CN104093838B - 用于筛选或选择的细胞高通量包封 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从表达的核酸序列的文库中选择序列集的方法，其中提供了细胞，每个细胞包含表达为靶蛋白的表达的核酸序列。通过使用阳离子多糖处理细胞，并且随后使用阴离子多糖处理细胞来包封所述细胞，产生包封的细胞，使包封的细胞的膜穿孔，得到溶解的区室，将所述溶解的区室与所述靶蛋白的配体接触，所述配体承载可检测标记，和选择溶解的区室的子集作为可检测标记的函数，以及从选择物中分离所述表达的核酸序列作为选择的序列集。

Description

用于筛选或选择的细胞高通量包封
发明内容
本发明涉及的优化(evolution)提供了具有改进特性的蛋白。将优化的蛋白作为工业酶、结合分子和重要的研究工具进行开发。在所有涉及的优化方法中的关键步骤是选择或筛选用于希望的表型的蛋白文库。选择技术能够通过将蛋白的表型与其基因型相联系来检查非常大的文库，能够快速确定感兴趣的变体。选择方法如噬菌体展示、酵母展示、细菌展示、mRNA展示和核糖体展示得到了充分的确认并常用于确定来自大文库的感兴趣的生物分子，然而，这些方法中没有适合于蛋白选择的方法，所述选择的蛋白依赖于复杂的细胞内合成或加工步骤，或者为了它们的功能完整而存在的细胞内结构。无法通过常规方法获得的蛋白类型的一个实例是G蛋白偶联受体(GPCR)组。在去污剂胶束(detergentmicelles)中稳定的GPCR突变体由于其在理解GPCR结构和生物化学中的重要性，因而是有吸引力的研究靶标。
细菌展示使用细菌细胞本身(physically)包含给定蛋白和编码该蛋白的质粒。已经将细菌展示应用于不同的GPCR以获得在大肠杆菌(E.coli)中具有较大改进的功能表达的突变体。虽然许多这些高表达GPCR在去污剂中更加稳定，但高表达和在去污剂胶束中的高稳定性之间的关联性充其量也不过是微弱的。
在本文中使用的缩略语为：GPCR(G蛋白偶联受体)、NT(神经降压肽)、FACS(荧光激活细胞分选术)、DDM(正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(maltopyranoside))、DM(正癸基-β-D-麦芽糖苷)、OG(正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷)、LbL(逐层(Layer by Layer))、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲基铵基]-1-丙磺酸盐/N,N-二甲基-3-磺基-N-[3-[[3α,5β,7α,12α)-3,7,12-三羟基-24-氧代胆烷-24-基]氨基]丙基]-1-丙基氢氧化铵)、CHS(胆甾醇基半琥珀酸酯Tris盐)、CHESS(细胞高通量包封(Cellular High throughput Encapsulation)、溶解和筛选)、HL-NT(HiLyte Fluor647标记的神经降压肽(8-13))、FL-NT(BODIPY FL标记的神经降压肽(8-13))、FL-哌唑嗪(BODIPY FL标记的哌唑嗪)。
本发明提供了用于从表达的核酸序列的文库中选择序列集的方法。所述方法一般通过以下步骤进行：
-提供了多个细胞，其中每个细胞包含表达的核酸序列，并且该核酸序列在细胞中表达并产生靶蛋白，
-在包封步骤中包封所述多个细胞，其中使用阳离子多糖处理细胞(“阳离子处理步骤”)和使用阴离子多糖处理细胞(“阴离子处理步骤”)，随后，所述细胞被称为“包封的细胞”，
-使包封的细胞溶解(“溶解步骤”)，使得它们的膜破裂以允许小分子(低分子量化合物如寡肽)进入细胞或离开细胞，从而使得更大的结构如球状蛋白被保留在细胞中；现在包封的细胞和溶解的细胞被称为“溶解的区室(solubilized compartment)”；
-将所述溶解的区室与
ο所述靶蛋白的配体接触，其中所述配体承载可检测标记，或
ο所述靶蛋白的酶活性的指示剂接触，并且所述酶活性将指示剂转化为可检测标记，(“标记步骤”)；
-选择溶解的区室的子集作为每个溶解的区室中存在的可检测标记的量的函数(“选择步骤”)，所选择的溶解的区室被称为“选择物(selection)”；和
-从选择物中分离表达的核酸序列作为选择的序列集(“分离步骤”)。
阳离子多糖的一个非限制性实例是脱乙酰壳多糖。脱乙酰壳多糖(CAS号9012-76-4)是β-1-4-D-葡糖胺和N-乙酰基-D-葡糖胺的(无规)线性聚合物。
阴离子多糖的一个非限制性实例是藻酸盐，另一个非限制性实例是透明质酸。藻酸盐(CAS号9005-32-7)是(1-4)-β-D-甘露糖醛酸酯和α-L-古洛糖醛酸酯的线性共聚物。透明质酸(CAS号9004-61-9)是糖胺聚糖。用于实施本发明的其它聚离子包括但不限于聚-L-赖氨酸、羧甲基纤维素、聚(4-苯乙烯磺酸钠)、聚(烯丙基胺盐酸盐)、聚苯乙烯磺酸钠、苯乙烯-苯乙烯磺酸钠共聚物(NaPSS)、PLGA(乳酸-乙醇酸共聚物)、聚丙烯酸或已知用于化妆品行业的水溶性聚阳离子聚合物，如化合物的聚季铵盐名录之一(指定为在化妆品行业中使用的不同的聚阳离子聚合物，参见维基百科“聚季铵盐(polyquaternium)条目”。
在一个实施方案中，阳离子处理步骤在阴离子处理步骤之前。初始层取决于模板表面的特性。对于大肠杆菌来说，由于脂多糖(LPS)包含外膜的外表面而使细胞表面带负电荷。这使得细胞适合于使用带正电荷的聚合物进行初始包覆。如果特定细胞具有带正电荷的表面，可以颠倒加工顺序(即，首先施加带负电荷的层)。
在一个实施方案中，包封步骤进行数个循环，重复阴离子和阳离子包覆的顺序。因此，可以使阳离子处理步骤和之后的阴离子处理步骤重复例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次，产生厚厚的囊(capsule)。
溶解步骤破坏细胞壁或外膜(和在革兰氏阴性菌如大肠杆菌的情况下的内膜)并暴露细胞的内部，而在包封步骤过程中施加到细胞的包覆层在随后的步骤中待探测的细胞中保留更大的结构。尺寸限制可以通过调节使用的聚电解质(分子量)和在包封步骤中沉积的层的量来调整。这样能够“调整”本发明的方法从而能保留感兴趣的特定蛋白，同样地其能够使特定尺寸的探针或配体进入到细胞。
