８日目の比較）。図１６は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．１９細胞を投与した上記の実験からの動物の生存曲線をグラフによって例証する。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ．ＣＡＲ．１９レシピエントのデータ曲線は、非改変ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞を投与されたレシピエントと比較して生存の改善を実証した。
（実施例５）
固形腫瘍に対するＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞
本実施例は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞が、固形腫瘍を処置するための適したプラットフォームであることを実証する。本実施例では、神経芽腫モデルを検討した。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫおよびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ細胞を、実施例３、ステップ１〜８に記載されるように生成した。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞を、神経芽腫腫瘍細胞によって発現されるＧＤ２抗原に対して特異的な第３世代ＣＡＲを有するレトロウイルスベクターによって４日目に遺伝子改変した。結果は、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ．ＧＤ２世代が、抗イディオタイプ抗体（１Ａ７）による染色によるフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析によって評価した場合にＣＤ５６＋細胞において有意なレベルのＣＡＲ発現を示すことを実証した。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲ．ＧＤ２産生におけるＮＫ集団の純度を、ＣＤ３＋細胞の無視できるパーセンテージに関して評価し、一方ＣＡＲ＋細胞のレベルを１Ａ７＋細胞として評価した。ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ ＣＡＲにおけるＣＡＲ．ＧＤ２の発現は、長期間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の間、安定であった（８日目、１５日目、２５日目、３１日目、３５日目に測定）。
（実施例６）
固形腫瘍の侵入における自然免疫の役割の評価
本実施例は、自然免疫が固形腫瘍に侵入するその能力における自然免疫の役割を評価した。その効果に対して、３−Ｄの神経芽腫腫瘍細胞のスフェロイドを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）培養において成長させた後、適応Ｔ細胞、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ、またはＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．ＧＤ２細胞を導入し、それらのスフェロイドへの侵襲能に関して評価した。具体的には、固形３−Ｄ腫瘍モデルを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように遺伝子改変されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫腫瘍細胞によって作製し、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、固形３−Ｄ腫瘍スフェアを形成した。適応末梢血Ｔ細胞、非改変ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞、およびＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ．ＣＡＲ．ＧＤ２を、赤色蛍光発光細胞マーカーによって標識し、腫瘍スフェアと共にインキュベートした。ニューロスフェアを３つの平面で３−Ｄ蛍光顕微鏡法によってアッセイし、腫瘍スフェアにおける細胞の位置および腫瘍に侵襲するその相対的能力を評価した。適応Ｔ細胞（赤色）の共焦点顕微鏡画像は、適応Ｔ細胞が、３つ全ての平面において観察されたが、腫瘍スフェア（緑色）の外部表面のみに局在したことから３−Ｄ腫瘍に能動的に侵入することができず、腫瘍の中心へと遊走しなかったことを示した。さらなる画像は、３つ全ての平面において観察されたように、ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ細胞（赤色）が、腫瘍スフェアの表面を突破し始めたことを示した；ＩＮＮＡＴＥ−ＮＫ−ＣＡＲ．ＧＤ２細胞は、腫瘍スフェアの表面を突破し、これらの細胞が３つ全ての平面において観察された腫瘍の中まで何らかの距離遊走する能力を有することを示した。
（実施例７）
架橋または可溶性の活性化
実施例１に記載するように、架橋した天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）抗体（例えば抗ＮＫｐ４６）およびリンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ）抗体（例えば、抗ＣＤ２）の組合せ（「コーティングしたビーズ」；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による活性化後に、培養において細胞集団を生成した。ＮＣＲ抗体（例えば、抗ＮＫｐ４６）およびＬＦＡ抗体（例えば、抗ＣＤ２）の組合せによって活性化され、ＮＫ細胞およびγδＴ細胞の混合物を含有する本明細書において考察される細胞集団を、本明細書において「ＢＩＮＡＴＥ」細胞集団と呼ぶ（および上記のある特定の実施例では、「ＩＮＮＡＴＥ−Ｋ」細胞と呼ぶ）。本実施例では、得られたＢＩＮＡＴＥ集団を、１）架橋した抗ＮＫｐ４６（クローン９Ｅ２ ５００ｎｇ／ｍｌ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）および架橋した抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１ ５００ｎｇ／ｍｌ）の組合せ、または２）可溶性抗ＮＫｐ４６（クローン９Ｅ２ ５００ｎｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２（クローンＯＫＴ１１ ５００ｎｇ／ｍｌ）の組合せのいずれかによる活性化後に解析した。架橋は、実験の開始前に、ＰＢＳ中の抗体の組合せによってフラスコを２４時間コーティングした後、抗体溶液をデカントし、実験時にＰＢＳによってすすぐことによって達成した（本明細書においてコーティングされたプレートと呼ぶ）。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った（本実施例および本明細書における他の実施例に記載する方法のある特定の変形形態では、正常で健常なドナーに、アフェレーシス手順（アフェレーシス、一般的にはＦｉｃｏｌｌ（商標）勾配細胞分離を伴わない）を行い、単核細胞産物を標準的な手順、典型的にはＴｅｒｕｍｏ Ｏｐｔｉａ機に従って収集する）。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した（本実施例および本明細書における他の実施例に記載されるある特定の変形形態では、アフェレーシス産物に、ＣＬＩＮＩＭＡＣＳ分離デバイスを使用してαβＴ細胞枯渇を行ってもよく；さらなる枯渇は、ＣＤ１９ Ｂ細胞枯渇を含み得る。αβＴ細胞を枯渇させた単核細胞のアリコートを凍結保存して、拡大のために後に使用してもよい）。得られたαβＴＣＲ−ｎｅｇ細胞集団を、５％ＡＢ血清を補充したＢＩＮＡＴＥ培地（すなわち、ＮＫ ＭＡＣＳ（商標）培地（＃１３０−１０７−８７９（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ））（あるいは、他の培地、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓの培地、ＣＥＬＬＧＥＮＩＸ培地等を、ヒト血清を使用してまたは使用せずに使用してもよい））、および５００ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌで、２４ウェルコーティングプレートでは追加の活性化試薬を伴わずに、または２４ウェル非コーティングプレートでは５００ｎｇ／ｍｌ可溶性抗ＮＫｐ４６（クローン９Ｅ２）および５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（クローンＯＫＴ１１）の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）と共に、フィーダーフリー培養において活性化した。
２．活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では最大１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換は、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２を用い、３日毎（バイオリアクターの場合はより少ない頻度（５〜７日毎））にに行った。本実施例および本明細書における他の実施例の方法のある特定の変形形態では、拡大の１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間後に、培養したＢＩＮＡＴＥ細胞を凍結保存してもよい。一例では、拡大したＢＩＮＡＴＥ細胞を洗浄した後、濃縮し、血清フリーの凍結保存培地（ＢＩＯＬＩＦＥ）を添加する。凍結保存したＢＩＮＡＴＥ産物を融解し、さらに培養するために本明細書に記載されるように再度播種してもよく、または融解し、例えばがんもしくはウイルス感染症を有する患者に注入してもよい。
３．１５日間の拡大の終わりに、ＢＩＮＡＴＥ細胞を、ＮＫおよびγδＣＤ３＋Ｔ細胞含有量、およびそのサブセット、例えばＣＤ５６に関して詳細に解析し、可能性がある混入細胞タイプ、例えばαβＴＣＲ＋Ｔ細胞のさらなる解析を行った。
ＢＩＮＡＴＥ細胞の表現型は、総細胞集団のパーセンテージとして報告され、コーティングプレート上でのまたは可溶性抗体による活性化の間で差を示さなかった。ＮＫ集団（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）は、コーティングプレート上で活性化した場合には最終集団の８９．１％であったが、これに対し可溶性抗体によって活性化した場合には９２％であった。ＣＤ３＋γδＴ細胞は、コーティングプレート条件および可溶性抗体条件においてそれぞれ、集団の６．２％および５．５％であった。ＣＤ３＋ＣＤ５６＋γδＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ５６−γδＴ細胞は、コーティングプレートでの活性化培養ではそれぞれ、集団の２．８％および３．４％であり、可溶性抗体による活性化培養ではそれぞれ、集団の３．３％および２．２％であった。αβＴＣＲ＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセントは両方の条件で無視できる程度であり、コーティングプレートでの活性化では０．１２％であり、可溶性抗体による活性化では０．４１％であった。
以前の報告では、架橋した抗体を使用するほうがより大きい活性を有し得ることが示されているが、可溶性抗体の使用はしばしば、例えば培養をより十分に制御できることから架橋した抗体（例えばプレートまたはビーズなどの表面上で使用する場合）より好ましい。可溶性の抗ＮＫｐ４６（クローン９Ｅ２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）および可溶性の抗ＣＤ２（クローンＯＫＴ１１）の組合せを使用すると、架橋条件と比較して差がなく、全ての実験をその後、可溶性抗体活性化試薬によって実施した。
（実施例８）
様々な量の抗ＮＫｐ４６を使用する活性化および拡大の評価
別々の実験において、異なる抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）試薬を、２つの拡大条件：１）ＩＬ−２（５００ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））、または２）ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））において３つの濃度（１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、および５００ｎｇ／ｍｌ）で評価した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（クローンＯＫＴ１１）および抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の３つの濃度：１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、または５００ｎｇ／ｍｌのうちの１つの組合せを有する、ＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２またはＩＬ−１５を用いるフィーダーフリーの培養条件に置いた。
２．活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はプレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２またはＩＬ−１５を用い、３日毎に（バイオリアクターではより少ない頻度で（５〜７日毎））行った。
３．１５日目の拡大の終わりに、ＢＩＮＡＴＥ細胞を、ＮＫおよびγδＣＤ３＋Ｔ細胞含有量ならびにそのサブセット、例えばＣＤ５６に関して解析し、可能性がある混入細胞タイプ、例えばαβＴＣＲ＋Ｔ細胞のさらなる解析を行った。
ＢＩＮＡＴＥ細胞の表現型は、総細胞集団のパーセンテージとして報告され、培養をＩＬ−１５による拡大によって拡大させた場合に、抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の３つの濃度の間で有意差を示さなかった。ＮＫ集団（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）は、５００ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）、５０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）、および１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）に関してそれぞれ、８４．５％、８７％、および８７．２％を構成した。γδＴＣＲ ＣＤ３＋集団はそれぞれ、１１．４％、８．７％、および８．１％を構成したが、ＣＤ３＋５６＋集団はそれぞれ、７．４０％、５．４０％、および５．３０％を構成した。αβＴＣＲ＋細胞は、全ての濃度で実質的に検出不能であった。
Figure 2021532829
（実施例９）
活性化および拡大させた細胞のマーカー評価
異なる実験では、医薬品等の製造管理及び品質管理に関する基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ））品質の１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）抗体およびＧＭＰ品質の５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）抗体の組合せによる活性化後の２つの拡大条件（すなわち、ＩＬ−２およびＩＬ−１５）におけるＢＩＮＡＴＥ表現型を比較した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）および１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５のいずれかを用いる、フィーダーフリー培養条件に置いた。
２．活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はプレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２またはＩＬ−１５を用い、３日毎に（バイオリアクターではより少ない頻度で（５〜７日毎））行った。
３．２０日の培養拡大終わりに、ＢＩＮＡＴＥ細胞を、自然、細胞傷害性、および疲弊発現細胞の含有量およびそのサブセットのマーカー、例えばＣＤ５６、ＣＤ１６、およびＣＤ５７に関して詳細に解析し、可能性がある混入細胞タイプ、例えばαβＴＣＲ＋Ｔ細胞に関する追加の解析を行った。
総ＢＩＮＡＴＥ細胞集団は、ＩＬ−１５およびＩＬ−２による拡大後にそれぞれ、９２％および８４．３％のＣＤ５６＋自然細胞を含有した。集団は、ＩＬ−１５およびＩＬ−２による培養拡大後にそれぞれ、３３％および１２％のＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞傷害性自然細胞、７６％および５９．６％のＣＤ８＋細胞傷害性自然細胞、ならびに９９％および９６．５％のＣＤ５６＋ＣＤ５７−未成熟自然細胞を含有した。ＩＬ−１５またはＩＬ−２のいずれかによる培養拡大後に検出可能なａｂＴＣＲ＋Ｔ細胞は認められなかった。ＮＫおよびγδＴ細胞のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４−ＣＤ８−集団を、以下の表２に提供する。
Figure 2021532829
Figure 2021532829
（実施例１０）
静止培養およびバイオリアクター培養条件下で拡大させた細胞の評価
別々の実験において、ＧＭＰ品質の５０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）抗体およびＧＭＰ品質の５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）抗体の組合せによる活性化後の２つの拡大条件（ＩＬ−２およびＩＬ−１５）における静止およびバイオリアクター培養条件でのＢＩＮＡＴＥ増殖を比較した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）および５０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５のいずれかを用いる、フィーダーフリー培養条件に置いた。
２．活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコまたはＧ−Ｒｅｘベンチトップバイオリアクター（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換は、プレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−１５を用い、３日毎に（バイオリアクターではより少ない頻度で（５〜７日毎））行った。
３．活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団をまた、ＧＲｅｘ培養デバイスにおいてＢＩＮＡＴＥ培地および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用い、細胞播種濃度１×１０６個／ｍｌで、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換は、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−１５を用い、７日毎に行った。
総ＢＩＮＡＴＥ拡大を、図１７に総細胞数として示す。フラスコにおいてＩＬ−２またはＩＬ−１５のいずれかを補充したＢＩＮＡＴＥ培地中の活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞の拡大は、４１日の期間で等価であった。同様に、バイオリアクターにおける最初の２１日間での活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団のＩＬ−１５による拡大は、フラスコにおけるＩＬ−１５による拡大と等価であった。
（実施例１１）
活性化および拡大した細胞のアロ反応性の評価
別々の実験において、ＩＬ−２またはＩＬ−１５のいずれかにおいて拡大させた活性化ＢＩＮＡＴＥ細胞集団のアロ反応性を評価した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）および５０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地を用いるフィーダーフリー培養条件に置いた。
２．活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５のいずれかを用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコにおいて、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２またはＩＬ−１５を用い、３日毎に行った。
３．ＢＩＮＡＴＥ細胞および３人の無作為な健康なドナー（ＨＤ）のＰＢＭＣに由来する刺激細胞を、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において試験した。３人のＨＤに由来する刺激細胞をプールし、放射線（３０Ｇｙ）を照射した後に使用した。ＢＩＮＡＴＥ細胞を、１００μｌ／ウェル（細胞１×１０５個）で同数の刺激細胞と共に９６ウェル平底マイクロタイタープレートにおいてＢＩＮＡＴＥ培地２００μｌに播種した。５日間インキュベーション後、培養物に１８ｋＢｑ３Ｈ−チミジンを１２時間パルスし、ガラス繊維フィルター上で回収した。乾燥させたフィルターを、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ１４５０カウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で計数した。結果をＳＩ（抗原によるｃｐｍ／バックグラウンドのｃｐｍ）として表記した。サイトカインを添加しなかったＢＩＮＡＴＥ細胞を陰性対照として使用し、陽性対照は、サイトカイン（ＩＬ−２またはＩＬ−１５）と共に播種したＢＩＮＡＴＥ細胞によって表された。
混合リンパ球共培養を、増殖の指標である３Ｈチミジン取り込み（ＣＰＭ）に関して解析した。ＩＬ−１５の実験では、陰性対照は、ＩＬ−１５を補充していない非刺激ＢＩＮＡＴＥ細胞からなり、３Ｈチミジン取り込みは１１４４であり、本質的に増殖していないことを示した。放射線照射したプールした健常ドナー細胞（ＨＤ）は、３Ｈチミジン取り込みが１１９４であり、これも増殖していないことを示した。陽性対照は、ＩＬ−１５による増殖刺激を含み、３Ｈチミジン取り込みは１５５５８であり、陰性対照と比較して１４倍の増加であった。ＩＬ−１５における拡大を受けた活性化ＢＩＮＡＴＥ細胞は、３Ｈチミジン取り込みが９４２であり、本質的にバックグラウンドと差がなかった。
ＩＬ−２の実験では、陰性対照は、ＩＬ−２を補充していない非刺激ＢＩＮＡＴＥ細胞を含み、３Ｈチミジン取り込みは８３４であり、本質的に増殖していないことを示した。放射線照射したプールしたヒトドナー細胞（ＨＤ）は、３Ｈチミジン取り込みが１１９４であり、これも増殖していないことを示した。陽性対照は、ＩＬ−２による増殖刺激を含み、３Ｈチミジン取り込みは１８８３４であり、陰性対照と比較して２２倍の増加であった。ＩＬ−１５における拡大を受けた活性化ＢＩＮＡＴＥ細胞は、３Ｈチミジン取り込みが１２４５であり、本質的にバックグラウンド対照と差がなかった。
ＭＬＲ応答が存在しなかったことは、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞の非存在による可能性があり、自然ＢＩＮＡＴＥ細胞集団にアロ反応性が欠如していることを裏付ける。アロ反応性が存在しないことは、細胞が移植片対宿主応答をもたらす能力を欠如することを裏付けることから、臨床的に重要である。
（実施例１２）
異なる拡大条件下での細胞増殖および表現型の評価
別々の実験において、ＧＭＰ品質の抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）抗体（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｃａｐｒｉｃｏ）およびＧＭＰ品質の抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）抗体（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｃａｐｒｉｃｏ）による活性化後の増殖能およびＢＩＮＡＴＥ表現型を５つの異なる拡大条件において比較した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）および５０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）、ならびに以下の拡大補助剤：
