CN107624132A - 膜蛋白在具有细胞壁的真核细胞中的定向进化 - Google Patents
膜蛋白在具有细胞壁的真核细胞中的定向进化 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于从文库选择表达的序列的方法,其包括以下步骤:多个包含细胞壁的真核细胞中的每个包含文库的核酸序列成员,其在所述真核细胞中表达为靶膜蛋白。所述细胞的细胞壁是透化的。所述透化的细胞使用能够结合到所述靶膜蛋白的配体标记。所述配体带有可检测的标记。选择所述标记的细胞的子集作为存在的可检测标记的函数。最终,在分离步骤中,从所述选择的细胞分离表达的核酸序列。
Description
说明
尽管在表达、纯化和结晶策略方面有进步技术,真核生物跨膜受体的结构和详细的生物化学研究仍然受到阻碍。主要的困难是缺乏产生足够数量的所需受体的能力及其固有的不稳定性。
通过定向进化提高大肠杆菌中GPCR的功能性表达水平的方法是本领域中已知的(Sarkar等(2008),PNAS 105:14808-14813;Dodevski&Plückthun(2011),J Mol Biol 408:599-615)。使用该方法已经分离出几种GPCR的高表达变体。然而,由于大肠杆菌不能进行翻译后修饰,缺乏真核生物膜蛋白的分泌质量控制和易位机制,以及在膜组成上不同,因此真核生物的跨膜受体在大肠杆菌中的进化限于在原核系统中固有表达高于成功进化所需的阈值的受体,因此对于真核生物的加工或膜组成没有严格的要求。
因此,需要建立快速、有效和稳定的方法以增加跨膜受体在真核宿主中的功能性表达。原则上,理想的真核宿主将是用于生产进化了的高表达变体的细胞。然而,这些哺乳动物或昆虫细胞不容易使用文库转化,这对于任何类型的定向进化方法是必需的。对于涉及文库的其它过程,使用“较低级的”真核生物如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常见的。然而,酵母细胞包含细胞壁,其通过限制所给予的配体到达位于质膜中的表达受体来限制功能性分析。对于可溶性蛋白质,该问题的常见解决方案是使用诸如酵母展示之类的方法,其将感兴趣的蛋白表达为存在于细胞壁外面的融合蛋白。然而,该方法不适用于选择不溶性跨膜受体的功能性高表达变体,其必须位于质膜中,并因此位于细胞壁之下,并且不能表达为附着于细胞壁的融合蛋白。
本发明针对的问题是提供新颖有效的方法来促进和加快跨膜受体的研究和药物设计,特别是通过鉴别跨膜蛋白变体,在包含细胞壁的真核细胞中产生优化的功能性表达。这个问题由独立权利要求的主题解决。
术语和定义
在本说明书的上下文中,术语“碱性pH”以其在化学领域中已知的含义使用;它指对水溶液的碱度的度量。pH大于7表示碱性(alkaline)或碱性(basic)溶液,pH小于7表示酸性溶液。
在本说明书的上下文中,术语“还原剂”以其在化学和生物化学领域中已知的含义使用;它指在氧化还原反应中向另一种化学物质提供电子的元素或化合物。在这个过程中,还原剂被氧化。
在本说明书的上下文中,术语“荧光细胞分选或荧光激活的细胞分选(FACS)”以其在细胞生物学领域中已知的含义使用;它们指用于细胞分选的方法,其中细胞悬浮于流体中并通过检测装置。根据通过的细胞的特定荧光信号的强度,每个通过的细胞可以被引导进入不同的隔室中。
在本说明书的上下文中,术语“随机诱变”以其在细胞生物学和分子生物学领域中已知的含义使用;它指其中将DNA突变随机引入以产生突变基因和蛋白的方法。然后可以将许多这些突变基因编译到文库中。随机诱变方法的非限制性实例为易错PCR、UV辐射和化学诱变剂。
在本说明书的上下文中,术语“文库”以其在细胞生物学和分子生物学领域中已知的含义使用;它指核酸片段的集合。一种特定类型的文库是通过随机诱变产生的随机的突变体文库。另一种实例为设计的(或合成的)文库,其包含专门工程化的DNA片段。
在本说明书的上下文中,术语“表达水平”以其在细胞生物学和分子生物学领域中已知的含义使用;它分别指DNA片段及其衍生mRNA的转录水平和/或翻译水平。在某些实施方案中,如果突变基因的表达高于对照基因或野生型基因,则表达水平被认定为是高的。在某些实施方案中,突变基因的表达比对照或野生型基因的表达至少高两倍被认定为高的。
根据本发明的第一方面,提供了一种用于从表达的核酸序列的文库选择序列的方法,其中根据其表达水平选择序列。所述方法包括以下步骤:
a)提供多个包含细胞壁的真核细胞,特别是多个酵母细胞,其中所述真核细胞中的每个包含所述文库的核酸序列成员。所述核酸序列成员为在所述细胞中可操作的启动子序列的控制下表达的所述细胞的转基因,其在所述多个包含细胞壁的真核细胞中作为靶膜蛋白。
b)在透化步骤中,透化所述多个包含细胞壁的真核细胞的细胞壁,产生多个活的透化的细胞。
c)在标记步骤中,将所述多个活的透化的细胞与能够特异结合到所述靶膜蛋白的配体接触。所述配体包括可检测的标记,产生多个活的透化的细胞。
d)在洗涤步骤中,洗涤所述多个活的透化的细胞,从而除去没有特异性结合到所述靶膜蛋白的大多数的(如果不是则是基本上所有的)任何配体和可检测的标记。
e)在选择步骤中,检测所述多个活的标记的细胞中的每个存在的可检测的标记,并且选择所述多个活的标记的细胞的子集作为存在于所述多个活的标记的细胞的可检测标记的函数。换言之,选择显示任何标记或标记数量高于某阈值的所述细胞,产生选择的活细胞。
f)在分离步骤中,从所述选择的细胞分离表达的核酸序列。
换言之,根据本发明的第一方面的方法实现了跨膜受体的文库在包含细胞壁的真核细胞中的表达,并实现了对这些受体的功能性表达的选择。通过以仍然维持活的和结构稳定的细胞的方式对细胞壁透化使这成为可能,其不同于细胞壁透化的其他方法,例如制备原生质球。本发明的透化过程甚至实现了大配体与跨膜受体的结合。通过结合配体的数量选择细胞能够根据质膜上功能性受体的数量而不是通过总的受体数量来选择细胞,总的受体数量还包括非功能性受体(例如存在于细胞内膜中的受体)。
在某些实施方案中,所述方法另外包括以下步骤:
i.在选择步骤e)后,在扩增步骤中,扩增选择的活细胞,产生扩增的选择的活细胞。所述扩增的选择的活细胞按该顺序经受步骤b)至e),和
ii.将步骤i.进行至少1、2、3、4、5、6或7次,最后跟随分离步骤f)。
在某些实施方案中,所述选择步骤包括众多的选择过程。在第一次选择后,再次使用选择的细胞用以选择这些细胞的子集作为存在于这些细胞中的可检测标记的函数。选择细胞重复至少1、2、3、4或5次。
在某些实施方案中,通过扩增编码靶膜蛋白的核酸序列,通过将突变引入到扩增序列的方法,获得表达的核酸序列的文库。
在某些实施方案中,所述方法另外包括以下步骤:
i.将在分离步骤f)中获得的表达的核酸引入到多个包含细胞壁的真核细胞中,并在其中表达,
ii.根据本发明的第一方面,使多个包含细胞壁的真核细胞以该顺序经受步骤b)至f),和
iii.将步骤i.和ii.进行至少1、2、3、4、5、6或7次。
在某些实施方案中,通过本发明的方法获得的表达的核酸序列的特征在于编码的靶膜蛋白的高表达水平和/或高热力学稳定性。
在某些实施方案中,根据本发明的所有方面,在选择步骤e)中,选择的活细胞包括最强荧光细胞的前0.1%至5%。
在某些实施方案中,所述方法另外包括以下步骤:
i.通过将突变引入到扩增序列中的方法,扩增在分离步骤f)中获得的表达的核酸,产生核酸序列的第二文库。
ii.将该核酸序列的第二文库转移到多个包含细胞壁的真核细胞。
iii.根据本发明的第一方面的方法,将多个包含细胞壁的真核细胞(现在包含第二文库的核酸序列成员)按该顺序递送至步骤b)至f)。
在某些实施方案中,包含细胞壁的真核细胞为酵母细胞。
在某些实施方案中,靶膜蛋白为G-蛋白偶联受体(GPCR)。
在某些实施方案中,透化步骤包括将多个包含细胞壁的真核细胞暴露于酶处理和/或化学处理。
在某些实施方案中,在透化步骤中的酶处理包括将多个包含细胞壁的真核细胞暴露于透化细胞壁的酶或酶混合物。这样的酶的限制性实例为葡聚糖酶、蛋白酶、甘露酶和/或硫酸酯酶。这样的酶混合物的非限制性实例为酵母裂解酶(Zymolyase)、溶细胞酶(Lyticase)或蜗牛酶(Glusulase)。
在某些实施方案中,透化步骤中的化学处理包括将多个包含细胞壁的真核细胞暴露于含锂离子、还原剂和/或螯合剂的碱性pH缓冲液。
在某些实施方案中,在透化步骤中使用的缓冲液中包含的缓冲剂的非限制性实例为:
Bicine(2-(双(2-羟基乙基)氨基)乙酸)或
HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)或
MOPS(3-吗啉代丙烷-1-磺酸)或
PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)或
TAPS(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]丙烷-1-磺酸)或
TAPSO(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸)或
TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸)或
Tricine(N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸)或
Tris(2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇)。
在某些实施方案中,在透化步骤的缓冲液中使用的螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。
在某些实施方案中,可检测标记为荧光染料并且选择步骤通过荧光细胞分选完成。
在某些实施方案中,还原剂的非限制性实例为:
含硫醇的化合物,例如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、巯基乙醇或还原性谷胱甘肽或
含膦化合物,如三羧乙基膦(TCEP)。
在某些实施方案中,所述透化步骤包括以下步骤:
a)在含有50mM Tris-HCl pH 9、1mM EDTA和100mM乙酸锂的TELi缓冲液中孵育酵母细胞,
b)在20℃下,在另外含有50mM DTT的TELi缓冲液中孵育酵母细胞30分钟,
c)在4℃下在TELi缓冲液中洗涤酵母细胞至少一次。
在某些实施方案中,TELi缓冲液含有50mM Tris-HCl pH 9、1mM EDTA和100mM乙酸锂。
