CN113040174A - 微胶囊菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微胶囊菌剂及其制备方法和应用,涉及农业微生物菌剂技术领域,微胶囊菌剂包括芯材和壁材,其中芯材为功能性微生物,壁材为海藻酸钙和壳聚糖;其中,所述海藻酸钙凝胶和壳聚糖最终复合包覆于功能性微生物的外层,上述结构的微胶囊菌剂具有密度大,微生物存活率高,储存稳定的优势,能够有效增强菌体在土壤中的缓释和定殖效果,同时,有效延长微生物菌剂的货架期。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物菌剂技术领域,尤其是涉及一种微胶囊菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
生物防治作为一种绿色安全的防治手段,其具有一定的优势,但也存在一些不足,功能性微生物的应用大多会受制于土壤环境等多种生态因素的制约,很难良好的在不同土壤中完成定殖,使得微生物菌剂在实际使用中无法起到真正的作用,同时农用微生物制剂在制备过程中仍存在活菌数含量相对偏低、后处理和加工工艺落后等瓶颈问题。
现阶段化学肥料经过长期使用,已经使土壤板结酸化极其严重,生物菌剂作为绿色健康的有机肥料成为了大家研发的热点。虽然,目前也出现了较多的用于农业生产的微生物菌剂,然而这些微生物菌剂的形态多为菌粉或颗粒,其生产过程中对微生物菌数损害较大,并不易于长期保存和土壤定殖。而且,现有的微生物菌剂产品主要包括液体菌剂和固体菌剂,液体菌剂运输不便,货架期短;固体菌剂包括粉剂和颗粒剂,相对于液体菌剂有较长的货架期,但生产过程中微生物活菌数损耗较大,且设备排放的废气废水会污染环境,最终施用在土壤中所受影响因素较多,难以发挥微生物的实际作用。
因此,研究开发出一种具有微生物密度大、活率高,且储存性能稳定的农业微生物菌剂,变得十分必要和迫切。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种微胶囊菌剂,所述微胶囊菌剂具有密度大,微生物存活率高,储存稳定的优势,能够有效增强菌体在土壤中的缓释和定殖效果,同时,有效延长微生物菌剂的货架期。
本发明的第二目的在于提供一种微胶囊菌剂的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种微胶囊菌剂的应用。
为了实现上述目的,本发明特提出如下技术方案:
本发明提供的一种微胶囊菌剂,所述微胶囊菌剂包括芯材和壁材;其中,所述芯材为功能性微生物,所述壁材为海藻酸钙凝胶和壳聚糖复合包覆于功能性微生物的外层。
进一步的,所述功能性微生物包括特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌;
优选地,所述芽孢杆菌为保藏编号CGMCC NO.20316的特基拉芽孢杆菌Bacillustequilensis,或保藏编号CGMCC NO.20317的贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis。
进一步的,所述微胶囊菌剂的粒径为1.5~3mm,优选为2mm。
本发明提供的一种上述微胶囊菌剂的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(a)、提供功能性微生物菌悬液,随后将菌悬液与海藻酸钠溶液混匀,得到溶液A;
(b)、将溶液A滴加到氯化钙溶液中形成内核为功能性微生物,外层为海藻酸钙的固化颗粒,随后将固化颗粒加入到壳聚糖溶液中包覆壳聚糖层,制得微胶囊菌剂。
进一步的,所述功能性微生物菌悬液中功能性微生物的浓度为 2.5×107cfu/mL~2.5×109cfu/mL;
优选地,所述海藻酸钠溶液的质量浓度为1~2.5%;
优选地,所述溶液A中功能性微生物菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为0.16~1:1。
进一步的,所述氯化钙溶液的质量浓度为1~2.5%;
优选地,所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.5~1.5%。
进一步的,所述步骤(b)将溶液A滴加到氯化钙溶液中的滴加粒径为0.40~0.50nm,优选为0.45nm。
进一步的,所述滴加在搅拌的条件下进行,所述搅拌的速度为 350~450rpm/min,优选为400rpm/min。
进一步的,所述将固化颗粒加入到壳聚糖溶液中包覆在搅拌的条件下进行,所述搅拌的速度为550~650rpm/min,优选为600rpm/min。
本发明提供的一种上述微胶囊菌剂在农业生产种植中的应用;
