JPH01235595A

JPH01235595A - 発酵法によるアミノ酸の製造法

Info

Publication number: JPH01235595A
Application number: JP5979488A
Authority: JP
Inventors: Kazumi Araki; 和美荒木; Junko Shimomura; 下村　順子
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1988-03-14
Filing date: 1988-03-14
Publication date: 1989-09-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、食品、医薬品として有用なＬ−グルタミン酸
、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシンの製
造法に関し、その特徴は、メタノール資化性細菌で温度
感受性を有する変異株を用いろことにある。

従来の技術メタノール資化性を有する微生物を、メタノールを主炭
素源とする培地を用いて培養することにより、アミノ酸
を製造する方法は種々知られている。Ｌ−グルタミン酸
のＩＪａ造法としては、アクロモバクタ−属、シュード
モナス属の細菌を用いる方法（特公昭４５−２５２７３
）　、バチルス属、ブレビバクテリウム属、ミクロコツ
カス属、セラチア属の細菌を用いる方法（特公昭４８−
９８０９２）　、プロタミノバクタ−属、ミクロサイク
ラス属、セラチア属の細菌を用いる方法（特公昭４９−
３４８３７．同４９−３４８３４）、シュードモナス属
およびプロタミノバクタ−属の栄養要求性変異株を用い
る方法（特開昭５Ｏ−４０７８６）、メチロモナス属細
菌を用いる方法（特開昭５Ｏ−８９５９１）などが知ら
れている。また、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリンの製造
法としては、アクロモバクタ−属またはシュードモナス
属の細菌を用いる方法（特公昭４５−２５２７３）　、
プロタミノバクタ−属の細菌を用いる方法（特公昭４９
−１２５５９０）、ピキア属酵母を用いる方法（特公昭
５５−３８１１６）　、メチロモナス属細菌を用いる方
法（特公昭５６−１９１２）などが知られている。Ｌ−
ヒスチジンについては、ハイフォミクロビウム属細菌で
微量のし一ヒスチジンを分泌することが知られている（
特公昭５６−１００３４）。

しかし、メタノール資化性菌から誘導した温度感受性変
異株によるアミノ酸の製造法については、これまで全く
報告がない。

発明が解決しようとする課題従来知られているメタノールを主炭素源とする培地を用
いた発酵法によるアミノ酸の製造法は、発酵収率が低く
、生産性もまだまだ満足すべきものではない。従って、
工業的に安価にアミノ酸を製造する方法の開発は、常に
求められている。

課題を解決するための手段本発明者は、メタノール資化性細菌であるメチロバチル
ス属細菌から誘導した温度感受性変異株の中に、著量の
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌｔ＜リンまたは
Ｌ−ロイシンを蓄積する能力を有する変異株を見出し本
発明を完成した。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、メチロバチルス属に属し、温度感受性でかつ
アミノ酸生産能を有する微生物を、メタノールを主炭素
源とする培地に培養し、培養物中にアミノ酸を生成ａｇ
４させ、該培養物から該アミノ酸を採取することを特徴
とする発酵法によるアミノ酸の製造法を提供する。

該アミノ酸としては、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジ
ン、Ｉ、−バリンまたはＬ−ロイシンがあげられる。

本発明に使用する微生物は、メチロバチルス属に属し、
温度感受性でかつアミノ酸生産能、例えばＬ−グルタミ
ン酸生産能、Ｌ−ヒスチジン生産能、Ｌ−バリン生産能
またはＬ−ロイシン生産能の向上した変異株であれば、
いずれの変異株でもよい。温度感受性変異株とは、通常
の生育温度、例えば２８℃では親株と同等に生育するが
、高温条件下、例えば４２℃では生育しないかまたは親
株と比較して明らかに生育の劣る変異株をいう。

これらの変異株は、例えばメチロバチルス・グリコゲネ
スＡＴＣＣ２１２７６株を親株として常法に従って変異
処理を施し、これに温度感受性を付与することによって
容易に得ることができる。

メチロバチルス・グリコゲネスＡＴＣＣ２１２７６株は
、元来シコードモナス・インスエタ＾ＴＣＣ２１２７Ｇ
として、特公昭４５−２５２７３において使用された菌
株であるが、本明細書では、最近の分類学的研究〔イン
ターナショナル・ジャーナル・オブ・システラティック
０バクテリオロジイ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、３６　　、　５０２〜５１１（
１９８６）　　〕にもとづいて、メチロバチルス属細菌
と改称して記載している。

