JP7048114B2 - 細胞壁を有する真核細胞における膜タンパク質の指向性進化 - Google Patents
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Description
真核生物の膜貫通型受容体に関する構造的及び詳細な生化学的調査は、発現、精製および結晶化の方策の技術的進歩にも拘らず、依然として阻まれている。重大な難点は、十分な量で所望の受容体を産生する能力の欠如、およびそれらの生得の不安定性である。
本明細書との関連において、アルカリ性pHという用語は、化学の技術分野で知られているその意味で用いられ、それは、水溶液の塩基度の尺度を指す。7より大きいpHはアルカリ性または塩基性の溶液を指し示し、7未満のpHは酸性溶液を指し示す。
胞を流体の流れの中に浮遊させて検出装置を通過させる細胞選別方法を指す。通過する各細胞は、通過する細胞の固有蛍光シグナルの強度に応じて異なる区画に導かれ得る。
a)細胞壁を含む複数の真核細胞、特に複数の酵母細胞を提供し、各真核細胞がライブラリーの核酸配列メンバーを含んでいる。核酸配列メンバーは、細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、細胞壁を含む複数の真核細胞内の標的膜タンパク質として発現される、細胞への導入遺伝子である。
b)透過化ステップにおいて、細胞壁を含む複数の真核細胞の細胞壁を透過化して、複数の透過化生細胞を生成する。
c)標識ステップにおいて、複数の透過化生細胞を、標的膜タンパク質に特異的に結合できるリガンドと接触させる。リガンドは、検出可能標識を含み、複数の標識生細胞を生成する。
d)洗浄ステップにおいて、複数の標識生細胞を洗浄し、それにより、標的膜タンパク質に特異的に結合しなかったあらゆるリガンドおよび検出可能標識を、実質的に全てではないにしてもほとんど除去する。
e)選択ステップにおいて、複数の標識生細胞の各々について検出可能標識の存在を検出し、複数の標識生細胞に存在する検出可能標識に応じて複数の標識生細胞のサブセットを選択する。換言すれば、あらゆる標識すなわち特定閾値を上回る標識量を示す細胞を選択して、生細胞の選択物(selection of viable cells)を生成する。
f)単離ステップにおいて、細胞の選択物から発現された核酸配列を単離する。
なリガンドの結合さえも可能にする。結合リガンドの量による細胞の選択は、非機能性受容体(例えば、細胞内膜に存在する受容体)も含むであろう全受容体量によってではなく原形質膜上の機能性受容体の量に応じて細胞を選択することを可能にする。
i.選択ステップe)の後に、増殖ステップにおいて生細胞の選択物を増殖させて、生細胞の増殖選択物を生成する。生細胞の増殖選択物をステップb)~e)にこの順で供し、さらに、
ii.ステップi.を少なくとも1、2、3、4、5、6または7回実施し、続いて最後に単離ステップf)を実施する。
i.単離ステップf)で得た発現された核酸を、細胞壁を含む複数の真核細胞に導入して発現させ、
ii.細胞壁を含む複数の真核細胞を、本発明の第1の態様によるステップb)~f)にこの順で供し、
iii.ステップi.およびii.を少なくとも1、2、3、4、5、6または7回実施する。
i.単離ステップf)で得た発現された核酸を、増幅配列に突然変異を導入するプロセスによって増幅させて、第2ライブラリーの核酸配列を生成する。
ii.この第2ライブラリーの核酸配列を、細胞壁を含む複数の真核細胞へ導入する。
iii.第2ライブラリーの核酸配列メンバーを今や含んでいる、細胞壁を含む複数の真核細胞を、本発明の第1の態様による方法のステップb)~f)にこの順で供する。
特定の実施形態において、標的膜タンパク質はGタンパク質共役受容体(GPCR)である。
-ビシン(2-(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ)酢酸)または
-HEPES(2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸)または
-MOPS(3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸)または
-PIPES(1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸)または
-TAPS(3-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]プロパン-1-スルホン酸)または
-TAPSO(3-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]-2-ヒドロキシプロパン-1-スルホン酸)または
-TES(2-[[1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル]アミノ]エタンスルホン酸)または
-トリシン(N-(2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル)グリシン)または
-トリス(2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール)である。
-ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスリトール(DTE)、メルカプトエタノールもしくは還元型グルタチオンなどの、チオール含有化合物、または
-トリス-カルボキシエチル-ホスフィン(TCEP)などのホスフィン含有化合物である。
a)pH9の50mMのTris-HCl、1mMのEDTA、および100mMの酢酸リチウムを含むTELi緩衝液中で酵母細胞を培養し、
b)50mMのDTTをさらに含むTELi緩衝液中で酵母細胞を30分間20℃で培養し、