溶解步骤可以使用在包封步骤过程中不破坏包覆到细胞上的聚合物层的任何方法。实例包括：去污剂处理穿孔蛋白、溶菌酶、温和超声处理、高渗或低渗休克、电穿孔、醇处理、冻融循环、加热和煮沸囊和压力梯度。
在一些实施方案中，在溶解步骤中使所述包封的细胞膜溶解，产生多个溶解的区室，包括将所述多个包封的细胞暴露于去污剂的水溶液中的步骤。
因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括：
-提供了多个细菌细胞，其中每个细胞包含在每个细胞中表达为靶蛋白的表达的核酸序列，
-在包封步骤中包封所述多个细胞，其包括：
ο在阳离子处理步骤中，使用阳离子多糖处理所述多个细菌细胞，
ο在阴离子处理步骤中，使用阴离子多糖处理所述多个细菌细胞，所述包封步骤产生多个包封的细菌细胞，
-在溶解步骤中，使用去污剂溶解所述包封的细菌细胞的膜，产生多个溶解的区室，
-在标记步骤中，使所述多个溶解的区室与
ο所述靶蛋白的配体接触，所述配体承载可检测标记，或与
ο所述靶蛋白的酶活性的指示剂接触，所述酶活性将所述指示剂转化为可检测标记，
-在选择步骤中，选择所述多个溶解的区室的子集作为在所述溶解的区室中存在的可检测标记的函数，产生选择物，和
-在分离步骤中，从选择物中分离所述表达的核酸序列作为选择的序列集。
在一个实施方案中，使用2％正癸基-β-D-麦芽糖苷(一种溶解细胞膜的去污剂)的水溶液处理表达GPCR的包封的大肠杆菌细胞数小时，所述GPCR位于内部细胞膜。因此，从细胞膜中去除受体分子并将其溶解在溶解的区室内部的正癸基-β-D-麦芽糖苷胶束中。也可以使用其它去污剂，如DDM、OG、CHAPS和任意这些去污剂的混合物(参见实施例)。
根据标记步骤的一个可供选择的方案，将溶解的区室与靶蛋白的配体接触，并且该配体承载可检测标记。与溶解的区室接触的配体能够通过在细胞壁或外膜中的穿孔(perforation)或洞-如果有剩下的话-并通过在包封步骤中包覆在细胞上的包封进入溶解的区室，以探测保留在溶解的区室内部的靶蛋白。
用于实施本发明的配体的非限制性实例为寡肽、(别构)酶激动剂或拮抗剂或离子通道激动剂或拮抗剂、受体激动剂或拮抗剂、逆激动剂、反向激动剂和别构调节剂。配体还可以为酶的底物或结合于靶蛋白变体的过渡态类似物。配体的其它非限制性实例为特异性结合分子，如抗体、DARPin(参见US20120142611(A1)，将其引入本文作为参考)、FAB、纳米抗体或单链可变区片段(scFv)。根据溶解的膜包覆层的孔的尺寸和添加的聚合物层的数量，也可以将功能蛋白(多肽)用作配体。
根据标记步骤的另一个可供选择的方案，将溶解的区室与靶蛋白的酶活性的指示剂接触。酶活性将指示剂转化为充当可检测标记的染料(其在转化之后与在转化之前的指示剂相比，具有不同的吸收或荧光谱)，使细胞或区室的检测和其进一步的选择成为可能。因此，根据该可供选择的方案，标记步骤是配体独立的，例如一般的氧化还原指示剂可以用于检测过氧化物酶的活性。通过非限制性实例的方式，可以在去污剂的存在下，在溶解的区室中检测富马酸还原酶的活性。可以包封表达富马酸还原酶或突变的富马酸还原酶的细胞并使用去污剂溶解区室。然后，将水溶性的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)加入到溶解的区室中，其中其进入区室，而任何活性的富马酸还原酶将MTT还原成不溶的紫色的甲甲沉淀物保留在溶解的区室的内部并且其存在在特定区室中，可以使用流式细胞术(FACS)检测和分离。
在一个实施方案中，可检测标记是荧光染料。荧光染料的非限制性实例为4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)；呫吨染料，如5-或6-羧基荧光素(5-FAM和6-FAM)或荧光素；若丹明染料，如5-或6-羧基四甲基若丹明(5或6-TAMRA)，或花青染料。
选择步骤可以通过任何方法进行，所述方法能够通过在其中的标记的量或质量区分细胞或区室。对于荧光标记，FACS(荧光激活细胞分选术)是特别的方法。
在一个实施方案中，根据本发明的方法，将选择的序列集提交到另一轮选择中。因此，将选择的序列集亚克隆并重新转染到细胞中，以及提交给一系列的包封步骤、溶解步骤、标记步骤、选择步骤和分离步骤一次或数次。在不进一步处理选择的序列集的情况下，可以将重复处理应用于先前重复处理的选择的序列集中。在一个实施方案中，可以例如通过易错PCR(Chen和Arnold,Proc.Nat.Acad.Sci.USA1993,90:5618-5622)使选择的序列集突变。该方法引入点突变，其在不实质改变任何单个序列长度的情况下，小幅度(in smallsteps)改变序列，向选择的序列集中添加“噪声”以引入随后数轮的选择可以从其中选择的突变。可供选择的方案或补充方案是DNA改组(shuffling)或饱和诱变(Stemmer,Nature1994,370:389-391；Miyazaki和Arnold,J.Mol.Evol.1999,49:716-720)。
供选择地，在一个实施方案中，使选择的序列集经受以下处理：删除序列区域(sequence tracts)、重组或改组选择的序列之间的序列区域或随机引入新的序列区域。这样的操作等于在生理环境中重组并在发展的空间中使更大的“跳跃(leap)”成为可能。在一个实施方案中，将点突变和重组两者组合。因此，通过以下方式使选择的序列集多样化：通过将突变引入扩增的序列的方法来扩增所述表达的核酸序列，和/或通过删除序列区域或将该序列区域插入到所述表达的核酸序列中，并且随后将选择的序列集提交给另一系列的包封步骤、溶解步骤、标记步骤、选择步骤和分离步骤。用于引入序列变体的方法由Dalby(Curr.Opin.Struct.Biology201 1,21,473-480)和其中引入的参考文献综述。
表达的核酸序列的文库可以是随机文库，或由同源序列或在某些细胞、组织、病理状态中表达的序列或以与感兴趣的参数联系的任何其他方式表达的序列组成的文库。在一个实施方案中，表达的核酸序列的文库由彼此具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高百分比同一性的同源序列组成。
