ES2867974T3 - Método para producir L-aminoácido - Google Patents

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Nobuaki Matsuoka
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Abstract

Método para producir un aminoácido básico o un producto de fermentación que contiene el aminoácido básico, comprendiendo el método las siguientes etapas (A) y (B): (A) una etapa de cultivar un microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico en un medio de cultivo, de modo que los iones bicarbonato y/o iones carbonato sirven como contraiones para el aminoácido básico, para obtener un caldo de fermentación que contiene el aminoácido básico, en el que la etapa se lleva a cabo de modo que la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo se controla a 300 mM o menor durante al menos un periodo parcial de cultivo; (B) una etapa de someter el caldo de fermentación a un tratamiento térmico bajo una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, en el que la temperatura del tratamiento térmico es de 60ºC o mayor.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para producir L-aminoácido
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para producir un L-aminoácido, específicamente un aminoácido básico tal como L-lisina y L-arginina, mediante fermentación usando un microorganismo. Los L-aminoácidos son útiles a nivel industrial como aditivos de piensos para animales, ingredientes para aderezos, alimentos y bebidas, infusiones de aminoácidos, etc.
Técnica anterior
Los L-aminoácidos, tales como aminoácidos básicos, se producen a nivel industrial, por ejemplo, mediante fermentación usando microorganismos que tienen la capacidad de producir un L-aminoácido. En un método para producir un aminoácido básico mediante fermentación, se cultiva un microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico para generar y acumular el aminoácido básico en un caldo de fermentación y se recoge el aminoácido básico a partir del caldo de fermentación. En un caso de este tipo, el cultivo se lleva a cabo mediante un método discontinuo, un método semicontinuo o un método continuo.
Convencionalmente, en la producción de un aminoácido básico mediante fermentación se han usado iones sulfato o iones cloruro como contraaniones del aminoácido básico para mantener el pH de un medio de cultivo (documentos de patente 1 y 2). Sin embargo, todavía existe cabida para una mejora en el método usando iones sulfato o iones cloruro desde el punto de vista del coste de purificación y la corrosión de un tanque de fermentación.
Cuando se requiere purificación, un aminoácido básico se recoge, a menudo, a partir de un caldo de fermentación mediante intercambio iónico. Por ejemplo, en el caso de L-lisina, se ajusta un caldo de fermentación a un pH ácido y se adsorbe L-lisina a una resina de intercambio iónico, luego se eluye a partir de la resina con iones amonio y se usa como base de lisina como tal, o se cristaliza como clorhidrato de L-lisina con ácido clorhídrico.
En cambio, cuando no se requiere purificación, generalmente, se concentra un caldo de fermentación como tal, o se somete un caldo de fermentación ajustado a un pH ácido con ácido clorhídrico o ácido sulfúrico a granulación por pulverización. En un caso de este tipo, la razón de contenido del aminoácido básico en el producto de fermentación obtenido está limitada debido al/a los componente(s) restante(s) contenido(s) en un medio de cultivo y, por tanto, no pueden ignorarse los contraaniones añadidos al medio de cultivo. Por tanto, una reducción de la cantidad de contraaniones usada es importante desde el punto de vista no sólo del coste de producción, sino también de la calidad del producto.
Como método para reducir la cantidad de contraaniones usada, se conocen métodos para producir un aminoácido básico mediante fermentación usando iones bicarbonato y/o iones carbonato como contraiones del aminoácido básico (también denominado “fermentación con carbonato”; documentos de patente 3 y 4). Mediante la fermentación con carbonato, puede producirse un aminoácido básico mediante fermentación a la vez que se reduce la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro usada. Además, cuando se requiere purificación, la descarboxilación puede llevarse a cabo elevando la temperatura o ajustando el pH a un pH ácido, para obtener fácilmente una disolución de base de lisina. Además de los métodos descritos anteriormente, el documento US 2015/0337254 A1 describe un método para controlar la concentración de amoniaco de un medio de cultivo contenido en un tanque de cultivo usando un aparato de control de amoniaco, y el documento JP 6094094 se refiere a la mejora en la productividad de lisina cultivando una cepa microbiana productora de lisina bajo irradiación de luz.
Bibliografía de la técnica anterior
Bibliografía de patentes
Documento de patente 1: JP05-030985A
Documento de patente 2: JP05-024969A
Documento de patente 3: US2002-025564A
Documento de patente 4: W02006/038695
Sumario de la invención
Objeto que va a lograrse mediante la invención
Un caldo de fermentación de un aminoácido se somete a menudo a un tratamiento térmico. Por ejemplo, se lleva a cabo un tratamiento térmico con el fin de esterilización o concentración y, además, a menudo se llevan a cabo otros tratamientos tales como retirada de células y tratamiento con resina de intercambio iónico a una alta temperatura desde el punto de vista de la mejora en la productividad. Los inventores de la presente invención descubrieron que cuando se calentaba un caldo de fermentación con carbonato de lisina, disminuía la cantidad de lisina contenida (tablas 1 y 2). Los inventores de la presente invención descubrieron además que cuando se calentaba un caldo de fermentación con carbonato de lisina, se liberaban iones bicarbonato y/o iones carbonato usados como contraiones como gas de dióxido de carbono para elevar de ese modo el pH, y que un mayor pH daba como resultado una mayor razón de disminución en la cantidad de lisina contenida (tabla 3).
Una disminución de este tipo en la cantidad de un aminoácido básico contenida puede evitarse disminuyendo el pH del caldo de fermentación con ácido clorhídrico o ácido sulfúrico. Sin embargo, en un caso de este tipo, se anula una característica ventajosa de la fermentación con carbonato de que la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro usada puede reducirse en la etapa de purificación. Por tanto, un objeto de la presente invención es desarrollar una nueva técnica para evitar una disminución en la cantidad de un aminoácido básico contenida en un caldo de fermentación que puede obtenerse mediante fermentación con carbonato y, por tanto, proporcionar un método para producir de manera eficiente un aminoácido básico o un producto de fermentación que contiene el mismo.
Medios para lograr el objeto
Con el fin de lograr el objeto mencionado anteriormente, los inventores de la presente invención llevaron a cabo diversas investigaciones. Como resultado, descubrieron que cuando se somete un caldo de fermentación que puede obtenerse mediante fermentación con carbonato a un tratamiento térmico, puede evitarse una disminución de la cantidad de un aminoácido básico contenida llevando a cabo el tratamiento térmico bajo una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, y lograron la presente invención.
Por tanto, la presente invención puede realizarse, por ejemplo, de la siguiente manera.
[1] Un método para producir un aminoácido básico o un producto de fermentación que contiene el aminoácido básico, comprendiendo el método las siguientes etapas (A) y (B):
(A) una etapa de cultivar un microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico en un medio de cultivo, de modo que los iones bicarbonato y/o iones carbonato sirven como contraiones para el aminoácido básico, para obtener un caldo de fermentación que contiene el aminoácido básico, en el que la etapa se lleva a cabo de modo que la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo se controla a 300 mM o menor durante al menos un periodo parcial de cultivo;
(B) una etapa de someter el caldo de fermentación a un tratamiento térmico bajo una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, en el que la temperatura del tratamiento térmico es de 60°C o mayor.
[2] El método mencionado anteriormente,
en el que la presión es una presión igual a o mayor que el valor total de la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de vapor de agua a la temperatura del tratamiento térmico en cuanto a presión manométrica, y
en el que la presión parcial de dióxido de carbono es un valor determinado usando las concentraciones del aminoácido básico, CO2, NH3, K, Mg, Cl, SO4, ácido acético y ácido succínico en el caldo de fermentación y la temperatura del tratamiento térmico como variables.
[3] El método mencionado anteriormente, en el que la presión es una presión igual a o mayor que la presión mostrada en la siguiente ecuación en cuanto a presión manométrica:
Presión (kPa) = 1,99 x 103 x tem peratura2-54
en el que “temperatura” en la ecuación representa la temperatura (°C) del tratamiento térmico.
[4] El método mencionado anteriormente, en el que la presión es una presión igual a o mayor que la presión de una fase gaseosa en un recipiente sellado observada cuando el caldo de fermentación se coloca en el recipiente sellado, de modo que la porosidad del aparato se vuelve del 6% v/v y se ajusta a la temperatura del tratamiento térmico en cuanto a presión manométrica.
[5] El método mencionado anteriormente, en el que la presión es de 400 kPa o mayor en cuanto a presión manométrica.