c)酵母細胞を4℃のTELi緩衝液中で少なくとも1回洗浄する。
i.リチウムイオン、
ii.アルカリ性pH、
iii.還元剤、および/または
iv.キレート剤を含む。
a)細胞壁を含む複数の真核細胞、特に複数の酵母細胞を提供し、各真核細胞がライブラリーの核酸配列メンバーを含んでいる。核酸配列メンバーは、細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、細胞壁を含む複数の真核細胞内の標的膜タンパク質として発現される、細胞への導入遺伝子である。
b)標識ステップにおいて、細胞壁を含む複数の真核細胞を、標的膜タンパク質に特異的に結合できるリガンドと接触させる。リガンドは、検出可能標識を含み、複数の標識
細胞を生成する。
c)洗浄ステップにおいて、複数の標識細胞を洗浄し、それにより、標的膜タンパク質に特異的に結合しなかった大部分の、またはあらゆるリガンドおよび検出可能標識を除去する。
d)選択ステップにおいて、複数の標識細胞の各々について上記検出可能標識の存在を検出し、複数の標識細胞に存在する検出可能標識に応じて複数の標識細胞のサブセットを選択する。換言すれば、あらゆる標識すなわち特定閾値を上回る標識量を示す細胞を選択して、生細胞の選択物を生成する。
e)単離ステップにおいて、細胞の選択物から発現された核酸配列を単離する。
a.複数の酵母細胞を提供し、酵母細胞の各々が、発現された核酸配列のライブラリーの核酸配列メンバーを含んでいる。核酸配列メンバーは、複数の酵母細胞において標的膜タンパク質として発現されている。
b.透過化ステップにおいて、複数の酵母細胞の細胞壁を透過化する。これは、複数の透過化生細胞を生成する。
c.標識ステップにおいて、複数の透過化生細胞を、標的膜タンパク質に結合できるリガンドと接触させる。リガンドは、検出可能標識を含み、それにより、複数の標識生細胞を生成する。
d.洗浄ステップにおいて、複数の標識生細胞を洗浄する。
e.選択ステップにおいて、複数の標識生細胞に存在する検出可能標識に応じて複数の標識生細胞のサブセットを選択して、生細胞の選択物を生成する。換言すれば、あらゆる標識すなわち特定閾値を上回る標識量を示す細胞を選択して、生細胞の選択物を生成する。
f.増殖ステップにおいて、生細胞の選択物を増殖させて、生細胞の増殖選択物を生成する。
g.生細胞の増殖選択物をステップb.~f.に少なくとも1、2、3、4、5、6または7回供する。
h.生細胞の増殖選択物をステップb.~e.に供する。
i.複数の標識生細胞に存在する検出可能標識に応じて生細胞の選択物のサブセットを選択する。これは、機能性膜タンパク質を高レベルで発現する能力を有する適応酵母細胞を生細胞の増殖選択物から生成する。
Gタンパク質共役受容体(GPCR)は、ヒトゲノム中に約800種の様々なメンバーを有して細胞表面受容体の最大のスーパーファミリーを構成している。真核細胞生命体においてGPCRは、多様なリガンドに応答するとともにヘテロ三量体Gタンパク質を介してGタンパク質非依存的な様式でシグナルを変換して、高度に多目的なシグナル伝達媒介物へと進化した。GPCRの極めて重要な役割は、異常なGPCRシグナル伝達に関連する非常に多くのヒト疾患、例えば肥満、糖尿病、心血管疾患、骨粗鬆症、免疫学的障害、神経変性疾患および癌に反映される。結果としてGPCRは、製薬産業にとって大いに重要性を有する薬剤標的を意味する。市販されている薬物の約30~50%が、GPCRまたはGPCR関連のメカニズムに作用するものであり、それらの多くは最も売れている薬物である。
分な量で産生することの困難さ、ならびにそれらの生得の不安定性および柔軟性である。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系の使用、または脂質キュービック相(LCP)での内在性膜タンパク質の結晶化の確立のような、発現および結晶化の方策の進歩は、X線結晶解析による三次元受容体構造を決定する上での突破口につながる。利用可能な構造データセットはGPCR機能のメカニズムについての原子レベルでの洞察を科学界に提供し、また合理的な構造に基づく薬物設計を可能にし始めるかもしれないが、その一方で、受容体の動態および配座変化についての詳細な理解が未だにいくぶん不完全なままであることは明らかである。
転位機構が欠けており、膜組成が異なっている。したがって、大腸菌におけるGPCRの指向性進化は、進化の成功に必要な閾値を超えて原核生物系において生得的に発現する受容体に限定され、それゆえ真核生物のプロセシングまたは膜組成のために厳密に必要なものを有していない。
この方法の一般的手法を図1に示す。まず、野生型GPCR遺伝子をエラープローンPCRによってランダム化し、結果として得られるDNAライブラリーを酵母の形質転換に使用する。インサートDNAおよび酵母発現ベクター主鎖を、設計された相同組換え部位を介して生体内で組み立てる。次に、得られた酵母ライブラリーにおける発現を誘導し、続いて細胞を、酵母細胞壁の透過化のために最適化された緩衝液で処理する。透過化は、原形質膜中の機能的に発現された受容体に対する投与蛍光リガンドの接近、したがって結合を可能にするために必要である。飽和濃度の蛍光リガンドと共に培養した後、未結合リガンドを洗浄によって除去し、細胞をFACSによる選択に供する。表面に変異体を機能性受容体分子最大数で発現している酵母細胞は、それに対応して最も高い蛍光を呈する。これらの細胞は、最も蛍光性であるの酵母細胞の上位0.5~1%に制限してそれらを後の増殖のために直接に増殖培地の中へと選別することによって、単離される。所望の表現型を有するGPCR変異体を発現している細胞の強力な濃縮を達成するために、発現、蛍光リガンドとの培養、およびFACSの反復的なサイクルを数回実施する。プラスミドDNAは、分析または、さらなるランダム突然変異誘発によるさらなる多様性の導入のために、FACS後に選択された細胞から単離することができ、それによって次の回の進化が開始される。
