JPH11505403A

JPH11505403A - 微生物を含有する顆粒剤、およびそれらの製造方法および使用

Info

Publication number: JPH11505403A
Application number: JP8504636A
Authority: JP
Inventors: マーガレトエンズマン; ウイリアムバエティック
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-07-03
Publication date: 1999-05-21
Also published as: AU705188B2; SK3197A3; US20020015988A1; ZA955830B; CN1152936A; PL317965A1; SK280088B6; BR9508398A; HUT76428A; CA2192681A1; IL114573A; NO970136L; CN1090237C; RU2160990C2; NO970136D0; EP0770126A1; AU2980495A; NZ289842A; BG101170A; WO1996002638A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、微粒子基材および微生物を含有するポリマー層よりなる顆粒剤であって、前記ポリマーはａ）皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーであって、かつ顆粒剤は前記顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％の水を含有するか、またはｂ）カルボキシル基もしくはスルフェート基を含有しそして水中においてカリウムイオンの存在下膨潤し得る皮膜形成性、構造的に架橋したポリサッカライドであって、また顆粒剤は前記顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％の水を含有する顆粒剤を提供する。本発明はさらに前記顆粒剤の製造方法および病気の感染もしくは昆虫の攻撃から植物を保護するためのそれらの使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】微生物を含有する顆粒剤、およびそれらの製造方法および使用本発明は、（１）固体の水不溶性および微粒子基材、（２）共有的に架橋していないかもしくは多価のカチオンと架橋している水溶性もしくは水膨潤性皮膜形成性ポリマー、（３）微生物および（４）水よりなる顆粒剤に関する。さらに本発明は前記顆粒剤の製造方法および病気および昆虫の攻撃から植物を保護するためのそれらの使用にも関する。胞子の形成もしくは成長細胞（微生物）を使用して植物を保護することの重要性が近年増加するに至った。該生物学的防除剤を使用するための前提条件は、それらを有用な製剤例えば懸濁剤原液、分散性粉体、顆粒、もしくは特に散水顆粒に調製できることである。製剤を調製する上で大きな問題があった。例えば、約４０℃を超えた温度では微生物が損傷を受けそして生存率の実質的減少が観察されるので、ほとんどの成長細胞およびまたいくつかの胞子は、約４０℃を超えた温度で調製できなかった。同様にして貯蔵にも問題があった。周囲条件下において生存率の減少を防けられず細胞が死滅する結果となっていたので、生存率の低下を防ぐために製剤を低い温度で貯蔵する必要があった。最も知られている微生物の製剤は、これらの微生物を含有する多価のカチオンと架橋するポリマーゲルよりなる。該製剤は特に、D.R.Fravel et al．in Phytopathology,Vol.75,No7 ,774-777,1985に記載されており、それはポリマー材料としてアルギン酸塩を使用している。一般的に使用される基材もそこに記載されている。これらの製剤の調製は、個々の液滴が形成されるようにおよび微生物が１種のうちの１つまたは双方の反応溶液中に懸濁され得るようにして、通常天然もしくは合成ゲル形成ポリマーの溶液、例えばアルギン酸塩および多価金属イオンの水溶液を混合することにより行われる。微生物の懸濁液をゲル化剤の溶液中に滴下すると、ゲル形成が開始する。これらのゲル粒子を続いて乾燥させることができる。このプロセスはイオノトロピックゲル化(ionotropic gelation)と呼ばれている。乾燥の度合いによって、このプロセスにより多価のカチオンで架橋されたポリマーのコンパクトでかつ堅いペレットを形成することが可能となる。該ペレットは均一に分散された微生物および基材を含有している。粒子サイズは５ｍｍまでである。ＥＰ−Ａ１−００９７５７１は、部分的に架橋したポリサッカライドをベースとする製剤を開示しており、該製剤は微生物の他に、基材として珪酸の微粒子を含有していてもよくまたＣａ⁺⁺イオンの添加により架橋が行われてもよい。製剤の水分活性は０．３を超えてはいけない。