MXPA97010044A - Metodo para producir l-lisina por medio de fermentacion - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una bacteria que pertenece al genero Serratia, que se transforma al introducir en sus células, un ADN que codifica a una dihidrodipicolinato sintasa que se origina de una bacteria que pertenece al genero Escherichia o Serratia que tiene una mutación para desensibilizar la inhibición por retroalimentación de L-lisina y un ADN que codifica a una aspartoquinasa que se origina de una bacteria que pertenece al genero Escherichia o Serratia que tiene una mutación para desensibilizar la inhibiciónpor retroalimentación de L-lisina se cultiva en un medio apropiado, L-lisina se produce y acumula en un medio de cultivo, y la L-lisina se recolecta del cultivo.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR - ISIWA POR MEDIO DE FERMENTACIÓN DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la industria microbiana, y en particular se refiere a un método para producir L-lisina por medio de fermentación, los ADN y microorganismos que han de ser usados para este método de producción. En la técnica anterior cuando se produce la L-lisina por medio de un método de fermentación, una cepa microbiana separada del medio natural o una cepa mutante artificial obtenida de esa cepa microbiana se usa para mejorar la productividad. Se conoce un gran numero de cepas mutantes artificiales que producen L-lisina. La mayoría de ellas son las cepas mutantes resistentes a S-2-aminoetilcisteina [AEC], y que pertenecen al genero de Brevibacteriu , Corybebacteriumt Bacillus , Escherichia o Seratia. Además se han descrito varias técnicas para aumentar la producción de aminoácidos, por ejemplo empleando un transformante que use un ADN recombinante [Patente de Estados Unidos no. 4,278,765] . Por ejemplo, bacterias que pertenezcan al genero Seratia se usan ampliamente como bacterias que producen varios aminoácido tales como L-prolina, L-histidina, L-arginina, L-treonina, L-valina y L-isoleucina y tienen excelentes propiedades como bacterias productoras de aminoácidos en varios aspectos como se describe en "Oyó Bunshi Idengaku (Genética Molecular Aplicada)", publicada por Kodansga Scientific, 1986, ISBN-06-139659-5) y "Aminosan Hakko (Fermentación de aminoácidos)" publicada por Gakkai Shuppan Center, 1986, ISBN4-7622-9454-3). Se ha reportado la producción de varios aminoácidos usando bacterias que pertenecen al genero Seratia . De acuerdo con un reporte [Publicación de patente japonesa no. 51-939391976)] que reporto que se volvió productor de L-lisina, calculándose el rendimiento en 5.4% [un valor dado al dividir una concentración de sal de HCl de L-lisina producida por una concentración inicial de una fuente de carbono]. Seratia marcescens, que representa una cepa de bacterias que pertenece al genero Seratia,. es similar a las bacterias que pertenecen al genero Escherichia en su estructura genética y mecanismo de expresión y regulación del gene y un vector clonante útil para la recombinación de ADN en bacterias que perteneces al genero Escherichia pueden usarse para bacterias que pertenecen al genero Seratia [Solicitud de patente japonesa publicada no. 2-27980 91980) y 5-10076 (19930]. La sintasa de dihidrodipiocolinato [DDPS] es una enzima para deshidratar u condensar aspartose ialdehido y ácido piruvico para sintetizar el ácido dihidrodipicolinico. Esta reacción se localiza en una entrada en una rama para avanzar a un sistema de biosintesis de L-lisina en la biosintesis de aminoácidos de la familia de ácido aspatico. Esta enzima es conocida por ser la responsable de un punto regulador importante de la biosintesis de L-lisina como lo es la aspartoquinasa en las bacterias que pertenecen al genero Escherichia . DDPS ee codificada por un gene llamado áa ?en E.Coli [Escherichia colil . El dapA ha sido clonado y su secuencia base ha sido determinada también [Richaud, F. et. al. J.Bacteriol. , 297 (1986)]. Por otro lado, la aspartoquinasa [de aquí en adelante abreviada algunas veces como "AK"] es una enzima para catalizar una reacción para convertir ácido aspartico en ácido ß-fosfoaspartico, que sirve como enzima reguladora principal en un sistema de biosintesis de aminoácidos de la familia de ácido aspartico. La AK de E.coli tiene tres tipos [AKI, AKII, AKIII], dos de las cuales son enzimas complejas con dihidrogenasa de ho oserina [de aquí en adelante abreviada como "HD"]. Una de las enzimas complejas es AKI-HDI codificada por medio un gene thrA, y la otra es AKII-HDII codificada por un gene metLM. AI se somete a supresión concertada por medio de treonina e isoleucina y se inhibe por medio de treonina, mientras que AKII es suprimida por metionina. Por el contrario se conoce que solo AKIII es una enzima de función simple que es un producto de un gene designado como lysC y ee somete a supresión e inhibición por retroalimentación por L-lisina. La proporción de sus actividades intracelulares es AKI:AKII:AKIII = aproximadamente 5:1:4. DDPS y AKIII se someten a inhibición de retroalimentación por medio de L-lisina como se describe antes e impide la producción efectiva de L-lisina. Se espera que la L-lisina pueda ser producida eficientemente por medio de fermentación usando una bacteria que pertenezca al genero Seratia si una enzima mutante de DDPS o AKIII, que no este sometida a la inhibición por medio de L-lisina, puede obtenerse. Sin embargo, no hay literatura anterior que describa una enzima mutante de DDSPS, y aunque existe un reporte sobre una enzima mutante de AKII [Boy E. et al., J.Bacteriorl. , 112, 84 (1992)]. no se conoce ejemplo que sugiera que esa enzima mutante pueda mejorar la productividad de L-lisina. Además, no han sido conocidos con respecto a los genes de un sistema de biosintesis de L-lisina de bacterias que pertenezcan al genero Seratia . La presente invención ha sido realizada tomando en consideración los puntos de vista antes mencionados, un objeto de la cual es obtener DDPS y AK, especialmente, DDPS y AKIII que se originen de bacterias que pertenezcan al genero Seratia con inhibición de retroalimentación suficientemente desensibilizada por medio de L-lisina, y proporcionar un método de producción de L-lisina al usar una bacteria que pertenezca al genero Seratia, que es mas eficiente que aquellos de la técnica anterior. Como resultado de la investigación diligente y repetida con el fin de lograr el objeto descrito antes, los presentes inventores han logrado obtener un ADN que codifique a DDPS originándose de bacterias que pertenezcan al genero Escherichia en la cual la inhibición por L-lisina sea suficientemente desensibilizada. El ADN que codifica a DDPS originado de E.Coli en la cual la inhibición por L-lisina se desensibiliza lo suficiente se refiere aquí como dapA o dapA* mutante. Los inventores han creado además una bacteria que pertenezca al genero Seratia y aspartoquinasa en la cual la inhibición de retroalimentación por medio de L-lisina es desensibilizada y DDPS en la cual la inhibición de retroalimentación por medio de L-lisina es suficientemente desensibilizada. El ADN que codifica a aspartoquinasa originaria de E.coli en la cual la inhibición de retroalimentación por medio de L-lisina es suficientemente desensibilizada, alguna vez se refiere aquí como lysC o LysC*. Los inventores han creado además una bacteria que pertenece al genero gerfttia que porta dapA mutante y lysC mutante. Y se ha encontrado que una cantidad considerable de L-lisina puede producirse y acumularse en un cultivo al cultivar la bacteria antes mencionada que pertenece al genero Seratia en un medio apropiado. De hecho, la presente invención provee una bacteria que pertenece al genero Seratja, que se transforma al introducir en sus células, un ADN que codifica a una sintasa de dihidrodipicolinato que tiene la mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación por medio de L-lisina . La sintasa de dihidrodipicolinato es ejemplificada por aquella que se origina de una bacteria que pertenece a un genero de Escherichia. Con respecto a la sintasa de dihidrodipicolinato que se origine de bacterias que pertenecen al genero Escherichia , la mutación para desensibilizar inhibición por retroalimentación por 1- se ejemplifica por la mutación para reemplazar un residuo de alanina 81o.. con un residuo de valina, la mutación para reemplazar un residuo de histidina 118o. con un residuo de tirosina, y una mutación para reemplazar el residuo de alanina 81o. con el residuo de valina y reemplaza el residuo de histidina 118o. con el residuo de tirosina, contado desde la terminal N en una secuencia aminoacida de sintasa de dihidrodipicolinato definida por la identificación de secuencia SEQ ID NO.:4 en el listado de secuencia. La sintasa de dihidrodipicolinato puede ser una nativa de una bacteria que pertenece al genero Seratia con la condición de que tiene una mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación por L-lisina. La presente invención provee además la bacteria antes mencionada que pertenece al genero Seratia que porta una aspartoquinasa en la cual la inhibición por retroalimentación por L-lisina se desensibiliza. Un método para permitir que una bacteria que pertenece al genero Seratia porte la aspartoquinasa en la cual la inhibición de retroalimentación por 1- es desensibilizada se ejemplifica por un método para introducir en sus células, un ADN que codifique a una aspartoquinasa III que se origine de una bacteria que pertenezca al genero Escherichia que tenga la mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación por L-lisina. La mutación de la aspartoquinasa III que se origina de una bacteria que pertenece al genero Escherichia para desensibilizar la inhibición por retroalimentación por L-lisina se ejemplifica por la mutación para reemplazar el 323o. residuo de glicina con el residuo de ácido aspartico y reemplaza un residuo 408o. de glicina con un residuo de ácido aspartico, la mutación para reemplazar el residuo 34o. de arginina con un residuo de cisteina y reemplazar el residuo 323 o. de glicina con el residuo de ácido aspartico, la mutación para reemplazar un residuo 325o. de leucina con un residuo de fenilalanina, la mutación para reemplazar un residuo 318o. de metionina con un residuo de isoleucina, la mutación para reemplazar el residuo 318o de metionina con el residuo de isoleucina y reemplazar un residuo 349o de valina con un residuo de metionina, mutación para reemplazar un residuo de serina 345o. con un residuo de leucina, mutación para reemplazar un residuo 347o. de valina con un residuo de metionina, mutación para reemplazar un residuo 352o. de treonina con un resido de isoleucina, la mutación para reemplazar el residuo de 369o. de serina con un residuo de fenilalanina, mutación para reemplazar un residuo 164o. de ácido glutamico con un residuo de lisina,y mutación para reemplazar un residuo de 417o. de metionina con un residuo de isoleucina y reemplazar un residuo 419o. de cisteina con un residuo de tirosina, contado desde la terminal N en una secuencia aminoacida de aspartoquinasa III definida en SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencia. No es necesario decir que la aspartoquinasa en la cual la inhibición de retroalimentación por L-lisina es desensibilizada puede ser una natural de una bacteria que pertenece al genero Seratia. El ADN que codifica a una sintasa de dihidrodipicolinato que tiene la mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación por L-lisina y el ADN que codifica a una aspartoquinasa que tiene una mutación para desensibilizar la inhibición por retroalimentación por L-lisina puede portarse en células de una bacteria que pertenece al genero Seratia en un idéntico plasmido o plasmidos separados. La bacteria que pertenece al genero Seratia . a la cual un ADN codifica para la sintasa de dihidrodipicolinato que tiene mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación por L-lisina, se ejemplifica por medio de una bacteria que es deficiente en decarboxilato de lisina. La presente invención proporciona además un método para producir L-lisina que comprende las etapas de cultivar cualquiera de las bacterias que pertenecen al genero Seratia descrita antes en un medio apropiado, produciendo y acumulando L-lisina en un cultivo similar del mismo, y colectar L-lisina del cultivo. En esta especificación, el ADN que codifica a DDPS o AKIII o ADN que contenga un promotor adicional llamada algunas veces como el "gene DDPS" o "gene AKIII" . Además, la enzima en la cual la inhibición pro L-lisina se desensibiliza, y ADN que codifica a un promotor adicional algunas veces son referidas simplemente como "enzima mutante" y "gene mutante", respectivamente. Además, la frase "la inhibición por retroalimentación por L-lisina se desensibiliza" significa que la desensibilización substancial de la inhibición es suficiente, y desensibilización completa no es necesaria. La presente invención se explicara detalladamente a continuación. <1> ADN que codifica a la sintasa de dihidrodipicolinato mutante [DDPS] usada para el método de la presente invención El ADN que codifica al DDPS mutante usado para el método de la presente invención tiene mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación por L-lisina de DDPS codifico en ADN que codifica para el DDPS tipo silvestre. El DDPS se ejemplifica por aquellos que se originan de las bacterias que pertenecen al genero Escherichia . especialmente DDPS originaria de E.coli. Además, cualquier DDPS de bacterias que pertenezca al genero Seratia puede usarse con la condición de que tenga la mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación por L-lisina. La mutación de de DDPS originaria de una bacteria que pertenece al gene Escherichia para desensibilizar inhibición de retroalimentación por medio de L-lisina se ejemplifica por: (1) mutación para reemplazar un residuo de alanina 81o. con un residuo de valina; (2) mutación para reemplazar un residuo de histidina 118o. con un residuo de tirosina; y (3) mutación para reemplazar el