优选地,所述应用为促进作物生长、防治番茄青枯病和番茄枯萎病。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本申请提供的一种微胶囊菌剂,所述微胶囊菌剂包括芯材和壁材;其中,所述芯材为功能性微生物,所述壁材为海藻酸钙凝胶和壳聚糖复合包覆于功能性微生物的外层。海藻酸钠-Ca2+的包埋体系中,Ca2+与海藻酸钠的比例越高,微胶囊包埋颗粒机械保护强度越强,但海藻酸钠-Ca2+的包埋体系对酸性条件敏感。此外,在其他高浓度单价离子或螯合剂存在的情况下,Ca2+会被替换出来,凝胶稳定性下降,颗粒孔径分布范围较宽,较难保留小分子芯材等缺点。本发明通过在其表面覆盖壳聚糖涂层,由于壳聚糖分子量小,能够较快地扩散至海藻酸钠中,并与海藻酸钠具有很好的生物相容性,形成的凝胶颗粒密度和强度更高,可避免因凝胶结构破坏导致的菌体释放问题,并对Ca2+螯合剂以及其他抗凝乳剂等严苛的不利因素具有较强的抵抗性能,因此显著提高了胶囊内部芽孢杆菌的稳定性。由此可知,本申请上述结构的微胶囊菌剂具有密度大,微生物存活率高,储存稳定的优势,能够有效增强菌体在土壤中的缓释和定殖效果,同时,有效延长微生物菌剂的货架期。
本发明提供的微胶囊菌剂的制备方法,该制备方法首先提供功能性微生物菌悬液,随后将菌悬液与海藻酸钠溶液混匀,得到溶液A;然后将溶液A滴加到氯化钙溶液中,溶液A中的海藻酸钠与氯化钙发生化学反应,固化形成内核为功能性微生物,外层为海藻酸钙的固化颗粒;随后将固化颗粒加入到壳聚糖溶液中包覆壳聚糖层,制得微胶囊菌剂。上述制备方法具有加工工艺简单,易于操作的优势。
本申请提供的微胶囊菌剂可以广泛应用于农业生产种植领域中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的功能性微生物包覆海藻酸钙层后的固化颗粒实物图;
图2为本发明实施例2提供的包覆壳聚糖层后的微胶囊菌剂实物图;
图3为本发明实验例2提供的本申请实施例2和对比例2制得的微胶囊菌剂稳定性检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面,一种微胶囊菌剂,所述微胶囊菌剂包括芯材和壁材;
其中,所述芯材为功能性微生物,所述壁材为海藻酸钙凝胶和壳聚糖复合包覆于功能性微生物的外层。
微胶囊技术的开发已有60余年,在食品和医药行业均得到了广泛的应用。现阶段利用微胶囊技术,已研制出了多种微胶囊化的产品,而在农业生产中微生物菌剂的形态多为菌粉或颗粒,其生产过程中对微生物菌数损害较大,并不易于长期保存和土壤定殖。本申请微胶囊化技术是把功能性微生物(例如贝莱斯芽孢杆菌或特基拉芽孢杆菌)包裹在囊壁物质中,制成几微米至几百微米的微球体,具有调节有效成分缓慢释放、易于保存、降低微生物受外界的影响、易于添加易氧化和分解的增效剂等多种作用。通过调节芯材浓度更能使农用微生物产品的有效活菌数和保存时长达到采用一般的深层发酵无法达到的程度。
本申请提供的一种微胶囊菌剂,所述微胶囊菌剂包括芯材和壁材;其中,所述芯材为功能性微生物,所述壁材为海藻酸钙凝胶和壳聚糖复合包覆于功能性微生物的外层。海藻酸钠-Ca2+的包埋体系中,Ca2+与海藻酸钠的比例越高,微胶囊包埋颗粒机械保护强度越强,但海藻酸钠-Ca2+的包埋体系对酸性条件敏感。此外,在其他高浓度单价离子或螯合剂存在的情况下,Ca2+会被替换出来,凝胶稳定性下降,颗粒孔径分布范围较宽,较难保留小分子芯材等缺点。本发明通过在其表面覆盖壳聚糖涂层,由于壳聚糖分子量小,能够较快地扩散至海藻酸钠中,并与海藻酸钠具有很好的生物相容性,形成的凝胶颗粒密度和强度更高,可避免因凝胶结构破坏导致的菌体释放问题,并对Ca2+螯合剂以及其他抗凝乳剂等严苛的不利因素具有较强的抵抗性能,因此显著提高了胶囊内部芽孢杆菌的稳定性。由此可知,本申请上述结构的微胶囊菌剂具有密度大,微生物存活率高,储存稳定的优势,能够有效增强菌体在土壤中的缓释和定殖效果,同时,有效延长微生物菌剂的货架期。
在本发明的一种优选实施方式中,所述功能性微生物包括特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌;
作为一种优选的实施方式,所述芽孢杆菌为保藏编号CGMCC NO.20316的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis,或保藏编号CGMCC NO.20317的贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis。