以下の文献中の他の調剤システムを参照してみると、New Directions in Biological Control: Alternatives for Supressing Agricultural Pests and Diseases,pp.345-372,A lan R.Liss,Inc.(1990),W.J.Connick et al.基材としてバーミキュライトを用いる顆粒剤およびイオノトロピックゲル化により調製されるコンパクトなアルギン酸塩ペレットが見いだされる。該製剤はまた、以下の文献に記載されている：D. R.Fravel in Pesticide Formulations and Application Systems:llth Volume,A STM STP 1112 American Society for Testing and Materials,Philadelphia,199 2,pp.177-179。これらの架橋したゲル製剤は生物学的防除剤の放出が遅いという欠陥を有する。それはゲルが水不溶性でありまた通常数ｍｍよりも大きい直径を有する大きな粒子を形成するからである。もしより速い放出を望むのであれば、製剤は典型的には緩衝液で予備処理されていなければならない。このことは最終使用者にとって、より困難となりまた安全に操作することが制限される。より高い集団密度（＞１０⁹ＣＦＵ／ｇ＝コロニー形成単位／ｇ）の場合、施用率を減少させる必要がある。該システムは通常十分な安定性を有さずしかも実質的低下を防ぐために冷却保存が必要となる。製剤調製のために、ゲル形成ポリマーを水中に溶解させなければならないが、いくつかの場合において溶解させることが困難でありそして加熱した温度においてのみ溶解させることが可能となる。滴下様ゲル製剤は、有用な顆粒剤を得るために必要なプロセスである。工業的規模で前記プロセスを実施するための技術的装置を用意することは、困難かつ費用がかかると考えられている。そのようにして得られた粒子は高い水含量を有し、該水含量は乾燥を行うことにより減少して満足できる貯蔵安定性を得る。この乾燥ステップによりプロセスがより高価なものとなり、微生物の生存率がさらに減少することとなる。水溶性もしくは水膨潤性ポリマーをベースとしまたイオノトロピックゲル化(ionotropic gelation)を行わずに製造された貯蔵安定性顆粒剤は、いまだに技術者に知られていない。驚くべきことに、（ａ）イオノトロピックゲル化を行うことなくおよびポリマーを完全に溶解せずに部分的に溶解させることで、ポリマー層中に微生物を含む顆粒剤を調製することが可能であること、（ｂ）乾燥時に生きた細胞を死滅させることを実質的に減少させること、（ｃ）特に周囲温度において、高い貯蔵安定性が得られること、（ｄ）良好な貯蔵安定性を維持しつつ、非常に高い微生物の集団密度を得ること、（ｅ）生物学的防除剤の放出が速くなること、および（ｆ）特に成長バクテリア細胞の良好な安定化を得ること、共有的に架橋していないかもしくは多価カチオンにより架橋されている水溶性もしくは水膨潤性皮膜形成性ポリマー中の微生物を、基材に塗布するかまたは基材と一緒に塗布し、全配合剤に基づいて、配合剤は少なくとも０．５重量％の水を含有することが可能であることが見いだされた。本発明の１つの目的は、微粒子基材および微生物を含有するポリマー層よりなる顆粒剤であって、前記ポリマーはａ）皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーであって、かつ顆粒剤は前記顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％の水を含有するか、またはｂ）カルボキシル基もしくはスルフェート基を含有しそして水中においてカリウムイオンの存在下膨潤し得る皮膜形成性、構造的に架橋したポリサッカライドであって、また顆粒剤は前記顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％の水を含有する顆粒剤を提供することにある。「本質的に未架橋」は、本願明細書中において、共有結合を形成する単価架橋剤を意味するものではなく、またイオノトロピックゲル化を起こす多価カチオンが加えられるものでもないと理解されるであろう。「構造的に架橋した」は、本願明細書中において、１種類のポリマーもしくは２種類のポリマー混合物の水素結合を介するかもしくはカリウムイオンの静電的相互作用を介する空間的な網状構造の形成を意味する。従って、熱可逆的な空間的な構造（ゲル）は、加熱して溶液中に再び戻ったときに見られる。具体例は、カリウムイオンの存在下におけるカラジーナンの二重螺旋構造もしくはカラジーナンおよびイナゴマメガム混合物の構造形成である。熱不可逆的な多価イオンによる構造形成は、上記の定義からは除かれる。１もしくはそれよりも多くのカルボキシル基もしくはスルフェート基は、ポリサッカライドの反復構造単位当たりに存在する。