在某些实施方案中,在透化步骤中使用的缓冲液包括:
i.锂离子,
ii.碱性pH,
iii.还原剂,和/或
iv.螯合剂。
在某些实施方案中,标记步骤包括在4℃下,将酵母细胞暴露于包含配体的TELi缓冲液。
在某些实施方案中,用于表达的核酸序列的文库的核酸序列通过随机诱变,优选地通过易错PCR产生。
在某些实施方案中,表达的核酸序列的文库为设计的(合成的)文库。
在某些实施方案中,表达的核酸序列的文库包含相互之间具有至少60%的序列一致性的同源序列。
在某些实施方案中,包含细胞壁的真核细胞为酵母细胞,特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。
在某些实施方案中,包含细胞壁的真核细胞为不包含原生细胞壁的突变或基因工程酵母菌株。
在某些实施方案中,包含细胞壁的真核细胞为酿酒酵母,特别是酿酒酵母菌株BY4741。
在某些实施方案中,能够特异地结合到靶膜蛋白的配体为激动剂、拮抗剂或变构调节剂。
在某些实施方案中,能够特异地结合到靶膜蛋白的配体为由至少3、4、5、6、8、10、14、18或25个氨基酸组成的寡肽。
在其它实施方案中,能够特异地结合到受体的配体为抗体、抗体片段或另一结合蛋白,例如来自以下实例的非限制性列表的支架蛋白:设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、亲和体(affibodies)、anticalins、纳米抗体(nanobodies)、affilins、纤连蛋白衍生的支架和其他支架。
根据本发明的该第一方面的可选方案,提供了从表达的核酸序列的文库选择序列的方法,其中根据其表达水平选择序列。所述方法包括以下步骤:
a)提供多个包含细胞壁的真核细胞,特别是多个酵母细胞,其中所述真核细胞中的每个包含所述文库的核酸序列成员。所述核酸序列成员为在所述细胞中可操作的启动子序列的控制下表达的所述细胞的转基因,其在所述多个包含细胞壁的真核细胞中作为靶膜蛋白。
b)在标记步骤中,将所述多个包含细胞壁的真核细胞与能够特异结合到所述靶膜蛋白的配体接触。所述配体包括可检测的标记,产生多个标记的细胞。
c)在洗涤步骤中,洗涤所述多个标记的细胞,从而除去没有特异地结合到所述靶膜蛋白的大多数或任何配体和可检测标记。
d)在选择步骤中,检测所述多个标记的细胞中的每个存在的所述可检测标记,并且选择所述多个标记的细胞的子集作为存在于所述多个标记的细胞中的可检测标记的函数。换言之,选择显示任何标记或标记数量高于某阈值的所述细胞,产生选择的活细胞。
e)在分离步骤中,从所述选择的细胞分离表达的核酸序列。
换言之,根据本发明的第一方面的该可选方面的方法实现了跨膜受体文库在包含细胞壁的真核细胞中的表达,并实现了对这些受体的功能性表达的选择。通过结合配体的数量选择细胞能够根据质膜上功能性受体的数量而不是通过总的受体数量来选择细胞,总的受体数量还包括非功能性受体(例如存在于细胞内膜中的受体)。本发明的第一方面的该可选方面对使用小配体可能是有利的。
根据本发明的第二方面,提供了一种用于选择具有高水平表达功能性膜蛋白的能力的适应的酵母细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
a.提供多个酵母细胞,其中所述酵母细胞中的每个包含表达的核酸序列的文库的核酸序列成员。所述核酸序列成员在多个酵母细胞中被表达为靶膜蛋白。
b.在透化步骤中,透化所述多个酵母细胞的细胞壁。这样产生多个活的透化的细胞。
c.在标记步骤中,使所述多个活的透化的细胞接触能够结合到所述靶膜蛋白的配体。所述配体包括可检测标记,并且从而产生多个活的标记的细胞。
d.在洗涤步骤中,洗涤所述多个活的标记的细胞。
e.在选择步骤中,选择所述多个活的标记的细胞的子集作为存在于所述多个活的标记的细胞中的可检测标记的函数,产生选择的活的细胞。换言之,选择显示任何标记或标记数量超过某阈值的细胞,产生选择的活细胞。
f.在扩增步骤中,扩增所述选择的活细胞,产生扩增的选择的活细胞。
g.将所述扩增的选择的活细胞递送至步骤b.至f.至少1、2、3、4、5、6或7次。
h.将所述扩增的选择的活细胞递送至步骤b.至e.。
i.选择所述选择的活细胞的子集作为存在于所述多个活的标记的细胞中的可检测标记的函数。这样从所述扩增的选择的活细胞产生具有高水平表达功能性膜蛋白的能力的适应的酵母细胞。
无论在什么情况下,用于单个可分开的特征的可选方案,例如,细胞株或透化缓冲液,分选方法或文库类型在本文中被列为“实施方案”,应理解,这些可选方案可以自由组合以形成本文所公开的发明的各自的实施方案。
通过以下实施例和附图进一步说明本发明,从中可以获取进一步的实施方案和优点。这些实施例旨在说明本发明,但不限制其范围。
附图的简短说明
图1显示了GPCR在酵母中的定向进化的工作流程。作为第一步,通过易错PCR使野生型GPCR基因随机化,以构建DNA文库。然后将DNA文库与线性化酵母表达载体组合,并将该混合物用于酵母的转化。插入的DNA和载体骨架通过同源重组在体内组装。培养获得的酵母文库并诱导表达。表达后,将细胞透化并与荧光配体一起孵育,荧光配体专门结合于质膜中的功能性GPCR。随后,通过洗涤除去未结合的配体,并通过FACS对细胞进行选择。选择显示强荧光,相应地以高功能水平表达GPCR的细胞,实现所需的高表达GPCR变体的分离。在FACS期间,将酵母细胞直接分选到生长培养基中用于随后的增殖。通过FACS重复进行选择以获得对具有最佳表达的GPCR的细胞的强富集。每当需要时,可以从选择的细胞分离质粒DNA用于分析单一变体,或者可以通过随机诱变引入另外的多样性以进行另一轮进化。
图2显示了NTR1、NK1R和KOR1变体的配体结合FC数据的直方图(A)、(C)、(E)。在野生型GPCR的酵母中的功能性表达(左图),在第二轮进化后获得的文库池(中间图)和在基于大肠杆菌的系统中进化的变体(右图)。通过将荧光配体结合到表达相应GPCR变体的酵母细胞中的受体获得总信号(黑色曲线)。在过量的未标记配体存在下测定非特异性结合(灰色,着色的)。对于野生型GPCR,由于在表面的功能性表达水平低,没有检测到特异性信号。选择的文库池显示,在表达细胞中表现出高特异性信号(在每个细胞表面的功能性受体),其中一小部分细胞在表面不表达任何功能性受体(注意总信号的双峰)。在基于大肠杆菌的系统中先前进化的变体(NTR1-D03、NK1R-E11)显示特异性信号,但是没有达到酵母文库池获得的水平。而且,对于明显更大部分的细胞,在表面没有检测到功能性GPCR表达。例如,测定的所有细胞仅约50%显示NTR1-D03表达的特异性信号。(B)、(D)、(F)通过NTR1、NK1R和KOR1变体的RLBA测定每个细胞的平均总功能性受体。用[3H]-放射性配体定量表达水平。在具有过量的未标记配体的[3H]-放射性配体的存在下测定非特异性信号,并从总信号减去非特异性信号。野生型NTR1和KOR1显示低表达水平,而对于NK1R,完全没有检测到功能性表达。NTR1-D03显示每个细胞的受体的水平为中等,而对于NK1R-E11,表达水平低。选择的文库池显示每个细胞100,000-150,000个受体的功能性生产水平,与野生型GPCR和在大肠杆菌中进化的变体相比,分别增加了25-50倍和5-20倍。误差条显示一式三份的代表性表达实验的标准偏差。
图3显示了选择的NTR1变体(NTR1-Y01-NTR1-Y07)在非适应酵母菌株中的功能性表达。(A)显示了具有总信号(黑色曲线)和非特异性信号(灰色,着色的)的配体结合FC数据的直方图。与野生型NTR1相比,所有选择的变体显示功能性表面表达的增加(参见图2A)。与文库池NTR1 2.5相比,单一变体显示在具有活性受体的表面表达的细胞中,不在表面表达的功能性受体的亚群的增加以及较低的特异性信号(每个细胞的受体)(参见图2A)。(B)通过RLBA测定每个细胞的平均总功能性受体。与野生型NTR1相比,所有变体显示功能性表达增加,但是未达到针对NTR1 2.5池观察到的表达水平(参见图2B)。从总信号减去非特异性信号。误差条显示一式三份的代表性表达实验的标准偏差。
图4显示了在非适应和适应的酵母菌株中表达的HA标记的NTR1变体的定量蛋白质印迹(Western blot)分析。在表达后,对每个样品使用相同数量的细胞进行全细胞裂解物蛋白提取。使用肌动蛋白作为负载对照。通过其HA标签检测GPCR,其中对应于单体GPCR的主条带运行稍微低于预期的分子大小(44kDa)并且较高分子量的条带最有可能表示GPCR二聚体,其在所使用的条件下不分解。为了定量,说明了所有限定条带的定量(条形图)强度,并且将信号针对野生型NTR1所获得的GPCR和肌动蛋白的强度归一化。在非适应菌株中,从野生型NTR1(泳道1)到进化的变体(泳道2)产生的总GPCR增加了两倍。尽管与非适应菌株(泳道2)相比,在适应菌株(泳道3)中的NTR1-Y06的总受体水平也略有增加,但所产生的总受体的相对增加远低于功能性受体的增加(参见图13B)。对于阴性对照(泳道4),使用表达没有HA标签的NTR1-Y06的细胞。
图5显示了在非适应和适应酵母菌株中表达的具有融合到mCH的C末端的NTR1变体的共焦荧光显微镜研究。显示了通过结合荧光配体(顶行)或来自mCh(中间行)以及明视野显微镜覆盖(底行)获得的荧光强度。对于野生型NTR1的表达(第一列),没有检测到在细胞表面具有配体结合信号的细胞,而一些细胞显示出明显的mCh信号,主要位于细胞内部,并由此反映出细胞内保留的受体。此外,检测到许多缺乏任何荧光信号的细胞,表示未表达的亚群。相比之下,NTR1-Y06在非适应细胞(第二列)中的表达实现了通过配体结合观察在细胞表面的功能性受体。这些细胞还显示出强mCh信号,但仍然在很大程度上定位在细胞内部。与野生型NTR1类似,在非适应菌株中的NTR1-Y06表达产生非表达细胞,既不显示配体结合的信号也不显示mCh的信号。对于在适应菌株(第三列)中NTR1-Y06的表达,检测到明显较少的非表达细胞,并且表达细胞在表面显示配体结合和mCh两者的强信号,在细胞内部仅检测到少量mCh。对于阴性对照(第四列),将没有mCh融合的表达NTR1-Y06的细胞与超过未标记的神经降压素的荧光标记的神经降压素一起孵育。显示了代表性照片。