エラープローンPCRによる1回のランダム化とその後のFACSによる5回の選択とから構成される―を行うだけで、機能的発現レベルを強く向上させるのに十分であった。図2は、大腸菌に基づく系において前もって進化させた野生型GPCRであるNTR1変異体およびNK1R変異体(それぞれNTR1-D03およびNK1R-E11)、ならびに第2回目の進化の後に得られたライブラリープールすなわちNTR1 2.5、NK1R2.5、およびKOR1 2.5(ライブラリー命名法:GPCR a.bは、aが全ランダム化の回数であり、bが全FACS選択の回数である)の、S.cerevisiaeにおける機能的発現レベルの比較を示す。機能的発現レベルは、フローサイトメトリー(FC)または放射性リガンド結合アッセイ(RLBA)のいずれかによって測定した。FCリガンド結合実験は、インタクトな個々の細胞の表面の原形質膜中の機能性受容体を専ら測定するものであり、他方、RLBAは、溶解した細胞の集団全体に亘って平均した機能性受容体の合計量を考量するものであり、それゆえ細胞内膜中の機能性GPCRも検出するものである、ということに留意されたい。野生型GPCRについては、FC実験において特異的シグナルは得られず、したがって表面の原形質膜中の活性受容体は検出されない(図2A、C、E)。対照的に、NTR1およびKOR1についてのRLBAでは、機能性受容体の低い発現レベルが測定され、少量の活性受容体が存在しているがしかし細胞内膜中に保持されている可能性が最も高いということが指し示される(図2B、F)。NK1Rについては、以前に報告されたこと(Butzら(2003)、Biotechnol Bioeng 84:292-304)と一致して、用いたいずれかの方法では機能性受容体が検出されなかった(図2C、D)。
濃縮されたクローンを同定すべく、DNA配列決定のために第1回目(段階1.5のライブラリー)および第2回目(段階2.5のライブラリー)の進化の後にプラスミドDNAをライブラリープールから単離した。選択されたクローンについて各クローンの様々な
突然変異を描写する概要を図8に示す。興味深いことに、NTR1およびKOR1の場合には完全長の変異体のみが選択されたが、選択されたNK1R変異体は全て、推定ヘリックス8およびパルミトイル化部位の後にある狭い7アミノ酸の範囲内の位置に終止コドンを含んでおり、その結果C末端が短くなった。このことは、完全長C末端に対して対抗的な選択が強くなされ、切断がこの受容体の発現の著しい増加をもたらす、ということを指し示している。酵母では機能性の野生型NK1Rが検出されないため、本発明者らは代わりに、最も顕著に選択されるC末端切断と野生型配列とを組み合わせて、NK1R-ΔCと呼ぶ基準変異体を構築した。これによって本発明者らは、選択された突然変異の基準を得、またC末端切断がNK1Rの機能的発現の改善にどれだけ寄与するかを定量することも可能になった。
は、改善された特性を受容体に付与するものである突然変異の選択が宿主適応の厳しい必須条件であり、配列変化が実は重要な進化事象である、ということを明白に示す。野生型NTR1を発現している細胞において適応を誘導するのに失敗したことは、毒性のある野生型GPCRの発現とそれに続く選択とが組み合わさって一緒に細胞の生存を制限するストレスの多い作用によって説明され得る。
宿主適応はNTR1-Y06の発現において最も顕著であったため、この変異体を使用して当該作用をさらに研究した。リガンド結合FC分析およびRLBAは活性受容体の検出を可能にするものの、リガンド結合活性を問わずこれらの方法はいずれも、産生された全受容体の定量化を可能としない。したがって、様々な株で産生された全受容体タンパク質をイムノブロッティングによって検出するために、受容体のC末端にヘマグルチニン(HA)タグを有するNTR1およびNTR1-Y06の発現構築を作出した。
未適応株および適応株においてNTR1変異体の細胞局在化および機能性を評価することによって宿主適応作用をさらに説明するために、C末端mCherry(mCh)融合を有するNTR1およびNTR1-Y06構築物を共焦点顕微鏡研究およびFC実験に使用した:全受容体はmChによって定量化されるが、原形質膜中で細胞表面に位置してい
る機能性受容体のみが蛍光リガンド結合からのシグナルを示すことになる。
的表面発現を少しも示さない未適応細胞とは対照的に、適応細胞は細胞内に保持された受容体をほんの少ししか示さない。かなりの部分の細胞内受容体が不活性であるため、宿主適応は活性受容体の全体的な増加につながる。さらに、適応株では未適応株に比べて、受容体をまったく発現していない細胞の亜集団も減少し、より高い平均機能的産生レベルにいっそう寄与する。
究極的には本発明者の目的は、酵母だけでなく昆虫細胞においても機能的GPCR発現を増加させることであった。したがって、進化したGPCRであるNTR1-Y06、NK1R-Y09およびKOR1-Y05の機能的発現レベルをSf9昆虫細胞において測定し、対応する野生型受容体と比較した。全てのGPCRについて、同一の標準発現条件(非最適化)を用いた。実際、進化した変異体の機能的発現の著しい増加が認められた。野生型NTR1に比べてNTR1-Y06では機能的発現が5倍増加し(図7A)、NK1R-Y09では野生型に対して4倍の増加が測定され(図7B)、KOR1-Y05―注目すべきことにこの研究で研究した発現に関して最も挑戦的な例である―では27倍の機能的発現の増加が検出される(図7C)。測定される1細胞あたりの平均した機能性受容体レベル(1細胞あたり4.1x106~5.5x106受容体)は高く、Sf9昆虫細胞において発現させた場合での大腸菌に基づく指向性進化系において発生させた第1世代さらには第2世代のNTR1突然変異体の発現レベル(Schlinkmannら(2012)、J Mol Biol 422:414-428)を上回る。
