JPS5923796B2

JPS5923796B2 - Ｌ−セリンの製造法

Info

Publication number: JPS5923796B2
Application number: JP15666376A
Authority: JP
Inventors: 一郎千畑; 年雄柿本; 正弘江馬
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1976-12-24
Filing date: 1976-12-24
Publication date: 1984-06-05
Also published as: JPS5381691A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はＬ−セリンの製法に関し、更に詳しくは微生物
の生産するＬ−セリントランスヒドロキシメチラーゼを
利用してＬ−セリンを製造する方法ζこ関する。

Ｌ−セリントランスヒドロキシメチラーゼ（Ｌ−セリン
テトラヒドロフオレート５．１０−ヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼ、Ｅ、Ｃ。

２．１．２．１）はグリシンとホルムアルデヒドからテ
トラヒドロ葉酸を補酵素としてＬ−セリンを生成せしめ
る酵素、換言すればグリシンと５゜１０−メチレンテト
ラヒドロ葉酸とからＬ−セリンを生成せしめる酵素であ
る。

この酵素は哺乳動物、鳥類のものについては古くから知
られているが、微生物ではカビ、酵母及びクロスｌ−Ｉ
Ｊデイウム属、エセリシア属、サルモネラ属、シュード
モナス属に属する細菌にその存在が知らえているにすぎ
なかった。

また、近年ブレビバクテリウム属、アルスロバクタ−属
、コリネバクテリウム属、ノカルジア属などの細菌や放
線菌を用いて、発酵法によりグリシンからＬ−セリンを
製造する方法が発表されている（特公昭４６−３２７９
３号、同５１−６２３６号、同５１−６２３９号、同５
１−９３９１号等）。

しかしながら、この酵素を利用して著量のＬ−セリンを
生成せしめたという報告はない。

本発明者らは酵素法によりＬ−セリンの製造法について
鋭意研究を重ねた結果、サルシナ属、シュードモナス属
およびミクロバクテリウム属に属する微生物がＬ−セリ
ントランスヒドロキシメチラーゼを生成する能力に優れ
ており、かつ該微生物の培養液、生菌体もしくは菌体処
理物をグリシンと５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸
もしくは反応液中に５，１０−メチレンテトラヒドロ葉
酸を生成せしめる物質とに作用せしめることにより、Ｌ
−セリンが著量蓄積されることを見い出し、本発明を完
成するに至った。

本発明に用いられるＬ−セリントランスヒドロキシメチ
ラーゼ生産能布する微生物としては、例えばサルシナ・
アルビダＩＡＭ１０１２、サルシナ・マルギネータＩＡ
Ｍ１１３０．シュードモナス・サツ力ロフイラＡＴＣＣ
９１１４、ミクロバクテリウム”５ｐ−ＡＴＣＣ２１３
７６、ミクロバクテリウム・フラバムＩＡＭ１６４２な
どが好適に挙げられる。

これらの微生物を培養するための培地は、炭素源、窒素
源、無機物および必要により他の栄養物を程よく含有す
る培地であれば、合成培地、天然培地のいずれも使用で
きる。

培地に使用する炭素源としては、例えばグルコース、シ
ュクロース、デキストリンなどの炭水化物、グリセロー
ルの如き多価アルコール、酢酸、フマール酸、クエン酸
などの有機酸などが使用され、その量は通常培地中０．
１〜１０％程度が適当である。

窒素源としては、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩
、尿素その他の窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母
エキス、コーンスチープリカー、脱脂大豆軸またはその
消化物などの天然物窒素源などが使用され、その量は通
常無機アンモニウム塩や窒素化合物については０．５〜
２係程度が適当であり、天然物窒素源については０．５
〜５係程度が適当である。

無機物としては、例えばリン酸第−カリウム、リン酸第
二カリウムなどのリン酸塩が０．５〜１チ程度の量で使
用され、更に硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第
一鉄などが適宜使用される。

また使用微生物が生育のために他の栄養素を必要とする
場合には、当然その要求を満足させる栄養素を培地に添
加しなければならないが、この栄養素は窒素源として使
用される天然物中に含まれて添加される場合もある。

尚、上記組成培地にグリシンを０．１〜１％程度含有せ
しめれば、Ｌ−セリントランスヒドロキシメチラーゼの
生成を助長せしめることが出来、酵素反応に際して一層
好ましい効果が期待できる。

培養は振とう培養の如き好気的条件下、２５〜３７°Ｃ
で行なうのが好ましい。

かくして得られる培養液、該培養液から遠心分離等によ
り採取した生菌体、或いは菌体処理物（例えば菌体磨砕
物、菌体の自己消化液、菌体の超音波処理物、菌体抽出
液、該抽出液より得られた酵素区分）などを酵素標品と
して利用することができる。