图6显示了表达具有C末端mCh融合的NTR1变体的非适应和适应菌株的FC和RLBA分析。(A)显示了表达NTR1(左图)、NTR1-Y06(中图)的非适应菌株和表达NTR1-Y06(右图)的适应菌株的FC数据。在配体结合实验(顶行)的直方图中,显示了活性受体变体的表面表达与总信号(黑色曲线)和非特异性信号(灰色,着色的)的比较。NTR1显示在表面仅有少量活性受体,而在非适应和适应菌株中NTR1-Y06的表面表达显著增加(特异性信号朝向较高荧光强度迁移)。与表达具有mCh融合的NTR1-Y06的非适应菌株相比,适应进一步导致显示没有活性受体的表面表达的细胞部分的显著减少。在mCh表达(中间行)的直方图中,产生的总受体被量化。黑色曲线描绘了mCh信号,而与荧光配体孵育的表达无mCh融合的NTR1-Y06的细胞的自体荧光代表背景(灰色,着色的)。非适应菌株中的NTR1和NTR1-Y06表达具有非常相似的mCh信号谱。由于对于在配体结合FC实验中NTR1的表达,仅检测到在表面的少量活性受体,强mCh信号意味着大多数NTR1必须保留在细胞内。对于所有变体,都看到完全没有表达任何受体的细胞亚群(注意双峰),但是在适应菌株中这种没有表达的部分显著减少。在关联分析(底行)中,将mCh荧光强度(产生的总受体)与配体结合荧光强度(在表面的功能性受体)进行比较。对于野生型NTR1的表达,在表面的功能性受体不与产生的总受体良好地关联。这种关联优于在非适应菌株中表达的NTR1-Y06,并且如果NTR1-Y06在适应菌株中表达,则在表面的功能性受体与产生的总受体良好地关联。(B)通过RLBA测定每个细胞的平均总功能性受体。在非适应菌株中,具有mCh融合的受体的功能性表达水平从野生型受体至进化的变体增加了三倍。与在非适应菌株中NTR1-Y06的表达相比,适应导致平均总功能性表达进一步增加了6倍。从总信号减去非特异性信号。误差条显示一式三份的代表性表达实验的标准偏差。
图7显示了Sf9昆虫细胞中进化的GPCR的功能性表达水平和NK1R变体的信号传导活性。(A)、(B)、(C)通过NTR1、NK1R和KOR1变体的RLBA测定每个细胞的平均总功能性受体。与野生型GPCR相比,所有进化的变体显示每个细胞的平均受体的水平显著增加。与野生型NTR1相比,NTR1-Y06显示增加了五倍,与NK1R和NK1R-ΔC相比,NK1R-Y09显示分别增加了四倍和两倍,与野生型KOR1相比,对于KOR1-Y05,检测到最强的增加(27倍)。对于每个GPCR,进行两个独立的表达实验(分开的条)。从总信号减去非特异性信号。误差条显示一式三份的标准偏差。(D)通过[35S]-GTPγS结合测定NK1R变体的信号传导活性。在P物质存在(灰色)和不存在(黑色)的情况下,检测等量的活性GPCR和重建的G蛋白。没有拮抗剂刺激,所有的变体显示低基本活性。当加入拮抗剂时,通过[35S]-GTPγS结合检测信号。NK1R和NK1R-ΔC具有相同的信号传导活性,NK1R-Y09的信号传导仍然类似于野生型受体。对于每个GPCR变体,从两个独立的表达实验进行两个独立的信号传导检测(分开的条)。误差条显示一式三份的标准偏差。
图8显示了在每个GPCR进化过程中最高富集的克隆的概述。显示每个克隆的突变,并且在突变数据顶端给出相应的野生型氨基酸。突变的位置由结构区域、Ballesteros-Weinstein编号(3)和连续氨基酸编号指示。(A)NTR1变体。(B)NK1R变体。(C)KOR1变体。(D)描绘具有突变的不同区域的GPCR拓扑图。
图9显示了在非适应酵母菌株中选择的NK1R和KOR1变体的功能性表达。(A)、(B)分别显示了具有总信号(黑曲线)和非特异性信号(灰色,着色的)的NK1R和KOR1变体的配体结合FC数据的直方图。在过量的未标记配体的存在下,获得非特异性信号。与相应的野生型GPCR(NK1R和KOR1,参见图2C、E)相比,所有变体显示功能性表达的增加。尽管与相应的文库池(NK1R 2.5和KOR1 2.5,参见图2C、E)相比,大多数变体的表达细胞的特异性信号类似或略低,但对于单一变体,观察到更多部分的细胞在表面不表达任何功能性受体。(C)、(D)通过RLBA测定每个细胞的平均总功能性受体。虽然与相应的野生型GPCR相比,所有变体显示出功能性表达的增加,但是对于大多数变体,通过RLBA测定的每个细胞的平均受体数量低于相应的文库池的(参见图2D、F)。从总信号减去非特异性信号。误差条表示一式三份的代表性表达实验的标准偏差。
图10显示了从NTR1 2.5池直接分离的酵母菌株中NTR1-Y06和随后通过使用FACS的表型选择适应的新转化菌株的功能性表达水平。(A)、(B)显示了具有总信号(黑色曲线)和非特异性信号(灰色,着色的)的配体结合FC数据的直方图。在过量的未标记配体的存在下获得非特异性信号。与表达NTR1-Y06的非适应的再转化菌株(参见图3A)相反,分离的菌株显示与NTR1 2.5文库池(参见图2A)类似的表达谱。在使用新转化的菌株通过FACS进行五轮表型选择后获得的在(B)中示出的随后适应的菌株中,重构高表面表达水平。(C)通过RLBA测定每个细胞的平均总功能性受体。与表达NTR1-Y06的再转化菌株(参见图3B)相比,检测到分离的菌株中高功能性NTR1-Y06表达以及该表型的适应菌株中的重构。从总信号减去非特异性信号。误差条显示一式三份的代表性表达实验的标准偏差。
图11显示了在针对宿主适应的表型选择期间,单一分选后NTR1-Y06的表达谱。显示了具有总信号(黑色曲线)和非特异性信号(灰色,着色的)的配体结合FC数据的直方图。在过量的未标记配体的存在下获得非特异性信号。在分选具有最高NTR1-Y06表达的细胞(最强荧光细胞的前1%的门控)的表型选择过程中,在表面不表达任何功能性受体的细胞群逐渐减少。同时,在选择期间,表达细胞的特异性信号迁移至更高的水平,表明在这些细胞在表面每个细胞的功能性受体的增加。注意需要两次分选以诱导适应。虽然前两次分选后的表达谱没有显著变化,但是在分选3后观察到没有活性NTR1-Y06的表面表达的亚群明显减少以及表达亚群内的特异性信号的迁移。这种趋势在后续分选中继续,如分选4后的表达谱所示。
图12显示了NTR1-Y06在酿酒酵母中在非适应菌株、适应菌株和在非表达条件下预先培养的适应菌株中的功能性表达。(A)显示了具有总信号(黑色曲线)和非特异性信号(灰色,着色的)的配体结合FC数据的直方图。在过量的未标记配体的存在下获得非特异性信号。表达NTR1-Y06的新转化菌株的适应导致表达细胞亚群的更高的特异性信号(每个细胞的受体)和不显示活性受体的任何表面表达的亚群的减少。如果将适应菌株在非表达条件下重复培养,则平均表达水平再次降低,其通过在表达亚群中的特异性信号(每个细胞的受体)的降落和没有活性NTR1-Y06的表面表达的细胞部分的增加来描绘。(B)通过RLBA测定每个细胞的平均总功能性受体。来自RLBA的结果显示从非适应菌株到适应菌株每个细胞的平均受体数量显著增加,如果在诱导表达之前在非表达条件下重复培养适应菌株,其转而再次下降约30%。缺乏对非适应菌株的原始较低表达水平的完全逆转可归因于泄漏表达,甚至在非诱导条件下足以部分地保留高表达的表型。从总信号减去非特异性信号。误差条显示一式三份的代表性表达实验的标准偏差。
图13显示了非适应和适应的酿酒酵母菌株中NK1R-Y09和KOR1-Y05的功能性表达。(A)、(C)显示了具有总信号(红色曲线)和非特异性信号(绿色,着色的)的配体结合FC数据的直方图。在过量的未标记配体的存在下获得非特异性信号。虽然与非适应菌株相比,适应菌株中表达细胞的特异性表达信号(每个细胞的受体)略微增加,但是观察到没有活性受体的表面表达的亚群显著降低。(B)、(D)通过RLBA测定每个细胞的平均总功能性受体。如FC数据中示出,在适应菌株中显示没有活性受体的表面表达的细胞部分的减少导致使用RLBA测定的平均功能性表达的增加。从总信号减去非特异性信号。误差条显示一式三份的代表性表达实验的标准偏差。
图14显示在非适应和适应的酿酒酵母菌株中HA标记的NTR1-Y06的功能性表达。(A)显示了具有总信号(黑色曲线)和非特异性信号(灰色,着色的)的配体结合FC数据的直方图。在过量的未标记配体的存在下获得非特异性信号。具有C末端HA标签的表达NTR1-Y06的菌株的适应导致显示没有活性受体的表面表达的细胞部分的减少,和在具有表面表达的细胞的表面每个细胞的活性受体的增加(特异性信号朝向更高的荧光强度迁移)。(B)通过RLBA测定每个细胞的平均总功能性受体。在非适应菌株中,从野生型受体到进化的变体功能性表达水平增加四倍。与在非适应菌株中HA标记的NTR1-Y06的表达相比,适应导致平均总功能性表达进一步增加10倍。从总信号减去非特异性信号。误差条表示一式三份的代表性表达实验的标准偏差。
图15显示了NK1R-Y09的纯化。(A)IMAC后纯化的受体的SEC谱。获得两个峰,其中峰1最可能对应于NK1R-Y09的限定的更高的寡聚态,而峰2表示单体受体部分。(B)在还原条件下通过SDS-PAGE分析纯化的NK1R-Y09。在每个泳道中加载等量的总蛋白。在IMAC(泳道1)后,获得纯NK1R-Y09(38.5kDa),检测到较高分子量的弱的另外的蛋白条带。这样的带最可能表示NK1R-Y09的低聚物,在所用的条件下,它们不被分解。挨着单体NK1R-Y09的强带,在峰1(泳道2)的部分中还检测到较高分子量的带,而在峰2(泳道3)的部分中,单体NK1R-Y09是唯一物质。注意到NK1R-Y09未被进一步工程化并在昆虫细胞中表达,因为它是从酵母中的选择获得的。对于目的是进行结晶试验的纯化,需要一些进一步的工程化,例如除去潜在的糖基化位点、N-末端截短、环缺失和/或引入融合蛋白(例如T4溶菌酶或热稳定的脱血红素细胞色素(apocytochrome)b562RIL(Chun等(2012),Structure 20:967-976))。通过减少异质性、限制构象柔性和增加稳定性,这些措施可能进一步改进受体的纯化(Maeda&Schertler(2013),Curr Opin Struct Biol 23:381-392)。
实施例
实施例1:通过在酵母中的定向进化产生高表达功能的GPCR
G蛋白偶联受体(GPCR)包含最大的细胞表面受体的超家族,在人类基因组中具有约800个不同的成员。在真核生物中,GPCR进化为高度通用的信号传导介质,通过异源三聚体G蛋白以及G蛋白不依赖的方式响应多种配体和转导信号。与GPCR信号传导异常相关的大量人类疾病,例如肥胖、糖尿病、心血管疾病、骨质疏松症、免疫失调、神经退行性疾病和癌症反映了GPCR的关键作用。因此,对于制药行业,GPCR代表了高度相关的药物靶点。大约30-50%的上市药物作用于GPCR或GPCR相关的机制,其中有许多畅销药物。