residuo de alanina 81o. con el residuo de valina y reemplazar el residuo 188o. de histidina con el residuo de tirosina; contado desde la terminal N de DDPS en una secuencia aminoacida de DDPS definida en la SEQ ID NO: 4 en el listado de secuencia. El ADN que codifica para el tipo silvestre de DDPS no esta especialmente limitado con la condición de que codifica a DDPS que origina de una bacteria que pertenece al genero Escherichia o Seratia. El ADN que codifica para DDPS originaria de una bacteria que pertenece al genero Escherichia se ejemplifica concretamente por ADN que codifica a una secuencia aminoacida definida por SEQ ID. NO: 4, y es ejemplificada concretamente por ADN de una secuencia representada por los números de bases 272-1147 en una secuencia de bases definida en SEQ ID NO: 3. En estas secuencias, aquellos que tengan la mutación en la secuencia base para provocar el reemplazo de los residuos aminoácidos descritos antes son ejemplos del ADN que codifica el DDPS mutante usada para la presente invención. Cualquier codon correspondiente al residuo aminoácido reemplazado esta disponible especialmente sin importar su tipo, con la condición de que codifique al residuo aminoácido idéntico. Además, se postula que DDPS poseído es ligeramente diferente en la secuencia dependiendo de las especies bacterianas y cepa bacteriana, sin embargo, aquellos que tengan reemplazo, delección o inserción de residuos aminoácidos en posiciones irrelevantes para la actividad enzimatica también se incluyen en el gene mutante de DDPS de la presente invención. Un método para obtener tal gene mutante puede ser el siguiente. Primero, un ADN que contiene un gene de DDPS tipo silvestre o gene de DDPS que tiene una mutación que substancialmente no tiene efecto adverso en la actividad enzimatica del DDPS se someta a un tratamiento de mutación in vitro, y un ADN después el tratamiento de mutación se liga con un ADN de vector adaptado a un huésped para obtener un ADN recombinante. El ADN recombinante se introduce en un microorganismo huésped para obtener transformantes. Cuando se selecciona uno que exprese un DDPS mutante se selecciona entre los transformantes antes mencionados, tal transformante alberga porta un gene mutante. Alternativamente, un ADN que contiene un gene de DDPS tipo silvestre o un gene de DDPS que tiene otra mutación puede ligarse con un ADN de vector adaptado a un huésped para obtener ADN recombinante. El ADN recombinante se somete después a un tratamiento de mutación jn vitro . y un ADN recorabinante después del tratamiento de mutación se introduce en un microoganis o huésped para obtener transformantes. Cuando se desea expresar un DDPS mutante se selecciona entre los transformantes antes mencionados, tal transformante también porta un gene mutante. También es aceptable que un microorganismo que produzca una enzima tipo silvestre se somete a un tratamiento de mutación para crear una cepa mutante que produce una enzima mutante, y entonces un gene mutante se obtiene de la cepa mutante. Alternativamente, un transformante al cual esta ligado un ADN recombinante con un gene tipo silvestre es introducido puede someterse a un tratamiento de mutación para crear una cepa mutante que produzca una enzima mutante. Cuando un ADN recombinante es recuperado después de la cepa mutante, un gene mutante se crea en el ADN antes mencionado. El agente para preformar el tratamiento de mutación in vitro de ADN se ejemplifica por medio de hidroxilamina y similares. La hidroxilamina es un agente de tratamiento de mutación quimica que provoca la mutación de cistosina a tiroina al cambiar la citosina a N*-hidroxicistosina. Alternativamente, cuando un microorganismo es sometido a un tratamiento de mutación, el tratamiento se realiza al usar irradiación con luz ultravioleta, o un agente mutante usado generalmente para la mutación artificial tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina [NTG] o ácido nitroso. Como microorganismo donador para ADN que contenga el gene DDPS tipo silvestre o el gene DDPS que tenga otra mutación descrita antes, puede usarse cualquiera de ellos incluyendo un microorganismo perteneciente al genero Escherichia o Seratia . Concretamente, como el microorganismo que pertenece al genero Escherichia . es posible utilizar aquellos descritos en un libro escrito por Neidhardt et al. [Neidhardt F.C. et al., Escherichia coli y Salmonella typhimurum,American Society for Microbology, Washington D.C. , 1208, tabla 1]. Por ejemplo se mencionan la cepa JM109 y MC1061 de E.Coli. Cuando se usa una cepa silvestre como microoganismo donador para ADN que contiene un gene DDPS, puede obtenerse un ADN que contiene un gene DDPS tipo silvestre. Por otro lado, el microorganismo que pertenece al genero Seratia se ejemplifica por Seratia marcescens . por ejemplo cepa AJ13125 de Seratia marcescens [FERM BP-5441]. [1] Preparación de gene de DDPS tipo silvestre Un ejemplo de preparación de ADN que contiene un gene de DDPS se describirá a continuación. La preparación se describe aqui con respecto a E.coli y el gene de DDPS puede prepararse con respecto a otra bacteria que pertenezca al genero Escherichia y una bacteria que pertenezca al genero Seratia. Primero E.coli que tenga -dapA tipo silvestre, por ejemplo la cepa MC1061, ee cultiva para obtener un cultivo.

Cuando el microorganismo descrito antes se cultiva, el cultivo puede realizarse de acuerdo con un método de cultivo solido común, sin embargo, el cultivo se realiza preferentemente adoptando un método de cultivo que considere la eficiencia durante la recolección de las bacterias. Puede usarse un medio con una o mas fuentes de nitrégeno tal como extracto de levadura, peptona, extracto de carne, licor de maiz y exudado de soya o trigo adicionado con una o mas sales inorgánicas tales como dihidrodipicolinato de potasio, hidrofosfato dipotasico, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro férrico, sulfato férrico o sulfato de manganeso y que ademas opcional y adecuadamente con azucares, vitaminas y similares. Es apropiado que el pH inicial del medio se ajuste a de 6 a 8. El cultivo puede realizarse durante 4 a 24 horas a 30 a 42*C, preferentemente a aproximadamente 37*C por medio de cultivo profundo con aereado y agitación, cultivo con agitación o estacionario o similares. El cultivo así obtenido se centrifuga por ejemplo a 3000 rpm, durante 5 minutos para obtener un pelet celular de la cepa MC1061 de E.coji. El ADN cromosomico puede obtenerse del pelet celular por medio de por ejemplo un método de Saito y Miura (Biochem.Biophys .Acta .. 72. 619, (1963)], o un método de K.S. Kirby (Biochem.J..64.405 (1956)). Para aislar el gene de DDPS del ADN cormosomico asi obtenido, se prepara una biblioteca de ADN cromosomico. primero el ADN cromosomico se digiere parcialmente un una enzima de restricción adecuada para onbtener una mezcla de varios fragmentos. Una amplia variedad de enzimas de restricción pueden usarse si el grado de corte se controla por medio del tiempo de reacción de corte y similares. Por ejemplo Sau3AI se permite que reacicone en el ADN cromosomico a una temperatura no menor a 30°C, preferentemente a 37°C a una concentración de enzimas de 1 a 10 unidades/ml durante varios periodos de tiempo [1 minuto a 2 horas] para digerirlo. A continuación, los fragmentos de ADN se lihgan con un ADN de vector replicable autónomamente en células de bacterias que pertenecen al genero Escherjchia para preparar ADN recombinante. Concretamente, una enzima de restricción que genera la secuencia de bases terminal complementaria a la generada por la enzima de restricción Sau3AI usada para cortar el ADN croosomico, por ejemplo BamHl, se deja actuar en el ADN de vector bajo una condición de temperatura no menor a 30ßC y una concentración enzimatica de 1 a 100 unidades/ml durante no menos de 1 hora, preferentemente de 1 a 3 horas para digerilo, completamente cortarlo y fijarlo térmicamente. A continuación, la mezcla de fragmento de ADN cromosomico obtenida como se describe antes se mezcla con el ADN de cextor fijado y cortado, en el cual la ligasa de ADN, preferentmente ligasa de ADN T4 se deja actuar bajo una condición de una temperatura de 4 16*C con una concentración enzimatica de 1 a 100 unidades/ml dunrante no menos de 1 hora, preferentemente durante 6 a 24 horas para obtener un ADN recombinante. El ADN recombiante onbtenida se usa para transformar un microorganismo que pertenezca al genero Escherichia , por ejemplo, una cepa mutante deficiente en DDPS tal como una cepa de Escherichia coli K-12, preferentemente una cepa JE7627 [ponB704 dacB12 pfv-t- tonA2 dapA lvsA str malA38 metBl ilvH611 leuA371 proA3 lac-3 tsx-76] para preparar una biblioteca de ADN cromosomico. La transformación puede realizarse por ejemplo por medio de un método de D.M. Morrison [Methods in Enzymology 68, 326 919790] o un método en el cual las células bacterianas receptoras se tratan con cloruro de calcio para aumentar la permeabilidad de ADN [Mandel, M. y Higa, A., J.Mol.Biol. ,53, 159 (1970)]. La cepa JE7627 esta disponible del Instituto Nacional de Genetrica [Mishima-shi, Shizouka-ken, Japón]. Una cepa bacteriana que tenia un ADN recombinante del gene DDPS se obtiene de las cepas que tienen una mayor actividad DDPS o cepas en las cuales la auxotropia que resulte de la deficiencia en el gene DDPS se completa, entre la biblioteca de ADN cromosomico. Por ejemplo, una cepa mutante deficiente en DDPS equiere ácido diaminopimelico. Asi cuando la cepa mutante deficiente en DDPS se usa como huésped, un fragmento de ADN que contiene le gene de DDPS puede ser obtenido al aislar una cepa bacteriana que se vuelve capaz de crecer en un medio que no contenga ácido diaminopimelico, y recuperar ADN recombinante de la cepa bacteriana. La confirmación del hecho de si un candidato que tiene ADN recobinante que contenga un gene DDPS realmente portan ADN recombiannte en el cual el gene de DDPS se clona puede lograrse al preparar un extracto celular de la cepa candidata, y preparar una solución enzimatica cruda para confirmar si la actividad DDPS ha aumentado. Un procedimiento para medir la actividad enzimatica de DDPS puede realizarse por medio de un método de Yugari et al. [Yugari Y y Gilvargm C, J.Biol.Chem..240.4710 (1962)]. ADN recombinante en el cual el ADN «que contiene el gene DDPS se inserta en el ADN de vector puede aislarse de la de la cepa bacteriana descrita antes por medio de por ejemplo un método de P.Guerry et al., [J.Bacteriol. ,116, 1064 (19730]. o un método de D.B. Cle ell (J.Bacteriol . , 110 f 667 (1972)]. La preparación del gene DDPS tipo silvestre puede también realizarse al preparar ADN cromosomico de una cepa que tenga un gene de DDPS en el cromosomico por medio de un método de Saito Y Miura o similares, y amplificar el gene DDPS por medio del método de reacción de cadena de polimerasa [PRC] [ver White, T.J.et al., Trends Genet. f ¿, 185 (1989)]. Los primeros de ADN que han de usarse para la reacción de amplificación son aquellos complementarios a ambas terminales 3' de un ADN de doble tira que contiene una regin entera o una región parcial del gene DDPS. Cuando solo ee amplifica una región parcial del gene DDPS, es necesario usar esoe fragmentos de ADN como primeros para realizar el análisie de un fragmento de ADN que contenga la región entera de una biblioteca de ADN cromosomico. Cuando toda la región del gene DDPS se amplifica, una solución de reacción PCR incluyendo fragmentos de ADN que contengan el gene DDPS amplificado se somete a electroforesis en gel de agarosa y entonces se extrae el fragmento de ADN deseado. Asi un fragmento de ADN que contiene al gene DDPS puede recuperarse. Los primeros de ADN pueden preparase adecuadamente en base por ejemplo a una secuencia conocida en E.coli [Richaud, D. et al., J.Bacteriol. , 297 (1986)]. Concretamente, los primeros que pueden amplificar una región que consiste de 1150 bases que codifican al gene de DDPS son preferiblee, y dos especies de primeros definidos en la SEQ ID N:l y NO: 2 son adecuadas. La síntesis de los primeros puede realizarse por medio de un método ordinario tal como el método de fosfoamidita [ver Tetrahedoron Letters, 22, 1859(1981)] al usar un sintetizador de AND comercial [por ejemplo, el sintetizador de ADN modelo 380B producido por Appplied Biosystems]. Además, el PCR puede realizarse usando un aparato PCR co ecial [por ejemplo, Ciclador térmico de ADN modelo PJ2000 producida por Takara Shuzo Co., Ltd], usando polimerasa de ADN Ttg[suministrada por Takara Shuzo Co., Ltd] de acuerdo con un método descrito por el proveedor. Con respecto al gene DDPS amplificado por el método PCR, las operaciones tales como la introducción de mutación en el gene DDPS se volvió fácil cuando se liga con un vector de ADN replicable autónomamente en células de bacterias que pertenezcan al genero Escherichia. e introducido en las células de bacterias que pertenezcan al genero Escherichia. El vector de ADN que ha de usarse, el método de transformación y de confirmación de la presencia del gene de DDPS son los mismos del procedimiento antes mencionado. El gene de DDPS que se origina de una bacteria que pertecece al genero Seratia de la misma forma anterior, y el gene puede aislaree de bibliotecas de ADN de bacterias que pertenezcan al genero Seratia por medio de hibridización usando un gene de DDPS que se origine de E.coli o una parte de lia como muestra. También, el gene de DDPS que se origina de una bacteria que pertenece al genero Seratia puede obtenerse por el método PCR usando un ADN cromosomico de una bacteria que pertenece al genero Seratia como un templado y oligonucleotido preparado en base a secuencia de bases del gene de DDPS que se origina de E.colif por ejemplo, oligonucleotidos que tienen dos tipos de secuencias como se muestran en las SEQ ID Nos. 1 y 2 como primero. Las bacterias que pertenecesn al genero Seratia están estrechamente realcionadas a bacterias que pertenecen al genero Escherichia, y se sabe que la homología de secuencias aminoácidos de proteinae y secuencias de bases de genes en células es alta entre ambas bacterias. Como tal gene, por ejemplo, hay tres conocidos thrA, thrB y frhrC, cuya homología son 83%, 73% y 84%, respectivamente [K.Omori et al., J. Bacteriol., 175, 785-794 (1993)]. Ademas ocmo es el cado de un aislado del gen de bacterias que pertenecen al genero Seratia usando una secuencia genética originaria de bacterias que pertenecen al genero Escherichia, dnaA se conoce [O.Skovhaard y GF.G. Hansem J. Bacetiorl., 169, 3976-3981919870]. Por lo tanto ee cierto que el gene DDPS de bacteriae que pertenecen al genero Seratia puede aielaree por medio de hibridización o método PCR en base a una secuencia de bases de un gene DDPS de bacterias que pertenecen a Escherichia. [2] Introducción de mutación en el gene DDPS El método de realización de la mutación tal como reemplazo, inserción o delección de residuos aminoácidos se ejemplifica por medio del método de PCR recombinante [Higuchi, R. , 61, en PCR Technology (Erlich, H.A. Eds., Stockton Prese (1989))], y un método de mutageneeis especifico al punto [Kraes, W. y Frits, H.J., Meth. in Enzymol.. 