機能的な形での組換えGPCRの産生は、未だに要求が厳しく困難でコスト集約的な作業であり続けている。近年決定されたGPCR三次元構造のほとんどが、真核生物発現宿主において産生された受容体から得られ、大腸菌におけるGPCRの発現増加のためのタンパク質工学的方法の成功によって促進された、ということを考慮して本発明者らは、指向性進化手法をS.cerevisiaeに導入して真核生物における機能的GPCR産生を特異的に改善することを目指した。
4に、酵母は既に、様々ないくつかのGPCRの異種発現のために広範に使用されてきた。そして第5に、新規リガンドによって活性化される、デザイナードラッグによって独占的に活性化されるデザイナー受容体(DREADD)を生成させることを目指して、異種GPCRを酵母内因性シグナル伝達経路と結合させる広く用いられているGPCRアッセイに基づき、かつてGPCRに対して指向性進化手法が成功裏に用いられた(Armbrusterら(2007)、Proc Natl Acad Sci 米国 104:5163-5168)。
が、その結果としてこれらの変異体を使用して当該機能を好都合に研究することができる。
全ての実験において、EUROSCARFから入手したS.cerevisiae株BY4741(MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)を使用した。標準的な発現は、p415 GAL1由来のpMS03hetを使用して実施した。様々な酵母発現ベクターのさらなる詳細については以下を参照されたい。pMS03hetベクターを使用して形質転換したBY4741を、SDD-Leu-培地(6.9g/Lの酵母用アミノ酸不含ニトロゲンベース(Formedium)、690mg/Lのロイシン不含完全補給混合物(Formedium)、20g/Lのグルコース、35mMのクエン酸三ナトリウム、35mMのクエン酸)の中で30℃で培養した。発現のために、SDD-Leu-培地中で30℃で増殖させた対数増殖期の酵母細胞を遠心分離し、続いてSDG-Leu-培地(SDD-Leu-と同一であるがグルコースの代わりに20g/Lのガラクトースを含む)の中に再び懸濁させた。SDG-Leu-中への再懸濁後、初期OD600を常に1.0に選択し、発現を20℃で24時間実施した。
pMS03hetを得るために、α接合因子プレプロ配列をpPICZαA(Life
Technologies)からp415 GAL1の多重クローニング部位(XhoI/SpeI)にクローニングした。pMS03hetには、高効率での形質転換、すなわちα接合因子プレプロ配列を初発とした遺伝子のインフレームクローニングのために、
効率的なベクター線状化を可能にするNheI/BamHI制限部位が含まれている。C末端HAタグまたはmCherryへの融合を有するGPCRの発現のために、ベクターpMS03het_HAまたはpMS03het_mChをそれぞれ使用した。pMS03het_HAおよびpMS03het_mChを得るために、HAタグまたはmCherryをコードする配列をBamHIによってpMS03hetにクローニングした。
ラットNTR1(アミノ酸1~42のN末端が切断されている)の野生型遺伝子は、Reinhard Grisshammer(アメリカ国立衛生研究所)から寄贈されたものである。ヒトNK1RおよびヒトKOR1の野生型cDNAは、Missouri S&T cDNA Resource Centerから入手した。全ての野生型GPCR遺伝子をpMS03het(NheI/BamHI)にクローニングした。DNAライブラリーの構築は、GeneMorph IIランダム突然変異誘発キット(Agilent Technologies)を製造元のプロトコルに従って使用してエラープローンPCRによる第1回目の進化を行った後に野生型遺伝子または単離DNAを増幅することによって実施した。DNAライブラリーによるBY4741の形質転換は、GenePulser Xcellエレクトロポレーター(Bio-Rad)での矩形波電気穿孔によって実施した。平均して5x107~1x108種の多様性を有するライブラリーが得られた。ライブラリー構築および高効率形質変換のさらなる詳細については、以下を参照されたい。
第1回目の進化の後の野生型GPCRまたは単離バージョンのDNAライブラリーを、一方が20サイクルのエラープローンPCR(epPCR)でありもう一方が25サイクルのepPCRである2回のepPCRを実施することによって生成させ、得られた産物をその後にプールした。epPCRのために使用したプライマーは、(NheI/BamHIによって消化された)線状化pMS03hetに相同的な部位を、遺伝子の各末端に導入した。
5’-CTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAACGTGAGGCGGAAGCGGCTAGC-3’;
逆方向プライマー:
5’-ATTACATGACTCGACTCGATGCCGACGAGAGCGGCCGCCTATTAGGATCC-3’。
。電気穿孔の後、細胞を30℃で1時間、振盪なしで5mLのYPD中で回復させた。最後に、回収した細胞をペレット化し、30℃で20~24時間の選択的増殖のために500mLのSDD-Leu-に移し、-80℃でグリセロールストックに保存した。高多様性ライブラリーを得るために、1ライブラリーあたり常に2つの形質転換を実施した。