ａ．５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）
ｂ．１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）
ｃ．５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２およびＩＬ−１５ １０ｎｇ／ｍＬの組合せ（ＩＬ−２／ＩＬ−１５）
ｄ．５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３クローン抗ＣＤ３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の組合せ（ＩＬ−２／ＯＫＴ３）
ｅ．ＩＬ−１５ １０ｎｇ／ｍＬおよび５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３の組合せ（ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＯＫＴ３）
のうちの１つを有するＢＩＮＡＴＥ培地を用いるフィーダーフリー培養条件に置いた。
２．活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＢＩＮＡＴＥ培地を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、上記に列挙した５つの拡大条件のうちの１つを用いてフィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はプレートまたはフラスコの場合、３日毎に（バイオリアクターではより少ない頻度で（５〜７日毎））新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地によって行い、最初の培養活性化および拡大相の間、同じ拡大条件を使用した。
総ＢＩＮＡＴＥ拡大を、図１８に総細胞数として示す。フラスコにおけるＩＬ−２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２／ＯＫＴ３のいずれかを補充したＢＩＮＡＴＥ培地中の活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞の拡大は、４０日間にわたって等価であった。フラスコにおけるＩＬ−２／ＩＬ−１５またはＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＯＫＴ３のいずれかを補充したＢＩＮＡＴＥ培地中の活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞の拡大は、２６日間の期間にわたって等価であったが、その後増殖は遅くなり、全細胞数は、培養２６日から４１日までは他の３群と比較して少なかった。
以下の表３に示すように、培養拡大の７、２０、および３０日目では、５つの条件の各々からのＢＩＮＡＴＥ細胞は、フローサイトメトリーによってＮＫまたはγδＴ細胞であると決定された。表４に示すように、７、２０、および３０日での条件の各々からの細胞を同様に、フローサイトメトリーによって細胞上の自然、細胞傷害性、および疲弊の特異的マーカー、および未成熟発現、ならびにγδＴ細胞における特異的ＶｄＴＣＲの使用に関して解析した。
Figure 2021532829
Figure 2021532829
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細胞疲弊の指標であるＰＤ−１発現は、低いことが示された。３０日目に、ＩＬ−１５による拡大条件は総ＢＩＮＡＴＥ集団において２．７％の発現を示し、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞では２％の発現、ＣＤ３＋ＣＤ５６−γδＴ細胞では１０．６％の発現、およびＣＤ３＋ＣＤ５６＋γδＴ細胞では１７．０５％の発現を示し、疲弊の欠如を実証した。ＩＬ−２による拡大条件下では、ＰＤ−１発現は、フローサイトメトリーによって決定した場合にＩＬ−２による拡大条件では総ＢＩＮＡＴＥ集団の１４．２％の低さであることが示され、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞は２％ＰＤ−１を発現し、ＣＤ３＋ＣＤ５６−γδＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ５６＋γδＴ細胞はそれぞれ、６２．９％および７８．３％を発現した。
（実施例１３）
ＣＤ１０７ａ細胞傷害性
実施例１２の５つの拡大条件の各々からの３０日目の細胞を、ＩＭＲ３２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（神経芽腫細胞株）、およびＫ５６２（Ｂ細胞白血病細胞株）を含む腫瘍細胞株と共培養した。３日間培養後、細胞傷害性の顆粒放出の尺度（measurement）であるＣＤ１０７ａの発現を、基底ＢＩＮＡＴＥ細胞およびそれぞれの腫瘍細胞株と共培養したＢＩＮＡＴＥ細胞においてフローサイトメトリー解析によって測定した。表５は、５つの拡大条件（ＩＬ−２、ＩＬ−２／ＯＫＴ３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２／ＩＬ−１５、およびＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＯＫＴ３）の各々において、各腫瘍細胞株および各ＢＩＮＡＴＥサブセット（ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞、およびＣＤ３＋ＣＤ５６＋γδＴ細胞、およびＣＤ３＋ＣＤ５６−γδＴ細胞）に関する基底値を差し引いた腫瘍刺激発現間の差を示す。統計学的有意性をＴ検定によるｐ値として報告する。
Figure 2021532829
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（実施例１４）
異なる拡大条件下での表現型マーカーの評価
実施例１２における３つの拡大条件（条件ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２／ＯＫＴ３）からの２０日目の細胞を、特異的活性化、細胞傷害性、および疲弊マーカーに関して解析した。図１９は、ＩＬ−１５による拡大条件に関するマーカータイプ（活性化、細胞傷害性、および疲弊／未成熟）毎の表現型解析を示す。図２０は、ＩＬ−２による拡大条件に関するマーカータイプ（活性化、細胞傷害性、および疲弊／未成熟）毎の表現型解析を示す。図２１は、ＩＬ−２／ＯＫＴ３拡大条件に関するマーカータイプ（活性化、細胞傷害性、および疲弊／未成熟）毎の表現型解析を示す。全ての条件下で、ＢＩＮＡＴＥ細胞は、一般的に高い活性化および細胞傷害性、ならびに低い疲弊を示した。
（実施例１５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍殺滅の評価
異なる実験では、１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）抗体および５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）抗体の組合せによる活性化後の２つの拡大条件（ＩＬ−２およびＩＬ−１５）におけるＢＩＮＡＴＥ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍殺滅を比較した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）および１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５のいずれかを用いる、フィーダーフリー培養条件に置いた。
２．活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５と共に、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はプレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２またはＩＬ−１５を用い、３日毎に（バイオリアクターではより少ない頻度で（５〜７日毎））行った。
３．２０日間の培養拡大の終了後、ＢＩＮＡＴＥ細胞を、腫瘍共培養実験に５〜７日間置いた。以下の表６に示した実験は、白血病細胞株を、６ウェル培養皿において２ｍｌ培地／培養ウェル中で１：１のエフェクターの標的に対する比（すなわち、０．５ＭのＢＩＮＡＴＥ細胞（エフェクター）と共に０．５Ｍの腫瘍細胞（標的））で培養することを伴った。
以下の表７に示す実験は、固形腫瘍細胞株（神経芽腫、肉腫、および結腸腫瘍株）を、６ウェル培養皿において２ｍｌ培地／培養ウェル中で２：１のエフェクターの標的に対する比（すなわち、０．５ＭのＢＩＮＡＴＥ細胞（エフェクター）と共に０．２５Ｍの腫瘍細胞（標的））で培養することを伴った。腫瘍およびエフェクター細胞の共培養は、サイトカインの非存在下で実施した。共培養を顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって３〜７日目に評価した。
共培養実験において残存腫瘍を調べると、表６から、ＩＬ−２またはＩＬ−１５のいずれかの存在下で拡大させた活性化ＢＩＮＡＴＥ細胞が、全ての細胞株の５０％またはそれより多くの腫瘍細胞、ＡＭＬ細胞株の４〜５つでは７５％より多くの根絶に成功したことが示される。表６では、全ての細胞株の短期間の共培養は、全ての２２１白血病細胞、＞８０％のＤａｕｄｉ白血病細胞、およびしばしば自然殺滅に対して抵抗性であると考えられているＫａｒｐａｓ細胞株の最大５０％を殺滅するＢＩＮＡＴＥ細胞をもたらした。
Figure 2021532829
共培養実験において残存腫瘍を調べる場合、表７は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５のいずれかによって拡大させた活性化ＢＩＮＡＴＥ細胞が、短期間の共培養実験において神経芽腫腫瘍の根絶に成功したことを示している。ＩＬ−２による拡大ＢＩＮＡＴＥ細胞は、結腸がんとの共培養において試験しなかったが、ＩＬ−１５による拡大ＢＩＮＡＴＥ細胞は、肉腫および結腸がんに対して活性を示した。
Figure 2021532829
（実施例１６）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入効率の評価
別々の実験において、形質導入の安定性を評価するために、第３世代ＧＤ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレトロウイルス構築物によるＢＩＮＡＴＥ細胞の初期および後期ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入効率を、１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）抗体および５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）抗体の組合せによる活性化後に比較した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）および１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を用いる、フィーダーフリー培養条件に置いた。
２．本明細書に記載される任意のＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲの生成のために、活性化した培養拡大αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団からの細胞のアリコートを、４〜１５日目に採取し、特異的キメラ抗原受容体の構築物を含有するガンマレトロウイルス上清の存在下、０．２５×１０６個／ｍｌの濃度でヒトフィブロネクチンコーティングプレートまたは代替的に培養バッグ（Ｇｏｂａｉｎ））に播種した。３から４日後、細胞を洗浄し、拡大または凍結保存のいずれかを含み得るプロセスを非形質導入細胞に関しても継続する。拡大条件は、５００ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を含有し得るが、本明細書において言及したいずれかの条件の組合せを含有し得る。本明細書で使用されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物は、ＣＡＲ．ＧＤ２、ＣＡＲ．１２３、およびＣＡＲ．ＣＤ１９を含み、これは非機能的マーカー、例えばＣＤ３４表面抗原の断片または変異体ＣＤ１９断片を含有する（ある特定の構築物の説明に関しては実施例２５を参照されたい）。本明細書における方法のある特定の変形形態では、レトロウイルストランスフェクションを補助するために、ＲＥＴＲＯＮＥＣＴＩＮの代わりにＶＥＣＴＯＦＵＳＩＯＮ−１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してもよく、遺伝子改変は、選択される任意の抗原の他のＣＡＲ構築物の遺伝子改変または他の分子による改変を含み得る。この例に関して、５日目での活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ヒトフィブロネクチンコーティングプレート（または代替的に培養バッグ（Ｇｏｂａｉｎ））に０．２５×１０６個／ｍｌの濃度で、ＧＤ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築物を含有するガンマレトロウイルス上清の存在下に置いた。ＧＤ２構築物は、選択および追跡マーカーとしてＣＤ３４受容体の変異体断片を含有した。
３．３日後、形質導入細胞を洗浄し、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２を用いて細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はプレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２を用い、３日毎（バイオリアクターの場合はより少ない頻度で（５〜７日毎））に行った。
４．形質導入の３日後および１５日後、ＢＩＮＡＴＥ細胞サブセットならびにγδＴ細胞のＶｄＴＣＲサブセットを、変異体ＣＤ３４受容体（形質導入効率の指標）の発現に関して解析した。３日目および１５日目に、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の形質導入効率はそれぞれ、８２．４％および８２．４％であった。３日目および１５日目に、ＣＤ３＋５６＋細胞の形質導入効率はそれぞれ、４３．２％および６２．４％であった。３日目および１５日目に、ＣＤ３＋ＣＤ５６−γδＴ細胞の形質導入効率はそれぞれ、３７．３％および５６．８％であった。遺伝子改変は培養期間の間安定であり、このことは高度の形質導入および永続的な組み込みを可能にする高度に活性化された集団であることを意味した。
類似の実験において、ＢＩＮＡＴＥ亜集団の形質導入は、ＧＤ２ ＣＡＲ構築物の高い形質導入、ならびにＶｄ１およびＶｄ２ ＴＣＲ γδＴ細胞の両方のポリクローナル形質導入を示した。ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞は６９％で形質導入されたが、ＣＤ３＋γδＴ細胞は３９％で形質導入された。Ｖｄ１ ＴＣＲ集団は６７％の形質導入効率を有し、Ｖｄ２ ＴＣＲ集団は３４％の形質導入効率を有した。
（実施例１７）
ＧＤ２ ＣＡＲのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入後の増殖の評価
別々の実験において、５０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）抗体および５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）抗体の組合せによる活性化後の、第３世代ＧＤ２ ＣＡＲをコードするレトロウイルス構築物によるＢＩＮＡＴＥ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入後の増殖能を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５による拡大条件において非改変ＢＩＮＡＴＥ細胞と比較した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）および５０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用いる、フィーダーフリー培養条件に置いた。
２．活性化非遺伝子改変αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はプレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２またはＩＬ−１５を用い、３日毎に（バイオリアクターではより少ない頻度で（５〜７日毎））行った。
３．５日目に、活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ヒトフィブロネクチンコーティングプレートまたは培養バッグ（Ｇｏｂａｉｎ）において０．２５×１０６個／ｍｌの濃度でＧＤ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築物を含有するガンマレトロウイルス上清の存在下に置いた。ＧＤ２構築物は、選択および追跡マーカーとしてＣＤ３４受容体の変異体断片を含有した。
４．５日後、形質導入細胞を洗浄し、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はプレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２またはＩＬ−１５を用い、３日毎に（バイオリアクターではより少ない頻度で（５〜７日毎））行った。
５．細胞数を７日毎にＢＩＮＡＴＥおよびＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲＧＤ２集団に関して記録した。
非改変ＢＩＮＡＴＥ細胞およびＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲＧＤ２細胞を、形質導入の前に拡大させた（図２２における縦線によって表される）。形質導入後の拡大を、異なる条件に関して図２２における斜線によって表す。遺伝子改変細胞または非改変細胞の間に有意差はなく、全細胞数に関してもＩＬ−２またはＩＬ−１５による拡大に差はなかった。
（実施例１８）
固形腫瘍のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅の評価
別々の実験において、第３世代のＧＤ２ ＣＡＲをコードするレトロウイルス構築物による活性化ＢＩＮＡＴＥの形質導入後の２つの拡大条件（ＩＬ−２およびＩＬ−１５）における固形腫瘍のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅を比較した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、、５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）および１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用いる、フィーダーフリー培養条件に置いた。
２．５日目、活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＧＤ２キメラ抗原受容体の構築物を含有するガンマレトロウイルス上清の存在下、０．２５×１０６個／ｍｌの濃度でヒトフィブロネクチンコーティングプレートまたは培養バッグ（Ｇｏｂａｉｎ）に置いた。ＧＤ２構築物は、選択および追跡マーカーとしてＣＤ３４受容体の変異体断片を含有した。
３．３日後、形質導入細胞を洗浄し、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はプレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２またはＩＬ−１５を用い、３日毎（バイオリアクターの場合はより少ない頻度で（５〜７日毎））に行った。
４．２０日の培養拡大の終わりに、ＢＩＮＡＴＥ細胞を、５〜７日間、腫瘍の共培養実験に置いた。実験は、６ウェル培養皿において２ｍｌ培地／培養ウェル中で１：１のエフェクターの標的に対する比で（すなわち、０．５Ｍ ＢＩＮＡＴＥ細胞またはＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ．ＧＤ２細胞（エフェクター）を０．５Ｍ腫瘍細胞（標的）と共に）培養することを伴った。腫瘍およびエフェクター細胞の共培養は、サイトカインの非存在下で実施した。共培養は、３〜７日目に顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって評価した。
表８は、腫瘍の、非改変ＢＩＮＡＴＥ ＩＬ−２またはＢＩＮＡＴＥ ＩＬ−１５、またはＣＡＲ．ＧＤ２改変ＢＩＮＡＴＥ ＩＬ−２またはＣＡＲ．ＧＤ２改変ＢＩＮＡＴＥ ＩＬ−１５のいずれかとの共培養後の残存腫瘍のパーセンテージに関する共培養からのデータを示す。対照における残存腫瘍を１００％として測定した。ＢＩＮＡＴＥ ＩＬ−２およびＢＩＮＡＴＥ ＩＬ−１５はいずれも有意な腫瘍殺滅を示した。ＣＡＲ．ＧＤ２改変ＢＩＮＡＴＥ ＩＬ−２およびＢＩＮＡＴＥ ＩＬ−１５も同様に、有意な殺滅を示した。
Figure 2021532829
（実施例１９）
骨髄白血病細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅の評価
別々の実験において、第３世代ＣＤ１２３ＣＡＲをコードするレトロウイルス構築物による活性化ＢＩＮＡＴＥの形質導入後の長期間の共培養における骨髄白血病細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅を評価した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、、５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）および５０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用いる、フィーダーフリー培養条件に置いた。
２．５日目、活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＣＤ１２３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築物を含有するガンマレトロウイルス上清の存在下、０．２５×１０６個／ｍｌの濃度でヒトフィブロネクチンコーティングプレートに置いた。ＣＤ１２３構築物は、選択および追跡マーカーとしてＣＤ１９受容体の変異体断片を含有した。
３．３日後、形質導入細胞を洗浄し、ＢＩＮＡＴＥ培地および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換は、プレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−１５を用い、３日毎（バイオリアクターの場合はより少ない頻度で（５〜７日毎））に行った。
４．２０日の培養拡大の終わりに、ＢＩＮＡＴＥ細胞およびＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ１２３を、７日間またはそれより多くの日数の間、腫瘍の共培養実験に置いた。実験は、６ウェル培養皿において２ｍｌ培地／培養ウェル中で１：１のエフェクターの標的に対する比で（すなわち、０．５×１０６個のＢＩＮＡＴＥまたはＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ１２３細胞（エフェクター）を０．５×１０６個の腫瘍細胞（標的）と共に）培養することを伴った。腫瘍およびエフェクター細胞の共培養は、サイトカインの非存在下で実施した。共培養は、３〜７日目に顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって評価した。
ＢＩＮＡＴＥ．ＣＤ１２３細胞は、６５％の効率で形質導入された。共培養で評価した骨髄性白血病腫瘍株は、ＴＨＰ１、ＭＯＬＭ３、およびＯＣＩ ＡＭＬ細胞株を含んだ。データは、腫瘍と非改変ＢＩＮＡＴＥまたはＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１２３のいずれかとの共培養後の残存腫瘍のパーセンテージを含んだ。対照における残存腫瘍を１００％として測定した。ＢＩＮＡＴＥ細胞は、最初の短期間の殺滅後の残存腫瘍の持続的な成長により、骨髄性白血病細胞の根絶に成功しなかった。ＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１２３細胞は、ＴＨＰ１およびＭＯＬＭ３細胞株との共培養において殺滅に成功して腫瘍フリー培養を維持することができ、ＯＣＩ ＡＭＬ細胞株では対照の＞７０％であった。