其中,所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis于2020年7月8日,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为 CGMCC NO.20317,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,分类命名为贝莱斯芽孢杆菌。
所述特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis于2020年7月8日,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为 CGMCC NO.20316,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,分类命名为特基拉芽孢杆菌。
作为一种优选的实施方式,枯草芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的模式菌种,具有促进农作物生长、诱导植物产生抗病性,降解土壤有害物质等多种生物活性,同时还能够批量生产、工艺简单、货架期长,现阶段枯草芽孢杆菌是产业化最为广泛的微生物菌剂之一。
在本发明的一种优选实施方式中,所述微胶囊菌剂的粒径为1.5~3mm,优选为2mm。
根据本发明的一个方面,一种上述微胶囊菌剂的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(a)、提供功能性微生物菌悬液,随后将菌悬液与海藻酸钠溶液混匀,得到溶液A;
(b)、将溶液A滴加到氯化钙溶液中形成内核为功能性微生物,外层为海藻酸钙的固化颗粒,随后将固化颗粒加入到壳聚糖溶液中包覆壳聚糖层,制得微胶囊菌剂。
本发明提供的微胶囊菌剂的制备方法,该制备方法首先提供功能性微生物菌悬液,随后将菌悬液与海藻酸钠溶液混匀,得到溶液A;然后将溶液A滴加到氯化钙溶液中,溶液A中的海藻酸钠与氯化钙发生化学反应,固化形成内核为功能性微生物,外层为海藻酸钙的固化颗粒;随后将固化颗粒加入到壳聚糖溶液中包覆壳聚糖层,制得微胶囊菌剂。上述制备方法具有加工工艺简单,易于操作的优势。
同时,上述微胶囊菌剂的制备方法始终保持在常温状态下进行,能够大幅减少菌种及其代谢产物的损失,并因该胶囊采用海藻酸钠-壳聚糖包膜技术手段,因此能够良好的应对外界不良因素。与现有菌粉制备工艺相比,能够显著降低将微生物菌体制备成菌剂过程中的损耗,提高包埋率以及菌剂的稳定性,延长产品的货架期,提高微生物的利用率,为解决现阶段微生物菌剂生产中包埋率低、菌剂稳定性弱等问题提供了一种新型的技术手段。
在本发明的一种优选实施方式中,所述功能性微生物菌悬液中功能性微生物的浓度为2.5×107cfu/mL~2.5×109cfu/mL;
作为一种优选的实施方式,上述功能性微生物的浓度为108cfu/mL。
在本发明的一种优选实施方式中,所述海藻酸钠溶液的质量浓度为 1~2.5%;
作为一种优选的实施方式,上述海藻酸钠溶液的质量浓度2.05%。
在本发明的一种优选实施方式中,所述溶液A中功能性微生物菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为0.16~1:1。
作为一种优选的实施方式,上述功能性微生物菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比1:2.5。
在本发明的一种优选实施方式中,所述氯化钙溶液的质量浓度为 1~2.5%;
优选地,所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.5~1.5%。
作为一种优选的实施方式,上述氯化钙溶液的质量浓度为1.9%,所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.85%。
在本发明的一种优选实施方式中,所述步骤(b)将溶液A滴加到氯化钙溶液中的滴加粒径为0.40~0.50nm,优选为0.45nm。
在本发明的一种优选实施方式中,所述滴加在搅拌的条件下进行,所述搅拌的速度为350~450rpm/min,优选为400rpm/min。
在本发明的一种优选实施方式中,所述将固化颗粒加入到壳聚糖溶液中包覆在搅拌的条件下进行,所述搅拌的速度为550~650rpm/min,优选为 600rpm/min。
根据本发明的一个方面,一种上述微胶囊菌剂在农业生产种植中的应用;
本申请提供的微胶囊菌剂可以广泛应用于农业生产种植领域中。
优选地,所述应用为促进作物生长、防治番茄青枯病和番茄枯萎病。
下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1
一种功能性微生物菌悬液,所述制备方法包括以下步骤:
(1)、将芽孢杆菌分离于大棚土壤中,经鉴定,该菌株为保藏编号 CGMCC NO.20316的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis。活化培养基为LB 液体培养基,培养基配方为:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠 10g/L。培养条件为37℃,150rpm,培养48h。
(2)、将步骤(1)培养后的菌体收集是经4000rpm离心15min后收集,随后添加无菌水,吹吸制成菌悬液,使得所述菌悬液浓度为108cfu/mL,制得功能性微生物菌悬液。
实施例2
图1为本实施例制得的功能性微生物包覆海藻酸钙层后的固化颗粒实物图;
图2为本实施例制得的包覆壳聚糖层后的微胶囊菌剂实物图。
如图1和图2所示,一种微胶囊菌剂的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(a)、取实施例1制得的功能性微生物菌悬液与灭菌的质量浓度为2%的海藻酸钠溶液混合均匀,得到溶液A;所述溶液A中功能性微生物菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为0.6:1;
然后,在搅拌速度为400rpm的情况下,用直径0.45nm的无菌注射器将得到溶液A滴加到质量浓度为2%的氯化钙溶液中,固化30min,形成内核为功能性微生物,外层为海藻酸钙的固化颗粒;随后,使用无菌水洗涤固化颗粒3次,收集备用;
(b)、将收集的固化颗粒在搅拌速度为600rpm的条件下加到质量浓度为1%的壳聚糖溶液中,覆膜40min,随后使用无菌水洗涤3次,4℃保存,制得直径为2mm的微胶囊菌剂。
实施例3
一种微胶囊菌剂的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(a)、取实施例1制得的功能性微生物菌悬液与灭菌的质量浓度为1%的海藻酸钠溶液混合均匀,得到溶液A;所述溶液A中功能性微生物菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为0.85:1;
然后,在搅拌速度为350rpm的情况下,用直径0.40nm的无菌注射器将得到溶液A滴加到质量浓度为1%的氯化钙溶液中,固化30min,形成内核为功能性微生物,外层为海藻酸钙的固化颗粒;随后,使用无菌水洗涤固化颗粒2次,收集备用;
(b)、将收集的固化颗粒在搅拌速度为550rpm的条件下加到质量浓度为0.5%的壳聚糖溶液中,覆膜40min,随后使用无菌水洗涤3次,4℃保存,制得直径为2mm的微胶囊菌剂。
实施例4
一种微胶囊菌剂的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(a)、取实施例1制得的功能性微生物菌悬液与灭菌的质量浓度为 2.5%的海藻酸钠溶液混合均匀,得到溶液A;所述溶液A中功能性微生物菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为1:1;
然后,在搅拌速度为450rpm的情况下,用直径0.5nm的无菌注射器将得到溶液A滴加到质量浓度为2.2%的氯化钙溶液中,固化30min,形成内核为功能性微生物,外层为海藻酸钙的固化颗粒;随后,使用无菌水洗涤固化颗粒2次,收集备用;
(b)、将收集的固化颗粒在搅拌速度为650rpm的条件下加到质量浓度为1.5%的壳聚糖溶液中,覆膜40min,随后使用无菌水洗涤3次,4℃保存,制得直径为2mm的微胶囊菌剂。
对比例1
一种微胶囊菌剂的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
取实施例1制得的功能性微生物菌悬液与灭菌的质量浓度为2.05%的海藻酸钠溶液混合均匀,得到溶液A;所述溶液A中功能性微生物菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为1:2.5;
然后,在搅拌速度为400rpm的情况下,用直径0.45nm的无菌注射器将得到溶液A滴加到质量浓度为1.9%的氯化钙溶液中,固化30min,形成海藻酸钠氯化钙凝胶,随后,在滴加到0.85%的壳聚糖溶液中,覆膜40min,形成海藻酸钠-氯化钙-壳聚糖微胶囊菌剂,最后,使用无菌水洗涤固化颗粒 2次,收集备用。
对比例2
一种微胶囊菌剂的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
取实施例1制得的功能性微生物菌悬液与灭菌的质量浓度为2.05%的海藻酸钠溶液混合均匀,得到溶液A;所述溶液A中功能性微生物菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为1:2.5;