154r 350 (1987); Kunkel T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)]. La mutación previeta puede realizarse en el lugar deseado usando esos métodos. Además de acuerdo con la síntesis quimica de un gene deseado, es posible introducir mutación o mutación aleatoria en el sitio deseado. Además existe un método en el cual el gene de DDPS en el cromosoma o plasmido se trata directamente con hidroxilamina [Hashimoto, T. y Sekiguchi, M.J.Bacteriol. ,159, 1039 (1989)]. Alternativamente es aceptable usar n método en el cual una bacteria que pertenece al genero Escherichia que tiene el gene DDPS se irradia con luz ultravioleta, o un método en base al tratamiento con un agente químico tal como N-metil-N'-nitroeoguanidina o ácido nitroso. De acuerdo con eeoe métodos, la mutación puede introduciree aleatoriamente. Con reepecto a un método de selecciona para el gene mutante, ADN recombinante que comprende un fragmento de ADN que contiene el gene de DDPS y un vector de ADN que primero se somete directamente a un tratamiento de mutación con hisoxilaminao similaree, que se usa para transformar, por ejemplo una cepa de E.coli W3110. A continuación, cepas transformadas se cultivan en un medio mínimo tal como S-2-aminoetilcieteina que contiene M9 [AEC] como un análogo de L-lieina. Lae cepas que portan ADN recombiante que contiene el gene DDPS tipo silvestre no puede sintetizar L-lisina y ácido diaminopimelico [DAP] y se suprime el crecimiento debido a que DDPS expresado del ADN recombiante se inhibe por AEC. Por el contrario, una cepa que porta un ADN recombinante que contiene el gene DDPS en la cual la inhibición por L-lisina se desensibiliza tiene una enzima mutante codificada por el gene DDPS en el ADN recombinante antes mencionado, que no es inhibido por AEC. Así debe ser capaz de crecer en un medio mínimo en el cual ee agrega AEC. Este fenómeno puede utilizarse para seleccionar una cepa que es resistente en crecimiento a AEC como un análogo de L-lisina, esto es una cepa que porta ADN recombinante que contiene un gene de DDPS mutante en el cual la inhibición se deseneibiliza. El gene mutante así obtenido puede introducirse como un ADN recombiante en una bacteria que pertenece al genero Seratia y se expresa. Así puede obtenerse una bacteria que porte DDPS en la cual se deseneibilice la inhibición de retroalimentación. Alternativamente, un fragmento de gene DDPS mutante puede retirarse del ADN recombinante, e ineertaree en otro vector para uearee. El ADN de vector que puede uearee en la presente invención es preferentemente el ADN de vector plasmido, que se ejemplifica por pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG299,pHSG 298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pmW119, pMWllß, pMW219 y mMW218. Además los vectores del ADN fago pueden utilizarse. Además, con el fin de expresar el gene de DDPS mutante eficientemente, otro promotor que trabaja en las células de bacterias que pertenezcan al genero Seratia tal como lac, trp y PL pueden ligarse corriente arriba de una secuencia de ADN que codifica al DDPS mutante, o un promotor contenido en el gene DDPS puede usarse como esta, o después de amplificar el promotor. <2> ADN que codifica a la aspartoquinasa mutante [AK] usada para la presente invención El ADN que codifica el AK mutante usado en la presente invención tiene la mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación de AK codificada por medio de L-lisina en un ADN que codifica para el AK tipo silvestre. AK es ejemplificado por aquellos que se originan de bacterias que pertenecen al genero Escherichia , especialmente AKIII que se origina de E.coli.Además, cualquier aspartoquinaea de bacteria que pertenezca al genero Seratia , con la condición de que tenga la mutación para deeensibilizar la inhibición de retroalimentación por L-lisina. La mutación para deseneibilizar la inhibición de retroalimentación de AKIII por L-lieina ee ejemplifica por: [a] mutación para reemplazar el reeiduo de glicina 323o. con un reeiduo de ácido aspartico; [b] mutación para reemplazar el residuo de glicina 323o. con un residuo de ácidos aspartico y reemplazar un residuo de glicina 408o. con un residuo de ácido aspartico; [c] mutación para reemplazar el residuo 34o de arginina con un residuo de cisteina y reemplazar el residuo de glicina 323o. con el residuo de ácido aspartico; [d] mutación para reemplazar un residuo de leucina 325o. con un residuo de fenilalanina; [e] mutación para reemplazar el residuo de metionina 318o. con un residuo de isolecina; [f] mutación para reemplazar el reeiduo de metionina 318o.con el reeiduo de ieoleucina y reemplazar un reeiduo de valina 349o con un reeiduo de metionina; [g] mutación para reemplazar un residuo de serina 345o. con un residuo de leucina; [h] mutación para reemplazar un residuo de valina 347o. con un residuo de metionina; [i] mutación para reemplazar un residuo de treonina 352o. con un residuo de isoleucina; [j] mutación para reemplazar el residuo de treonina 352o. con el residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de serina 369o. con un residuo de fenilalanina; [k] mutación para reemplazar un reisduo de metionina 417o. con un residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de cisteina 419o. con un residuo de tirosina; contado desde la terminal N de AKIII en una secuencia aminoacida de AKIII definida en la SEQ ID NO; 8 en el listado de secuencia. Como el ADN codifica para el AKIII tipo silveetre, por ejemplo, el ADN que codifica para el AKIII que ee origina de una bacteria que pertenece al genero Eecherichia tal como E,colj se menciona. Concretamente, ee ejemplifica ADN que codifica para una secuencia aminoacida definida en la SEQ ID no: 8, y una secuencia representada por los números de basee 584-1930 en una eecuencia de baeee definida en SEQ ID NO;7, incidentalmente, AKIII de E.coli ee codificada por el gene lyeC.

En estas secuencias, aquelloe que tienen mutación en la secuencia de bases para provocar el reemplazado de los residuoe aminoácidos descritos antes son ejemplos de ADN que codifican para el AKIII mutante usado para la presente invención. Cualquier codon que corresponda al residuo aminoácido reemplazado esta disponible especialmente sin importar su tipo, con la condición que codifique para el mismo residuo aminoácido idéntico. Además existen aquellos en los cuales las secuenciae a inoacidae del' AKIII tipo eilvestre poseído son ligeramente diferentes dependiendo de la diferencia en la especie bacteriana y cepas bacterianas. Aquellos que tengan reemplazo, delección o inserción de residuos aminoácidos en posicionee irrelevantee para la actividad enzimatica de eea manera también ee incluyen en el gene mutante AKIII ueado para la preeente invención. Por ejemplo una secuencia base de un gene lyeC tipo silvestre obtenido en el ejemplo 2 descrito adelante [SEQ ID No.7] es diferente de la secuencia ya publicada de lysC de una cepa de E.coli K-12 JC411 en 6 lugaree [Caeean, M., Pareot, C, Cohén, G.N., y Patte, J.C., J.Biol.Chem. , 261 1052 (19860]. Loe reeiduoe aminoácidos codificados son diferentes en 2 sitios de ellos [en lysC de la cepa JC411, un residuo de glicina 50o. se reemplaza con un residuo de cieteina, y un reeiduo de glicina 401o. ee reemplaza con un reeiduo de alanina, contado desde la terminal N en una secuencia aminoacida de lysC definida en SEQ ID NO: 8]/ S espera que aun lysC que tiene la misma secuencia de la lyeC de la cepa de E.coliK-12 JC411 que lyeC que tiene la mutación en la cual se desensibiliza la inhibición de retroalimentación pro L-lisina se obtiene si cualquiera de las mutaciones antes mencionadas de [a] a [1] se introduce. Un método para obtener ADN que codifica al AK mutante en el cual la inhibición de retroalimentación por L-lisina se desensibiliza de la siguiente manera. Primero, un ADN que contiene un gene Ak tipo silveetre o un gene AK que tiene otra mutación ee eo ete a un tratamiento de mutación in vitro, y un ADN después del tratamiento de mutación se liga con un vector ADN adaptado a un huésped para obtener un ADN recombinante. El ADN recombinante se introduce en un microorganismo huésped para obtener transformantee . Cuando uno de esoe expreea un AK mutante ee eelecciona entre loe transformantes antes mencionados, de tal forma que un transformante porta un gene imitante. Alternativamente, un ADN que contiene un gene AK tipo silvestre o un gene AK que tenga otra mutación puede ligarse con un vector de ADN adaptado a un huésped para obtener un ADN recombinante. El ADN recombinante se somete a un tratamiento de mutación in vitro, y un ADN recombiante después de que el tratamiento de mutación se introduce en un microorganismo huésped para obtener transformantes. Cuando uno que expresa un AK mutante ee selecciona entre los transformantee antee mencionadoe, tal tratamiento también porta un gene mutante. Alternativamente, también ee aceptable que un microorganismo que produce una enzima tipo silvestre se someta a un tratamiento de mutación para crear una cepa mutante hi h produce una enzima mutante, y luego un gene mutante se obtiene de la cepa mutante. El agente para realizar un tratamiento de mutación directo de ADN se ejemplifica por hidroxilamina y similares. La hidroxilamina es un agente de tratamiento de mutación guímica que provoca la mutación de citosina a tiamina por medio del cambio de cistosina a N-hidroxicietoeina. Alternativamente, cuando un microorganismo se somete a un tratamiento de mutación, el tratamiento se realiza por medio de irradiación de luz ultravioleta, o usando un agente de mutación generalmente usada para la mutación artificial tal como N-etil-N'-nitroN-nitrosoguanidina [NTG] . Cualquiera ee uea como un mircoorgani mo donador para ADN que contiene el gene AL tipo silvestre o el gene AK que tiene otra mutación descrita antes, con la condición de que sea un microorganismo que pertenece al genero Escherichia o el genero Seratia . Concretamente, es posible utilizar aquellos descritos por Neidhardt et al. [Neidhardt, F.C. et al., Esceherichia coli y Salmonella typhimurium. American Society for Microbiology, Washington D.C. , 1208, tabla 1]. Por ejemplo una cepa de E.coli JM109 y MC1061 se ejemplifican. También, el microorganismo que pertenece al genero Seratia se ejemplifica por medio Seratia marcescens , por ejemplo la cepa de Seratia marcescene AJ13125 [FERM BP-5441]. Cuando el gene AK ee obtiene de esas cepae, la preparación de ADN cromosomico, preparación de una biblioteca de ADN y similares puede realizarse de la misma manera que la preparación del gene de DDPS. Como el huésped que se usa para la preparación de la biblioteca, es preferible usar una cepa completamente deficiente, en AKI, II y III tal como la cepa GT3 de E.coli [distribuida de E.coli Genetic Stock Center (Connecticut, Estados Unidos)]. Para la biblioteca de ADN cromosomica obtenida, una cepa bacteriana que tenga un ADN recombinante del gene AK se obtiene como una cepa en la cual la actividad de AK aumenta, o una cepa en la cual la auxotropia es completa. Los extractos celulares se preparan de cepas candidatas, y solucionee de enzima cruda eon preparadoe de esto para confirmar la actividad AKL. El procedimiento de medición de la actividad enzimatica AK puede realizarse de acuerdo con un método de Stadtman et. al. [Stadtman, E.R., Cohén, G.N., LeBras, G., y Robichon-Szulajster, H., J.Biol.Chem.. 236, 2033 (1961)]. Por ejemplo, cuando se usa una cepa mutante completamente deficiente en AK como huésped, un fragmento de ADN que contiene un gene AK puede obtenerse al aislar una cepa transformada que se vuelve capaz de crecer en un medio que no contenga L-lisina, L-treonina, L-metionina y ácido diaminopimelico, o un medio que no contenga homoserina y ácido diaminopimelico, y recuperar ADN recombinante de la cepa bacteriana. Cuando el gene AK se amplifica del ADN cromosomico por medio del método PCR, Los primeros de ADN que han de usarse para la reacción PCR pueden prepararse apropiadamente a base de por ejemplo una secuencia conocida en E.coli [Caseann, M.Pareot, C, Cohén, G.N., y Patte, J.C., J.Biol .Chem. ,261. 1052 (1986)]. Sin embargo, loe primeroe que pueden amplificar una región que comprende 1347 baeee que codifican al gene lyeC eon adecuadoe, por ejemplo dos primeros que tienen secuenciae definidae en SEQ ID NO: 5 y NO: 6 eon adecuados. Además, el gene K que se origina de una bacteria que pertenece al genero Seratia puede obtenerse de la misma manera anterior, y el gene puede aislarse de bibliotecas de ADN cromosomicas de bacteriae que pertenecen al genero Seratia por hibridización usando el gene K que se origina de E.coli o una parte del mismo como una muestra. Así, el gene AK que se origina de una bacteria que pertenece al genero Seratia puede obtenerse por medio del método PCR usando un ADN cromosomico de una bacteria que pertenece al genero Seratia como un templado y oligonucleotido preparado en base a la secuencia de un gene AK originario de E.Coli. El método para realizar la mutación tal como reemplazo, inserción y delección de residuos aminoácidoe en le gene AK obtenidoe como ee deecribe antes se ejemplifica por medio del método de PCR recombiante, el método de mutagenesis de punto especifico y similaree, de la miema manera que el tratamiento de mutación del gene DDPS deecrito antee. Ademáe de acuerdo con la eínteeie química de un gene marcado, es posible introducir la mutación o mutación aleatoria en un sitio deseado. Además, existe un método en el cual el ADN del gene AK en ADN recombinante cromosomico o extracromosomico ee trata directamente con hidroxilamina [Haehimoto, T. y Sekiguchi, M. J.Bacteriorl.. 