「水溶性」は、本願明細書中において、５ないし９５℃の温度範囲において少なくとも０．５重量％のポリマー水溶液を調製することが可能であることを意味する。顆粒剤は、顆粒剤１ｋｇを基に、乾燥状態で好ましくは０．１ないし１０重量％、さらに好ましくは０．３ないし５重量％、もっとも好ましくは０．５ないし０．３重量％の量の微生物を含有する。細胞濃度に基づく集団密度は、特に高くてよい。好ましい集団密度は、顆粒剤の１ｇ当たり、１×１０⁵ないし１×１０¹¹ＣＦＵ（colony forming units: コロニー形成単位）である。室温における貯蔵中に、この生きている細胞の濃度は、最高１０カ月にわたって本発明の顆粒剤中で維持され得る。その間１／１０未満のＣＦＵの微生物のわずかな減少が見られる。残留水含量は少なくとも１重量％、より好ましくは少なくとも３重量％、最も好ましくは５重量％である。最大の水含量は好ましくは少なくとも４０重量％、より好ましくは少なくとも３０重量％、および最も好ましくは少なくとも２０重量％である。水含量の上限は、担体、ポリマーの水溶解性および製剤の製造方法に支配される。皮膜形成方法、例えば流動層増粒において、０．５ないし２０重量％の水含量が容易に得られ、一方押出し方法においては、水含量はそれよりも高くてよく典型的には０．５ないし４０重量％であってよい。微粒子基材は１μｍないし０．８ｃｍ、より好ましくは１０μｍないし０．５ｃｍ、最も好ましくは２０μｍないし０．２ｃｍの平均粒子サイズを有する。基材は無機もしくは有機材料である。真菌に対して有機材料が使用されそして成長細胞（バクテリア）には無機材料が使用されることが好ましい。水不溶性有機材料の具体例は細かく砕かれたブランストロー（bran．straw）、おがくずもしくはセルロースである。特に適した無機基材は水不溶性金属酸化物、金属塩（ＳｉＯ₂、Ａｌ₂Ｏ₃、ＢａＳＯ₄、ＣａＣＯ₃）、アルカリ金属およびアルカリ土類金属のシリケートもしくはアルミノシリケートである。シリケートの中で、板状シリケートが好ましい。シリケートの具体例は鉱物粘土、アタパルジャイト、多孔質珪藻土、粉末状生石灰、珪藻土、珪灰石、かんらん石、モンモリロナイトもしくはバーミキュライトである。バーミキュライトが特に好ましい。基材の量は５０ないし９９重量％、好ましくは６５ないし９９重量％、最も好ましくは７５ないし９９重量％である。顆粒剤は０．０１ないし８ｍｍの平均粒子サイズを有し得る。好ましい平均粒子サイズは、０．２ないし４ｍｍおよび特に好ましい平均粒子サイズは０．５ないし２ｍｍである。皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーは合成もしくは天然ポリマーである。合成ポリマーの具体例は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールもしくはポリビニルピロリドンのホモポリマーもしくはコポリマー並びにポリアクリルアミドである。天然ポリマーの具体例は主に誘導されたポリサッカライドである。好ましい天然の知られているポリマーは典型的にはスターチ、アルギン酸塩、カラジーナン、好ましくはκ−カラジーナン、ι−カラジーナン、キサンテン、イナゴマメガム(locust beam gum)もしくはメチルセルロースである。それらの混合物もまた使用できる。ポリマーは微生物と相溶性がなければならない。相溶性は当業者により微生物とポリマーを一緒にする単純な方法により達成することができる。アルギン酸塩およびカラジーナンが、特に好ましい。特に好ましい担体と水溶性ポリマーの組み合わせは、バーミキュレートとκ−カラジーナンである。皮膜形成性構造的に架橋した水溶性ポリマーは、ポリサッカライド、好ましくはκ−カラジーナン、ι−カラジーナン、イナゴマメガム(locust beam gum)、キサンテン、もしくはそれらの混合物であって、該ポリマーはカリウムイオンの存在下において形成される。このポリマーは、分子間水素結合もしくはイオン結合に特徴を有する熱可逆的ゲルを形成する。水溶性もしくは水膨潤性ポリマーの量は、０．１ないし２０重量％、好ましくは０．１ないし１０重量％および最も好ましくは０．５ないし５重量％であってよい。カリウムイオンとポリマーのカルボキシル基もしくはスルフェート基のモル比は０．００１：１ないし１：１である。農業における有害生物の防除もしくは植物の病気の抑制に使用できる微生物は、特にＥＰ−Ａ−０４７２４９４に記載されている。適した微生物は、以下のものを包含するバアクテリアである：リゾビウム(Rhi zobium spp.,)、メタリジウム(Metharizium)、フザリウム(Fusarium)、トリコデルマ(Trichoderma)、ストリプトマイス（Stryptomyces）、グリオクラジウム(Gl iocladium)、ペニシリン（Penicillium,）、タラノマイス（Talaromyces,）、ベルティシリウム（Verticillium）もしくはコレトトリチャム（Colletotrichum）。