然后,在搅拌速度为400rpm的情况下,用直径0.45nm的无菌注射器将得到溶液A滴加到质量浓度为1.9%的氯化钙溶液中,固化30min,形成海藻酸钠-氯化钙微胶囊。随后,使用无菌水洗涤固化颗粒2次,收集备用。
实验例1
为表明本申请制备得到的微胶囊菌剂具有包覆率高的优势,现对实施例2~4制备得到的微胶囊进行包埋率的测定。
微胶囊的包埋率是微胶囊所包埋的活菌数占总投活菌数的百分比。微胶囊制备后,溶液内、胶囊表面和内部都含有活菌,测定其所有的活菌数即为总菌数;测定溶液内以及微胶囊表面的活菌数即为未包埋的活菌数;总菌数与未包埋的活菌数之差即为微胶囊所包埋的活菌数。包埋率计算公式如下所示:
微胶囊包埋率=(总菌量-未包埋的菌量)/总菌量×100%。
所述测定结果如下所示:实施例2海藻酸钠-氯化钙-壳聚糖微胶囊制备工艺下微胶囊的包埋率为99.06%,而对比例2海藻酸钠-氯化钙微胶囊制备工艺体系微胶囊的包埋率为97.57%。结果表明,采用双层微胶囊体系在包埋率上比单层微胶囊体系要效果更好。
实验例2
为表明本申请微胶囊菌剂具有储存性能稳定的优势,现将本申请实施例2~4以及对比例1、2制得的微胶囊菌剂进行存储稳定性的测定,具体检测方法如下:
将制备好的双层微胶囊菌剂与单层微胶囊菌剂至于4℃保存,每隔一周采用平板稀释法检测一次微胶囊及菌液中的菌体浓度,连续测定5周。
图3为本申请实施例2和对比例2制得的微胶囊菌剂稳定性检测结果图。
如图3所示,在不添加任何保护剂的条件,本申请实施例2制得的微胶囊菌剂下35天后,双层包膜的微胶囊菌剂菌数的下降率为14.14%,而对比例2单层包膜的微胶囊菌剂的菌数下降率为21.8%,数据表明双层包膜对微生物的保存效果更佳。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种微胶囊菌剂,其特征在于,所述微胶囊菌剂包括芯材和壁材;
其中,所述芯材为功能性微生物,所述壁材为海藻酸钙凝胶和壳聚糖复合包覆于功能性微生物的外层。
2.根据权利要求1所述的微胶囊菌剂,其特征在于,所述功能性微生物包括特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌;
优选地,所述芽孢杆菌为保藏编号CGMCC NO.20316的特基拉芽孢杆菌Bacillustequilensis,或保藏编号CGMCC NO.20317的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。
3.根据权利要求1所述的微胶囊菌剂,其特征在于,所述微胶囊菌剂的粒径为1.5~3mm,优选为2mm。
4.一种根据权利要求1~3任一项所述的微胶囊菌剂的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
(a)、提供功能性微生物菌悬液,随后将菌悬液与海藻酸钠溶液混匀,得到溶液A;
(b)、将溶液A滴加到氯化钙溶液中形成内核为功能性微生物,外层为海藻酸钙的固化颗粒,随后将固化颗粒加入到壳聚糖溶液中包覆壳聚糖层,制得微胶囊菌剂。
5.根据权利要求4所述的微胶囊菌剂的制备方法,其特征在于,所述功能性微生物菌悬液中功能性微生物的浓度为2.5×107cfu/mL~2.5×109cfu/mL;
优选地,所述海藻酸钠溶液的质量浓度为1~2.5%;
优选地,所述溶液A中功能性微生物菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为0.16~1:1。
6.根据权利要求4所述的微胶囊菌剂的制备方法,其特征在于,所述氯化钙溶液的质量浓度为1~2.5%;
优选地,所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.5~1.5%。
7.根据权利要求4所述的微胶囊菌剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(b)将溶液A滴加到氯化钙溶液中的滴加粒径为0.40~0.50nm,优选为0.45nm。
8.根据权利要求7所述的微胶囊菌剂的制备方法,其特征在于,所述滴加在搅拌的条件下进行,所述搅拌的速度为350~450rpm/min,优选为400rpm/min。
9.根据权利要求4所述的微胶囊菌剂的制备方法,其特征在于,所述将固化颗粒加入到壳聚糖溶液中包覆在搅拌的条件下进行,所述搅拌的速度为550~650rpm/min,优选为600rpm/min。
10.一种根据权利要求1~3任一项所述的微胶囊菌剂在农业生产种植中的应用;
优选地,所述应用为促进作物生长、防治番茄青枯病和番茄枯萎病。
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