上記のようにして得られる温度感受性変異株を、メタノ
ールを主炭素源とする培地で培養し、Ｌ−グルタミン酸
、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシンの生
産能が親株より向上した変異株を選択して本発明に使用
する。

次に、これらの変異株を得る具体例を説明する。

メチロバチルス・グリコゲネス＾ＴＣＣ２１２Ｔ６　（
野生株）を常法によって、Ｎ−メチル−Ｎ′−二トロー
Ｎ−ニドＸ１ソゲ了ニシン３００ｕｇ／ｍｌで変異処理
し、そＱ）細胞懸濁液を最少寒天培地〔メタノール０．
５％（ｖ／ｖ）、　（ＮＨ−＞２ｓｏ、　０．２　ｇ／
ｄｉ。

Ｋｌ（、ＰＯ，Ｏ，ｌ　ｇ／ｄｉ、　Ｋ２ＨＰ０．０．
７　ｇ／ａ。

ＮａＣＲＯｌｏ　１　ｇ／ｄ１．　Ｍｇ　Ｓｏ＜・７　
ＨａＯｏ、　０５　ｇ／ａ、チオ尿素０．　Ｏｌ　ｇ　
／　ａ、　Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ４・７　ｔＬ２０　１０ｍｇ
／　Ｉｌ、　Ｍｎ　ＳＯ，・４　Ｈ２Ｏ８ｓｇ　／　１
　、サイアミン・ＨＣｌ１１ｍｇ／Ｌ　ビオチン５０．
ｕｇ／Ｌ寒天２ｇ／ａ（ＮａＯＨでｐｔｉ７．２に調整
）〕に、平板当り３００〜１０００個のコロニーが発現
するように希釈して塗抹し、２８ｔの温度条件下で１〜
２日間静置培養した。

小さなコロニーが発現したところで平板を４２℃の温度
条件下に移して、さらに３〜４日間培養を続けた後、小
フＤニーのみを約９００個釣菌した。

これらを、上記と同じ最少寒天培地に１株につき２枚ず
つの寒天平板に塗抹して、各々を２８℃と４２℃の両方
で培養し、２８℃では親株と同等に生育するが、４２℃
では生育しないかもしくは親株と比較して明らかに生育
の劣る変異株を約６０株分能した。これらの温度感受性
変異株を、後述の実施例１に示したのと同様の培養条件
下でｊ８養を行った結果、親株と比較して著量のアミノ
酸を蓄積する変異株が多数見出された。そのうちの代表
的な４株を選択した。

このようにして分離した温度感受性変異株は、それぞれ
、メチロバチルス・グリコゲネスＮα４５（Ｌ−グルタ
ミン酸生産能の向上した変異株）、メチｒ】バチルス・
グリコゲネス〜α１２（Ｌ−ヒスチジン生産菌）、メチ
ロバチルス・グリコゲネスＮｕ１６（Ｌ−バリン生産能
の向上した変異株）、メチロバチルス・グリコゲネスＮ
α３６（Ｌ−ロイシン生産能の向上した変異株）として
、工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に昭和６
３年３月９日付でＦＥＲＭ　Ｂｌ’４７９０、ＦＥＲＭ
　ＢＰ−１７８７、ＦＥＲＭＢＰ−１７８８、ＦＥＲＩ
Ｊ　ＩＩＩＰ−１７８９として寄託されている。

本発明に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機
物その他使用菌の必要とする微量の栄養物を程よく含有
するものであれば、天然培地１合成培地のいずれもが使
用可能である。

炭：Ｊ？、源としては、メタノール、メタノールアミン
などが使用できる。その他、糖類、有機酸類。

他のアルコール類など使用菌の利用可能なものならば、
！ｐ、−あるいは混合して使用してもよい。

窒素源としては、塩化アンモニウム、アンモニア水、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウトなどのアンモ
ニウム化合物、尿素、ペプトン、肉エキス、コーン・ス
チーブ・リカー、カゼイン加水分解物、大σ粕加水分解
物などの天然物由来の窒素含有物などが使用できる。

無機物としては、リン酸第−カリウト、リン酸第二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄
、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウドなどが使用できる
。使用菌が栄養要求性を持つ場合には、これらの物質を
適量培地に添加する。

微生物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源などは
、前記したような他の培地成分によって培地に供給され
れば特に加えなくてもよい。

培養温度は２０〜５０℃で振盪培養または通気攪拌培養
などの好気的条件下でｌ〜８日間培養する。培養終了後
、培養物より蓄積したアミノ酸を採取するには、イオン
交換樹脂法などの常法が用いられる。