発現後、培養物を遠心分離し、培地を吸引し、室温で細胞をTELi緩衝液(pH9.0(4℃で)の50mMのTris-HCl、1mMのEDTA、100mMの酢酸リチウム)の中に再び懸濁させた。次に細胞を、50mMのDTTで補給されたTELi緩衝液中で20℃で30分間培養し、続いて、冷やしたTELi緩衝液中で2回洗浄した。それ以降は細胞を常に4℃に保った。蛍光リガンド結合のために、透過化細胞をHiLyte Fluor 488(AnaSpec)で標識したリガンド(NTR1変異体:25nMの蛍光ニューロテンシン(8-13);NK1R変異体:20nMの蛍光P物質;KOR1変異体:10nMの蛍光ダイノルフィンA(1-11))と共にTELi緩衝液中で4℃で2時間、光に曝露することなく培養した。培養後、測定前に細胞をTELi緩衝液中で1回洗浄した。非特異的結合は、1000倍過剰の非標識リガンド(NTR1変異体:25μMのニューロテンシン(8-13)(AnaSpec);NK1R変異体:20μMのP物質(AnaSpec);KOR1変異体:10μMのダイノルフィンA(1-11)(GenScript))の存在下で測定した。蛍光リガンドのさらなる詳細については、以下を参照されたい。
全ての蛍光リガンドをHiLyte Fluor 488(Anaspec)で標識した。ニューロテンシン(8-13)(KKPYIL)をN末端アミノ基に共有結合的に標識した。P物質(RPKPQQFFGLM)をリジン-3のアミノ基に共有結合的に標識した。ダイノルフィンA(1-11)(YGGFLRRIRPK)をリジン-11のアミノ基に共有結合的に標識した。
測定のために、リガンド結合によって蛍光標識した細胞をTELi緩衝液中で保持した。フローサイトメトリーは、BD FACSCanto IIサイトメーター(BD Biosciences)またはBD LSRFortessa細胞分析装置(BD Biosciences)で実施し、FACSは、BD FACSAria III選別装置(BD Biosciences)で実施した。分析測定のために、常に50,000イベントを記録した。FACSでは、最も蛍光性である0.5~1.0%の細胞3x105~5x105個が、その後の30℃で24時間の培養のためにSDD-Leu-培地中へ選別された。全ての試料について、比較分析を可能にするために同一の取得設定を用いた。データはFlowJo vX.0.7を用いて解析した。
全酵母細胞に対するRLBAを以下のとおりに実施した:まず、(OD600=1.0が107細胞/mLに相当すると仮定して)1x108個の細胞を、発現後に採集し、最初にddH2O中、その後にSPH1緩衝液(1Mのソルビトール、25mMのEDTA、50mMのDTT、pH8.0)中、最後に1Mのソルビトール中で、連続的に洗浄することによって処理した。次に、細胞をSPH2緩衝液(1Mのソルビトール、1mMのEDTA、10mMのクエン酸三ナトリウム、pH5.8)中に再び懸濁させ、6U/mLのZymolyase 20T(AMS Biotechnology)の添加によって細胞壁消化を実施し、その後に30℃で30分間培養した。それ以降は細胞を4℃に保った。続いて細胞を、[3H]標識リガンド(NTR1変異体:20nMの[3,11-チロシル-3,5-3H(N)]-ニューロテンシン(Perkin Elmer);N
K1R変異体:15nMの[ロイシル-3,4,5-3H(N)]-P物質(Perkin Elmer);KOR1変異体:15nMの[15,16-3H]-ジプレノルフィン(Perkin Elmer))を含有するpH7.4(4℃で)の50mMのTris-HCl中で2時間、4℃で培養した。非特異的結合は、1000倍過剰の非標識リガンド(NTR1変異体:20μMのニューロテンシン(8-13)(AnaSpec);NK1R変異体:15μMのP物質(AnaSpec);KOR1変異体:15μMのジプレノルフィン(Tocris Bioscience))の存在下で測定した。培養後に細胞を、真空マニホールドの備わったMultiScreenフィルタープレート(Merck Millipore)で濾過し、冷やしたpH7.4(4℃で)の50mMのTris-HClでフィルターを4回洗浄し、Isoplate-96シンチレーションプレート(Perkin Elmer)へ移し、65℃で2時間乾燥させ、Optiphase Supermixシンチレーションカクテル(Perkin Elmer)を添加した。RLBA測定は、1450 MicroBeta Plus液体シンチレーションカウンター(Wallac)で実施した。
発現後、各試料について(OD600=1.0が107細胞/mLに相当すると仮定して)4x107個の細胞を遠心分離し、全細胞タンパク質を、先に公開されたプロトコル(Zhangら(2011)、Yeast 28:795-798)に従って抽出した。タンパク質検出は、ウサギ抗HA一次抗体(Sigma-Aldrich、H6908)およびマウス抗アクチン一次抗体(Abcam、ab8224)、ならびにAlexa Fluor680と結合したヤギ抗ウサギ二次抗体(Life Technologies、A-21076)およびIRDye800と結合したロバ抗マウス二次抗体(Rockland Immunochemicals、610-732-124)を使用して実施した。画像取得はOdysseyシステム(LI-COR Biosciences)で実施し、定量はImage Studio Liteバージョン3.1.4(LI-COR Biosciences)を使用して実施した。さらなる詳細については以下を参照されたい。
全細胞タンパク質抽出のために、発現後の試料を遠心分離し、培地を吸引し、ペレット化させた細胞を氷上での5分間の培養のために2Mの酢酸リチウム500μL中に再び懸濁させた。次に、細胞をペレット化し、上清を除去し、0.4MのNaOH100μLを添加し、試料を氷上で5分間培養した。培養後、試料を遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを200μLの還元用NuPAGE LDS試料用緩衝液(Life Technologies)中に再び懸濁させた。試料を20℃で15分間培養し、遠心分離し、5μLの各試料をNuPAGE MES SDSランニング用緩衝液(Life Technologies)中でNuPAGE Novex 4-12%Bis-Trisタンパク質ゲル(Life Technologies)に流した。ウェットブロッティングをImmobilon-FLメンブレン(Merck Millipore)上に行った。メンブレンのブロッキングは、PBS中の1xのカゼインブロッキング用緩衝液(Si