（実施例２０）
白血病細胞のｉｎ ｖｉｖｏ殺滅の評価
別々の実験において、第２世代ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレトロウイルス構築物による活性化ＢＩＮＡＴＥ細胞の形質導入後の白血病細胞のｉｎ ｖｉｖｏ殺滅を評価した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離およびＭｉｌｔｅｎｙｉ ＮＫ選択キットを使用するＮＫ富化に供した。ＮＫおよびγδＴ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２抗体（クローンＬＴ２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）および１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を用いる、フィーダーフリー培養条件に置いた。
２．５日目、活性化集団を、ＣＤ１９キメラ抗原受容体の構築物を含有するガンマレトロウイルス上清の存在下、０．２５×１０６個／ｍｌの濃度でヒトフィブロネクチンコーティングプレートに置いた。ＣＤ１９構築物は、選択および追跡マーカーとしてＣＤ３４受容体の変異体断片を含有した。
３．３日後、形質導入細胞を洗浄し、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はプレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２を用い、３日毎（バイオリアクターの場合はより少ない頻度で（５〜７日毎））に行った。拡大の終わりに、ＢＩＮＡＴＥ細胞を洗浄し、マウスにＩＶ投与するためにＰＢＳ溶液中で製剤化した。
異種ｉｎ ｖｉｖｏ白血病モデル
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）異種移植マウスに、ＤＡＵＤＩ細胞を注入し、ＣＡＲ形質導入細胞の抗腫瘍効果をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。マウスの実験は、倫理上の国際要件、ＥＵの要件、および国内要件に従って行い、イタリア保健省（Ｎ°８８／２０１６−ＰＲ）の承認を受けた。ＮＧＳマウス（５週齢；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）に、ホタルルシフェラーゼ標識Ｄａｕｄｉ細胞（ＦＦ−Ｄａｕｄｉ）（０．２５×１０６個）を−３日目に接種した。マウスに５０×１０６個のＢＩＮＡＴＥ細胞またはＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ１９細胞を、ＩＶ注射によって０日目に注射し、毎週の生体発光イメージング（ＩＶＩＳ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）に供した。
ＢＩＮＡＴＥ細胞またはＢＩＮＡＴＥ．ＣＤ１９細胞の３つの用量を０日目に動物モデルに注入した。非遺伝子改変ＢＩＮＡＴＥ細胞は、部分的応答を生じることができ、マウスは４２日目まで生存した。ＣＡＲ．ＣＤ１９によって遺伝子改変したＢＩＮＡＴＥ細胞は、用量効果応答を実証し、最低用量の１×１０６個のＢＩＮＡＴＥ細胞は、非形質導入細胞より１週間長く動物を維持することができたが、５×１０６個または１０×１０６個のＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１９細胞を投与した動物ほど長く維持することはできなかった。このモデルは、毎週２回のＩＬ−２皮下注射によって裏付けられた。ＣＡＲ−Ｔ ＣＤ１９遺伝子改変αβＴ細胞とは異なり、動物は、９０日目に屠殺するまで生存し、ＩＬ−２投与にもかかわらず、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）や同種異系もしくは異種反応性の証拠はなく、自然細胞の安全性の改善を裏付けた。動物を９０日目に屠殺し、組織を末梢血および肝臓におけるヒトＣＤ４５＋細胞（ＢＩＮＡＴＥ）の存在に関して評価した後、％ＮＫおよびγδＴサブセットをそれぞれ、各組織において調べた。図２３に示すように、血液および組織の両方においてＢＩＮＡＴＥ細胞が維持され、ｉｎ ｖｉｖｏの環境でＢＩＮＡＴＥ細胞集団の生存および拡大の可能性を実証した。
（実施例２１）
固形腫瘍（神経芽腫）のｉｎ ｖｉｖｏ殺滅の評価
別々の実験において、第３世代のＧＤ２ ＣＡＲをコードするレトロウイルス構築物による活性化ＢＩＮＡＴＥ細胞の形質導入後の固形腫瘍、神経芽腫のｉｎ ｖｉｖｏ殺滅を評価した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（ＯＫＴ１１）および５０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（Ｂａｂ２８１）の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を用いる、フィーダーフリー培養条件に置いた。
２．５日目、活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、ＧＤ２キメラ抗原受容体の構築物を含有するガンマレトロウイルス上清の存在下、０．２５×１０６個／ｍｌの濃度でヒトフィブロネクチンコーティングプレートに入れた。ＧＤ２構築物は、選択および追跡マーカーとしてＣＤ３４受容体の変異体断片を含有した。
３．３日後、形質導入細胞を洗浄し、ＢＩＮＡＴＥ培地および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換は、３日毎に（バイオリアクターの場合はより少ない頻度で（５〜７日毎））行った。２０日目に細胞を洗浄し、投与のためにＰＢＳ中で製剤化した。
異種ｉｎ ｖｉｖｏ神経芽腫モデル
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）異種移植マウスに、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を注入し、ＣＡＲ形質導入細胞の抗腫瘍効果をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。マウスの実験は、倫理上の国際要件、ＥＵの要件、および国内要件に従って行い、イタリア保健省（Ｎ°８８／２０１６−ＰＲ）の承認を受けた。ＮＧＳマウス（５週齢；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）に、ホタルルシフェラーゼ標識ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（０．７５×１０６個）を−３日目に腹腔内に接種した。マウスに３０×１０６個のＢＩＮＡＴＥ細胞またはＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲＧＤ２細胞を、腹腔内注射によって２週間毎に３用量を注射し、毎週の生体発光イメージング（ＩＶＩＳ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）に供した。
非遺伝子改変ＢＩＮＡＴＥ細胞は、およそ１８日目に末梢腫瘍塊の消失を伴う部分応答を示したが、マウスはその後局所進行を示した。ＣＡＲ．ＣＤＧＤ２による遺伝子改変ＢＩＮＡＴＥ細胞は、末梢腫瘍塊の有意な除去を実証したが、局所病巣を殺滅することはできなかった。このモデルは、毎週２回のＩＬ−２皮下注射によって裏付けられた。
（実施例２２）
固形腫瘍（神経芽腫）のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅およびＮＫ細胞によるＡＤＣＣ抗体の評価
別々の実験において、固形腫瘍、神経芽腫の自然ＮＫ細胞または自然ＮＫ．ＣＡＲ．ＧＤ２細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅を評価した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離およびＭｉｌｔｅｎｙｉ ＮＫ選択キットを使用するＮＫ富化に供した。得られた集団を、２４ウェルプレート中０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２抗体（クローンＬＴ２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）および１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６の組合せ（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）を有する、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を用いる、フィーダーフリー培養条件に置いた。
２．５日目、活性化集団を、ＧＤ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築物を含有するガンマレトロウイルス上清の存在下、０．２５×１０６個／ｍｌの濃度でヒトフィブロネクチンコーティングプレートに置いた。ＧＤ２構築物は、選択および追跡マーカーとしてＣＤ３４受容体の変異体断片を含有した。
３．３日後、形質導入細胞を洗浄し、ＢＩＮＡＴＥ培地および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２を用いて、細胞播種濃度０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌでＴ７５フラスコ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）において、フィーダーフリー培養条件でさらに培養拡大させた。培地交換はプレートまたはフラスコの場合、新鮮なＢＩＮＡＴＥ培地およびＩＬ−２を用い、３日毎（バイオリアクターの場合はより少ない頻度で（５〜７日毎））に行った。
４．２０日の培養拡大の終わりに、ＢＩＮＡＴＥ細胞およびＢＩＮＡＴＥ．ＣＡＲＧＤ２細胞を、７日間またはそれより多くの日数の間、腫瘍の共培養実験に置いた。実験は、６ウェル培養皿において２ｍｌ培地／培養ウェル中で１：１のエフェクターの標的に対する比で（すなわち、０．５×１０６個の自然ＮＫまたは自然ＮＫ．ＣＡＲ．ＧＤ２（エフェクター）を０．５×１０６個のＳＨ−ＳＹ５Ｙ腫瘍細胞（標的）と共に）培養することを伴った。抗ＧＤ２抗体（１０μｇ、１４．Ｇ２ａモノクローナル抗体）を共培養群の各々に添加し、活性化細胞のＡＤＣＣ能を評価した。腫瘍およびエフェクター細胞の共培養を、サイトカインの非存在下で実施した。共培養は、３〜７日目に顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって評価した。
データは、腫瘍を非改変の自然ＮＫまたは自然ＮＫ．ＣＡＲ．ＧＤ２と共に、１４．Ｇ２ａ ＡＤＣＣ抗体の存在下または非存在下で共培養後の残存腫瘍のパーセンテージを含んだ。対照における残存ＳＨ−ＳＹ５Ｙ腫瘍を、９９．５％として測定した。１４．Ｇ２ａ抗体をＳＨ−ＳＹ５Ｙ腫瘍細胞に添加しても、対照（９８．５％）と比較して差はなかった。非改変活性化自然ＮＫ細胞を、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ腫瘍細胞に添加すると、残存腫瘍は２２％であった。１４Ｇ．２ａ抗体を、自然ＮＫ細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ腫瘍細胞の組合せに添加すると、より少ない残存腫瘍パーセンテージ（１４．５％）をもたらした。自然ＮＫ．ＣＡＲ．ＧＤ２細胞をＳＨ−ＳＹ５Ｙ腫瘍細胞に添加すると、４０．９％の残存腫瘍パーセンテージをもたらし、自然ＮＫ．ＣＡＲ．ＧＤ２細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ腫瘍細胞、および１４．Ｇ２ａ抗体を共培養した場合、残存腫瘍パーセンテージは８．７％に低下した。ＦｃγＩＩＩ受容体発現を有する細胞、例えば活性化自然細胞の存在下では、抗体によるＡＤＣＣ活性は腫瘍殺滅を増強した。
（実施例２３）
別々の実験において、拡大の間のサイトカインの切り替えが細胞含有量に及ぼす効果を評価した。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行った。
２．単核細胞を、実験室規模のＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム分離を使用するαβＴ細胞枯渇に供した。
３．得られたαβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、５％ＡＢ血清を補充したＮＫ ＭＡＣＳ（商標）培地（＃１３０−１０７−８７９（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）（あるいは、他の培地、例えばＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓの培地、ＣＥＬＬＧＥＮＩＸ培地等を使用してもよい）を用いるフィーダーフリー培養条件に置いた。
４．活性化は、ＣａｐｒｉｃｏによるＧＭＰ精製された１０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（クローンＢａｂ２８１）および１０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（クローンＯＫＴ１１）または５０ｎｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ４６（クローンＢａｂ２８１）および５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２（クローンＯＫＴ１１）（あるいは、活性化剤の他の濃度を使用してもよく、他の剤を活性化のために添加してもよい）のいずれかの組合せによって達成された。活性化αβＴＣＲｎｅｇ細胞集団を、２４ウェルプレート中０．２５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度において、５％ＡＢ血清を補充したＮＫ ＭＡＣＳ（商標）培地（＃１３０−１０７−８７９（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）（あるいは、他の培地、例えばＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓの培地、ＣＥＬＬＧＥＮＩＸ培地等を使用してもよい）を用い、以下の条件：
ａ．５００ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）
ｂ．１０ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）
ｃ．５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５の組合せ
ｄ．５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の組合せ
ｅ．１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３の組合せ
の１つを用いる、フィーダーフリー培養条件で培養拡大した後、Ｔ７５フラスコに移した。
５．培地交換は、新鮮な培地および上記に列挙した条件の１つを用い、３日毎に（バイオリアクターの場合はより少ない頻度で（５〜７日毎））行った。
６．細胞を、０．２５〜０．５×１０６個／ｍｌ（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）の濃度で播種した。
７．さらに、最初の２５日間ＩＬ−２によって最初に拡大させた細胞を次に洗浄し、培養終了のとき（３０日目）までＩＬ−１５を補充した。ＩＬ−１５によって最初に拡大させた細胞を、２５日目に洗浄した後、３０日目の培養終了のときまでＩＬ−２を補充した（サイトカイン切り替え条件と呼ぶ）。一部の例では、最初の２０日間ＩＬ−２によって最初に拡大させた細胞を次に洗浄し、培養終了のとき（３０日目）までＩＬ−１５を補充した。最初にＩＬ−１５によって拡大させた細胞を、２０日目に洗浄した後、３０日目の培養終了のときまでＩＬ−２を補充した。代替の組合せまたは他のサイトカイン、例えばＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＯＫＴ３、ＯＫＴ１１、および抗ＮＣＲを切り替え条件に使用してもよい。
８．拡大の終わりに、ＢＩＮＡＴＥ細胞を、ＮＫおよびγδＣＤ３＋Ｔ細胞含有量に関して解析し、フローサイトメトリーを介して細胞上の受容体発現によって特徴付けた。
本実施例では、単一のサイトカインを切り替え条件と比較し（ＩＬ−２と、ＩＬ−２のＩＬ−１５への切り替えと比較する）、ＩＬ−２とＩＬ−２／ＩＬ−１５との比較の場合、γδＴ細胞数は、ＩＬ−１５を添加するとＩＬ−２単独と比較して増加した（それぞれ、７０％対５０％）。ＩＬ−１５とＩＬ−１５／ＩＬ−２との比較の場合、ＮＫ集団は、切り替え条件ではＩＬ−１５単独と比較して増加した（それぞれ、９０％対８０％）。ＩＬ−２およびＩＬ−１５はいずれも細胞上のＩＬ−２受容体との相互作用を通して作用することから、データは、特定のサイトカインによる最初の拡大条件に都合がよい集団の拡大が、他のサイトカインへの切り替えによって増強されることを示している。
（実施例２４）
純粋なＮＫ細胞または純粋なγδＴ細胞の単離
本実施例では、純粋なＮＫ細胞集団を単離するプロセスおよび純粋なγδＴ細胞集団を単離するプロセスを記載する。本プロセスの例としての変形形態を例証するフローチャートを図２４に表す。
１．正常で健常なドナー由来のバフィーコートに、手動での遠心分離器での分離によって実施するＦｉｃｏｌｌ（商標）による勾配細胞分離を行う；Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配、ＳＥＰＡＸ、Ｃｏｂｅ２９９１、またはエルトリエーションシステムも同様に使用してもよい。あるいは、アフェレーシス、臍帯血単位、骨髄、または体液、例えば腹水、ＣＳＦ、もしくは胸水を、勾配遠心分離を行ってまたは行うことなく細胞供給源として使用してもよい。
２．単核細胞を、直接使用するか、もしくは勾配分離後に使用するか、またはさらなる細胞選択、例えばＦｉｃｏｌｌ（商標）ＭＮＣ、抗体枯渇、ＮＫの正の選択、ＮＫの負の選択、γδＴ細胞の負の選択、および／またはＣＤ３＋の正の選択などに供する。ある特定の例では、単核細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気ビーズに基づく方法または他の細胞選択技術を使用してＣＤ５６＋ＮＫ細胞の正の選択または負の選択に供する。あるいは、細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気ビーズに基づく技術または他の細胞選択技術を使用してγδＴＣＲ＋の正の選択に供してもよい。あるいは、細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気ビーズに基づく技術または他の細胞選択技術を使用してＣＤ３＋細胞枯渇に供してもよい。
３．次に、得られた細胞集団を、可溶性または架橋した抗ＬＦＡおよび抗ＮＣＲ抗体の存在下、ＢＩＮＡＴＥ培地（５％ＡＢ血清を補充したＮＫ ＭＡＣＳ（商標）培地＃１３０−１０７−８７９ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ（あるいは、他の培地、例えばＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ培地、ＣＥＬＬＧＥＮＩＸ培地等を使用してもよい））、または、ヒト血清補充ありまたは無しの、他の動物成分フリーの培養培地、例えばＩｎ ＶｉｖｏまたはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、またはＣｅｌｌｇｅｎｉｘを用いる、フィーダーフリー培養において活性化する。
４．細胞拡大は、Ｔ７５フラスコにおいて０．２５〜５×１０６個／ｍｌの細胞播種濃度（あるいは細胞播種濃度は、培養バッグ、フラスコ、または他の大きい培養容器、例えばバイオリアクター（Ｇ−Ｒｅｘ）では１×１０６個／ｍｌまでの範囲であり得る）で、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびその組合せなどのサイトカインを補充することによって行う。培地交換は、３日毎（バイオリアクターの場合はより少ない頻度で（５〜７日毎））に成長培地およびサイトカインによって行う。
５．得られた７、２０、３０、４５、および６０日目の培養物は、ＮＫおよびγδＴ細胞の混合物のＢＩＮＡＴＥ集団を含み得て、次にこれを投与のために凍結保存する。あるいは、得られた細胞集団に、さらなる拡大後細胞選択ステップ、例えばＮＫ ＣＤ５６＋枯渇を行ってもよく、それによって純粋なγδＴ細胞集団を得てもよい。あるいは、細胞に、γδＴ細胞の正の除去または負の選択を行って純粋なＮＫ集団を得てもよく、またはＣＤ１６の正の選択を行って高度に富化されたＡＤＣＣ ＦｃｙＩＩＩ受容体＋集団を生じる。あるいは、細胞にＮＫ枯渇を行った後にＡＤＣＣ γδＴ細胞集団についてのＣＤ１６選択を行ってもよい。
（実施例２５）
レトロウイルス構築物
本実施例では、上記のある特定の例において使用したレトロウイルスベクターＣＡＲＧＤ２、ＣＡＲＣＤ１２３、およびＣＡＲＣＤ１９を記載する。
ベクター骨格
以下に記載される構築物は、ＳＦＧ骨格を含み、これはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に基づくレトロウイルスベクターを使用する。パッケージング配列（ｐｓｉ）を除く全てのｅｎｖおよびｇａｇ−ｐｏｌを除去した。その結果、ベクターは複製インコンピテントである。
産生細胞株
以下のレトロウイルス構築物を産生するためのパッケージング細胞株を、ＯＰＢＧ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｔｕｍｏｒ研究所の実験室の環境において専用の層流フードおよびＣＯ２インキュベーター、ならびにガンマ線照射したPharmagradeのＦＢＳ（ＥｕｒｏＣｌｏｎｅ、カタログＥＣＳ０１７２Ｌ、ロットＥＵＳ０１３１９０６ＧＩ）を除き非動物由来材料を使用して生成した。パッケージング細胞株は、ＢｉｏＶｅｃ Ｐｈａｒｍａから受領したｃＧＭＰに基づいて寄託されたヒトベースの２９３ＶＥＣ ＲＤ１１４産生株から生成した。特に、２９３ＶＥＣ ＲＤ１１４細胞は、それがヒト起源の細胞であり、大規模臨床等級の産生にとって適した高いベクター力価の産生を可能にすることから、パッケージング細胞株として選択した。
ＣＡＲＧＤ２
ｉＣ９−ＣＡＲＧＤ２．ＣＤ２８．４１ｂｂ．ＣＤ３ゼータ（ＯＰＢＧ−９１ベクター）レトロウイルスベクターを、Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｏ Ｂａｍｂｉｎｏ Ｇｅｓｕ（ＯＰＢＧ）、“Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｔｕｍｏｒ”研究所において構築した。２つのトランスジーン、すなわち誘導型カスパーゼ９（ｉＣ９）およびＣＡＲＧＤ２（ｉＣ９−ＣＡＲＧＤ２．ＣＤ２８．４１ｂｂ．ＣＤ３ゼータ）の同時発現を可能にするバイシストロニックベクターを使用した。単一細胞クローニングを実施し、最高力価を産生した（上清中のベクターの存在に関してＰＣＲ解析を使用して）２９３ＶＥＣ ＲＤ１１４クローン（すなわち、ＯＰＢＧ−９１−７）を拡大させ、Ｏｆｆｉｃｉｎａ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ＯＰＢＧに寄託し、無菌性およびマイコプラズマに関して試験した後、ｃＧＭＰ条件下でレトロウイルス産生のために使用した。
ｉＣ９構成要素において、細胞内に発現されるＣａｓｐ９タンパク質の触媒ドメインを、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）に由来する薬物結合ドメインに融合する。抗原結合後に活性化シグナルを形質導入するためにＣＤ２８膜貫通ドメインおよびそのエンドドメイン、４．１ｂｂ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ細胞質ドメインとインフレームの、ヒト抗原ＧＤ２に対して特異的なモノクローナル抗体１４．Ｇ２Ａの融合ＶＨ−ＶＬ領域の一本鎖に基づくＣＡＲ分子を、アプローチの安全性態様を改善するためにレトロウイルスベクターにおいてｉＣ９の配列を含む遺伝子カセット後にクローニングした。
ｉＣ９．ＣＡＲＧＤ２．ＣＤ２８．４１ｂｂ．ＣＤ３ｚの発現および活性に関するある特定の機能的および構造的構成要素を以下の表９に要約し、本明細書に列挙する：
・ ５’ＬＴＲ − ベクターの５’末端のレトロウイルス長末端反復配列（プロモーター配列として機能する）。
・ ψ − レトロウイルスカプシド化シグナル（ｐｓｉ；ＲＮＡをビリオン粒子にパッケージングするために必要）。
・ ＳＡ − スプライスアクセプター部位。