GPCR的结构和详细生物化学研究中的主要难题是以足够量产生所需受体困难以及其固有的不稳定性和灵活性。表达和结晶策略的发展,如使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统,或在脂质立方相(LCP)中建立完整的膜蛋白结晶,导致在通过X射线晶体学确定三维受体结构中的突破。虽然可用的结构数据集为科学界提供在原子水平上对GPCR功能的机制的了解,并可能开始实现合理的基于结构的药物设计,但是对受体动力学和构象变化的详细了解显然仍然相当不完整。
而且,储存在蛋白质数据库(the Protein Data Bank,PDB,http://www.pdb.org)中的26种独特的GPCR结构至今仍仅代表所有受体的一小部分(<4%),反映出对GPCR的结构研究的瓶颈仍然存在。例如,虽然成功地将昆虫细胞用于生产迄今已确定的约85%的所有GPCR结构的重组受体(来源:PDB;不包括从天然组织提取的蛋白获得的结构),但是该表达系统不提供通用方案。甚至在昆虫细胞中,GPCR超家族的几个成员以低产量表达,表明在真核细胞中还存在关于这些受体的生物合成和膜插入的基本问题。这个问题不能通过表达条件的简单优化来解决,特别是因为各个GPCR的最佳条件看起来不一致。因此,为了促进和加速GPCR研究,需要新的方法。
近来,本发明人开发了通过定向进化提高大肠杆菌中GPCR功能性表达水平的方法(Sarkar等(2008),Proc Natl Acad Sci USA 105:14808-14813;Dodevski&Plückthun(2011),J Mol Biol 408:599-615)。在野生型GPCR随机诱变后用荧光激活细胞分选(FACS)进行选择,能够从四种不同的GPCR,即神经降压素受体1(NTR1)、NK-1受体(NK1R,也称为速激肽受体1或物质-P受体)和α-1A和α-1B肾上腺素能受体的随机文库分离高表达变体。在对NTR1的连续研究中,通过广泛选择(Schlinkmann等(2012),Proc Natl Acad Sci USA 109:9810-9815)和穷尽重组(Schlinkmann 等(2012),J Mol Biol 422:414-428),将获得的第一代变体构建为创建第二代突变体的基础。在这些研究中创建的合成文库也被用于通过被称为CHESS的互补定向进化方法产生NTR1变体,其具有改进的在短链洗涤剂中的稳定性(Scott&Plückthun(2013),J Mol Biol 425:662-677;Scott等(2014),Biochim BiophysActa 1838:2817-2824)。最终,这些努力导致来自在大肠杆菌中产生的材料的拮抗剂结合的NTR1的三种不同变体结构(Egloff等(2014),Proc Natl Acad Sci USA 111:E655-62),突显了在膜蛋白工程中定向进化的力量。
在大肠杆菌中使用进化所获得的成功结果和所证明的真核表达宿主的有效性要求进一步开发这种朝向在真核表达系统中特异性高功能性GPCR表达的方法。本发明人假设,直接地在真核系统中进行GPCR进化以在真核生物中实现特异性序列适应,以及由此实现改进的功能性生产可能是有利的。而且,与真核宿主相比,大肠杆菌不能进行翻译后修饰,缺乏真核生物膜蛋白的分泌质量控制和易位机制,并且在膜组成上不同。因此,GPCR在大肠杆菌中的定向进化限于在原核系统中固有表达高于成功进化所需的阈值的受体,因此对于真核生物加工或膜组成没有严格的要求。
这里,本发明人公开了通过在酿酒酵母中的定向进化来建立快速、有效和稳定的方法以增加在真核宿主中GPCR的功能性表达。该方法是普遍适用的,如使用三种不同GPCR所证实的,仅使用两轮进化,就导致在酵母和昆虫细胞两者中显示高功能性表达的受体变体。此外,通过诱导的宿主适应可以进一步可重复地增加酵母中的功能性表达水平。
在酵母中三种不同GPCR的定向进化导致在酿酒酵母中的高功能性表达
该方法的通用途径如图1中所示。首先,通过易错PCR将野生型GPCR基因随机化,并且将得到的DNA文库用于酵母转化。插入的DNA和酵母表达载体骨架通过设计的同源重组位点在体内组装。接下来,在获得的酵母文库中诱导表达,并且随后使用优化的缓冲液处理细胞用于酵母细胞壁的透化。透化是必需的,以使所给予的荧光配体能够到达在质膜中的功能性表达的受体并因此结合。与饱和浓度的荧光配体孵育后,通过洗涤除去未结合的配体,并用FACS使细胞经受选择。表达在表面具有最多数量的功能性受体分子的变体的酵母细胞相应地显示最强的荧光。通过门控前0.5-1%的最强荧光酵母细胞分离这些细胞,并将它们直接分选到生长培养基中用于随后的增殖。为了实现具有所需表型的表达GPCR变体的细胞的强富集,进行几个重复的表达、与荧光配体的孵育和FACS的循环。在FACS后可以从选择的细胞分离出质粒DNA用于分析或通过另外的随机诱变引入进一步的多样性,从而开始下一轮的进化。
本发明人旨在平行进化三种不同的GPCR:(i)大鼠NTR1、(ii)人NK1R和(iii)人κ型阿片样受体(KOR1)。在几项研究中,NTR1已显示在基于大肠杆菌的系统中是可容易地进化的,并因此被认为是阳性对照。NK1R也已经在大肠杆菌中成功地经受了朝向更高表达的定向进化(Dodevski&Plückthun(2011),J Mol Biol 408:599-615)。然而,尽管相对改进强,但由于在原核生物中野生型NK1R非常低的表达水平,与在大肠杆菌中进化的其他受体相比,进化的受体变体仍然仅以中等的绝对水平表达(Sarkar等(2008),Proc Natl Acad SciUSA 105:14808-14813;Dodevski&Plückthun(2011),J Mol Biol 408:599-615)。而且,这些进化的NK1R变体在酿酒酵母中的表达水平也低(见下文),表明功能性生产的进一步改进是可能的,这可能有利于未来对该受体的研究。关于KOR1,目前尚未进行进化这种受体的尝试,并且它代表了关于异源表达的挑战性实例。
按照以上列出的过程,对于三种受体中的每种只进行两轮进化-每轮由通过易错PCR的一个随机化和随后通过FACS的五次选择组成-足以强烈地提高功能性表达水平。图2显示了野生型GPCR,在基于大肠杆菌的系统中先前进化的NTR1和NK1R变体(分别为NTR1-D03、NK1R-E11),以及第二轮进化后获得的文库池,即NTR1 2.5、NK1R 2.5和KOR1 2.5(文库命名法:GPCR a.b,其中a是随机化的总数,b是FACS选择的总数)在酿酒酵母中的功能性表达水平的比较。使用流式细胞术(FC)或放射性配体结合试验(RLBA)测定功能性表达水平。注意FC配体结合实验确定专一地在完整的单一细胞表面的质膜中的功能性受体,而RLBA说明整个裂解的细胞群的平均的功能性受体的总数,并且因此还检测细胞内膜中的功能性GPCR。对于野生型GPCR,在FC实验中未获得非特异性信号,因此在表面的质膜中没有检测到活性受体(图2A、C、E)。相比之下,在针对NTR1和KOR1的RLBA中,测到功能性受体的低表达水平,表明存在少量的活性受体,然而,最可能是保留在细胞内膜中(图2B、F)。对于NK1R,在所使用的任何方法中没有检测到功能性受体(图2C、D),与之前报道的一致(Butz等(2003),Biotechnol Bioeng 84:292-304)。
引人注目的是,如FC和RLBA分析所示,选择的文库的表达水平不仅远高于野生型受体,而且高于在大肠杆菌中进化的相应变体(NTR1-D03、NK1R-E11)。对于选择的酵母文库,在RLBA中测到每个细胞100,000-150,000个总功能性受体,表明与相应的野生型GPCR和大肠杆菌进化的变体相比,分别增加了25-50倍和5-20倍(图2B、D、F)。FC数据通过显示来自大肠杆菌和选择的酵母文库两者进化的变体的不同特异性信号来证实在表面的活性受体(图2A、C、E)。然而,与大肠杆菌进化的变体相比,选择的酵母文库的特异性信号向着更高的荧光强度迁移,反映了在表面的活性受体的增加。而且,在选择的酵母文库中检测到在表面没有表达任何功能性受体的细胞亚群明显更少。
在酵母单克隆和文库两者中测试的所有GPCR表达时,在FC实验中可重复地观察到这两个亚群的划分。因此,该效果似乎是酿酒酵母中GPCR表达的固有特征,其中在大量的细胞部分中缺乏在表面的功能性表达。例如,通过大肠杆菌进化的变体的FC数据所描绘的,在所有细胞的约50%中获得了NTR1-D03的活性表面表达,而对于低表达变体NKR1-E11,只有少数细胞显示出活性表面表达(图2A、C)。尚不清楚为什么从一个单个克隆生长的群体的一些细胞在表面不产生任何功能性受体,但是可以排除这些细胞中缺乏表达载体,因为所有的培养仅在选择性基本培养基中进行。
通过与选择同时发生的宿主适应,进一步提高在酵母中富集的受体变体的改进的表达水平。
为了鉴定富集的克隆,在进化的第一轮(文库1.5阶段)和第二轮(文库的2.5阶段)后,从文库池分离质粒DNA用于DNA测序。在图8中给出描述每个克隆的不同突变的选择的克隆的总结。有趣的是,对于NTR1和KOR1,仅选择全长变体,而所有选择的NK1R变体在推定的螺旋8和棕榈酰化位点之后在七个氨基酸的狭窄范围内的位置处含有终止密码子,导致缩短的C-末端。这表明全长C末端被强烈地淘汰,并且截短导致该受体的表达显著增加。由于在酵母中未能检测到功能性野生型NK1R,本发明人构建了具有与野生型序列结合的最突出选择的C末端截短的供选择的参考变体,命名为NK1R-ΔC。这为本发明人提供了针对选择的突变的参考,并且还使他们能够量化多少C末端截短有助于改进NK1R的功能性表达。
在再转化后分析单一克隆,并揭示所有富集的受体变体在酵母中确实比相应的野生型受体明显更好地表达(图3和图9)。这表明确实已经获得了更好地适应在该真核宿主中的生物合成的变体。
虽然在所选择的GPCR文库中仅检测到小部分在表面没有表达任何功能性受体的细胞(图2A、C、E),但是当将单一变体已经再转化到新鲜的宿主细胞中时,观察到更大的这种细胞的亚群(图3A和图9A、B)。而且,还检测到再转化后具有活性表面表达的细胞中单一NTR1变体的每个细胞的受体水平较低,如通过特异性FC信号朝向较低荧光强度迁动所示的(图3A)。与在FC中这些对组合效应的观察结果一致,与选择的GPCR文库(图2B)相比,在表达单一NTR1变体的再转化的菌株中获得了明显较低的平均RLBA读数(图3B)。