在本发明的上下文中，同一性为表示逐位(position by position)进行的序列比较结果的单一定量参数。序列比较的方法在本领域中是已知的；可公开得到的BLAST算法是一个实例。
在大多数实施方案中，表达的核酸序列是在细胞(或多个细胞)中存在的转基因表达构建体的部分，例如表达质粒。在一个实施方案中，表达的核酸序列是基因组的，而多个细胞是突变体的群体。在一个实施方案中，多个细胞是细胞类型或有机体的异种混合物。这能够研究罕见的表型，例如在因环境生成的有机体样本中的超稳定的酶。
靶蛋白可以为在细胞中表达并在包封和溶解之后保留在溶解的区室中的任何蛋白。一个重要的非限制性实例为G蛋白偶联受体蛋白。其它非限制性实例包括离子通道、酶、细胞核受体、转录因子和DNA/RNA结合蛋白。靶蛋白的其它实例为特异性结合分子，如抗体、DARPin、FAB、纳米抗体或单链可变区片段(scFv)。小分子量的靶蛋白通过融合到其它寡肽或蛋白以形成更大的结构(例如，三倍GFP标记)或通过经增加聚合物层的数量来降低溶解的区室的有效孔径，而保留在溶解的区室中。
原则上，可以使用任何类型的细胞(在所述词的生物学含义中)。因此，在本说明书的上下文中的术语细胞包括(革兰氏阳性和革兰氏阴性)细菌细胞；真核细胞，包括植物细胞、哺乳动物细胞(包括适合细胞培养的哺乳动物细胞)或适合于包封和随后的破坏细胞的天然保护层(natural containment)的步骤的任何其它细胞。本文显示的实施例使用细菌细胞，然而，本发明的范围不限于细菌细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是细菌细胞。在一个实施方案中，所述细胞是分离的、悬浮在细胞培养物中的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述细胞是分离的、悬浮在细胞培养物中的植物细胞。
在一个实施方案中，可检测标记是荧光染料，并且所述选择步骤是通过荧光细胞分选术实现的。
在一个实施方案中，所述细胞是大肠杆菌细胞，靶蛋白是G蛋白偶联受体，以及所述可检测标记是荧光染料。
无论何处，单一可分的特征的可供选择的方案，例如细胞、靶蛋白、阳离子多糖、阴离子多糖、可检测标记或选择方案在本文中以“实施方案”列出，要理解的是可以自由组合这样的可供选择的方案以形成本文公开的发明的独立实施方案。
通过以下附图和实施例来进一步说明本发明，从以下附图和实施例可以得到进一步的实施方案和优点。
附图简述
图1显示了本发明的一个实施方案的示意图。转化受体突变体文库并在大肠杆菌中表达。包封细胞并使用去污剂使细胞膜透化。包封层充当半透性屏障，将溶解的受体和其编码质粒保留在囊内，但允许荧光标记的配体进入囊，在囊中其可以结合到功能受体分子。含有去污剂稳定的GPCR突变体的囊具有更多的荧光并可以使用FACS从群体中分选出来。从分选的囊中回收遗传物质并用于确定希望的受体突变体或作为用于又一轮的突变或选择的模板。
图2显示了大肠杆菌细胞的LbL包封和该方法针对本发明的优化的示意图。(a)通过铺设带正电荷的脱乙酰壳多糖聚合物和带负电荷的藻酸盐的交替层来包封大肠杆菌细胞。(b)通过将EDTA(+EDTA)添加到藻酸盐和脱乙酰壳多糖的包封溶液中使在“Hillberg”LbL加工过程中产生的聚集细胞的量大大降低。(c)使包封溶液的pH降低至7以下，产生能够抵抗去污剂处理的更强的囊。
图3显示了对包封细胞的表征。用1层脱乙酰壳多糖和1层藻酸盐一式三份地包封表达GPCR的大肠杆菌细胞，并用FACS分析。(a)裸露细胞的激光散射特性使得能限定包围91.4％单一细胞的任意门(arbitary gate)。(b)在包封的细胞样品中检测的60.5％的颗粒落入该门内，且大多数剩余的颗粒表现出更大颗粒的散射特性特征。(c)将裸露和包封的细胞暴露于去污剂(1％DDM，0.6％CHAPS，0.12％CHS)中，并使用FACS分析细胞样颗粒随时间的损失。去污剂处理裸露的细胞导致细胞样颗粒(黑色空心圆圈)的快速损失，而去污剂处理的包封的细胞样品(灰色空心方块)在15天的时间内保持高比例的细胞样纳米颗粒。未处理的裸露细胞(黑色实心三角形)和未处理的包封的细胞(灰色实心方块)两者随时间推移保持高比例的细胞样颗粒。(d)在HL-NT的存在下，包封C末端sfGFP-标记的、表达D03和C7E02的细胞，并将其暴露于温和去污剂混合物(SAB)或强力去污剂(DM)中。使用FACS测量在囊中包含的sfGFP荧光15天。在样品中，没有观察到在sfGFP通道中的平均荧光强度(MFI)的显著降低，表明表达的受体没有从纳米囊中泄漏。(e)相反地，每个囊中结合的配体的平均水平在15天的实验内变化更多。如所预期的，D03在DM中的活性随时间降低。在15天之后，在返回到初始水平之前，C7E02样品的荧光在最初2天内倾向于增加，表明该突变体仍旧能够结合配体。
图4显示了包封细胞的电子显微照片图像。使用透射电子显微镜使(a)裸露的大肠杆菌细胞，(b)包封的细胞和(c)使用1％DDM处理24小时的包封的细胞可视化。
图5显示了对去污剂稳定的303文库成员的选择。使用FACS来选择对去污剂稳定的“303文库”成员。(a)分选群体的荧光直方图显示去污剂稳定的受体的大量富集。(b)使22个选择的克隆单独地表达、溶解并分析在OG中2小时或100小时之后的配体结合活性。表达前3个受体并使其在20℃下、在1.7％DM中溶解3小时。在4℃下，使用链霉亲和素顺磁珠从上清液中捕获溶解的受体1小时。(c)使用20nM HL-NT(8-13)的1.7％DM溶液处理C7E02(灰色圆圈)、303OGB5(灰色方块)、303OGG7(黑色圆圈)或303OGG8(黑色三角形)包覆的珠1小时，之后在升高的温度下热激发(thermally challenged)30分钟，或者(d)在配体缺乏的情况下，在加热之后使用20nM HL-NT(8-13)处理C7E02(灰色圆圈)、303OGB5(灰色方块)、303OGG7(黑色圆圈)或303OGG8(黑色三角形)包覆的珠。(e)供选择地，在用1.7％DM溶解之后，在无配体的情况下在4℃下用2％OG清洗受体包覆的珠15分钟，之后暴露于20nMHL-NT(8-13)的2％OG溶液1小时，随后在升高的温度下热激发30分钟，或(f)在配体缺乏的情况下，在加热之后使用20nM HL-NT(8-13)处理受体包覆的珠。从2％OG中的C7E02包覆的珠中没有测量到特异性信号。在作为竞争剂的5μΜNT(8-13)的存在下，在每个温度点进行平行测量以确定特异性荧光信号。以重复测量值的平均值对数据点进行作图，100％表示在20℃下加热30分钟之后测量的信号。误差条表示平均值的标准误差。