・ ｉＣａｓｐ９ − 誘導型カスパーゼ−９発現カセット。ｉＣａｓｐ９は、６アミノ酸のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して改変ＣＡＲＤドメイン欠失ヒトカスパーゼ−９に接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）で構成される。
・ ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖ − ＡＰ１９０３に対する結合親和性を最適にするためにＦ３６Ｖ変異を含有する操作されたＦＫ５０６結合タンパク質。ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖタンパク質ドメインは、連結した治療タンパク質の薬物結合／オリゴマー化ドメインとして役立つ。ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖは、カスパーゼ９の調節因子として機能する。ＡＰ１９０３の非存在下では、ｉＣａｓｐ９は最少の活性を有し；ＡＰ１９０３がＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖに結合すると、二量体化を促進し、２つのカスパーゼ−９分子を並置させてアポトーシスを開始する。このように、ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖ部分は、Ａｐａｆ−１関連オリゴマー化を媒介するカスパーゼ−９の内因性の二量体化／活性化モジュール（カスパーゼ活性化および動員ドメイン；ＣＡＲＤ）を機能的に交換する。
・ リンカー − 切り替え調節因子配列をカスパーゼ−９に融合するために使用される合成Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙペプチドリンカー。
・ カスパーゼ−９ − ヒトカスパーゼ−９ｃＤＮＡ配列（重要なアポトーシス促進性の調節因子）および構築物の治療構成要素（調節された自殺遺伝子）。自然発生Ａｐａｆ１結合を低減させ、したがってバックグラウンド殺滅を低減させるために、内因性の二量体化／活性化モジュール（カスパーゼ活性化および動員ドメイン；ＣＡＲＤ）を欠失させた。
・ ２Ａ − Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の合成の２０アミノ酸のペプチドをコードし、これはカスパーゼ−９タンパク質とＣＡＲタンパク質との間の切断可能なリンカーとして機能する。
・ シグナルペプチド − 小胞体から細胞膜への分泌タンパク質の正確な移動を可能にする短いアミノ酸配列。
・ ＣＡＲ − ＣＤ２８ＴＭおよび共刺激ドメイン、４．１ｂｂ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ細胞質ドメインとインフレームの、ヒト抗原ＧＤ２に対して特異的なモノクローナル抗体１４．Ｇ２Ａの融合ＶＨ−ＶＬ領域の一本鎖に基づくＣＡＲ分子。
・ ３’ＬＴＲ − ベクターの３’末端でのレトロウイルス長末端反復配列（ターミネーター配列／ポリアデニル化配列として機能する）。
Figure 2021532829
Figure 2021532829
参照の電子ベクター配列を、ベクター構築物の各構成要素のＤＮＡ配列ファイルを組み合わせることによってアセンブルした。レトロウイルスゲノムはＲＮＡに基づくことから、２９３ＶＥＣ細胞株へのトランスフェクションのために使用したプラスミドＤＮＡに関して配列解析を実施した（レトロウイルス産物調製における最初のステップ）。Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｏ Ｂａｍｂｉｎｏ ＧｅｓｕにおいてＯＰＢＧ−９１ベクター全体について双方向シークエンシングを実施した。シークエンシングランを、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアを使用してアセンブルした。理論的な参照電子配列と比較してミスマッチ塩基は同定されなかった。
ＣＡＲＣＤ１２３
ΔＣＤ１９−２Ａ−ＣＡＲ−ＣＤ１２３−ΔＣＤ３４．ＣＤ８．４１ｂｂ．ＣＤ３ゼータ（ＯＰＢＧ−２４２ベクター）レトロウイルスベクターを、Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｏ Ｂａｍｂｉｎｏ Ｇｅｓｕ（ＯＰＢＧ）、“Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｔｕｍｏｒ”研究所において構築した。２つのトランスジーン、すなわちΔＣＤ１９およびＣＡＲＣＤ１２３の同時発現を可能にするバイシストロニックベクター（ΔＣＤ１９−２Ａ−ＣＡＲ−ＣＤ１２３−ΔＣＤ３４．ＣＤ８．４１ｂｂ．ＣＤ３ゼータ）を使用した。単一細胞クローニングを実施し、最高の力価を産生したクローン（上清中のベクターの存在に関するＰＣＲ解析を使用して）を、上記のように拡大させて寄託した。
ΔＣＤ１９は、膜貫通部分に連結したヒトＣＤ１９の細胞外ドメインを表す。これは、遺伝子改変細胞の選択および表現型特徴付けを助けるために二重の機能を有する。抗原結合後の活性化シグナルの形質導入のためにＣＤ８膜貫通ドメインおよびそのエンドドメイン、４．１ｂｂ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ細胞質ドメインとインフレームの、ヒト抗原ＣＤ１２３に対して特異的なモノクローナル抗体７Ｇ３の融合ＶＨ−ＶＬ領域の一本鎖に基づくＣＡＲ分子を、レトロウイルスベクターにおいて２Ａ配列の使用を通してΔＣＤ１９の配列を含む遺伝子発現カセット後にクローニングした。
ΔＣＤ１９−２Ａ−ＣＡＲ−ＣＤ１２３−ΔＣＤ３４．ＣＤ８．４１ｂｂ．ＣＤ３ｚ発現および活性のためのある特定の機能的および構造的構成要素を以下の表１０に要約し、本明細書に列挙する：
・ ５’ＬＴＲ − ベクターの５’末端のレトロウイルス長末端反復配列（プロモーター配列として機能する）。
・ ψ − レトロウイルスカプシド化シグナル（ｐｓｉ；ＲＮＡをビリオン粒子にパッケージングするために必要）。
・ ＳＡ − スプライスアクセプター部位。
・ △ＣＤ１９ − 最適化ヒト細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。
・ ２Ａ − Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の合成の２０アミノ酸のペプチドをコードする。
・ シグナルペプチド − 小胞体から細胞膜への分泌タンパク質の正確な移動を可能にする短いアミノ酸配列。
・ △ＣＤ３４ −形質導入後のＣＡＲ＋ Ｔ細胞を検出する助けとなる、ヒトＣＤ３４に由来する短いペプチドを含む。
・ ＣＡＲ − ＣＤ８ＴＭおよび共刺激ドメイン、４．１ｂｂ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ細胞質ドメインとインフレームの、ヒト抗原ＣＤ１２３に対して特異的なモノクローナル抗体７Ｇ３の融合ＶＨ−ＶＬ領域の一本鎖に基づくＣＡＲ分子。
・ ３’ＬＴＲ − ベクターの３’末端でのレトロウイルス長末端反復配列（ターミネーター配列／ポリアデニル化配列として機能する）。
Figure 2021532829
参照の電子ベクター配列をベクター構築物の各構成要素のＤＮＡ配列ファイルを組み合わせることによってアセンブルした。レトロウイルスゲノムはＲＮＡに基づくことから、２９３ＶＥＣ細胞株へのトランスフェクションのために使用したプラスミドＤＮＡに関して配列解析を実施した（レトロウイルス産物調製における最初のステップ）。Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｏ Ｂａｍｂｉｎｏ ＧｅｓｕにおいてＯＰＢＧ−２４２ベクター全体について双方向シークエンシングを実施した。シークエンシングランを、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアを使用してアセンブルした。理論的な参照電子配列と比較してミスマッチ塩基は同定されなかった。
ＣＡＲＣＤ１９
治療的レトロウイルス構築物ＳＦＧ−ｉＣ９−Ｃａｒ．ＣＤ１９．４１ｂｂは、マウス抗原ＣＤ１９、４．１ｂｂ共刺激ドメインに対して特異的なモノクローナル抗体の融合ＶＨ−ＶＬ領域の一本鎖に連結された合成リガンド誘導型ヒトカスパーゼ−９ｃＤＮＡをコードする。アセンブリは、それが第２世代であることを除き、上記のＣＡＲＧＤ２と同じである。レトロウイルスベクターを、ＥＵ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて構築した。単一細胞クローニングを実施し、最高の力価を産生したクローン（上清中のベクターの存在に関するＰＣＲ解析を使用して）を拡大させ、ｃＧＭＰ施設に寄託し、無菌性およびマイコプラズマに関する試験の後、ｃＧＭＰ条件下でのレトロウイルス産生のために使用した。
ＳＦＧ−ｉＣ９−Ｃａｒ．ＣＤ１９．４１ｂｂ発現および活性のためのある特定の機能的および構造的構成要素を以下に列挙する：
・ ５’ＬＴＲ − ベクターの５’末端のレトロウイルス長末端反復配列（プロモーター配列として機能する）。
・ ψ − レトロウイルスカプシド化シグナル（ｐｓｉ；ＲＮＡをビリオン粒子にパッケージングするために必要）。
・ ＳＡ − スプライスアクセプター部位。
・ ｉＣａｓｐ９ − 誘導型カスパーゼ−９発現カセット。ｉＣａｓｐ９は、６アミノ酸Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して改変ＣＡＲＤドメイン欠失ヒトカスパーゼ−９に接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）で構成される。
・ ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖ − ＡＰ１９０３に対する結合親和性を最適にするためにＦ３６Ｖ変異を含有する操作されたＦＫ５０６結合タンパク質。ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖタンパク質ドメインは、連結した治療タンパク質の薬物結合／オリゴマー化ドメインとして役立つ。ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖは、カスパーゼ９の調節因子として機能する。ＡＰ１９０３の非存在下では、ｉＣａｓｐ９は最少の活性を有し；ＡＰ１９０３がＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖに結合すると、二量体化を促進し、２つのカスパーゼ−９分子を並置させてアポトーシスを開始する。このように、ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖ部分は、Ａｐａｆ−１関連オリゴマー化を媒介するカスパーゼ−９の内因性の二量体化／活性化モジュール（カスパーゼ活性化および動員ドメイン；ＣＡＲＤ）を機能的に交換する。
・ リンカー − 切り替え調節因子配列をカスパーゼ−９に融合するために使用される合成Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙペプチドリンカー。
・ カスパーゼ−９ − ヒトカスパーゼ−９ ｃＤＮＡ配列（重要なアポトーシス促進性の調節因子）および構築物の治療構成要素（調節された自殺遺伝子）。自然発生Ａｐａｆ１結合を低減させ、したがってバックグラウンド殺滅を低減させるために、内因性の二量体化／活性化モジュール（カスパーゼ活性化および動員ドメイン；ＣＡＲＤ）を欠失させた。
・ ２Ａ − Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の合成２０アミノ酸のペプチドをコードし、これはカスパーゼ−９タンパク質とＣＡＲタンパク質との間の切断可能なリンカーとして機能する。
・ シグナルペプチド − 小胞体から細胞膜への分泌タンパク質の正確な移動を可能にする短いアミノ酸配列。
・ ＣＡＲ − マウス抗原ＣＤ１９、４．１ｂｂ共刺激ドメインに対して特異的なモノクローナル抗体の融合ＶＨ−ＶＬ領域の一本鎖に基づくＣＡＲ分子。
・ ３’ＬＴＲ − ベクターの３’末端でのレトロウイルス長末端反復配列（ターミネーター配列／ポリアデニル化配列として機能する）。
（実施例２６）
ある特定の非制限的な実施形態の例
以下に本技術のある特定の実施形態の非制限的な例を列挙する。
Ａ１．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物を製造する方法であって、
１または複数の対象から細胞を含有する試料を得ること；
ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞を含む枯渇細胞集団を生成する条件下で試料からアルファ．ベータＴ細胞を枯渇させること；ならびに
枯渇細胞集団を（ａ）細胞接着ポリペプチドに免疫特異的に結合する少なくとも１種の外因性ポリペプチド、および（ｂ）細胞接着ポリペプチドとは異なるポリペプチドに免疫特異的に結合し、試料集団の１種または複数種の細胞の表面上に発現される少なくとも１種の外因性ポリペプチドに接触させることを含む活性化条件に枯渇細胞集団を曝露すること；ならびに
枯渇細胞集団を少なくとも１種の補助的ポリペプチドに接触させることを含む拡大条件に枯渇細胞集団を曝露し、それによってＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物を生成すること
を含む方法。
Ａ１．１．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物を製造する方法であって、
１または複数の対象から細胞を含有する試料を得ること；
試料を（ａ）細胞接着ポリペプチドに免疫特異的に結合する少なくとも１種の外因性ポリペプチド、および（ｂ）細胞接着ポリペプチドとは異なるポリペプチドに免疫特異的に結合し、試料集団の１種または複数種の細胞の表面上に発現される少なくとも１種の外因性ポリペプチドに接触させることを含む活性化条件であって、（ａ）もしくは（ｂ）が可溶性であるか、または（ａ）および（ｂ）が可溶性である活性化条件に試料を曝露すること；ならびに
試料を少なくとも１種の補助的ポリペプチドに接触させることを含む拡大条件に試料を曝露し、それによってＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物を生成すること
を含む方法。
Ａ２．少なくとも１種の補助的ポリペプチドが、集団におけるガンマ．デルタＴ細胞の量と比較したＮＫ細胞の量が少なくとも１種の補助的ポリペプチドの量および／またはタイプに依存的であるように選択される、実施形態Ａ１またはＡ１．１に記載の方法。
Ａ２．１．少なくとも１種の補助的ポリペプチドが、枯渇細胞集団を少なくとも１種の補助的ポリペプチドに接触させた後に、細胞の集団におけるガンマ．デルタＴ細胞と比較してＮＫ細胞の量を増加または減少させる、実施形態Ａ１、Ａ１．１またはＡ２に記載の方法。
Ａ３．活性化条件が、非ヒト動物由来の血清を含まない、実施形態Ａ１、Ａ１．１、Ａ２またはＡ２．１のいずれかに記載の方法。
Ａ４．拡大条件が、非ヒト動物由来の血清を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ３のいずれかに記載の方法。
Ａ５．活性化条件がフィーダー細胞を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれかに記載の方法。
Ａ６．拡大条件がフィーダー細胞を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ５のいずれかに記載の方法。
Ａ７．試料が、末梢血、肝組織、上皮組織、骨髄、および臍帯血から選択される、実施形態Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の方法。
Ａ８．試料が末梢血である、実施形態Ａ７に記載の方法。
Ａ９．末梢血試料が処理された試料である、実施形態Ａ８に記載の方法。
Ａ１０．試料が臍帯血である、実施形態Ａ７に記載の方法。
Ａ１１．臍帯血試料が処理された試料である、実施形態Ａ１０に記載の方法。
Ａ１２．（ｂ）における外因性ポリペプチドが、ＮＫ細胞活性化受容体、ガンマ．デルタＴ細胞活性化受容体、または両方に免疫特異的に結合する、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれかに記載の方法。
Ａ１３．受容体が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６である、実施形態Ａ１２に記載の方法。
Ａ１４．受容体がＮＫｐ４６である、実施形態Ａ１３に記載の方法。
Ａ１５．（ａ）における外因性ポリペプチドが、ＣＤ２に免疫特異的に結合する、実施形態Ａ１〜Ａ１４のいずれかに記載の方法。
Ａ１６．（ａ）もしくは（ｂ）、または（ａ）および（ｂ）における外因性ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合性断片である、実施形態Ａ１〜Ａ１５のいずれかに記載の方法。
Ａ１７．（ａ）または（ｂ）のうちの少なくとも１つが可溶性である、実施形態Ａ１〜Ａ１６のいずれかに記載の方法。
Ａ１７．１．（ａ）および（ｂ）における外因性ポリペプチドの両方が可溶性である、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれかに記載の方法。
Ａ１８．（ａ）における外因性ポリペプチドまたは（ｂ）における外因性ポリペプチドが基質に結合する、実施形態Ａ１〜Ａ１６のいずれかに記載の方法。
Ａ１９．活性化条件が、試料または枯渇細胞集団を少なくとも２種の外因性ポリペプチドに接触させることを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれかに記載の方法。
Ａ２０．第１の外因性ポリペプチドがＣＤ２に免疫特異的に結合し、第２の外因性ポリペプチドがＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する、実施形態Ａ１９に記載の方法。
Ａ２１．第１の外因性ポリペプチドおよび／または第２の外因性ポリペプチドが抗体またはその抗原結合性断片である、実施形態Ａ１９またはＡ２０に記載の方法。
Ａ２２．活性化条件のポリペプチド構成要素が、
（ａ）細胞接着ポリペプチドＣＤ２に免疫特異的に結合する外因性ポリペプチド；および
（ｂ）（ａ）における外因性ポリペプチドとは異なり、ＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する外因性ポリペプチド
から本質的になるかまたはそれからなる、実施形態Ａ１〜Ａ２１のいずれかに記載の方法。
Ａ２３．補助的ポリペプチドが、サイトカインおよび／またはガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ２２のいずれかに記載の方法。
Ａ２４．拡大条件が、試料または枯渇細胞集団をサイトカインである少なくとも１種の補助的ポリペプチド、および必要に応じてガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合する補助的ポリペプチドに接触させることを含む、実施形態Ａ２３に記載の方法。
Ａ２５．サイトカインがインターロイキン（ＩＬ）である、実施形態Ａ２４に記載の方法。
Ａ２６．少なくとも１種の補助的ポリペプチドが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５、またはその任意の組合せを含む、実施形態Ａ２３〜Ａ２５のいずれかに記載の方法。
Ａ２７．拡大条件が、試料または枯渇細胞集団を
（ａ）ＩＬ−２ポリペプチド、および必要に応じてガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチド；
（ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチド；または
（ｃ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＩＬ−１５ポリペプチド、ならびに必要に応じてガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチド
に接触させることを含む、実施形態Ａ２３〜Ａ２６のいずれかに記載の方法。
Ａ２８．ガンマ．デルタＴ細胞上の受容体がＣＤ３である、実施形態Ａ２３〜Ａ２７のいずれかに記載の方法。
Ａ２９．ガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドが、抗体またはその抗原結合性断片である、実施形態Ａ２３〜Ａ２８のいずれかに記載の方法。
Ａ３０．拡大条件が、試料を
（ａ）ＩＬ−２ポリペプチド；
（ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチド；
（ｃ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＩＬ−１５ポリペプチド；
（ｄ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体；または
（ｅ）ＩＬ−２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体
に接触させることを含む、実施形態Ａ２９に記載の方法。
Ａ３１．ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体がＯＫＴ３である、実施形態Ａ３０に記載の方法。
Ａ３２．活性化および拡大条件が同時にまたは任意の順序で逐次的に実施される、実施形態Ａ１〜Ａ３１のいずれかに記載の方法。
Ａ３３．少なくとも１種の外因性ポリペプチドが補助的ポリペプチドとしても機能することができる；または
少なくとも１種の補助的ポリペプチドが外因性ポリペプチドとしても機能することができる；または
少なくとも１種の外因性ポリペプチドが補助的ポリペプチドとしても機能することができ、かつ少なくとも１種の補助的ポリペプチドが外因性ポリペプチドとしても機能することができる、実施形態Ａ１〜Ａ３２のいずれかに記載の方法。
Ａ３４．（ｉ）拡大条件が、試料または枯渇細胞集団をＩＬ−２ポリペプチドに接触させることを含み；
（ｉｉ）得られた、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団が、約２５〜３０％のＮＫ細胞および約７０〜７５％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、実施形態Ａ３０〜Ａ３３のいずれかに記載の方法。
Ａ３５．（ｉ）拡大条件が、試料または枯渇細胞集団をＩＬ−１５ポリペプチドに接触させることを含み；
（ｉｉ）得られた、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団が、約８０〜９９％のＮＫ細胞および約１〜２０％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、実施形態Ａ３０〜Ａ３３のいずれかに記載の方法。
Ａ３６．（ｉ）拡大条件が、試料または枯渇細胞集団をＩＬ−２ポリペプチドおよびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体に接触させることを含み；
（ｉｉ）得られた、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団が、約４０〜４５％のＮＫ細胞および約５５〜６０％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、実施形態Ａ３０〜Ａ３３のいずれかに記載の方法。
Ａ３７．拡大条件が、
試料または枯渇細胞集団を、１種または複数種の補助的ポリペプチドを含む第１の条件セットに接触させ、ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する第１の比を含む第１の細胞集団をもたらすこと；および
第１の細胞集団を、１種または複数種の補助的ポリペプチドを含む第２の条件セットに接触させ、ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する所望の最終的な比を含む第２の細胞集団をもたらすことを含み、第１の条件セットが第２の条件セットとは異なる、実施形態Ａ１〜Ａ３６のいずれかに記載の方法。
Ａ３８．第１の細胞集団が第２の条件セットとの接触前に洗浄される、実施形態Ａ３７に記載の方法。
Ａ３９．第１の条件セットがＩＬ−２を含み、第２の条件セットがＩＬ−１５を含む；
第１の条件セットがＩＬ−１５を含み、第２の条件セットがＩＬ−２を含む；
第１の条件セットがＩＬ−２およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体を含み、第２の条件セットがＩＬ−１５を含む；または
第１の条件セットがＩＬ−１５およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体を含み、第２の条件セットがＩＬ−２およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体を含む、実施形態Ａ３７またはＡ３８に記載の方法。
Ａ４０．ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体がＯＫＴ３である、実施形態Ａ３９に記載の方法。