本发明人假设在选择过程中发生了表达宿主的适应,其导致在选择的文库中的膜蛋白表达水平进一步提高。为了测试这个假设,从NTR1 2.5文库池直接分离了命名为NTR1-Y06的表达强烈选择的变体的酵母克隆。如预期的,分离菌株以高功能性水平表达NTR1-Y06,具有与NTR1 2.5文库池相似的表达谱(图10A、C)。从表达NTR1-Y06的再转化菌株和分离菌株分离的完整质粒DNA的测序揭示没有差异。因此,本发明人得出结论,重复表达和通过FACS分选最佳表达克隆的实际过程诱导酵母朝向改进的GPCR产生适应。为了测试这个假设,以FACS使用再转化的表达NTR1-Y06的单克隆进行了五次后续的模拟选择(不使用任何序列随机化),其中通过门控最强荧光细胞的前1%,分离具有最高NTR1-Y06表达的细胞。实际上,在这种表型选择的过程中,通过在具有表面表达的亚群中逐渐减少的没有活性表面表达的细胞以及增加的每个细胞的功能性受体,菌株适应NTR1-Y06的较高表达(图11)。最后在适应之后,NTR1-Y06以与在所选择的NTR1 2.5库中获得的表达水平一样高的总功能水平表达,每个细胞具有约160,000个平均功能性受体,并具有相似的表达谱(图10B、C)。然而,通过在非表达条件下重复培养适应的菌株,观察到适应效应的部分逆转,表达水平下降30%(图12)。
为了检验表型适应是否可能甚至已经是选择的主要特征,本发明人还尝试使表达野生型NTR1的菌株适应。然而,在FACS之后,所分选的细胞不再增殖,阻止了重复选择。该观察清楚地显示,赋予受体改进的特性的突变选择是宿主适应的严格先决条件,并且序列改变实际上是关键的进化事件。在表达野生型NTR1的细胞中诱导适应的失败可以由选择前毒性野生型GPCR的表达的组合应激作用一起限制细胞存活来解释。
因此,通过重复分选诱导的适应似乎被限制到进化的GPCR变体,其本质上对细胞的毒性较小。实际上,表达NK1R-Y09和KOR1-Y05的菌株、进化的NK1R和KOR1变体的分别适应也是可能的。两种变体在选择期间都强富集并且表达NK1R-Y09或KOR1-Y05的新转化细胞显示比相应的文库池更低的表达水平。对于每种变体,通过FACS进行五轮表型选择,与表达NTR1-Y06的菌株适应所用的过程相同。对于两种变异体,观察到朝向更高的表达水平的宿主适应,其在选择过程中逐渐出现(图13)。尽管对于NK1R-Y09和KOR1-Y05的宿主适应效应不如NTR1-Y06明显,但是这些结果表明,适应不是受体特异性的,如果进化的受体被表达,可以重复诱导适应。
在适应菌株中功能性受体部分增加,而产生的总受体的量未显著更高。
由于宿主适应对于NTR1-Y06的表达最重要,所以使用该变体来进一步研究效果。虽然配体结合FC分析和RLBA能检测活性受体,但是无论配体结合活性如何,这些方法都不能对所产生的总受体定量。因此,为了通过免疫印迹检测不同的菌株中产生的总受体蛋白,构建了在受体的C末端具有血凝素(HA)标签的NTR1和NTR1-Y06表达构建体。
通过使用FACS的五轮表型选择,表达HA标记的NTR1-Y06的菌株朝向更高的表达适应(图14A)。随后,在表达后使用相同数量的酵母细胞,在来自全细胞裂解物的定量免疫印迹中,通过HA标签检测测定表达野生型NTR1和NTR1-Y06的不同菌株的总受体产量,后者处在非适应和适应菌株中(图4)。
在非适应菌株中,产生的总受体的量从野生型NTR1到进化的变体增加了两倍(图4)。通过RLBA数据观察到的功能性表达增加4倍(图14B)。这表明功能性受体与产生的总受体的比例从野生型到进化的受体仅略有增加。
然而,当基于RLBA数据,比较适应菌株与非适应菌株时,NTR1-Y06的功能性表达增加了十倍(图14B),但总受体产生增加少于两倍(图4)。由于产生的总受体的数量仅略有增加,所以可以推断出在适应菌株中,功能性受体部分显著增加。
适应增加活性受体的表面表达,减少专一地表达细胞内保留的GPCR的细胞的数量,并减少不表达的细胞亚群。
通过评估NTR1变体在非适应和适应菌株中的细胞定位和功能性进一步描述宿主适应效果,将具有C末端mCherry(mCh)融合的NTR1和NTR1-Y06构建体用于共焦显微镜研究和FC实验:当通过mCh定量总受体时,仅仅质膜中的位于细胞表面的功能性受体显示来自荧光配体结合的信号。
与HA标记的变体相同,首先通过表型选择来适应表达具有mCh融合的NTR1-Y06的菌株。接下来,将表达NTR1和NTR1-Y06的非适应菌株,以及表达NTR1-Y06的适应菌株暴露于荧光配体,以使用共焦荧光显微镜进行共定位研究(图5)。
如在配体结合FC实验中所见(图6A),质膜中功能性野生型NTR1的水平非常低,因此在显微镜中没有检测到配体结合信号(图5)。相反地,针对一些细胞获得清晰的mCh信号,然而其专门地位于细胞内部,由此反映出表达细胞内保留的NTR1-mCh融合受体的细胞。根据从野生型NTR1获得的低RLBA读数(图6B),大多数细胞内受体一定是无活性的。此外,检测到完全没有任何mCh信号的许多其他细胞,其代表不表达的亚群(图5)。值得注意的是,这两个亚群,专一地表达细胞内保留的受体的细胞以及不表达的细胞不能在使用FC的配体结合实验中区别。因此,这两个亚群一起组成了在FC配体结合数据中不显示任何表面表达的细胞部分。
在非适应菌株中表达的进化的NTR1-Y06显示在表面可检测的配体结合以及mCh信号(图5)。然而,在质膜处的mCh信号仍然相当弱,而在细胞内部检测到强mCh信号,表明与野生型NTR1类似,大量的受体保留在细胞内膜中。而且,还频繁检测到没有任何信号(既没有配体结合信号也没有mCh信号)的不表达细胞。因此,对于进化的受体,在FC配体结合实验中检测到的没有表面表达的细胞亚群也包括两类细胞:没有任何受体表达的那些,以及其中表达的受体没有易位到质膜的那些细胞。
在适应菌株中表达的NTR1-Y06的情况不同,其中在质膜中检测到配体结合和mCh的强信号(图5)。尽管在细胞内部仍然可见一些信号,但mCh主要位于表面。而且,观察到明显更少的不表达细胞。
通过FC实验的进一步研究(图6A),将配体结合与mCh信号比较,证实在共焦显微镜研究中获得的结果:在表达亚群中检测到所有变体的mCh信号,然而,对于野生型NTR1,mCh荧光强度与配体结合信号强度的关联不好。这反映了多数野生型受体未易位到细胞表面的事实。之前已经描述了融合到自发荧光蛋白(例如GFP或mCh)的野生型GPCR的荧光强度与功能性受体水平仅弱关联的发现。有趣的是,对于在非适应菌株中的NTR1-Y06表达,该关联更好,并且对于在适应菌株中表达的NTR1-Y06,所产生总受体和功能性受体良好关联。在这种情况下,受体主要被转运到细胞表面,反映具有专一地细胞内受体表达的细胞减少。有趣的是,与非适应菌株相比,在适应菌株中没有显示任何mCh信号的亚群(不表达细胞)也减少,进一步导致在适应菌株中功能性GPCR产生水平的总体增加。
总之,用于GPCR表达的酿酒酵母的宿主适应增加了活性受体的表面表达,而不增加产生的受体的总量,这相当于产生更高百分比的活性受体。与大部分细胞不显示任何功能性表面表达的非适应细胞相反,适应细胞仅显示少量的细胞内保留的受体。因为大部分细胞内受体是无活性的,宿主适应导致活性受体的总体增加。此外,与非适应菌株相比,在适应菌株中完全没有表达任何受体的细胞亚群也减少,进一步促进较高的平均功能性产生水平。
所有三种GPCR的进化的变体在草地夜蛾(Sf9)昆虫细胞中显示高功能性表达水平。
最终,本发明人的目标是不仅在酵母中,而且还在昆虫细胞中增加功能性GPCR的表达。因此,确定Sf昆虫细胞中进化的GPCR,NTR1-Y06、NK1R-Y09和KOR1-Y05的功能性表达水平,并与相应的野生型受体比较。对于所有的GPCR,使用相同的标准表达条件(未优化的)。确实观察到进化的变体的功能性表达的显著增加。对于NTR1-Y06,与野生型NTR1相比,功能性表达增加5倍(图7A),对于NK1R-Y09,测到比野生型增加4倍(图7B),而对于KOR1-Y05-值得注意是关于这项工作中研究的表达的最具挑战性的实例-检测到功能性表达增加27倍(图7C)。当在Sf9昆虫细胞中表达这些时,测定的每个细胞的平均功能性受体水平(每个细胞4.1×106-5.5×106个受体)高并且超过在基于大肠杆菌的定向进化系统中产生的第一代和甚至第二代NTR1突变体的表达水平(Schlinkmann等(2012),J Mol Biol 422:414-428)。
如针对所测试的所有我们的三种GPCR突变体所获得的,具有如此高的表达水平,升规模的表达培养物足以产生足够的用于结构研究的材料。为了测试这点,将来自昆虫细胞表达培养物的NK1R-Y09进行纯化,可重复地产生4-6mg/L的纯蛋白。图15显示了对通过尺寸排阻(SEC)和SDS-PAGE纯化的NK1R-Y09的分析。
鉴于非常高的纯化产量,NK1R-Y09代表了用于结构研究的令人感兴趣和有希望的候选物。因此,NK1R-Y09的功能性的特征在于基于[35S]-GTPγS结合的信号传导试验(图7D)。NK1R-Y09显示与野生型NK1R和C-末端截短的变体NK1R-ΔC相似的活性,两者都涉及无刺激(基础活性)和拮抗剂刺激时的[35S]-GTPγS结合,进一步突显了我们的方法的潜力。
概要
生产功能型重组GPCR仍然是要求高、费力和成本密集的任务。考虑到大多数最近确定的三维GPCR结构是从真核表达宿主中产生的受体获得的,并且受到蛋白质工程方法在增加GPCR在大肠杆菌中表达的成功的鼓励,本发明人旨在将定向进化方法转移到酿酒酵母,以特异性改进在真核生物中功能性GPCR的产生。
酿酒酵母,其特征为生长快速,成本上有效益的培养并且易于遗传操作,是用于蛋白质工程和定向进化的理想真核宿主,其另外原因如下:首先,酵母表面展示已经成为一系列不同应用中非常强大的技术。其次,现今使用酵母容易获得高多样性文库。第三,酵母细胞配备功能性GPCR生产所需的细胞机制,因为酿酒酵母内源性表达两种不同的GPCR,其具有类似于高等真核生物的信号传导通路。第四,酵母已被广泛应用于几种不同的GPCR的异源表达。以及第五,基于广泛使用的将异源GPCR偶联到酵母内源性信号传导通路的GPCR试验,针对GPCR定向进化的方法在之前已经成功地使用,其目的是产生通过被新配体激活的设计药物(DREADD)专一地激活的设计受体(designer receptors exclusively activatedby designer drugs,DREADD)((Armbruster等(2007),Proc Natl Acad Sci USA 104:5163-5168)。