好ましい微生物は、シュードモナス（Pseudomonas spp.）、セラチア（Serrat ia spp．）、バチルス（Bacilus spp.）、アグロバクテル(Agrobacter spp.)、エキセロヒウム（Exserohium s pp．）、エンテロバクテル（Enterobacter spp．）である。微生物シュードモナスオウランチアカ（Pseudomonas aurantiaca）ATTC No.55169が特に好ましい。微生物により防除され得る、雑草、昆虫および菌類病は典型的には、リゾクトニアソラーニ(Rhizoctonia solani)、リゾクトニアオリザエ（Rhizoctonia oryz ae）、ピチウムウルチマム(Phytium ultimum)、フザリウムオキシスポラム（Fus arium oxysporum spp）、アルヒノミスリービス(Alphnomyces laevis)、ヒトプトラインフェクタンス(Phytophtora infestans)、ボトリチス（Botrytis spp., ）、シュレロチニアシュレロチオラム（Sclerotinia sclerotiorum）、バチラス (Bacillus sp.,)、マイクロドチウムニバエ(Microdochium nivale)、チエラビオシスバシコーラ（Thielaviopsis basicola）、ガエマノミセスグラミニス(Gaeum anomyces graminis)および、主に病原性微生物により引き起こされる他の全ての病気(Erwiniacarotovora,Saccharomyces cerevisiae,Xanthomonasvesicatoria,P seudomonas syrigae)である。シュードモナスオウランチアカ（Pseudomonasaurantiaca）ATTC No.55169は、異なる作物について多くの上記した病気に対して活性を有する。綿、瓜科植物、キャベツ、フウロソウ、ホウセンカおよびポインセチアについてのリゾクトニアソラーニ(Rhizoctonia solani)に対する保護作用が特に注目される。古典的な液滴顆粒剤の製造方法により（例えば、Connik W.J.："Formulation of living biologicalcontrol agents with alginate" in American Chemical S ociety,ACS Symposium Series 1988,Vol.371,pp.241-250;Fravel D.R.,Marois J .J.,Lumsden R.D.,Connik W.J.："Encapsulation of potential biocontrol age nts in alginate"およびPhytopathology,1985,Heft 75,S.774-777;Stormo K.E., Crawford R.L.:"Preparation of encpsulated micobial cells for environment al application"in Applied andEnvironmental Microbiology,1992,pp.727-730 ）、実質上不溶性でありかつ緩衝液にすらとりわけ非常にゆっくりと溶解する、微生物の放出が非常に遅いかもしくはまったくない顆粒剤が得られる。驚くことに、本発明の方法により調製された顆粒剤により、微生物の放出が非常に速くなることが見いだされた。顆粒剤は、ポリマーに依存して、０．５ないし数時間以上で緩衝液もしくは水中で分解する。即ち、ポリマー層は分離もしくは膨潤し、全ての微生物含量が２４時間以内に土壌に放出される。本発明の他の目的は、微粒子基材および微生物を含有するポリマー層よりなる顆粒剤であって、前記ポリマーはａ）皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーであって、かつ顆粒剤は前記顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％の水を含有するか、またはｂ）皮膜形成性、構造的に架橋した、カルボキシル基もしくはスルフェート基を含有しそして水中においてカリウムイオンの存在下膨潤し得るポリサッカライドであって、また顆粒剤は前記顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％の水を含有する顆粒剤の製造方法であって、（Ａ）顆粒ａ）を製造するために、皮膜形成性および水溶性ポリマーを、懸濁もしくは９５℃未満の温度において溶解し、そして室温にまで冷却した後に、微生物をこの懸濁液もしくは溶液中に懸濁させ、（Ｂ）顆粒ｂ）を製造するために、カルボキシル基含有もしくはスルフェート基含有ポリサッカライドをカリウムイオンを含有する水性緩衝液中に懸濁させ、そして微生物をこの溶液中に懸濁させ、（Ｃ）得られる懸濁液を微粒子基材上に直接噴霧するかまたは前記懸濁液を微粒子基材と混合し、そして（Ｄ）水を、顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％である濃度まで取り除くことよりなる製造方法を提供することである。