图6显示了用于表征选择的303文库成员的方法。
图7显示了高度稳定的选择的303文库成员的氨基酸序列。将选择受体的氨基酸序列与亲本大鼠NTS1、D03和高表达克隆C7E02比对。用圆柱体表示跨膜螺旋的位置，而在D03上的突变数量显示在Δ列中。
图8显示了使用CHESS选择去污剂稳定的ADRA1A突变体。使用200nM BODIPY FL哌唑嗪，用FACS选择去污剂稳定的ADRA1A文库成员。(a)使21个选择的克隆单独地表达、溶解并分析在PBS-E(DCC)中3小时之后的配体结合活性。(b)在缺乏配体的情况下，在20℃下，将前4个受体在PBS-E(DCC)中溶解3小时。在4℃下，使用链霉亲和素顺磁珠从上清液中捕获溶解的受体1小时。使用20nM[3H]哌唑嗪处理ADRA1ADCCA3(黑色圆圈)、ADRA1ADCCG4(灰色空心方块)、ADRA1ADCCD7(黑色叉号)或ADRA1ADCCD8(灰色空心圆圈)包覆的珠1小时，之后在升高的温度下热激发30分钟，或者(c)在配体缺乏的情况下，在加热之后使用20nM[3H]哌唑嗪处理ADRA1ADCCA3(黑色圆圈)、ADRA1ADCCG4(灰色空心方块)、ADRA1ADCCD7(黑色叉号)或ADRA1ADCCD8(灰色空心圆圈)包覆的珠。当在缺乏配体的情况下溶解受体时，从ADRA1A-或A1A-05包覆的珠中没有测量到显著信号。在作为竞争剂的10μΜ未标记的哌唑嗪的存在下，对每个受体进行平行测量以确定特异性荧光信号。以重复测量值的平均值将数据点进行作图，100％表示在20℃下加热30分钟之后测量的信号。误差条表示平均值的标准误差。
图9显示了稳定选择的ADRA1A文库成员的氨基酸序列。将选择的受体的氨基酸序列与亲本大鼠ADRA1A和先前确定的高表达突变体A1A-05比对。用圆柱体表示跨膜螺旋的位置，而在ADRA1A上的突变的数量显示在Δ列中。
实施例
去污剂稳定的G蛋白偶联受体的选择
G蛋白偶联受体(GPCR)是具有相当大的治疗效益的完整膜蛋白。GPCR基因家族是人类基因组中最大的，并编码对很多种刺激有感觉并作出响应的大约850种不同的受体。对于大多数生物物理研究和结构研究来说，受体需要首先溶解在去污剂中并纯化。虽然已经破解了一些GPCR的晶体结构，其经常作为与T4溶菌酶的融合体，所述T4溶菌酶会阻止与G蛋白的偶联，但该家族的多数成员对于该研究来说太不稳定了。
对该家族的更广泛的研究的挑战是没有描述过能直接改进完整膜蛋白的去污剂稳定性的理论方法或优化方法。之前已经使用半理论试验和误差或丙氨酸扫描和筛选方法确定稳定化突变。然而，即使使用自动化平台，仅可以筛选少量突变，因为分析必须基于单独制备的裂解物来进行。供选择地，已经开发了选择在细菌中更高功能表达的受控制的优化方法(Sarkar等人,Proc Natl Acad Sci U S A,2008.105(39):p.14808-13；Dodevski和Pluckthun,J Mol Biol,2011.408(4):p.599-615)。虽然在膜中更高的功能表达显示了与在温和去污剂中的稳定性的明显相关性，但对短链去污剂的抗性不会直接相关，因为特定的残基控制短链去污剂进入蛋白内部，大体积去污剂或磷脂分子不能进入所述蛋白内部。
尽管如此，为了挖掘重复受控优化的巨大能量，我们追寻直接在细菌细胞中进行受体溶解以能够同时筛选>108个细胞，对于去污剂可溶的和有功能的GPCR变体，各个细胞表达不同的受体突变体。通过将细胞用作初始区室，我们将保持GPCR的表型与基因型(编码质粒)的联系，从而将该筛选用作Darwinian加工的部分，即重复选择和多样化。
要解决的问题是当细胞暴露于去污剂时，细胞将立即分解，从而使受体突变体和质粒的整个混合物均质化，导致加工对于受控优化是无用的，因为将破坏关键的基因型与表型的联系。
为了解决该问题，我们的关键构思为对细胞进行包封。我们设想了将表达GPCR的(细菌)细胞转化到包含溶解的GPCR突变蛋白和编码质粒的去污剂抗性纳米囊中，将能够使用用于适于蛋白结晶化的去污剂抗性GPCR的分子优化的不同文库。由GPCR的选择使功能选择适应在大肠杆菌中的高功能表达(Sarkar等人，出处同上；Dodevski和Pluckthun，出处同上)。将荧光标记的受体配体应用于细胞，所述配体结合于活性受体分子。外膜被温和透化，在内膜中表达大量活性GPCR的细菌细胞可以随后使用荧光激活细胞分选术(FACS)，通过多轮的表达和选择进行选择。然后，可以通过对包含在选择的细胞中的质粒测序来确定高表达突变体的遗传同一性。在本研究中，需要分选溶解的受体，而类似的FACS策略也可以与包封的细胞一起使用。将设计的策略称为细胞高通量包封、溶解和筛选(CHESS)(图1)。
为了对细胞进行包封，我们优化了基于聚电解质的逐层(LbL)沉积的技术(Hillberg和Tabrizian,Biomacromolecules,2006.7(10):p.2742-50)。该方法制备了非空囊、含有多种细胞的少数囊，并且可以容易地按比例扩大至批量包封大量的细胞(>1010个)。所述方法利用了由在外膜展示的脂多糖造成的大肠杆菌细胞的负性表面电荷，其有助于将带正电荷的聚合物，脱乙酰壳多糖(聚-D-葡糖胺)沉积在细胞上。在清洗掉未结合的脱乙酰壳多糖之后，沉积带负电荷的藻酸盐聚合物，产生交替地带电荷的稳定聚合物的强包覆层(图2a)。通过筛选不同的缓冲液和pH值来优化包封条件以使聚合物沉积最大化，同时使细胞聚集最小化(图2b和图2c)。当使用流式细胞术和电子显微镜分析(图4)时，优化的条件产生了由大多数单细胞尺寸的(图3a和图3b)、去污剂抗性的(图3c)囊组成的制备物。包封使得去污剂能处理细胞膜分解的完整细胞，同时原位溶解在内膜中表达的GPCR并将其保持在囊内，甚至在暴露于去污剂中15天之后(图3d)。