到目前为止,酵母中GPCR的功能性生产通常保持低产量(Sarramegna等(2003),Cell Mol Life Sci 60:1529-1546)。在酿酒酵母中增加GPCR表达的策略包括表达条件的优化、分子伴侣的共表达、筛选高表达的宿主克隆、筛选工程化GPCR变体或宿主工程化。在本说明书中,本发明人公开了本发明通过进化三种不同的GPCR直接获得具有提高的功能性GPCR表达水平的GPCR变体的普遍适用性。引人注目的是,只需要两轮进化-意味着两轮随机化,每个随后是使用FACS的选择-以获得大大提高的表达水平,因此能够在短时间内有效地进化所有三种GPCR。在基于大肠杆菌的系统中,通常需要四轮进化。而且,本发明人公开了酵母宿主细胞可以朝向增加的GPCR产生适应。这是选择系统的固有特征,其与改进的受体变体的选择同时发生。重要的是重申定向进化确实导致序列变化,其改进的表达表型可以转移至昆虫细胞,并且宿主适应是在选择期间发生在酵母中的唯一另外的因素。而且,本发明人发现进化的受体的表达是诱导宿主适应的先决条件,因为在表达野生型GPCR的细胞中诱导宿主适应的尝试失败了。酵母的宿主适应可以通过使用FACS的重复表型选择可重复地诱导。这通常需要4到5次分选,并且在选择期间效果逐渐增加。
适应菌株显示表面表达的活性受体的显著增加,导致在质膜中的功能性受体的部分多得多,而产生的总受体只有少量增加。相反地,在非适应菌株中,并且特别是对于野生型受体的表达,大量的受体保留在细胞内区室中,其中大量表示为无活性的错误折叠的蛋白。在适应细胞的表达培养物中整体更高的平均功能性产量可以通过表达细胞内保留的无活性受体的细胞亚群的减少以及不表达亚群的减少来解释。
由于本发明人不希望受限于作为生产宿主的酿酒酵母,因此探索了所获得的GPCR变体在其他的真核宿主中是否还将实现更高的表达。事实上,在酵母中进化的GPCR变体的功能性表达在昆虫细胞中也增加。值得注意的是,与在酵母中产生的变体相比,当移到真核宿主如昆虫细胞时,在基于大肠杆菌的系统中进化的变体显示较少改进的功能性表达(Schlinkmann等(2012),J Mol Biol 422:414-428)。采用新的酵母进化的变体在Sf9细胞中获得的高表达水平,足以用于在标准条件下采用升规模的表达培养物的结晶学研究。更具体地,NK1R变体NK1R-Y09的纯化产生非常大量的纯蛋白。而且,NK1R-Y09显示类似于野生型NK1R的信号传导活性,说明所公开的方法可以产生能够执行其天然预期功能的生物活性变体,因此可以方便地用这些变体研究。
总之,在本文公开的用于在酿酒酵母中定向进化GPCR的方法能够在短时间内在真核表达宿主中有效地产生具有高功能性表达的GPCR变体。使用酿酒酵母作为进化宿主在酵母和昆虫细胞两者中产生具有高功能性表达水平的GPCR变体,在后一系统中高达27倍。因此,突变是可转移的,并且与在大肠杆菌中已经进行进化时相比,选择的变体在酵母以及在昆虫细胞中显示表达的更大增加。
受体突变的有益作用可转移至昆虫细胞进一步促进Sf9细胞作为大规模生产所生成的突变体的表达宿主。尽管如此,作为与诱导的宿主适应相结合的GPCR进化的结果,现在也可以在酿酒酵母中获得高表达水平的事实,意味着酵母作为大规模生产宿主的潜力。从实践的观点来看,在适应菌株中,功能性受体与产生的总受体的比例被改进的事实对不能区别非功能性蛋白和功能性蛋白的纯化策略如IMAC而言是很大的优势。对于没有可用的配体亲和柱的受体纯化,例如像已建立的用于纯化NTR1的可裂解的配体柱(Egloff等人(2014),Protein Expr Purif,印刷中),这是特别有兴趣的。
酿酒酵母的多功能性扩大了适合我们的方法的GPCR的组合,实现了GPCR的进化,对于GPCR的进化,先前在大肠杆菌中建立的系统是不足的。例如,对于GPCR如KOR1,其甚至在真核生物中显示出非常低的功能性表达水平,在大肠杆菌中的表达水平可能低于成功进化所需的阈值。而且,虽然原核生物和天然酵母都不产生胆固醇-一些GPCR的活性依赖于胆固醇-产生胆固醇的酿酒酵母菌株已经被工程化。原则上,所公开的方法应该可容易地转移到这种或任何其他的工程化酵母菌株。
酵母菌株、载体、培养和表达。
对于所有实验,使用从EUROSCARF获得的酿酒酵母菌株BY4741(MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)。使用来源于p415GAL1的pMS03het进行标准表达。关于不同酵母表达载体的更多细节见下文。在SDD-Leu-培养基(无氨基酸的6.9g/L酵母氮基(Formedium)、无亮氨酸的690mg/L完全补充混合物(Formedium)、20g/L葡萄糖、35mM柠檬酸三钠、35mM柠檬酸)中,在30℃下培养用pMS03het载体转化的BY4741。为了表达,在30℃下,将生长于SDD-Leu-培养基中的对数生长期的酵母细胞离心,随后重悬于SDG-Leu-培养基(与SDD-Leu-相同,但使用20g/L半乳糖代替葡萄糖)。在SDG-Leu-中重悬后,将初始OD600一直选择为1.0,并在20℃下进行表达24小时。
酵母表达载体
为了获得pMS03het,将α-交配因子前原序列从pPICZαA(Life Technologies)克隆到p415GAL1的多克隆位点(XhoI/SpeI)中。pMS03het包含NheI/BamHI限制性位点,其实现有效的载体线性化用于高效转化或在α-交配因子前原序列之前的基因的框内克隆。为了表达具有C末端HA标签或与mCherry融合的GPCR,分别使用载体pMS03het_HA或pMS03het_mCh。为了获得pMS03het_HA和pMS03het_mCh,通过BamHI将编码HA标签或mCherry的序列克隆到pMS03het中。
酵母文库的构建与转化。
大鼠NTR1的野生型基因(N-末端从氨基酸1-42截短)获赠于ReinhardGrisshammer(国立卫生研究院)。人NK1R和人KOR1的野生型cDNA获自Missouri S&T cDNAResource Center。将所有野生型GPCR基因克隆到pMS03het(NheI/BamHI)中。在根据制造商的方案,使用GeneMorph II随机诱变试剂盒(Agilent Technologies),利用易错PCR进行第一轮进化后,通过扩增野生型基因或分离的DNA进行DNA文库构建。在GenePulser Xcell电穿孔仪(Bio-Rad)上通过方波电穿孔法,用DNA文库进行BY4741的转化。平均来说,获得了多样性为5×107-1×108的文库。有关文库构建和高效转化的更多细节见下文。
DNA文库的构建和高效转化
通过进行两个易错PCR(epPCR),一个epPCR具有20个循环和一个具有25个循环,产生在第一轮进化后野生型GPCR或分离形式的DNA文库,其中随后合并获得的产物。epPCR所用的引物引入与在基因的每个末端的线性化pMS03het(使用NheI\BamHI消化)同源的位点。
正向引物:
5'-CTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAACGTGAGGCGGAAGCGGCTAGC-3';
反向引物:
5'-ATTACATGACTCGACTCGATGCCGACGAGAGCGGCCGCCTATTAGGATCC-3'。
使用相同的引物通过标准PCR进一步扩增获得的epPCR产物,以获得用于转化的足够的DNA材料。
进行通过方波电穿孔的高效转化,类似于以前公开的方法(Van Deventer&Wittrup(2014),Methods Mol Biol1 131:151-181),有细微改变。在30℃下,酵母细胞生长于60ml的YPD中至OD600=1.8-2.0。一旦达到该细胞密度,将50mL培养物离心,吸出培养基,并在30℃下,将细胞在25mL调节溶液(100mM乙酸锂,10mM DTT)中处理15分钟。随后,使细胞形成团块(pellet),在25mL冷ddH2O中洗涤,再次形成团块,并重悬于冷ddH2O中至总体积为500μL。自此以后,将细胞一直保持在4℃下。对于一次转化,将250μL的酵母细胞与4μg线性化pMS03het和12μg PCR产物混合,并将转化混合物转移至2mm电穿孔比色杯中。使用500V的电压和15ms的脉冲长度的一个脉冲进行方波电穿孔。电穿孔后,在30℃下在5mL YPD中使细胞恢复1小时,无振荡。最后,恢复的细胞形成团块,转移到500mL SDD-Leu-中,在30℃下选择性生长20-24小时,并在-80℃下,储存于甘油储液中。为了获得高多样性的文库,每个文库总是进行两次转化。
酵母细胞的透化和荧光配体的结合。
表达后,将培养物离心,吸出培养基,并在室温下将细胞重悬于TELi缓冲液(50mMTris-HCl pH9.0(在4℃下),1mM EDTA,100mM乙酸锂)中。接下来,在20℃下,在补充50mMDTT的TELi缓冲液中孵育细胞30分钟,随后在冷的TELi缓冲液中洗涤两次。自此以后,将细胞一直保持在4℃下。对于荧光配体结合,在4℃下,将透化的细胞与使用HiLyte Fluor 488标记的配体(AnaSpec)(NTR1变体:25nM荧光神经降压素(8-13);NK1R变体:20nM荧光P物质;KOR1变体:10nM荧光强啡肽A(1-11))在TELi缓冲液中孵育2小时,不曝光。孵育后,在测定前将细胞在TELi缓冲液中洗涤一次。在过量1000倍的未标记配体(NTR1变体:25μM神经降压素(8-13)(AnaSpec);NK1R变体:20μM P物质(AnaSpec);KOR1变体:10μM强啡肽A(1-11)(GenScript))的存在下,确定非特异性结合。有关荧光配体的更多细节见下文。
荧光配体
所有的荧光配体使用HiLyte Fluor 488(Anaspec)标记。神经降压素(8-13)(KKPYIL)于N-末端氨基共价标记。P物质(RPKPQQFFGLM)于赖氨酸-3的氨基共价标记。强啡肽A(1-11)(YGGFLRRIRPK)于赖氨酸-11的氨基共价标记。
流式细胞术和FACS。
将通过配体结合荧光标记的细胞保持在TELi缓冲液中用于测定。在BD FACSCantoII细胞仪(BD Biosciences)或在BD LSRFortessa细胞分析仪(BD Biosciences)上进行流式细胞术,并在BD FACSAria III分选机(BD Biosciences)上进行FACS。对于分析测定,总是记录50,000个事件。在FACS中,将3×105-5×105的0.5-1.0%的最强荧光细胞分选至SDD-Leu-培养基中,随后在30℃下培养24小时。对于所有样品,使用相同的采集设置以实现比较分析。使用FlowJo vX.0.7分析数据。