Ａ４１．試料を活性化および拡大条件に曝露する前に、試料からアルファ．ベータＴ細胞を枯渇させ、それによって枯渇細胞集団を生成すること；ならびに
枯渇細胞集団を活性化および拡大条件に供すること
をさらに含み、
それによってＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物が得られる、実施形態Ａ１．１およびＡ２〜Ａ４０のいずれかに記載の方法。
Ａ４１．１．活性化および拡大の前に、試料または枯渇細胞集団が、ＮＫ細胞またはガンマ．デルタＴ細胞について選択する条件にも、アルファ−ベータＴ細胞以外の細胞を枯渇させる条件にも曝露されない、実施形態Ａ１〜Ａ４１のいずれかに記載の方法。
Ａ４１．２．活性化および拡大の前に、試料または枯渇細胞集団がＣＤ３＋細胞を枯渇させる条件に曝露されない、実施形態Ａ４１．１の方法。
Ａ４２．試料または枯渇細胞集団の細胞が、活性化および拡大の前、間、または後に外因性核酸を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ４１．１のいずれかに記載の方法。
Ａ４３．試料または枯渇細胞集団の細胞が、活性化および拡大の前、間、または後に腫瘍壊死因子受容体も、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、骨髄分化一次応答タンパク質も、自然免疫シグナル伝達アダプターをコードする外因性核酸も含まない、実施形態Ａ１〜Ａ４１．１のいずれかに記載の方法。
Ａ４４．試料または枯渇細胞集団の細胞が、活性化および拡大の前、間、または後に遺伝子改変されない、実施形態Ａ１〜Ａ４３のいずれかに記載の方法。
Ａ４５．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を、それによってガンマ．デルタ細胞が枯渇される処置に供することをさらに含み、得られた集団がＮＫ細胞から本質的になるかまたはそれからなる、実施形態Ａ１〜Ａ４４のいずれかに記載の方法。
Ａ４６．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を、それによってＮＫ細胞が枯渇される処置に供することをさらに含み、得られた集団がガンマ．デルタＴ細胞から本質的になるかまたはそれからなる、実施形態Ａ１〜Ａ４４のいずれかに記載の方法。
Ａ４７．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を、ＮＫ細胞についての正の選択に供することをさらに含み、それによってＮＫ細胞から本質的になるかまたはそれからなる細胞集団が得られる、実施形態Ａ１〜Ａ４５のいずれかに記載の方法。
Ａ４８．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を、ガンマ．デルタ細胞についての正の選択に供することをさらに含み、それによってガンマ．デルタ細胞から本質的になるかまたはそれからなる細胞集団が得られる、実施形態Ａ１〜Ａ４４およびＡ４６のいずれかに記載の方法。
Ａ４９．拡大条件が、試料または枯渇細胞集団のフィーダー細胞フリー培地中での約１週間から約１０週間のインキュベーションを含み、それによってＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された拡大した細胞の集団を含む組成物が得られる、実施形態Ａ１〜Ａ４８のいずれかに記載の方法。
Ａ５０．培養条件が、試料または枯渇細胞集団のフィーダー細胞フリー培地中での約７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２５日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間、５０日間、５５日間、もしくは６０日間もしくはそれより多くの日数、または約２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、もしくは１０週間のインキュベーションを含む、実施形態Ａ４９に記載の方法。
Ａ５１．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団が、拡大条件下の３０日間で約２ｌｏｇより大きく拡大される、実施形態Ａ１〜Ａ５０のいずれかに記載の方法。
Ａ５２．細胞の集団が、拡大条件下の３０日間で約３ｌｏｇより大きく拡大される、実施形態Ａ５１に記載の方法。
Ａ５３．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された拡大した細胞の集団が、疲弊した細胞を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ５２のいずれかに記載の方法。
Ａ５４．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された拡大した細胞の集団が、拡大条件の６０日後に疲弊した細胞を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ５３のいずれかに記載の方法。
Ａ５５．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された拡大した細胞の集団におけるＮＫ細胞の５％未満、４％未満、３％未満、または２％未満がＰＤ−１マーカーを含み、および／または拡大した集団における総細胞もしくは拡大した集団におけるガンマ．デルタＴ細胞の約２０％、１５％、１０％、またはそれ未満がＰＤ−１マーカーを含む、実施形態Ａ１〜Ａ５４のいずれかに記載の方法。
Ａ５６．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団が、集団における総細胞数のパーセンテージとして以下の活性化マーカー：
（ａ）９０％またはそれより多くのＫＩＲ５；
（ｂ）１０％またはそれより多くのＳＩＧＬＥＣ−７；
（ｃ）６０％またはそれより多くのＫＩＲ３Ｄ５１；
（ｄ）１０％またはそれより多くのＫＩＲ２ＤＬ１；
（ｅ）２５％またはそれより多くのＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６；
（ｆ）３５％またはそれより多くのＮＫＧ２Ｄ；
（ｇ）９０％またはそれより多くのＤＮＡＭ１；
（ｈ）８５％またはそれより多くのＮＴＢＡ；
（ｉ）９５％またはそれより多くのＣＤ２；および
（ｊ）５５％またはそれより多くのＫＩＲ３ＤＳ１
のうちの１つまたは複数を含む、実施形態Ａ１〜Ａ５５のいずれかに記載の方法。
Ａ５７．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団が、８０％またはそれより多くの自然免疫細胞を含む、実施形態Ａ１〜Ａ５６のいずれかに記載の方法。
Ａ５８．細胞の約７０％から約１００％の間、または少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％がＣＤ５６＋である、実施形態Ａ５７に記載の方法。
Ａ５９．細胞の約１０％から約４０％の間、または少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、もしくは４０％がＣＤ１６＋である、実施形態Ａ５７またはＡ５８に記載の方法。
Ａ６０．細胞の１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、または２％未満がＣＤ５７＋である、実施形態Ａ５７〜Ａ５９のいずれかに記載の方法。
Ａ６１．試料または枯渇細胞集団が、活性化および拡大の間または後にＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ６０のいずれかに記載の方法。
Ａ６２．活性化条件および拡大条件がビスホスホネートを含まない、実施形態Ａ１〜Ａ６１のいずれかに記載の方法。
Ａ６３．ビスホスホネートがパミドロネートまたはゾレドロネートである、実施形態Ａ６２に記載の方法。
Ａ６４．ガンマ．デルタＴ細胞が、Ｖ．デルタ．１およびＶ．デルタ．２発現に関してポリクローナルである、実施形態Ａ１〜Ａ６３のいずれかに記載の方法。
Ａ６５．ポリクローナルガンマ．デルタＴ細胞が、Ｖ．デルタ．１＋およびＶ．デルタ．１−から選択される少なくとも１つの亜集団、ならびにＶ．デルタ．２＋およびＶ．デルタ．２−から選択される少なくとも１つの亜集団を含む、実施形態Ａ６４に記載の方法。
Ａ６６．実施形態Ａ１〜Ａ６５のいずれかに記載の方法によって得ることができるまたは得られた組成物。
Ｂ１．改変された末梢血細胞の集団を含む組成物であって、その集団が
複数のＮＫ細胞および複数のガンマ．デルタＴ細胞を含み；
アルファ．ベータＴ細胞が枯渇され；
フィーダー細胞を含まない、組成物。
Ｂ２．細胞の約２５％から約４５％の間がＮＫ細胞であり、細胞の約５５％から約７５％の間がガンマ．デルタＴ細胞である；
細胞の約２５％から約３０％の間がＮＫ細胞であり、細胞の約７０％から約７５％の間がガンマ．デルタＴ細胞である；
細胞の約８０％から約９９％の間がＮＫ細胞であり、細胞の約１％から約２０％の間がガンマ．デルタＴ細胞である；または
細胞の約４０％から約４５％の間がＮＫ細胞であり、細胞の約５５％から約６０％の間がガンマ．デルタＴ細胞である、実施形態Ｂ１に記載の組成物。
Ｂ３．細胞の３０％またはそれより多くが活性化される、実施形態Ｂ１またはＢ２に記載の組成物。
Ｂ４．改変された細胞の集団が、集団における総細胞数のパーセンテージとして以下の活性化マーカー：
（ａ）９０％またはそれより多くのＫＩＲ５；
（ｂ）１０％またはそれより多くのＳＩＧＬＥＣ−７；
（ｃ）６０％またはそれより多くのＫＩＲ３Ｄ５１；
（ｄ）１０％またはそれより多くのＫＩＲ２ＤＬ１；
（ｅ）２５％またはそれより多くのＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６；
（ｆ）３５％またはそれより多くのＮＫＧ２Ｄ；
（ｇ）９０％またはそれより多くのＤＮＡＭ１；
（ｈ）８５％またはそれより多くのＮＴＢＡ；
（ｉ）９５％またはそれより多くのＣＤ２；および
（ｊ）５５％またはそれより多くのＫＩＲ３ＤＳ１
のうちの１つまたは複数を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれかに記載の組成物。
Ｂ５．改変された集団が、８０％またはそれより多くの自然免疫細胞を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４のいずれかに記載の組成物。
Ｂ６．改変された集団が、ＣＤ５６＋である活性化細胞傷害性細胞に関して富化されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ５のいずれかに記載の組成物。
Ｂ７．改変された集団が、ＣＤ５７−である活性化細胞傷害性細胞に関して富化されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ６のいずれかに記載の組成物。
Ｂ８．集団が、ＣＤ５６＋ＣＤ５７−である活性化細胞傷害性細胞に関して富化されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ７のいずれかに記載の組成物。
Ｂ９．細胞の約８０％から約１００％の間、または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％がＣＤ５６＋である、実施形態Ｂ６〜Ｂ８のいずれかに記載の組成物。
Ｂ１０．細胞の約１０％から約４０％の間、または少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、もしくは４０％がＣＤ１６＋である、実施形態Ｂ６〜Ｂ９のいずれかに記載の組成物。
Ｂ１１．細胞の５％未満、４％未満、３％未満、または２％未満がＣＤ５７＋である、実施形態Ｂ６〜Ｂ１０のいずれかに記載の組成物。
Ｂ１２．ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞以外の細胞を実質的に含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ１１のいずれかに記載の組成物。
Ｂ１３．５パーセント未満のＮＫＴ細胞を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１２のいずれかに記載の組成物。
Ｂ１４．１パーセント未満のＮＫＴ細胞を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれかに記載の組成物。
Ｂ１５．０．１パーセント未満のＮＫＴ細胞を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれかに記載の組成物。
Ｂ１６．２パーセント未満のアルファ．ベータＴ細胞を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１５のいずれかに記載の組成物。
Ｂ１７．１パーセント未満のアルファ．ベータＴ細胞を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１６のいずれかに記載の組成物。
Ｂ１８．０．１パーセント未満のアルファ．ベータＴ細胞を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１７のいずれかに記載の組成物。
Ｂ１９．集団におけるＮＫ細胞のサブセットがＣＤ１６＋細胞である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１８のいずれかに記載の組成物。
Ｂ２０．大多数のガンマ．デルタＴ細胞がＣＤ５７−細胞である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１９のいずれかに記載の組成物。
Ｂ２１．大多数のＮＫ細胞がＣＤ５７−細胞である、実施形態Ｂ１〜Ｂ２０のいずれかに記載の組成物。
Ｂ２２．ガンマ．デルタＴ細胞が、Ｖ．デルタ．１およびＶ．デルタ．２発現に関してポリクローナルである、実施形態Ｂ１〜Ｂ２１のいずれかに記載の組成物。
Ｂ２３．ポリクローナルガンマ．デルタＴ細胞が、Ｖ．デルタ．１＋およびＶ．デルタ．１−から選択される少なくとも１つの亜集団、ならびにＶ．デルタ．２＋およびＶ．デルタ．２−から選択される少なくとも１つの亜集団を含む、実施形態Ｂ２２に記載の組成物。
Ｂ２４．大多数のガンマ．デルタＴ細胞がＶ．デルタ．１を発現し、少数のガンマ．デルタＴ細胞がＶ．デルタ．２を発現する；または
少数のガンマ．デルタＴ細胞がＶ．デルタ．１を発現し、大多数のガンマ．デルタＴ細胞がＶ．デルタ．２発現を発現する、実施形態Ｂ１〜Ｂ２３のいずれかに記載の組成物。
Ｂ２５．集団における少数の細胞がＣＤ３陽性細胞であり、集団における大多数の細胞がＣＤ３陰性細胞である；または
集団における大多数の細胞がＣＤ３陽性細胞であり、集団における少数の細胞がＣＤ３陰性細胞である、実施形態Ｂ１〜Ｂ２４のいずれかに記載の組成物。
Ｂ２６．ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する比が１より大きい、実施形態Ｂ１〜Ｂ２５のいずれかに記載の組成物。
Ｂ２７．ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する比が１未満である、実施形態Ｂ１〜Ｂ２５のいずれかに記載の組成物。
Ｂ２８．改変された細胞の集団が、約９８〜９９％のＮＫ細胞および約１〜２％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、実施形態Ｂ２６に記載の組成物。
Ｂ２９．改変された細胞の集団が、約２５％から約４５％の間のＮＫ細胞および約５５％から約７５％の間のガンマ．デルタＴ細胞を含む、実施形態Ｂ２７に記載の組成物。
Ｂ３０．改変された細胞の集団が、約２５〜３０％のＮＫ細胞および約７０〜７５％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、実施形態Ｂ２７に記載の組成物。
Ｂ３１．改変された細胞の集団が、約４０〜４５％のＮＫ細胞および約５５〜６０％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、実施形態Ｂ２７に記載の組成物。
Ｂ３２．ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の約５０％から約９９％もしくはそれより多くの間、または約５０％より多くのもしくはそれに等しい、５１％より多くのもしくはそれに等しい、５２％より多くのもしくはそれに等しい、５３％より多くのもしくはそれに等しい、５４％より多くのもしくはそれに等しい、５５％より多くのもしくはそれに等しい、５６％より多くのもしくはそれに等しい、５７％より多くのもしくはそれに等しい、５８％より多くのもしくはそれに等しい、５９％より多くのもしくはそれに等しい、６０％より多くのもしくはそれに等しい、６％より多くのもしくはそれに等しい、６２％より多くのもしくはそれに等しい、６３％より多くのもしくはそれに等しい、６４％より多くのもしくはそれに等しい、６５％より多くのもしくはそれに等しい、６６％より多くのもしくはそれに等しい、６７％より多くのもしくはそれに等しい、６８％より多くのもしくはそれに等しい、６９％より多くのもしくはそれに等しい、７０％より多くのもしくはそれに等しい、７１％より多くのもしくはそれに等しい、７２％より多くのもしくはそれに等しい、７３％より多くのもしくはそれに等しい、７４％より多くのもしくはそれに等しい、７５％より多くのもしくはそれに等しい、７６％より多くのもしくはそれに等しい、７７％より多くのもしくはそれに等しい、７８％より多くのもしくはそれに等しい、７９％より多くのもしくはそれに等しい、８０％より多くのもしくはそれに等しい、８１％より多くのもしくはそれに等しい、８２％より多くのもしくはそれに等しい、８３％より多くのもしくはそれに等しい、８４％より多くのもしくはそれに等しい、８５％より多くのもしくはそれに等しい、８６％より多くのもしくはそれに等しい、８７％より多くのもしくはそれに等しい、８８％より多くのもしくはそれに等しい、８９％より多くのもしくはそれに等しい、９０％より多くのもしくはそれに等しい、９１％より多くのもしくはそれに等しい、９２％より多くのもしくはそれに等しい、９３％より多くのもしくはそれに等しい、９４％より多くのもしくはそれに等しい、９５％より多くのもしくはそれに等しい、９６％より多くのもしくはそれに等しい、９７％より多くのもしくはそれに等しい、９８％より多くのもしくはそれに等しい、９９％より多くのもしくはそれに等しい、８０％より多くのもしくはそれに等しい、８１％より多くのもしくはそれに等しい、８２％より多くのもしくはそれに等しい、８３％より多くのもしくはそれに等しい、８４％より多くのもしくはそれに等しい、８５％より多くのもしくはそれに等しい、８６％より多くのもしくはそれに等しい、８７％より多くのもしくはそれに等しい、８８％より多くのもしくはそれに等しい、８９％より多くのもしくはそれに等しい、９０％より多くのもしくはそれに等しい、９１％より多くのもしくはそれに等しい、９２％より多くのもしくはそれに等しい、９３％より多くのもしくはそれに等しい、９４％より多くのもしくはそれに等しい、９５％より多くのもしくはそれに等しい、９６％より多くのもしくはそれに等しい、９７％より多くのもしくはそれに等しい、９８％より多くのもしくはそれに等しい、９９％より多くのもしくはそれに等しい、またはその端数、最大１００％がＣＤ８＋である、実施形態Ｂ１〜Ｂ３１のいずれかに記載の組成物。
Ｂ３３．ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の２％未満がＣＤ４＋である、実施形態Ｂ３２に記載の組成物。
Ｂ３４．ＮＫ細胞および／またはガンマ．デルタＴ細胞の２％未満がＣＤ８＋ＣＤ４＋である、実施形態Ｂ３２またはＢ３３に記載の組成物。
Ｂ３５．ＮＫ細胞の約１５％から約３０％の間および／またはガンマ．デルタＴ細胞の約５５％から８５％の間の端数がＣＤ８−ＣＤ４−である、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３４のいずれかに記載の組成物。
Ｂ３６．集団における細胞の約３０％から約９９％もしくはそれより多くの間、または少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはその端数、最大１００％が、外因性ポリヌクレオチド、変異ポリヌクレオチド、欠失ポリヌクレオチド、またはその組合せを含む遺伝子改変をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３５のいずれかに記載の組成物。
Ｂ３６．１ 複数のＮＫ細胞および複数のガンマ．デルタＴ細胞を含む、実施形態Ｂ３６に記載の組成物。
Ｂ３７．集団における細胞の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が遺伝子改変を含むか、または集団における細胞の約１００％もしくは１００％が遺伝子改変を含む、実施形態Ｂ３６またはＢ３６．１に記載の組成物。
Ｂ３８．遺伝子改変が外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ３６、Ｂ３６．１またはＢ３７のいずれかに記載の組成物。
Ｂ３９．外因性ポリヌクレオチドがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター中にある、実施形態Ｂ３８に記載の組成物。
Ｂ４０．外因性ポリヌクレオチドが、改変された細胞集団の１種または複数種の細胞のゲノムに組み込まれる、実施形態Ｂ３８に記載の組成物。
Ｂ４１．集団における細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、実施形態Ｂ３６〜Ｂ４０のいずれかに記載の組成物。
Ｂ４２．キメラ抗原受容体がＣＤ１９、ＧＤ２、ＨＥＲ３、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１２３、またはＣＤ３０のうちの１つまたは複数に免疫特異的に結合する結合分子部分を含む、実施形態Ｂ４１に記載の組成物。
Ｂ４３．複数のＮＫ細胞および複数のガンマ．デルタＴ細胞を含む集団が、１より多くの対象の末梢血細胞に由来する、実施形態Ｂ１〜Ｂ４２のいずれかに記載の組成物。
Ｃ１．実施形態Ｂ１〜Ｂ４３のいずれか１つに記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
Ｄ１．（ａ）外因性ポリヌクレオチドを、実施形態Ａ６６およびＢ１〜Ｂ３５のいずれかの組成物に添加すること
（ｂ）実施形態Ａ６６およびＢ１〜Ｂ３５のいずれかの組成物の１種または複数種の細胞においてポリヌクレオチドを変異させること；または
（ｃ）実施形態Ａ６６およびＢ１〜Ｂ３５のいずれかの組成物の１種または複数種の細胞においてポリヌクレオチドを欠失させること
のうちの１つまたは複数を含む、改変された免疫細胞を作製する方法。
Ｄ２．遺伝子改変が、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、電気穿孔、トランスフェクション、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮＳによる、実施形態Ｄ１に記載の方法。
Ｄ３．遺伝子改変が、（ａ）でのように外因性ポリヌクレオチドを添加することからなるか、またはそれから本質的になる、実施形態Ｄ１またはＤ２に記載の方法。
Ｄ４．遺伝子改変が、（ａ）でのように外因性ポリヌクレオチドを添加すること、および／または（ｂ）でのようにポリヌクレオチドを変異させることを含み、外因性ポリヌクレオチドおよび／または変異ポリヌクレオチドが免疫細胞のゲノムに組み込まれる、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれかに記載の方法。
Ｄ５．組み込みが、電気穿孔、トランスフェクション、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮＳによる、実施形態Ｄ４に記載の方法。
Ｄ６．外因性ポリヌクレオチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、実施形態Ｄ１〜Ｄ５のいずれかに記載の方法。
Ｄ７．キメラ抗原受容体が、ＣＤ１９、ＧＤ２、ＨＥＲ３、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１２３、またはＣＤ３０のうちの１つまたは複数に免疫特異的に結合する結合分子部分を含む、実施形態Ｄ６に記載の方法。
Ｄ８．集団における細胞の約３０％から約９９％もしくはそれより多くの間、または少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはその端数、最大１００％が遺伝子改変を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ７のいずれかに記載の方法。
Ｄ８．１ 集団における細胞が、複数のＮＫ細胞および複数のガンマ．デルタＴ細胞を含む、実施形態Ｄ８に記載の方法。
Ｄ９．遺伝子改変が外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ８またはＤ８．１に記載の方法。
Ｄ１０．集団における細胞の約１００％または１００％が外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ９に記載の方法。