接下来，我们确保了可以在囊内检测有功能的去污剂溶解的GPCR分子和可以将稳定的GPCR与不稳定的GPCR变体区分。对于这些实验，使用了大鼠神经降压素受体(rNTS1)两种突变体。D03是使用伴随细菌展示的受控优化确定的rNTS1的高表达变体，并且在温和的去污剂中是稳定的。C7E02是衍生自在DM胶束中非常稳定的D03的变体。我们通过FACS测试了功能性：荧光标记的NTR1配体、HiLyte Fluor647-标记的NT(HL-NT)可以通过囊孔扩散进入并被溶解的受体结合。使用温和的去污剂混合物(1％DDM、0.5％CHAPS、0.1％CHS和30％甘油)，两种溶解受体与功能性配体结合可以通过囊的FACS，在15天时间内测量(图3e)。当使用更加苛刻的含有1.7％DM的去污剂缓冲液处理时，含有D03的囊在10小时内表现出HL-NT结合丧失，而稳定的受体C7E02在完整15天时间内表现出配体结合活性(图3e)。有趣地，从含有稳定受体的囊中测量的特异性荧光信号随时间增加，很可能是由于通过去污剂净化囊，导致较少地散射荧光辐射。在全部这些实验中，清楚地证实了我们可以探测已经直接在纳米囊内部经去污剂溶解的不同受体的稳定性特性。
为了证实CHESS作为在受控优化实验中的选择工具，我们将所述方法应用于先前建立的、已知包含一些对去污剂稳定的受体的文库。“303文库”是一类衍生自D03的rNTS1突变体。由饱和诱变和高功能性表达选择策略确定了在该文库中的30个可变位置。在该文库中包含已经报道的增加rNTS1稳定性的另外3个氨基酸取代。使用野生型残基重组这33个可变位置以产生具有8.6×109个单独突变体的理论多样性的文库。先前将该文库应用于细菌展示中以确定高表达突变体(参见Schlinkmann等人,J.Mol.Biol.2012,422(3),414-28)。发现了这些突变体中的一些(包括C7E02)在短链去污剂中相对稳定。因此，该文库可以充当CHESS选择的测试例，其目的是为了通过筛选全文库多样性直接分离在短链去污剂中稳定的受体。
诱导了含有GPCR文库成员的大肠杆菌DH5α的大约108个转化体并使其能表达GPCR、对其包封并且在无配体的情况下，在20℃下使用2％DM处理3小时，随后在20nM FL-NT的存在下，在20℃下处理2小时。在每一轮中，使用FACS选择前0.5-1％的绿色荧光囊，接着是囊的超声破坏，选择的突变体的PCR扩增、再克隆和转化。在第二和第三轮中，使用短链去污剂辛基葡糖苷(OG)进行溶解。从第1至第3轮中分选的群体的荧光强度表明在分选的群体中OG抗性rNTS1变体的大量富集(图5a)。
将在第三轮分选之后选择的突变体克隆至含有C末端sfGFP融合体和avi-标记的表达载体中用于在体内生物素酰化[21]。为了测试表达的受体蛋白的稳定性(图6)，在20℃下，将该表达的受体蛋白在2％DM中溶解3小时并固定在链霉亲和素包覆的顺磁珠上，其使得能洗掉其它蛋白，并且将去污剂交换为2％OG。加入HL-NT以结合功能受体分子。
当在2％OG中溶解2小时时，在分析的22个选择的文库成员中有20个表现显著的配体结合，而亲代基因D03完全无活性(图5b)。在2％OG中2小时后，13个克隆表现出比C7E02显著增加的功能受体的分数。在2％OG中超过4天后，这些克隆中的8个仍旧显示显著的配体结合，而C7E02完全无活性。令人备受鼓舞的是，将CHESS应用于“303文库”中产生了这样的高频率的OG抗性GPCR。
当在1.7％DM或2％OG中溶解时，在存在或不存在配体的情况下测量前3个选择的克隆的热变性谱。当在DM和OG两者中，在存在或不存在NT的情况下加热时，303OGB5、303OGG7和303OGG8表现出比C7E02增强的热稳定性(图5c、d、e和f)。特别值得注意的是当在配体不存在的情况下加热时这些受体的高稳定性，表明高度的内在受体稳定性。与之相反，对于C7E02，在相同条件下没有测量到活性，很可能是因为C7E02在无NT结合的情况下，在OG中不稳定，并且对于这些分析，已经在配体不存在的情况下交换了去污剂。
另一方面，通过CHESS、303OGB5、303OGG7和303OGG8选择的克隆在存在或不存在配体的情况下，在OG中、在40℃左右表现出T1/2值(图5e和f)。相对于D03，受体的序列(图7)分别显示22、21和14个氨基酸取代，其主要位于跨膜螺旋内。
为了研究CHESS是否可以一般应用于GPCR中，将选择应用于先前已经经受两轮易错PCR和用于在大肠杆菌中高功能性表达的选择的α1A肾上腺受体(ADRA1A)的文库(Dodevski和Pluckthun，出处同上)。在FACS选择之前，在BODIPY-FL标记的哌唑嗪(FL哌唑嗪)的存在下，通过去污剂混合物(1％DDM、0.5％CHAPS、0.1％CHS、30％甘油)原位溶解包封的ADRA1A文库。在使用相同的去污剂混合物进行连续3轮的选择之后，单独分析21个单独选择的克隆在该去污剂混合物中的增加的稳定性(图8a)。这些受体中的12个表现出比野生型ADRA1A显著更高的稳定性并且比先前选择用于高功能性表达(A1 A-05)的最好突变体的稳定性更高。
在存在或不存在配体的情况下，测量选择的前4个克隆的热变性谱(图8b和c)。选择的前4个克隆A1ADCCA3、A1ADCCG4、A1ADCCD7和A1ADCCD8在存在配体的情况下，在40℃左右表现出T1/2值，或在配体不存在的情况下，在35℃左右表现出T1/2值。在这些条件下，选择用于更高功能性表达的野生型ADRA1A和突变体A1A-05，甚至在20℃下，在缺乏配体的情况下，在该去污剂中显得不稳定，因为没有获得显著的荧光信号。发现针对在去污剂中的稳定性而受控优化的受体与野生型受体相比，包含12至14个氨基酸取代(图9)。将大多数突变定位在受体的7个跨膜芯中，主要在螺旋2、3、4和7中，并且还发现许多保守的取代位于受体的C末端尾部。有趣地，所有选择的克隆包含在ADRA1A突变体中未被确定的取代，所述ADRA1A突变体是从相同的高功能性表达文库中选择的(Dodevski和Pluckthun，出处同上)，表明CHESS使特异性改进受体在去污剂中的稳定性的低频率突变的富集成为可能。与基于NTS1的文库的选择一样，CHESS能够递送到目前为止报道的大多数去污剂稳定的ADRA1A同种型。
将CHESS成功应用于两种不相关的GPCR中表明CHESS是直接生成对于苛刻去污剂稳定的GPCR的新的、快速方法，所述苛刻去污剂完全适于生物物理分析和结晶学筛选。通过优化不依赖于将T4溶菌酶融合进入环中的一个的受体，使对具有G蛋白的复合物的研究简单化。CHESS可能能够直接选择帮助G蛋白模拟物的结合的受体突变体，所述蛋白模拟物如肽或甚至是G蛋白自身，所述G蛋白模拟物的结合可以加强在活性构象中稳定的受体的直接选择。