以下に実施例を示す。

実施例！メタノール２０ｍ１．　　（ＮＨＩ＞２ＳＯ４８ｇ。

Ｋ）Ｉ２ＰＯ，ｌ　ｇ、ＮａＣｆ　　１　ｇ、Ｍｇ５Ｏ
＊・７Ｈ２０１］、４ｇ、　　　Ｆｅ５０．　　・　　
７Ｈ２０１０ｍｇ。

Ｍｎ５Ｏ１・４Ｈ２０１０ｍｇ、サイアミン・Ｈ（１１
ｍｇ、ビオチン５０μｇ、コーン・スチーブ・リカー３
ｇ、フェノール　レッド　１０ｍｇ、ＣａＣＣＬ２％を
水で１１とした組成の種培地（ｐＨ７，２）３ｍｌを含
む試験管（１６ｍ＋ａＸ　ｌ　６０ｍｍ）にメチロバチ
ルス・グリコゲネスＮα４５（Ｌ−グルタミン酸生産菌
）、メチロバチルス・グリコゲネスＮα１２（Ｌ−ヒス
チジン生産菌）、メチロバチルス・グリコゲネスＮ（１
１６（Ｌ−バリン生産菌）、メチロバチルス・グリコゲ
ネスＮα３６（Ｌ−ロイシン生産菌）をそれぞれｌエー
ゼ宛接種し、３０℃で、２１０ｒｐｍの振盪条件下で２
１〜間振盪培養した。得られた種培養液を、Ｌ記の種培
地と同一組成の培地２０ｍ１を含む邪魔板付の３００ｍ
１容三角フラスコに２ｍｌｍｌ挿接、３０℃で２１　Ｏ
ｒｐｍの振盪条件下で振盪培養した。培養１６時間目に
２％（Ｖ／Ｖ）のメタノールを流加して、合計４８時間
培養した。

対照として、親株であるＡ　Ｔ　ＣＣ２１２７６株も同
様に培養した。

その結果、培養物中には親株の＾ＴＣ［：　２１２７６
株ではＬ−グルタミン酸が１．２　ｍｇ／ｍｌ、　Ｎｎ
４５株ではＬ−グルタミン酸が６．７ｍｇ／ｍｌ、Ｎｎ
１２株ではＬ−ヒスチジンが０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｎｎ１
６株ではＬ−バリンが１．１ｍｇ／ｍｌ、Ｎｎ３６株で
はＬ−ロイシンが１．５＋ｎｇ／ｍｌそれぞれ蓄積した
。

実施例２メタノール２０ｍ１１　（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ。

ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、Ｋ　　２ＨＰｏ　　４　２．５ｇ、
Ｍｇ５Ｏｎ　　・７ｔｌａ００．５　ｇ、　　Ｆ　ｅ　
ＳＯａ・７Ｈ２０２５ｍｇ。

Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏａ　・４　Ｈ２０８ｍｇ、サイアミン・
ＨＣｌ２２ｍｇ、ビオチン５０μｇ、ペプトン１０ｇを
ｉｆの水に含む組成のｊΔ地（ｐＨ７，２）２．７１を
５ｆ！容ジャーファーメンタ−に分注し、これに実施例
１と同様の方法で１１られたメチロバチルス・グリコゲ
ネスに４５の４１ｉ培養３００ｍ１を接種し、４５０　
ｒｐｍの回転数、３β／ｍｉｎの通気条件下で３０℃で
通気攪拌培養を行った。培養中アンモニア添加によって
ｐＨを６．８に維持し、培養開始ｌＯ時間目から４６時
間目までの間にメタノールを１時間当り０４〜０．５％
（Ｖ／Ｖ）の割合で添加し、合計６２時間培養した。そ
の結果、培養物中には３４．５ｍｇ／ｍｌのし一グルタ
ミン酸が蓄積した。対照として同様に培養した親株＾Ｔ
ＣＣ２＋２７６株は、３．２ｍｇ／ｍｌのし一グルタミ
ン酸しか蓄積しなかった。

発明の効果本発明によれば、メタノールを主炭素源とする培地を用
いて、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、し−バリン
、Ｌ−ロイシンを収率よ（製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）メチロバチルス属に属し、温度感受性でかつアミ
ノ酸生産能を有する微生物を、メタノールを主炭素源と
する培地に培養し、培養物中にアミノ酸を生成蓄積させ
、該培養物から該アミノ酸を採取することを特徴とする
発酵法によるアミノ酸の製造法。
（２）該アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン
、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシンから選ばれる特許請求
の範囲第１項記載の方法。