BRPI0715584B1

BRPI0715584B1 - método para produzir um l-aminoácido

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Publication number: BRPI0715584B1
Application number: BRPI0715584A
Authority: BR
Inventors: Borisovna Altman Irina; Romanovich Ptitsyn Leonid; Nikolaevna Mokhova Olga; Abramovna Yampolskaya Tatyana; Aleksandrovna Kotliarova Veronika; Ivanovich Kozlov Yury
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2006-07-19
Filing date: 2007-07-12
Publication date: 2017-01-31
Also published as: JP5407858B2; WO2008010565A3; BRPI0715584A2; US20090203090A1; CN101490251A; US20150203881A1; JP2009543543A; WO2008010565A2; CN103215319A; BRPI0715584B8; EP2046949A2; EP2046949B1; CN101490251B

Abstract

metodo para produzir um l-aminoácido. método para produzir um l-aminoácido é descrito, por exemplo, l-treonina, l-lisina, l-histidina, l-fenilalanina, l-arginina, l-triptofano, ou ácido l-glutâmico, usando uma bactéria da família enterobaci'eriaceae, em que a bactéria tenha sido modificada para acentuar uma atividade de um álcool desidrogenase selvagem codificada pelo gene adhe ou uma álcool desidrogenase mutante que é resistente a inativação aeróbica.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO” Campo técnico A presente invenção se relaciona à indústria microbiológica e especificamente a um método para produzir um L-aminoácido tal como L-treonina, L-lisina, L-histidina, L-fenilalanina, L-arginina, L-triptofano, ácido L-glutâmico e L-leucina por fermentação usando uma bactéria com uma atividade acentuada de álcool desidrogenase. Técnica antecedente Convencionalmente, L-aminoácidos são produzidos industrialmente por métodos de fermentação utilizando cepas de microorganismos obtidos a partir de fontes naturais, ou mutantes destas. Tipicamente, os microorganismos são modificados para acentuar rendimentos de produção de L-aminoácidos.

Muitas técnicas para acentuar rendimentos de produção de L-aminoácidos foram relatadas, incluindo transformação de microorganismos com DNA recombinante (Patente US No. 4.278.765). Outras técnicas para acentuar rendimentos de produção incluem aumentar as atividades de enzimas envolvidas em biossíntese de aminoácidos e/ou dessensibilização de enzimas alvo à inibição por retroalimentação pelo L-aminoácido resultante (Patentes US Nos. 4.346.170, 5.661.012 e 6.040.160).

Pela otimização da via biossintética principal de um composto desejado, melhoramento adicional de cepas produtoras de L-aminoácidos pode ser executado. Tipicamente, isto é executado através da suplementação da bactéria com quantidades crescentes de fonte de carbono tal como açúcares, por exemplo, glicose. Apesar da eficiência do transporte de glicose por PTS, acesso para a fonte de carbono em uma cepa altamente produtiva pode ainda ser insuficiente. Outro modo de aumentar a produtividade de cepas produtoras de L-aminoácidos e diminuir o custo do L-aminoácido alvo é usar uma fonte alternativa de carbono, tal como álcool, por exemplo, etanol. Álcool desidrogenase (etanol oxirredutase, AdhE) de Escherichia coli é uma enzima multifuncional que catalisa a produção fermentativa de etanol por duas reduções NADH-dependentes seqüenciais de acetil-CoA, assim como desativação de piruvato formiato-liase, que cliva piruvato em acetil-CoA e formiato.

AdhE é sintetizada abundantemente (cerca de 3x104) cópias por célula) durante o crescimento anaeróbico na presença de glicose e forma estruturas helicoidais, chamadas espirossomos, que possuem cerca de 0,22 pm de comprimento e contêm 40-60 moléculas de AdhE (Kessler, D., Herth, W., e Knappe, J., J. Boi. Chem., 267: 18073-18079 (1992)). Quando a cultura de E. coli é transferida de condições anaeróbicas para aeróbicas, a transcrição do gene adhE é reduzida e mantida em 10% da faixa encontrada sob anaerobiose (Chen, Y. M., e Lin, C. C., J. Bacteriol. 173: 8009-8013 (1991); Leonardo, M. R., Cunningham, R R., e Clark, D. R, J. Bacteriol. 175: 870-878 (1993); Mikulskis, A., Aristarkhov, A., e Lin, E. C. C., J. Bacteriol. 179: 7129-7134 (1997); Membrillo-Hemandez, J., e Lin, E. C. C., J. Bacteriol. 181: 75717579 (1999)). A tradução também é regulada e requer RNAse III (Membrillo-Hemandez, J., e Lin, E. C. C., J. Bacteriol. 181: 7571-7579 (1999); Aristarkhov, A. et al., J. Bacteriol. 178: 4327-4332 (1996)). AdhE foi identificada como um dos principais alvos quando células de E. coli são submetidas estresse por peróxido de hidrogênio (Tamarit, J., Cabiscol, E., e Ros, J., J. Biol. Chem. 273, 3027-3032 (1998)).

Apesar da reversibilidade das duas reações acopladas a NADH catalisadas por AdhE, E. coli selvagem não é capaz de crescer na presença de etanol como a única fonte de carbono e energia, devido ao gene adhE ser transcrito aerobicamente em níveis diminuídos (Chen, Y. Μ. E Lin, E. C. C., J. Bacteriol. 73: 8009-8013 (1991); Leonardo, M. R., Cunningham, P. R. & Clark, D. P., J. Bacteriol. 175: 870-878 (1993)) e a meia-vida da proteína AdhE é encurtada durante o metabolismo aeróbico por oxidação catalisada por metal (MCO).

Mutantes de E. coli capazes de crescimento aeróbico em etanol como a única fonte de carbono e energia foram isolados e caracterizados (mutantes com a substituição Ala267Thr cresceram na presença de etanol com um tempo de geração de 240 min; com as substituições Ala267Thr e Glu568Lys, um tempo de geração de 90 min a 37°C) (Membrillo-Hemandez, J. et al., J. Biol. Chem. 275: 33869-33875 (2000); Holland-Staley, C. A. et ai, J. Bacteriol. 182: 6049-6054 (2000)). Aparentemente, quanto às duas reações seqüenciais são catalisadas numa direção oposta àquela de uma fisiológica, a formação de acetil-CoA é velocidade-limitante para AdhE selvagem. O fator limitante para melhorar a Vmax pela substituição A267T na AdhE é estabilidade de enzima termal diminuída e sensibilidade a dano por MCO aumentada. A segunda substituição de aminoácidos, E568K, na AdhE (A267T/E568K) restaurou parcialmente a estabilidade da proteína e resistência a dano por MCO sem melhora adicional de eficiência catalítica na oxidação de substrato.

Entretanto, não há relatos até esta data de uso de uma bactéria da família Enterobacteriaceae que tenham uma atividade acentuada de álcool desidrogenase nativa ou álcool desidrogenase resistente à inativação aeróbica para aumentar a produção de L-aminoácidos por fermentação em um meio de cultura contendo etanol.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Objetivos da presente invenção incluem acentuar a produtividade de cepas produtora de L-aminoácidos e prover um método para produzir L-aminoácidos aromáticos ou não aromáticos usando essas cepas.

Este objetivo foi atingido pela descoberta de que expressar o gene adhE nativo ou mutante que codifica álcool desidrogenase sob o controle de um promotor que funciona sob uma condição de cultivo aeróbica acentua a produção de L-aminoácidos, por exemplo, L-treonina, L-lisina, L- histidina, L-fenilalanina, L-arginina, L-triptofano, ácido L-glutâmico e/ou L-leucina. É um objetivo da presente invenção prover um método para produzir um L-aminoácido compreendendo: A) cultivar em um meio de cultura contendo etanol uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae que tem uma álcool desidrogenase e B) isolar o L-aminoácido da meio de cultura, em que o gene codificando a citada álcool desidrogenase é expresso sob o controle de um promotor não nativo que funciona sob condições de cultivo aeróbico. É um objetivo adicional da presente invenção prover o método descrito acima, em que o citado promotor não nativo é selecionado do grupo que consiste em Ptac, Plac, Ptrp, Ptrc, PR e PL. É um objetivo adicional da presente invenção prover o método descrito acima, em que a citada álcool desidrogenase é resistente a inativação aeróbica. É um objetivo adicional da presente invenção prover o método descrito acima, em que a citada álcool desidrogenase origina-se de uma bactéria selecionada do grupo que consiste em Escherichia coli, Erwinia carotovora, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia pestis, Pantoea ananatis, Lactobacillus plantarum e Lactococcus lactis. É um objetivo adicional da presente invenção prover o método descrito acima, em que a citada álcool desidrogenase compreende a seqüência de aminoácidos exposta em SEQ ID NO: 2, exceto pelo resíduo de ácido glutâmico na posição 568 ser substituído por outro resíduo de aminoácido fora um resíduo de ácido aspártico. É um objetivo adicional da presente invenção prover o método descrito acima, em que a citada álcool desidrogenase compreende a seqüência de aminoácidos exposta em SEQ ID NO: 2, exceto pelo resíduo de ácido glutâmico na posição 568 ser substituído por um resíduo de lisina. É um objetivo adicional da presente invenção prover o método descrito acima, em que a citada álcool desidrogenase tem pelo menos uma mutação adicional que é capaz de melhorar o crescimento da citada bactéria em um meio líquido que contém etanol como a única fonte de carbono. É um objetivo adicional da presente invenção prover o método descrito acima, em que a citada mutação adicional é selecionada do grupo que consiste em: A) substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 560 na SEQ ID NO: 2 por outro resíduo de aminoácido; B) substituição do resíduo de fenilalanina na posição 566 na SEQ ID NO: 2 por outro resíduo de aminoácido; C) substituição do resíduo de ácido glutâmico, do resíduo de metionina, do resíduo de tirosina, do resíduo de isoleucina e do resíduo de alanina nas posições 22, 236, 461, 554 e 786, respectivamente, na SEQ ID NO: 2 por outros resíduos de aminoácidos e D) combinações destes. É um objetivo adicional da presente invenção prover o método descrito acima, em que a citada mutação adicional é selecionada do grupo que consiste em: A) substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 560 na SEQ ID NO: 2 por um resíduo de lisina; B) substituição do resíduo de fenilalanina na posição 566 na SEQ ID NO: 2 por um resíduo de valina; C) substituição do resíduo de ácido glutâmico, do resíduo de metionina, do resíduo de tirosina, do resíduo de isoleucina e do resíduo de alanina nas posições 22, 236, 461, 554 e 786, respectivamente, na SEQ ID NO: 2 por um resíduo de glicina, um resíduo de valina, um resíduo de cisterna, um resíduo de serina e um resíduo de valina, respectivamente e D) combinações destes. É um objetivo adicional da presente invenção prover o método descrito acima, em que a citada bactéria pertence ao gênero selecionado do grupo que consiste em Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella e Morganella. E um objetivo adicional da presente invenção prover o método descrito acima, em que o citado L-aminoácido é selecionado do grupo que consiste em L-treonina, L-lisina, L-histidina, L-fenilalanina, L-arginina, L-triptofano, ácido L-glutâmico e/ou L-leucina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS A álcool desidrogenase é uma proteína multifuncional dependente de Fe com uma atividade de acetaldeído-CoA desidrogenase na extremidade N-terminal, uma atividade de álcool desidrogenase dependente de ferro na extremidade C-terminal e uma atividade de piruvato-formiato liase desativase. Sinônimos incluem BI241, AdhC e Ana. Sob condições aeróbicas, a meia-vida da proteína AdhE ativa é encurtada durante o metabolismo aeróbico por oxidação catalisada por metal. Na presente invenção, a frase “atividade de álcool desidrogenase” significa uma atividade de catalisar a reação de oxidação dependente de NAD de álcoois em aldeídos ou cetonas. A álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1) trabalha bem com etanol, n-propanol e n-butanol. A atividade de álcool desidrogenase pode ser detectada e medida, por exemplo, pelo método descrito por Membrillo-Hemandez, J. et al., (J. Biol. Chem. 275: 33869-33875 (2000)). A álcool desidrogenase é codificada pelo gene adhE e qualquer gene adhE derivado de ou nativo a bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia, Erwinia, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Yersinia, Pantoea, Lactobacillus e Lactococcus pode ser usado como o gene de álcool desidrogenase na presente invenção. Exemplos específicos da fonte do gene adhE incluem cepas bacterianas tal como Escherichia coli, Erwinia carotovora, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia pseudotuberculosis, Pantoea ananatis, Lactobacillus plantarum e Lactococcus lactis. O gene adhE selvagem que codifica álcool desidrogenase de Escherichia coli foi elucidado (números nucleotídicos complementares aos números 1294669 até 1297344 na seqüência de acesso do GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene adhE está localizado entre as ORFs de ychG e ychE no cromossomo de E. coli K-12. Outros genes adhE que codificam álcool desidrogenases também foram elucidados: gene adhE de Erwinia carotovora (números nucleotídicos 2634501 até 2637176 na seqüência de acesso GenBank NC_004547.2; gi: 50121254); gene adhE de Salmonella enterica (números nucleotídicos 1718612 até 1721290 na seqüência de acesso GenBank NC_004631.1; gi: 29142095); gene adhE de Salmonella typhimurium (números nucleotídicos 1 até 2637 na seqüência de acesso GenBank U68173.1; gi: 1519723); gene adhE de Shigella flexneri (números nucleotídicos complementares aos números 1290816 até 1293491 na seqüência de acesso GenBank NC 004741.1, gi: 30062760); gene adhE de Yersinia pseudotuberculosis (números nucleotídicos complementares aos números 2478099 até 2480774 na seqüência de acesso GenBank NC_006155.1, gi: 51596429), gene adhE de Pantoea ananatis (SEQ ID NO: 29), gene adhE de Lactobacillus plantarum (Entrada de UniProtKB: Q88RY9 LACPL), gene adhE de Lactococcus lactis MG1363 (EMBL no. de acesso AJ001007) e semelhantes (veja a Figura 2). A seqüência nucleotídica do gene de adhE de Escherichia coli é representada pela SEQ ID NO: 1. A seqüência de aminoácidos codificada por este gene de adhE é representada pela SEQ ID NO: 2.

Portanto, o gene adhE pode ser obtido por PCR (reação em cadeia da polimerase; referir a White, T. J. et al., Trends Genet. 5: 185 (1989)) utilizando iniciadores preparados com base na seqüência nucleotídica conhecida do gene do cromossomo de E. coli. Genes que codificam álcool desidrogenase de outros microorganismos podem ser obtidos de uma maneira similar. O gene adhE derivado de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2; ou (B) uma proteína variante da seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, que tem uma atividade de álcool desidrogenase. O gene adhE derivado de Pantoea ananatis é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 30; ou (B) uma proteína variante da seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 30, que tem uma atividade de álcool desidrogenase. O gene adhE derivado de Shigella flexneri é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 53; ou (B) uma proteína variante da seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 53, que tem uma atividade de álcool desidrogenase. O gene adhE derivado de Yersinia pestis é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 54; ou (B) uma proteína variante da seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 54, que tem uma atividade de álcool desidrogenase. O gene adhE derivado de Erwinia carotovora é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 55; ou (B) uma proteína variante da seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 55, que tem uma atividade de álcool desidrogenase. O gene adhE derivado de Salmonella typhimurium é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 56; ou (B) uma proteína variante da seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 56, que tem uma atividade de álcool desidrogenase. O gene adhE derivado de Lactobacillus plantarum é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 57; ou (B) uma proteína variante da seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 57, que tem uma atividade de álcool desidrogenase. O gene adhE derivado de Lactococcus lactis é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58; ou (B) uma proteína variante da seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58, que tem uma atividade de álcool desidrogenase. A frase “proteína variante” como utilizada na presente invenção significa uma proteína que tem alterações na seqüência, quer elas sejam deleções, inserções, adições ou substituições de aminoácidos, mas ainda mantenham atividade de álcool desidrogenase em um nível útil. O número de alterações na proteína variante depende da posição da estrutura tridimensional da proteína ou do tipo de resíduo de aminoácido. O número de alterações pode ser de 1 até 30, de preferência 1 até 15 e de maior preferência 1 até 5, em relação à proteína (A). Essas alterações nas variantes são mutações conservativas que preservam a função da proteína. Em outras palavras, essas alterações podem ocorrer em regiões da proteína que não sejam críticas para a função da proteína. Isto porque alguns aminoácidos têm alta homologia uns com os outros, desse modo a estrutura tridimensional ou atividade não é afetada por tal alteração. Portanto, a variante de proteína (B) pode ser uma que tenha uma identidade de não menos de 70%, de preferência não menos de 80% e de maior preferência não menos de 90% e da maior preferência não menos de 95% com respeito à seqüência de aminoácidos inteira da álcool desidrogenase mostrada na SEQ ID NO: 2, assim como a atividade da álcool desidrogenase é mantida. A homologia entre duas seqüências de aminoácidos pode ser determinada usando os métodos bem conhecidos, por exemplo, o programa de computador BLAST 2.0, que calcula três parâmetros: pontuação, identidade e similaridade. A substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou de vários resíduos de aminoácidos deve ser mutação(ões) conservativa para que a atividade seja mantida. A mutação conservativa representativa é uma substituição conservativa. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de Ala por Ser ou Thr, substituição de Arg por Gin, His ou Lys, substituição de Asn por Glu, Gin, Lys, His ou Asp, substituição de Asp por Asn, Glu ou Gin, substituição de Cys por Ser ou Ala, substituição de Gin por Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg, substituição de Glu por Asn, Gin, Lys ou Asp, substituição de Gly por Pro, substituição de His por Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr, substituição de Ile por Leu, Met, Vai ou Phe, substituição de Leu por Ile, Met, Vai ou Phe, substituição de Lys por Asn, Glu, Gin, His ou Arg, substituição de Met por Ile, Leu, Vai ou Phe, substituição de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu, substituição de Ser por Thr ou Ala, substituição de Thr por Ser ou Ala, substituição de Trp por Phe ou Tyr, substituição de Tyr por His, Phe ou Trp e substituição de Vai por Met, Ile ou Leu.