由于囊的渗透性可以通过添加另外的聚电解质层来调节，因此，可以将CHESS应用于非GPCR膜蛋白或可溶性蛋白如酶。虽然其是形成微观区室并因此在这方面类似于油包水乳状液的方法，但其向小分子提供了从本体溶液(bulk solution)离开和进入本体溶液的入口，并且由细菌细胞直接生成每个区室。其中使用去污剂的如以上所描述的应用不可以使用油包水乳状液进行。现在可以在由活细菌细胞生成的这些区室中直接进行通常将需要细胞破裂，如膜蛋白溶解和稳定性测试的所有分析或使用细胞不渗透性荧光底物的酶分析。
CHESS适于长期的稳定性研究，因为一旦适当包封，CHESS囊稳定数周。通过直接将细菌细胞转化为半渗透性稳定囊，与单个细胞裂解物相比，可以同时测试的样品的数量可能增加5或6个数量级。在膜蛋白研究领域中，希望的是CHESS可以变成难题的通用解决方案的部分，所述难题与直接优化对苛刻去污剂稳定的蛋白，如这里所描述的GPCR相关，反过来能够更完整地理解这些与治疗相关的蛋白。
材料和方法
质粒、受体文库和细菌表达
在本研究中，所有克隆和表达使用大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α。本研究使用GPCR编码质粒或文库和如之前所述的表达的蛋白进行转化(Sarkar等人，出处同上：Dodevski和Pluckthun，出处同上)。
细胞的包封
对于LbL包封，按照Hillberg等人所述的方案(出处同上)并进行以下修改：在蛋白表达之后，通过在3800rcf下，在摆动式吊桶离心机中离心来收获细胞，并使用PBS pH7.4、1mM EDTA和25pg/ml氯霉素(PBS-E)清洗3次。将细胞重悬于含有0.25mg/ml低分子量脱乙酰壳多糖(Sigma Aldrich)的PBS-E pH6.0中并剧烈混合。通过在1700rcf下，在摆动式吊桶离心机中离心来收集细胞并用PBS-E pH6.0清洗细胞3次，之后重悬于含有0.25mg/ml低粘度藻酸(Sigma Aldrich)的PBS-E pH6.0中并使其经受剧烈振摇。用PBS-E pH6.0清洗囊3次并重悬于PBS-E pH7.4中。使用具有体积颗粒计数能力的Partec CyFlow Space细胞计数器表征包封样品的微粒特征和荧光特性。在使用FACS测量的配体结合分析中，将细菌细胞暴露于20nM HiLyte Fluor647标记的NT(8-13)(HL-NT)(通过Anaspec合成的)中至少2小时，之后离心并在FACS分析之前清洗该细菌细胞一次。
透射电子显微镜
在微量离心管(Eppendorf tube)中离心未处理的大肠杆菌培养物并弃去上清液。将来自细胞团(pellet)的细胞吸入纤维素毛细管中并立即浸入1-十六碳烯中以防止干燥。使用解剖刀切割约4mm长的管并转移到6mm铝样本载体(aluminium specimen carrier)的150μm孔中。将密封的200μl移液吸头(pipette tip)中的处理的大肠杆菌培养物离心。使用滤纸去除上清液，切掉密封的吸头并将细胞团直接吸入6mm铝样本载体的100μm腔中。使用浸入1-十六碳烯中的平坦的6mm铝样本载体将样品夹在中间并使用EM HPM100高压冷冻机(Leica Microsystems,Vienna,Austria)进行高压冷冻。在AFS2冷冻置换单元(LeicaMicrosystems)中，使用含有2％OsO4的无水丙酮冷冻置换样品。以30℃/小时的定期温度转变梯度将样品在-90℃下置换8小时，在-60℃下置换8小时，在-30℃下置换8小时并在0℃下置换1小时。然后使用无水丙酮，在4℃下清洗样品两次并将其包埋在Epon/Araldite中。使用乙酸双氧铀和柠檬酸铅对切片进行后染色并使用Gatan CCD摄像机(1k x1k)和数字显微照片获得软件(Gatan GmbH,Munich,德国)，在Phillips CM12透射电子显微镜(FEI,Eindhoven,Netherlands)中成像。
从文库中选择去污剂稳定的GPCR
对使用GPCR文库转化的大肠杆菌培养物包封并使用含有完全蛋白酶抑制剂(Roche)、25μg/ml氯霉素和2％DM(PBS-E(DM))的PBS-E pH7.4处理。对于使用“303文库”的选择，初始选择轮涉及在无配体的情况下，伴随剧烈振摇，在20℃下使用2％DM激发包封的天然文库3小时，随后在20nM BODIPY FL标记的NT(8-13)(FL-NT)(Sarkar等人，出处同上)的存在下，在20℃下激发包封的天然文库2小时。在FITC通道中，在FACS选择前0.5-1％荧光囊之前，用PBS-E(DM)溶液清洗囊两次。在超声水浴中超声破坏囊5分钟之后，通过使用特异性引物的PCR扩增，从分选的囊中回收遗传信息。在第二轮和第三轮选择中，与在第一轮中一样，使囊在PBS-E(DM)中溶解3小时，接着添加20nM FL-NT1小时，之后通过离心收集囊并重悬于含有2％OG(PBS-E(OG))和20nM FL-NT的PBS-E中。用20nM FL-NT的PBS-E(OG)溶液清洗囊一次以促进有效的去污剂交换，之后囊在2％OG中与配体孵育2小时。用PBS-E(OG)清洗囊两次并使用FACS分选前0.5-1％的荧光囊。
对于ADRA1A文库选择，进行3轮选择，每轮使用相同的条件。用含有200nM BODIPY-FL-哌唑嗪(Invitrogen)(FL-哌唑嗪)的1％DDM、0.5％CHAPS、0.1％CHS的PBS溶液、1mMEDTA、30％甘油在pH7.4下溶解囊。在1％DDM、0.5％CHAPS、0.1％CHS的PBS溶液、1mMEDTA、30％甘油中在pH7.4下清洗囊两次并使用FACS分选前0.5-1％的荧光囊。
针对去污剂稳定性筛选选择的克隆