か５る酵素標品をグリシンと５，１０−メチレンテトラ
ヒドロ葉酸もしくは反応液中に５，１〇−メチレンテト
ラヒドロ葉酸を生成せしめうる物質とに作用させること
によりＬ−セリンが生成される。

本酵素反応を行なうにあたり、反応系中に添加する物質
は、酵素標品の種類によって適宜選択される。

例えば酵素標品として培養液や該培養液から分離した生
菌体を用いる場合、これらの酵素標品はＬ−セリントラ
ンスヒドロキシメチラーゼ活性以外に、通常ホルムアル
デヒドから５゜１０−メチレンテトラヒドロ葉酸を生成
せしめる能力、或いはグリシンからホルムアルデヒドを
経て５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸を生成せしめ
る能力を有しているので、反応系に添加する物質はグリ
シンと５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸との組合せ
、或いはグリシンとホルムアルデヒドとテトラヒドロ葉
酸との組合せを用いる代りに、グリシンとホルムアルデ
ヒドとの組合せを用いてもよく、或いはグリシンのみを
単独で用いてもよい。

一方、酵素標品として菌体処理物を用いる場合、該酵素
標品は通常ホルムアルデヒドから５．１０−メチレンテ
トラヒドロ葉酸を生成せしめる能力、或いはグリシンか
らホルムアルデヒドを経て５．１０−メチレンテトラヒ
ドロ葉酸を生成せしめる能力を有していないか、或いは
有していても極めて弱いので、反応系に添加する物質は
グリシンと５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸との組
合せ、或いはグリシンとホルムアルデヒドとテトラヒド
ロ葉酸との組合せを用いる必要がある。

グリシンの使用濃度は特に制限されないが、一般に１〜
１０係程度が好ましい。

またホルムアルデヒドを用いる場合その使用濃度は酵素
標品の種類によっても異なるが、通常０．０１〜１０；
ｂ程度が好ましい。

更にテトラヒドロ葉酸を用いる場合その使用量は０．１
〜１０ｍＭ程度が好ましい。

本発明の酵素反応はｐＨ６〜９程度において、温度２０
〜５０℃程度で、静置、振とうもしくはかく押下に行な
うのが好ましい。

尚、反応系にピリドキサールリン酸を０．０１〜１ｍＭ
程度添加しておけば反応が高められることがある。

反応液中に生成したＬ−セリンの単離は、イオン交換樹
脂法の如き常法により容易に行なうことができる。

生成したＬ−セリンの確認はペーパークロマトグラム上
のニンヒドリン発色法および過ヨウ素酸酸化法により行
なった。

また定量はロイコノストック・メセンテロイデスＰ−６
０によるバイオアッセイ法により行なった。

参考例ＩＬ−セリントランスヒドロキシメチラーゼ活性の測定デキストリン２％、酵母エキス０．５％、塩化アンモニ
ウムｉ、ｏ％、リン酸第−カリウム０．１％、リン酸第
二カリウムｏ、１％、硫酸マグネシウム・７水和物０．
０１％、硫酸マンガン・４〜６水和物０．００１％、硫
酸第一鉄・７水和物０．０００１係、ビオチン０．００
０５％、グリシン０．２％から成る組成の培地（ｐＨ
７，０）１００ＴＬｌを入れた５００ｒｆＬｌ容坂ロ
フラスコに、下記第１表に示す微生物を一白金耳接種し
、３０℃にて２４時間振とう（１４０ｃｐｍ、７ｃｒｒ
Ｌストローク）培養した。

培養液から菌体を集め、生理食塩水で２回洗浄した。

この菌体をｐＨ７，０の２Ｘ１０−３ＭＩＪン酸カリ緩
衝液にけん濁し、０℃で５分間超音波処理もしくはダイ
ン・ミルにより破砕処理した。

この処理液を遠心分離（１０，００１，１０分間、０℃
）し、その上澄液を酵素標品さし、Ｋ、Ｇ、Ｓｃｒｉｍ
ｇｅｏｕｒ、Ｆ−Ｍ−Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓの方法〔メ
ソッド・イン・エンザイモロジー、Ｖｏｌ−５，ｐ８３
８（１９６２）参照〕に準じてＬ−セリントランスヒド
ロキシメチラーゼ活性を測定した。

１分間にｌｎｍｏｌｅの基質（ホルムアルデヒド）を減
少せしめる活性を１単位としたところ、培養液１ｒＩＬ
ｌ当りの活性は下記第１表に示す通りであった。

実施例１グルコース２係、酵母エキス０．５％、硫酸アンモニウ
ム１．２３％、リン酸第−カリウム０．１％、ン酸第二
カリウムｏ、１％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０
１％、硫酸マンガン・４〜６水和物ｏ、ｏｏｉ係、硫酸
第一鉄・７水和物０．０００１％、ビオチンＯ，０Ｏ０
５％、グリシン０．２％から成る組成の培地（ｐＨ７，
ｏ）１２０ｍｌを入れた５００ｒＩｌｌ容坂ロフラ
スコに、サルシナ・アルビダＩＡＭ１０１２を１白金耳
接種し、３０℃にて１８時間振とう（１４０ｃｐｍ、
７ｃｒｎストローク）培養した。