Dados comparando as seqüências primárias de álcool desidrogenase de Escherichia coli, Shigella flexneri, Pantoea ananatis, Yersinia pestis, Erwinia carotovora, Salmonella typhimurium (bactérias Gram-negativas) e Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis (bactérias Gram-positivas), mostram um alto nível de homologia entre essas proteínas (veja a Figura 2). Deste ponto de vista, substituições ou deleções dos resíduos de aminoácidos que são idênticos (marcados por asterisco) em todas as proteínas acima mencionadas poderíam ser cruciais para a função delas. E possível substituir resíduos de aminoácidos similares (marcados por dois pontos) pelos resíduos de aminoácidos similares sem deterioração da atividade da proteína. Porém, modificações de outros resíduos de aminoácidos não conservados podem não levar a alteração da atividade de álcool desidrogenase. O DNA que codifica consideravelmente a mesma proteína que a álcool desidrogenase descrita acima pode ser obtido, por exemplo, pela modificação da seqüência nucleotídica de DNA que codifica álcool desidrogenase (SEQ ID NO: 1), por exemplo, por meio de mutagênese sítio-dirigida para que a seqüência nucleotídica responsável por um ou mais resíduos de aminoácidos em um sítio especificado seja deletada, substituída, inserida ou adicionada. O DNA modificado como acima descrito pode ser obtido por tratamentos de mutação convencionalmente conhecidos. Tais tratamentos incluem tratamento por hidroxilamina do DNA que codifica proteínas da presente invenção, ou tratamento de bactéria contendo o DNA com irradiação de UV ou com um reagente tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina ou ácido nitroso.

Um DNA que codifica consideravelmente a mesma proteína que a álcool desidrogenase pode ser obtido pela expressão de DNA que tem uma mutação como acima descrita em uma célula apropriada e investigação da atividade de qualquer produto expresso. Um DNA que codifica consideravelmente a mesma proteína que álcool desidrogenase também pode ser obtido pelo isolamento de um DNA que seja capaz de se hibridizar com uma sonda que tem uma seqüência nucleotídica que contém, por exemplo, a seqüência nucleotídica mostrada como SEQ ID NO: 1, sob condições estringentes e codifica uma proteína que tem atividade de álcool desidrogenase. As “condições estringentes” referidas a esse respeito são condições sob as quais os também chamados híbridos específicos são formados e híbridos não específicos não são formados. Por exemplo, condições estringentes podem ser exemplificadas por condições sob as quais DNAs que têm alta homologia, por exemplo, DNAs que têm identidade de não menos de 50%, de preferência não menos de 60%, de maior preferência de 70%, ainda de maior preferência não menos de 80%, de preferência adicional não menos de 90% e da maior preferência não menos de 95%, são capazes de se hibridizarem uns com os outros, mas DNAs que têm identidade menor que as acima não são capazes de se hibridizarem uns com os outros. Senão, condições estringentes podem ser exemplificadas por condições sob as quais DNA é capaz de se hibridizar em uma concentração salina equivalente a condições de lavagem ordinárias em hibridização de Southern, isto é, SSC 1 x, SDS 0,1%, de preferência SSC 0,1 x, SDS 0,1%, a 60°C. A duração da lavagem depende do tipo de membrana usada para a transferência e, como regra, do que é recomendado pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada da lavagem da membrana de náilon Hybond™ N+ (Amersham) sob condições estringentes é de 15 minutos. De preferência, a lavagem pode ser realizada 2 até 3 vezes.

Uma seqüência parcial da seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 também pode ser utilizada como sonda. Sondas podem ser preparadas por PCR usando iniciadores com base na seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 e um fragmento de DNA contendo a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 como um gabarito. Quando um fragmento de DNA que têm um comprimento de cerca de 300 pb é usado como a sonda, as condições de hibridização para lavagem incluem, por exemplo, 50°C, SSC 2 x e SDS 0,1%. A substituição, deleção, inserção, ou adição de nucleotídeos como acima descrito também inclui mutações que ocorrem naturalmente (mutante ou variante), por exemplo, devido à diversidade na espécie ou gênero de bactéria e que contenham a álcool desidrogenase.

Uma álcool desidrogenase selvagem pode ser submetida à oxidação catalisada por metal. Embora tal álcool desidrogenase selvagem possa ser usada, uma álcool desidrogenase mutante que é resistente a inativação aeróbica é preferível na presente invenção. A frase “álcool desidrogenase mutante que é resistente a inativação aeróbica” significa que a álcool desidrogenase mutante mantém sua atividade sob condições aeróbicas, ou que a atividade é reduzida em uma quantidade negligenciável comparada com a álcool desidrogenase selvagem.

No caso do gene de AdhE de E. coli, a álcool desidrogenase selvagem compreende a seqüência de aminoácidos exposta em SEQ ID NO: 2. Um exemplo de uma mutação na álcool desidrogenase de SEQ ID NO: 2 que resulta na proteína tomando-se resistente a inativação aeróbica é a substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 568 por um resíduo de lisina. Entretanto, a introdução de uma mutação no gene adhE, por exemplo, na posição 568 na SEQ ID NO: 2, pode levar ao retardo de crescimento em um meio líquido contendo etanol como uma fonte de carbono e em tal caso, é preferível que a álcool desidrogenase mutante tenha pelo menos uma mutação adicional que seja capaz de melhorar o crescimento da bactéria em um meio líquido que contém etanol como a única fonte de carbono. Por exemplo, o crescimento de E. coli é melhorado quando o resíduo de ácido glutâmico na posição 568 na álcool desidrogenase de SEQ ID NO: 2 é substituído por outro aminoácido pela introdução de uma mutação adicional selecionada do grupo que consiste em: A) substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 560 na SEQ ID NO: 2 por outro resíduo de aminoácido, p. ex., um resíduo de lisina; B) substituição do resíduo de fenilalanina na posição 566 na SEQ ID NO: 2 por outro resíduo de aminoácido, p. ex., um resíduo de valina; C) substituição do resíduo de ácido glutâmico, do resíduo de metionina, do resíduo de tirosina, do resíduo de isoleucina e do resíduo de alanina nas posições 22, 236, 461, 554 e 786, respectivamente, na SEQ ID NO: 2 por outros resíduos de aminoácido, p. ex., um resíduo de glicina, um resíduo de valina, um resíduo de cisteína, um resíduo de serina e um resíduo de valina, respectivamente e D) combinações destes. A referência a números de posição em uma seqüência, por exemplo, a expressão “resíduos de aminoácidos nas posições 22, 236, 554, 560, 566, 568 e 786” se refere às posições desses resíduos na seqüência de aminoácidos da AdhE selvagem de E. coli. Entretanto, a posição de um resíduo de aminoácido pode mudar. Por exemplo, se um resíduo de aminoácido é inserido na porção N-terminal, o resíduo de aminoácido localizado inerentemente na posição 22 toma-se de posição 23. Em tal caso, o resíduo de aminoácido na posição original 22 é o resíduo de aminoácido na posição 22 na presente invenção. A AdhE mutante pode incluir deleção, substituição, inserção ou adição de um ou diversos aminoácidos em uma ou em uma pluralidade de posições fora posições identificadas em A) até C) acima, contanto que a atividade de AdhE não seja perdida ou reduzida. A AdhE mutante e gene adhE mutante de acordo com a presente invenção podem ser obtidas a partir do gene adhE selvagem, por exemplo, por mutagênese sítio-específica usando métodos ordinários, tal como PCR (reação em cadeia da polimerase; referem-se a White, T. J. et al., Trends Genet. 5: 185 (1989)) utilizando iniciadores preparados com base na seqüência nucleotídica do gene. A transcrição do gene adhE em E. coli selvagem é induzida apenas sob condições anaeróbicas, em grande parte em resposta a níveis elevados de NADEI reduzido (Leonardo, M. R., Cunningham, R R. & Clark, D. P„ J. Bacteriol. 175: 870-878 (1993)).

Na presente invenção, uma cepa bacteriana usada para produzir um L-aminoácido é modificada de modo que a expressão do gene adhE seja controlada por um promotor não nativo, isto é, um promotor que não controle a expressão do gene adhE em uma cepa selvagem. Tal modificação pode ser obtida pela substituição do promotor nativo do gene adhE no cromossomo por um promotor não nativo que funcione sob uma condição de cultivo aeróbico de modo que o gene adhE esteja operacionalmente ligado ao promotor não nativo. Como um promotor não nativo que funciona sob condições de cultivo aeróbico, qualquer promotor que possa expressar o gene adhE acima de um certo nível sob condições de cultivo aeróbico pode ser usado. Com referência ao nível da proteína AdhE na presente invenção, a atividade de álcool desidrogenase no extrato livre de célula mensurada de acordo com o método de Clark e Cronan (J. Bacteriol. 141: 177-183 (1980)) deve ser de 1,5 unidades ou mais, de preferência 5 unidades ou mais e de maior preferência 10 unidades ou mais, por mg de proteína. Condições de cultivo aeróbico podem ser aquelas geralmente usadas para cultivo de bactérias em que o oxigênio é fornecido por métodos tal como agitamento, aeração e agitação. Especificamente, qualquer promotor que é conhecido por expressar um gene sob condições de cultivo aeróbico pode ser usado. Por exemplo, promotores dos genes envolvidos na glicólise, na via de pentose fosfato, ciclo TCA, vias de biossíntese de aminoácidos, etc., podem ser usados. Além disso, o promotor Ptac, o promotor lac, o promotor trp, o promotor trc, o PR, ou os promotores PL do fago lambda são todos conhecidos por serem promotores fortes que funcionam sob condições de cultivo aeróbico e são usados de preferência. O uso de um promotor não nativo pode ser combinado com a multiplicação de cópias gênicas. Por exemplo, inserir o gene adhE operacionalmente ligado a um promotor não nativo em um vetor que é capaz de funcionar em uma bactéria da família Enterobacteriaceae e introduzir o vetor na bactéria aumenta o número de cópias do gene em uma célula. De preferência, vetores de baixa-cópia são usados. Exemplos de vetores de baixa-cópia incluem, mas, não estão limitados a, pSClOl, pMW118, pMW119 e semelhantes. O termo “vetor de baixa cópia” é usado para vetores, o número de cópias dos quais é de até 5 cópias por célula. O aumento do número de cópias do gene adhE também pode ser obtido pela introdução de múltiplas cópias do gene no DNA cromossômico da bactéria, por exemplo, por recombinação homóloga, integração Mu e semelhantes. A recombinação homóloga é efetuada usando uma seqüência que está presente em cópias múltiplas como alvo no DNA cromossômico. Seqüências que têm múltiplas cópias no DNA cromossômico incluem, mas não estão limitadas a, DNA repetitivo ou repetições invertidas que existem no final de um elemento de transposição. Além disso, como divulgado na Patente US No. 5.595.889, é possível incorporar o gene adhE em um transposon e permitir que ele seja transferido para introduzir múltiplas cópias do gene no DNA cromossômico.

Nesses exemplos, o gene adhE pode ser colocado sob o controle de um promotor que funcione sob condições de cultivo aeróbico. Senão, o efeito de um promotor pode ser acentuado, por exemplo, pela introdução de uma mutação no promotor para aumentar o nível de transcrição de um gene localizado a jusante do promotor. Além disso, sabe-se que a substituição de diversos nucleotídeos no espaçador entre o sítio de ligação a ribossomo (RBS) e o códon de início, especialmente as seqüências imediatamente a montante do códon de início, afetam profundamente a tradutibilidade no RNAm. Por exemplo, uma variação de 20 vezes nos níveis de expressão foi encontrada, dependendo da natureza dos três nucleotídeos precedendo o códon de início (Gold et al, Annu. Rev. Microbiol., 35: 365-403, 1981: Hui et al., EMBO J., 3: 623-629, 1984). Previamente, foi demonstrado que a mutação rhtA23 é uma substituição de G-por-A na posição -1 em relação ao códon de início ATG (RESUMOS do 17° Congresso Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular em conjunto com o Encontro Anual da Sociedade Americana para Bioquímica e Biologia Molecular de 1997, São Francisco, Califórnia 24-29 de agosto de 1997, resumo No. 457). Portanto, pode ser sugerido que a mutação rhtA23 acentua a expressão gênica de rhtA e, como conseqüência, aumenta a resistência a treonina, homosserina e algumas outras substâncias transportadas para fora das células.

Além disso, também é possível introduzir uma substituição de nucleotídeos em uma região promotora do gene adhE no cromossomo bacteriano, o que resulta em função promotora mais forte. A alteração da seqüência de controle de expressão pode ser realizada, por exemplo, da mesma maneira que a substituição gênica usando um plasmídeo termo lábil, como divulgado na Publicação de Patente Internacional WO 00/18935 e Pedido de Patente Japonesa Laid-Open No. 1-215280.

Na presente invenção, “bactéria produtora de L-aminoácido” significa uma bactéria que tem uma habilidade de produzir e secretar um L- aminoácido em um meio, quando a bactéria é cultivada no meio. A habilidade produtora de L-aminoácido pode ser conferida ou acentuada por criação. O termo “bactéria produtora de L-aminoácido” conforme aqui utilizado também significa uma bactéria que é capaz de produzir e acumular um L-aminoácido em um meio de cultura em uma quantidade maior que a de uma cepa selvagem ou parental da bactéria, por exemplo, E. coli, tal como E. coli K-12 e de preferência significa que a bactéria é capaz de acumularem um meio uma quantidade de não menos que 0,5 g/L, de maior preferência não menos que 1,0 g/L do L-aminoácido alvo. O termo “L-aminoácido” inclui L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina. L-treonina, L-lisina, L-histidina, L-fenilalanina, L-arginina, L-triptofano, ácido L-glutâmico e L-leucina são particularmente preferidos. A família Enterobacteriaceae inclui bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, etc.. Especificamente, aquelas classificadas na família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada pelo banco de dados NCBI (Centro Nacional para Informação em Biotecnologia) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347) podem ser usadas. Uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia ou Pantoea é preferida. A expressão “uma bactéria pertencente ao gênero Escherichià’'’ significa que a bactéria é classificada dentro da gênero Escherichia de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na técnica de microbiologia. Exemplos de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia como utilizado na presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, Escherichia coli (E. coli). A bactéria pertencente ao gênero Escherichia que pode ser usada na presente invenção não está particularmente limitada, entretanto, por exemplo, bactérias descritas por Neidhardt, F. C. et al., {Escherichia coli e Salmonella typhimurium, Sociedade Americana para Microbiologia, Washington D.C., 1208, Tabela 1) são abrangidas pela presente invenção. A bactéria pertencente ao gênero Pantoea significa que a bactéria é classificada dentro do gênero Pantoea de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na técnica de microbiologia. Algumas espécies de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, ou semelhantes, com base na análise de seqüência nucleotídica de RNAr 16S etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43: 162-173 (1993)). A bactéria da presente invenção abrange uma cepa da família Enterobacteriaceae que tem uma habilidade para produzir um L-aminoácido e foi modificada de modo que o gene que codifica uma álcool desidrogenase é expresso sob o controle de um promotor que funciona sob condições de cultivo aeróbico. Além disso, a bactéria da presente invenção abrange uma cepa da família Enterobacteriaceae que tem habilidade de produzir um L-aminoácido e não tem uma atividade nativa de álcool desidrogenase, mas foi transformada com um fragmento de DNA que codifica álcool desidrogenase.

Na presente invenção, a quantidade de L-aminoácido acumulado, por exemplo, L-treonina, L-lisina, L-histidina, L-fenilalanina, L-arginina, L-triptofano, ácido L-glutâmico e L-leucina, pode ser aumentada significativamente em um meio de cultura contendo etanol como uma fonte de carbono como resultado da expressão do gene que codifica uma álcool desidrogenase sob o controle de um promotor que funciona sob condições de cultivo aeróbico.