放射性配体结合试验。
如下进行对全酵母细胞的RLBA:首先,在表达后收获1×108个细胞(假设OD600=1.0,对应于107个细胞/mL),首先在ddH2O中,然后在SPH1缓冲液(1M山梨糖醇、25mM EDTA、50mM DTT,pH8.0)中,最后在1M山梨醇中通过连续洗涤处理。接下来,将细胞重悬于SPH2缓冲液(1M山梨糖醇、1mM EDTA、10mM柠檬酸三钾,pH5.8)中,通过加入6U/mL酵母裂解酶(Zymolyase)20T(AMS Biotechnology),然后在30℃下孵育30分钟进行细胞壁消化。自此以后,将细胞保持在4℃下。随后,将细胞在含有[3H]标记的配体(NTR1变体:20nM[3,11-酪氨酰-3,5-3H(N)]-神经降压素(Perkin Elmer);NK1R变体:15nM[亮氨酰-3,4,5-3H(N)]-P物质(Perkin Elmer);KOR1变体:15nM[15,16-3H]-二丙诺菲(Perkin Elmer))的50mM Tris-HClpH7.4(在4℃下)中在4℃下孵育2小时。在过量1000倍的未标记配体(NTR1变体:20μM神经降压素(8-13)(AnaSpec));NK1R变体:15μM P物质(AnaSpec);KOR1变体:15μM二丙诺菲(Tocris Bioscience))的存在下,确定非特异性结合。孵育后,使用真空歧管在Multiscreen滤板(Merck Millipore)上过滤细胞,用冷的50mM Tris-HCl pH7.4(在4℃下)将过滤器洗涤四次,转移到lsoplate-96闪烁板(Perkin Elmer),在65℃下干燥2小时,加入Optiphase Supermix闪烁混合物(Perkin Elmer)。在1450MicroBeta Plus液体闪烁计数器(Wallac)上进行RLBA测定。
对全Sf9细胞的RLBA如之前所述进行(Schlinkmann等(2012),J Mol Biol 422:414-428;Egloff等(2014),Proc Natl Acad Sci USA 111:E655-62)。将全细胞在含有15nM[3H]标记的配体的结合缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4(在4℃下),1mM EDTA,0.1%(w/v)BSA和40μg/mL杆菌肽)中孵育。在15μM未标记配体的存在下,确定非特异性结合。使用与采用酵母细胞的RLBA相同的配体。
定量蛋白质印迹。
表达后,将每个样品的4×107个细胞(假定OD600=1.0,对应于107个细胞/mL)离心,并根据先前公开的方案进行全细胞蛋白提取(Zhang等(2011),Yeast 28:795-798)。使用第一抗体,兔抗-HA(Sigma-Aldrich,H6908)和小鼠抗-肌动蛋白(Abeam,ab8224)与第二抗体,缀合于Alexa Fluor 680的山羊抗-兔(Life Technologies,A-21076)和缀合于IRDye800的驴抗-小鼠(Rockland Immunochemicals,610-732-124)进行蛋白检测。在Odyssey系统(LI-COR Biosciences)上进行图像采集,并用Image Studio Lite 3.1.4版(LI-CORBiosciences)进行定量。更多细节见下文。
酵母全细胞蛋白提取、SDS-PAGE和蛋白质印迹
为了全细胞蛋白提取,将表达后的样品离心,吸出培养基,将形成团块的细胞重悬于500μL 2M乙酸锂中,在冰上孵育5分钟。接下来,细胞形成团块,移除上清液,加入100μL0.4M的NaOH,将样品在冰上孵育5分钟。孵育后,将样品离心,移除上清液,将细胞团块重悬于200μL还原的NuPAGE LDS样品缓冲液(Life Technologies)中。将样品在20℃下孵育15分钟,离心,并在NuPAGE MES SDS运行缓冲液(Life Technologies)中的NuPAGE Novex 4-12%Bis-Tris蛋白质凝胶(Life Technologies)上运行5μL的每个样品。在Immobilon-FL膜(Merck Millipore)上进行湿印迹。在室温下,在PBS中的1×酪蛋白封闭缓冲液(Sigma-Aldrich)中进行膜封闭20分钟。在室温下,在PBST(PBS,0.05%(v/v)Tween-20)中的1×酪蛋白封闭缓冲液中进行抗体结合1小时,并在所有膜洗涤步骤中使用PBST。以1:5000的稀释度使用第一兔抗-HA抗体,以1:1,000的稀释度使用第一小鼠抗-肌动蛋白抗体,第二抗体(缀合于Alexa Fluor 680的山羊抗-兔和缀合于IRDye800驴抗-小鼠)均以1:10,000的稀释度使用。
共焦荧光显微镜。
如上所述,将酵母细胞透化并进行荧光神经降压肽结合。洗涤后,将细胞转移至Nunc Lab-Tek II带腔室的盖玻片(Thermo Scientific)中,并在Leica TCS SP5显微镜(Leica Microsystems)上进行共焦显微检查。对于所有样品,放大倍率为630倍,并使用相同的采集设置以实现比较分析。草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)载体和表达。
通过PCR从酵母表达载体pMS03het扩增野生型和进化的受体构建体,并通过SLIC克隆到修饰的MultiBac pFL载体中。指定为pFL_mFLAG_His10_TEV_SLIC的载体包含表达盒,所述表达盒具有N-末端蜂毒肽信号序列,随后是FLAG标签,十聚组氨酸标签,TEV蛋白酶裂解位点和SLIC克隆位点。使用含有不同受体基因的pFL载体转化大肠杆菌DH10EMBacY细胞,并分离得到的杆状病毒基因组。关于产生重组杆状病毒和杆状病毒感染的昆虫细胞原液(BIIC)的细节见下文。在Sf-900II SFM培养基(Life Technologies)中,通过使用100倍稀释的BIIC原液以3×106个细胞/mL的密度感染Sf9细胞,并在27℃下培养4天进行表达。表达后,通过离心收获细胞,在冷的PBS中洗涤并储存在-80℃下直到使用。
重组杆状病毒和杆状病毒感染的昆虫细胞原液(BIIC)的产生。
通过使用8μL Cellfectin II试剂(Life Technologies)在2mL Sf-900II SFM培养基(Life Technologies)中转染8×105的Sf9细胞产生重组杆状病毒。在27℃下,在湿润培养箱中孵育4小时后,移除转染培养基,并替换为2mL新鲜的Sf-900II SFM。在27℃下5天后收获V0病毒原液,并用于产生V1高滴度病毒原液(每毫升108-109个病毒颗粒)。然后使用V1病毒原液产生BIIC。简言之,以感染复数为5(MOI)感染密度为106个细胞/mL的Sf9细胞,悬浮孵育24小时,收集并在-80℃下以等分试样冷冻在含有青霉素-链霉素(LifeTechnologies)和10%(v/v)DMSO的Sf-900II SFM中。
[35S]-GTPγS结合试验。
如之前所述,分离用于[35S]-GTPγS结合试验的膜(Egloff等(2014),Proc NatlAcad Sci USA 111:E655-62)。简言之,渗透压休克后通过剪切力破坏细胞。为了减少非特异性[35S]-GTPγS结合,将膜在含尿素的缓冲液中洗涤。将分离的膜以等分试样冷冻并储存在-80℃下。通过如上所述的放射性配体结合试验来确定尿素洗涤的膜上的受体水平。
如前所述进行[35S]-GTPγS结合试验(Egloff等(2014),Proc Natl Acad Sci USA111:E655-62)。简言之,在200μM P物质(AnaSpec)存在或不存在的情况下,将在尿素洗涤的膜中的1nM GPCR和在试验缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4(在4℃下)、1mM EDTA、100mMNaCl、1mM DTT、3mM MgSO4、0.3%(w/v)BSA、2μΜGDP、4nM[35S]-GTPγS(Perkin Elmer))中的100nM G蛋白(Gαi1β1γ1,根据(Rasmussen等(2011),Nature 477:549-555.)纯化的)在25℃下孵育20分钟。
已经考虑并减去由缓冲液、GPCR和G蛋白单独产生的背景计数。因此,给出的计数表示在存在和不存在激动剂的情况下GPCR诱导的[35S]-GTPγS与G蛋白的结合。
NK1R变体NK1R-Y09的纯化
所有步骤在4℃下进行。将冷冻的Sf9细胞解冻并在低渗缓冲液(10mM HEPESpH7.4、20mM KCl、10mM MgCl2、cOmplete ULTRA无EDTA片剂(Roche),1μM P物质)中溶胀1小时。然后通过均质化((杜恩斯匀浆器(Dounce homogenizer))破坏细胞膜,并通过130,000rcf的离心收集。通过在低渗缓冲液中重复匀浆(杜恩斯匀浆器)并离心,将分离的膜充分洗涤两次,然后使用高渗缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、1M NaCl、20mM KCl、10mM MgCl2,cOmplete ULTRA无EDTA片剂,1μM P物质)将该过程重复三次。将纯化的膜重悬于溶解缓冲液(30mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、10mM MgCl2、cOmplete ULTRA无EDTA片剂、1μM P物质,2mg/mL碘乙酰胺(Sigma))中并搅拌45分钟。然后将膜溶解在1.5%(w/v)正-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM,Anatrace)和0.3%(w/v)胆固醇半琥珀酸酯(CHS,Sigma)中。搅拌3小时后,通过离心(130,000rcf,40min,4℃)移除未溶解的物质。在与1.5mL TALON Superflow树脂(Clontech)孵育过夜之前,将上清液调节至含有终浓度800mM的NaCl和25mM的咪唑。将蛋白结合的树脂转移到重力流动柱中,然后各自用10个柱体积(CV)的洗涤1缓冲液(25mM HEPESpH 7.4、800mM NaCl、10mM MgCl2、25mM咪唑、10%(v/v)甘油、0.5μM P物质、0.3%/0.06%DDM/CHS),洗涤2缓冲液(25mM HEPES pH 7.4、400mM NaCl、10mM MgCl2、40mM咪唑、10%(v/v)甘油、0.5μM P物质、0.2%/0.04%DDM/CHS、10mM ATP)和洗涤3缓冲液(25mM HEPESpH7.4、200mM NaCl、40mM咪唑、10%(v/v)甘油,0.5μM P物质、0.2%/0.04%DDM/CHS)洗涤。以4CV的洗脱缓冲液(25mM HEPES pH 7.4、200mM NaCl、300mM咪唑、10%(v/v)甘油、0.5μMP物质、0.2%/0.04%DDM/CHS)洗脱NK1R-Y09。使用截留分子量100kDa的Vivaspin离心浓缩器(Sartorius Stedim Biotech)将纯化的受体浓缩至0.5mL。在具有使用SEC缓冲液(20mMHEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.05%0.01%DDM/CHS、0.1μM P物质)平衡的SuperdexS200Increase 10/300GL柱(GE Healthcare)的Aekta Pure FPLC系统(GE Healthcare)上进行尺寸排阻色谱(SEC)。