gma-Aldrich)中で20分間、室温で実施した。抗体結合は、PBST(PBS、0.05%(v/v)Tween-20)中の1xのカゼインブロッキング用緩衝液中で1時間、室温で実施し、PBSTを全てのメンブレン洗浄ステップのために使用した。ウサギ抗HA一次抗体は1:5,000に希釈して使用し、マウス抗アクチン一次抗体は1:1,000に希釈して使用し、二次抗体(Alexa Fluor 680と結合したヤギ抗ウサギ、およびIRDye800と結合したロバ抗マウス)はどちらも1:10,000に希釈して使用した。
酵母細胞を透過化し、蛍光ニューロテンシンの結合を上記のとおりに実施した。洗浄後、細胞をNunc Lab-Tek IIカバーグラスチャンバー(Thermo Scientific)に移し、共焦点顕微鏡検査をLeica TCS SP5顕微鏡(Leica Microsystems)で実施した。全ての試料について、倍率を630倍とし、比較分析を可能にするために同一の取得設定を用いた。
野生型および進化した受容体構築物を、酵母発現ベクターpMS03hetからのPCRによって増幅させ、SLICによって、改変されたMultiBac pFLベクターにクローニングした。pFL_mFLAG_His10_TEV_SLICと名付けられたベクターは、N末端メリチンシグナル配列に続いてFLAGタグ、デカヒスチジンタグ、TEVプロテアーゼ切断部位およびSLICクローニング部位を有する発現カセットを含んでいる。大腸菌DH10 EMBacY細胞を、様々な受容体遺伝子を含むpFLベクターで形質転換し、結果として得られたバキュロウイルスゲノムを単離した。組換えバキュロウイルスおよびバキュロウイルス感染昆虫細胞ストック(BIIC)の生成の詳細については以下を参照されたい。発現は、Sf-900 II SFM培地(Life Technologies)中で、100倍希釈のBIICストックを使用して密度3x106細胞/mLでSf9細胞を感染させ、27℃で4日間の培養することにより、実施した。発現後、遠心分離によって細胞を採集し、冷やしたPBSで洗浄し、使用するときまで-80℃で保存した。
組換えバキュロウイルスは、8μLのCellfectin II試薬(Life Technologies)を使用して2mLのSf-900II SFM培地(Life
Technologies)中で8×105個のSf9細胞を遺伝子導入することによって生成させた。加湿インキュベーターで27℃で4時間培養した後、遺伝子導入培地を除去し、2mLの新鮮なSf-900II SFMと交換した。V0ウイルスストックを、27℃で5日間の後に採集し、V1高力価ウイルスストック(1mLあたり108~109個のウイルス粒子)を生成させるために使用した。その後、V1ウイルスストックを使用してBIICを生成させた。簡潔に述べると、密度106細胞/mLのSf9細胞を感染多重度(MOI)5で感染させ、懸濁液中で24時間培養し、採集し、ペニシリン-ストレプトマイシン(Life Technologies)と10%(v/v)のDMSOとを含有するSf-900II SFM中で一定分量ごとに-80℃で凍結させた。
[35S]-GTPγS結合アッセイに使用する膜は、先に記載(Egloffら(2014)、Proc Natl Acad Sci 米国 111:E655-62)したとおりに単離した。簡潔に述べると、細胞を浸透圧衝撃の後にせん断力によって破壊した。非特異的な[35S]-GTPγS結合を軽減するために、膜を尿素含有緩衝液中で洗浄した。単離した膜を一定分量ごとに凍結させて-80℃で保存した。尿素洗浄済の膜
上の受容体レベルを、上記の放射性リガンド結合アッセイによって測定した。
全てのステップは4℃で行った。凍結したSf9細胞を解凍し、低張緩衝液(pH7.4の10mMのHEPES、20mMのKCl、10mMのMgCl2、cOmplete ULTRA EDTA不含錠(Roche)、1μMのP物質)中で1時間膨潤させた。その後、細胞膜を、ホモジナイゼーション(Dounceホモジナイザー)によって破壊し、130,000rcfで遠心分離によって採集した。単離した膜を、ホモジナイゼーション(Dounceホモジナイザー)と低張緩衝液中での遠心分離との反復によって広範に2回洗浄し、その後にこの手順を、高張緩衝液(pH7.4の10mMのHEPES、1MのNaCl、20mMのKCl、10mMのMgCl2、cOmplete ULTRA EDTA不含錠、1μMのP物質)を使用して3回繰り返した。精製した膜を溶解用緩衝液(pH7.4の30mMのHEPES、150mMのNaCl、10mMのMgCl2、cOmplete ULTRA EDTA不含錠、1μMのP物質、2mg/mLのヨードアセトアミド(Sigma))中に再び懸濁させ、45分間撹拌した。その後、1.5%(w/v)のn-ドデシル-β-D-マルトピラノシド(DDM、Anatrace)および0.3%(w/v)のヘミこはく酸コレステリル(CHS、Sigma)に膜を溶かした。3時間の撹拌後、溶けなかった材料を遠心分離(130,000rcf、40分間、4℃)によって除去した。上清を、終濃度で800mMのNaClおよび25mMのイミダゾールを含有するように調節し、その後、1.5mLのTALON