159, 1039 (1984)]. Alternativamente, es aceptable usar un método en el cual una bacteria que pertenezca al genero Escherichia que tiene un gene en el ADN recombinante cromosomico o extracromosomico se irradia con luz o un método para realizar un tatamiento con un agente químico tal como N-metil-N'-nitrosoguanidina o ácido nitroeo. Con respecto a un método de selecciona para un gene mutante AK, una cepa completamente deficiente en AJ, por ejemplo una cepa GT3 de E.coli se transforma primero con un ADN recombinante que contiene un gene de AK que ha sido sometida al tratamiento de mutación. A continuación, las cepas transformadas se cultivas en un medio mínimo tal como M9 que contenga una cantidad coneiderable de L-lieina. Lae cepae que portan ADN recombiante que contiene un gene AK tipo eilvestre no puede sintetizar L-treonina, L-isoleucina, L-metionina y ácido diaminopimelico [DAP] y se suprime su crecimiento debido a que solo un AK se inhibe por medio de L-lisina. Por el contrario, la cepa que porta el ADN recombiannte que contiene el gene K mutante en el cual la inhibición por L-lisina se desensibiliza debe eer capaz de crecen en el medio minimo al cual ee le agrega una cantidad coneiderable de L-lieina. Eete fenómeno puede utilizare epara eeleccionar una cepa que sea resietente en crecimiento a L-lieina o AEC como un análogo de L-lieina, eeto ee una cepa que porte ADN recombinante que contenga un gene mutante de AK en el cual la inhibición se desensibiliza. El gene mutante asi obtenido puede introducirse como un ADN recombinante en una bacteria que pertenece al genero Seratia, y se expresa. Asi puede obtenerse la bacteria que porta AK en la cual se desensibiliza la inhibición de retroalimentación. Alternativamente, un fragmento de gene AK mutante puede sacaree del ADN recombiante, e ineertaree en otro vector para uearlo. El ADN de vector que puede eer usado en la presente invención es preferentemente un ADN de vector de plasmido, para el cual pueden ejemplificarse pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG299,pHSG 298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMWlld, pMW219 y mMW218. Ademas, los vectores de ADM fago pueden utilizarse también. Ademas, con el fin de expresar el gene AK mutante, eficientemente otro promotor que trabaja en células de bacterias que pertenecen al genero Seratia tal como lac, trp y PL pueden ligarse corriente arriba desde una secuencia de ADN que codifica al mutante AK, o un promotor contenido en el gene AK puede uearee como eetá o despuee de amplificarlo. <3> Producción de L-lisina de acuerdo con la preeente invención La L-lieina puede produciree eficientemente al cultivar en un medio adecuado la bacteria que pertenece al genero Seratia traneformada al introducir el gene DDPS rautante obtenido como ee deecribe antee y ee deja portar AK en el cual la inhibición de retroalimentación por L-lieina ee deeeneibilizada, produciendo y acumulando L-lieina en un cultivo del miemo, y colectar la L-lieina del cultivo. Eepecificamente, L-lisina puede producirse eficientemente al dejar que las bacterias que pertenecen al genero Seratia porten ambos mutantes DDPS y AK. Las bacterias que pertenecen al genero Seratia que porta AK en el cual la inhibición de retroalimentación por L-lieina es desensibilizada se ejemplifica por medio de bacterias que pertenecen al genero Seratia transformado al introducir en las células, un ADN recombinante construidas al ligar ADN que codifica a la AK que tiene la mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación por medio de L-lisina con un vector de ADN replicable autonomamanete en células de bacetias que pertenecen al genero Seratia. Ademas AK en el cual la inhibición de retroalimentación por L-lisina esta desensibilizada puede se run AK tipo silvestre que no sufre de inhibición de retroalimentación por L-lisina, o uno tal que un gene AK tipo silveetre es introducido en una bacteria que pertenece al genero Seratia de la misma añera. Ademas, una cepa mutante, de una bacteria que pertenece a una bacteria que pertenece al genero Seratia , que ahora produce un AK mutanta por medi de un tratamiento de mutación de células de una bacteria que pertenece al genero Seratia , también es aceptable. Por otro lado, con el fin de lograr la transformación al introducir el geneDDPS mutante en una bacteria que pertenece al gene Seratia P la transformación puede lograrse al introducir en las recluías un ADNN construido a ligar el gene DDPS mutante con un ADN de vecto autónomamente replicable en células de bacterias que pertenecen al genero Seratia. Cuando el gene DPS mutante y el gene AK mutante se introducen en una bacteria que pertenezca al genero Seratia , ambos genes mutantes pueden portarse en un plasmido idéntico o en plasmidoe separados en células. Cuando se usan plasmidos separados, ee preferible uear plaeidoe que tienen un mecaniemo de distribución estable para pertir que cada uno de ellos sean portados de manera estable en la célula. Cuando el gene de DDPS mutante y el gene de AK mutante se introducen en una bacteria que pertenezca al genero Seratia usando los plasmidoe separados, cualquier orden de introducción de ambos genes ee aceptable. La productividad de L-lisina puede mejorarse al aumentar el gene de reductasa de dihidrodipicolinato fdapB] de la bacteria que pertenece al genero Seratia en el cualel gene DPS mutante y el gene K mutante ha sido introducido. La productividad de L-lisina puede mejorarse al introducir un gene de dihidrogenasa de diaminopimelato fDDHl originario de una bacteria de tipo corino en la bacteria que pertenece al genero Seratia que porta al gene mutante AK y al gene DDPS mutante y en el cual el gene de reductasa de dihidrodipicolinato ha sido mejorada. Esta dihidrogenasa de diaminopimelato debe mejorarse. Alternativamente, la productividad de la L-lisina puede también mejorarse en un grado similar al mejorar un gene de transaminasa de succinildiaminopimelato [dapD] y un gene de acilasa de succinildiaminopimelato fDAPe] en vez de la introduccon de la dihidrogenasa de diaminopielato. La mejora al gene se refiere aqui a la mejora de la actividad de una enzima como producto de expresión del gene por célula. Concretamente, puede ejemplificarse la mejora en un numero de copias del gene en una célula, el aumento en la cantidad de expresión por gene al usar un promotor que tiene una alta eficiencia de expresión, y la introducción de la mutación para mejorar la actividad enzimatica en el gene. Con el fin de mejorar el numero de copias de un gene en una célula, el gene se inserta en un vectr automáticamente replicable en bacterias que pertenecen al genero Seratia y una bacteria que pertenece al genero Seratia puede transformarse con este vector. Este vector es preferentemente un plasmido del tipo de múltiples copias.

Alternativamenete, el numero de copias puede aumentar al amplificar el ADN integrado en ADN cromosomico al usar el fago µ o similares. Con respecto al uso del plasmido, cuando se usan plsmidoe para la introducción del gene DDPS y el gene AK mutante, eeoe plasmidos que tienen mecanismoe de dietribución eetables se usan preferentemente en los cuales los plasmidos están portados junto de forma estable en una célula. Cualquier orden de introducción de los genes es aceptable. Un método para obtener los genes del sistema de biosintesis de L-lisina de E.coli y el gene DDH de la bacteria tipo corino se ejemplificara a continuación. El geen PDH seobtiene al amplificar ADN cromoeoraica de la bacteria corineforme tal como Brevibacterium lactofermuntum por medio del método PCR usando dos especies de primero oligonucleotidos [por ejemplo, SEQ ID NO:9, NO: 10] preparada en baee de una eecuencia nucleotida conocida de un gene DDH de Corynebacterium slutamicum [Iehino, S., et. al., Nucleic Acids Ree., 15, 3917 (1987)]. El gene dapD ee obtiene al amplificar el ADN cromoeomico de una cepa de E.coli W3110 por medio del método PCR ueando doe especies de primeroe oligonucleotidoe [por ejemplo, SEQ ID NO: 11, No: 12] preparadoe a base de una sencian nucleotida de un gene conocido da[D [Richaud, C. et al., J.Biol.Chem. , 259, 14824 (1984)].

El gene dapE se obtiene al amplificar ADN de E.coli por medio del método PCR al usar dos especiee de primeroe oligonucleotidos [SEQ. ID.NO: 14, NO: 14] preparadoo a base de una secuencia nucleotida de un gene conocido dapE [Bouvier J. et al., J. Bacteriol..174 5265 (1992)]. En la presente invención cualquier bacteria que pertenezca al genero Seratia puede usaree para el ueo como un huésped con la condición de que un promotor del gene DDPS mutante, el gene mutante AK u otro gen del sietema de biosinteise de L-lisina, ou otro promotor para expresar esae funciones de genes en sus células, y un origen de replica de un ADN de vector que se usara para funciones d eintroducción en sus células para que sean capaces de replica cuando el gene DDPS mutante, el gene AK mutante u otro gene del sietema de bioeinteeis de L-lisina se introduce en un plasmido como ADN extracromosomico. Por ejemplo, una bacteria que pertenece al genero Seratia ee ejemplifca por medio de microorganiemoe porductoree de L-tronina, debido a la inhibición de eu aepartoquinasa por L-lisina esta generalmente deseneibilizada también en los microorganismos que producen L-treonina. Como una bacteria productora de L-treonina que pertenece a S.marcescene reeistente aAHV [ácido a-amino-ß-hidroxivalerico] que es un análogo de tronina [s. Komateubara, M. Kieumi y I. China, Appl. Environ. Microbiol., 35, 834 (1978)]. Como tal cepa, exiete una cepa de Serati marcescens AJ13125. La cepa se deposito en el Instituto Nacional de Biosciencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Indistrial [1-3, Higashi 1-chome, teukuba-ehi, Ibaraki-ken, 305 japón] bajo un numero de acceso de FERM P-14983 el 12 d ejunio de 1995 y transferido al deposito internacional de acuerdo con el Tratado de Budapest el 4 de marzo de 1996, y se le asigno un numero de acceso de FERM bp-5441. Ademas, como bacteria que pertenece al genero Seratia util en la presente invención, la seratia marcescens deficiente en descarboxilasa lieina se ejemplifica [solciitud de patente publicada japonesa no. 50-53589 (1995)]. La descarboxilasa de lisina es una enzima que cataliza una reacción que produce cadaverina por medio de la deeacarboxilación de L-lieina comouna enzima degradadora de L-lieina, y la cepa deficiente se suprime en la degradación de L-lisina. Las bacterias que producen L-tronina y bacterias que pertenecen al genero Seratia deficiente en decarboxilato de lisina puede obtenerse por medio de irradiación ultravioleta o tratamiento por medio de mutagenos tales como N-metil-N'-nitro-N-nirosoguanidina y ácido nítrico, que se usan generalemte para la mutación artificial. El medio que se va a usar para el cultivo del transformante que porta el gene mutante de acuerdo con la presente invención es un medio ordinario que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicas y opcionalmente otros componentes orgánicos. Como fuente de carbón es posible uear azucaree tales como sacaroea, glucosa, lactosa, galactosa, fructosa, o hidrolizado de almidoon; alcoholes tales como glicerol o sorbitol; o ácidos orgánicos tales como ácido fuarico, ácido cítrico o ácido succinico. Como fuente de nitrógeno es posible usar sales de maonio inorgánicas tales como ures, sulfato de aonio, cloruro de amonio o fosfato de amonio; nitrógeno orgánico tal como hidrolizado de soya; gas de amoniaco, o amoniaco acuoso. Es preferible dejar que las subetanciae talee como vitamina Bx y L-ieoleucina o extracto de levadura eea contenida en cantidadee apropiadae como nutirientee organicae en huellas. Si es necesario se agregan otros en pequeñas cantidades como fosfato de potasio, sulfato de magnesio, ion de hierro, ion de manganeso y similares. El cultivo se realiza preferentemente bajo condiciones aerobicas durante 16 a 96 horae. La temperatura de culivo se controla a 25*C a 45°C, y el pH se controla a 5 a 8 durante el cultvo. Substanciae inorgánicas u orgánicas, acidas o alcalinas asi como gas de amoniaco o eimilaree pueden uearse para ajustar el pH. La recolección de L-lisina de un licor fermentado es realizada generalmente al combinar un método de resina de intercambio de iones, un método de precipitación y otros métodos conocidos. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 muestra las etapas de preparación de pdapAl y pdapA2. La figura 2 muestra la inhibición por L-lisina de DDPS tipo silveetre y mutante. La figura 3 mueetra las etapas de preparación de un plasmido pdapAS824 que tiene un gene dapA8 del tipo de doble mutación. La figura 4 muestra las etapas de preparación de pLYSCl y pLYSC2. La figura 5 muestra una proporciona de apariencia y una proporción de mutación de loe traneformantes después del tratamiento de hidroxilamina. La figura.6 muestra la inhibición por L-lisina de los AKIII tipo silvestre y mutante. La figura 7 muestra las etapas de preparación de un plasmido RSF24P que se origina de RSF1010 que tiene dapA*24. La figura 8 muestra las etapas de preparación de un plasmido pLLC*80. La figura 9 muestra las etapas de preparación de un plasmido RSFD80 originario de RSF1010 que tiene dapA*3 y lysC80. La presente invención se explicara mas concretamente con referencia a los ejemplos.