将由最终轮的选择扩增的PCR片段克隆至含有C末端的sfGFP-AviTag融合体的载体中。之前已经显示了具有C末端的sfGFP-Avi-标记的GPCR的表达生成高百分比的体内生物素化受体(Dodevski和Pluckthun，出处同上)。在24孔深孔板中表达受体并将细胞溶解于含有50mg/ml鸡卵溶菌酶(Sigma Aldrich)的PBS-E(DM)中。使板在超声水浴中经受5分钟的超声处理，之后在20℃下孵育3小时，并伴随剧烈振摇。用离心去除细胞碎片并在4℃下将含有溶解的受体的上清液和链霉亲和素包覆的顺磁珠(Invitrogen)一起孵育1小时，在“303文库”成员的情况下使用20nM HL-NT。混合溶液并使用kingfisher FLEX磁颗粒处理器(Thermo scientific)，在96孔深孔板中操作珠。对于“303文库”成员，将受体包覆的珠转移到2个随后的、含有20nM HL-NT的PBS-E(OG)的去污剂交换溶液中。在暴露于OG中2小时或100小时之后，在PBS-E(OG)中清洗珠一次，之后转移到清澈见底的黑色的96孔微板(Greiner)中，每个孔100μlPBS-E(OG)。使用M1000双重单色仪荧光板读数器(Tecan)测量每个孔中的HL-NT和sfGFP荧光水平，对于HL-NT在630nm下激发，而对于sfGFP，在488nm下激发。在668nm下测量HL-NT的荧光发射信号并在512nm下测量sfGFP的荧光发射信号。
对于单独的ADRA1A克隆分析，红色荧光标记的配体的不适用性意味着我们需要使用3H-标记的哌唑嗪(Invitrogen)来定量结合于溶解的受体的配体。如上所述，使用含有1％DDM、0.5％CHAPS、0.1％CHS和30％甘油(PBS-E(DCC))，进一步补充50mg/ml鸡卵溶菌酶和20nM[3H]哌唑嗪的PBS-E pH7.4的温和去污剂混合物，在20℃下进行表达和溶解。在结合于磁珠并清洗之后，将每个数据点的最终珠溶液的3/4(15μl)重悬于200μl的OptiPhaseSupermix混合物(PerkinElmer)中并在液体闪烁计数器(1450Microbeta plus；PerkinElmer)上测量3H计数。将剩余的1/4珠溶液重悬于100μl PBS-E(DCC)中并如上所述测量每个样品的sfGFP荧光。
热稳定性分析
在20℃下，在200ml培养物中表达NTS1相关受体20-24小时。使用离心收获细胞，使用PBS-E清洗一次，并用超声处理(Sonifier250,Branson)破坏细胞。使用离心收集裂解的细胞并弃去上清液。将细胞团在20℃下，伴随剧烈振摇，在含有50mg/ml鸡卵溶菌酶的PBS-E(DM)中溶解3小时。通过离心去除不溶物质并将上清液暴露于链霉亲和素包覆的顺磁珠中。使溶解的受体能在4℃下结合于珠1小时，之后转移到含有PBS-E(DM)或PBS-E(OG)而无配体的新容器中并混合15分钟。将珠重悬于含有PBS-E(DM)或PBS-E(OG)、具有或不具有配体(或竞争剂)的新容器中。沿着96孔PCR板的排分配含有珠的溶液并使用梯度PCR循环仪(Biometra)使其经受30分钟的热处理。在加热之前或之后，配体与受体包覆的珠孵育1.5小时。在相关的去污剂溶液中清洗珠一次，之后重悬于清澈见底的黑色96孔微板中，并如上所述测量每个孔的残余荧光强度。使用GraphPad Prism，利用数据的非线性回归拟合限定表观T1/2值。
对于ADRA1A衍生的克隆，如上所述进行表达和超声处理，但在缺乏配体的情况下，在20℃下，伴随剧烈振摇，将细胞团在含有50mg/ml鸡卵溶菌酶的PBS-E(DCC)中溶解3小时。如上所述进行热和配体处理，并如之前所述(Dodevski和Pluckthun，出处同上)进行放射性配体结合分析和曲线拟合。

Claims (15)

1.一种用于从表达的核酸序列的文库中选择序列集的方法，其中
-提供了多个细胞，每个细胞包含在所述细胞中表达为靶蛋白的表达的核酸序列，
-在包封步骤中包封所述多个细胞，其包括：
ο在阳离子处理步骤中，使用阳离子多糖处理所述多个细胞，
ο在阴离子处理步骤中，使用阴离子多糖处理所述多个细胞，
所述包封步骤产生多个包封的细胞，
-在溶解步骤中，溶解所述包封的细胞的膜，产生多个溶解的区室，
-在标记步骤中，使所述多个溶解的区室与
ο所述靶蛋白的配体接触，所述配体承载可检测标记，或与
ο所述靶蛋白的酶活性的指示剂接触，所述酶活性将所述指示剂转化为可检测标记，
-在选择步骤中，选择所述多个溶解的区室的子集作为在所述溶解的区室中存在的可检测标记的函数，以产生选择物，和
-在分离步骤中，从选择物中分离所述表达的核酸序列作为选择的序列集。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述阳离子多糖为脱乙酰壳多糖和/或所述阴离子多糖为藻酸盐或透明质酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述阳离子处理步骤在阴离子处理步骤之前。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中使阳离子处理步骤，随后是阴离子处理步骤重复二至十次。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述可检测标记为荧光染料。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述配体为寡肽、激动剂、拮抗剂、底物或结合于所述靶蛋白的变体的过渡态类似物。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述选择的序列集转移到多个细胞中并提交给另一系列的包封步骤、溶解步骤、标记步骤、选择步骤和分离步骤。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述分离步骤之后，通过以下方式使选择的序列集多样化：
a.通过将突变引入扩增的序列中的方法来扩增所述表达的核酸序列，和/或通过
b.删除序列区域或将该序列区域插入到所述表达的核酸序列中，