Bactérias produtoras de L-aminoácido Assim como uma bactéria da presente invenção que é modificada para ter álcool desidrogenase mutante da presente invenção, bactérias que são capazes de produzir L-aminoácidos aromáticos ou não aromáticos podem ser usadas. A bactéria da presente invenção pode ser obtida pela introdução do gene que codifica a álcool desidrogenase mutante da presente invenção em uma bactéria que inerentemente tem a habilidade de produzir L-aminoácidos. Senão, a bactéria da presente invenção pode ser obtida conferindo-se a habilidade de produzir L-aminoácidos a uma bactéria já tendo a álcool desidrogenase mutante.

Bactérias produtoras de L-treonina Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-treonina da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patente US No. 5.175.107, Patente US No. 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (Patente US No. 5.631.157), E. coli NRRL-21593 (Patente US No. 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente US No. 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente US No. 5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al, Genetika (em Russo), 14: 947-956 (1978)), E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A) e semelhantes. A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, assim como é sacarose-assimilativa e o gene ilvA nesta cepa tem uma mutação defeituosa. Essa cepa também tem uma mutação no gene rhtA, que confere resistência a altas concentrações de treonina e homosserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40 que foi obtido por inserção de um operon thrA*BC que inclui um gene thrA mutante em um vetor derivado de RSF1010. Este gene thrA mutante codifica aspartoquinase homosserina desidrogenase I que tem inibição por retroalimentação consideravelmente dessensibilizada por treonina. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no All- Union/Todos união Centro Científico de Antibióticos (Rússia, 117105 Moscou, rua Nagatinskaya, 3-A) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais (VKPM) (Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd, 1) em 7 de abril de 1987 sob o número de acesso VKPM B-3996. E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B) também pode ser usada como uma cepa parental para derivar bactérias produtoras de L-treonina da presente invenção. A cepa B-5318 é prototrófica com relação à isoleucina e um repressor de fago lambda Cl termo lábil e promotor PR substituem a região regulatória do operon de treonina no plasmídeo pVIC40 abrigado pela cepa. A cepa VKPM B-5318 foi depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais (VKPM) em 3 de maio de 1990 sob o número de acesso VKPM B-5318.

De preferência, a bactéria da presente invenção é modificada adicionalmente para acentuar a expressão de um ou mais dos seguintes genes: - o gene thrA mutante que codifica aspartoquinase-homosserina desidrogenase I resistente a inibição por retroalimentação de treonina; - o gene thrB que codifica homosserina quinase; - o gene thrC que codifica treonina sintase; - o gene rhtA que codifica uma proteína transmembrana putativa; - o gene asd que codifica aspartato-p-semialdeído desidrogenase e - o gene aspC que codifica aspartato aminotransferase (aspartato transaminase);

O gene que codifica aspartoquinase-homosserina desidrogenase I de Escherichia coli foi elucidado (posições nucleotídicas 337 até 2799, acesso do GenBank no. NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrB que codifica homosserina quinase de Escherichia coli foi elucidado (posições nucleotídicas 2801 até 3733, acesso do GenBank no. NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrC que codifica treonina sintase de Escherichia coli foi elucidado (posições nucleotídicas 3734 até 5020, acesso do GenBank no. NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrC está localizado entre o gene thrB e a fase aberta de leitura de yaaX no cromossomo de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um único operon de treonina. Para acentuar a expressão do operon de treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é desejavelmente removida do operon (W02005/049808, W02003/097839). O gene thrA mutante que codifica aspartoquinase-homosserina desidrogenase I resistente a inibição por retroalimentação de treonina, assim como os genes thrB e thrC pode ser obtido como um operon a partir do bem conhecido plasmídeo pVIC40, que está presente na cepa de E. coli produtora de treonina VKPM B-3996. O plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhe na Patente US No. 5.705.371. O gene rhtA está localizado a 18 min no cromossomo de E. coli próximo ao operon de glnHPQ, que codifica componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico a ORF1 (gene ybiF, posições nucleotídicas 764 até 1651, número de acesso do GenBank AAA218541, gi: 440181) e está localizado entre os genes pexB e ompX. A seqüência de DNA que expressa uma proteína codificada pela ORF1 foi designada o gene rhtA (rht: resistência a homosserina e treonina). Além disso, sabe-se que a mutação rhtA23 é uma substituição de G-por A na posição -1 em relação ao códon de início ATG (RESUMOS do 17° Congresso Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular em conjunto com o Encontro Anual da Sociedade Americana para Bioquímica e Biologia Molecular, São Francisco, Califórnia 24-29 de agosto de 1997, resumo No. 457, EP 1013765 A). Daqui por diante, a mutação rhtA23 é marcada como rhtA*. O gene asd de E. coli já foi elucidado (posições nucleotídicas 3572511 até 3571408, acesso do GenBank NC 000913.1, gi: 16131307) e pode ser obtido por PCR (reação em cadeia da polimerase; refere-se a White, T. J. et al., Trends Genet. 5: 185 (1989)) utilizando iniciadores preparados com base na seqüência nucleotídica do gene. Os genes asd de outros microorganismos podem ser obtidos de um modo similar.

Além disso, o gene aspC de E. coli já foi elucidado (posições nucleotídicas 983742 até 984932, acesso do GenBank NC_000913.1, gi: 16128895) e pode ser obtido por PCR. Os genes aspC de outros microorganismos podem ser obtidos de um modo similar.

Bactérias produtoras de L-lisina Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina pertencentes ao gênero Escherichia incluem mutantes que têm resistência a um análogo de L-lisina. O análogo de L-lisina inibe o crescimento de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, mas sua inibição é completamente ou parcialmente dessensibilizada quando a L-lisina está presente no meio. Exemplos de análogo de L-lisina incluem, mas não estão limitados a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), γ-metilisina, a-clorocaprolactamo e assim por diante. Mutantes que têm resistência a esses análogos de lisina podem ser obtidos submetendo-se bactérias pertencentes ao gênero Escherichia a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para produzir L-lisina incluem Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; veja Patente US No. 4.346.170) e Escherichia coli VL611. Nesses microorganismos, a inibição por retroalimentação de aspartoquinase por L-lisina está dessensibilizada. A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria produtora de L-lisina de Escheríchia coli. Esta cepa bacteriana foi criada para conferir resistência AEC à cepa W3110, que foi derivada de Escheríchia coli K-12. A cepa resultante foi designada Escheríchia coli AJ13069 e foi depositada no Instituto Nacional de Biociência e Tecnologia Humana, Agência de Ciência e Tecnologia Industriais (atualmente Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industriais Avançadas, Depositário de Organismo de Patente Internacional, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 3058566, Japão) em 6 de dezembro de 1994 e recebeu um número de acesso FERM P-14690. Então, ela foi convertida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995 e recebeu um número de acesso FERM BP-5252 (Patente US No. 5.827.698).

Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-lisina da presente invenção também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima de biossíntese de L-lisina está acentuada. Exemplos de tais genes incluem, mas não estão limitados a, genes que codificam diidrodipicolinato sintase (dapA), aspartoquinase (lysC), diidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato descarboxilase (lysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (Patente US No. 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenase (asd) e aspartase (aspA) (EP 1253195 A). Além disso, as cepas parentais podem ter um nível aumentado de expressão do gene envolvido em eficiência energética (cyo) (EP 1170376 A), o gene que codifica nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (pntAB) (Patente US No. 5.830.716), o genejybjE (W02005/073390), ou combinações deste.

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-lisina da presente invenção também incluem cepas que têm atividade diminuída ou eliminada de uma enzima que catalisa uma reação para gerar um composto fora L-lisina por ramificação a partir da via de biossíntese de L-lisina. Exemplos de enzimas que catalisam uma reação para gerar um composto fora L-lisina por ramificação a partir da via de biossíntese de L-lisina incluem homosserina desidrogenase, lisina descarboxilase (Patente US No. 5.827.698) e a enzima málica (W02005/010175).

Exemplos de cepas produtoras de L-lisina incluem E. coli WC196AcadAAldc/pCABD2 (W02006/078039). Esta cepa foi obtida pela introdução do plasmídeo pCABD2, que está divulgado na Patente US No. 6.040.160, na cepa WC196 com os genes IdcC e cadA interrompidos, que codificam lisina descarboxilase. O plasmídeo pCABD2 contém o gene dapA de E. coli que codifica uma diidrodipicolinato sintase que tem uma mutação que dessensibiliza a inibição por retroalimentação por L-lisina, o gene lysC de E. coli que codifica aspartoquinase III que tem uma mutação que dessensibiliza a inibição por retroalimentação por L-lisina, o gene dapB de E. coli que codifica diidrodipicolinato redutase e o gene ddh de Corynebacterium glutamicum que codifica diaminopimelato desidrogenase. Bactérias produtoras de L-cisteína Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-cisteína da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli JM15 que é transformada com diferentes alelos de cysE que codificam serino acetiltransferases resistentes a retroalimentação (Patente US No. 6.218.168, pedido de patente russa 2003121601); E. coli W3110 que superexpressa genes que codificam proteínas adequadas para secretar substâncias tóxicas para células (Patente US No. 5.972.663); cepas de E. coli que têm atividade de cisteíno dessulfoidrase diminuída (JP11155571A2); E. coli W3110 com atividade aumentada de um regulador transcricional positivo para regulon de cisteína codificado pelo gene cysB (W00127307A1) e semelhantes.

Bactérias produtoras de L-leucina Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-leucina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como cepas de E. coli resistentes a leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente US No. 6.124.121)) ou análogos de leucina incluindo β-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5-trifluorleucina (JP 6234397 e JP 8-70879); cepas de E. coli obtidas pelos métodos de engenharia genética tal como aqueles descritos em WO96/06926; E. coli H-9068 (JP 870879 A) e semelhantes. A bactéria da presente invenção pode ser melhorada pelo acentuamento da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-leucina. Exemplos incluem genes do operon leuABCD, que são de preferência representados por um gene leu A mutante que codifica isopropilmalato sintase que não está sujeita a inibição por retroalimentação por L-leucina (Patente US No. 6.403.342). Além disso, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada pelo acentuamento da expressão de um ou mais genes que codificam proteínas que excretam L-aminoácidos da célula bacteriana. Exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041 A2).

Bactérias produtoras de L-histidina Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-histidina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como cepa 24 de E. coli (VKPM B-5945, RU2003677), cepa 80 de E. coli (VKPM B-7270, RU2119536), E. coli NRRL B-12116-B12121 (Patente US No. 4.388.405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676) (Patente US No. 6.344.347), E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP 1085087), E. co//A180/pFM201 (Patente US No. 6.258.554) e semelhantes.

Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-histidina da presente invenção também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima da biossíntese de L-histidina está acentuada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam ATP fosforribosiltransferase (hisG), fosforribosil AMP cicloidrolase (hisl), fosforribosil-ATP pirofosfoidrolase (hisIE), fosforribosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), amidotransferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB), histidinol desidrogenase (hisD) e assim por diante.

Sabe-se que as enzimas da biossíntese de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são inibidas por L-histidina e portanto, uma habilidade produtora de L-histidina também pode ser eficientemente acentuada pela introdução de uma mutação em qualquer desses genes que confere resistência à inibição por retroalimentação em enzimas codificadas pelos genes (Patente Russa Nos. 2003677 e 2119536).

Exemplos específicos de cepas que têm uma habilidade produtora de L-histidina incluem E. coli FERM P-5038 e 5048 que foram transformadas com um vetor portando um DNA que codifica uma enzima de biossíntese de L-histidina (JP 56-005099 A), cepas de E. coli transformadas com rht, um gene para um exportados de aminoácido (EP 1016710A), cepa 80 de E. coli conferida com sulfaguanidina, DL-l,2,4-triazol-3-alanina e resistência a estreptomicina (VKPM B-7270, Patente Russa No. 2119536) e assim por diante.

Bactérias produtoras de ácido L-glutâmico Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de ácido L-glutâmico da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli VL334thrC+ (EP 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica para L-isoleucina e L-treonina que em mutações nos genes thrC e ilvA (Patente US No. 4.278.765). Um alelo selvagem do gene thrC foi transferido usando transdução geral com um bacteriófago PI crescido em células da cepa Kl2 de E. coli selvagem (VKPM B-7). Como resultado, uma cepa auxotrófica para L-isoleucina VL334thrC+ (VKPM B-8961), que é capaz de produzir ácido L-glutâmico, foi obtida.

Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de ácido L-glutâmico da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cepas que são deficientes na atividade de a-cetoglutarato desidrogenase, ou cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando uma enzima de biossíntese de ácido L-glutâmico está acentuada. Exemplos de tais genes incluem genes codificando glutamato desidrogenase (gdh), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltAB), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato desidrogenase (aceEF, IpdA), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bisfosfato aldolase (fbp), fosfofrutoquinase (pfkA, pfkB), glicose fosfato isomerase (pgi) e assim por diante.

Exemplos de cepas que foram modificadas para que a expressão do gene de citrato sintetase e/ou do gene de fosfoenolpiruvato carboxilase fosse reduzida e/ou são deficientes em atividade de a-cetoglutarato desidrogenase incluem aquelas divulgadas em EP 1078989A, EP 955368 e EP 952221 A.

Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de ácido L-glutâmico da presente invenção também incluem cepas que têm a atividade de uma enzima que catalisa a síntese de um composto fora ácido L-glutâmico reduzida ou eliminada por ramificação a partir de uma via de biossíntese de ácido L-glutâmico. Exemplos de tais enzimas incluem isocitrato liase (aceA), a-cetoglutarato desidrogenase (sucA), fosfotransacetilase (pta), acetato quinase (ack), aceto-hidróxi ácido sintase (ilvG), acetolactase sintase (ilvl), formiato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (Idh) e glutamato descarboxilase (gadAB). Bactérias pertencentes ao gênero Escherichia deficientes em atividade de α-cetoglutarato desidrogenase ou que têm uma atividade de a-cetoglutarato desidrogenase reduzida e métodos para obtê-las são descritos em Patente US Nos. 5.378.616 e 5.573.945. Especificamente, essas cepas incluem as seguintes: E. coli W311 OsucA::KmR E. coli AJ12624 (FERM BP-3853) E. coli AJ12628 (FERM BP-3854) E. coli AJ12949 (FERM BP-4881) E. coli W3110sucA::KmR é obtida pela interrupção do gene de α-cetoglutarato desidrogenase (daqui por diante referido como “gene sucA”) de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente na atividade de a-cetoglutarato desidrogenase.

Outros exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem aquelas que pertencem ao gênero Escherichia e têm resistência a um antimetabólito de ácido aspártico. Essas cepas também podem ser deficientes na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e incluem, por exemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (Patente US No. 5.908.768), FFRM P-12379, que adicionalmente tem uma baixa habilidade de decomposição de ácido L-glutâmico (Patente US No. 5.393.671), AJ13138 (FERM BP-5565) (Patente US No. 6.110.714) e semelhantes.

Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem cepas mutantes pertencentes ao gênero Pantoea que são deficientes na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase ou têm atividade de a-cetoglutarato desidrogenase diminuída e podem ser obtidas como descrito acima. Tais cepas incluem Pantoea ananatis AJ13356 (Patente US No. 6.331.419). Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no Instituto Nacional de Biociência e Tecnologia Humana, Agência de Ciência e Tecnologia Industriais, Ministério de Indústria e Comércio Internacional (atualmente, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industriais Avançadas, Depositário de Organismo de Patente Internacional, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 sob um número de acesso FERM P-16645. Ela foi então convertida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso FERM BP-6615. Pantoea ananatis AJ13356 é deficiente na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase como resultado da interrupção do gene de subunidade aKGDH-El (sucA). A cepa acima foi identificada como Enterobacter agglomerans quando ela foi isolada e depositada como Enterobacter agglomerans AJ13356. Entretanto, ela foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis com base em seqüenciamento nucleotídico de RNAr 16S e assim por diante. Embora, AJ13356 tenha sido depositada no depositório acima mencionado como Enterobacter agglomerans, para os fins desta especificação, elas são descritas como Pantoea ananatis.

Bactérias produtoras de L-fenilalanina Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-fenilalanina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197), E. coli HW1089 (ATCC 55371) portando o gene mutantepheA34 (Patente US No. 5.354.672), E. coli MWEClOl-b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (Patente US No. 4.407.952). Além disso, como uma cepa parental, E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] nomeada como AJ 12604 (FERM BP-3579) podem ser usadas (EP 488424 Bl). Além disso, bactérias produtoras de fenilalanina pertencentes ao gênero Escherichia com uma atividade acentuada da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG também podem ser usadas (pedidos de patente US 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al). Bactérias produtoras de L-triptofano Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-triptofano da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) que são deficientes em triptofanil-RNAt sintetase codificada pelo gene trpS mutante (Patente US No. 5.756.345), E. coli SV164 (pGH5) que tem um alelo ser A que codifica fosfoglicerato desidrogenase que não está sujeita a inibição por retroalimentação por serina e um alelo trpE que codifica antranilato sintase que não está sujeita a inibição por retroalimentação por triptofano (Patente US No. 6.180.373), E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) que são deficientes na enzima triptofanase (Patente US No. 4.371.614), E. coli AGX17/pX50, pACKG4-pps em que uma habilidade produtora de fosfoenolpiruvato está acentuada (WO9708333, Patente US No. 6.319.696) e semelhantes. Bactérias produtoras de L-triptofano pertencentes ao gênero Escherichia que tem atividade acentuada da proteína codificada pelos genes yedA ou yddG também podem ser usadas (pedidos de patente US 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-triptofano da presente invenção também incluem cepas em que um ou mais atividades das seguintes enzimas são acentuadas: antranilato sintase (trpE ), fosfoglicerato desidrogenase (serA ) e triptofano sintase (trpAB). A antranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase estão ambas sujeitas à inibição por retroalimentação por L-triptofano e L- serina, portanto uma mutação dessensibilizando a inibição por retroalimentação pode ser introduzida nessas enzimas. Exemplos específicos de cepas que têm tal mutação incluem E. coli SV164 que abriga antranilato sintase dessensibilizada e uma cepa transformante obtida pela introdução na E. coli SV164 do plasmídeo pGH5 (WO 94/08031), que contém um gene serA mutante que codifica fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada a retroalimentação.

Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-triptofano da presente invenção também incluem cepas que foram transformadas com o operon de triptofano contendo um gene que codifica antranilato sintase dessensibilizada (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, Patente US No. 4.371.617). Além disso, a habilidade produtora de L-triptofano pode ser conferida pelo acentuamento da expressão de um gene que codifica triptofano sintase, entre operons de triptofano (trpBA). Triptofano sintase consiste de subunidades α e β que são codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Além disso, a habilidade produtora de L-triptofano pode ser melhorada pelo acentuamento da expressão do operon de isocitrato liase-malato sintase (W02005/103275).

Bactérias produtoras de L-prolina Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que é deficiente no gene ilvA e é capaz de produzir L-prolina (EP 1172433). A bactéria da presente invenção pode ser melhorada pelo acentuamento da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de prolina. Exemplos de tais genes incluem o gene proB que codifica glutamato quinase que está dessensibilizada à inibição por retroalimentação por L-prolina (Patente DE 3127361). Além disso, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada pelo acentuamento da expressão de um ou mais genes que codificam proteínas responsáveis por secretar L-aminoácidos da célula bacteriana. Tais genes são exemplificados pelos genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041 A2).

Exemplos de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, que têm uma atividade de produzir L-prolina incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente GB 2075056), VKPM B-8012 (pedido de patente Russa 2000124295), mutantes de plasmídeo descritos na Patente DE 3127361, mutantes de plasmídeo descritos por Bloom F. R. et al., (15° Simpósio de inverno de Miami, 1983, p. 34) e semelhantes.

Bactérias produtoras de L-arginina Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-arginina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli cepa 237 (VKPM B-7925) (Pedido de Patente US 2002/058315 Al) e derivados desses que abrigam N-acetilglutamato sintase mutante (Pedido de Patente Russa 2001112869), E. coli cepa 382 (VKPM B-7926) (EP 1170358 Al), uma cepa produtora de arginina transformada com o gene argA que codifica N-acetilglutamato sintetase (EP 1170361A1) e semelhantes.

Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-arginina da presente invenção também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima da biossíntese de L-arginina está acentuada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), omitina acetil transferase (argj), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilomitina transaminase (argD), omitina carbamoil transferase {argF), ácido argininossuccínico sintetase (<argG), ácido argininossuccínico liase (argH), carbamoil fosfato sintetase (carAB) e assim por diante.

Bactérias produtoras de L-valina Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-valina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cepas que foram modificadas para superexpressar o operon ilvGMEDA (Patente US No. 5.998.178). É desejável remover a região do operon ilvGMEDA responsável pela atenuação de modo que a L-valina produzida não possa atenuar a expressão do operon. Além do mais, o gene ilvA no operon está desejavelmente interrompido de modo que a atividade de treonina desaminase esteja diminuída.

Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-valina da presente invenção também incluem mutantes de amino-acil t-RNA sintetase (Patente US No. 5.658.766). Por exemplo, E. coli VL1970, que tem uma mutação no gene ileS que codifica isoleucina tRNA sintetase, pode ser usado. E. coli VL 1970 foi depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais (VKPM) (Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny Proezd, 1) em 24 de junho de 1988 sob o número de acesso VKPM B-4411.

Além do mais, mutantes que requerem ácido lipóico para crescimento e/ou não possuem Efi-ATPase também podem ser usados como cepas parentais (WO96/06926).

Bactérias produtoras de L-isoleucina Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-isoleucina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, mutantes que têm resistência a 6-dimetilaminopurina (JP 5-304969 A), mutantes que têm resistência a um análogo de isoleucina tal como hidroxamato de isoleucina e tiaisoleucina e mutantes que têm adicionalmente resistência a DL-etionina e/ou hidroxamato de arginina (JP 5-130882 A). Além disso, cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese de L-isoleucina, tal como treonina desaminase e acetoidroxato sintase, também podem ser usadas como cepas parentais (JP 2-458 A, FR 0356739 e Patente US No. 5.998.178). O método para produzir um L-aminoácido da presente invenção inclui etapas de cultivar a bactéria da presente invenção em um meio de cultura, permitir que se acumule L-aminoácido no meio de cultura e coletar L-aminoácido no meio de cultura. Além disso, o método da presente invenção inclui um método para produzir L-treonina, L-lisina, L-histidina, L-fenilalanina, L-arginina, L-triptofano, ácido L-glutâmico ou L-leucina, incluindo as etapas de cultivar a bactéria da presente invenção em um meio de cultura, permitir que se acumule L-treonina, L-lisina, L-histidina, L-fenilalanina, L-arginina, L-triptofano, ácido L-glutâmico ou L-leucina no meio de cultura e coletar L-treonina, L-lisina, L-histidina, L-fenilalanina, L-arginina, L-triptofano, ácido L-glutâmico ou L-leucina no meio de cultura.

Na presente invenção, o cultivo, coleta e purificação de L-aminoácidos a partir do meio de cultura e semelhantes pode ser realizado por métodos de fermentação convencionais em que um L-aminoácido é produzido usando uma bactéria. O meio de cultura pode ser sintético ou natural, contanto que o meio inclua uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, minerais e se necessário, quantidades apropriadas de nutrientes que a bactéria requer para crescimento. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos tal como glicose e sacarose, vários ácidos orgânicos e álcoois, tal como etanol. De acordo com a presente invenção etanol pode ser usado como a única fonte de carbono ou misturada com carboidratos, tal como glicose e sacarose. Como fonte de nitrogênio, vários sais de amônio tal como amônia e sulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio tal como aminas, uma fonte de nitrogênio natural tal como peptona, hidrolisado de soja e microorganismos fermentativos digeridos podem ser usados. Como minerais, monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio e semelhantes, podem ser usados. Vitaminas, tiamina, extrato de levedura e semelhantes podem ser usados. Nutrientes adicionais podem ser adicionados ao meio, se necessário. Por exemplo, se a bactéria requer um L-aminoácido para crescimento (auxotrofia para L-aminoácido), uma quantidade suficiente do L-aminoácido pode ser adicionada ao meio de cultivo. O cultivo é realizado de preferência sob condições aeróbicas tal como uma cultura em agitamento e cultura em agitação com aeração, a uma temperatura de 20 até 40°C, de preferência 30 até 38°C. O pH da cultura geralmente está entre 5 e 9, de preferência entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases e tampões. Geralmente, um cultivo de 1 até 5 dias leva ao acúmulo do L-aminoácido alvo no meio líquido.

Após o cultivo, sólidos tal como células podem ser removidos do meio líquido por centrifugação ou filtragem em membrana e então o L-aminoácido alvo pode ser coletado e purificado por métodos de troca iônica, concentração e/ou cristalização.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a estrutura da região à montante do gene adhE no cromossomo de E. coli e a estrutura de um fragmento de DNA integrado contendo o gene cat e um promotor PL_tac. A Figura 2 mostra o alinhamento das seqüências primárias de álcool desidrogenase de Escherichia coli (ADHE ECOLI, SEQ ID NO: 2), Shigella flexneri (Q83RN2 SHIFL, SEQ ID NO: 53), Pantoea ananatis (ADHE PANAN, SEQ ID NO: 30), Yersinia pestis (Q66AM7_YERPS, SEQ ID NO: 54), Erwinia carotovora (Q6D4R4ERWVT, SEQ ID NO: 55), Salmonella typhimurium (P74880_SALTY, SEQ ID NO: 56), Lactobacillus plantarum (Q88RY9_LACPL, SEQ ID NO: 57) e Lactococcus lactis (086282 9LACT, SEQ ID NO: 58). O alinhamento foi feito usando o programa de alinhamento múltiplo PIR (http://pir.georgetown.edu). Os aminoácidos idênticos são marcados por asterisco (*), aminoácidos similares são marcados por dois-pontos (:). A Figura 3 mostra curvas de crescimento de cepas modificadas crescidas no meio mínimo M9 contendo etanol (2% ou 3%) como uma fonte de carbono única. A Figura 4 mostra curvas de crescimento de cepas modificadas crescidas no meio mínimo M9 contendo uma mistura de glicose (0,1% peso %) e etanol (0,1 volume %). A Figura 5 mostra comparação de curvas de crescimento de cepas que têm gene adhE* mutante sob controle do promotor nativo, ou promotor PL-tac crescidas no meio mínimo M9 contendo etanol (2% ou 3%) como uma fonte de carbono única.

Exemplos A presente invenção será explicada mais concretamente abaixo com referência aos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplo 1. Preparação de E. coli MG 1655 Atdh. rhtA* A cepa MG 165 5 Atdh, rhtA* (pVIC40) de E. coli produtora de L- treonina foi construída por inativação do gene de tdh nativo que codifica treonina desidrogenase em E. coli MG1655 (ATCC 700926) usando o gene cat seguida por introdução de uma mutação rhtA23 {rhtA*) que confere resistência a altas concentrações de treonina (>40mg/mL) e homosserina (>5mg/mL). Então, a cepa resultante foi transformada com plasmídeo pVIC40 de E. coli VKPM B-3996. O plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhe na Patente US No. 5.705.371.

Para substituir o gene tdh nativo, um fragmento de DNA portanto o marcador de resistência a cloranfenicol (CmR) codificado pelo gene cat foi integrado no cromossomo de E. coli MG 1655 no lugar do gene nativo pelo método descrito por Datsenko K. A. e Wanner B. L. (Proc. Natl. Sei. USA, 2000, 97: 6640-6645) que também é chamado “integração mediada por vermelho(Red-mediated)” e/ou “integração vermelho-dirigida (Red-driven)”. Foi usado o plasmídeo recombinante pKD46 (Datsenko K. A., Wanner B. L., Proc. Natl. Sei. USA, 2000, 97: 6640-6645) com o replicon termo lábil como o doador dos genes derivados de fago λ responsáveis pelo sistema de recombinação mediado por vermelho. E. coli BW25113 contendo o plasmídeo recombinante pKD46 pode ser obtida a partir do Centro de Estoque Genético de E. coli, Universidade de Yale, New Haven, EUA, o número de acesso da qual é CGSC7630.

Um fragmento de DNA contendo um marcador Cm codificado pelo gene cat foi obtido por PCR usando o plasmídeo disponível comercialmente pACYC184 (número de acesso GenBank/EMBL X06403, “Fermentas”, Lituânia) como gabarito e iniciadores PI (SEQ ID NO: 3) e P2 (SEQ ID NO: 4). O iniciador PI contém 35 nucleotídeos homólogos à região 5' do gene tdh introduzido no iniciador para integração posterior no cromossomo bacteriano. O iniciador P2 contém 32 nucleotídeos homólogos à região 3' do gene tdh introduzido no iniciador para integração posterior no cromossomo bacteriano. PCR foi provida usando o termociclador “Gene Amp PCR System 2700” (Applied Biosystems). A mistura de reação (volume total - 50 pL) consistiu de 5 pL de tampão de PCR lOx com 25 mM de MgCh (“Fermentas", Lituânia), 200 pM cada de dNTP, 25 pmol de cada um dos iniciadores explorados e 1 U de Taq-polimerase (“Fermentas", Lituânia). Aproximadamente 5 ng do DNA plasmidial foram adicionados na mistura de reação como DNA gabarito para a amplificação de PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C, seguida por 25 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, ligação a 55°C por 30 s, extensão a 72°C por 40 s e a extensão final por 5 min a 72°C. Então, o fragmento de DNA amplificado foi purificado por eletroforese em gel de agarose, extraído usando “GenElute Spin Columns” (Sigma, EUA) e precipitado por etanol. O fragmento de DNA obtido foi usado em eletroporação e integração mediada por vermelho no cromossomo bacteriano de E. coli MG1655/pKD46. Células MG1655/pKD46 foram cultivadas durante a noite a 30°C em meio LB líquido contendo ampicilina (100 pg/mL), então diluídas 1:100 em meio SOB (extrato de levedura, 5 g/L; NaCl, 0,5 g/L; triptona, 20 g/L; KC1, 2,5 mM; MgCl2, 10 mM) contendo ampicilina (100 pg/mL) e L-arabinose (10 mM) (arabinose é usada para induzir o plasmídeo contendo os genes do sistema vermelho) e cultivadas a 30°C para atingir a densidade ótica da cultura bacteriana OD60o=0,4-0,7. As células cultivadas a partir de 10 mL da cultura bacteriana foram lavadas 3 vezes com água deionizada gelada, seguido por suspensão em 100 pL da água. Dez micro litros de fragmentos de DNA (100 ng) dissolvidos na água deionizada foram adicionados à suspensão celular. A eletroporação foi realizada por eletroporador “Bio-Rad” (EUA) (No. 165-2098, versão 2-89) de acordo com as instruções do fabricante. Células submetidas a choque foram adicionadas a 1 mL de meio SOC (Sambrook et al., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), incubadas por 2 horas a 37°C e então foram espalhadas em L-ágar contendo 25 pg/mL de cloranfenicol. Colônias cultivadas por 24 horas foram testadas pela presença do marcador CmR em vez do gene tdh nativo por PCR usando iniciadores P3 (SEQ ID NO: 5) e P4 (SEQ ID NO: 6). Para esta finalidade, uma colônia recém isolada foi recolocada em suspensão em 20pL de água e então 1 pL da suspensão obtida foi usado para PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C; então 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 30s, ligação a 55°C por 30s e extensão a 72°C por 30s; a extensão final por 5 min a 72°C. Poucas colônias CmR testadas continham o fragmento de DNA de 1104 pb desejado, confirmando a presença do DNA de marcador CmR em vez de fragmento de 1242 pb de gene tdh. Uma das cepas obtidas foi curada do plasmídeo termo lábil pKD46 por cultivo a 37°C e a cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655Atdh.

Então, a mutação rhtA23 da cepa VL614rhtA23 (Livshits V. A. et al., 2003, Res. Microbiol., 154: 123-135) foi introduzida na cepa obtida MG 1655 Atdh resultando na cepa MG 1655 Atdh, rhtA*. A rhtA23 é uma mutação que confere resistência a altas concentrações de treonina (>40 mg/mL) e homosserina (>5 mg/mL). Para essa finalidade a cepa MG 1655 Atdh foi infectada com fago PIVír cultivado na cepa doadora VL614rhtA23. Os transdutantes foram selecionados em meio mínimo M9 contendo 8 mg/mL de homosserina e 0,4% de glicose como a única fonte de carbono.

Exemplo 2. Construção de E. coli MG1655::Pi .,af adhE E. coli MG1655::PL_tacadh foi obtida pela substituição da região promotora nativa do gene adhE na cepa MG 1655 pelo promotor PL-tac· Para substituir a região promotora nativa do gene adhE, o fragmento de DNA portando um promotor PL.tac e marcador de resistência a cloranfenicol (CmR) codificado pelo gene cat foram integrados no cromossomo de E. coli MG 1655 no lugar da região promotora nativa pelo método descrito por Datsenko K. A. e Wanner B. L. (Proc. Natl. Sei. USA, 2000, 97: 6640-6645), que também é chamado “integração mediada por vermelho” e/ou “integração vermelho-dirigida”.