Ejemplo 1: Preparación del gene mutante DDPS <1> Clonación del gene dapA tipo eilveetre Una secuencia base de un gene dapA de E.coli ya ha sido reportada [Richaud, F. etal., J.Bacteriol.. 297 (19860]. y se sabe que su marco de lectura abierto [ORF] tiene 876 pares de bases, y codifica a una proteina que tiene 292 residuos aminoácidos. Ya que se desconoce como se regula este gene dapA, una región que contiene solo una secuencia SD y ORF excepto una región promotora se amplifico usando el método de Saito y Miura rBiochem.Biophys.Acta.. 72, 619 (1963)]. Se prepararon dos especies de primeros que tengan secuencias mostradas en SEQ ID NO:l y NO: 2, que se usaronpara realizar la reacción PCR de acuerdo con un método de Erlich et al. [PCR Techno1ogyf Stocktoin press (1989)], y un ADN objetivo se amplifica. El ADN obtenido se inserto en un vector clonantes comercial pCRIOOO para fragmentos de PCR [obtenida de Invitrogen, Ltd., (California, Estados Unidos)] tal cual. pCRIOOO contiene un promotor lacZ [Placz] y se vende en un estado cortado en un punto corriente abajo del promotor lacZ. Cuando un ADN recombinante obtenido al ligar un fragmento PCR entre ambas temrinales de corte de pCRIOOO se introduce en E.coli, el fragmento PCR se transcribe bajo el control del promotor lacZ. Después del ligado del fragmento PCR con pCRIOOO, dos especies de plasmidoe se obtvieron, los cuales fueron pdapAl un plasmido ligado en una orientación posición y pdapA2 un plasmido ligado en una orientación inversa, para la dirección de la transcripción por el promotor lacZ [figura 1]. Cuando esos plasmidoe se introdujeron en E.Coli JE7627 que es una cepa deficiente en DDPS, cepas con los plasmidos introducidos se complementan por auxotropia por el ácido diaminopomelico del huésped JE7627. Asi se confirmo que los fragmentos de ADN insertadoe en a boe plaeidoe contienen el gen dapA que codifica al DDPS activo. Una cepa traneformada obtenida al introducir pdapAl en una cepa W3110 de E.coli tipo silvestre [existente en el Instituto Nacional de Gnetica (Mishuima-shi, Shizuoka-ken, Japón)] ee deeigno W3110/pdapAl, y una cepa traneformada obetenida al introducir pdapA2 en la cepa W3110 de E.coli se designo como W3110/pdapA2, respectivamente. Esas dos cepas transformadas se cultivaron respectivament en un medio minimo M9 que tenia la eiguiente composición a la cual se le agrego AES como un análogo de lisina. La cepa W3110 sin plasmido introducido se cultivo también en el mismo medio como control. Esae dos cepas transformadas y la cepa W3110 qur no tiene plasmido fueron suprimidoe en crecimiento por medio de AEC, ein embargo su inhibición de crecimiento se recupero por la adición de L-lisina. [Medio minimo M9] A: (20XM9) Na2HP004.12H20 303 g/L KH2P04 60 g/L NaCl 10 g/L NH4C1 20 g/L B: MgS04 1M C: 50% de glucosa D: lg/L tiamina A, B, C y D descritas antes se esterilizaron por separado y se mezclaron en una proporción A:B:C:D:agua =5:0.1:1:0.1:95. <2> Preparación del gene mutante DDPS [dapA*1 Se aeumio que una cepa que porta un plaemido que contiene dapA* que codifica a DDPS con inhibición desensibilizada por L-lisina podria crecer en un medio minimo M9 al cual se le agrego una cantidad considerable de AEC. Una cepa que porta un plasmido que contine dapA* se selecciono por su resistencia al crecimiento a AEC. Con el fin de obtener eficientemente dapA* , dapA' en pdapAl y pdapA2 preparada en <1> se sometieron a un tratamiento de mutación. (1-2-1) Investigación sobre a condición de selecciona para la cepa que porta el plasmido que contien dapA* . La cepa W3110/pdapAl y la cepa W3110/pdapA2 obtenidas como se describen antes se cultivaron en medios de placas de agar M9 que contenia varias concentraciones de AEC, respectivamente. Concentraciones inhibidoras del crecimiento por AEX ee examinaron y se estudio una condición de selección para una cepa que porte un plasmido que contenga dapA* . El creciiento de los transformantee en el medio M9 que contenida AEC en diferentes concentracione se mueetra en la Tabla 1. En eeta tabla + indica crecimiento del traneforante, y - indica falta de crecimiento.

Tabla 1 Concen ración APC W3UQ/Píl?fAl W3110/pdapA2 im] 250 - - 125 - - 60 - - 30 - - 15 + - 8 + + 4 + + 2 + + La direcicon de la tranecripción del gene dapA en padpAl coincide con la dirección de tranecirpicon por el promotor l&sZ. [figura l]. Aei se encontró que el gene dapA en pdapAl proporciono resistencia a AEC a concentraicones considerablemente alta sun cuando dapA permaneció como un tipo silvestre porque su cantidad de expresión se amplifico por miedo del promotor lacZ, mientras que el gene dapA en pdapA2 tenia una canitdad de expresonmenor y proporciono inhibición en crecimiento por AEC en concentracionee menores debido a que la dirección de transcripción fue en la dirección inversa con respecto al promotor lapZ y un promotor del propio 3fh también fue deficiente [el crecimiento se suprimió en una distribución de adiciond e 30 mM en el cao de la cepa W3110/pdapAl, y de 15 mM en el caso de la cepa W3110/pdap2] . Se confirmo que la inhibición del crecimiento se elimino por medio de la adición simultanea de L-lisina. Por lot anto, pdpA2 se uso como un objeto dpara la introducción de la mutación. Un medio preparado al agregar 60mM de AEC al medio minimo M9 se uso para la selección de una cepa que porte un plasmido que contiene dapA* . Eete medio ee refiere como "medio de eeleccion" en el ejemplo 1. (1-2-2) Tratamiento de mutación in vitro para pdapA2 con hidroxilamina Un tratamiento de mutación in vitro en el cual los plsmidoe se trataron directamente con hidroxilamina se uso para la introducción de una mutación en el plasido pdpA2. 2 µg de ADN se trtao a 75°C durante 1 a 4 horas en hidroxilamina 0.4 M [0.1 M KH2P04-1 Mm EDTA (pH 6.0): 80 µl, ADN: 2µG, total 200 µl llenado con agua]/ El ADN despuee del tratamiento ee purifico con polvo de vidrio y ee introdujo en E.coli W3110, y ee extendió eobre todo el medio [caldo L: 1% Bacto trypton, 0.5% de extracto de levadura, 0.5% de NaCl, 1.5% de agar] para formar colonias. Se replicaron en el medio de selección descrtio en (1-2-1) y auqellas que formaron colocniae en el medio se selección fueron seleccionados. Los candidatos de los plasmidos mutantes en un totoal de 26 cepae se obtuvieron deepuee de repetir doe veces los experimentos. Las cepas candidatas de 26 cepas en total obtenidas asi se volvieron a gotear en el medio de selección otra vez, la resistencia a AEC se confirmo. (1-2-3) Aislado del gene dapA* e investigación sobre el producto dapA* Los pdapA2 mutante se recuperaron de las 36 cepas descritas antes. Una cepa deficiente en dapA, JE7627 se transformaron con ellos y el pdapA2 tipo silveetre, reepectivamente. Un extracto libre ee células se preparo de cada una de las cepas tranefor adae, y se midió la actividad enzimatica de DDPS. El extracto libnre de células [solución enzimatica cruda] se preparo de la siguiente manera. Se cultivo una cepa transformada en un medio 2xTY [1.6% bacto trypoton, 1% extracto de levadura, 0.5% NaCl], y se recolecto a una densidad óptica a 660 nm [0D66O] de aproximadamente 0.8. Un pelet celular se lavo con 0.855 NaCl bajo una condición de 0°C, y se suspendió en 20M de amortiguador de fosfato de potasio [pH 7.5] que contiene 400 mM KCl. Las células se rompieron por sonificación [0°C, 200 W, 10 minutos]. Una solución de de células rotas se centrifugo a 33 krpm durante 1 hora bajo una condición de 0*C para obtener una nata a la cual se agrego sulfato de amonio para dar una saturación del 80% para ser almacenado a 0*C durante la noche deguido por centrifugación. Un pelet se disolvió en amortiguador de fosfato de potasio 20 mM [pH 7.5]-400 mM KCl. La actividad enzimatica de DDPS se midió de acuerdo con un método de Yugari et al. [Yugari Y u Gilvarg, C. , J.Biol.Chem.240. 4710 (1962)]. De hecho la abeorbencia de una eolución de reacción que tiene la siguiente compoeición ee midió a 37ßC con un eepectrofotometro con una longitud de onda de 270 nm de una manera de cureo de tiempo, y el dihidrodipicolinato generado se midió. Se retio el piruvirato de sodio del sietema de reacción que se iba a usar como modelo. [Composicoin de la solución de reacion] 50 mM clorhidrato de imidazol pH 7.4 20 mM semialdehido L-aepartico 20 mM piruvato de eodio eolución enzimatica agua [balance] Total 1.0 mi Al medir la actividad enzimatica de DDPS, varias concentraciones de L-lisina se agregaron a la solución de reacción enzimatica y el grado de inhibicon por L-lisina se examino. Como se muestra en la figura 2, el DDPS tipo silveete sufre de inhibicon por L-lisina. Los plasmidoe mutantee que ee orifinan de lae cepae traneformadas que tienen dificultad DDPS para sufir la inhibición por L-lisina en comparación con el tipo silvestre habían tres especies entre las 26 especies de losplamsidos candidatos. Se designaron como pdapAS8, pdapAS9 y pdapAS24, respectivamente. De acuerdo con la siguiente determinación de secuenciae de base, se revelo que pdapASß y pdapAS9 tenían la misma mutación. El grado de desensibilización de inhibición de retroalimentación por l-lisina se modifico en las tres especies de DDPS mutantee codificadas por pdapASd, pdapAS9 y pdapAS24, sin emabrfo la inhibición por L-lisina fue desensibilizada en las tre especiee. Aunque la actividad eepecifica de la enzima puede eer afectada por situaiconee de crecimiento de lae celulae y la preparación de ueetrae, se encontró que se reducía un poco en cualquier caso en comparación con el tipo silvestre. Sin embargo, se juzgo que no causarian problemas substancialmes como material de reproducción. (1-2-4) Determinación de la secuencia base del gene mutante dapA Las secuencias de bases de los genes mutante dapA se determinaron de acuerdo con un método ordinario al usar un secuenciador de ADN ABI modelo 373A [producido por Applied Biosystem Inc.]. Como resultado, se revelo «que el C 487o. se cabio a T en pdapASd y pdapAS9, y el C 597o. se cambio a T en pdapAS24 en una secuencia del gene dapA tipo silvestre mostrado en SEQ ID NO: 3. Por lo tanto se revelo que un reeiduo de alanina 81o. ee cambio a un reeiduo de valina en DDPS codificado por pdapASd y pdapAS9, y un reeiduo de hietidina lldo se cambio ap un reisduo de tirosina en DDPS codificados por pdapAS 24 en una secuencia aminoacida de DDPS mostrada en la SEQ ID NO; 4. (1-2-5) Preparación de dapA que tiene doble mutación Dos especies de genes mutantes da A se obtuvieron como se describe antes. Con el fin de verificar si la desentibilización de la inhibición tiene efecto aditivo para eeas mutaciones, se preparo un plasmido que contiene dapA mutante que tiene las dos mutaciones. Un procedimiento de preparación es como se muestra en la figura 3. Un plasmido obtenido que tiene doble mutación se designo como pdapAS824. Ejemplo 2; Preparación de gene mutante AKIII <1> Clonaciond el gene lysC tipo silvestre Una secuencia base de un gene AKIII [lysC] de E.coli ha eio reportado [Caeean, M. Pareot, C, Cohén, G.N., y Patte, J.C., J.Biol.Chem. ,261 , 1052 (19667)] y se sabe que su marco de lectura abierto [ORF] tiene 1347 pares de bases, y codifica par aun proteinaque tenga 449 residuoe aminoacidoe. Un operador esta presente en este gene, y se eomete a eupresión por L-lisina, Asi con el fin de retirar su región operador, una región que solo contiene una secuencia SD y ORF se amplifico usando el método PCR y se clono. El ADN genomico total de una cepa E.coli K-12 MC1061 se preparo de acuerdo con un método de Sito y Miura (Biochem.Biophys.Acta.. 72, 619, (1963)]. Se prepararon dos especies de primeros que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 5 y 6, que se usaron para realizar la reacción PCR de acuerdo con un método de (Erlich et al. PCR Technology Stockton Press (1969)), y se amplifico el gene lysC. El ADN obtenido se digirió con BafflHI y Asel, con exstremo romo, y ee ineertaen un punto Smal de un vector de múltiples copias, pUCld. Este punto Smal se localiza en un lado corriente abajo de un promotor lacZ que existe en el vector, y cuando el ADN recombinante obtenido al insertar un fragmento de ADN en el punto Smal de pUCld se introduce en E.coli, el fragmento de ADN insertado se transcribe por medio de la transcripción transparente bajo el contol por el promotor lacZ. Después de la inserción del fragmento PCR ne el punto Smal de pUC 18, dos especies de plasmidos se obtuveron, que fueron pLYSCl como un plasido insertado en una orientación inversa y pLUSC2 como un plasmido insertado en una orientación positiva, para la dirección de transcripción del lysC con respecto a la dirección de transcripción por el promotor lacZ [figura 4]. Cuando esos plasmidos se usaron para transforma E.coli GT3 [THRal016b metLM1005 lysC10041 como una cepa completamente deficiente para AKI, II, III, se completo la auxotropia de GT3 para homserina y ácido diaminopimelico. Asi se confirmo que los fragmentos de ADN insertadoe en amboe plaemidoe contiene el gene lysC que codifican para AKIII activas. Una cepa transformada obtenida al introducir pLYSCl en en una cepa compeltamente deficien te de AK, E.coli GT3 se designo como GT3/pLYSCl, y una cepa transformada obtenida al introducir pLYSC2 en la E.coli GT3 se deeigno como GT3/pLYSC2. Una cantidad considerable de L-lisina se agrego al medio mínimo M9, y las cepas GT3/pLYSCl y GT3/pLYSC2 se cultivaron cada una.