[6] El método mencionado anteriormente, en el que la presión es de 1000 kPa o mayor en cuanto a presión manométrica.
[7] El método mencionado anteriormente, en el que la temperatura del tratamiento térmico es de 80°C a 130°C.
[8] El método mencionado anteriormente, en el que la temperatura del tratamiento térmico es de 100°C a 130°C.
[9] El método mencionado anteriormente, en el que la etapa (B) se lleva a cabo en un recipiente de presión en condiciones en las que no hay presente sustancialmente fase gaseosa en el recipiente de presión.
[10] El método mencionado anteriormente, que comprende además una etapa de someter el caldo de fermentación tratado térmicamente a un tratamiento de descarboxilación.
[11] El método mencionado anteriormente, en el que la etapa (A) se lleva a cabo mientras se controla el pH del medio de cultivo a de 7,2 a 9,0 durante al menos un periodo parcial de cultivo.
[12] El método mencionado anteriormente, en el que la etapa (A) se lleva a cabo de modo que el pH del medio de cultivo al finalizar el cultivo es de 7,2 o mayor.
[13] El método mencionado anteriormente, en el que la etapa (A) se lleva a cabo de modo que los iones bicarbonato y/o iones carbonato están presentes en el medio de cultivo a una concentración de 20 mM o más durante al menos un periodo parcial de cultivo controlando que la presión interna de un tanque de fermentación sea positiva y/o suministrando gas de dióxido de carbono al medio de cultivo.
[14] El método mencionado anteriormente, en el que la etapa (A) se lleva a cabo de modo que la concentración de aniones distintos de iones bicarbonato y/o iones carbonato en el medio de cultivo es de 900 mM o menor.
[15] El método mencionado anteriormente, en el que la presión interna del tanque de fermentación es de 0,03 a 0,2 MPa en cuanto a presión manométrica.
[17] El método mencionado anteriormente, en el que el aminoácido básico es L-lisina.
[18] El método mencionado anteriormente, en el que el microorganismo es una bacteria corineforme o Escherichia coli.
[19] El método mencionado anteriormente, en el que el producto de fermentación se selecciona del caldo de fermentación, un sobrenadante del caldo de fermentación, un producto de descarboxilación del mismo, un producto concentrado del mismo, un producto secado del mismo y un producto procesado del mismo.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] Un diagrama que muestra un cambio de Ch+ cuando se lleva a cabo el cálculo repetido basándose en el método de Newton.
[Figura 2] Un diagrama que muestra valores medidos y valores simulados de pH.
[Figura 3] Un diagrama que muestra curvas de disociación de Lys a 38°C y 120°C.
[Figura 4] Un diagrama que muestra imágenes del balance de iones a 38°C y 120°C.
[Figura 5] Un diagrama que muestra el estado disociativo de Lys a 120°C.
[Figura 6] Un diagrama que muestra valores calculados y valores experimentales de presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir de un caldo de fermentación.
[Figura 7] Un diagrama que muestra una ecuación aproximada de presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir de un caldo de fermentación, ecuación obtenida para un caldo de fermentación de lisina modelo (concentración de lisina, 11 g/dl; pH 9,0).
Modos para llevar a cabo la invención
A continuación en el presente documento, la presente invención se explicará con detalle.
El método de la presente invención es un método para producir un aminoácido básico o un producto de fermentación que contiene el mismo, comprendiendo el método las siguientes etapas (A) y (B): (A) una etapa de cultivar un microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico en un medio de cultivo, de modo que los iones bicarbonato y/o iones carbonato sirven como contraiones para el aminoácido básico, para obtener un caldo de fermentación que contiene el aminoácido básico, en el que la etapa se lleva a cabo de modo que la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo se controla a 300 mM o menor durante al menos un periodo parcial de cultivo; (B) una etapa de someter el caldo de fermentación a un tratamiento térmico bajo una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, en el que la temperatura del tratamiento térmico es de 60°C o mayor. La etapa (A) también se denomina “etapa de fermentación”. La etapa (B) también se denomina “etapa de tratamiento térmico presurizado”. El caldo de fermentación que contiene un aminoácido básico obtenido en la etapa (A) también se denomina simplemente “caldo de fermentación”. El microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico también se denomina “microorganismo productor de aminoácido básico”. Los ejemplos del aminoácido básico incluyen L-lisina, L-arginina y L-histidina. Entre ellos, la L-lisina es un ejemplo preferido. En la presente invención, puede producirse una sola clase de aminoácido básico, o pueden producirse dos o más clases de aminoácidos básicos. Además, el producto de fermentación puede contener una sola clase de aminoácido básico, o dos o más clases de aminoácidos básicos. En la presente invención, cada aminoácido básico es L-isómero, a menos que se indique lo contrario.
<1> Microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico
<1-1> Microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico
El término “microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico (microorganismo productor de aminoácido básico)” se refiere a un microorganismo que tiene la capacidad de generar y acumular un aminoácido básico objetivo en un medio de cultivo en tal grado que el aminoácido básico pueda recogerse a partir del mismo, cuando se cultiva el microorganismo en el medio de cultivo. El microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico puede ser un microorganismo que es capaz de acumular un aminoácido básico objetivo en un medio de cultivo en una cantidad preferiblemente de 0,5 g/l o más, más preferiblemente 1,0 g/l o más. El microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico puede tener la capacidad de producir una sola clase de aminoácido básico, o dos o más clases de aminoácidos básicos.
El microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico no está particularmente limitado, siempre que sea capaz de producir un aminoácido básico mediante fermentación con carbonato. Los ejemplos de microorganismo incluyen bacterias y levaduras. Entre ellos, las bacterias son ejemplos preferidos. Los ejemplos de bacterias incluyen bacterias corineformes, bacterias pertenecientes al género Escherichia, bacterias pertenecientes al género Serratia y bacterias pertenecientes al género Bacillus.
Los ejemplos de las bacterias corineformes incluyen bacterias pertenecientes al género Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium o similares.
Los ejemplos específicos de las bacterias corineformes incluyen las siguientes especies.
Corynebacterium acetoacidophilum
Corynebacterium acetoglutamicum
Corynebacterium alkanolyticum
Corynebacterium callunae
Corynebacterium crenatum
Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium lilium
Corynebacterium melassecola
Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)
Corynebacterium herculis
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum )
Brevibacterium immariophilum
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium roseum
Brevibacterium saccharolyticum
Brevibacterium thiogenitalis
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)
Brevibacterium album
Brevibacterium cerinum
Microbacterium ammoniaphilum
Los ejemplos específicos de las bacterias corineformes incluyen las siguientes cepas.
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
Las bacterias Corynebacterium incluyen bacterias que se habían clasificado previamente en el género Brevibacterium, pero que actualmente se han unido al género Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)). Además, Corynebacterium stationis incluye bacterias que se habían clasificado previamente como Corynebacterium ammoniagenes, pero que actualmente se han reclasificado en Corynebacterium stationis basándose en el análisis de la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S, etc. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879 (2010)).
Las bacterias Escherichia no están particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen aquellas clasificadas en el género Escherichia según la taxonomía conocida por los expertos en el campo de la microbiología. Los ejemplos de las bacterias Escherichia incluyen, por ejemplo, aquellas descritas en el trabajo de Neidhardt et al. (Backmann B.J., 1996, Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, págs. 2460­ 2488, tabla 1, en F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/segunda edición, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Los ejemplos de las bacterias Escherichia incluyen, por ejemplo, Escherichia coli. Los ejemplos de Escherichia coli incluyen, por ejemplo, cepas K-12 de Escherichia coli tales como la cepa W3110 (ATCC 27325) y la cepa MG1655 (ATCC 47076); cepa K5 de Escherichia coli (ATCC 23506); cepas B de Escherichia coli tales como la cepa BL21 (DE3); y cepas derivadas de las mismas.
Estas cepas están disponibles de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo (dirección: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América). Es decir, a las cepas respectivas se les dan números de registro, y las cepas pueden ordenarse usando estos números de registro (remítase a http://www.atcc.org/). Los números de registro de las cepas se enumeran en el catálogo de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Estas cepas también pueden obtenerse a partir de, por ejemplo, los depositarios en los que se depositaron las cepas.
El microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico puede ser un microorganismo que tiene, de forma inherente, la capacidad de producir un aminoácido básico, o puede ser un microorganismo modificado de modo que tenga la capacidad de producir un aminoácido básico. El microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico puede obtenerse otorgando la capacidad de producir un aminoácido básico a un microorganismo de este tipo tal como se mencionó anteriormente, o potenciando la capacidad de producir un aminoácido básico de un microorganismo de este tipo tal como se mencionó anteriormente.
Para otorgar o potenciar la capacidad de producir un aminoácido básico, pueden usarse métodos empleados convencionalmente en el cultivo de cepas productoras de aminoácidos de bacterias corineformes, bacterias Escherichia, etc. (remítase a “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd ), 1a edición, publicado el 30 de mayo de 1986, págs. 77-100). Los ejemplos de tales métodos incluyen, por ejemplo, adquirir una cepa mutante auxótrofa, adquirir una cepa resistente a análogos de aminoácidos básicos, adquirir una cepa mutante de regulación metabólica y construir una cepa recombinante en la que se potencia la actividad de una enzima biosintética de aminoácido básico. En el cultivo de microorganismos productores de aminoácidos básicos, puede otorgarse una de las propiedades descritas anteriormente, tales como auxotrofia, resistencia a análogos y mutación de regulación metabólica sola, o pueden otorgarse dos o tres o más de tales propiedades en combinación. Además, en el cultivo de microorganismos productores de aminoácidos básicos, puede potenciarse la actividad de una de las enzimas biosintéticas de aminoácidos básicos sola, o pueden potenciarse las actividades de dos o tres o más de tales enzimas en combinación. Además, otorgar propiedad(es) tal(es) como auxotrofia, resistencia a análogos y mutación de regulación metabólica puede combinarse con potenciar la(s) actividad(es) de enzima(s) biosintética(s).
Una cepa mutante auxótrofa, cepa resistente a análogos o cepa mutante de regulación metabólica que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico puede obtenerse sometiendo una cepa original o cepa de tipo natural a un tratamiento de mutagénesis habitual, y luego seleccionando una cepa que muestra autotrofia, resistencia a análogos o una mutación de regulación metabólica, y que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico a partir de las cepas mutantes obtenidas. Los ejemplos del tratamiento de mutagénesis habitual incluyen irradiación de rayos X o ultravioleta y un tratamiento con un agente de mutación tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanosulfonato de etilo (EMS) y metanosulfonato de metilo (MMS).
La capacidad de producir un aminoácido básico puede otorgarse o potenciarse potenciando la actividad de una enzima biosintética de un aminoácido básico objetivo. La actividad de la enzima puede potenciarse, por ejemplo, potenciando la expresión de un gen que codifica para la enzima. Los métodos para potenciar la expresión génica se describen en los documentos W000/18935, EP1010755A, etc. Más adelante se describirán métodos detallados para potenciar la actividad de la enzima.
Además, la capacidad de producir un aminoácido básico también puede otorgarse o potenciarse reduciendo la actividad de una enzima que cataliza una reacción que se bifurca lejos de la ruta biosintética de un aminoácido básico objetivo para generar un compuesto distinto del aminoácido básico objetivo. La “enzima que cataliza una reacción que se bifurca lejos de la ruta biosintética de un aminoácido básico objetivo para generar un compuesto distinto del aminoácido básico objetivo” a la que se hace referencia en el presente documento incluye una enzima implicada en la descomposición del aminoácido objetivo. La actividad de la enzima puede reducirse, por ejemplo, alterando un gen que codifica para la enzima. Más adelante se describirán métodos detallados para reducir la actividad de una enzima.
A continuación en el presente documento, se ejemplificarán específicamente microorganismos productores de aminoácidos básicos y métodos para otorgar o potenciar la capacidad de producir un aminoácido básico. Todas las propiedades de los microorganismos productores de aminoácidos básicos y las modificaciones para otorgar o potenciar la capacidad de producir un aminoácido básico pueden usarse independientemente o en cualquier combinación apropiada.
<Microorganismos productores de L-lisina>
Los ejemplos de métodos para otorgar o potenciar la capacidad de producir L-lisina incluyen, por ejemplo, un método para modificar una bacteria de modo que la bacteria tenga una actividad o actividades potenciadas de una o más clases de enzimas seleccionadas de las enzimas biosintéticas de L-lisina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero sin limitarse particularmente a, dihidrodipicolinato sintasa (dapA), aspartocinasa III (lysC), dihidrodipicolinato reductasa (dapB), diaminopimelato descarboxilasa (lysA), diaminopimelato deshidrogenasa (ddh) (patente estadounidense n.° 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd), aspartato aminotransferasa (aspartato transaminasa) (aspC), diaminopimelato epimerasa (dapF), tetrahidrodipicolinato succinilasa (dapD), succinil diaminopimelato desacilasa (dapE) y aspartasa (aspA) (documento EP1253195A). En los paréntesis después de los nombres de las enzimas se muestran ejemplos de genes que codifican para las enzimas (lo mismo debe aplicarse a las mismas ocasiones a continuación en el presente documento). Es preferible potenciar la actividad o las actividades de una o más clases de enzimas seleccionadas de, por ejemplo, dihidrodipicolinato reductasa, diaminopimelato descarboxilasa, diaminopimelato deshidrogenasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, aspartato aminotransferasa, diaminopimelato epimerasa, aspartato semialdehído deshidrogenasa, tetrahidrodipicolinato succinilasa y succinil diaminopimelato desacilasa, entre estas enzimas. Además, las bacterias productoras de L-lisina y las cepas parentales para derivarlas pueden expresar un nivel aumentado del gen implicado en la eficiencia de energía (cyo) (documento EP1170376A), el gen que codifica para nicotinamida nucleótido transhidrogenasa (pntAB) (patente estadounidense n.° 5.830.716), el gen ybjE (documento W02005/073390) o combinaciones de los mismos. Puesto que la aspartocinasa III (lysC) se somete a retroinhibición por la L-lisina, puede usarse un gen lysC mutante que codifica para una aspartocinasa III desensibilizada para la retroinhibición por la L-lisina para potenciar la actividad de esta enzima. Los ejemplos de la aspartocinasa III desensibilizada para la retroinhibición por la L-lisina incluyen aspartocinasa III derivada de Escherichia coli y que tiene una o más mutaciones seleccionadas de una mutación para reemplazar el residuo de metionina en la posición 318 por un residuo de isoleucina; una mutación para reemplazar el residuo de glicina en la posición 323 por un residuo de ácido aspártico; y una mutación para reemplazar el residuo de treonina en la posición 352 por un residuo de isoleucina (patentes estadounidenses n.os 5.661.012 y 6.040.160). Además, puesto que la dihidrodipicolinato sintasa (dapA) se somete a retroinhibición por la L-lisina, puede usarse un gen dapA mutante que codifica para una dihidrodipicolinato sintasa desensibilizada para la retroinhibición por la L-lisina para potenciar la actividad de esta enzima. Los ejemplos de la dihidrodipicolinato sintasa desensibilizada para la retroinhibición por la L lisina incluyen dihidrodipicolinato sintasa derivada de Escherichia coli y que tiene una mutación para reemplazar el residuo de histidina en la posición 118 por un residuo de tirosina (patente estadounidense n.° 6.040.160).
Los ejemplos de métodos para otorgar o potenciar la capacidad de producir L-lisina también incluyen, por ejemplo, un método para modificar una bacteria de modo que la bacteria tenga una actividad o actividades reducidas de una o más clases de enzimas seleccionadas de las enzimas que catalizan una reacción que se bifurca lejos de la ruta biosintética de L-lisina para generar un compuesto distinto de L-lisina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero sin limitarse particularmente a, homoserina deshidrogenasa, lisina descarboxilasa (patente estadounidense n.° 5.827.698) y enzima málica (documento W02005/010175).
Además, los ejemplos de métodos para otorgar o potenciar la capacidad de producir L-lisina a o en bacterias corineformes también incluyen un método para modificar las bacterias de modo que aumente la actividad de un sistema de excreción de lisina (lysE) (documento W097/23597). El gen lysE de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 corresponde a la secuencia complementaria a la secuencia de los números de nucleótidos 1.329.712 a 1.330.413 en la secuencia del genoma registrada con el n.° de registro de Genbank NC_006958 (VERSIÓN NC_006958.1 GI:62388892) en la base de datos del NCBI. La proteína LysE de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 está registrada con el n.° de registro de Genbank YP_225551 (YP_225551.1 GI:62390149).