并且随后，将选择的序列集提交给另一系列的包封步骤、溶解步骤、标记步骤、选择步骤和分离步骤。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表达的核酸序列的文库为彼此具有至少60％同一性的同源序列的文库。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中使所述表达的核酸序列包含在转基因表达构建体中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述转基因表达构建体为质粒。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶蛋白为G蛋白偶联受体蛋白、离子通道、酶、细胞核受体、转录因子或DNA/RNA结合蛋白。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述溶解步骤通过将所述包封的细胞暴露于去污剂中来实现。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞为细菌细胞。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述可检测标记为荧光染料并且所述选择步骤通过荧光细胞分选来实现。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2612916A1 (en) 2012-01-09 2013-07-10 Universität Zürich Cellular high throughput encapsulation for screening or selection
CN107075545A (zh) 2014-07-30 2017-08-18 哈佛学院院长及董事 探针文库构建
CN107624132A (zh) * 2014-12-22 2018-01-23 苏黎士大学 膜蛋白在具有细胞壁的真核细胞中的定向进化
EP3635159A4 (en) 2017-05-11 2021-01-13 The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health ENCAPSULATION OF EUKARYOT CELLS FOR EXPRESSED SEQUENCE CELL SCREENING
WO2018218150A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for high-throughput image-based screening
AU2020211622A1 (en) * 2019-01-25 2021-08-19 The Australian National University Encapsulated cells
US20220411788A1 (en) 2019-11-20 2022-12-29 Leadxpro Ag Method of enabling pooled-library based nucleic acid constructs screening
US20230174912A1 (en) * 2020-04-21 2023-06-08 University Of Maryland, College Park System, device, and method for single-cell encapsulation and culture

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011047870A1 (en) * 2009-10-22 2011-04-28 Plasticell Ltd Nested cell encapsulation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2130177T3 (es) * 1991-08-10 1999-07-01 Medical Res Council Tratamiento de poblaciones de celulas.
US20040241759A1 (en) * 1997-06-16 2004-12-02 Eileen Tozer High throughput screening of libraries
DK1332209T3 (da) 2000-09-08 2010-03-29 Univ Zuerich Samlinger af repeatproteiner indeholdende repeatmoduler
GB0802474D0 (en) * 2008-02-11 2008-03-19 Heptares Therapeutics Ltd Mutant proteins and methods for selecting them
EP2612916A1 (en) 2012-01-09 2013-07-10 Universität Zürich Cellular high throughput encapsulation for screening or selection

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011047870A1 (en) * 2009-10-22 2011-04-28 Plasticell Ltd Nested cell encapsulation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biorecognition through Layer-by-Layer Polyelectrolyte Assembly：In-Situ Hybridization on Living Cells;Anna L.Hillberg and Maryam Tabrizian;《Biomacromolecules》;20060920;第7卷(第10期);2742-2750 *
Daniel J. Scott and Andreas Plückthun.Direct Molecular Evolution of Detergent-Stable G Protein-Coupled Receptors Using Polymer Encapsulated Cells.《J.Mol.Biol.》.2012,第425卷662-677. *

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