Ｅ１．実施形態Ａ６６およびＢ１〜Ｂ４３のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態Ｃ１に記載の医薬組成物、必要に応じて使用のための指示、および必要に応じてサイトカインを含むキット。
Ｅ２．組成物または医薬組成物が、セ氏マイナス４度またはそれ未満にある、実施形態Ｅ１に記載のキット。
Ｅ３．組成物または医薬組成物が、セ氏約マイナス７５度からセ氏約マイナス８０度にある、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ４．細胞約１×１０５個から細胞約１×１０１２個を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３のいずれかに記載のキット。
Ｅ５．サイトカインがインターロイキンポリペプチドである、実施形態Ｅ１〜Ｅ４のいずれかに記載のキット。
Ｅ６．インターロイキンペプチドがＩＬ−２、ＩＬ−４、またはＩＬ−１５である、実施形態Ｅ５に記載のキット。
Ｅ７．非ヒト血清を含まないおよび／またはウシ血清を含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ６のいずれかに記載のキット。
Ｅ８．異種のものを含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれかに記載のキット。
Ｅ９．外因性フィーダー細胞を含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ１０．単位剤形の実施形態Ｅ１〜Ｅ９のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ１１．単位剤形が、細胞約１×１０６個から細胞約１×１０１２個である、実施形態Ｅ１０に記載のキット。
Ｆ１．各々が１または複数のドナー対象に由来する細胞を含む複数の容器を含む、異なるドナー対象に由来する細胞のコレクションであって、各容器が、実施形態Ａ６６およびＢ１〜Ｂ４３のいずれか１つに記載の組成物、実施形態Ｃ１に記載の医薬組成物、または実施形態Ｅ１〜Ｅ１１のいずれかに記載のキットを含む、細胞のコレクション。
Ｇ１．がんまたは感染症を処置する方法であって、それを必要とする対象に、がんまたは感染症を処置するために有効な量の実施形態Ａ６６およびＢ１〜Ｂ４３のいずれか１つに記載の組成物、実施形態Ｃ１に記載の医薬組成物、または実施形態Ｅ１〜Ｅ１１のいずれかに記載のキットを投与することを含み、組成物、医薬組成物、またはキットにおける細胞が対象に対して同種異系である方法。
Ｇ２．がんまたは感染症を処置する方法であって、それを必要とする対象に、がんまたは感染症を処置するために有効な量の実施形態Ａ６６およびＢ１〜Ｂ４３のいずれか１つに記載の組成物、実施形態Ｃ１に記載の医薬組成物、または実施形態Ｅ１〜Ｅ１１のいずれかに記載のキットを投与することを含み、組成物、医薬組成物、またはキットにおける細胞が対象に対して自己である方法。
Ｇ３．組成物を対象に２日またはそれより多くの別々の日に投与することを含む、実施形態Ｇ１または実施形態Ｇ２に記載の方法。
Ｇ４．細胞のドナーが処置のレシピエントである、実施形態Ｇ２または実施形態Ｇ３に記載の方法。
Ｇ５．細胞のドナーが処置のレシピエントではない、実施形態Ｇ１または実施形態Ｇ３に記載の方法。
Ｇ６．処置のレシピエントが、ドナー由来のアルファ．ベータＴ細胞によって処置した場合にＧｖＨＤに罹りやすい、実施形態Ｇ５に記載の方法。
Ｇ７．処置が、約２週間から約４週間の間の間隔で約１単位投薬量から約３６またはそれより多くの単位投薬量の間で投与される、実施形態Ｇ１〜Ｇ６のいずれかに記載の方法。
Ｇ８．処置が、単一単位投薬量として毎日１回、２回、３回、４回、もしくは最大５回、または数日間、数週間もしくは数ヶ月間の間に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回もしくはそれより多く、または２日毎、または週に１回、２回、３回、４回、５回、もしくは６回投与される、実施形態Ｇ１〜Ｇ６のいずれかに記載の方法。
Ｇ９．処置が静脈内（ＩＶ）、髄腔内または筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、胸膜内、関節腔内に投与されるか、またはがんもしくは感染症の部位もしくはその近傍に注射もしくは埋め込まれる、実施形態Ｇ１〜Ｇ８のいずれかに記載の方法。
Ｇ１０．単位投薬量が、対象の体重１キログラムあたり細胞約１０４個から細胞約１０１０個の間、または対象あたり細胞約１０６個から細胞約１０１２個の間を含む、実施形態Ｇ８またはＧ９に記載の方法。
Ｇ１１．単位投薬量が、対象あたり細胞約１０１０個、または対象の体重１キログラムあたり細胞約１０８個である、実施形態Ｇ１０に記載の方法。
Ｇ１２．処置ががんのためである、実施形態Ｇ１〜Ｇ１１のいずれかに記載の方法。
Ｇ１３．がんが、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、白血病もしくはリンパ腫、ホジキンリンパ腫もしくは小児急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、肥満細胞腫もしくは肥満細胞腫瘍、卵巣がんもしくは癌、膵臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝細胞癌、網膜芽腫、乳腺腫瘍、結腸直腸癌、白血病、リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）もしくは急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、組織球肉腫、脳腫瘍、星状細胞腫、膠芽腫、神経腫、結腸癌、子宮頸癌、肉腫、膀胱腫瘍、細網内皮組織の腫瘍、ウィルムス腫瘍、骨がん、骨肉腫、腎臓がん、または頭頸部がん、口腔がん、喉頭がん、転移疾患、または口腔咽頭がんから選択される、実施形態Ｇ１２に記載の方法。
Ｇ１４．第２の薬剤が、組成物、医薬組成物、またはキットと共投与される、実施形態Ｇ１２またはＧ１３に記載の方法。
Ｇ１５．第２の薬剤が、がん関連抗原に免疫特異的に結合する抗体である、実施形態Ｇ１４に記載の方法。
Ｇ１６．がん関連抗原が、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂ７−Ｈ３、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ−５）、ＣＥＡＣＡＭ−６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素症誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＧＤ２、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓がんムチン、ＰＤ１受容体、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−Ｒ、Ｌ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムソン−フリードライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、およびＫｒａｓからなる群から選択される、実施形態Ｇ１５に記載の方法。
Ｇ１７．抗体が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、ＫＣ４（抗ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二特異性抗体、ＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ−５）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ−６）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ−６）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ）、ジヌツキシマブ（抗ＧＤ２）、インフリキシマブ（抗ＴＮＦ−α）、セルトリズマブペゴル（抗ＴＮＦ−α）、アダリムマブ（抗ＴＮＦ−α）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ムロモナブ−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、ＢＷＡ−３（抗ヒストンＨ２Ａ／Ｈ４）、ＬＧ２−１（抗ヒストンＨ３）、ＭＲＡ１２（抗ヒストンＨ１）、ＰＲ１−１（抗ヒストンＨ２Ｂ）、ＬＧ１１−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）、およびＬＧ２−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）から選択される、実施形態Ｇ１５またはＧ１６に記載の方法。
Ｇ１８．処置が感染症のためである、実施形態Ｇ１〜Ｇ１１のいずれかに記載の方法。
Ｇ１９．感染症が、細菌病原体、真菌病原体、ウイルス病原体、または原虫病原体の存在によって特徴付けられる、実施形態Ｇ１８に記載の方法。
Ｇ２０．感染症が、ヘルペス、エボラ、ウエストナイルウイルス、ワクシニアウイルス、エプスタインバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＨＨＶ−６、ＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ、リケッチア細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｔｅｔａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ等）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ等）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｇｅｎｕｓ Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（ｍｕｃｏｒ、ａｂｓｉｄｉａ、ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、蠕虫寄生生物（鉤虫、条虫、吸虫、扁形動物（例えば、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａ）、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ、ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ Ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉからなる群から選択される、実施形態Ｇ１９に記載の方法。
本明細書においてそれにより参照された各特許、特許出願、刊行物、および文書の全体は、参照により本明細書に組み込まれている。上記の特許、特許出願、刊行物、および文書の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることを認めたわけではなく、これらの刊行物または文書の内容または日時に対するいかなる承認とも見なされない。それらの引用は関連する開示について検索したことを示すものである。文書の日付または内容に関する全ての声明は、入手可能な情報に基づいており、その精度または正確性に関する承認ではない。
本技術の基本的態様から逸脱することなく、前述に変更を行うことができる。本技術を、１つまたは複数の特定の実施形態を参照して実質的に詳細に記載してきたが、当業者は、本出願に特に開示した実施形態に変更を行ってもよく、それでもこれらの変更および改善が本技術の範囲および精神の範囲内であることを認識する。
本明細書において例示的に記載される技術は、適切には本明細書に具体的に開示されない任意の要素の非存在下で実践され得る。このように、例えば本明細書における各々の例において、用語「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれかを、他の２つの用語のいずれかと交換してもよい。使用されている用語および表現は、説明の用語として使用されており、制限のためではなく、そのような用語および表現の使用は、示され、記載される特色またはその一部のいかなる均等物も除外せず、特許請求される技術の範囲内で様々な改変が可能である。用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、文脈から１つの要素または１つより多くの要素のいずれかが記載されていることが明らかである場合を除き、それが修飾する要素の１つまたは複数を指すことができる（例えば、「１つの試薬」は１つまたは複数の試薬を意味することができる）。用語「約」は、本明細書で使用される場合、基礎となるパラメーターの１０％以内の値（すなわち、プラスマイナス１０％）を指し、一連の値の最初にある用語「約」の使用は、値の各々を修飾する（すなわち、「約１、２、および３」は、約１、約２、および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラムから１１０グラムの間の重量を含むことができる。さらに、値の列挙が本明細書において記載されている場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、または８６％）、列挙は全ての中間値およびその端数の値（例えば、５４％、８５．４％）を含む。このように、本技術を代表的な実施形態によって具体的に開示してきたが、本明細書に開示した概念の必要に応じた特色、改変、および変形形態を、当業者が頼りにしてもよく、そのような改変および変形形態は本技術の範囲内であると見なされると理解すべきである。
本技術のある特定の実施形態を以下の特許請求の範囲に記載する。

Claims (177)

  1. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物を製造する方法であって、
    １または複数の対象から細胞を含有する試料を得ること；
    ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞を含む枯渇細胞集団を生成する条件下で前記試料からアルファ．ベータＴ細胞を枯渇させること；ならびに
    前記枯渇細胞集団を（ａ）細胞接着ポリペプチドに免疫特異的に結合する少なくとも１種の外因性ポリペプチド、および（ｂ）前記細胞接着ポリペプチドとは異なるポリペプチドに免疫特異的に結合し、前記試料集団の１種または複数種の細胞の表面上に発現される少なくとも１種の外因性ポリペプチドに接触させることを含む活性化条件に前記枯渇細胞集団を曝露すること；ならびに
    前記枯渇細胞集団を少なくとも１種の補助的ポリペプチドに接触させることを含む拡大条件に前記枯渇細胞集団を曝露し、それによってＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物を生成すること
    を含む方法。
  2. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物を製造する方法であって、
    １または複数の対象から細胞を含有する試料を得ること；
    前記試料を（ａ）細胞接着ポリペプチドに免疫特異的に結合する少なくとも１種の外因性ポリペプチド、および（ｂ）前記細胞接着ポリペプチドとは異なるポリペプチドに免疫特異的に結合し、前記試料集団の１種または複数種の細胞の表面上に発現される少なくとも１種の外因性ポリペプチドに接触させることを含む活性化条件であって、（ａ）もしくは（ｂ）が可溶性であるか、または（ａ）および（ｂ）が可溶性である活性化条件に前記試料を曝露すること；ならびに
    前記試料を少なくとも１種の補助的ポリペプチドに接触させることを含む拡大条件に前記試料を曝露し、それによってＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物を生成すること
    を含む方法。
  3. 前記少なくとも１種の補助的ポリペプチドが、前記集団におけるガンマ．デルタＴ細胞の量と比較したＮＫ細胞の量が前記少なくとも１種の補助的ポリペプチドの量および／またはタイプに依存的であるように選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記少なくとも１種の補助的ポリペプチドが、前記枯渇細胞集団を前記少なくとも１種の補助的ポリペプチドに接触させた後に、前記細胞の集団におけるガンマ．デルタＴ細胞と比較してＮＫ細胞の量を増加または減少させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記活性化条件が、非ヒト動物由来の血清を含まない、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記拡大条件が、非ヒト動物由来の血清を含まない、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記活性化条件がフィーダー細胞を含まない、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記拡大条件がフィーダー細胞を含まない、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記試料が、末梢血、肝組織、骨髄、上皮組織、および臍帯血から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記試料が末梢血である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記末梢血試料が処理された試料である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記試料が臍帯血である、請求項９に記載の方法。
  13. 前記臍帯血試料が処理された試料である、請求項１２に記載の方法。
  14. （ｂ）における前記少なくとも１種の外因性ポリペプチドが、ＮＫ細胞活性化受容体、ガンマ．デルタＴ細胞活性化受容体、または両方に免疫特異的に結合する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記受容体が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記受容体がＮＫｐ４６である、請求項１５に記載の方法。
  17. （ａ）における前記外因性ポリペプチドが、ＣＤ２に免疫特異的に結合する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. （ａ）もしくは（ｂ）、または（ａ）および（ｂ）における前記外因性ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. （ａ）または（ｂ）のうちの少なくとも１つが可溶性である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. （ａ）および（ｂ）における前記外因性ポリペプチドの両方が可溶性である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. （ａ）における前記外因性ポリペプチドまたは（ｂ）における前記外因性ポリペプチドが基質に結合する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  22. 前記活性化条件が、前記試料または枯渇細胞集団を少なくとも２種の外因性ポリペプチドに接触させることを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 第１の外因性ポリペプチドがＣＤ２に免疫特異的に結合し、第２の外因性ポリペプチドがＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記第１の外因性ポリペプチドおよび／または前記第２の外因性ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合性断片である、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
  25. 前記活性化条件のポリペプチド構成要素が、
    （ａ）前記細胞接着ポリペプチドＣＤ２に免疫特異的に結合する外因性ポリペプチド；および
    （ｂ）（ａ）における前記外因性ポリペプチドとは異なり、ＮＫｐ４６に免疫特異的に結合する外因性ポリペプチド
    から本質的になるかまたはそれからなる、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記少なくとも１種の補助的ポリペプチドが、サイトカインおよび／またはガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドである、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
  27. 前記拡大条件が、前記試料または枯渇細胞集団をサイトカインである少なくとも１種の補助的ポリペプチド、および必要に応じてガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合する補助的ポリペプチドに接触させることを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記サイトカインがインターロイキン（ＩＬ）である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記少なくとも１種の補助的ポリペプチドが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５、またはその任意の組合せを含む、請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
  30. 前記拡大条件が、前記試料または枯渇細胞集団を
    （ａ）ＩＬ−２ポリペプチド、および必要に応じてガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチド；
    （ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチド；または
    （ｃ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＩＬ−１５ポリペプチド、ならびに必要に応じてガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合するポリペプチド
    に接触させることを含む、請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
  31. 前記ガンマ．デルタＴ細胞上の前記受容体がＣＤ３である、請求項２６〜３０のいずれかに記載の方法。
  32. 前記ガンマ．デルタＴ細胞上の受容体に免疫特異的に結合する前記ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合性断片である、請求項２６〜３１のいずれかに記載の方法。
  33. 前記拡大条件が、前記試料を
    （ａ）ＩＬ−２ポリペプチド；
    （ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチド；
    （ｃ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＩＬ−１５ポリペプチド；
    （ｄ）ＩＬ−２ポリペプチドおよびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体；または
    （ｅ）ＩＬ−２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体
    に接触させることを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. ＣＤ３に免疫特異的に結合する前記抗体がＯＫＴ３である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記活性化および拡大条件が同時にまたは任意の順序で逐次的に実施される、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
  36. 前記少なくとも１種の外因性ポリペプチドが補助的ポリペプチドとしても機能することができる；または
    前記少なくとも１種の補助的ポリペプチドが外因性ポリペプチドとしても機能することができる；または
    前記少なくとも１種の外因性ポリペプチドが補助的ポリペプチドとしても機能することができ、かつ前記少なくとも１種の補助的ポリペプチドが外因性ポリペプチドとしても機能することができる、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