Los ejemplos de bacterias productoras de L-lisina y cepas parentales para derivarlas también incluyen cepas mutantes que tienen resistencia a un análogo de L-lisina. Los análogos de L-lisina inhiben el crecimiento de bacterias tales como bacterias de la familia Enterobacteriaceae y bacterias corineformes, pero esta inhibición se libera completa o parcialmente cuando la L-lisina está presente en el medio de cultivo. Los ejemplos de estos análogos de L-lisina incluyen, pero sin limitarse particularmente a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), y-metillisina y a-clorocaprolactama. Las cepas mutantes que tienen resistencia a estos análogos de lisina pueden obtenerse sometiendo una bacteria a un tratamiento de mutagénesis artificial convencional.
Los ejemplos específicos de bacterias productoras de L-lisina y cepas parentales para derivarlas incluyen E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, patente estadounidense n.° 4.346.170) y E. coli VL611. En estas cepas, la aspartocinasa está desensibilizada para la retroinhibición por la L-lisina.
Los ejemplos específicos de bacterias productoras de L-lisina y cepas parentales para derivarlas también incluyen la cepa WC196 de E. coli. La cepa WC196 se cultivó otorgando resistencia a AEC a la cepa W3110, que se derivó de E. coli K-12 (patente estadounidense n.° 5.827.698). La cepa WC196 se denominó E. coli AJ13069 y se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial (actualmente, agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación, Depositario Internacional de Organismos de Patentes, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japón) el 6 de diciembre de 1994 y se le asignó el número de registro de FERM P-14690. Después, se convirtió el depósito en un depósito internacional bajo la disposición del Tratado de Budapest el 29 de septiembre de 1995, y se le asignó el número de registro de FERM BP-5252 (patente estadounidense n.° 5.827.698).
Los ejemplos preferidos de bacterias productoras de L-lisina incluyen E. coli WC196AcadAAldc y E. coli WC196AcadAAldc/pCABD2 (documento W02010/061890). E. coli WC196AcadAAldc es una cepa construida a partir de la cepa WC196 alterando los genes cadA y IdcC que codifican para lisina descarboxilasa. La cepa WC196AcadAAldc/pCABD2 se construyó introduciendo el plásmido pCABD2 que contiene genes de enzimas biosintéticas de lisina (patente estadounidense n.° 6.040.160) en la cepa WC196AcadAAldc. La cepa WC196AcadAAldc, denominada AJ110692, se depositó en la agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depositario Internacional de Organismos de Patentes (actualmente, agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación, Depositario Internacional de Organismos de Patentes, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japón) el 7 de octubre de 2008 como un depósito internacional, y se le asignó el número de registro de FERM BP-11027. El plásmido pCABD2 contiene un gen dapA mutante derivado de Escherichia coli y que codifica para una dihidrodipicolinato sintasa (DDPS) que tiene una mutación para la desensibilización para la retroinhibición por la L-lisina (H118Y), un gen lysC mutante derivado de Escherichia coli y que codifica para aspartocinasa III que tiene una mutación para la desensibilización para la retroinhibición por la L-lisina (T352I), el gen dapB derivado de Escherichia coli y que codifica para dihidrodipicolinato reductasa y el gen ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum y que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa.
Los ejemplos preferidos de bacterias productoras de L-lisina también incluyen E. coli AJIK01 (NITE BP-01520). La cepa AJIK01 se denominó E. coli AJ111046 y se depositó en la agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación, Depositario Internacional de Organismos de Patentes (#122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japón) el 29 de enero de 2013. Después, se convirtió en un depósito internacional bajo la disposición del Tratado de Budapest el 15 de mayo de 2014, y se le asignó el número de registro de NITE BP-01520.
Los ejemplos de bacterias corineformes que tienen capacidad de producir L-lisina incluyen, por ejemplo, las cepas mutantes resistentes a AEC (cepa de Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum AJ11082) (NRRL B-11470) etc., publicaciones de patente japonesa (Kokoku) n.os 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 y 7-112438); cepas mutantes que requieren un aminoácido tal como L-homoserina para su crecimiento (publicaciones de patente japonesa n.os 48-28078 y 56­ 6499); cepas mutantes que muestran resistencia a AEC y que requieren además un aminoácido tal como L-leucina, L-homoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina y L-valina (patentes estadounidenses n.os 3.708.395 y 3.825.472); cepas mutantes que muestran resistencia a DL-a-amino-g-caprolactama, a-amino-lauril-lactama, análogo de ácido aspártico, sulfamidas, quinoide y N-lauroil-leucina; cepas mutantes que muestran resistencia a un inhibidor de oxaloacetato descarboxilasa o un inhibidor de enzimas de la cadena respiratoria (patentes japonesas abiertas a consulta por el público (Kokai) n.os 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995, 56-39778, publicaciones de patente japonesa n.os 53-43591 y 53-1833); cepas mutantes que requieren inositol o ácido acético (patentes japonesas abiertas a consulta por el público (Kokai) n.os 55-9784 y 56-8692); cepas mutantes que son susceptibles a ácido fluoropirúvico o a una temperatura de 34°C o mayor (patentes japonesas abiertas a consulta por el público (Kokai) n.os 55-9783 y 53-86090); y cepas mutantes que muestran resistencia a etilenglicol (patente estadounidense n.° 4.411.997).
<Microorganismos productores de L-arginina>
Los ejemplos de métodos para otorgar o potenciar la capacidad de producir L-arginina incluyen, por ejemplo, un método para modificar una bacteria de modo que la bacteria tenga una actividad o actividades aumentadas de una o más clases de enzimas seleccionadas de las enzimas biosintéticas de L-arginina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero sin limitarse particularmente a, N-acetilglutamato sintasa (argA), N-acetilglutamilfosfato reductasa (argC), ornitina acetiltransferasa (argJ), N-acetilglutamato cinasa (argB), acetilornitina transaminasa (argD), acetilornitina desacetilasa (argE), ornitina carbamoil transferasa (argF), argininosuccinato sintetasa (argG), argininosuccinato liasa (argH) y carbamoil fosfato sintetasa (carAB). Como gen de N-acetilglutamato sintasa (argA), por ejemplo, puede usarse preferiblemente un gen que codifica para una N-acetilglutamato sintasa mutante desensibilizada para la retroinhibición por la L-arginina mediante sustitución de los residuos de aminoácido correspondientes a las posiciones 15 a 19 de la enzima de tipo natural (documento EP1170361A).
Los ejemplos específicos de bacterias productoras de L-arginina y cepas parentales para derivarlas incluyen, por ejemplo, la cepa 237 de E. coli 237 (Vk Pm B-7925, documento US2002/058315A1), cepas de derivados de la misma a las que se les ha introducido el gen argA que codifica para una N-acetilglutamato sintasa mutante (solicitud de patente rusa n.° 2001112869, documento EP1170361A1), la cepa 382 de E. coli derivada de la cepa 237 y que tiene capacidad de asimilación de ácido acético mejorada (VKPM B-7926, EP1170358A1) y la cepa 382ilvA+ de E. coli, que es una cepa obtenida de la cepa 382 introduciendo en la misma el gen ilvA de tipo natural de la cepa K-12 de E. coli. La cepa 237 de E. coli se depositó en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, FGUP GosNIl Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscú 117545, Rusia) el 10 de abril de 2000 con el número de registro de VKPM B-7925, y el depósito se convirtió en un depósito internacional bajo la disposición del Tratado de Budapest el 18 de mayo de 2001. La cepa 382 de E. coli se depositó en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscú 117545, Rusia) el 10 de abril de 2000 con el número de registro de VKPM B-7926.
Los ejemplos de bacterias productoras de L-arginina y cepas parentales para derivarlas también incluyen cepas que tienen resistencia a análogos de aminoácido, etc. Los ejemplos de tales cepas incluyen cepas mutantes de E. coli que tienen resistencia a a-metilmetionina, p-fluorofenilalanina, D-arginina, hidroxamato de arginina, S-(2-aminoetil)-cisteína, a-metilserina, p-2-tienilalanina o sulfaguanidina (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 56-106598).
Los ejemplos de bacterias productoras de L-arginina y cepas parentales para derivarlas también incluyen tales bacterias corineformes como una cepa deficiente en ArgR, que es un represor de arginina (documento US2002-0045223A) y una cepa en la que se aumenta la actividad glutamina sintetasa (documento US2005-0014236A).