Um fragmento contendo o promotor PL_tac e o gene cat foi obtido por PCR usando DNA cromossômico de E. coli MG1655PL.tacxylE (W02006/043730) como gabarito. A seqüência nucleotídica do promotor PL-tac é representada na listagem de seqüências (SEQ ID NO: 7). Iniciadores P5 (SEQ ID NO: 8) e P6 (SEQ ID NO: 9) foram usados para amplificação por PCR. O iniciador P5 contém 40 nucleotídeos complementares à região localizada 318 pb a montante do códon de início do gene adhE introduzido no iniciador para integração posterior no cromossomo bacteriano e o iniciador P6 contém 39 nucleotídeos idênticos à seqüência 5' do gene adhE. A PCR foi provida usando o termociclador “Gene Amp PCR System 2700” (Applied Biosystems). A mistura de reação (volume total - 50 pL) consistiu de 5 pL de tampão de PCR lOx com 15 mM de MgCl2 (“Fermentas", Lituânia), 200 μΜ cada de dNTP, 25 pmol de cada um dos iniciadores explorados e 1 U de Taq-polimerase (“Fermentas", Lituânia). Aproximadamente 20 ng do DNA genômico de E. coli MG1655PL.tacxylE foram adicionados na mistura de reação como DNA gabarito para a amplificação de PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, ligação a 54°C por 30 s, extensão a 72°C por 1,5 min e a extensão final por 5 min a 72°C. Então, o fragmento de DNA amplificado foi purificado por eletroforese em gel de agarose, extraído usando “GenElute Spin Columns” (Sigma, EUA) e precipitado por etanol. O fragmento de DNA obtido foi usado em eletroporação e integração mediada por vermelho no cromossomo bacteriano de E. coli MG1655/pKD46. Células MG1655/pKD46 foram cultivadas durante a noite a 30°C em meio LB líquido contendo ampicilina (100 pg/mL), então diluídas 1:100 em meio SOB (extrato de levedura, 5 g/L; NaCl, 0,5 g/L; triptona, 20 g/L; KC1, 2,5 mM; MgCl2, 10 mM) contendo ampicilina (100 pg/mL) e L-arabinose (10 mM) (arabinose é usada para induzir o plasmídeo que codifica genes do sistema vermelho) e cultivadas a 30°C para atingir a densidade ótica da cultura bacteriana OD60o=0,4-0,7. As células cultivadas a partir de 10 mL da cultura bacteriana foram lavadas 3 vezes com água deionizada gelada, seguido por suspensão em 100 pL da água. Dez micro litros de fragmentos de DNA (100 ng) dissolvidos na água deionizada foram adicionados à suspensão celular. A eletroporação foi realizada por eletroporador “Bio-Rad” (EUA) (No. 165-2098, versão 2-89) de acordo com as instruções do fabricante. Células submetidas a choque foram adicionadas a 1 mL de meio SOC (Sambrook et al., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), incubadas por 2 horas a 37°C e então foram espalhadas em L-ágar contendo 25 pg/mL de cloranfenicol.

Cerca de 100 clones resultantes foram selecionados em placas de M9 com 2% de etanol como a única fonte de carbono. Alguns clones que cresceram em placas M9 com 2% de etanol em 36 horas foram escolhidas e testadas pela presença do marcador CmR em vez da região promotora nativa do gene adhE por PCR usando iniciadores P7 (SEQ ID NO: 10) e P8 (SEQ ID NO: 11). Para esta finalidade, uma colônia recém isolada foi recolocada em suspensão em 20pL de água e então lpL da suspensão obtida foi usado para PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 10 min a 95°C; então 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 30s, ligação a 54°C por 30s e extensão a 72°C por 1,5 min; a extensão final por 1 min a 72°C. Poucas colônias CmR testadas continham o fragmento de DNA de ~ 1800 pb desejado, confirmando a presença do DNA de marcador CmR em vez de 520 pb da região promotora nativa do gene adhE. Uma das cepas obtidas foi curada do plasmídeo termo lábil pKD46 por cultivo a 37°C e a cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655::PL-taCadhE (veja a Figura 1).

Exemplo 3. Construção de E. coli MG1655Atdh, rhtA*,Pi ,,,-adhE E. coli MG1655Atdh, rhtA*,PL-tacadhE foi obtida por transdução do promotor PL4ac da cepa MG1655::PL-tacadhE na cepa MG1655Atdh, rhtA*. A cepa MG1655Atdh, rhtA* foi infectada com fago Plvjr cultivado na cepa doadora MG1655::PL_tacadhE e a cepa E. coli MG1655Atdh, rhtA*,PL-tacadhE foi obtida. Esta cepa foi checada por crescimento em placas M9 com 2% de etanol como a única fonte de carbono. A taxa de crescimento foi a mesma para a cepa MG1655::PL-tacadhE.

Exemplo 4. O efeito do aumento da expressão do gene adhE na produção de L-treonina Para avaliar o efeito do acentuamento da expressão do gene adhE na produção de L-treonina, tanto a cepa de E. coli MG1655Atdh, rhtA*, PL-taCadhE como MG1655Atdh, rhtA* foram transformadas com plasmídeo pVIC40. A cepa MG1655Atdh, rhtA*, PL-tacadhE (pVIC40) e uma cepa parental MG1655Atdh, rhtA* (pVIC40) foram cultivadas cada uma a 37°C por 18 horas em um caldo nutritivo e 0,3 mL de cada uma das culturas obtidas foram inoculados em 3 mL de meio de fermentação que tem a seguinte composição em um tubo de teste de 20x200 mm e cultivada a 34°C por 48 horas com um agitador em rotação. Dados de pelo menos 10 experimentos independentes são mostrados nas Tabelas 1 e 2.

Composição de meio de fermentação (g/L): Etanol 24 ou 16 Glicose 0 (Tabela 1) ou 3 (Tabela 2) (NH4)2S04 16 K2HP04 0,7 MgS04.7H20 1,0 MnS04.5H20 0,01 FeS04.7H20 0,01 Hidrocloreto de tiamina 0,002 Extrato de levedura 1,0 L-isoleucina 0,01 CaC03 33 MgSo4*7H20 e CaC03 foram cada um esterilizados separadamente.

Pode-se ver a partir das Tabelas 1 e 2, MG1655Atdh, rhtA*, PL-tacadhE foi capaz de acumular uma quantidade maior de L-treonina quando comparada com MG1655Atdh, rhtA*. Além disso, MG1655Atdh, rhtA*, PL-taCadhE foi capaz de crescer no meio contendo etanol como única fonte de carbono e levar ao acúmulo de L-treonina, enquanto MG1655Atdh, rhtA* exibiu crescimento e produtividade muito pobres no meio contendo etanol como única fonte de carbono.

Exemplo 5. Construção de E. coli MG1655AadhE

Esta cepa foi construída pela inativação do gene adhE nativo na E. coli MG 1655 pelo gene kan.

Para inativar (ou interromper) o gene adhE nativo, o fragmento de DNA portando marcador de resistência a canamicina (KmR) codificado pelo gene kan foi integrado no cromossomo de E. coli MG1655 (ATCC 700926) no lugar do gene nativo pelo método descrito por Datsenko K. A. e Wanner B. L. (Proc. Natl. Sei. USA, 2000, 97: 6640-6645), que também é chamado “integração mediada por vermelho” e/ou “integração vermelho-dirigida”.

Um fragmento de DNA contendo um marcador KmR (gene kan) foi obtido por PCR usando o plasmídeo disponível comercialmente pACYC177 (número de acesso GenBank/EMBL X06402, “Fermentas”, Lituânia) como gabarito e iniciadores P9 (SEQ ID NO: 12) e P10 (SEQ ID NO: 13). O iniciador P9 contém 40 nucleotídeos homólogos à região localizada 318 pb a montante do códon de início do gene adhE introduzido no iniciador para integração posterior no cromossomo bacteriano. O iniciador P10 contém 41 nucleotídeos homólogos à região 3' do gene adhE introduzido no iniciador para integração posterior no cromossomo bacteriano. PCR foi provida usando o termociclador “Gene Amp PCR System 2700” (Applied Biosystems). A mistura de reação (volume total — 50 pL) consistiu de 5 pL de tampão de PCR lOx com 25 mM de MgCb (“Fermentas”, Lituânia), 200 pM cada de dNTP, 25 pmol de cada um dos iniciadores explorados e 1 U de Taq-polimerase (“Fermentas", Lituânia). Aproximadamente 5 ng do DNA plasmidial foram adicionados na mistura de reação como DNA gabarito para a amplificação de PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C, seguida por 25 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, ligação a 55°C por 30 s, extensão a 72°C por 40 s e a extensão final por 5 min a 72°C. Então, o fragmento de DNA amplificado foi purificado por eletroforese em gel de agarose, extraído usando “GenElute Spin Columns” (Sigma, EUA) e precipitado por etanol. O fragmento de DNA obtido foi usado em eletroporação e integração mediada por vermelho no cromossomo bacteriano de E. coli MG1655/pKD46. Células MG1655/pKD46 foram cultivadas durante a noite a 30°C em meio LB líquido contendo ampicilina (100 pg/mL), então diluídas 1:100 em meio SOB (extrato de levedura, 5 g/L; NaCl, 0,5 g/L; triptona, 20 g/L; KC1, 2,5 mM; MgCl2, 10 mM) contendo ampicilina (100 pg/mL) e L-arabinose (10 mM) (arabinose é usada para induzir o plasmídeo contendo os genes do sistema vermelho) e cultivadas a 30°C para atingir a densidade ótica da cultura bacteriana OD60o=0,4-0,7. As células cultivadas a partir de 10 mL da cultura bacteriana foram lavadas 3 vezes com água deionizada gelada, seguido por suspensão em 100 pL da água. Dez micro litros de fragmentos de DNA (100 ng) dissolvidos na água deionizada foram adicionados à suspensão celular. A eletroporação foi realizada por eletroporador “Bio-Rad” (EUA) (No. 165-2098, versão 2-89) de acordo com as instruções do fabricante. Células submetidas a choque foram adicionadas a 1 mL de meio SOC (Sambrook et al., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), incubadas por 2 horas a 37°C e então foram espalhadas em L-ágar contendo 20 pg/mL de canamicina. Colônias cultivadas por 24 horas foram testadas pela presença do marcador KmR em vez do gene adhE nativo por PCR usando iniciadores P11 (SEQ ID NO: 14) e PI2 (SEQ ID NO: 15). Para esta finalidade, uma colônia recém isolada foi recolocada em suspensão em 20pL de água e então 1 pL da suspensão obtida foi usado para PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C; então 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 30s, ligação a 55°C por 30s e extensão a 72°C por 3Os; a extensão final por 5 min a 72°C. Poucas colônias KmR testadas continham o fragmento de DNA de 1030 pb desejado, confirmando a presença do DNA de marcador KmR em vez de fragmento de 3135 pb de gene adhE. Uma das cepas obtidas foi curada do plasmídeo termo lábil pKD46 por cultivo a 37°C e a cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655AadhE. Exemplo 6. Construção de E. coli MG1655::PT-»aradhE* E. coli MG 1655: :PL.tacadhE* foi obtida pela introdução da mutação Glu568Lys (E568K) no gene adhE. Primeiro, fragmento de 1,05 Kpb do gene adhE portanto a mutação E568K foi obtida por PCR usado o DNA genômico de E. coli MG1655 como gabarito e iniciadores P13 (SEQ ID NO: 16) e PI2 (SEQ ID NO: 15). O iniciador PI5 é homólogo às regiões de 16621701 pb e 1703-173 Opb do gene adhE e inclui a substituição g/a (posição 1702 pb) mostrada em negrito e o iniciador P12 é homólogo à extremidade 3' do gene adhE. A PCR foi provida usando o termociclador “Gene Amp PCR System 2700” (Applied Biosystems). A mistura de reação (volume total — 50 pL) consistiu de 5 pL de tampão de PCR lOx com MgCb (“TaKaRa”, Japão), 250 pM de cada um dos dNTPs, 25 pmol de cada um dos iniciadores explorados e 2,5 U de DNA polimerase Pyrobest (“TaKaRa”, Japão). Aproximadamente 20 ng do DNA genômico de E. coli MG 1655 foram adicionados nas misturas de reação como gabarito para PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, ligação a 54°C por 30 s, extensão a 72°C por 1 min e a extensão final por 5 min a 72°C. O fragmento obtido foi purificado por eletroforese em gel de agarose, extraído usando “GenElute Spin Columns” (“Sigma”, EUA) e precipitado por etanol.

Na segunda etapa, o fragmento contendo o promotor PL-tac com o gene adhE mutante e marcado pelo gene cat, que provê resistência a cloranfenicol, foi obtido por PCR usando o DNA genômico de E. coli MG1655::PL_tacadhE como gabarito (veja Exemplo 2), iniciador Pll (SEQ ID NO: 14) e um fragmento de 1,05 Kpb portanto uma seqüência mutante (veja acima) como um segundo iniciador. O iniciador Pll é homólogo à região localizada a 402-425 pb a montante do códon de início do gene adhE. A PCR foi provida usando o termociclador “Gene Amp PCR System 2700” (Applied Biosystems). A mistura de reação (volume total — 50 pL) consistiu de 5 pL de tampão de PCR lOx (“TaKaRa”, Japão), 25 mM de MgCl2, 250 pM de cada um dos dNTPs, 10 ng do iniciador Pll, lpg do fragmento de 1,05 kpb como um segundo iniciador e 2,5 U de DNA polimerase TaKaRa LA (“TaKaRa”, Japão). Aproximadamente 20 ng do DNA genômico de E. coli MG1655::PL. tacadhE foram adicionados às misturas de reação como gabarito para PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, ligação a 54°C por 30 s, extensão a 72°C por 3,5 min e a extensão final por 7 min a 72°C. O fragmento resultante foi purificado por eletroforese em gel de agarose, extraído usando “GenElute Spin Columns” (“Sigma”, EUA) e precipitado por etanol.

Para substituir a região nativa do gene adhE, o fragmento de DNA portando um promotor PL.tac com o adhE mutante e marcador de resistência a cloranfenicol (CmR) codificado pelo gene cat (cat-PL.tacadhE*, 4,7 kpb) foi integrado no cromossomo de E. coli MG1655AadhE pelo método descrito por Datsenko K. A. e Wanner B. L. (Proc. Natl. Sei. USA, 2000, 97: 6640-6645), que também é chamado “integração mediada por vermelho” e/ou “integração vermelho-dirigida”. Células MG1655 AadhE/pKD46 foram cultivadas durante a noite a 30°C em meio LB líquido contendo ampicilina (100 pg/mL), então diluídas 1:100 em meio SOB (extrato de levedura, 5 g/L;

NaCl, 0,5 g/L; triptona, 20 g/L; KC1, 2,5 mM; MgCl2, 10 mM) contendo ampicilina (100 pg/mL) e L-arabinose (10 mM) (arabinose é usada para induzir o plasmídeo que codifica genes do sistema vermelho) e cultivadas a 30°C para atingir a densidade ótica da cultura bacteriana OD60o=0,4-0,7. As células cultivadas a partir de 10 mL da cultura bacteriana foram lavadas 3 vezes com água deionizada gelada, seguido por suspensão em 100 pL da água. Dez micro litros de fragmento de DNA (300 ng) dissolvidos na água deionizada foram adicionados à suspensão celular. A eletroporação foi realizada por eletroporador “Bio-Rad” (EUA) (No. 165-2098, versão 2-89) de acordo com as instruções do fabricante. Células submetidas a choque foram adicionadas a 1 mL de meio SOC (Sambrook et ai, “Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), incubadas por 2 horas a 37°C e então foram espalhadas em L-ágar contendo 25 pg/mL de cloranfenicol.

Os clones obtidos foram selecionados em placas de M9 com 2% de etanol como a única fonte de carbono. O clone de sucesso foi escolhido e a seqüência do gene completa foi verificada. A série de mutações foi revelada como segue: Glu568Lys (gag-aag), Ile554Ser (atc-agc), Glu22Gly (gaa-gga), Met236Val (atg-gtg), Tyr461Cys (tac-tgc), Ala786Val (gca-gta). Este clone foi nomeado MG1655: :PL_tacadhE*.

Exemplo 7. Construção de E. coli MG1655Atdh, rhtA*,PT .t^adhE* E. coli MG1655Atdh, rhtA*,PL.tacadhE* foi obtida por transdução da mutação adhE* em PL-tac da cepa MG1655::PL-taCadhE*. A cepa MG1655Atdh, rhtA* foi infectada com fago Plvir cultivado na cepa doadora MG 1655: :PL.tacadhE* e a cepa MG1655Atdh, rhtA*,PL.tacadhE* foi obtida. Esta cepa foi checada por crescimento em placas de M9 com 2% de etanol como a única fonte de carbono. A taxa de crescimento foi a mesma para a cepa MG1655::PL_taCadhE*.

Exemplo 8. Construção de E. coli MG1655Atdh, rhtA*,PT .taradhE-Lys568 Uma segunda tentativa de obter um adhE mutante único que tem a mutação Glu568Lys foi realizada. Para esta finalidade, a cepa de E. coli MG1655Atdh, rhtA*,PL_tacadhE-wtA34 foi construída. E. coli MG1655Atdh, rhtA*,PL.tacadhE-wtA34 foi obtida pela substituição de um fragmento de 34 pb do gene adhE (a região de 1668 pb até 1702 pb, inclusive do tripleto que codifica Glu568) na E. coli MG1655Atdh, rhtA*,PL-tacadhE-wt (wt significa um selvagem) como gene kan. O gene kan foi integrado no cromossomo de E. coli MG1655Atdh, rhtA* ,P[_tacadhE-wt pelo método descrito por Datsenko K. A. e Wanner B. L. (Proc. Natl. Sei. USA, 2000, 97: 6640-6645), que também é chamado “integração mediada por vermelho” e/ou “integração vermelho-dirigida”.