皮膜形成性および水溶性ポリマーの懸濁液が顆粒剤ａ）の製造に使用される場合、前記懸濁液は好ましくは１０℃ないし３０℃の温度範囲において製造される。皮膜形成性および水溶性ポリマーの溶液を製造するための、温度範囲はポリマーの種類に依存して２５℃ないし９５℃である。微生物は４０℃未満の温度のポリマー懸濁液もしくは４０℃未満の温度、好ましくは３０℃未満の温度の冷却されたポリマー溶液のいずれかに加えられる。他の変法において、顆粒剤ｂ）は、カルボキシル基含有もしくはスルフェート基含有ポリサッカライドをカリウムイオンを含有する水性緩衝液中に、加熱した温度例えば７０℃において溶解させるか、または同一の方法によりお互いに反応し合う２種のポリマーを溶解させることにより製造される。熱可逆性ゲルはこの冷却された溶液から形成される。微生物の添加は凝固点の直前に４０℃未満の温度において行われる。緩衝液は、いずれかのカリウムを含有する多価酸の塩である。商業的に入手できるホスフェート緩衝液が特に好ましい。二水素化ホスフェートと一水素化ホスフェートのモル比に依存して、ｐＨは約６．５ないし約７．５に調製できる。好ましいｐＨは７である。緩衝液濃度は０．００００１Ｍ／リットルないし１Ｍ／リットル、最も好ましくは０．００５Ｍ／リットルないし０．０５Ｍ／リットルである。水は可能な限り穏やかな条件下において、好ましくは室温においてもしくは約３５℃までのわずかに高められた温度において取り除かれる。水を取り除くための装置、および方法はそれ自体知られている。最良の方法はプロセスに用いられるバッチの粘度に依存する。本発明の顆粒剤は、慣用の装置を用いる知られている方法により製造できる。成分を混合するための噴霧方法は、都合良くはコーティングのための、典型的には流動層リアクター(fluidised bed reactor)が使用される。この方法において、ポリマーおよび微生物の溶液もしくは懸濁液は、流動層中の基材上に噴霧されそして即座に乾燥される。他のプロセスの態様は、新規な顆粒剤を知られている押し出し方法により調製することよりなる。これは混合機中で全ての成分を必要量の水と混合しそして多孔性プレートから押し出すことよりなる。その後顆粒は所望のサイズに細かく砕かれそして乾燥される。単軸押出し機、グラニュレーター、サブグラニュレーター、多孔性プレート等が使用される。本発明のプロセスにより、微生物が分散しているポリマー薄層で基材をコートした顆粒剤が得られる。得られたものは通常不連続的にコートされた粒子ではないが、しかし塊状の多数のふぞろいの形状をした基材粒子である。選択した混合方法および乾燥方法に依存して、異なる形態の粒子が得られる。つまり、押出しプロセスにより、ペレット中の基材および微生物は各々独立してポリマー材料でコートされている円柱状のペレットが得られ、一方流動層中での噴霧方法により凝集物中で微生物を含有するポリマー薄層でコートされている凝集物が得られる。ポリマー薄層により微生物の特に速い放出が得られるので、この粒子形態が好ましい。本発明の顆粒剤はいかなる場合においても固体の、浮遊混合物であり、該混合物は散水顆粒として直接使用できる。それは取扱が単純かつ安全であるので、それを土壌施用のための機械装置に直接充填できる。施用率は、微生物のタイプに依存して１ｋｇないし２０ｋｇである。本発明の顆粒剤は、植物、植物の部分もしくは植物の生育地（果実、花、葉、茎、塊茎、根、土壌）、雑草の処理に使用され、そしてそこに発生する有害昆虫もしくは病気を阻害もしくは取り除く。顆粒剤を同時にもしくは後に他の化学的助剤と一緒に、処理されるべき領域もしくは植物に施用できる。他の化学的助剤は、微量元素ドナー並びに植物の成長に影響をもたらす他の助剤であってもよい。選択的除草剤並びに殺昆虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、なめくじ駆除剤もしくはそれらの混合物を使用してもよい。本発明はさらに病気の感染もしくは昆虫による損傷から植物を保護するための本発明の顆粒剤の使用に関する。対照は、農業および園芸の栽培植物および慣用植物、特に穀類、綿、野菜、ぶどうのつる、果実、油植物および花植物の病気に適している。特に重要な野菜作物の例は、瓜科植物、キャベツおよび豆、花植物、ポインセチア、ホウセンカである。本発明は以下の実施例により説明される。実施例Ａ１シュードモナスオウランチアカ（Pseudomonas aurantiaca），ATTC No.5516 9 を接種した１０×２５０ｍｌのルリアブロス（Luria Broth）を、加震機上で細胞を１６時間成長させた後に、遠心分離しそして該ペレットを０．