Superflow樹脂(Clontech)と共に一晩保温した。タンパク質結合樹脂を重力流カラム内に移し、その後、各々10カラムボリューム(CV)の、洗浄1緩衝液(pH7.4の25mMのHEPES、800mMのNaCl、10mMのMgCl2、25mMのイミダゾール、10%(v/v)のグリセロール、0.5μMのP物質、0.3%/0.06%のDDM/CHS)と、洗浄2緩衝液(pH7.4の25mMのHEPES、400mMのNaCl、10mMのMgCl2、40mMのイミダゾール、10%(v/v)のグリセロール、0.5μMのP物質、0.2%/0.04%のDDM/CHS、10mMのATP)と、洗浄3緩衝液(pH7.4の25mMのHEPES、200mMのNaCl、40mMのイミダゾール、10%(v/v)のグリセロール、0.5μMのP物質、0.2%/0.04%のDDM/CHS)とで洗浄した。NK1R-Y09を4CVの溶出用緩衝液(pH7.4の25mMのHEPES、200mMのNaCl、300mMのイミダゾール、10%(v/v)のグリセロール、0.5μMのP物質、0.2%/0.04%のDDM/CHS)中で溶出させた。精製した受容体を、分子量カットオフ100kDaのVivaspin遠心濃縮器(Sartorius Stedim Biotech)で0.5mLまで濃縮した。SEC緩衝液(pH7.4の20mMのHEPES、150mMのNaCl、0.05%/0.01%のDDM/CHS、0.1μMのP物質)で平衡化したSuperdex S200 Increase 10/
300 GLカラム(GE Healthcare)を備えたAekta Pure FPLCシステム(GE Healthcare)でサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を実施した。
大腸菌における発現レベルの向上に向けたGPCRの指向性進化は、以前に確立されている(Sarkarら(2008)、Proc Natl Acad Sci 米国 105:14808-14813;DodevskiおよびPlueckthun(2011)、J Mol Biol 408:599-615)。本発明は、酵母Saccharomyces cerevisiaeにおける指向性進化のための類似の方法を開示する。S.cerevisiaeにおいていくつかのGPCRをこの方法で進化させており、酵母および昆虫細胞における高い機能的発現につながり、大腸菌に基づく系において進化させた変異体から得られ発現レベルを凌駕した。通常は、高度に発現された変異体を得るのにたった2回の進化を必要とした。
異なるいくつかのGPCR発現構築物が入手可能である。全てのベクターはp415 GAL1に由来するものである。ベクターは、S.cerevisiaeにおいて、ロイシンに対して栄養要求性である株の選択的増殖のための機能性LEU2遺伝子を提供しながら低コピープラスミドとして維持され、また、形質転換後に酵母から簡単に再単離されることができる。それらは、シャトルベクターであるために、大腸菌において高コピーベクターとして増えることができ、それに対応して全てのクローニングステップが行われる。
この節では、リガンド結合実験のための酵母細胞の透過化について説明する。TELi緩衝液およびDTTによる調節によって細胞壁が透過化され、細胞膜中のGPCRへのリガンドの拡散が可能になる。この透過化方法の利点は、細胞が生きたまま保たれ、かつスフェロプラストほど脆弱ではない点である。したがって、この手順は、分析のためのフローサイトメトリーおよびFACS、ならびにリガンド結合を検出するその他のいかなる用
途(例えば、共焦点蛍光顕微鏡検査、RLBA)にも使用することができる。
・発現後に細胞を遠心分離(5,000rcf、10分間、室温)によって採集し、上清を吸引する。
・細胞を室温で1mLのTELi緩衝液中に再び懸濁させ、遠心分離し(4,000rcf、3分間、室温)、上清を吸引する。
・細胞を室温で900μLのTELi緩衝液中に再び懸濁させ、新しく調製されフィルター滅菌された(100mMの酢酸リチウム溶液中に溶かした)0.5MのDTTを100μL添加する。これにより、50mMのDTTの終濃度が得られる。
・細胞をサーモミキサー内で700rpmで振盪しながら20℃で30分間培養する。
・細胞を遠心分離し(4,000rcf、3分間、4℃)、上清を吸引する。
・これより細胞は常に氷上に保たれなければならない。
・冷やした1mLのTELi緩衝液中に細胞を再び懸濁させ、遠心分離(4,000rcf、3分間、4℃)し、上清を吸引する。
・冷やしたTELi緩衝液中に細胞を再び懸濁させる(体積は実験上の必要性に応じて選択する)。
細胞表面における機能的GPCR発現の検出は、原則的に、フローサイトメトリーで測定する蛍光リガンド結合によって実施することができる。蛍光リガンドと共に培養すると、原形質膜中に位置する機能的に発現されたGPCRのみがリガンドに結合することになる。未結合リガンドを洗浄によって除去した後、蛍光強度を測定することによってリガンド結合を検出する。ところが酵母細胞壁は、保護障壁として働いて、ペプチドリガンドのようなより大きな分子を通過させない。そのため、蛍光リガンドと共に培養する前に酵母細胞を透過化させる必要がある。機能的発現レベルの分析的定量化に次いで、蛍光リガンド結合をFACSによる選択のためにも用いる。高発現表現型を有する変異体を発現している細胞は、対応してより高い蛍光強度を呈することになる。最も蛍光性である細胞を選別することにより、高度に発現しているGPCR変異体を単離することができる。
選択のワークフローの概要を図1に示す。GPCRの指向性進化のために、選択はライブラリーの生成から始める。GPCR遺伝子に対するエラープローンPCR(epPCR)を用いるランダム突然変異誘発によって、新規なDNAライブラリーが作出される。DNAライブラリーは、高効率形質転換に適したインサートを生成する特別なプライマーを使用するPCR(ampPCR)によって増幅されなければならない。ひとたび酵母ライブラリーが所望の効率で形質転換によって作出されれば、FACSによる選択を実施することができる。典型的にはFACSを5回実施する。ひとたびFACSによる選択が完了すれば、選択されたクローンのDNAが単離される。このステップでは、選択されたクローンを分析することができる。所望により、選択されたクローンからepPCRおよびその後のFACSによる選択によって新しいライブラリーを作出することによって、別の指