Um fragmento de DNA contendo um marcador KmR codificado pelo gene kan foi obtido por PCR usando o plasmídeo disponível comercialmente pACYC177 (número de acesso GenBank/EMBL X06402, “Fermentas”, Lituânia) como gabarito e iniciadores P14 (SEQ ID NO: 17) e PI5 (SEQ ID NO: 18). O iniciador P14 contém 41 nucleotídeos idênticos à região de 1627 até 1668 pb do gene adhE e o iniciador PI5 contém 39 nucleotídeos complementares à região de 1702 até 1740 pb do gene adhE introduzido nos iniciadores para integração posterior no cromossomo bacteriano. PCR foi provida usando o termociclador “Gene Amp PCR System 2700” (Applied Biosystems). A mistura de reação (volume total — 50 pL) consistiu de 5 pL de tampão de PCR lOx com 25 mM de MgCl2 (“Fermentas”, Lituânia), 200 pM de cada dNTP, 25 pmol de cada um dos iniciadores explorados e 1 U de Taq-polimerase (“Fermentas", Lituânia). Aproximadamente 5 ng do DNA plasmidial foram adicionados na mistura de reação como DNA gabarito para a amplificação de PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C, seguida por 25 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, ligação a 55°C por 30 s, extensão a 72°C por 50 s e a extensão final por 5 min a 72°C. Então, o fragmento de DNA amplificado foi purificado por eletroforese em gel de agarose, extraído usando “GenElute Spin Columns” (Sigma, EUA) e precipitado por etanol.

Colônias obtidas foram testadas pela presença do marcador KmR por PCR usando iniciadores P16 (SEQ ID NO: 19) e P17 (SEQ ID NO: 20). Para esta finalidade, uma colônia recém isolada foi recolocada em suspensão em 20pL de água e então lpL da suspensão obtida foi usado para PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C; então 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 30s, ligação a 55°C por 3Os e extensão a 72°C por 45s; a extensão final por 5 min a 72°C. Poucas colônias KmR testadas continham o fragmento de DNA de 1200 pb desejado, confirmando a presença do DNA de marcador KmR em vez de fragmento de 230 pb de gene adhE nativo. Uma das cepas obtidas foi curada do plasmídeo termo lábil pKD46 por cultivo a 37°C e a cepa resultante foi nomeada E. coli MG 1655Atdh, rhtA* ,PL.tacadhE-wtA34.

Então, para substituir o marcador de resistência a canamicina (KmR) codificado pelo gene kan por um fragmento do gene adhE codificando a mutação Glu568Lys, os oligonucleotídeos PI8 (SEQ ID NO: 21) e P19 (SEQ ID NO: 22) portando a mutação apropriada foram integrados no cromossomo de E. coli MG1655Atdh, rhtA,PL_tacadhE-wt Δ34 pelo método de “integração mediada por vermelho” e/ou “integração vermelho-dirigida” (Yu D., Sawitzke J. et al., Recombineering with overlapping single-stranded DNA oligonucleotides: Testing of recombination intermediate, PNAS, 2003, 100(12): 7207-7212). O iniciador PI8 contém 75 nucleotídeos idênticos à região de 1627 pb até 1702 pb do gene adhE e o iniciador PI9 contém 75 nucleotídeos complementares à região de 1668 pb até 1740 pb do gene adhE, ambos os iniciadores incluem o tripleto que codifica Lys568 em vez de Glu568.

Os clones foram selecionados em meio mínimo M9 contendo 2% de etanol e 25 mg/mL de succinato como fonte de carbono.

Colônias foram testadas pela ausência do marcador KmR por PCR usando iniciadores PI6 (SEQ ID NO: 19) e P17 (SEQ ID NO: 20). Para esta finalidade, uma colônia recém isolada foi recolocada em suspensão em 20pL de água e então lpL da suspensão obtida foi usado para PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C; então 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 30s, ligação a 55°C por 30s e extensão a 72°C por 25 s; a extensão final por 5 min a 72°C. Poucas colônias KmR testadas continham o fragmento de DNA de 230 pb desejado, confirmando a ausência do DNA de marcador KmR em vez do fragmento de 1200 pb. Diversas das cepas obtidas foram curadas do plasmídeo termo lábil pKD46 por cultivo a 37°C e a cepa resultante foi nomeada E. coli MG 1655Atdh, rhtA,PL.tacadhE-Lys568. A presença da mutação Glu568Lys foi confirmada por seqüenciamento, por exemplo, cl.18 tem uma única mutação Glu568Lys. Adicionalmente, descobriu-se que alguns clones (#1, 13) continham mutações adicionais: cl.l - Glu568Lys, Phe566Val; cl. 13 — Glu568Lys, Glu560Lys.

Para as cepas MG 1655Atdh, rhtA*,PL_lacadhE-Lys568 (cl.18), MG 165 5Atdh, rhtA*,PL.tacadhE-Lys568, Val566 (cl.l), MG1655Atdh, rhtA*,P[.tacadhE-Lys568, Lys560 (cl.13) e MG1655Atdh, rhtA*,PL_tacadhE*, as curvas de crescimento foram estudadas (Figuras 3 e 4).

As cepas foram cultivadas em meio M9 com etanol como única fonte de carbono e em meio M9 com glicose e etanol (razão molar 1:3). Exemplo 9. Construção de MG1655Atdh, rhtA*,adhE* A cepa de E. coli MG1655Atdh, rhtA*, adhE* foi obtida pela reconstrução do promotor de adhE nativo na cepa MG1655Atdh, rhtA*, PL_tacadhE*. Um fragmento de DNA portando um promotor PL-tac e marcador de resistência a cloranfenicol (CmR) codificado pelo gene cat no cromossomo da cepa MG1655Atdh, rhtA*,PL.tacadhE* foram substituídos por um fragmento portando promotor de adhE nativo e marcador de resistência a canamicina (KmR) codificado pelo gene kan. PadhE nativo foi obtido por PCR usando um DNA da cepa MG 1655 como gabarito e iniciadores P20 (SEQ ID NO: 23) e P21 (SEQ ID NO: 24). O iniciador P20 contém um sítio de reconhecimento de EcoRI em sua extremidade 5', o qual é necessário para junção posterior ao gene kan e o iniciador P21 contém 30 nucleotídeos homólogos à região 5' do gene adhE (de 50 pb até 20 pb).

Um fragmento de DNA contendo um marcador Km codificado pelo gene kan foi obtido por PCR usando o plasmídeo disponível comercialmente pACYC177 (número de acesso GenBank/EMBL X06402, “Fermentas”, Lituânia) como gabarito e iniciadores P22 (SEQ ID NO: 25) e P23 (SEQ ID NO: 26). O iniciador P22 contém 41 nucleotídeos homólogos à região localizada 425 pb a montante do códon de início do gene adhE introduzido no iniciador para integração posterior no cromossomo bacteriano e o iniciador P23 contém um sítio de reconhecimento de EcoRI em sua extremidade 3', o qual é necessário para junção posterior ao promotor PadhE· PCR foi provida usando o termociclador “Gene Amp PCR System 2700” (Applied Biosystems). A mistura de reação (volume total - 50 pL) consistiu de 5 pL de tampão de PCR lOx com 25 mM de MgCL (“Fermentas”, Lituânia), 200 pM de cada dNTP, 25 pmol de cada um dos iniciadores explorados e 1 U de Taq-polimerase (“Fermentas", Lituânia). Aproximadamente 20 ng do DNA genômico ou 5 ng do DNA plasmidial foram adicionados na mistura de reação como gabarito para a amplificação de PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C, seguida por 35 ciclos de desnaturação para PadhE ou 25 ciclos de desnaturação para gene kan a 95°C por 30 s, ligação a 55°C por 30 s, extensão a 72°C por 20 s para promotor Ptac e 50 s para gene kan e a extensão final por 5 min a 72°C. Então, os fragmentos de DNA amplificados foram purificados por eletroforese em gel de agarose, extraídos usando “GenElute Spin Columns” (Sigma, EUA) e precipitados por etanol.

Cada um dos dois fragmentos de DNA acima descritos foi tratado com restritase EcoRl e ligado. O produto de ligação foi amplificado por PCR usando iniciadores P21 e P22. O fragmento de DNA fow-PadhE amplificado foi purificado por eletroforese em gel de agarose, extraído usando “GenElute Spin Columns” (Sigma, EUA) e precipitado por etanol. O fragmento de DNA obtido foi usado para eletroporação e integração mediada por vermelho no cromossomo bacteriano de E. coli MG1655Atdh::rhtA*, PL-tacadhE*/pKD46. Células de MG1655Atdh::rhtA*, PL.tacadhE*/pKD46 foram cultivadas durante a noite a 30°C em meio LB líquido com adição de ampicilina (100 pg/mL), então diluídas 1:100 em meio SOB (extrato de levedura, 5 g/L; NaCl, 0,5 g/L; triptona, 20 g/L; Kcl, 2,5 mM; MgCU, 10 mM) com adição de ampicilina (100 pg/mL) e L-arabinose (10 mM) (arabinose é usada para induzir o plasmídeo contendo os genes do sistema vermelho) e cultivadas a 30°C para atingir a densidade ótica da cultura bacteriana OD60o-0,4-0,7. As células cultivadas a partir de 10 mL da cultura bacteriana foram lavadas 3 vezes com água deionizada gelada, seguido por suspensão em 100 pL da água. Dez micro litros de fragmentos de DNA (100 ng) dissolvidos na água deionizada foram adicionados à suspensão celular. A eletroporação foi realizada por eletroporador “Bio-Rad” (EUA) (No. 1652098, versão 2-89) de acordo com as instruções do fabricante.

Células submetidas a choque foram adicionadas a 1 mL de meio SOC (Sambrook et al., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), incubadas por 2 horas a 37°C e então foram espalhadas em L-ágar contendo 20 pg/mL de canamicina.

Colônias cultivadas por 24 horas foram testadas pela presença do marcador PadhE-KmR em vez do marcador PL-tac-CmR por PCR usando iniciadores P24 (SEQ ID NO: 27) e P25 (SEQ ID NO: 28). Para esta finalidade, uma colônia recém isolada foi recolocada em suspensão em 20pL de água e então lpL da suspensão obtida foi usado para PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C; então 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 30s, ligação a 54°C por 30s e extensão a 72°C por 1,0 min; a extensão final por 5 min a 72°C. Poucas colônias KmR testadas continham o fragmento de DNA de 1200 pb desejado, confirmando a presença do DNA de promotor Pa<ihE nativo e de marcador KmR. Alguns desses fragmentos foram seqüenciados. A estrutura do promotor PadhE nativo foi confirmada. Uma das cepas contendo o gene adhE mutante sob o controle de um promotor nativo foi curada do plasmídeo termo lábil pKD46 por cultivo a 37°C e a cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655Atdh, rhtA*,adhE*. A habilidade de todas as cepas obtidas MG1655Atdh, rhtA*, PL-taCadhE; MG1655Atdh, rhtA*, PL_tacadhE*; MG1655Atdh, rhtA*, Pl-tacadhE-Lys568 (cl.18); MG1655Atdh, rhtA*, PL-tacadhE-Lys568, Val566 (cl.l); MG1655Atdh, rhtA*, adhE* e cepa parental MG1655Atdh, rhtA* em crescer no meio mínimo M9 contendo etanol como a única fonte de carbono foi investigada. Foi demonstrado que a cepa parental MG1655Atdh, rhtA* e a cepa com expressão acentuada de álcool desidrogenase selvagem foram incapazes de crescer no meio contendo etanol (2% ou 3%) como única fonte de carbono (Figura 3, A e B). A cepa MG1655Atdh, rhtA*, PL_tacadhE-Lys568 (cl.18) contendo a mutação única na álcool desidrogenase descrita inicialmente (Membrillo-Hemandez, J. et al, J. Biol. Chem. 275: 3386933875 (2000)) exibiu crescimento muito pobre no mesmo meio. Mas cepas contendo mutações na álcool desidrogenase além da mutação Glu569Lys exibiram bom crescimento (Figura 3, A e B). Todas as cepas acima foram capazes de crescer no meio mínimo M9 contendo uma mistura de glicose e etanol, mas cepas com expressão acentuada da álcool desidrogenase mutante contendo mutações além da mutação Glu569Lys exibiram melhor crescimento (Figura 4).

Também foi mostrado que a cepa MG1655Atdh, rhtA*, adhE* contendo a álcool desidrogenase com 5 mutações sob o controle do promotor nativo foi incapaz de crescer no meio mínimo M9 contendo etanol (2% ou 3%) como única fonte de carbono. A expressão acentuada do gene codificando a citada álcool desidrogenase é necessária para bom crescimento (Figura 5).

Exemplo 10. O efeito do aumento da expressão do gene adhE mutante na produção de L-treonina Para avaliar o efeito do acentuamento da expressão do gene adhE mutante na produção de treonina, cepas de E. coli MG1655Atdh, rhtA*, PL-tacadhE; MG1655Atdh, rhtA*, PL.tacadhE*; MG1655Atdh, rhtA*, Pl-tacadhE-Lys568 (cl.18); MG1655Atdh, rhtA*, PL.tacadhE-Lys568, Val566 (cl.l); MG1655Atdh, rhtA*, adhE* e cepa parental MG1655Atdh, rhtA* foram transformadas com plasmídeo pVIC40.

Essas cepas e a cepa parental MG1655Atdh, rhtA* (pVIC40) foram cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutritivo e 0,3 mL de cada uma das culturas obtidas foram inoculados em 3 mL de meio de fermentação (veja Exemplo 4) em um tubo de teste de 20x200 mm e cultivada a 34°C por 48 horas com um agitador em rotação. Dados de pelo menos 10 experimentos independentes são mostrados nas Tabelas 1 e 2.

Pode-se ver a partir das Tabelas 1 e 2, álcool desidrogenase mutante foi capaz de acumular uma quantidade maior de L-treonina quando comparada com MG1655Atdh, rhtA* em que nem a expressão de uma álcool desidrogenase selvagem nem a de uma mutante foi aumentada ou mesmo com MG1655Atdh, rhtA*, ou PL-taCadhE, em que a expressão de álcool desidrogenase selvagem foi aumentada. Tal acúmulo maior de L-treonina durante a fermentação foi observado no meio contendo uma mistura de glicose e etanol ou só etanol como única fonte de carbono.

Fermentação em tubo de teste foi efetuada sem reversão de etanol evaporado.

Exemplo 11.0 efeito do aumento da expressão do gene adhE na produção de L-lisina Para testar o efeito da expressão acentuada do gene adhE sob o controle de promotor PL_tac na produção de lisina, os fragmentos de DNA do cromossomo das cepas acima descritas MG1655Atdh, rhtA*, PL_tacadhE; MG1655Atdh, rhtA*, PL.tacadhE*; MG1655Atdh, rhtA*, PL^adhE-LysSÓS (cl. 18); MG1655Atdh, rhtA*, PL.tacadhE-Lys568, Val566 (cl.l); MG1655Atdh, rhtA*, adhE* foram transferidos para a cepa de E. coli produtora de lisina WC196AcadAAldc (pCABD2) por transdução com PI (Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). PCABD2 é um plasmídeo compreendendo o gene dapA que codifica uma diidrodipicolinato sintase que tem uma mutação que dessensibiliza inibição por retroalimentação por L-lisina, o gene lysC que codifica aspartoquinase III que têm uma mutação que dessensibiliza inibição por retroalimentação por L-lisina„ o gene dapB que codifica uma diidrodipicolinato redutase e o gene ddh que codifica diaminopimelato desidrogenase (Patente US No. 6.040.160).

As cepas resultantes e a cepa parental WC196AcadAAldc (pCABD2) foram espalhadas em placas com L-meio contendo 20 mg/L de estreptomicina a 37°C e células correspondentes a 1/8 de uma placa foram inoculadas em 20 mL de meio de fermentação contendo as drogas requeridas em um frasco de 500 mL. O cultivo pode ser efetuado a 37°C por 48 horas usando um agitador recíproco na velocidade de agitação de 115 rpm. Após o cultivo, as quantidades de L-lisina e etano residual no meio podem ser medidas por um método conhecido (Bio-Sensor BF-5, fabricado por Oji Scientific Instruments). Então, o rendimento de L-lisina em relação ao etanol consumido pode ser calculado para cada uma das cepas. A composição do meio de fermentação(g/L) foi como se segue: Etanol 20,0 (NH4)2S04 24,0 k2hpo4 1,0 MgS04.7H20 1,0 FeS04.7H20 0,01 MnS04.5H20 0,01 Extrato de levedura 2,0 O pH é ajustado a 7,0 por KOH e o meio foi autoclavado a 115°C por 10 min. Etanol e MgS04 foram esterilizados separadamente.

CaC03 foi esterilizado por calor seco a 180°C por 2 horas e adicionado ao meio em uma concentração final de 30 g/L. Dados de dois experimentos paralelos são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3 Pode-se ver a partir das Tabela 3 que a álcool desidrogenase mutante e uma álcool desidrogenase selvagem foram capazes de levar ao aumento de crescimento e acúmulo de uma quantidade maior de L-lisina quando comparada com WC196AcadAAldc (pCABD2), em que nem a expressão de uma álcool desidrogenase selvagem nem a de uma mutante foi aumentada.