Los ejemplos de bacterias productoras de L-arginina y cepas parentales para derivarlas también incluyen cepas mutantes de bacterias corineformes, cepas mutantes que tienen resistencia a un análogo de aminoácido o similares. Los ejemplos de tales cepas incluyen, por ejemplo, cepas que tienen resistencia a 2-tiazol-alanina y que muestran además auxotrofia para L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina o L-triptófano (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 54-44096); cepas resistentes a ácido cetomalónico, ácido fluoromalónico o ácido monofluoroacético (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 57-18989); cepas resistentes a argininol (publicación de patente japonesa n.° 62-24075); cepas resistentes a X-guanidina (X representa una cadena alifática o un derivado de la misma, patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.1 2-186995); y cepas resistentes a hidroxamato de arginina y 6-azauracilo (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 57­ 150381).
Los ejemplos específicos de bacterias corineformes que tienen la capacidad de producir L-arginina incluyen las siguientes cepas.
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11169 (FERM BP-6892)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum ) AJ12092 (FERM BP-6906)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11336 (FERM BP-6893)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11345 (FERM BP-6894)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12430 (FERM BP-2228)
<Microorganismos productores de L-histidina>
Los ejemplos de métodos para otorgar o potenciar la capacidad de producir L-histidina incluyen, por ejemplo, un método para modificar una bacteria de modo que la bacteria tenga una actividad o actividades aumentadas de una o más clases de enzimas seleccionadas de las enzimas biosintéticas de L-histidina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero sin limitarse particularmente a, ATP fosforribosiltransferasa (hisG), fosforribosil AMP ciclohidrolasa (hisl), fosforribosil-ATP pirofosfohidrolasa (hisl), fosforribosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribótido isomerasa (hisA), amidotransferasa (hisH), histidinol fosfato aminotransferasa (hisC), histidinol fosfatasa (hisB) e histidinol deshidrogenasa (hisD).
Entre estas enzimas, se sabe que la L-histidina inhibe las enzimas biosintéticas de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI. Por tanto, puede otorgarse o potenciarse la capacidad de producir L-histidina, por ejemplo, mediante la introducción de una mutación para conferir resistencia a la retroinhibición al gen que codifica para ATP fosforribosiltransferasa (hisG) (patentes rusas n.os 2.003.677 y 2.119.536).
Los ejemplos específicos de bacterias productoras de L-histidina y cepas parentales para derivarlas incluyen, por ejemplo, cepas pertenecientes al género Escherichia, tales como la cepa 24 de E. coli (VKPM B-5945, documento RU2003677), E. coli NRRL B-12116 a B-12121 (patente estadounidense n.° 4.388.405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675) y H-9343 (FERM BP-6676, patente estadounidense n.° 6.344.347), E. coli H-9341 (FERM BP-6674, documento EP1085087), E. coli AI80/pFM201 (patente estadounidense n.° 6.258.554), E. coli FERM P-5038 y FERM P-5048, a las que se les ha introducido un vector que porta ADN que codifica para una enzima biosintética de L-histidina (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 56-005099), cepas de E. coli a las que se les ha introducido un gen para el transporte de aminoácidos (documento EP1016710A) y la cepa 80 de E. coli, a la que se le ha otorgado resistencia a sulfaguanidina, DL-1,2,4-triazol-3-alanina y estreptomicina (VKPM B-7270, patente rusa n.° 2119536).
Además, los ejemplos de métodos para otorgar o potenciar la capacidad de producir un aminoácido básico también incluyen, por ejemplo, un método para modificar una bacteria de modo que la bacteria tenga una actividad o actividades aumentadas de una o más proteínas seleccionadas proteínas implicadas en el glicometabolismo y proteínas implicadas en el metabolismo energético.
Los ejemplos de las proteínas implicadas en el glicometabolismo incluyen proteínas implicadas en la captación de sacáridos y enzimas del sistema de glicólisis. Los ejemplos de genes que codifican para un proteína implicada en el glicometabolismo incluyen el gen de glucosa-6-fosfato isomerasa (pgi, documento WO01/02542), el gen de piruvato carboxilasa (pyc, documento W099/18228, documento EP1092776A), el gen de fosfoglucomutasa (pgm, documento W003/04598), el gen de fructosa bisfosfato aldolasa (pfkB,fbp, documento W003/04664), el gen de transaldolasa (talB, documento W003/008611), el gen de fumarasa (fum, documento WO01/02545), el gen de captación de sacarosa distinta de PTS (csc, documento EP1149911A) y el gen de asimilación de sacarosa (operón scrAB, patente estadounidense n.° 7.179.623).
Los ejemplos de genes que codifican para las proteínas implicadas en el metabolismo energético incluyen el gen de transhidrogenasa (pntAB, patente estadounidense n.° 5.830.716) y el gen de citocromo oxidasa de tipo bo (cyoB, documento EP1070376A).
Los genes y las proteínas usados para cultivar microorganismos productores de aminoácidos básicos pueden tener, por ejemplo, secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos conocidas de los genes y las proteínas ejemplificados anteriormente (también denominadas simplemente a continuación en el presente documento “secuencias de nucleótidos y de aminoácidos conocidas”), respectivamente. La expresión “un gen o una proteína tiene una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos” abarca casos en los que el gen o la proteína comprende la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, y casos en los que el gen o la proteína consiste en la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Además, los genes y las proteínas usados para cultivar microorganismos productores de aminoácidos básicos pueden ser variantes conservadoras de genes y proteínas que tienen secuencias de nucleótidos y de aminoácidos conocidas, respectivamente. El término “variante conservadora” se refiere a una variante que mantiene la función original del mismo. Los ejemplos de las variantes conservadoras incluyen, por ejemplo, homólogos y versiones modificadas artificialmente de genes y proteínas que tienen secuencias de nucleótidos y de aminoácidos conocidas.
La expresión “se mantiene la función original” significa que una variante de un gen o una proteína tiene una función (tal como actividad o propiedad) correspondiente a la función (tal como actividad o propiedad) del gen o la proteína original. La expresión “se mantiene la función original” usada para un gen significa que una variante del gen codifica para una proteína que mantiene la función original. Por ejemplo, la expresión “se mantiene la función original” usada para el gen de dihidrodipicolinato reductasa significa que una variante del gen codifica para una proteína que tiene actividad dihidrodipicolinato reductasa. Además, la expresión “se mantiene la función original” usada para la dihidrodipicolinato reductasa significa que una variante de la proteína tiene actividad dihidrodipicolinato reductasa.
A continuación en el presente documento, se explicarán ejemplos de las variantes conservadoras.
Los homólogos de los genes y las proteínas usados para cultivar microorganismos productores de aminoácidos básicos pueden obtenerse fácilmente a partir de bases de datos públicas, por ejemplo, mediante búsqueda en BLAST o búsqueda en FASTA usando cualquiera de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos conocidas como secuencia problema. Además, los homólogos de los genes usados para cultivar microorganismos productores de aminoácidos básicos pueden obtenerse, por ejemplo, mediante PCR usando un cromosoma de organismos tales como bacterias corineformes como molde y oligonucleótidos preparados basándose en cualquiera de las secuencias de nucleótidos conocidas como cebadores.
Los genes usados para cultivar microorganismos productores de aminoácidos básicos pueden ser cada uno un gen que codifica para una proteína que tiene cualquiera de las secuencias de aminoácidos conocidas, pero que incluye una sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios residuos de aminoácido en una o varias posiciones, siempre que se mantenga la función original. Por ejemplo, puede alargarse o acortarse el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal de la proteína codificada. Aunque el número al que se refiere el término “uno o varios” mencionado anteriormente puede diferir dependiendo de las posiciones de los residuos de aminoácido en la estructura tridimensional de la proteína o de los residuos de aminoácido, específicamente, es, por ejemplo, de 1 a 50, de 1 a 40 o de 1 a 30, preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 10, todavía más preferiblemente de 1 a 5, en particular, preferiblemente de 1 a 3.