实施例2:GPCR在酵母中的定向进化
之前已经在大肠杆菌中建立了朝向更高表达水平的GPCR定向进化(Sarkar等(2008),Proc Natl Acad Sci USA 105:14808-14813;Dodevski&Plückthun(2011),J MolBiol 408:599-615)。本发明公开了用于在酿酒酵母中定向进化的类似方法。使用这种方法已经在酿酒酵母中进化了几种GPCR,导致在酵母和昆虫细胞中的高功能性表达,并且超过由在基于大肠杆菌的系统中进化的变体获得的表达水平。通常,只需要两轮进化就获得高表达的变体。
有趣的是,所用的酵母菌株也可以朝向增加GPCR生产适应。这是通过使用荧光激活细胞分选(FACS)的重复分选在进化期间中自动诱导的,并且在选择过程中逐渐出现。因此,获得的所选文库的表达水平是GPCR进化与宿主适应相结合的结果。如果单一GPCR变体在新转化的酵母细胞中表达,则平均表达水平将低于选择的文库的平均表达水平,因为这些细胞未适应。然而,简单地通过重复FACS选择,可以针对任何进化的变体诱导适应。
GPCR表达构建体
可以使用几种不同的GPCR表达构建体。所有的载体衍生自p415GAL1。该载体在酿酒酵母中维持为低拷贝质粒,提供功能性LEU2基因,用于亮氨酸营养缺陷型菌株的选择性生长,并且在转化后可以容易地从酵母再分离。作为穿梭载体,它们可以在大肠杆菌中作为高拷贝载体繁殖,在其中相应地进行所有的克隆步骤。
每个载体编码在用于插入GPCR基因的克隆位点之前的α-交配因子前原序列。通过NheI和BamHI限制性位点完成克隆,实现感兴趣的基因的框内插入。表达在诱导型GAL1启动子的控制之下。不同的载体在克隆位点后的序列不同。用于进化的标准载体pMS03het在克隆位点后不编码任何标签或蛋白,因此使用pMS03het产生没有任何融合的GPCR。其他载体编码含有C末端可裂解的十聚组氨酸标签(pMS03het_3CHis10)、HA-标签(pMS03het HA)、与mCherry的融合(pMS03het_mCh)或AviTagTM(pMS03het_Avi)的构建体。
用于配体结合的酵母细胞的透化
本节描述用于配体结合实验的酵母细胞的透化。使用TELi缓冲液和DTT调节使细胞壁透化并使得配体扩散到在细胞膜中的GPCR。这种透化方法的优点是保持细胞是活的并且不像原生质球一样脆弱。因此,该过程可用于分析型流式细胞术和FACS,以及其中检测配体结合的任何其他应用(例如共焦荧光显微镜、RLBA)。
方案:
·表达后,通过离心(5,000rcf,10min,室温)收集细胞,并吸出上清液。
·在室温下,将细胞重悬于1ml TELi缓冲液中,离心(4,000rcf,3min,室温),并吸出上清液。
·在室温下,将细胞重悬于900μl TELi缓冲液中,加入100μl新鲜制备并过滤灭菌的0.5M DTT(溶于100mM乙酸锂溶液中)。这样得到终浓度50mM的DTT。
·在恒温混匀仪中,在20℃下孵育细胞,以700rpm振荡30分钟。
·将细胞离心(4,000rcf,3min,4℃),并吸出上清液。
·细胞必须从现在开始始终保持在冰上。
·将细胞重悬于1ml冷的TELi缓冲液中,离心(4,000rcf,3min,4℃),并吸出上清液。
·将细胞重悬于冷的TELi缓冲液中(根据实验需要选择体积)。
使用流式细胞仪测定GPCR表达
在细胞表面的功能性GPCR表达的检测原则上可以通过在流式细胞仪中测定的荧光配体结合进行。在与荧光配体一起孵育时,仅有位于质膜中的功能性表达的GPCR将结合配体。在通过洗涤除去未结合的配体后,通过测定荧光强度来检测配体结合。然而,酵母细胞壁用作保护屏障,不允许较大的分子如肽配体通过。因此,在与荧光配体孵育之前,需要透化酵母细胞。紧接着功能性表达水平的分析定量,荧光配体结合也用于采用FACS的选择。表达具有高表达表型变体的细胞将相应地显示更高的荧光强度。通过分选最强荧光的细胞,可以分离高表达GPCR变体。
当与荧光配体一起孵育实现对总信号的测定时,确定非特异性信号也是重要的。这可以通过在竞争结合实验中,与过量的非标记的配体一起的荧光配体的孵育来完成。
在这种测定中获得的非特异性信号描绘了背景。通常,酵母中的GPCR表达导致两个细胞亚群。而一部分细胞显示活性GPCR的表面表达,还有对其未观察到活性表面表达的亚群。通常,这部分非表达细胞在适应菌株中减少。
使用FACS选择的工作流程
选择的工作流程的概述描绘于图中。对于GPCR的定向进化,从生成库开始选择。通过对GPCR基因使用易错PCR(epPCR)的随机诱变构建新的DNA文库。必须通过使用特定引物的PCR(ampPCR)扩增DNA文库,生成适合高效转化的插入片段。一旦已经通过具有所需效率的转化构建了酵母文库,可以进行采用FACS的选择。通常,进行5轮FACS。一旦使用FACS的选择完成,分离所选克隆的DNA。在该步骤中,可以分析选择的克隆。如果需要,可以通过由epPCR选择的克隆构建新的文库并随后用FACS选择进行另一轮定向进化。在以前的GPCR定向进化中,需要进行两轮进化-这意味着两次随机化,每次随后使用FACS选择五次-以获得大幅度提高的表达水平。
对于表达进化的GPCR变体的菌株的适应性,工作流程几乎相同。唯一的区别是不需要制备文库。菌株适应开始于表达选择的GPCR变体的单克隆,其经受使用FACS的5轮选择。选择后,可以制备适应菌株的甘油储液。
Claims (10)
1.一种用于从表达的核酸序列的文库选择序列的方法,其包括以下步骤:
a)提供多个包含细胞壁的真核细胞,其中所述真核细胞中的每个包含所述文库的核酸序列成员,并且所述核酸序列成员被表达为在所述多个真核细胞中的靶膜蛋白,
b)在透化步骤中,透化所述多个真核细胞的所述细胞壁,产生多个透化的细胞,
c)在标记步骤中,使所述多个透化的细胞与能够结合到所述靶膜蛋白的配体接触,其中所述配体包括可检测标记,产生多个标记的细胞,
d)在洗涤步骤中,洗涤所述多个标记的细胞,
e)在选择步骤中,选择所述多个标记的细胞的子集作为存在于所述多个标记的细胞中的可检测标记的函数,产生选择的细胞,和
f)在分离步骤中,从所述选择的细胞分离表达的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法,其中:
i.在所述选择步骤e)后,在扩增步骤中扩增所述选择的活细胞,产生扩增的选择的活细胞,并且所述扩增的选择的活细胞经受所述步骤b)至e),
ii.所述步骤i.进行至少1、2、3、4、5、6或7次,最终跟随所述分离步骤f)。
3.根据权利要求1所述的方法,其中:
i.将在所述分离步骤f)中获得的表达的核酸引入多个包含细胞壁的真核细胞并在其中表达,
ii.所述多个包含细胞壁的真核细胞经受根据权利要求1的所述步骤b)至f),和
iii.步骤i.和ii.进行至少1、2、3、4、5、6或7次。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中通过将突变引入所述扩增序列的方法扩增在所述分离步骤f)中获得的所述表达的核酸,产生核酸序列的第二文库,和
i.将所述核酸序列的第二文库转移至所述多个包含细胞壁的真核细胞,和
ii.将所述多个包含细胞壁的真核细胞递送至根据权利要求1至3所述的方法。
5.根据前述权利要求的任一项所述的方法,其中通过以将突变引入到扩增序列的方法扩增编码所述靶膜蛋白的核酸序列获得所述表达的核酸序列的文库。
6.根据前述权利要求的任一项所述的方法,其中所述靶膜蛋白为G-蛋白偶联受体。
7.根据前述权利要求的任一项所述的方法,其中所述透化步骤包括将所述多个真核细胞暴露于包含锂离子、还原剂和/或螯合剂的碱性pH缓冲液。
8.根据前述权利要求的任一项所述的方法,其中所述可检测标记为荧光染料,并且所述选择步骤通过荧光细胞分选完成。
9.根据前述权利要求的任一项所述的方法,其中所述多个真核细胞为多个酵母细胞。
10.一种用于选择具有高水平表达功能性膜蛋白的能力的适应的酵母细胞的方法,其包括以下步骤:
a.提供多个酵母细胞,其中所述酵母细胞中的每个包含表达的核酸序列的文库的核酸序列成员,并且所述核酸序列成员被表达为所述多个酵母细胞中的靶膜蛋白,
b.在透化步骤中,透化所述多个酵母细胞的细胞壁,产生多个透化的细胞,
c.在标记步骤中,使所述多个透化的细胞与能够结合到所述靶膜蛋白的配体接触,其中所述配体包括可检测标记,产生多个标记的细胞,
d.在洗涤步骤中,洗涤所述多个标记的细胞,
e.在选择步骤中,选择所述多个标记的细胞的子集作为存在于所述多个标记的细胞中的可检测标记的函数,产生选择的细胞,
f.在扩增步骤中,扩增所述选择的细胞,产生扩增的选择的细胞,
g.将所述扩增的选择的活细胞递送至步骤b.至f.至少1、2、3、4、5、6或7次,
h.将所述扩增的选择的细胞递送至步骤b.至e.,和
i.选择所述选择的细胞的子集作为存在于所述多个标记的细胞的可检测标记的函数,从所述扩增的选择的细胞产生所述具有高水平表达功能性膜蛋白的能力的适应的酵母细胞。
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