Exemplo 12. Construção deE. coli MG 1655AargR,Pi .taradhE* 1. Construção da cepa MG 1655AargR

Esta cepa foi construída pela inativação do gene argR nativo, que codifica um repressor da via de biossíntese de L-arginina em E. coli MG1655 pelo gene kan. Para substituir o gene argR nativo, o fragmento de DNA portando um marcador de resistência a canamicina (KmR) codificado pelo gene kan foi integrado no cromossomo de E. coli MG 1655 (ATCC 700926) no lugar do gene argR nativo pela integração dirigida por vermelho.

Um fragmento de DNA contendo um marcador Km codificado pelo gene kan foi obtido por PCR usando o plasmídeo disponível comercialmente pACYC177 (número de acesso GenBank/EMBL X06402, “Fermentas”, Lituânia) como gabarito e iniciadores P26 (SEQ ID NO: 31) e P27 (SEQ ID NO: 32). O iniciador P26 contém 40 nucleotídeos homólogos à região 5' do gene argR introduzido no iniciador para integração posterior no cromossomo bacteriano. O iniciador P27 contém 41 nucleotídeos homólogos à região 3' do gene argR introduzido no iniciador para integração posterior no cromossomo bacteriano. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C, seguida por 25 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, ligação a 55°C por 30 s, extensão a 72°C por 40 s e a extensão final por 5 min a 72°C. Então, o fragmento de DNA amplificado foi purificado por eletroforese em gel de agarose, extraído usando “GenElute Spin Columns” (Sigma, EUA) e precipitado por etanol. O fragmento de DNA obtido foi usado para eletroporação e integração mediada por vermelho no cromossomo bacteriano de E. coli MG1655/pKD46. Células de MG1655/pKD46 foram cultivadas durante a noite a 30°C em meio LB líquido com adição de ampicilina (100 pg/mL), então diluídas 1:100 em meio SOB (extrato de levedura, 5 g/L; NaCl, 0,5 g/L; triptona, 20 g/L; Kcl, 2,5 mM; MgCl2, 10 mM) com adição de ampicilina (100 pg/mL) e L-arabinose (10 mM) (arabinose é usada para induzir o plasmídeo contendo os genes do sistema vermelho) e cultivadas a 30°C para atingir a densidade ótica da cultura bacteriana OD6oo=0,4-0,7. As células cultivadas a partir de 10 mL da cultura bacteriana foram lavadas 3 vezes com água deionizada gelada, seguido por suspensão em 100 pL da água. Dez micro litros de fragmentos de DNA (100 ng) dissolvidos na água deionizada foram adicionados à suspensão celular. A eletroporação foi realizada por eletroporador “Bio-Rad” (EUA) (No. 165-2098, versão 2-89) de acordo com as instruções do fabricante. Células submetidas a choque foram adicionadas a 1 mL de meio SOC, incubadas por 2 horas a 37°C e então foram espalhadas em L-ágar contendo 25 pg/mL de cloranfenicol. Colônias cultivadas por 24 horas foram testadas pela presença do marcador KmR em vez do gene argR nativo por PCR usando iniciadores P28 (SEQ ID NO: 33) e P29 (SEQ ID NO: 34). Para esta finalidade, uma colônia recém isolada foi recolocada em suspensão em 20pL de água e então lpL da suspensão obtida foi usado para PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C; então 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 30s, ligação a 55°C por 3 Os e extensão a 72°C por 30 s; a extensão final por 5 min a 72°C. Poucas colônias KmR testadas continham o fragmento de DNA de 1110 pb desejado, confirmando a presença do DNA de marcador KmR em vez do fragmento de 660 pb do gene argR. Uma das cepas obtidas foi curada do plasmídeo termo lábil pKD46 por cultivo a 37°C e a cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655AargR. 2. Construção de E. coli MG1655AargR,Pi.t;,radhE* E. coli MG1655AargR,PL_tacadhE* foi obtida pela transdução da mutação PL_tacadhE* a partir da cepa MG1655::PL_tacadhE*. A cepa MG1655AargR foi infectada com fago Plvir cultivado na cepa doadora MG1655::PL-taCadhE* e a cepa E. coli MG1655AargR, PL.tacadhE* foi obtida. Esta cepa foi avaliada por crescimento em placas de M9 com 2% de etanol como a única fonte de carbono. A taxa de crescimento foi a mesma para a cepa MG1655::PL.tacadhE* (36h).

Exemplo 13. Construção do plasmídeo pMWl 19-ArgA4 O gene argA com uma única mutação provê o fenótipo fbr (resistente a retroalimentação) (JP2002253268, EP1170361) e sob o controle de seu próprio promotor foi clonado no vetor pMWl 19. O gene argA foi obtido por PCR usando o plasmídeo pKKArg-r4 (JP2002253268, EP1170361) como gabarito e iniciadores P30 (SEQ ID NO: 35) e P31 (SEQ ID NO: 36). A seqüência do iniciador P30 é homóloga à região 5' do gene argA localizada 20 pb a montante e 19 pb a jusante do códon de início do gene argA. O iniciador P31 contém 24 nucleotídeos homólogos à região 3' do gene argA e sítio de restrição de HindIII introduzido para clonagem posterior no vetor pMWl 19IBamHI-HindIII. A seqüência do promotor PargA foi obtida por PCR usando oE. coli MG1655 como gabarito e iniciadores P32 (SEQ ID NO: 37) e P33 (SEQ ID NO: 38). O iniciador P32 contém 30 nucleotídeos homólogos à região 5' não traduzida do gene argA localizada 245 pb a montante do códon de início e além disso essa seqüência inclui sítio de reconhecimento de BamHI. O iniciador P33 contém 24 nucleotídeos homólogos à região 5' do gene argA localizada 20 pb a montante do códon de início e códon de início por si só. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C, seguida por 25 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, ligação a 54°C por 30 s, extensão a 72°C por 1 min 20 s (para gene argA) ou 20 s (para promotor PargA) e a extensão final por 5 min a 72°C. Então, os fragmentos de DNA amplificados foram purificados por eletroforese em gel de agarose, extraídos usando “GenElute Spin Columns” (Sigma, EUA) e precipitados por etanol. O fragmento PargA argA foi obtido por PCR usando ambos os fragmentos de DNA acima descritos: promotor PargA e gene argA. Primeiro, a mistura de reação (volume total - 100 pL) consistiu de 10 pL de tampão de PCR lOx com 25 mM de MgCl2 (Sigma, EUA), 200 pM de cada dNTP e 1 U de Accu-Taq DNA polimerase (Sigma, EUA). O fragmento de argA (25 ng) e PargA (5 ng) foram usados como DNA gabarito e como iniciadores simultaneamente. Em seguida, iniciadores P31 e P32 foram adicionados na mistura de reação. O perfil de temperatura foi o seguinte: la etapa -desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C, seguida por 10 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, ligação a 53°C por 30 s, extensão a 72°C por 1 min, 2a etapa - 15 ciclos de desnaturação a 95°C, ligação a 54°C por 30 s, extensão a 72°C por 1 min 30 s. Os fragmentos de DNA amplificados foram purificados por eletroforese em gel de agarose, extraídos usando “GenElute Spin Columns” (Sigma, EUA), precipitados por etanol, tratados com BamHI e HindlII e ligados com vetor pMW 119IBamHI-HindIII. Como resultado foi obtido o plasmídeo pMW 119-ArgA4.

Exemplo 14. O efeito do aumento da expressão do gene adhE na produção de L-arginina Para avaliar o efeito da expressão acentuada do gene adhE mutante na produção de L-arginina, cepas de E. coli MG1655AargR Pl-tacadhE* e MG1655AargR foram transformadas cada uma pelo plasmídeo pMWl 19-ArgA4. Dez colônias obtidas de cada tipo de transformantes foram cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutritivo suplementado com 150 mg/L de Ap e 0,1 mL de cada uma das culturas obtidas foram inoculados em 2 mL de meio de fermentação em um tubo de teste de 20x200 mm e cultivada a 32°C por 96 horas com um agitador em rotação. Após o cultivo, a quantidade de L-arginina que se acumula no meio foi determinada por cromatografía em papel usando a seguinte fase móvel: butanol: ácido acético: água = 4:1:1 (v/v). Uma solução (2%) de ninidrina em acetona foi usada como um agente de visualização. Um ponto contendo L-arginina foi cortado, L-arginina foi eluída em 0,5% de solução aquosa de CdCl2 e a quantidade de L-arginina foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm. Os resultados de dez fermentações em tubos de teste independentes são mostrados na Tabela 4. Como se segue a partir da Tabela 4, MGA1655argR PL_taCadhE* produziu uma maior quantidade de L-arginina, quando comparada com MGA1655argR PL-taCadhE*, ambas em meio com glicose suplementada e sem ela. A composição do meio de fermentação foi como se segue (g/L): Etanol 20 Glicose 0/5 (NH4)2S04 25 K2HP04 2 MgS04.7H20 1,0 Hidrocloreto de tiamina 0,002 Extrato de levedura 5,0 CaC03 33 MgSo4*7H20, etanol e CaC03 foram cada um esterilizados separadamente. Tabela 4 Exemplo 15. Construção da cepa NS1391 de E. coli produtora de L-leucina A cepa NS1391 foi obtida como se segue.

Primeiro, uma cepa que tem genes de acetolactato sintase inativados (combinação de deleções ΔilvIH e AilvGM) foi construída. Os genes ilvIH (AilvIH::cat) foram deletadas da cepa selvagem de E. coli Kl2 (VKPM B-7) por transdução com PI (Sambrook et al., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). E. coli MG 1655 AilvIH::cat foi usada como uma cepa doadora. A deleção do operon ilvIH na cepa MG1655 foi conduzida por meio da integração dirigida por vermelho. De acordo com este procedimento, os iniciadores de PCR P34 (SEQ ID NO: 39) e P35 (SEQ ID NO: 40) homólogos a ambas as regiões adjacentes ao operon ilvIH e gene conferindo resistência a cloranfenicol no plasmídeo gabarito foram construídos. O plasmídeo pMW-attL-Cm-attR (pedido PCT WO 05/010175) foi usado como um gabarito em uma reação de PCR. Condições para PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação por 3 min a 95°C; perfil para dois primeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 s a 34°C, 40 s a 72°C; perfil para os últimos 30 ciclos: 95°C por 30 s, 50°C por 30 s, 72°C por 40 s; etapa final: 5 min a 72°C. O produto de PCR de 1713 pb obtido foi purificado em gel de agarose e usado para eletroporação de E. coli MG1655/pKD46. Recombinantes resistentes a cloranfenicol foram selecionados após a eletroporação e verificados por meio de PCR com iniciadores lócus-específicos P36 (SEQ ID NO: 41) e P37 (SEQ ID NO: 42). Condições para verificação de PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação por 3 min a 94°C; perfil para os 30 ciclos: 94°C por 30 s, 53°C por 30 s, 72°C por 1 min 20 s; etapa final: 7 min a 72°C. Produto de PCR, obtido na reação com o DNA cromossômico da cepa IlvIH+ parental MG 1655 como gabarito, tinha 2491 nt de comprimento. Produto de PCR, obtido na reação com o DNA cromossômico da cepa MG1655 AilvIH::cat mutante como gabarito, tinha 1823 nt de comprimento. Como resultado, a cepa MG1655 AilvIH::cat foi obtida. Após a deleção de genes ilvIH (AilvIH::cat) de E. coli Kl2 (VKPM B-7) por transdução com P1, transdutantes CmR foram selecionados. Como resultado, a cepaAilvIH::cat B-7 foi obtida. Para eliminar o marcador de resistência a cloranfenicol de AilvIH::cat B-7, células foram transformadas com o plasmídeo pMWl 18-int-xis (ApR) (W02005/010175). Clones ApR foram cultivados em placas de LB ágar contendo 150 mg/mL de ampicilina a 30°C. Várias dezenas de clones ApR foram colhidos e testados por sensibilidade a cloranfenicol. O plasmídeo pMW 118-int-xis foi eliminado de células Cms por incubação em placas de LB ágar a 42°C. Como resultado, a cepa B-7 AilvIH foi obtida.

Os genes ilvGM (AilvGM::cat) foram deletadas de E. coli B-7 AilvIH por transdução com Pl. E. coli MG 1655 AilvGM::cat foi usada como uma cepa doadora. O operon ilvGM foi deletado da cepa MG 165 5 por integração dirigida por vermelho. De acordo com este procedimento, os iniciadores de PCR P38 (SEQ ID NO: 43) e P39 (SEQ ID NO: 44) homólogos a ambas as regiões adjacentes ao operon ilvGM e gene conferindo resistência a cloranfenicol no plasmídeo gabarito foram construídos. O plasmídeo pMW-attL-Cm-attR (pedido PCT WO 05/010175) foi usado como um gabarito em uma reação de PCR. Condições para PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação por 3 min a 95°C; perfil para dois primeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 s a 34°C, 40 s a 72°C; perfil para os últimos 30 ciclos: 95°C por 30 s, 50°C por 30 s, 72°C por 40 s; etapa final: 5 min a 72°C. O produto de PCR de 1713 pb obtido foi purificado em gel de agarose e usado para eletroporação de E. coli MG1655/pKD46. Recombinantes resistentes a cloranfenicol foram selecionados após a eletroporação e verificados por meio de PCR com iniciadores lócus-específicos P40 (SEQ ID NO: 45) e P41 (SEQ ID NO: 46). Condições para verificação de PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação por 3 min a 94°C; perfil para os 30 ciclos: 94°C por 30 s, 54°C por 30 s, 72°C por 1 min 30 s; etapa final: 7 min a 72°C. Produto de PCR, obtido na reação com o DNA cromossômico da cepa parental MG1655 como gabarito, tinha 2209 nt de comprimento. Produto de PCR, obtido na reação com o DNA cromossômico da cepa MG1655 AilvGM::cat mutante como gabarito, tinha 1491 nt de comprimento. Como resultado, a cepa MG1655 AilvGM::cat foi obtida. Após a deleção de genes ilvGM (AilvGM: :cat) de E. coli B-7 AilvIH por transdução com Pl, transdutantes CmR foram selecionados. Como resultado, a cepa B-7 AilvIH AilvBN AilvGM::cat foi obtida. O marcador de resistência a cloranfenicol foi eliminado de B-7 AilvIH AilvBN AilvGM::cat como descrito acima. Como resultado, a cepa B-7 AilvIH AilvGM foi obtida. A região reguladora nativa do operon ilvBn foi substituída pelo promotor do fago lambda PL pela integração dirigida por vermelho. Para esta finalidade, a cepa B7 AilvIH AilvGM a AHAS I única foi usada como uma cepa inicial para tal modificação. De acordo com o procedimento da integração dirigida por vermelho, os iniciadores de PCR P42 (SEQ ID NO: 47) e P43 (SEQ ID NO: 48) foram construídos. O oligonucleotídeo P42 (SEQ ID NO: 47) é homólogo à região a montante do gene ilvB e à região adjacente ao gene que confere resistência a antibiótico que estava presente no DNA cromossômico de BW25113 cat-PL-yddG. O oligonucleotídeo P43 (SEQ ID NO: 48) era homólogo tanto à região de ilvB como à região a jusante do promotor PL que estava presente no cromossomo de BW25113 cat-PL-yddG. A obtenção de BW25113 cat-PL-yddG foi descrita em detalhe previamente (EP1449918A1, Patente Russa RU2222596). O DNA cromossômico da cepa BW25113 cat-PL-yddG foi usado como gabarito para PCR. Condições para PCR foram as seguintes: desnaturação por 3 min a 95°C; perfil para dois primeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 s a 34°C, 40 s a 72°C; perfil para os últimos 30 ciclos: 95°C por 30 s, 50°C por 30 s, 72°C por 40 s; etapa final: 5 min a 72°C. Como resultado, o produto de PCR foi obtido (SEQ ID NO: 49), purificado em gel de agarose e usado para eletroporação de E. coli B-7 ΔϋνΙΗ AilvGM, que contém o plasmídeo pKD46 com replicação termo lábil. Células eletrocompetentes foram preparadas como se segue: E. coli cepa B-7 ΔϋνΙΗ AilvGM foi cultivada durante a noite a 30°C em meio LB contendo ampicilina (100 pg/mL) e a cultura foi diluída 100 vezes com 5 mL de meio SOB (Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) com ampicilina e L-arabinose (1 mM). As células foram cultivadas com aeração a 30°C até uma OD60o de -0,6 e então tomadas eletrocompetentes por concentração de 100 vezes e lavagem três vezes com H20 deionizada gelada. A eletroporação foi realizada usando 70pL de células e -100 ng de produto de PCR. Após a eletroporação, as células foram incubadas com 1 mL de meio SOC (Sambrook et al., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) a 37°C por 2,5 horas e então foram plaqueadas em L-ágar e cultivadas a 37°C para selecionar recombinantes CmR. Então para eliminar o plasmídeo pKD46, 2 passagens em L-ágar com Cm a 42°C foram realizadas e as colônias obtidas testadas por sensibilidade a ampicilina. A cepa obtida B-7 AilvIH AilvGM cat-PL-ilvBN era sensível a valina. Novos mutantes espontâneos resistentes a valina de AHAS I foram obtidos a partir desta cepa. Cepas que cresceram melhor em 1 g/L de valina foram caracterizadas.