向性進化を実施することができる。事前のGPCRの指向性進化では、高度に増加した発現レベルを得るために2回の進化―2回のランダム化とその各々に続くFACSによる5回の選択という意味で―が必要であった。
Claims (7)
- 発現された核酸配列のライブラリーから配列を選択する方法であり、前記配列はその発現レベルに応じて選択される、方法であって、
a)細胞壁を含む複数の真核細胞を提供するステップであって、前記真核細胞の各々は前記ライブラリーの核酸配列メンバーを含んでおり、前記核酸配列メンバーは、前記複数の真核細胞において原形質膜中におけるGタンパク質共役受容体(GPCR)として発現されている、ステップと、
b)透過化ステップにおいて、前記複数の真核細胞の前記細胞壁を透過化して、複数の透過化生細胞を生成するステップであって、前記透過化ステップは前記複数の真核細胞を化学処理に暴露することを含む、ステップと、
c)標識ステップにおいて、前記複数の透過化生細胞を、前記GPCRに結合できるリガンドと接触させ、複数の標識細胞を生成するステップであって、前記リガンドは検出可能標識を含む、ステップと、
d)洗浄ステップにおいて、前記複数の標識細胞を洗浄するステップと、
e)選択ステップにおいて、前記複数の標識細胞に存在する検出可能標識に応じて前記複数の標識細胞のサブセットを選択して、細胞の選択物を生成するステップと、
f)単離ステップにおいて、発現された核酸配列を細胞の前記選択物から単離するステップと、
を含み、
前記発現された核酸配列は、1細胞あたり少なくとも100000の全機能性GPCRに対応する前記GPCRの高い発現レベルによって特徴付けられ、
前記化学処理は、リチウムイオン、還元剤および/またはキレート剤を含むアルカリ性pHの緩衝液に前記複数の真核細胞を曝露することを含み、
前記検出可能標識は蛍光色素であり、前記選択ステップは蛍光細胞の選別によって達成される、方法。 - i.前記選択ステップe)の後に、生細胞の前記選択物を増殖させて、生細胞の増殖選択物を生成し、生細胞の前記増殖選択物を前記ステップb)~e)に供するステップを更に含み、
前記ステップi.は、少なくとも1、2、3、4、5、6または7回実施し、続いて最後に前記単離ステップf)を実施する、請求項1に記載の方法。 - i.前記単離ステップf)で得た前記発現された核酸を、細胞壁を含む複数の真核細胞に導入して発現させ、
ii.細胞壁を含む前記複数の真核細胞を、請求項1に記載の前記ステップb)~f)に供し、
iii.ステップi.およびii.を少なくとも1、2、3、4、5、6または7回実施する、請求項1に記載の方法。 - 前記単離ステップf)で得た前記発現された核酸を、増幅配列に突然変異を導入するプロセスによって増幅させて、核酸配列の第2ライブラリーを生成し、
i.核酸配列の前記第2ライブラリーを、細胞壁を含む前記複数の真核細胞へ導入し、
ii.細胞壁を含む前記複数の真核細胞を、請求項1~3に記載の方法に供する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記発現された核酸配列のライブラリーは、増幅配列に突然変異を導入するプロセスによって前記GPCRをコードする核酸配列を増幅することにより得られる、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の真核細胞は複数の酵母細胞である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 機能性Gタンパク質共役受容体(GPCR)を高レベルで発現する能力を有する適応酵母細胞を選択する方法であって、
a.複数の酵母細胞を提供するステップであって、前記酵母細胞の各々は、発現された核酸配列のライブラリーの核酸配列メンバーを含んでおり、前記核酸配列メンバーは、前記複数の酵母細胞において原形質膜中におけるGPCRとして発現されている、ステップと、
b.透過化ステップにおいて、前記複数の酵母細胞の細胞壁を透過化して、複数の透過化生細胞を生成するステップであって、前記透過化ステップは前記複数の酵母細胞を化学処理に暴露することを含む、ステップと、
c.標識ステップにおいて、前記複数の透過化生細胞を、前記GPCRに結合できるリガンドと接触させ、複数の標識細胞を生成するステップであって、前記リガンドは検出可能標識を含む、ステップと、
d.洗浄ステップにおいて、前記複数の標識細胞を洗浄するステップと、
e.選択ステップにおいて、前記複数の標識細胞に存在する検出可能標識に応じて前記複数の標識細胞のサブセットを選択して、細胞の選択物を生成するステップと、
f.細胞の前記選択物を増殖させて、細胞の増殖選択物を生成するステップと、
g.生細胞の前記増殖選択物をステップb.~f.に少なくとも1、2、3、4、5、6または7回供し、
h.細胞の前記増殖選択物をステップb.~e.に供し、
i.前記複数の標識細胞に存在する検出可能標識に応じて細胞の前記増殖選択物のサブセットを選択して、機能性GPCRを、1細胞あたり少なくとも100000の全機能性GPCRに対応する高レベルで発現する能力を有する前記適応酵母細胞を細胞の前記増殖選択物から生成する、ステップを含み、
前記化学処理は、リチウムイオン、還元剤および/またはキレート剤を含むアルカリ性pHの緩衝液に前記複数の酵母細胞を曝露することを含み、
前記検出可能標識は蛍光色素であり、前記選択ステップは蛍光細胞の選別によって達成される、方法。
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