La sustitución, deleción, inserción o adición mencionada anteriormente de uno o varios residuos de aminoácido es una mutación conservadora que mantiene la función normal de la proteína. Los ejemplos típicos de la mutación conservadora son sustituciones conservadoras. La sustitución conservadora es una mutación en la que la sustitución tiene lugar mutuamente entre Phe, Trp y Tyr, si el sitio de sustitución es un aminoácido aromático; entre Leu, Ile y Val, si es un aminoácido hidrófobo; entre Gln y Asn, si es un aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, si es un aminoácido básico; entre Asp y Glu, si es un aminoácido ácido; y entre Ser y Thr, si es un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo. Los ejemplos de sustituciones consideradas como sustituciones conservadoras incluyen, específicamente, la sustitución de Ser o Thr por Ala, la sustitución de Gln, His o Lys por Arg, la sustitución de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn, la sustitución de Asn, Glu o Gln por Asp, la sustitución de Ser o Ala por Cys, la sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln, la sustitución de Gly, Asn, Gln, Lys o Asp por Glu, la sustitución de Pro por Gly, la sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His, la sustitución de Leu, Met, Val o Phe por Ile, la sustitución de Ile, Met, Val o Phe por Leu, la sustitución de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys, la sustitución de Ile, Leu, Val o Phe por Met, la sustitución de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe, la sustitución de Thr o Ala por Ser, la sustitución de Ser o Ala por Thr, la sustitución de Phe o Tyr por Trp, la sustitución de His, Phe o Trp por Tyr y la sustitución de Met, Ile o Leu por Val. Además, tal sustitución, deleción, inserción, adición, inversión o similar de residuos de aminoácido tal como se mencionó anteriormente incluye una mutación que se produce de manera natural debido a una diferencia individual, o una diferencia de especies del organismo a partir del cual se deriva el gen (mutante o variante).
Los genes usados para cultivar microorganismos productores de aminoácidos básicos pueden ser cada uno un gen que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una homología de, por ejemplo, el 50% o más, el 65% o más o el 80% o más, preferiblemente el 90% o más, más preferiblemente el 95% o más, todavía más preferiblemente el 97% o más, en particular, preferiblemente el 99% o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos total de cualquiera de las secuencias de aminoácidos conocidas, siempre que se mantenga la función original. En esta descripción, “homología” significa “ identidad”.
Los genes usados para cultivar microorganismos productores de aminoácidos básicos también pueden ser cada uno ADN que es capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con una sonda que puede prepararse a partir de cualquiera de las secuencias de nucleótidos conocidas, tales como una secuencia complementaria a una secuencia parcial o completa de cualquiera de secuencias de nucleótidos conocidas, siempre que se mantenga la función original. El término “condiciones rigurosas” se refiere a condiciones en las que se forma el denominado híbrido específico y no se forma un híbrido inespecífico. Los ejemplos de las condiciones rigurosas incluyen aquellas en las que se hibridan entre sí ADN altamente homólogos, por ejemplo, ADN homólogos en no menos del 50%, el 65% o el 80%, preferiblemente homólogos en no menos del 90%, más preferiblemente homólogos en no menos del 95%, todavía más preferiblemente homólogos en no menos del 97%, en particular, preferiblemente homólogos en no menos del 99% que se hibridan entre sí, y ADN menos homólogos que los anteriores que no se hibridan entre sí, o condiciones de lavado de hibridación de tipo Southern típica, es decir, condiciones de lavado una vez, preferiblemente 2 ó 3 veces, a una concentración de sal y una temperatura correspondientes a 1 x SSC, SDS al 0,1% a 60°C, preferiblemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 60°C, más preferiblemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 68°C.
La sonda usada para la hibridación mencionada anteriormente puede ser una parte de una secuencia que es complementaria al gen tal como se describió anteriormente. Una sonda de este tipo puede prepararse mediante PCR usando oligonucleótidos preparados basándose en cualquiera de las secuencias de nucleótidos conocidas como cebadores y un fragmento de ADN que contiene cualquiera de los genes mencionados anteriormente como molde. Como sonda, por ejemplo, puede usarse un fragmento de ADN que tiene una longitud de aproximadamente 300 pb. Cuando se usa un fragmento de ADN que tiene una longitud de aproximadamente 300 pb como sonda, las condiciones de lavado de la hibridación pueden ser, por ejemplo, 50°C, 2 x SSC y SDS al 0,1%.
Además, puesto que la degeneración de codones difiere dependiendo del huésped, puede reemplazarse cualquier codón en los genes usados para cultivar microorganismos productores de aminoácidos básicos por codones equivalentes respectivos.
El porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias puede determinarse, por ejemplo, usando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitativos de un algoritmo matemático de este tipo incluyen el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17, el algoritmo de homología local de Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, el método para buscar la homología de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448 y una versión modificada del algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264 tal como la descrita en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.
Al usar un programa basándose en un algoritmo matemático de este tipo, puede realizarse la comparación de secuencias (es decir, la alineación) para determinar la identidad de secuencia. El programa puede ejecutarse de manera apropiada por ordenador. Los ejemplos de un programa de este tipo incluyen, pero sin limitarse a, CLUSTAL del programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, Calif.), el programa ALIGN (versión 2.0) y el paquete de software GAP, Be STFIT, BLAST, FASTA y TFASTA de Wisconsin Genetics, versión 8 (disponibles de Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., EE.UU.). La alineación usando estos programas puede realizarse usando, por ejemplo, parámetros iniciales. El programa CLUSTAL se describe bien en Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988), Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res.
16:10881-90, Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65 y Pearson et al. (1994) Met. Mol. Biol. 24:307-331.
Con el fin de obtener una secuencia de nucleótidos homóloga a una secuencia de nucleótidos diana, en particular, por ejemplo, puede realizarse la búsqueda de nucleótidos mediante BLAST usando el programa BLASTN con puntuación de 100 y longitud de palabra de 12. Con el fin de obtener una secuencia de aminoácidos homóloga a una proteína diana, en particular, por ejemplo, puede realizarse la búsqueda de proteínas mediante BLAST usando el programa BLASTX con puntuación de 50 y longitud de palabra de 3. Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov para la búsqueda de nucleótidos mediante BLAST y la búsqueda de proteínas mediante BLAST. Además, puede usarse BLAST con huecos (BLAST 2.0) con el fin de obtener una alineación que incluye huecos a modo de comparación. Además, puede usarse PSI-BLAST (BLAST 2.0) con el fin de realizar una búsqueda repetitiva para detectar relaciones distantes entre secuencias. Véase Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 para BLAST con huecos y PSI-BLAST. Cuando se usa BLAST, BLAST con huecos o PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros iniciales de cada programa (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTX para secuencias de aminoácidos). La alineación también puede realizarse a mano.
La identidad de secuencia entre dos secuencias se calcula como la razón de residuos que coinciden en las dos secuencias cuando se alinean las dos secuencias para ajustarse al máximo entre ellas.
<1-2> Métodos para aumentar la actividad de una proteína
A continuación en el presente documento, se explicarán métodos para aumentar la actividad de una proteína.
La expresión “se aumenta la actividad de una proteína” significa que se aumenta la actividad de la proteína por célula en comparación con la de un cepa sin modificar, tal como una cepa de tipo natural o cepa original. El término “cepa sin modificar” usado en el presente documento se refiere a una cepa de control que no se ha modificado, de modo que se aumenta la actividad de una proteína objetivo. Los ejemplos de la cepa sin modificar incluyen una cepa de tipo natural y una cepa original. La expresión “se aumenta la actividad de una proteína” también puede expresarse como “se potencia la actividad de una proteína”. Específicamente, la expresión “se aumenta la actividad de una proteína” significa que se aumenta el número de moléculas de la proteína por célula y/o se aumenta la función de cada molécula de la proteína en comparación con aquellos de una cepa sin modificar. Es decir, el término “actividad” en la expresión “se aumenta la actividad de una proteína” no se limita a la actividad catalítica de la proteína, sino que también quiere decir la cantidad de transcripción de un gen (es decir, la cantidad de ARNm) que codifica para la proteína o la cantidad de traducción del gen (es decir, la cantidad de la proteína). Además, la expresión “se aumenta la actividad de una proteína” incluye no sólo un estado en el que se aumenta la actividad de una proteína objetivo en una cepa que tiene, de forma inherente, la actividad de la proteína objetivo, sino también un estado en el que se otorga la actividad de una proteína objetivo a una cepa que no tiene, de forma inherente, la actividad de la proteína objetivo. Además, siempre que se aumente eventualmente la actividad de la proteína, puede atenuarse y/o eliminarse la actividad de una proteína objetivo contenida, de forma inherente, en un huésped y, a continuación, puede otorgarse al huésped un tipo apropiado de la proteína objetivo.
El grado de aumento de la actividad de una proteína no está particularmente limitado, siempre que se aumente la actividad de la proteína en comparación con una cepa sin modificar. La actividad de la proteína puede aumentarse hasta, por ejemplo, 1,5 veces o más, 2 veces o más o 3 veces o más que la de una cepa sin modificar. Además, cuando la cepa sin modificar no tiene la actividad de la proteína objetivo, es suficiente que la proteína se produzca como resultado de la introducción del gen que codifica para la proteína y, por ejemplo, la proteína puede producirse hasta tal punto que pueda medirse la actividad de la misma.