Mutações de resistência a valina que eram resistentes a isoleucina também foram obtidas. Variantes com uma atividade específica que era mais que aquela da selvagem foram obtidas. A seqüência nucleotídica dos operons mutantes para ilvBN4 mutante foi determinada. Foi revelado que IlvBN4 continha uma mutação pontual em Ilv:N17K Asn-Lys (códon aac foi substituído por aag). A cepa obtida B-7 AilvIH AilvGM cat-PL-ilvBN4 foi usada para as seguintes construções.

Então, fragmento de DNA de cat-PL-ilvBN4 foi transferido de E. coli B-7 AilvIH AilvGM cat-PL-ilvBN4 para E. coli MG1655 mini-Mu::scrKYABR (pedido EP 1149911) por transdução com Pl. Como resultado a cepa ESP214 foi obtida. O marcador de resistência a cloranfenicol foi eliminado da cepa ESP214 como descrito acima. Como resultado, a cepa ESP215 foi obtida.

Então o fragmento de DNA mostrado em (SEQ ID NO: 50) foi usado para eletroporação da cepa ESP215/pKD46 para a finalidade de integração subseqüente no cromossomo. Este fragmento de DNA continha regiões complementares à região 3' do gene bl701 e à região 5' do gene b!703 (esses genes são adjacentes ao gene pps), que são necessárias para a integração no cromossomo. Ele também continha um marcador cat de resistência a cloranfenicol excisável e um operon ilvBN4 mutante sob o controle do promotor constitutivo PL. A eletroporação foi realizada como descrito acima. Recombinantes CmR selecionados continham uma deleção do gene pps como resultado da integração de fragmento cat-PL-ilvBN4 no cromossomo. Assim, a cepa ESP216 foi obtida. O marcador de resistência a cloranfenicol foi eliminado da cepa ESP216 como descrito acima. Como resultado, a cepa ESP217 foi obtida.

Na próxima etapa, o gene leuA mutante (Gly479 -> Cys) sob o controle do promotor constitutivo PL foi introduzido na cepa ESP217. O fragmento de DNA mostrado na (SEQ ID NO: 51) foi usado para eletroporação da cepa ESP217/pKD46 para a finalidade de integração subseqüente no cromossomo. Este fragmento de DNA continha a região de 35 nt, que é necessária para a integração no cromossomo e homólogo à região a montante do gene leuA. Ele também continha uma região excisável complementar à seqüência do marcador cat de resistência a cloranfenicol e o gene leuA mutante (Gly479 -> Cys) sob o controle do promotor constitutivo Pl· A eletroporação foi realizada como descrito acima. Recombinantes CmR selecionados continham o gene mutante leuA (Gly479 -> Cys) sob o controle do promotor constitutivo PL integrado no cromossomo. Assim, a cepa ESP220 foi obtida. O marcador de resistência a cloranfenicol foi eliminado da cepa ESP220 como descrito acima. Como resultado, a cepa ESP221 foi obtida.

Então, o fragmento de DNA mostrado na SEQ ID NO: 52 foi usado para eletroporação da cepa ESP221/pKD46 para a finalidade de integração subseqüente no cromossomo. Este fragmento de DNA continha a região de 35 nt homóloga à região a montante do gene tyrB, que é necessária para a integração no cromossomo. Ele também continha uma região excisável complementar à seqüência do marcador cat de resistência a cloranfenicol e o gene tyrB com uma região regulatória (-35) modificada. A eletroporação foi realizada como descrito acima. Recombinantes CmR selecionados continham o gene tyrB com a região regulatória (-35) modificada. Assim, a cepa NS1390 foi obtida. O marcador de resistência a cloranfenicol foi eliminado da cepa NS1390 como descrito acima. Como resultado, a cepa NS1391 foi obtida. A cepa NS1391 produtora de leucina foi usada para trabalho adicional.

Exemplo 16. O efeito do aumento da expressão do gene adhE mutante na produção de L-leucina Para testar o efeito da expressão acentuada do gene adhE sob o controle de um promotor PL-tac na produção de leucina, fragmentos de DNA do cromossomo da cepa acima descritas MG1655PL-tacadhE* foram transferidos para a cepa NS1391 de E. coli produtora de L-leucina por transdução com Pl (Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) para obter a cepa NS1391 PL-tacadhE*.

Ambas as cepas, NS1391 e NS1391 PL_tacadhE*, foram cultivadas por 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Para obter uma cultura semente, as cepas foram cultivadas em um agitador por rotação (250 rpm) a 32°C por 18 horas em tubos de teste de contendo 2 mL de L-caldo suplementado com 4% de sacarose. Então, o meio de fermentação foi inoculado com 0,21 mL de material semente (10%). A fermentação foi realizada em 2 mL de um meio de fermentação mínima em tubos de teste de 20x200 mm. Células foram cultivadas por 48-72 horas a 32°C com agitação a 250 rpm. A quantidade de L-leucina foi medida por cromatografia em papel (composição de fase líquida: butanol: ácido acético: água = 4:1:1). Os resultados de dez fermentações em tubos de teste independentes são mostrados na Tabela 5. Como se segue a partir da Tabela 5, NS1391 PL. tacadhE* produziu uma maior quantidade de L-leucina, quando comparada com NS1391, em meios contendo diferentes concentrações de etanol. A composição do meio de fermentação (g/L) foi como se segue: Glicose 60,0 Etanol 0/10,0/20,0/30,0 (NH4)2S04 25,0 K2HP04 2,0 MgS04.7H20 1,0 Tiamina 0,01 CaC03 25,0 Glicose, etanol e CaC03 foram cada um esterilizados separadamente.

Tabela 5 Exemplo 17. Q efeito do aumento da expressão do gene adhE na produção de L-fenilalanina Para testar o efeito da expressão acentuada do gene adhE sob o controle de um promotor PL_tac na produção de fenilalanina, os fragmentos de DNA do cromossomo das cepas acima descritas MG1655Atdh, rhtA*, Pl-tacadhE; MG1655Atdh, rhtA*, PL_tacadhE*; MG1655Atdh, rhtA*, PL_tacadhE-Lys568 (cl.18); MG1655Atdh, rhtA*, PL.tacadhE-Lys568, Val566 (cl.l); MG1655Atdh, rhtA*, adhE* podem ser transferidos para a cepa de E. coli produtora de fenilalanina AJ12739 por transdução com PI (Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). A cepa AJ 12739 foi depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais (VKPM) (Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd, 1) em 6 de novembro de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8197 e então convertida para um depósito sob o Tratado de Budapeste em 23 de agosto de 2002.

As cepas resultantes e a cepa parental AJ12739 podem ser cultivadas cada uma a 37°C por 18 horas em um caldo nutritivo e 0,3 mL das culturas obtidas foram inoculados cada um em 3 mL de meio de fermentação em um tubo de teste de 20x200 mm e cultivadas a 37°C por 48 horas com um agitador em rotação. Após o cultivo, a quantidade de fenilalanina que se acumula no meio pode ser determinada por TLC. Placas de TLC de 10 x 15 cm revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbfll sem indicador fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Rússia) podem ser usadas. As placas de Sorbfll podem ser desenvolvidas com uma fase móvel: propan-2-ol: etilacetato: amônia aquosa 25%: água = 40: 40: 7: 16 (v/v). Uma solução (2%) de ninidrina em acetona pode ser usada como um reagente de visualização.

Composição de meio de fermentação (g/L): Etanol 20,0 (NEfi^SCh 16,0 k2hpo4 0,1 MgS04.7H20 1,0 FeS04.7H20 0,01 MnS04.5H20 0,01 Hidrocloreto de tiamina 0,0002 Extrato de levedura 2,0 Tirosina 0,125 CaC03 20,0 Etanol e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaC03 esterilizado por calor seco a 180°C por 2 horas. PH ajustado a 7,0. Exemplo 18. O efeito do aumento da expressão do gene adhE na produção de L-triptofano Para testar o efeito da expressão acentuada do gene adhE sob o controle de um promotor PL-tac na produção de triptofano, os fragmentos de DNA do cromossomo das cepas acima descritas MG1655Atdh, rhtA*, Pl-tacadhE; MG1655Atdh, rhtA*, PL_tacadhE*; MG1655Atdh, rhtA*, PL_tacadhE-Lys568 (cl.18); MG1655Atdh, rhtA*, PL.tacadhE-Lys568, Val566 (cl.l); MG1655Atdh, rhtA*, adhE* podem ser transferidos para a cepa de E. coli produtora de triptofano SV164 (pGH5) por transdução com PI (Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). A cepa SV164 tem o alelo trpE que codifica antranilato sintase que não está sujeita a inibição por retroalimentação por triptofano. O plasmídeo pGH5 abriga um gene ser A mutante que codifica fosfoglicerato desidrogenase que não está sujeita a inibição por retroalimentação por serina. A cepa SV164 (pGH5) é descrita em detalhe em Patente US No. 6.180.373 ou Patente Européia 0662143.

As cepas resultantes e a cepa parental SV164 (pGH5) podem ser cultivadas cada uma com agitação a 37°C por 18 horas em 3 mL de caldo nutritivo suplementado com 20 mg/L de tetraciclina (marcador de plasmídeo pGH5). Três décimos de mililitro das culturas obtidas podem ser inoculados cada um em 3 mL de um meio de fermentação contendo tetraciclina (20 mg/L) em tubos de teste de 20x200 mm e cultivadas a 37°C por 48 horas com um agitador em rotação a 250 rpm. Após o cultivo, a quantidade de triptofano que se acumula no meio pode ser determinada por TLC como descrito no Exemplo 17. Os componentes do meio de fermentação são expostos na Tabela 6, mas devem ser esterilizados em grupos separados A, B, C, D, E, F e H, como mostrado, para evitar interações adversas durante a esterilização.

Tabela 6 A solução A tinha um pH de 7,1, ajustado por NH4OH.

Exemplo 19. O efeito do aumento da expressão do gene adhE na produção de L-histidina Para testar o efeito da expressão acentuada do gene adhE sob o controle de um promotor PL-tac na produção de histidina, os fragmentos de DNA do cromossomo das cepas acima descritas MG1655Atdh, rhtA*, PL. tacadhE; MG1655Atdh, rhtA*, PL.tacadhE*; MG1655Atdh, rhtA*, PL-tacadhE-Lys568 (cl. 18); MG1655Atdh, rhtA*, PL.taCadhE-Lys568, Val566 (cl.l); MG1655Atdh, rhtA*, adhE* podem ser transferidos para a cepa de E. coli produtora de histidina 80 por transdução com PI (Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). A cepa 80 foi descrita em detalhe na Patente Russa 2119536 e depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais (VKPM) (Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd, 1) em 15 de outubro de 1999 sob o número de acesso VKPM B-7270 e então convertida para um depósito sob o Tratado de Budapeste em 12 de julho de 2004.

As cepas resultantes e a cepa parental 80 podem ser cultivadas cada uma em caldo L por 6 horas a 29°C. Então 0,1 mL das culturas obtidas podem ser inoculados cada um em 2 mL de um meio de fermentação em tubos de teste de 20x200 mm e cultivadas a 29°C por 65 horas com um agitador em rotação (350 rpm). Após o cultivo, a quantidade de histidina que se acumula no meio pode ser determinada por cromatografia em papel. O papel pode ser desenvolvido com uma fase móvel: n-butanol: ácido acético: Agua = 4:1:1 (v/v). Uma solução de ninidrina em acetona pode ser usada como um reagente de visualização.

Composição de meio de fermentação (pH 6,0)(g/L): Etanol 20,0 Mameno (hidrolisado de soja) 0,2 como nitrogênio total L-prolina 1,0 (NH4)2S04 25,0 K2HP04 2,0 MgS04.7H20 1,0 FeS04.7H20 0,01 MnSQ4 0,01 Tiamina 0,001 Betaína 2,0 CaC03 60,0 Etanol, prolina, betaína e CaC03 são esterilizados separadamente. O pH é ajustado a 6,0 antes da esterilização.

Exemplo 20. O efeito do aumento da expressão do gene adhE na produção de ácido L-glutâmico Para testar o efeito da expressão acentuada do gene adhE sob o controle de um promotor PL-tac na produção de ácido glutâmico, os fragmentos de DNA do cromossomo das cepas acima descritas MG1655Atdh, rhtA*, PL. tacadhE; MG1655Atdh, rhtA*, PL.tacadhE*; MG1655Atdh, rhtA*, PL_tacadhE-Lys568 (cl. 18); MG1655Atdh, rhtA*, PL.tacadhE-Lys568, Val566 (cl.l); MG1655Atdh, rhtA*, adhE* podem ser transferidos para a cepa de E. coli produtora de ácido glutâmico VL334thrC+ (EP1172433) por transdução com PI (Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). A cepa VL334thrC+ foi depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais (VKPM) (Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd, 1) em 6 de dezembro de 2004 sob o número de acesso VKPM B-8961 e então convertida para um depósito sob o Tratado de Budapeste em 8 de dezembro de 2004.

As cepas resultantes e a cepa parental VL334thrC+ podem ser cultivadas cada uma com agitação a 37°C por 18 horas em 3 mL de caldo nutritivo. Três décimos de mililitro das culturas obtidas podem ser inoculados cada um em 3 mL de um meio de fermentação em tubos de teste de 20x200 mm e cultivadas a 37°C por 48 horas com um agitador em rotação a 250 rpm. A composição de meio de fermentação (pH 7,2)(g/L): Etanol 20,0 Sulfato de amônio 25,0 KH2P04 2,0 MgS04.7H20 1,0 Tiamina 0,0001 L-isoleucina 0,05 CaC03 25,0 Etanol e CaC03 foram esterilizados separadamente.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe com referência às modalidades preferidas desta, será evidente a alguém versado na técnica que várias alterações podem ser feitas e equivalentes empregados, sem sair do âmbito da invenção. Cada um dos documentos acima mencionados é incorporado a esse respeito como referência em sua totalidade.

Aplicabilidade Industrial De acordo com a presente invenção, a produção de um L-aminoácido por uma bactéria da família Enterobacteriaceae pode ser acentuada.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende: A) cultivar em um meio de cultura contendo etanol uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae que tenha um álcool desidrogenase e B) isolar o L-aminoácido do meio de cultura, cm que o gene que codifica a citada álcool desidrogenase c expresso sob o controle de um promotor não nativo que funciona sob condições de cultivo aeróbico.

2, Método de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo fato de que o citado promotor não nativo é selecionado do grupo que consiste em P,uc,Pi;ii:, Plq„ Pirt:, PR e Pi,.

3, Método de acordo com a reivindicação I ou 2, caracterizado pelo fato de que a citada álcool desidrogenase c resistente a inatívação aeróbica.

4, Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a citada álcool desidrogenase origina-se de uma bactéria selecionada do grupo que consiste em Escherichia co!iy Erwinia carotovora, Salmonella typhinutrium, Shigeüa flexnerí, Yersinia pestiSy Pantoea ananatis, LtwlobacUhts plantaram e Lactococxus lactis,

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a citada álcool desidrogenase compreende a sequência de aminoãcidos exposta em SEQ ID NO: 2, exceto pelo resíduo de ácido glutâmico na posição 568 ser substituído por outro resíduo de aminoácido fora um resíduo de ácido aspártico.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a citada álcool desidrogenase compreende a sequência de aminoácidos exposta em SEQ ID NO: 2, exceto pelo resíduo de ácido glutâmico na posição 568 ser substituído por um resíduo de lisina.

7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a citada álcool desidrogenase tem pelo menos uma mutação adicional que é capaz de melhorar o crescimento da citada bactéria em um meio líquido que contém etanol como a única fonte de carbono, e em que a citada mutação adicional é selecionada do grupo que consiste em: A) substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 560 na SEQID NO: 2 por outro resíduo de aminoácido; B) substituição do resíduo de fenilalanina na posição 566 na SEQ ID NO: 2 por outro resíduo de aminoácido; C) substituição do resíduo de ácido glutâmico, do resíduo de metionina, do resíduo de tirosina, do resíduo de isoleucina e do resíduo de alanina nas posições 22, 236, 461, 554 e 786, respectivamente, na SEQ ID NO: 2 por outros resíduos de aminoácidos e D) combinações destes.

8.

Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a citada mutação adicional é selecionada do grupo que consiste em: A) substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 560 na SEQ ID NO: 2 por um resíduo de lisina; B) substituição do resíduo de fenilalanina na posição 566 na SEQ ID NO: 2 por um resíduo de valina; C) substituição do resíduo de ácido glutâmico, do resíduo de metionina, do resíduo de tirosina, do resíduo de isoleucina e do resíduo de alanina nas posições 22, 236, 461, 554 e 786, respectivamente, na SEQ ID NO: 2 por um resíduo de glicina, um resíduo de valina, um resíduo de cisteína, um resíduo de serina e um resíduo de valina, respectivamente e D) combinações destes.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a citada bactéria produtora de L-aminoácido pertence ao gênero selecionado do grupo que consiste em Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella e Morganella. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o citado L-aminoácido é selecionado do grupo que consiste em L-treonina, L-lisina, L-histidina, L-fenilalanina, L-arginina, L-triptofano, ácido L-glutâmico e/ou L-leucina.