Tanto la cepa GT3/pLYSCl coo la GT3/pLYSC2 portan plasmidoe que contienen el tipo silvestre de lysC, en la cual AKIII codificado por lysC en el plasmido es un AK único. El AKIII tipo silvestre como el AK unido se inhibe por medio de L-lieina en la presencia de una coneiderable cantidad de L-lisina. Asi las dos cepas no podran sintetizar L-treonina, L-isoleicina, L-metionina y ácido diaminopimelico [DAP], y se suprimió su crecimiento. <2> Preparación del gene mutante AKIII [lysC*] Se asumió que una cepa que porta un plasmido que contiene lysC* que codifica a AL con inhibición desensibilizada por medio de L-lisina podria crecer en un medio minimo M9 al cual se le agrego una cantidad considerable de L-lisina. Una cepa que porte un plasmido que contiene l?sC* se selecciono al escoger cepas con su crecimiento resistente a L-lisina o AEC en un análogo de L-lisina. Con el fin de obtener eficientemente LysC8 , lysC en pLYSCl y pLYSC2 preparadas en <1> se sometieron a un tratamiento de mutación. (2-2-1) Investigación sobre la condición de selección para la cepa que porte plasmido que contenga lysC* La cepa GT3/pLYSCl y el GT3/pLYSC2 ee cultivaron en medio de placa de agar M9 que contiene variae concentraciones de L-lieina o AEC, respectivamente. Las concentraciones inhibidoras del crecimiento por L-lisina y AEC se examinaron y una condición de selección se investigo para una cepa que porta un plasmido que contiene lysC* . El crecimiento de loe traneformante en el medio M9 que contiene L-lieina o AEC en diferentee concentracionee ee muestra en la tabla 2. En esta tabla + indica crecimiento del transformante, + indica un crecimiento ligero y - indica falta de crecimiento. Tabla 2 Crecimiento v concentración de L-lisina 0 0.2 0.4 0.8 1.5 3 6 12 25 50 100 200 fmMI GT3/pLYSCl + - - - _ _ _ _ _ GT3/pLYSCl + + + + + + + + + + + - Crecimiento v concentración de AEC 0 0.2 0.4 0.6 1.5 3 6 12 25 50 [mM] GT3/pLYSCl + - - - _ - _ GT3/pLYSCl + + ± ± + + - _ _ - La dirección de transcripoicon del gene lysQ en pLYSC2 coincide con la dirección de transcripción por el promotor lacZ [figura 4]. Asi se encontró que el gene lysC en pLYSC2 proporciono resistencia a L-lisina y AEC a concentraciones considerablemente altas aun cuando lysC permaneció como tipo silvestre debido a que su cantidad de expresión se amplifico por medio del promotor lacZ, mientrae que el gen lyeC en pLYSCl tenia una cantidad de expresión menor y provee inhibición en el crecimiento por L-lisina y AEC a menores concentraciones debido a que la dirección de transcripción fue en la dirección inversa con respecto al promotor lacZ, y un promotor del mismo también fue deficiente [el crecimiento no se suprimió hasta una distribición de adición de3 mM para AEC en el caeo de la cepa GT3/pLYSC2, mientras que el crecimiento se suprimió completamente en la dietribición de adición de 0.2 mM para la L-lisina y AEC en el caso de la cepa GT3/pLYSCl]. Se confirmo que la inhibición del crecimiento se elimino por medio de la adición simultanea de homoserina y ácido diaminopimelico. Por lo tanto, pLYSCl ee ueo para experimentoe de introducción de mutación. Un medio preparado al agregar 10 mM de L-lieina o 0.2 mM de AEC al meido minimo M9 se uso para la selección de una cepa que porte un plasmido que contenga lysC* . Eete medio se refiere como "medio de selección" en el ejemplo 2. (2-2-2) Tratamiento de mutación in vitro para pLYSCl con hidroxilamina Dos tipos de métodos se usaron para la introducción de la mutación en el plasmido pLYSCl que fue un método de tratamiento de mutación in vitro en el cual los plasmidos se tatan directamente con hidroxilamina, y un método de tratamiento de mutación in vivo adicional en el cual una cela que porta un plasmido se trata con nitrosoguanidina [NMTG] eeguido por la extracción del plaemido con el fin de proporcionar divereidad de mutación, de hecho mutación expectante diferente a la mutación de cietosina a timina con hidroxilamina. [Tratamiento de mutación in vitro con hidroxilamina] 2µg de ADN ee trataron bajo una condición de 75°C durante 1 a 4 horae en hidroxilamina 0.4 M [KH2P04-1 mM EDTA (pH 6.0):ß0µl, ADN:2µg, total :200µl llenando con agua]. El ADN deepuée del tratamiento ee purifico con polvo de vidrio, ee introdujo en una cepa completamente deficiente en AK, una cepa de E.coli GT3, y se extedio sobre un medio completo [caldo L: 1% Bacto trypton, 0.5% de extracto de levadura, 0.5% de NaCl, 1.5% de agar] para formar colonias. Se replicaron en el medio de selección descrtio en (2-1-2) y las cepas capaces de crecer en el medio de selección fueron seleccionadas como cepas candidadas. La proproción de apariencia de loe traneformante y la proporción de mutación se encontraron diferentes como se muestra en la figura 5. Sepas mutantes se obtuvieron por medio del tratamiento durante 4 horas a una proporción considerablemente alta de 0.5 a 0.8%. [Tratamiento de mutación in vivo con NTG] pLYSCl se introdujo en E.coli MC1061, y las células enteras se sometieron a un tratamiento NTG. Las células después del tratamiento secultivaron durante la noche para fijar la mtación y entoncee un plasmido se extracto y se introdujo en E.coliGT3. De hecho, la cepa transformada se cultivo en un medio 2xTY [1.6% Bacto trypton, 0.5% de extracto de levadura, 0.5% de NaCl, se recolectaron a un 0D66O de aproximadamente 0.2 Se lavaron con un amortiguador TM descrito adelante, entonces se suependio en una solución NTG [preparada la disolver NTG a una concentración de 0.2 mg/ml en amortiguador RM] , y se trata a 37°C durante 0 a 90 minutos. Las células se lavaron con amortiguador RTM y 2x medio TY durante la noche. Subsecuentemente el ADN del plasmido se extracto de las células y se introdujo en una cepa GT3 de E.coli. La selección de las cepas candidatas se realizo de la misma manera que la mutación in vitro. y se obtuvieron los mutantes de resistencia a lisina [LysR] y reeistencia a AEC [AECr]. [Amortiguador TM] Tris 50 mM Ácido maleico 50 mM (NH4)2S04 1 g/L MgS04.7Ha0 0.1 g/L Ca(N0s)2 5 mg/L FeS04.7Ha0 0.25 mg/L el pH se ajusto a 6.0 con NaOH. Un total de 180 cepas de las cepas candidas obtenidas como se describe antes [tratamiento de hidroxilamina; 48 cepas, tratamiento NTG; 132 cepas] se gotearon en el medio de selección, y las resistenciae a AEC y L-lieina ee confirmaron para obtener 153 cepae. Regietrando la diferencia en un modelo de acumulación aminoácido en el medio, esas 153 cepas se dividieron en 14 grupos, y la actividad AK se midieron después de seleccionar cepas representativas de cada uno de los grupos. No hubo grna diferencia en la actividad AL entre las cepas mutantes obtenidas por medio deel tratamiento de hidroxilamina y las cepas mutantes obtenidas por el tratamiento de hidroxilamina y las cepas mutantes obtenidas por el tratamiento NTG. Asi los siguientes experimentos se realizaron sin distinguirlos . (2-2-3) Aislado del gene lysC* e inveetigación del producto lysC* Se seleccionaron las siguienes cepae como repreeentativae de los 14 grupos antes mencionados: Nos. 24, 43, 48, 60, 80, 117, 126, 149, 150, 156, 158, 167, 169 y 172. Los plasmidos mutantes derivados de pLYSCl se recuperaron de cada uno de ellos y se designaron como pLYSCl*24, pLYSCl*43,pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSCl* 80, pLYSCl* 117, pLYSCl* 126, pLYSCl* 149, pLYSCl* 150, pLYSCl* 156, pLYSCl* 158, pLYSCl* 167, pLYSCl* 169 y pLYSCl* 172, respectivamente. Una cepa GT3 completaente deficiente de Ak se traneformo con ellas y con pLYSCl. Un extracto libre de células se preparo de cada una de las cepas transformadas, y se midió la actividad enzimatica AKIII. El extracto libre de células [solución enzimatica cruda] se preparo de la siguiente manera. Una cepa transformada se cultuvo en 2x medio TY, y se recolecto en un 0D66D de aproximadanete 0.8. Las células se lavaron con KH2P040.02M [pH 6.75] ß-mercaptoetanl -0.03 bajo una condición de 0°C y las células se rompieron por sonificación [0°C, 100W, 30 minutos x 4]. Una solución de células totas se centrifugo a 33 krpm durante 1 hora bajo una condición de 0° C para obtener una nata a la cual se le agrego sulfato de amonio para dar una saturación del 80%. Después de la centrifugación se disolvió un pelet en 0.02 M KH2P04 [Ph 6.75] ß-Mercaptoetanol -0.03M, y ee almaceno durante la noche a 0°C. La actividad enzimatica de AKIII se midió de acuerdo con un método de Stadman et al. [Stadtman, E.R., Cohén, G.N.,LeBras, G., y Robichon, -Szulmajster, H. ,J.Biol.Chem. , 236, 2033 (1961)]. Esto es una solución de reacción que tiene la siguiente composición se incubo a 27*C durante 45 minutos, y una solución de FeCl3 [0.4 mi HCl 2.8N + 0.4 mi TCA al 12%+ 0.7 mi FeCl3.6H20/HCl 0.1N al 5%] se agrego para deearrollar un color, y ee centrifugo eeguido por el medición de la absorbencia de la nata a 540 nm. La actividad se indico por una cantidad de acido hisoxamico generado por minuto [lU=lµmol/min] . El coeficiente de absorbción molar fue 600. Aspartato de potasio se retiro de la solución de reacción para usarse como modelo. (Composición de la solución de reacción) mezcla de reacción *1 0.3 mi solución de hidroxilamina *2 0.2 mi Aspartato de potasio 0.1 M [pH7.0] 0.1 mi Solución enzimatica Agua [balance] Total 1.0 m; *1: 9 mi Tris-HCl 1M [pH 8.1] + 0.5 mi MgS04 0.3 M + 5 mi ATP 0.2 M [pH 7.0] *2 : solución de hidroxilamina 8 M neutralizaa justo antes dell uso con KOH. Al medir la actividad enzimática de AK, se agregaron varias concentraciones de L-lisina a la soluión enzimatica de reacción y se examino el grado de inhibición por L-lisina. Los resultados se muestran en la figura 6 y la tabla 3. El tipo silvestre y los números 24, 43, 48, 60, 80, 117, 126, se muestran en la figura 6A, los números 149, 150, 156, 158, 167, 169 y 172 se ilustran en la figura 6B. Como se muestra en esos resultadoe, el AKIII tipo silvestre sufrió una fuerte inhibición por L-lisina, que se inhibió en 50% a aproximadamente 0.45 mM de L-lisina, y inhibió en aproximadamente 100% a 5 mM. Por el contrario, aunque los AKIII mutantes obtenidos esta vez tenían varios grados de desensibilizacion, la inhibición por L-lisina se deseneibilizo en lae 14 especies. Especialmente en el caso de los nos. 24, 80, 117, 169 y 172, la inhibición se observo escasamente aun a 100 mM de L-lisina, y tenían concentraciones inhibidoras del 50% qu eno fueron enores a 200 vecee en comparación con eltipo silvestre. La actividad especifica en base a la proteina total, que puede afectarse por situaciones de crecimiento de las células y preparación de muestras, fue igual o mayor a la del tipo silvestre en casi todos los casos, y hubo poco problema en la disminución de la actividad debido a la introducción de la mutación [Tabla 3]. De acuerdo con este hecho, se espero que un centro activo de AKIII fuera independiente de un punto regulador por L-lisina entre si. En la Tabla 3, el grado de desensibiliación de inhibición [%] ee refiere auna actividad Al en la preeencia de 100 mM de L-lisina en comparación con una actividad AK en la ausencia de L-lisina en la solución de reacción. La estabilidad térmica [%] se refiere a la proporción de antenimiento de actividad despuée de un tratamiento a 55'c durante 1.5 horae. Tabla 3 Actividad Grado de Eetabilidad especifica desensibiligacin térmica [U/mg proteina1 de inhibición r%V JXH Tipo silvestre 0.0247 0 18 no. 117 0.0069 120 0 no. 24 0.0218 100 30 no. 80 0.0244 99 36 no. 172 0.0189 97 0 no. 169 0.0128 96 2 no. 150 0.0062 77 25 no. 126 0.0250 61 39 no. 149 0.0256 59 9 no. 167 0.0083 43 45 no. 48 0.0228 38 42 no. 60 0.0144 35 9 no. 158 0.0224 22 42 nnoo.. 115566 00..00110011 1186 2 no. 43 0.0212 17 0 *1: Actividad AK (%) en la presencia de 199 mM de L-lisina comparada con la aactividad AK en la ausencia de L-lisina. *2: proporción de mantenimiento de actividad (%) despuée del tratamiento a 55"c durante 1.5 horae.