La modificación para aumentar la actividad de una proteína se logra, por ejemplo, aumentando la expresión de un gen que codifica para la proteína. La expresión “se aumenta la expresión de un gen” significa que se aumenta la cantidad de expresión del gen por célula en comparación con la de una cepa sin modificar, tal como una cepa de tipo natural y una cepa original. Específicamente, la expresión “se aumenta la expresión de un gen” puede significar que se aumenta la cantidad de transcripción del gen (es decir, la cantidad de ARNm) y/o que se aumenta la cantidad de traducción del gen (es decir, la cantidad de la proteína expresada a partir del gen). La expresión “se aumenta la expresión de un gen” también puede denominarse “se potencia la expresión de un gen”. La expresión de un gen puede aumentarse hasta, por ejemplo, 1,5 veces o más, 2 veces o más o 3 veces o más que la de una cepa sin modificar. Además, la expresión “se aumenta la expresión de un gen” incluye no sólo un estado en el que se aumenta la cantidad de expresión de un gen objetivo en una cepa que expresa, de forma inherente, el gen objetivo, sino también un estado en el que se introduce el gen en una cepa que no expresa, de forma inherente, el gen objetivo y se expresa en la misma. Es decir, la expresión “se aumenta la expresión de un gen” también puede significar, por ejemplo, que se introduce un gen objetivo en una cepa que no posee el gen y se expresa en la misma.
La expresión de un gen puede aumentarse, por ejemplo, aumentando el número de copias del gen.
El número de copias de un gen puede aumentarse mediante la introducción del gen en el cromosoma de un huésped. Un gen puede introducirse en un cromosoma, por ejemplo, usando recombinación homóloga (Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). Los ejemplos del método de transferencia de genes que utiliza la recombinación homóloga incluyen, por ejemplo, un método de uso de un ADN lineal tal como integración dirigida por Red (Datsenko, K.A. y Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)), un método de uso de un plásmido que contiene un origen de replicación sensible a la temperatura, un método de uso de un plásmido capaz de realizar transferencia conjugativa, un método de uso de un vector suicida que no tiene ningún origen de replicación que funcione en un huésped y un método de transducción usando un fago. Pueden introducirse una sola copia o dos o más copias de un gen. Por ejemplo, al realizar recombinación homóloga usando una secuencia que está presente en múltiples copias en un cromosoma como diana, pueden introducirse múltiples copias de un gen en el cromosoma. Los ejemplos de una secuencia de este tipo que está presente en múltiples copias en un cromosoma incluyen ADN repetitivos y repeticiones invertidas ubicadas en ambos extremos de una transposón. Alternativamente, la recombinación homóloga puede realizarse usando una secuencia apropiada en un cromosoma, tal como un gen innecesario, para la producción de una sustancia objetivo como diana. Además, un gen también puede introducirse al azar en un cromosoma usando un transposón o Mini-Mu (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 2-109985, patente estadounidense n.° 5.882.888, documento EP805867B1).
La introducción de un gen diana en un cromosoma puede confirmarse mediante hibridación de tipo Southern usando una sonda que tiene una secuencia complementaria al gen completo o a parte del mismo, PCR usando cebadores preparados basándose en la secuencia del gen o similares.
Además, el número de copias de un gen también puede aumentarse mediante la introducción de un vector que contiene el gen en un huésped. Por ejemplo, el número de copias de un gen diana puede aumentarse ligando un fragmento de ADN que contiene el gen diana con un vector que funciona en un huésped para construir un vector de expresión del gen y transformando el huésped con el vector de expresión. El fragmento de ADN que contiene el gen diana puede obtenerse, por ejemplo, mediante PCR usando el ADN genómico de un microorganismo que tiene el gen diana como molde. Como vector, puede usarse un vector que puede replicarse de forma autónoma en la célula del huésped. El vector es preferiblemente un vector de múltiples copias. Además, el vector tiene preferiblemente un marcador, tal como un gen resistente a los antibióticos, para la selección del transformante. Además, el vector puede tener un promotor y/oterminador para expresar el gen introducido. El vector puede ser, por ejemplo, un vector derivado de un plásmido bacteriano, un vector derivado de un plásmido de levadura, un vector derivado de un bacteriófago, cósmido, fagémido o similares. Los ejemplos específicos del vector que puede replicarse de forma autónoma en bacterias Enterobacteriaceae tales como Escherichia coli incluyen, por ejemplo, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322, pSTV29 (todos ellos están disponibles de Takara Bio), pACYC184, pMW219 (NIPPON GENE), pTrc99A (Pharmacia), vectores de la serie pPROK (Clontech), pKK233-2 (Clontech), vectores de la serie pET (Novagen), vectores de la serie pQE (QIAGEN), pCold TF DNA (Takara Bio), vectores de la serie pACYC y el vector de amplio espectro de huésped RSF1010. Los ejemplos específicos del vector que puede replicarse de forma autónoma en bacterias corineformes incluyen, por ejemplo, pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); plásmidos obtenidos mejorando los mismos y que tienen un gen farmacorresistente; plásmido pCRY30 (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 3-210184); plásmidos pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE y pCRY3KX (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 2-72876 y patente estadounidense n.° 5.185.262); plásmidos pCRY2 y pCRY3 (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 1-191686); pAJ655, pAj611 y pAJ1844 (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 58-192900); pCG1 (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 57-134500); pCG2 (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 58-35197); pCG4 y pCG11 (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 57-183799); pVK7 (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 10-215883); y pVC7 (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 9-070291).
Cuando se introduce un gen, es suficiente que la bacteria de la presente invención albergue de manera expresable al gen. Específicamente, es suficiente que el gen se introduzca de modo que se exprese bajo control por una secuencia promotora que funciona en la bacteria de la presente invención. El promotor puede ser un promotor derivado del huésped o un promotor heterogéneo. El promotor puede ser el promotor nativo del gen que va a introducirse o un promotor de otro gen. Como promotor, por ejemplo, también puede usarse un promotor tan fuerte como el que se menciona más adelante.
Un terminador para la terminación de la transcripción génica puede ubicarse aguas abajo del gen. El terminador no está particularmente limitado siempre que funcione en la bacteria de la presente invención. El terminador puede ser un terminador derivado del huésped o un terminador heterogéneo. El terminador puede ser el terminador nativo del gen que va a introducirse o un terminador de otro gen. Los ejemplos específicos del terminador incluyen, por ejemplo, el terminador T7, el terminador T4, el terminador de fagos fd, el terminador tet y el terminador trpA.
Los vectores, promotores y terminadores disponibles en diversos microorganismos se divulgan con detalle en “Fundamental Microbiology vol. 8, Genetic Engineering, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD, 1987” y pueden usarse los mismos.
Además, cuando se introducen dos o más genes, es suficiente que la bacteria de la presente invención albergue de manera expresable a cada uno de los genes. Por ejemplo, un solo vector de expresión o un cromosoma puede portar todos los genes. Además, dos o más vectores de expresión pueden portar por separado los genes, o uno solo o dos o más vectores de expresión y un cromosoma pueden portar por separado los genes. También puede introducirse un operón constituido por dos o más genes. El caso de “ introducir dos o más genes” incluye, por ejemplo, casos de introducción de genes respectivos que codifican para dos o más clases de enzimas, introducción de genes respectivos que codifican para dos o más subunidades que constituyen una única enzima y una combinación de los casos anteriores.
El gen que va a introducirse no está particularmente limitado, siempre que codifique para una proteína que funcione en el huésped. El gen que va a introducirse puede ser un gen derivado del huésped o puede ser un gen heterogéneo.
El gen que va a introducirse puede obtenerse, por ejemplo, mediante PCR usando cebadores diseñados basándose en la secuencia de nucleótidos del gen y usando el ADN genómico de un organismo que tiene el gen, un plásmido que porta el gen o similar como molde. El gen que va a introducirse también puede sintetizarse por completo, por ejemplo, basándose en la secuencia de nucleótidos del gen (Gene, 60(1), 115-127 (1987)). El gen obtenido puede usarse como tal o después de haberse modificado según se requiera.