培養液を遠心分離し菌体を集め、これをグリシン３．６
，９゜ホルムアルデヒド１８〜および１０ｍＭピリドキ
サールリン酸０．４ｍｌを含有する水溶液１２０ＴＬｌ
に添加し、３０°Ｃにて４２時間振とうしながら反応を
行なったところ、反応液中にＬ−セリンが３８９■蓄積
していた。

菌体を除去し、ｐＨを塩酸にてｐＨ２，０とし、アンバ
ーライトＩＲ−１２０樹脂に導通した。

水および０．０５Ｎ塩酸で充分カラムを洗浄後、０．２
Ｎ塩酸で溶出したし一セリン区分を濃縮することにより
、Ｌ−セリンの結晶２７０ｍ９を得た。

実施例２実施例１においてグリシン、ホルムアルデヒドおよびピ
リドキサールリン酸を含有する水溶液の代りに、グリシ
ン３．６ｇを含有する水溶液１２０罰を用い、実施例１
と同様に酵素反応させた。

反応液中ｌこおけるＬ−セリン蓄積量は１９５１ｎ９で
あった。

実施例３サルシナ・アルビダＩＡＭＩ０１２を実施例１と同様に
培養した。

培養液１２０１１Ｌｌｌこグリシン３．６ｇおよびホル
ムアルデヒド１８〜を添加し、’ｐＨを塩酸（こて６．
０に調整後、３０℃にて４０時間振とうしながら反応さ
せた。

反応液中ζこおけるＬ−セリン蓄積量は１．９０〜／ｍ
１３であった。

実施例４グリセロール５係、酵母エキス０．５％、硫酸アンモニ
ウム１２３％、リン酸第−カリウム０．１％、リン酸第
二カリウムｏ、１％、硫酸マグネシウム・７水和物０．
０１％、硫酸マンガン・４〜６水和物０．００１係、硫
酸第一鉄・７水和物ｏ、ｏｏｏｉ％、ビオチン０．００
０５％、グリシン０．２％の組成の培地（１）Ｈ７，Ｏ
）１２０ＴＬｌを入れた５００ＴＬｌ容坂ロフラスコ
に、サルシナ・アルビダＩＡＭ１０１２を１白金耳液種
し、３０℃にて４８時間振とう培養した。

培養液を遠心分離して菌体を集め、下記第２表の組成を
含有する水溶液１２０ｍ１に添加し、３０℃にて４２時
間振とうしながら反応させた。

反応液中に生成したＬ−セリンの量は下記第２表に示す
通りである。

実施例５実施例１の培養方法において、炭素源および窒素源を下
記第３表に示した組成に変えた培地に各微生物を培養し
、実施例１と同様の方法で酵素反応させたところ、反応
液中に生成蓄積したＬ−セリン量は下記第３表の通りで
あった。

Claims

【特許請求の範囲】１サルシナ属、シュードモナス属またはミクロバクテ
リウム属に属し、Ｌ−セリントランスヒドロキシメチラ
ーゼ生産能を有する微生物の培養液。生菌体もしくは菌体処理物の存在下、グリシンと５．１
０−メチレンテトラヒドロ葉酸とを反応させることを特
徴とするＬ−セリンの製造法。２５．１０−メチレンテトラヒドロ葉酸が、該微生物
の培養液もしくは生菌体によりホルムアルデヒドから反
応液中に生成せしめられたものである特許請求の範囲第
１項記載の製造法。３５．１０−メチレンテトラヒドロ葉酸が、該微生物
の培養液もしくは生菌体によりグリシンから反応液中に
生成せしめられたものである特許請求の範囲第１項記載
の製造法。４５．１０−メチレンテトラヒドロ葉酸が、ホルムア
ルデヒドとテトラヒドロ葉酸との反応により反応液中に
生成せしめられたものである特許請求の範囲第１項記載
の製造法。５微生物が、Ｌ−セリントランスヒドロキシメチラー
ゼ生産能を有するサルシナ属の細菌である特許請求の範
囲第１項、第２項、第３項または第４項記載の製造法。６微生物が、Ｌ−セリントランスヒドロキシメチラー
ゼ生産能を有するシュードモナス属の細菌である特許請
求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記載の製
造法。７微生物が、Ｌ−セリントランスヒドロキシメチラー
ゼ生産能を有するミクロバクテリウム属の細菌である特
許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記載
の製造法。