０１Ｍのホスフェート緩衝液（Ｋ₂ＨＰＯ₄：ＫＨ₂ＰＯ₄＝１：０．７８、ｐＨ＝７）中に再び懸濁させて４０ｍｌの濃度とした。ホスフェート緩衝液１００ｍｌを７０℃まで加熱しそしてκ−カラジーナン０．７ｇを加えて０．０１Ｍホスフェート緩衝液中の０．７％のκ−カラジーナン溶液を調整した。この溶液を凝固点よりもわずかに高い温度まで冷却しそして微生物懸濁液と混合した。この混合物をその後、流動層中のバーミキュライト１００ｇ上に噴霧して、以下の成分の顆粒剤を得た。１６％の残留水１．５％の微生物、乾燥物８１．９％のバーミキュライト０．６％のκ−カラグレナン初期濃度は約１．１×１０¹⁰ＣＦＵ／ｇ（コロニー形成単位）であった。貯蔵安定性を評価するために、適当な間隔をおいて濃度を測定した。以下のデータが得られた。実施例Ａ２ κ−カラジーナン５ｇを０．０１Ｍのホスフェート緩衝液と一緒に攪拌した。その後５０リットルの発酵槽中で調製されたシュードモナスオウランチアカ（ Pseudomonas aurantiaca），ATTC No.55169 の細胞ペレット１０ｇを加えた。ポリマーおよび微生物物質を、バーミキュライト１２０ｇと同時に混合しそして押し出した。そのようにして得られた顆粒を、所望の水含量になるように流動層中で乾燥させた。以下の成分の顆粒剤を得た。１８％の残留水１．８％の微生物、乾燥物７７％のバーミキュライト３．２％のκ−カラグレナン初期濃度は約３．３×１０¹⁰ＣＦＵ／ｇ（コロニー形成単位）であった。貯蔵安定性を評価するために、適当な間隔をおいて濃度を測定した。以下のデータが得られた。実施例Ａ３シュードモナスオウランチアカ（Pseudomonasaurantiaca），ATTC No.55169 を接種した２５０ｍｌのルリアブロス（Luria Broth）を、加震機上で細胞を１６時間成長させた後に、遠心分離しそして該ペレットを実施例１に従って０．０１Ｍのホスフェート緩衝液中に再び懸濁させて４０ｍｌの濃度とした。微生物懸濁液を実施例２に従って０．０１Ｍホスフェート緩衝液中の３％のアルギン酸ナトリウム溶液１００ｍｌと混合しそして流動層中でバーミキュライト１００ｇ上に噴霧した。以下の成分の顆粒剤を得た。１２％の残留水０．５％の微生物、乾燥物８５．５％のバーミキュライト２．５％のアルギン酸ナトリウム初期濃度は約７．６×１０⁸ＣＦＵ／ｇ（コロニー形成単位）であった。シュードモナスオウランチアカ（Pseudomonasaurantiaca）,ATTC No.55169 の自然突然変異体を実施例Ａ４およびＡ５に従って使用した。変異体を以下のようにして得た。シュードモナスオウランチアカ（Pseudomonasaurantiaca）,ATTC No.55169を、０．００００５％リファンピシン（Rifampicin）を含有するルリア寒天（Luri a Agar）上に置きそして続いて耐性のある変異体を知られている方法で単離しそしてさらに培養した。そのようにして得られたリファンピシン耐性のある変異体を以下の実施例Ａ４およびＡ５に使用した。実施例Ａ４シュードモナスオウランチアカ（Pseudomonasaurantiaca），ATTC No.55169 を接種した２５０ｍｌのルリアブロス（Luria Broth）を、加震機上で細胞を１６時間成長させた後に、遠心分離しそして該ペレットを０．０１Ｍのホスフェート緩衝液中で再び懸濁させて実施例１に従って４２ｇの濃度とした。微生物懸濁液を同量のポリビニルアルコール（Mowiol４０ないし８８、１６％）と混合しそして流動層中でバーミキュライト１００ｇ上に噴霧した。以下の成分の顆粒剤を得た。１０％の残留水０．５％の微生物、乾燥物８４％のバーミキュライト５．５％のポリビニルアルコール初期濃度は約１．１×１０⁹ＣＦＵ／ｇ（コロニー形成単位）であった。実施例Ａ５シュードモナスオウランチアカ（Pseudomonas aurantiaca）,ATTC No.55169 を接種した２５０ｍｌのルリアブロス（Luria Broth）を、加震機上で細胞を１６時間成長させた後に遠心分離しそしてペレットを実施例１に従って０．０１Ｍのホスフェート緩衝液中に再び懸濁させて４０ｍｌの濃度とした。微生物懸濁液を実施例２に従って０．０１Ｍホスフェート緩衝液中の３％のκ−カラジーナン１００ｍｌと混合しそしてバーミキュライト１００ｇ上に噴霧した。以下の成分の顆粒剤を得た。１２％の残留水０．５％の微生物、乾燥物８５％のバーミキュライト２．５％のκ−カラジーナン初期濃度は約１．１×１０⁹ＣＦＵ／ｇ（コロニー形成単位）であった。実施例Ａ６ ι−カラジーナン８ｇを０．０１Ｍホスフェート緩衝液４０ｍｌと攪拌した。その後、リチャード媒体（Richard's medium）上の５０リットル発酵槽で１２０時間発酵させた、遠心分離したFusarium nygamaiの胞子を加えた。ポリマー−微生物混合物をバーミキュライト粉末と一緒に均一に混合しそして押し出した。そのようにして得られた顆粒剤を流動層中で乾燥させて所望の水含量とした。以下の成分の顆粒剤を得た。１３％の残留水０．５％の微生物、乾燥物８１％のバーミキュライト５．５％のι−カラジーナン実施例Ｂ１：生物学的防除実施例Ａ１において製造された顆粒剤の生物学的活性を、室温の温室条件下における特定の貯蔵時間後に測定した。標準試験条件は、以下に示される。栽培植物：綿病原体：リゾクトニアソラーニ（Rhizoctoniasolani) 顆粒剤を１６ｇ／鉢物質１リットルの量で鉢物質に加えた。室温において１０カ月貯蔵した後に、生物学的活性の減少は観察されなかった。