Subeecuentemente, la eetabilidad térmica de las enzimas mutantes se examinan. Cuando se pretendió que una exima se mejore para aumentar su actividad, es importante que la enzima creada se mantenga estable en las células. Las mediciones in vitro tuvieron algunos problemas debido a la diferencia entre las actividades de proteaea intracelular y extracelular y la influencia de loe amortiguadore para el almacenamiento in vitro de enzimas. Sin embargo, por conveniencia, la estabilidad térmica de las AKIII mutante se investigo in vitro como un parámetro. Juzgando los resultados de investigación en la temperatura de inactivación de AKIII bajo varias condiciones, se midió la proporción del mantenimiento de la actividad despuée de un tratamiento a 55°C durante 90 minutoe. Como ee muestra en la tabla 3, la mitad de las enzimas fueron mas excelentes que las tipo silvestre. Generalente, una enzima mutante frecuentemente es inestable en comapración con el tipo silveetre. Sin embargo, algunos de los AKIII mutantes obtenidos eeta vez fueron superiores al tipo silveetre en estabilidad y muchos de ellos parecían ser muy útiles en el uso practico de la producción de L-lisina. (2-2-4) Determinación de la secuencia base de lyeC tipo eilveetre y lysC mutante Una secuencia basee del gene lysC tipo silvestre obtenida esta vez se determino de cuerdo con un método ordinario usando un secuenciador de ADN modelo ABI 372A [producido por Appplied Buisystem Inc.] [SEQ. ID N0;7]. Como resultado, se encontraron diferencias en seie puntoe [dos a nivel aminoácido] de una secuencia ya publicada de lysC de una cepa de E.coli K-12 JC411 [Cassan, M. , Rarsot, C, Cohén, G.N. y Patte, J.C. , J.Biol.Chem.. 261, 1052 (1986)). Se especulo que la diferencia en los seie puntos se debe a la diferencia en la cepa bacteriana usada.

De la misma manera se determinaron secuencias de basee para cada lysC* exietentee en lae 14 eepeciee de pLUYSCl mutantes, y se determinaron los puntos de mutación. Los resultados se muestran en la tabla 4. En esta tabla las indicaciones en paréntesis muestran mutaciones de residuoe ainoacidos en base a las mutaciones de los nucleotidos. Los tipos de mutación fueron 12 tipos debido a que dos grupos [nos. 48 y 167, nos. 24 y 80] tenían exactamente los misos tipos de mutación entre las 14 especies. Con respecto a los tipos de mutación se obtuvieron por el tratamiento con hidroxilamina nos. 149, 150, 156, 158, 167, 169 y 172, y los nos. 24, 43, 48, 60, 80, 117 y 136 ee obtuvieron por medio del tratamiento NTG. sin embargo, como el modelo de mutación cualquiera de ellos residieron en la mutación de citosina a tiamina, o mutación de guanina a adenina en una tira codificante debido a la mutación de cistosina a tiraina y una cepa no codificante.

Tabla 4: Determinación de los puntos de mutación de lvsC* Tipo de mutación lysC* Mutaaeno PntQ de mu ación [ apfrip fle aminQapiflp.J No. 126 N GGT-GA*T (3 3Gly-Asp) No. 43 N GGT-GA* T (323Gly-Asp) GGC-GA+C (40ßGly-Asp) No. 149 H CGT-T+GT ( 34Arg-Cys) GGT-GA*T (323Gly-Asp) No. 48/167 N/! CTC T*TC (325Leu-Phe) No. 150 H ATG-ATA* (318Met-Ile) No. 172 H 7SC-T ( silent) ATG-ATA* (318Met-I le) GTG-A*TG (349Val-Met) No. 117 N TCA-TT*A (345Ser~Leu) No. 158 H GTG-A*TG (3°Val-Met ) No. 24/80 N/N ACC-AT*C (352Thr-Ile) No. 169 H -23C,T ( silent) '» ACC-AT*C (352Thr-Ile) TCT-TT*T (3d9Ser-Phe) No . 60 N 859G-A {silent) GAA-A*AA (164Glu-Lys ) No . 156 H ATG-ATA* (417Met-I le ) TGT-TA*T (419Cys-Tyr) 2014C-T ( silent) *:H; tratamiento con hidroxilamina; N; tratamiento NTG Ejemplo 3: Producción por fermentación de L-lisina con cepa en la cual se introdujo dapA* Con el fin de producir L-lisina usando una bacteria que pertenece al genero Escherichia , indicado en la patente japonesa publicada no. 56-18596, patente de los Estados Unidos no. 4,346,170 y Applid Migrobiology an Biotechnology, 15, 227- 231 (1982), se considera esencial que un huésped que ha de mejorarse en DDPS tenga una aspartoquinaea que ee ha modificado para que no eufra la inhibición por L-lieina. Una bacteria que pertenece al genero Eecherichia. Las bacterias que producen L-treonina puede ejemplificarse por una cepa. Como S.Marcescene productora de L-reonina, ee conoce una cepa resistente a AVH [acido a-amino-ß-hidroxi walerico] como análogo de treonina [S.Komatsubara, M.Kisumi y I. China, Appl. Environ. Microbiol., 35, 834 (1978)]. Esepci icamente, como tal cepa, ee enciona la cepa Seratia marcescens AJ13125. La cepa se deposito en el Instituto Nacional de Biosciencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Indistrial [1-3, Higaehi 1-chome, teukuba-ehi, Ibaraki-ken, 305 japón] bajo un numero de acceso de FERM P-14983 el 12 de junio de 1995 y transferido al deposito internacional de acuerdo con el Tratado de Budapest el 4 de marzo de 1996, y se le asigno un numero de acceso de FERM bp-5441. Por otro lado, dapA* contenia un pdpAS24 [en la cual el residuo de histina 118o. reeplazado con un reieudo de tirosina] se selecciono como dapA* que ha de introducirse en S.arcescene , juzgando del grado de desensibilización de inhibición y la actividad especifica de la enzima, primero, con el fin de aumentar la cantidad de expresión de dapA* y aumento de estabilidad del plasmido, el mutante dapA* ha existido en pdapAS24 [llamado de aqui en adelante como "dapA*24"] se ligo corriente abajo de un prooitor de un gene de reeistencia a la tetraciclina de pVIC40, y RSF24P, se obtuvo como se muestra en la figura 7. Una cepa obtenida al introducir el plasmidoRSF24P en la cepa de E.coli JM109 se designo AJ12395, que se deposito en Instituto Nacional de Biosciencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial el 28 de octubre de 1993, bajo el numero de acceso FERM P-13935, y transferida del deposito original al deposito internacional en base al Tratado de Budapest el 1 de noviembre de 1994, y ha sido depositada bajo el numero de acceso de FERM BP-4858. Las cepas que portaban pdapA58 y pdapAS9 no fueron depositadas, sin embargo, todos los puntos de mutación de dapA* en cada uno de los plasmidos han sido determinados como se describe antes. Asi es fácil para aquellos expertos en la técnica el recuperar el plasmido del la bacteria depositada antes mencionada usando un método de Maniatis et al. [Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. , Molecular clonins Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)]. Y obtener un gene usando un método de mutagenesie dirigida al lugar [Sambrook, J., Fritsch, E.F. , Maniatis, T. , Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory Prese, 15.63 (1969)] El plasraido RSF24P se introdujo en la cepa AJ13125 de acuerdo con un método ordinario, y se obtuvo AJ13125/RSF24P. La productividad de L-lisina de AJ13125/RSF24P se evaluó. Por otro lado, RSFP se construyo como un plasmido de control. Esto es un fragmento grande se selecciono del digesto de pVIC40 doblemente digerido con BamHl y Dral como se muestra en la figura 7, y tenia un extremo romo con fragmento de polimerasa de ADN Klenow. El fragmento grande de extremo romo se auto-lugo para obtener el plasmido RSFP. RSFP se intropdujo en la cepa AJ13125 de acuerdo con un método ordinario y se obtuvo AJ13125/RSFP. La productividad de L-lisina también se evaluó para AJ13125/RSFP. El cultivo se realizo con una gitación de 114 a 116 rpm bajo una condición de un periodo de cultivo de 72 horas a una temperatura de 30*C usando el siguiente medio. Resultadoe ee mueetran en la tabla 5. [medio par ala producción de L-lieina] A: (NH4)2S0 16 g/L KH2P04 1 g/L MgS04.7H20 1 g/L FeS04.7H20 0.1 g/L MnS04.7H2O 0.1 g/L Extracto de levadura [Difco] 2 g/L L-metionina 0.5 g/L L-treonina 0.1 g/L L-isoleucina 0.05 g/L El pH se ajusta a 7.0 con KOH para ser sometido a autoclave a 115ßC durante 10 minutos [16/20 volumen] B: 20% de glucosa [sometido a autoclave a 115°C durante 10 minutos] [4/20 volumen] C: CaC03 de farmacopea [esterilizado con calor en estado seco a 180°C durante 2 dias] [30 g/L] A y B se mezclan en la proporción de A:B=4:1, C se agrega a la mezcla en una cantidad de 30 g por litro y se disuelve, y se agrega un antibiótico [estreptomicina: 200 µg/ml]. a la 5 Cepa bacteriana Cantidad de producción de clorhidrato de L-lisina AJ13125/RSF24P 3.2 g/L AJI3125/RSFP 0 g/L Ejemplo 4: Producción por fermentación de L-lieina con la cepa a la cual se introducen dapA* y lysC* El efecto del DDPS mutante en la producción de L- lieina se ha mostrado en el ejemplo 3. Con el fin de logfrar mayor mejora, el gene AKIII mutante obtenido en el ejemplo 2 se dejo co-exietir con el gene mutante DDPS. Como el gene mutante de AKIII co-exieta con el gene DDPS mutante se selecciono uno orifinario de la cepa no. 80 f Iysc*80] juzgando de la actividad enzimatica, la estabilidad térmica y similaree. lysC*80 se uso despuée de eepararlo de un plasmido pLLC*80 [figura 8] preparada por ligado lysC* que ha existido en pLYSCl*80 [llamado de aqui en adelante lysC*80 ] corriente abajo del promitor lacZ del vector pHSG399 [producido por Takara Shuzo Co., Ltd] que tiene un punto de insercion-direccional-invertido con respecto a pUCld con el fin de aumentar la cantidad de expresión de lysC*. pLLC*80 es un plasmido preparado para arreglar pLLC*80 para permitir que la direcicon de transcripción tenga una orientacionpositiva con respecto al promotor LacZ para mejorar la productividad de L-lisina debido a que lysC*80 en pLYSCl*80 tiene eu dirección de transcripción arreglada en una orientación inversa con respecto al promotor lac . Un plasmido, RSFD80 que tiene dapA* y lysC* se prepara de pLLC*80 Y RSF24P obtenido en el ejemplo 3 como ee mueetra en la figura 9. RSFD80 incluye dapA* y lyeC* arreglado en eeta orden para permitir que la dirección de transcripción tenga una orientación positiva con respecto a un promotor [tetP]] de un gene de resietencia a la tetraciclina corriente abajo de tetP.

El plasmido RSFD80 se introdujo en una cepa «JM109 de E.coli, que se designo como AJÍ2396. AJÍ2396 se deposito en Instituto Nacional de Biosciencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial el 28 de octubre de 1993, bajo el numero de acceso FERM P-13936, y transferida del deposito original al deposito internacional en base al Tratado de Budapest el 1 de noviembnre de 1994, y ha sido depositada bajo el numero de acceso de FERM BP-4859. Las cepas que portaban pLYSCl*24, pLYSCl*43, pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSCl*117, pLYSCl*126, pLYSCl*149, pLYSCl*150, pLYSCl*156, pLYSCl*158, pLYSCl*1678, pLYSCl*169 y pLYSCl*172 no se depositaron. Sin embaro todos loe puntos de mutación de lysC* en cada uno de los plasmidos ha sido determinado coo se describe antes. Asi es fácil para aquellos expertos en la tencica el recuperar el plasmido de la bacteria anteriormente depositada usando un todo de Maniatis et al. [Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory Prese, 1.21 (1989)], y obtener un gene ueando un método de mutagenesis dirigida al lugar [Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory Prese, 15.63 (1989)]. RSFD80 ee introdujo en AJ13125 de acuerdo con un método ordinario, y ee obtuvo AJ13125/RSFD80 ee obtuvo. Se evaluó la productividad de L-lisina de AJ13125/RSFD80. La productividad de L-lisina también se evaluó para AJ13125/RSFP como control. El cultivo se realizo con una agitación de 114 a 116 rpm bajo condiciones de un periodo de cultivo de 72 horas y a una temperatura de 30°C usando el miemo medio para la producción de L-lieina como en el ejemplo 3. Loe reeultados se muestran en la tabla 6. Tabla 6 Cepa bacteriana Cantidad de producción de clorhidrato de L-lisina AJ13125/RSFD80 3.2 g/L AJI3125/RSFP 0 g/L Aplicabilidad industrial De acuerdo con la presente invención, se ha obtenido un gene mutante DDPS que se origina de una bacteria que pertenece al genero Escherichia en la cual la inhibición de retroalimentación por L-lisina es suficientemente desensibilizada. Una bacteria que pertenece al genero Seratia, gue porta el gene produce L-lisina en una cantidad considerable.