  37. （ｉ）前記拡大条件が、前記試料または枯渇細胞集団をＩＬ−２ポリペプチドに接触させることを含み；
    （ｉｉ）得られた、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記細胞の集団が、約２５〜３０％のＮＫ細胞および約７０〜７５％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、請求項３３〜３６のいずれかに記載の方法。
  38. （ｉ）前記拡大条件が、前記試料または枯渇細胞集団をＩＬ−１５ポリペプチドに接触させることを含み；
    （ｉｉ）得られた、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記細胞の集団が、約８０〜９９％のＮＫ細胞および約１〜２０％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、請求項３３〜３６のいずれかに記載の方法。
  39. （ｉ）前記拡大条件が、前記試料または枯渇細胞集団をＩＬ−２ポリペプチドおよびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体に接触させることを含み；
    （ｉｉ）得られた、ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記細胞の集団が、約４０〜４５％のＮＫ細胞および約５５〜６０％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、請求項３３〜３６のいずれかに記載の方法。
  40. 前記拡大条件が、
    前記試料または枯渇細胞集団を、１種または複数種の補助的ポリペプチドを含む第１の条件セットに接触させ、ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する第１の比を含む第１の細胞集団をもたらすこと；および
    前記第１の細胞集団を、１種または複数種の補助的ポリペプチドを含む第２の条件セットに接触させ、ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する所望の最終的な比を含む第２の細胞集団をもたらすことを含み、前記第１の条件セットが前記第２の条件セットとは異なる、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
  41. 前記第１の細胞集団が前記第２の条件セットとの接触前に洗浄される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記第１の条件セットがＩＬ−２を含み、前記第２の条件セットがＩＬ−１５を含む；
    前記第１の条件セットがＩＬ−１５を含み、前記第２の条件セットがＩＬ−２を含む；
    前記第１の条件セットがＩＬ−２およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体を含み、前記第２の条件セットがＩＬ−１５を含む；または
    前記第１の条件セットがＩＬ−１５およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体を含み、前記第２の条件セットがＩＬ−２およびＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体を含む、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
  43. ＣＤ３に免疫特異的に結合する前記抗体がＯＫＴ３である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記試料を前記活性化および拡大条件に曝露する前に、前記試料からアルファ．ベータＴ細胞を枯渇させ、それによって枯渇細胞集団を生成すること；ならびに
    前記枯渇細胞集団を前記活性化および拡大条件に供すること
    をさらに含み、
    それによってＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物が得られる、請求項２〜４３のいずれかに記載の方法。
  45. 活性化および拡大の前に、前記試料または前記枯渇細胞集団が、ＮＫ細胞またはガンマ．デルタＴ細胞について選択する条件にも、前記アルファ−ベータＴ細胞以外の細胞を枯渇させる条件にも曝露されない、請求項１〜４４のいずれかに記載の方法。
  46. 活性化および拡大の前に、前記試料または前記枯渇細胞集団が、前記試料または前記枯渇細胞集団の全てのＣＤ３＋細胞を枯渇させる条件に曝露されない、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
  47. 前記試料または枯渇細胞集団の細胞が、活性化および拡大の前、間、または後に外因性核酸を含まない、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法。
  48. 前記試料または枯渇細胞集団の細胞が、活性化および拡大の前、間、または後に腫瘍壊死因子受容体も、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、骨髄分化一次応答タンパク質も、自然免疫シグナル伝達アダプターをコードする外因性核酸も含まない、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法。
  49. 前記試料または枯渇細胞集団の細胞が、活性化および拡大の前、間、または後に遺伝子改変されない、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
  50. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記細胞の集団を、それによって前記ガンマ．デルタ細胞が枯渇される処置に供することをさらに含み、得られた集団がＮＫ細胞から本質的になるかまたはそれからなる、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法。
  51. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記細胞の集団を、それによって前記ＮＫ細胞が枯渇される処置に供することをさらに含み、得られた集団がガンマ．デルタＴ細胞から本質的になるかまたはそれからなる、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法。
  52. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記細胞の集団を、ＮＫ細胞についての正の選択に供することをさらに含み、それによってＮＫ細胞から本質的になるかまたはそれからなる細胞集団が得られる、請求項１〜５０のいずれかに記載の方法。
  53. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記細胞の集団を、ガンマ．デルタ細胞についての正の選択に供することをさらに含み、それによってガンマ．デルタ細胞から本質的になるかまたはそれからなる細胞集団が得られる、請求項１〜４９および５１のいずれかに記載の方法。
  54. 前記拡大条件が、前記試料または枯渇細胞集団のフィーダー細胞フリー培地中での約１週間から約１０週間のインキュベーションを含み、それによってＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された拡大した細胞の集団を含む組成物が得られる、請求項１〜５３のいずれかに記載の方法。
  55. 前記培養条件が、前記試料または枯渇細胞集団のフィーダー細胞フリー培地中での約７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２５日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間、５０日間、５５日間、もしくは６０日間もしくはそれより多くの日数、または約２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、もしくは１０週間のインキュベーションを含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された細胞の集団が、前記拡大条件下の３０日間で約２ｌｏｇより大きく拡大される、請求項１〜５５のいずれかに記載の方法。
  57. 前記細胞の集団が、前記拡大条件下の３０日間で約３ｌｏｇより大きく拡大される、請求項５６に記載の方法。
  58. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記拡大した細胞の集団が、疲弊した細胞を含まない、請求項１〜５７のいずれかに記載の方法。
  59. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記拡大した細胞の集団が、前記拡大条件の６０日後に疲弊した細胞を含まない、請求項１〜５８のいずれかに記載の方法。
  60. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記拡大した細胞の集団におけるＮＫ細胞の５％未満、４％未満、３％未満、または２％未満がＰＤ−１マーカーを含み、および／または前記拡大した集団における総細胞もしくは前記拡大した集団における前記ガンマ．デルタＴ細胞の約２０％、１５％、１０％、またはそれ未満が前記ＰＤ−１マーカーを含む、請求項１〜５９のいずれかに記載の方法。
  61. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記細胞の集団が、前記集団における総細胞数のパーセンテージとして以下の活性化マーカー：
    （ａ）９０％またはそれより多くのＫＩＲ５；
    （ｂ）１０％またはそれより多くのＳＩＧＬＥＣ−７；
    （ｃ）６０％またはそれより多くのＫＩＲ３Ｄ５１；
    （ｄ）１０％またはそれより多くのＫＩＲ２ＤＬ１；
    （ｅ）２５％またはそれより多くのＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６；
    （ｆ）３５％またはそれより多くのＮＫＧ２Ｄ；
    （ｇ）９０％またはそれより多くのＤＮＡＭ１；
    （ｈ）８５％またはそれより多くのＮＴＢＡ；
    （ｉ）９５％またはそれより多くのＣＤ２；および
    （ｊ）５５％またはそれより多くのＫＩＲ３ＤＳ１
    のうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜６０のいずれかに記載の方法。
  62. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞に関して富化された前記細胞の集団が、８０％またはそれより多くの自然免疫細胞を含む、請求項１〜６１のいずれかに記載の方法。
  63. 前記細胞の約７０％から約１００％の間、または少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％がＣＤ５６＋である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記細胞の約１０％から約４０％の間、または少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、もしくは４０％がＣＤ１６＋である、請求項６２または請求項６３に記載の方法。
  65. 前記細胞の５％未満、４％未満、３％未満、または２％未満がＣＤ５７＋である、請求項６２〜６４のいずれかに記載の方法。
  66. 前記試料または枯渇細胞集団が、活性化および拡大の間または後にＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞を含まない、請求項１〜６５のいずれかに記載の方法。
  67. 前記活性化条件および前記拡大条件がビスホスホネートを含まない、請求項１〜６６のいずれかに記載の方法。
  68. 前記ビスホスホネートがパミドロネートまたはゾレドロネートである、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記ガンマ．デルタＴ細胞が、Ｖ．デルタ．１およびＶ．デルタ．２発現に関してポリクローナルである、請求項１〜６８のいずれかに記載の方法。
  70. 前記ポリクローナルガンマ．デルタＴ細胞が、Ｖ．デルタ．１＋およびＶ．デルタ．１−から選択される少なくとも１つの亜集団、ならびにＶ．デルタ．２＋およびＶ．デルタ．２−から選択される少なくとも１つの亜集団を含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 請求項１〜７０のいずれかに記載の方法によって得ることができるまたは得られた組成物。
  72. 改変された末梢血細胞の集団を含む組成物であって、前記集団が
    複数のＮＫ細胞および複数のガンマ．デルタＴ細胞を含み；
    アルファ．ベータＴ細胞が枯渇され；
    フィーダー細胞を含まない、組成物。
  73. 前記細胞の約２５％から約４５％の間がＮＫ細胞であり、前記細胞の約５５％から約７５％の間がガンマ．デルタＴ細胞である；
    前記細胞の約２５％から約３０％の間がＮＫ細胞であり、前記細胞の約７０％から約７５％の間がガンマ．デルタＴ細胞である；
    前記細胞の約８０％から約９９％の間がＮＫ細胞であり、前記細胞の約１％から約２０％の間がガンマ．デルタＴ細胞である；または
    前記細胞の約４０％から約４５％の間がＮＫ細胞であり、前記細胞の約５５％から約６０％の間がガンマ．デルタＴ細胞である、請求項７２に記載の組成物。
  74. 前記細胞の３０％またはそれより多くが活性化される、請求項７２または請求項７３に記載の組成物。
  75. 前記改変された細胞の集団が、前記集団における総細胞数のパーセンテージとして以下の活性化マーカー：
    （ａ）９０％またはそれより多くのＫＩＲ５；
    （ｂ）１０％またはそれより多くのＳＩＧＬＥＣ−７；
    （ｃ）６０％またはそれより多くのＫＩＲ３Ｄ５１；
    （ｄ）１０％またはそれより多くのＫＩＲ２ＤＬ１；
    （ｅ）２５％またはそれより多くのＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６；
    （ｆ）３５％またはそれより多くのＮＫＧ２Ｄ；
    （ｇ）９０％またはそれより多くのＤＮＡＭ１；
    （ｈ）８５％またはそれより多くのＮＴＢＡ；
    （ｉ）９５％またはそれより多くのＣＤ２；および
    （ｊ）５５％またはそれより多くのＫＩＲ３ＤＳ１
    のうちの１つまたは複数を含む、請求項７２〜７４のいずれかに記載の組成物。
  76. 前記改変された集団が、８０％またはそれより多くの自然免疫細胞を含む、請求項７２〜７５のいずれかに記載の組成物。
  77. 前記改変された集団が、ＣＤ５６＋である活性化細胞傷害性細胞に関して富化されている、請求項７２〜７６のいずれかに記載の組成物。
  78. 前記改変細胞が、ＣＤ５７−である活性化細胞傷害性細胞に関して富化されている、請求項７２〜７７のいずれかに記載の組成物。
  79. 前記集団が、ＣＤ５６＋ＣＤ５７−である活性化細胞傷害性細胞に関して富化されている、請求項７２〜７８のいずれかに記載の組成物。
  80. 前記細胞の約８０％から約１００％の間、または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％がＣＤ５６＋である、請求項７７〜７９のいずれかに記載の組成物。
  81. 前記細胞の約１０％から約４０％の間、または少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、もしくは４０％がＣＤ１６＋である、請求項７７〜８０のいずれかに記載の組成物。
  82. 前記細胞の５％未満、４％未満、３％未満、または２％未満がＣＤ５７＋である、請求項７７〜８１のいずれかに記載の組成物。
  83. ＮＫ細胞およびガンマ．デルタＴ細胞以外の細胞を実質的に含まない、請求項７２〜８２のいずれかに記載の組成物。
  84. ５パーセント未満のＮＫＴ細胞を含む、請求項７２〜８３のいずれかに記載の組成物。
  85. １パーセント未満のＮＫＴ細胞を含む、請求項７２〜８４のいずれかに記載の組成物。
  86. ０．１パーセント未満のＮＫＴ細胞を含む、請求項７２〜８５のいずれかに記載の組成物。
  87. ２パーセント未満のアルファ．ベータＴ細胞を含む、請求項７２〜８６のいずれかに記載の組成物。
  88. １パーセント未満のアルファ．ベータＴ細胞を含む、請求項７２〜８７のいずれかに記載の組成物。
  89. ０．１パーセント未満のアルファ．ベータＴ細胞を含む、請求項７２〜８８のいずれかに記載の組成物。
  90. 前記集団におけるＮＫ細胞のサブセットがＣＤ１６＋細胞である、請求項７２〜８９のいずれかに記載の組成物。
  91. 大多数のガンマ．デルタＴ細胞がＣＤ５７−細胞である、請求項７２〜９０のいずれかに記載の組成物。
  92. 大多数のＮＫ細胞がＣＤ５７−細胞である、請求項７２〜９１のいずれかに記載の組成物。
  93. 前記ガンマ．デルタＴ細胞が、Ｖ．デルタ．１およびＶ．デルタ．２発現に関してポリクローナルである、請求項７２〜９２のいずれかに記載の組成物。
  94. 前記ポリクローナルガンマ．デルタＴ細胞が、Ｖ．デルタ．１＋およびＶ．デルタ．１−から選択される少なくとも１つの亜集団、ならびにＶ．デルタ．２＋およびＶ．デルタ．２−から選択される少なくとも１つの亜集団を含む、請求項９３に記載の組成物。
  95. 大多数のガンマ．デルタＴ細胞がＶ．デルタ．１を発現し、少数のガンマ．デルタＴ細胞がＶ．デルタ．２を発現する；または
    少数のガンマ．デルタＴ細胞がＶ．デルタ．１を発現し、大多数のガンマ．デルタＴ細胞がＶ．デルタ．２発現を発現する、請求項７２〜９４のいずれかに記載の組成物。
  96. 前記集団における少数の細胞がＣＤ３陽性細胞であり、前記集団における大多数の細胞がＣＤ３陰性細胞である；または
    前記集団における大多数の細胞がＣＤ３陽性細胞であり、前記集団における少数の細胞がＣＤ３陰性細胞である、請求項７２〜９５のいずれかに記載の組成物。
  97. ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する比が１より大きい、請求項７２〜９６のいずれかに記載の組成物。
  98. ＮＫ細胞のガンマ．デルタＴ細胞に対する比が１未満である、請求項７２〜９６のいずれかに記載の組成物。
  99. 前記改変された細胞の集団が、約９８〜９９％のＮＫ細胞および約１〜２％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、請求項９７に記載の組成物。
  100. 前記改変された細胞の集団が、約２５％から約４５％の間のＮＫ細胞および約５５％から約７５％の間のガンマ．デルタＴ細胞を含む、請求項９８に記載の組成物。
  101. 前記改変された細胞の集団が、約２５〜３０％のＮＫ細胞および約７０〜７５％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、請求項９８に記載の組成物。
  102. 前記改変された細胞の集団が、約４０〜４５％のＮＫ細胞および約５５〜６０％のガンマ．デルタＴ細胞を含む、請求項９８に記載の組成物。
  103. 前記ＮＫ細胞および／または前記ガンマ．デルタＴ細胞の約５０％から約９９％もしくはそれより多くの間、または約５０％より多くのもしくはそれに等しい、５１％より多くのもしくはそれに等しい、５２％より多くのもしくはそれに等しい、５３％より多くのもしくはそれに等しい、５４％より多くのもしくはそれに等しい、５５％より多くのもしくはそれに等しい、５６％より多くのもしくはそれに等しい、５７％より多くのもしくはそれに等しい、５８％より多くのもしくはそれに等しい、５９％より多くのもしくはそれに等しい、６０％より多くのもしくはそれに等しい、６％より多くのもしくはそれに等しい、６２％より多くのもしくはそれに等しい、６３％より多くのもしくはそれに等しい、６４％より多くのもしくはそれに等しい、６５％より多くのもしくはそれに等しい、６６％より多くのもしくはそれに等しい、６７％より多くのもしくはそれに等しい、６８％より多くのもしくはそれに等しい、６９％より多くのもしくはそれに等しい、７０％より多くのもしくはそれに等しい、７１％より多くのもしくはそれに等しい、７２％より多くのもしくはそれに等しい、７３％より多くのもしくはそれに等しい、７４％より多くのもしくはそれに等しい、７５％より多くのもしくはそれに等しい、７６％より多くのもしくはそれに等しい、７７％より多くのもしくはそれに等しい、７８％より多くのもしくはそれに等しい、７９％より多くのもしくはそれに等しい、８０％より多くのもしくはそれに等しい、８１％より多くのもしくはそれに等しい、８２％より多くのもしくはそれに等しい、８３％より多くのもしくはそれに等しい、８４％より多くのもしくはそれに等しい、８５％より多くのもしくはそれに等しい、８６％より多くのもしくはそれに等しい、８７％より多くのもしくはそれに等しい、８８％より多くのもしくはそれに等しい、８９％より多くのもしくはそれに等しい、９０％より多くのもしくはそれに等しい、９１％より多くのもしくはそれに等しい、９２％より多くのもしくはそれに等しい、９３％より多くのもしくはそれに等しい、９４％より多くのもしくはそれに等しい、９５％より多くのもしくはそれに等しい、９６％より多くのもしくはそれに等しい、９７％より多くのもしくはそれに等しい、９８％より多くのもしくはそれに等しい、９９％より多くのもしくはそれに等しい、８０％より多くのもしくはそれに等しい、８１％より多くのもしくはそれに等しい、８２％より多くのもしくはそれに等しい、８３％より多くのもしくはそれに等しい、８４％より多くのもしくはそれに等しい、８５％より多くのもしくはそれに等しい、８６％より多くのもしくはそれに等しい、８７％より多くのもしくはそれに等しい、８８％より多くのもしくはそれに等しい、８９％より多くのもしくはそれに等しい、９０％より多くのもしくはそれに等しい、９１％より多くのもしくはそれに等しい、９２％より多くのもしくはそれに等しい、９３％より多くのもしくはそれに等しい、９４％より多くのもしくはそれに等しい、９５％より多くのもしくはそれに等しい、９６％より多くのもしくはそれに等しい、９７％より多くのもしくはそれに等しい、９８％より多くのもしくはそれに等しい、９９％より多くのもしくはそれに等しい、またはその端数、最大１００％がＣＤ８＋である、請求項７２〜１０２のいずれかに記載の組成物。
  104. 前記ＮＫ細胞および／または前記ガンマ．デルタＴ細胞の２％未満がＣＤ４＋である、請求項１０３に記載の組成物。
  105. 前記ＮＫ細胞および／または前記ガンマ．デルタＴ細胞の２％未満がＣＤ８＋ＣＤ４＋である、請求項１０３または請求項１０４に記載の組成物。
  106. 前記ＮＫ細胞の約１５％から約３０％の間および／または前記ガンマ．デルタＴ細胞の約５５％から８５％の間の端数がＣＤ８−ＣＤ４−である、請求項１０３〜１０５のいずれかに記載の組成物。
  107. 前記集団における前記細胞の約３０％から約９９％もしくはそれより多くの間、または少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはその端数、最大１００％が、外因性ポリヌクレオチド、変異ポリヌクレオチド、欠失ポリヌクレオチド、またはその組合せを含む遺伝子改変をさらに含む、請求項７２〜１０６のいずれかに記載の組成物。
  108. 前記集団における前記細胞の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が前記遺伝子改変を含むか、または前記集団における前記細胞の約１００％もしくは１００％が前記遺伝子改変を含む、請求項１０７に記載の組成物。
  109. 前記遺伝子改変が外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１０７または請求項１０８に記載の組成物。
  110. 前記外因性ポリヌクレオチドがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター中にある、請求項１０９に記載の組成物。
  111. 前記外因性ポリヌクレオチドが、前記改変された細胞集団の１種または複数種の細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１０９に記載の組成物。
  112. 前記集団における前記細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１０７〜１１１のいずれかに記載の組成物。
  113. 前記キメラ抗原受容体がＣＤ１９、ＧＤ２、ＨＥＲ３、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１２３、またはＣＤ３０のうちの１つまたは複数に免疫特異的に結合する結合分子部分を含む、請求項１１２に記載の組成物。
  114. 前記複数のＮＫ細胞および前記複数のガンマ．デルタＴ細胞を含む前記集団が、１より多くの対象の前記末梢血細胞に由来する、請求項７２〜１１３のいずれかに記載の組成物。