Claims

【特許請求の範囲】１．微粒子基材および微生物を含有するポリマー層よりなる顆粒剤であって、前記ポリマーはａ）皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーであって、かつ顆粒剤は前記顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％の水を含有するか、またはｂ）カルボキシル基もしくはスルフェート基を含有しそして水中においてカリウムイオンの存在下膨潤し得る皮膜形成性、構造的に架橋したポリサッカライドであって、また顆粒剤は前記顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％の水を含有する顆粒剤。２．前記顆粒剤１ｋｇに基づいて、０．１ないし１０重量％の微生物を含有するところの請求項１記載の顆粒剤。３．前記顆粒剤１ｋｇに基づいて、０．３ないし５重量％の微生物を含有するところの請求項１記載の顆粒剤。４．前記顆粒剤１ｋｇに基づいて、０．５ないし３重量％の微生物を含有するところの請求項１記載の顆粒剤。５．前記顆粒剤の１ｇ当たり、１×１０⁵ないし１×１０¹¹ＣＦＵ（colony form ing units: コロニー形成単位）の集団密度の微生物を含有するところの請求項１記載の顆粒剤。６．前記顆粒剤に基づいて、残留水含量は少なくとも１重量％であるところの請求項１記載の顆粒剤。７．前記顆粒剤に基づいて、残留水含量は少なくとも３重量％であるところの請求項１記載の顆粒剤。８．前記顆粒剤に基づいて、残留水含量は少なくとも５重量％であるところの請求項１記載の顆粒剤。９．前記顆粒剤に基づいて、最大の水含量は少なくとも４０重量％であるところの請求項１記載の顆粒剤。１０．微粒子基材は１μｍないし０．８ｃｍの平均粒子サイズを有するところの請求項１記載の顆粒剤。１１．微粒子基材は１０μｍないし０．５ｃｍの平均粒子サイズを有するところの請求項１記載の顆粒剤。１２．微粒子基材は２０μｍないし０．２ｃｍの平均粒子サイズを有するところの請求項１記載の顆粒剤。１３．水不溶性基材は無機もしくは有機材料であるところの請求項１記載の顆粒剤。１４．水不溶性基材は細かく砕かれたブランストロー（bran．straw）、おがくずもしくはセルロースであるところの請求項１３記載の顆粒剤。１５．無機基材は水不溶性金属酸化物、金属塩（ＳｉＯ₂、Ａｌ₂Ｏ₃、ＢａＳＯ₄ 、ＣａＣＯ₃）、アルカリ金属およびアルカリ土類金属のシリケートもしくはアルミノシリケートであるところの請求項１３記載の顆粒剤。１６．水不溶性基材は鉱物粘土、アタパルジャイト、多孔質珪藻土、粉末状生石灰、珪藻土、珪灰石、かんらん石、モンモリロナイトもしくはバーミキュライトであるところの請求項１５記載の顆粒剤。１７．水不溶性基材はバーミキュライトであるところの請求項１５記載の顆粒剤。１８．前記顆粒剤に基づいて、基材の量は５０ないし９９重量％であるところの請求項１記載の顆粒剤。１９．前記顆粒剤に基づいて、基材の量は６５ないし９９重量％であるところの請求項１８記載の顆粒剤。２０．前記顆粒剤に基づいて、基材の量は７５ないし９９重量％であるところの請求項１記載の顆粒剤。２１．０．０１ないし８ｍｍの平均粒子サイズを有するところの請求項１記載の顆粒剤。２２．０．２ないし４ｍｍの平均粒子サイズを有するところの請求項２１記載の顆粒剤。２３．０．５ないし２ｍｍの平均粒子サイズを有するところの請求項２１記載の顆粒剤。２４．皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーは合成もしくは天然ポリマーであるところの請求項１記載の顆粒剤。２５．皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーはポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールもしくはポリビニルピロリドンのホモポリマーもしくはコポリマー並びにポリアクリルアミドであるところの請求項１記載の顆粒剤。２６．皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーはポリサッカライドもしくは誘導されたポリサッカライドであるところの請求項１記載の顆粒剤。２７．皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーはスターチ、アルギン酸塩、カラジーナン、κ−カラジーナン、ι−カラジーナン、キサンテン、イナゴマメガム(locust beam gum)もしくはメチルセルロース、またはそれらの混合物であるところの請求項２６記載の顆粒剤。２８．皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーは、κ−カラジーナン、ι−カラジーナンもしくはアルギン酸塩であるところの請求項２７記載の顆粒剤。２９．皮膜形成性、構造的に架橋した、水−膨潤性、カルボキシル基含有もしくはスルフェート基含有ポリマーは、κ−カラジーナン、ι−カラジーナン、キサンテン、またはイナゴマメガム(locust beam gum)とキサンテンの混合物であるところの請求項１記載の顆粒剤。３０．皮膜形成性、構造的に架橋した、水膨潤性、カルボキシル基含有もしくはスルフェート基含有ポリマーは、κ−カラジーナンもしくはι−カラジーナンであるところの請求項１記載の顆粒剤。３１．前記顆粒剤に基づいて、０．１ないし２０重量％の量で水溶性もしくは水膨潤性ポリマーを含有するところの請求項１記載の顆粒剤。３２．カリウムイオンとポリマーのカルボキシル基もしくはスルフェート基のモル比が０．００１：１ないし１：１であるところの請求項１記載の顆粒剤。３３．微生物がリゾビウム(Rhizobium spp.,)、メタリジウム(Metharizium)、フザリウム(Fusarium)、トリコデルマ(Trichoderma)、ストリプトマイス（Stryptomyces）、グリオクラジウム(Gliocladium)、ペニシリン（Penicillium,）、タラノマイス（Talaromyces,）、ベルティシリウム目コレトトリチャム（Verticillium oder Colletotrichum）、シュードモナス（Pseudo monas spp.，）、セラチア（Serratia spp.,）、エキセロヒウム（Exserohium s pp.,）、バチルス（Bacilus spp.,）、アグロバクテル(Agrobabcter spp.,)、エンテロバクテル（Enterobacter spp．）およびシュードモナスオウランチアカ（Pseudomonas aurantiaca）ATTC No.55169 よりなる群より選択された請求項１記載の顆粒剤。３４．微生物はシュードモナスオウランチアカ（Pseudomonas aurantiaca）AT TC No.55169 であるところの請求項１記載の顆粒剤。３５．微粒子基材および微生物を含有するポリマー層よりなる顆粒剤であって、前記ポリマーはａ）皮膜形成性、水溶性および本質的に未架橋のポリマーであって、かつ顆粒剤は前記顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％の水を含有するか、またはｂ）皮膜形成性、構造的に架橋した、カルボキシル基もしくはスルフェート基を含有しそして水中においてカリウムイオンの存在下膨潤し得るポリサッカライドであって、また顆粒剤は前記顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％の水を含有する顆粒剤の製造方法であって、（Ａ）顆粒ａ）を製造するために、皮膜形成性および水溶性ポリマーを、懸濁もしくは９５℃未満の温度において溶解し、そして室温にまで冷却した後に、微生物をこの懸濁液もしくは溶液中に懸濁させ、（Ｂ）顆粒ｂ）を製造するために、カルボキシル基含有もしくはスルフェート基含有ポリサッカライドをカリウムイオンを含有する水性緩衝液中に懸濁させ、そして微生物をこの溶液中に懸濁させ、（Ｃ）得られる懸濁液を微粒子基材上に直接噴霧するかまたは前記懸濁液を微粒子基材と混合し、そして（Ｄ）水を、顆粒剤に基づいて少なくとも０．５重量％である濃度まで取り除くことよりなる製造方法。３６．皮膜形成性および水溶性ポリマーの懸濁液が顆粒剤ａ）の製造に使用される場合、前記懸濁液は好ましくは１０℃ないし３０℃の温度範囲において製造されるところの請求項３５記載の製造方法。３７．皮膜形成性および水溶性ポリマーの懸濁液が顆粒剤ａ）の製造に使用される場合、前記懸濁液は好ましくは２５℃ないし９５℃の温度範囲において製造されるところの請求項３５記載の製造方法。３８．微生物を４０℃未満の温度においてポリマーの溶液もしくは懸濁液に加えるところの請求項３５記載の製造方法。３９．微生物を３０℃未満の温度において加えるところの請求項３５記載の製造方法。４０．緩衝液は燐酸水素カリウムおよび燐酸一水素カリウムの混合物であるところの請求項３５記載の製造方法。４１．溶液もしくは懸濁液のｐＨは７であるところの請求項４０記載の方法。４２．緩衝液濃度は０．００００１Ｍ／リットルないし１Ｍ／リットルであるところの請求項３９記載の方法。４３．病気の感染もしくは昆虫による損傷から植物を保護するための顆粒剤の使用。