La producción de L-lisinas puede mejorarse al introducir el gen mutante DDPS en una bacteria que pertenece al genero Seratia que porta una aspartoquinasa en la cual se deseneibiliza la inhibición de retroalimentación por L-lieina.

LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE; AJINOMOTO CO. , INC. (Ü) TITULO FOR INVENCIÓN: MÉTODO PARA PRODUCIR L-LISINA B MEDIO DE FERMENTACIÓN (Üi) NUMERO DE SECUENCIAS: 14 (iv) DIRECCIÓN: (A) DESTINATARIO: Ajinomoto Co., Inc. (B) CALLE: 15-1, Kyobashi 1-chome (C) CIUDAD: Chuo-ku (D) ESTADO: Tokyo-to (E) PAÍS: Japón (F) CÓDIGO POSTAL: 104 (V) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn (vi) DATOS DE LA SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (Viii) INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO: (A) NOMBRE: (B) NUMERO DE REGISTRO: (C) NUMERO DE DOCUMENTO DE REFERENCIA: (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNIACIONES: (A) TELEFONO: (B) TELEFAX: (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) MOLECULAR TIPO: otro..ADN sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: CCGCAACTAC TGACATGACG 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLECULAR: otro..ADN sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1197 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: doble (D) TOPOLOGÍA: sencilla (ii) TIPO MOLECULAR: ADN genómico (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Escherichia coli (B) CEPA: MC1061 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: transcripto primario (B) LOCALIZACION: 248 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: E (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 272..1150 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: E (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: enlace primero ( B) LOCALIZACION : 27 . . 46 ( C ) Método DE IDENTIFICACIÓN : E ( ix ) CARACTERÍSTICA : (A) NOMBRE/CLAVE: enlace primero (B) LOCALIZACION: 1156..1175 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: E (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: RBS (B) LOCALIZACION: 261..265 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: S (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA 60 CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG 120 TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA 180 TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA 240 TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC 292 Met Phe Thr Gly Ser He Val 1 5 GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT GAA AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC 340 Ala He Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser 15 20 TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT CAT GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC 388 Leu Lys Lys Leu He Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala He 30 35 GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC GAG TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA 436 Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu 40 45 50 55 CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG ACG CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT 484 His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg He 60 65 70 CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC 532 Pro Val He Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala He Ser 75 80 85 CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA 560 Leu Thr Gln Arg Phe Asn Aep Ser Gly He Val Gly Cye Leu Thr Val 90 95 100 ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC 628 Thr Pro Tyr Tyr Aen Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe 105 110 115 AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG Lys Ala He Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln He Leu Tyr Asn Val 120 125 130 135 CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG 724 Pro Ser Arg Thr Gly Cye Aep Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu 140 145 150 GCG AAA GTA AAA AAT ATT ATC GGA ATC AAA GAG GCA ACA GGG AAC TTA 772 Ala Lys Val Lys Asn He He Gly He Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu 155 160 165 ACG CGT GTA AAC CAG ATC AAA GAG CTG GTT TCA GAT GAT TTT GTT CTG 820 Thr Arg Val Asn Gln He Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu 170 175 180 CTG AGC GGC GAT GAT GCG AGC GCG CTG GAC TTC ATG CAA TTG GGC GGT 868 Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly 185 190 195 CAT GGG GTT ATT TCC GTT ACG ACT AAC GTC GCA GCG CGT GAT ATG GCC 916 His Gly Val He Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala 200 205 210 215 CAG ATG TGC AAA CTG GCA GCA GAA GAA CAT TTT GCC GAG GCA CGC GTT 964 Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val 220 225 230 ATT AAT CAG CGT CTG ATG CCA TTA CAC AAC AAA CTA TTT GTC GAA CCC 1012 He Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro 235 240 245 AAT CCA ATC CCG GTG AAA TGG GCA TGT AAG GAA CTG GGT CTT GTG GCG 1060 Asn Pro He Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala 250 255 260 ACC GAT ACG CTG CGC CTG CCA ATG ACA CCA ATC ACC GAC AGT GGT CGT 1108 Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro He Thr Asp Ser Gly Arg 265 270 275 GAG ACG GTC AGA GCG GCG CTT AAG CAT GCC GGT TTG CTG T AAAGTTTAGG 1158 Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu 280 285 290 GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG 1197 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 292 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: sencilla (ii) TIPO MOLECULAR: peptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: Met Phe Thr Gly Ser He Val Ala He Val Thr Pro Met Aep Glu Lye 1 5 10 15 Gly Aen Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu He Asp Tyr His Val 20 25 30 Ala Ser Gly Thr Ser Ala He Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser 40 45 Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu 50 55 60 Asp Leu Ala Asp Gly Arg He Pro Val He Ala Gly Thr Gly Ala Asn 65 70 75 80 Ala Thr Ala Glu Ala He Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly 85 90 95 He Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln 100 105 110 Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala He Ala Glu His Thr Asp Leu 115 120 125 Pro Gln He Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu 130 135 140 Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn He He Gly He 145 150 155 160 Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln He Lys Glu Leu 165 170 175 Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val He Ser Val Thr Thr Asn 195 200 205 Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu 210 215 220 His Phe Ala Glu Ala Arg Val He Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His 225 230 235 240 Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro He Pro Val Lys Trp Ala Cys 245 250 255 Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr 260 265 270 Pro He Thr Aep Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His 275 280 285 Ala Gly Leu Leu 290 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLECULAR: otro..ADN sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLECULAR: otro..ADN sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6: GAATTCCTTT GCGAGCAG 18 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2147 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: doble (D) TOPOLOGÍA: sencilla (ii) TIPO MOLECULAR: ADN genómico (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Escherichia coli (B) CEPA: MC1061 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: -35 signal (B) LOCALIZACION: 242..249 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: S (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: -10 signal (B) LOCALIZACION: 265..273 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: S (ÍX) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: enlace primero (B) LOCALIZACION: 536..555 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: E (ÍX) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: enlace primero (B) LOCALIZACION: 2128..2147 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: E (ÍX) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: RBS (B) LOCALIZACION: 575..578 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: S (ÍX) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 584..1933 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: S (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: terminal (B) LOCALIZACION: 1941..1968 (C) Método DE IDENTIFICACIÓN: S (xí) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60 AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120 AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180 AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240 CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC 300 CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360 AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420 TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480 ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540 CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595 Met Ser Glu He 1 GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643 Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met 5 10 15 20 AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691 Asn Arg Ser Ala Asp He Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val 25 30 35 GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739 Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly He Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala 40 45 50 GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787 Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala He Arg 55 60 65 AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835 Asn He Gln Phe Ala He Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val He 70 75 80 CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 8d3 Arg Glu Glu He Glu Arg Leu Leu Glu Asn He Thr Val Leu Ala Glu 85 90 95 100 GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser 105 110 115 CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979 His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu He Leu Arg Glu 120 125 130 CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027 Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr 135 140 145 AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075 Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp He Ala Ala Leu Ala Glu 150 155 160 CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123 Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val He 165 170 175 180 ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171 Thr Gln Gly Phe He Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu 185 190 195 GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219 Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu 200 205 210 CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267 His Ala Ser Arg Val Asp He Trp Thr Asp Val Pro Gly He Tyr Thr 215 220 225 ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315 Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg He Asp Glu He Ala 230 235 240 TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363 Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His 245 250 255 260 CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411 Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp He Pro Val Phe Val 265 270 275 GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459 Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys 280 285 290 ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507 Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln 295 300 305 ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555 Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe 310 315 320 CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603 Leu Ala Glu Val Phe Gly He Leu Ala Arg His Asn He Ser Val Asp 325 330 335 340 TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651 Leu He Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr 345 350 355 GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699 Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met 360 365 370 GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747 Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu 375 380 385 GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795 Val Ala Leu He Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys 390 395 400 GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843 Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn He Arg Met He Cys Tyr 405 410 415 420 GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891 Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala 425 430 435 GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940 Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu 440 445 ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000 ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT 2060 ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120 TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 449 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: sencilla (ii) TIPO MOLECULAR: peptido (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: Met Ser Glu He Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp 1 5 10 15 Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp He Val Leu Ser Asp Ala Asn 25 30 Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly He Thr Aen Leu Leu 40 45 Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lye Leu 50 55 60 Aep Ala He Arg Aen He Gln Phe Ala He Leu Glu Arg Leu Arg Tyr 65 70 75 80 Pro Aen Val He Arg Glu Glu He Glu Arg Leu Leu Glu Asn He Thr 85 90 95 Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp 100 105 110 Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu 115 120 125 He Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys 130 135 140 Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp He Ala 145 150 155 160 Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu 165 170 175 Gly Leu Val He Thr Gln Gly Phe He Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg 180 185 190 Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu 195 200 205 Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp He Trp Thr Asp Val Pro 210 215 220 Gly He Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg He 225 230 235 240 Asp Glu He Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala 245 250 255 Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp He 260 265 270 Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu 275 280 285 Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu 290 295 300 Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His 305 310 315 320 Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly He Leu Ala Arg His Asn 325 330 335 He Ser Val Asp Leu He Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr 340 345 350 Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln 355 360 365 Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu 370 375 380 Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu He Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys 385 390 395 400 Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn He Arg 405 410 415 Met He Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro 420 425 430 Gly Glu Aep Ala Glu Gln Val Val Gln Lye Leu Hie Ser Aen Leu Phe 435 440 445 Glu (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLECULAR: otro..ADN sintético (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLECULAR: otro..ADN sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLECULAR: otro..ADN sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: TTTATTCATA ATTGCCACCG 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLECULAR: otro..ADN sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12: CACGGTAATA CATATAACCG 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLECULAR: otro..ADN sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: CCTGCAATTG TCAAACGTCC 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE TIRA: eencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLECULAR: otro..ADN sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: GTCGACGCGC TTGAGATCTT 20

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES 1.- Una bacteria que pertenece al genero Seratia , que se transforma al introducir en sue célulae, un ADN que codifica a una eintaea de dihidrodipicolinato que tiene la mutación para deeensibilizar la inhibición de retroalimentación por L-lisina.
2. 2.- Un ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual la sintasa de dihidrodipicolinato es una natural de una bacteria que pertenece al genero Seratia.
3. 3.- Una bacteria que pertenece al genero Seratia de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual la mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación por medio de L-lieina ee eelecciona del grupo que coneiete de mutación para reemplazar un reeiduo de alanina 81o. con un reeiduo de valina, mutación para reemplazar un residuo de histidina 118o. con un residuo de tirosina y mutación para reemplazar el residuo de alanina 81o. con el residuo de valina y reemplazar el residuo de histidina 118o. con el residuo de tirosina, contado desde la terminal N en una secuencia aminoacida de sintaea de dihidrodipicolinato definida en la identificación de eecuencia SEQ ID NO: 4 en el lietado de eecuencia.
4. 4.- Una bacteria que pertenece al genero Seratia, de acuerdo con la reivindicación 1, que ademáe porta una aepartoquinasa en la cual se desensibiliza la inhibición de retroalimentación por medio de L-lisina.
5. 5.- Una bacteria que pertenece al genero Seratia , de acuerdo con la reivindicación 4, que además porta una aspartoquinasa en la cual se deseneibiliza la inhibición de retroalimentación por medio de L-lieina, obtenida al introducir en eus células un ADN que codifique para una aspartoquinasa que tiene una mutación para deseneibilizar la inhibición de retroalimentación por L-lieina.
6. 6.- Una bacteria que pertenece al genero Seratia , de acuerdo con la reivindicación 5, en la cual la aepartoquinasa es una aspartoquinaea III que ee natural a una bacteria que pertenece al genero Eecherichia.
7. 7.- Una bacteria que pertenece al genero Seratia , de acuerdo con la reivindicación 6, en la cual la mutación para desensibilizar la inhibición de retroalimentación de la aspartoquinaea III por L-lisina se selecciona del grupo que consiete de la mutación para reemplazar un reeiduo de glicina 323o. con un reeiduo de ácido aspartico, mutación para reemplazar el residuo de glicina 323o. a un residuo de glicina 408o. con un residuo de ácido aspartico, mutación para reemplazar un residuo de arginina 34o. con un residuo de cisteina y reemplazar el residuo de glicina 323o. con el residuo de ácido aspartico, mutación para reemplazar un residuo de leucina 325o con un residuo de fenilalanina, mutación para reemplazar un residuo de metionina 318o. con un residuo de isoleucina, mutación para reemplazar el residuo de metionina 318o. con el residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de valina 349o. con un residuo de metionina, mutación para reemplazar un resido de valina 347o. con un residuo de metionina, mutación para reemplazar un residuo de treonina 352o. con un residuo de isoleucina, mutación para reemplazar el residuo de treonina 352 con el residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de serina 369o. con un residuo de fenilalanina, mutación para reemplazar un residuo de ácido gluta ico 164o con un residuo de lisina, y mutación para reemplazar un residuo de metionina 417o con un residuo de isoleucina y reemplazar un residuo de cisteina 419o. con un residuo de tirosina, contado desde la terminal N en una secuencia aminoacida de aspartoquinasa III definida en la SEQ ID NO:ß en el listado de secuencia.
8. 8.- Una bacteria que pertenece al genero Seratia de acuerdo con la reivindicación 1, que es deficiente en descarboxilasa de lisina.
9. 9.- Un método para producir L-lisina que comprende las etapas de cultivar las bacterias que pertenecen al genero Seratia como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un medio apropiado, producir y acumular L-lisina en una cultiva del mismo y recolectar L-lisina del cultivo.