  115. 実施形態７２〜１１４のいずれかに記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  116. 遺伝子改変免疫細胞を作製する方法であって、
    （ａ）外因性ポリヌクレオチドを、請求項７１〜１０６のいずれかに記載の組成物に添加すること；
    （ｂ）請求項７１〜１０６のいずれかに記載の組成物の１種または複数種の細胞においてポリヌクレオチドを変異させること；または
    （ｃ）請求項７１〜１０６のいずれかに記載の組成物の１種または複数種の細胞においてポリヌクレオチドを欠失させること
    のうちの１つまたは複数を含む方法。
  117. 前記遺伝子改変が、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、電気穿孔、トランスフェクション、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮＳによる、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記遺伝子改変が、（ａ）でのように外因性ポリヌクレオチドを添加することからなるか、またはそれから本質的になる、請求項１１６または請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記遺伝子改変が、（ａ）でのように外因性ポリヌクレオチドを添加すること、および／または（ｂ）でのようにポリヌクレオチドを変異させることを含み、前記外因性ポリヌクレオチドおよび／または前記変異ポリヌクレオチドが前記免疫細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１１６〜１１８のいずれかに記載の方法。
  120. 前記組み込みが、電気穿孔、トランスフェクション、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮＳによる、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記外因性ポリヌクレオチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項１１６〜１２１のいずれかに記載の方法。
  122. 前記キメラ抗原受容体が、ＣＤ１９、ＧＤ２、ＨＥＲ３、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１２３、またはＣＤ３０のうちの１つまたは複数に免疫特異的に結合する結合分子部分を含む、請求項１２１の方法。
  123. 前記集団における前記細胞の約３０％から約９９％もしくはそれより多くの間、または少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはその端数、最大１００％が前記遺伝子改変を含む、請求項１１６〜１２２のいずれかに記載の方法。
  124. 前記遺伝子改変が外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記集団における前記細胞の約１００％または１００％が前記外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１２４に記載の方法。
  126. 請求項７１〜１１４のいずれかに記載の組成物、または請求項１１５に記載の医薬組成物、必要に応じて使用のための指示、および必要に応じてサイトカインを含むキット。
  127. 前記組成物または前記医薬組成物が、セ氏マイナス４度またはそれ未満にある、請求項１２６に記載のキット。
  128. 前記組成物または前記医薬組成物が、セ氏約マイナス７５度からセ氏約マイナス８０度にある、請求項１２７に記載のキット。
  129. 細胞約１×１０５個から細胞約１×１０１２個を含む、請求項１２６〜１２８のいずれかに記載のキット。
  130. 前記サイトカインがインターロイキンポリペプチドである、請求項１２６〜１２９のいずれかに記載のキット。
  131. 前記インターロイキンペプチドがＩＬ−２、ＩＬ−４、またはＩＬ−１５である、請求項１３０に記載のキット。
  132. 非ヒト血清を含まないおよび／またはウシ血清を含まない、請求項１２６〜１３１のいずれかに記載のキット。
  133. 異種のものを含まない、請求項１２６〜１３２のいずれかに記載のキット。
  134. 外因性フィーダー細胞を含まない、請求項１２６〜１３３のいずれかに記載のキット。
  135. 単位剤形の、請求項１２６〜１３４のいずれかに記載のキット。
  136. 前記単位剤形が、細胞約１×１０６個から細胞約１×１０１２個である、実施形態Ｅ１０に記載のキット。
  137. 各々が１または複数のドナー対象に由来する細胞を含む複数の容器を含む、異なるドナー対象に由来する細胞のコレクションであって、各容器が、請求項７１〜１１４のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５に記載の医薬組成物、または請求項１２６〜１３６のいずれかに記載のキットを含む、細胞のコレクション。
  138. がんまたは感染症を処置する方法であって、それを必要とする対象に、前記がんまたは感染症を処置するために有効な量の請求項７１〜１１４のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５に記載の医薬組成物、または請求項１２６〜１３６のいずれかに記載のキットを投与することを含み、前記組成物、前記医薬組成物、またはキットにおける細胞が前記対象に対して同種異系である方法。
  139. がんまたは感染症を処置する方法であって、それを必要とする対象に、前記がんまたは感染症を処置するために有効な量の請求項７１〜１１４のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５に記載の医薬組成物、または請求項１２６〜１３６のいずれかに記載のキットを投与することを含み、前記組成物、前記医薬組成物、またはキットにおける細胞が前記対象に対して自己である方法。
  140. 前記組成物を前記対象に２日またはそれより多くの別々の日に投与することを含む、請求項１３８または請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記細胞のドナーが前記処置のレシピエントである、請求項１３９または請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記細胞のドナーが前記処置のレシピエントではない、請求項１３８または請求項１４０に記載の方法。
  143. 前記処置のレシピエントが、前記ドナー由来のアルファ．ベータＴ細胞によって処置した場合にＧｖＨＤに罹りやすい、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記処置が、約２週間から約４週間の間の間隔で約１単位投薬量から約３６またはそれより多くの単位投薬量の間で投与される、請求項１３８〜１４３のいずれかに記載の方法。
  145. 前記処置が、単一単位投薬量として毎日１回、２回、３回、４回、もしくは最大５回、または数日間、数週間もしくは数ヶ月間の間に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回もしくはそれより多く、または２日毎、または週に１回、２回、３回、４回、５回、もしくは６回投与される、請求項１３８〜１４３のいずれかに記載の方法。
  146. 前記処置が静脈内（ＩＶ）、髄腔内または筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、胸膜内、関節腔内に投与されるか、または前記がんもしくは感染症の部位もしくはその近傍に注射もしくは埋め込まれる、請求項１３８〜１４５のいずれかに記載の方法。
  147. 前記単位投薬量が、前記対象の体重１キログラムあたり細胞約１０４個から細胞約１０１０個の間、または対象あたり細胞約１０６個から細胞約１０１２個の間を含む、請求項１４４〜１４６のいずれかに記載の方法。
  148. 前記単位投薬量が、対象あたり細胞約１０１０個、または前記対象の体重１キログラムあたり細胞約１０８個である、請求項１４７に記載の方法。
  149. 前記処置ががんのためである、請求項１３８〜１４８のいずれかに記載の方法。
  150. 前記がんが、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、白血病もしくはリンパ腫、ホジキンリンパ腫もしくは小児急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、肥満細胞腫もしくは肥満細胞腫瘍、卵巣がんもしくは癌、膵臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝細胞癌、網膜芽腫、乳腺腫瘍、結腸直腸癌、白血病、リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）もしくは急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、組織球肉腫、脳腫瘍、星状細胞腫、膠芽腫、神経腫、結腸癌、子宮頸癌、肉腫、膀胱腫瘍、細網内皮組織の腫瘍、ウィルムス腫瘍、骨がん、骨肉腫、腎臓がん、または頭頸部がん、口腔がん、喉頭がん、転移疾患、または口腔咽頭がんから選択される、請求項１４９に記載の方法。
  151. 第２の薬剤が、前記組成物、医薬組成物、またはキットと共投与される、請求項１４９または請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記第２の薬剤が、がん関連抗原に免疫特異的に結合する抗体である、請求項１５１に記載の方法。
  153. 前記がん関連抗原が、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂ７−Ｈ３、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ−５）、ＣＥＡＣＡＭ−６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素症誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＧＤ２、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓がんムチン、ＰＤ１受容体、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−Ｒ、Ｌ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムソン−フリードライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、およびＫｒａｓからなる群から選択される、請求項１５２に記載の方法。
  154. 前記抗体が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、ＫＣ４（抗ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二特異性抗体、ＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ−５）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ−６）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ−６）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ）、ジヌツキシマブ（抗ＧＤ２）、インフリキシマブ（抗ＴＮＦ−α）、セルトリズマブペゴル（抗ＴＮＦ−α）、アダリムマブ（抗ＴＮＦ−α）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ムロモナブ−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、ＢＷＡ−３（抗ヒストンＨ２Ａ／Ｈ４）、ＬＧ２−１（抗ヒストンＨ３）、ＭＲＡ１２（抗ヒストンＨ１）、ＰＲ１−１（抗ヒストンＨ２Ｂ）、ＬＧ１１−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）、およびＬＧ２−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）から選択される、請求項１５２または請求項１５３に記載の方法。
  155. 前記処置が感染症のためである、請求項１３８〜１４８のいずれかに記載の方法。
  156. 前記感染症が、細菌病原体、真菌病原体、ウイルス病原体、または原虫病原体の存在によって特徴付けられる、請求項１５５に記載の方法。
  157. 前記感染症が、ヘルペス、エボラ、ウエストナイルウイルス、ワクシニアウイルス、エプスタインバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＨＨＶ−６、ＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ、リケッチア細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｔｅｔａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ等）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ等）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｇｅｎｕｓ Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（ｍｕｃｏｒ、ａｂｓｉｄｉａ、ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、蠕虫寄生生物（鉤虫、条虫、吸虫、扁形動物（例えば、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａ）、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ、ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ Ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉからなる群から選択される、請求項１５６に記載の方法。
  158. 複数のガンマデルタＴ細胞（γδ）；複数のナチュラルキラー細胞（ＮＫ）；またはγδ細胞およびＮＫ細胞の組合せを含む細胞の治療的組成物。
  159. 前記γδおよび／またはＮＫ細胞が組換えによって操作されるか、または遺伝子改変され、
    必要に応じて前記γδおよび／またはＮＫ細胞が、外因性または異種タンパク質を細胞外に発現するように組換えによって操作されるかまたは遺伝子改変され、
    必要に応じて前記外因性、異種、またはキメラタンパク質がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または外因性もしくは異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、
    必要に応じて前記外因性、異種、もしくはキメラタンパク質もしくはＣＡＲが、がん細胞もしくは腫瘍マーカーもしくは感染細胞に対して特異的である（特異的に結合することができる）か、または前記外因性、異種、もしくはキメラタンパク質もしくはＣＡＲが、がん細胞もしくは腫瘍マーカーもしくは感染細胞もしくは任意の疾患関連抗原を特異的に標的としてこれに結合することができる抗体に対して特異的である（または特異的に結合することができる）、請求項１５８に記載の細胞の治療的組成物。
  160. 前記γδおよび／またはＮＫ細胞がヒト細胞または動物細胞である、請求項１５８または請求項１５９に記載の細胞の治療的組成物。
  161. 前記治療的組成物が、静脈内（ＩＶ）、髄腔内、もしくは筋肉内（ＩＭ）投与のために製剤化されるか、または単位剤形で製剤化され、必要に応じて単位投薬量が細胞約１０２個から細胞１０１２個の間を含む、請求項１５８〜１６０のいずれかに記載の細胞の治療的組成物。
  162. 前記γδおよび／またはＮＫ細胞がｉｎ ｖｉｖｏ供給源から単離される、請求項１５８〜１６１のいずれかに記載の細胞の治療的組成物。
  163. 前記γδおよび／またはＮＫ細胞が培養において拡大されるか、またはｉｎ ｖｉｖｏ供給源から単離され、培養において拡大される、請求項１５８〜１６２のいずれかに記載の細胞の治療的組成物。
  164. 前記γδおよび／またはＮＫ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏ供給源から単離され、いかなるフィーダー細胞も使用することなくまたはフィーダー細胞層を使用することなく培養において拡大され、それによってフィーダー細胞を欠如する拡大したγδおよび／またはＮＫ細胞の集団を生成する、請求項１６３に記載の細胞の治療的組成物。
  165. 前記γδおよび／またはＮＫ細胞がｉｎ ｖｉｖｏ供給源から単離され、フィーダー細胞またはフィーダー細胞層を使用して培養において拡大され、必要に応じて前記フィーダー細胞が実質的に除去され、および／または殺滅されて、フィーダー細胞を実質的に欠如する拡大したγδおよび／またはＮＫ細胞の集団を生成する、請求項１６３に記載の細胞の治療的組成物。
  166. 前記γδおよび／またはＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ供給源が自己供給源に由来する（必要に応じて、前記γδおよび／またはＮＫ細胞のレシピエントとなる個体に由来する）、または外因性、異種、もしくは同種異系供給源に由来する、請求項１５８〜１６５のいずれかに記載の細胞の治療的組成物。
  167. がん、腫瘍、機能障害細胞または感染細胞を処置する方法であって、
    （ａ）それを必要とする個体に、先行請求項のいずれかに記載の細胞の治療的組成物の治療有効量を投与すること、または
    （ｂ）（ｉ）先行請求項のいずれかに記載の細胞の治療的組成物を提供するまたは提供したこと；および
    （ｉｉ）それを必要とする個体に、前記細胞の治療的組成物の治療有効量を投与することまたは投与したこと
    を含む方法。
  168. それを必要とする前記個体がヒトまたは動物である、請求項１６７に記載の方法。
  169. 前記γδおよび／またはＮＫ細胞がｉｎ ｖｉｖｏ供給源から単離され、必要に応じて前記γδおよび／またはＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ供給源が、同系もしくは自己供給源に由来する（必要に応じて、前記γδおよび／またはＮＫ細胞のレシピエントとなる個体に由来する）、または外因性、異種、もしくは同種異系供給源、またはその組合せに由来する、請求項１６７または請求項１６８に記載の方法。
  170. 前記細胞の治療的組成物が、静脈内（ＩＶ）、髄腔内、もしくは筋肉内（ＩＭ）投与され、または前記がん、腫瘍、機能障害、もしくは感染細胞にもしくはその近傍に（近くに）注射もしくは埋め込まれ、必要に応じて前記細胞の治療的組成物が埋込物またはゲルとして送達され、必要に応じて前記ゲルがハイドロゲルである、請求項１６７〜１６９のいずれかに記載の方法。
  171. 前記細胞の治療的組成物が、単位剤形で投与され、必要に応じて単位投薬量が、細胞約１０２個から細胞１０１２個の間、または細胞１０４個から細胞１０１０個の間を含み；または１日投与量が細胞約１０２個から細胞１０１２個の間、または細胞１０４個から細胞１０１０個の間を含む、請求項１６７〜１７０のいずれかに記載の方法。
  172. 前記細胞の治療的組成物または単位剤形が、それを必要とする前記個体に数回（複数回）、または数日間、数週間もしくは数ヶ月間の間に２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回またはそれより多く投与され、必要に応じて前記複数の単位剤形の各々が、毎日、２日毎、週に２回、３回、４回、５回、もしくは６回、または週に１回投与される、請求項１６７〜１７１のいずれかに記載の方法。
  173. 前記がんまたは腫瘍が、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、白血病もしくはリンパ腫、ホジキンリンパ腫もしくは小児急性リンパ芽球性白血病、肥満細胞腫もしくは肥満細胞腫瘍、卵巣がんもしくは癌、膵臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝細胞癌、網膜芽腫、乳腺腫瘍、結腸直腸癌、白血病、リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）もしくは急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、組織球肉腫、脳腫瘍、星状細胞腫、膠芽腫、神経腫、結腸癌、子宮頸癌、肉腫、膀胱腫瘍、細網内皮組織の腫瘍、ウィルムス腫瘍、骨がん、骨肉腫、腎臓がん、または頭頸部がん、口腔がん、喉頭がん、または口腔咽頭がんである、請求項１６７〜１７２のいずれかに記載の方法。
  174. それを必要とする前記個体が、最初に、がん関連または腫瘍関連、感染症関連または疾患関連抗原に対する非コンジュゲート抗体を、それを必要とする前記個体に予め投与し、その後先行請求項のいずれかに記載の細胞の治療的組成物を投与することによって、がん、感染症、または疾患に対する免疫応答を開始するように誘導され、前記細胞の治療的組成物の少なくとも一部が前記非コンジュゲート抗体に特異的に結合するポリペプチド、必要に応じてＣＡＲをその細胞表面上に発現する、請求項１６７〜１７３のいずれかに記載の方法。
  175. それを必要とする前記個体が、がん関連または腫瘍関連、感染症関連または疾患関連抗原に特異的に結合することが可能な抗体を投与され、その後先行請求項のいずれかに記載の細胞の治療的組成物を投与され、前記細胞の治療的組成物の少なくとも一部が前記抗体に特異的に結合するポリペプチド、必要に応じてＣＡＲをその細胞表面上に発現し、
    必要に応じて前記抗体が、前記細胞の治療的組成物の投与の前に、それと共に、またはその後に投与される、請求項１６７〜１７４のいずれかに記載の方法。
  176. 前記がん関連または腫瘍関連抗原が、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂ７−Ｈ３、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ−５）、ＣＥＡＣＡＭ−６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素症誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現されるジシアロガングリオシド）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓がんムチン、ＰＤ１受容体、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−Ｒ、Ｌ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムソン−フリードライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、およびＫｒａｓからなる群から選択される抗原である、請求項１６７〜１７５のいずれかに記載の方法。
  177. 前記抗体または前記非コンジュゲート抗体が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、ＫＣ４（抗ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ−５）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ−６）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ−６）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ）、インフリキシマブ（抗ＴＮＦ−α）、セルトリズマブペゴル（抗ＴＮＦ−α）、アダリムマブ（抗ＴＮＦ−α）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ムロモナブ−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、ＢＷＡ−３（抗ヒストンＨ２Ａ／Ｈ４）、ＬＧ２−１（抗ヒストンＨ３）、ＭＲＡ１２（抗ヒストンＨ１）、ＰＲ１−１（抗ヒストンＨ２Ｂ）、ＬＧ１１−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）、およびＬＧ２−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）からなる群から選択される、請求項１７４または１７５に記載の方法。
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