Incidentalmente, cuando una proteína funciona como un complejo que consiste en una pluralidad de subunidades, puede modificarse una parte o toda de la pluralidad de subunidades, siempre que se aumente eventualmente la actividad de la proteína. Es decir, por ejemplo, cuando se aumenta la actividad de una proteína aumentando la expresión de un gen, puede potenciarse la expresión de una parte o toda de la pluralidad de genes que codifican para las subunidades. Habitualmente, es preferible potenciar la expresión de toda de la pluralidad de genes que codifican para las subunidades. Además, las subunidades que constituyen el complejo pueden derivarse de una única clase de organismo o de dos o más clases de organismos, siempre que el complejo tenga una función de la proteína objetivo. Es decir, por ejemplo, pueden introducirse genes del mismo organismo que codifican para una pluralidad de subunidades en un huésped, o pueden introducirse genes de organismos diferentes que codifican para una pluralidad de subunidades en un huésped.
Además, la expresión de un gen puede aumentarse mejorando la eficiencia de transcripción del gen. Además, la expresión de un gen también puede aumentarse mejorando la eficiencia de traducción del gen. La eficiencia de transcripción del gen y la eficiencia de traducción del gen pueden mejorarse, por ejemplo, modificando una secuencia de control de la expresión del gen. El término “secuencia de control de la expresión” se refiere en conjunto a sitios que afectan a la expresión de un gen. Los ejemplos de la secuencia de control de la expresión incluyen, por ejemplo, promotor, secuencia Shine-Dalgarno (SD) (también denominada sitio de unión al ribosoma (RBS)) y región espaciadora entre el RBS el codón de inicio. Las secuencias de control de la expresión pueden identificarse usando un vector de búsqueda de promotor o software de análisis génico tal como GENETYX. Estas secuencias de control de la expresión pueden modificarse, por ejemplo, mediante un método de uso de un vector sensible a la temperatura o el método de integración dirigida por Red (documento W02005/010175).
La eficiencia de transcripción de un gen puede mejorarse, por ejemplo, reemplazando el promotor del gen en un cromosoma por un promotor más fuerte. El término “promotor más fuerte” se refiere a un promotor que proporciona una transcripción mejorada de un gen en comparación con un promotor de tipo natural existente de forma inherente del gen. Los ejemplos de promotores más fuertes incluyen, por ejemplo, los conocidos promotores de alta expresión tales como promotor T7, promotor trp, promotor lac, promotor thr, promotor tac, promotor trc, promotor tet, promotor araBAD, promotor rpoH, promotor msrA, promotor Pm1 (derivado del género Bifidobacterium), promotor PR y promotor PL. Los ejemplos de promotores más fuertes que pueden usarse en bacterias corineformes incluyen el promotor P54-6 modificado artificialmente (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)), los promotores pta, aceA, aceB, adh y amyE inducibles en bacterias corineformes con ácido acético, etanol, ácido pirúvico o similares, los promotores cspB, SOD y tu f (EF-Tu), que son potentes promotores capaces de proporcionar una gran cantidad de expresión en bacterias corineformes (Journal of Biotechnology, 104 (2003) 311-323; Appl. Environ. Microbiol., diciembre de 2005; 71 (12):8587-96), así como el promotor lac, el promotor tac y el promotor trc. Además, como promotor más fuerte, también puede obtenerse un tipo altamente activo de un promotor existente usando diversos genes indicadores. Por ejemplo, haciendo que las regiones -35 y -10 en una región promotora estén más cercanas a la secuencia de consenso, puede potenciarse la actividad del promotor (documento W000/18935). Los ejemplos del promotor de tipo altamente activo incluyen diversos promotores similares a tac (Katashkina JI et al., solicitud de patente de la Federación Rusa n.° 2006134574) y el promotor pnlp8 (documento W02010/027045). Los métodos para evaluar la fuerza de los promotores y ejemplos de promotores fuertes se describen en el artículo de Goldstein et al. (Prokaryotic Promoters in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)), etc.
La eficiencia de traducción de un gen puede mejorarse, por ejemplo, reemplazando la secuencia Shine-Dalgarno (SD) (también denominada sitio de unión al ribosoma (RBS)) para el gen en un cromosoma por una secuencia SD más fuerte. La “secuencia SD más fuerte” significa una secuencia SD que proporciona una traducción mejorada de ARNm en comparación con la secuencia SD de tipo natural existente de forma inherente del gen. Los ejemplos de secuencias SD más fuertes incluyen, por ejemplo, r Bs del gen 10 derivado del fago T7 (Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227­ 235). Además, se sabe que la sustitución, inserción o deleción de varios nucleótidos en una región espaciadora entre el RBS y el codón de inicio, especialmente en una secuencia inmediatamente aguas arriba del codón de inicio (5'-UTR), afecta significativamente a la estabilidad y a la eficiencia de traducción de ARNm y, por tanto, la eficiencia de traducción de un gen también puede mejorarse modificándolos.
La eficiencia de traducción de un gen también puede mejorarse, por ejemplo, modificando los codones. En Escherichia coli, etc., existe un claro sesgo de codones entre los codones de 61 aminoácidos encontrados dentro de la población de moléculas de ARNm y el nivel de ARNt relacionado parece directamente proporcional a la frecuencia de uso de codones (Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6 (5), 494-500 (1995)). Es decir, si existe una gran cantidad de ARNm que contiene una cantidad en exceso de codones raros, puede surgir un problema traduccional. Según recientes investigaciones, se sugiere que las agrupaciones de codones AGG/AGA, CUA, AUA, CGA o CCC pueden reducir especialmente tanto la cantidad como la calidad de una proteína sintetizada. Un problema de este tipo se produce especialmente en el momento de la expresión de un gen heterólogo. Por tanto, en el caso de la expresión heterogénea de un gen o similar, la eficiencia de traducción del gen puede mejorarse reemplazando un codón raro presente en el gen por un codón parecido usado con más frecuencia. Es decir, el gen que va a introducirse puede modificarse, por ejemplo, para contener los codones óptimos según las frecuencias de codones observadas en un huésped que va a usarse. Los codones pueden reemplazarse, por ejemplo, mediante el método de mutación específica de sitio para la introducción de una mutación objetivo en un sitio objetivo del ADN. Los ejemplos del método de mutación específica de sitio incluyen el método que utiliza PCR (Higuchi, R., 61, en PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press (1989); Carter, P., Met. en Enzymol., 154, 382 (1987)) y el método que utiliza fagos (Kramer, W. y Frits, H.J., Met. en Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Met. en Enzymol., 154, 367 (1987)). Alternativamente, puede sintetizarse por completo un fragmento de gen en el que están reemplazados los codones objetivo. Las frecuencias de los codones en diversos organismos se divulgan en la “base de datos de uso de codones” (http://www.kazusa.o.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).
Además, la expresión de un gen también puede aumentarse amplificando un regulador que aumenta la expresión del gen, o eliminando o atenuando un regulador que reduce la expresión del gen.
Tales métodos para aumentar la expresión génica, tal como se mencionó anteriormente, pueden usarse independientemente o en cualquier combinación.
Además, la modificación que aumenta la actividad de una proteína también puede lograrse, por ejemplo, potenciando la actividad específica de la enzima. La potenciación de la actividad específica también incluye una reducción y eliminación de la retroinhibición. Una proteína que muestra una actividad específica potenciada puede obtenerse, por ejemplo, buscando diversos organismos. Además, un tipo altamente activo de una proteína existente también puede obtenerse mediante la introducción de una mutación en la proteína existente. La mutación que va a introducirse puede ser, por ejemplo, una sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios residuos de aminoácido en una o varias posiciones de la proteína. La mutación puede introducirse, por ejemplo, mediante el método de mutación específica de sitio, tal como se mencionó anteriormente. La mutación también puede introducirse, por ejemplo, mediante un tratamiento de mutagénesis. Los ejemplos del tratamiento de mutagénesis incluyen irradiación de rayos X, irradiación de ultravioleta y un tratamiento con un agente de mutación tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanosulfonato de etilo (EMS) y metanosulfonato de metilo (MMS). Además, puede inducirse una mutación al azar tratando directamente el ADN in vitro con hidroxilamina. La potenciación de la actividad específica puede usarse independientemente, o puede usarse en cualquier combinación con tales métodos para potenciar la expresión génica, tal como se mencionó anteriormente.
El método para la transformación no está particularmente limitado, y pueden usarse métodos convencionalmente conocidos. Puede usarse, por ejemplo, un método para tratar células receptoras con cloruro de calcio para aumentar la permeabilidad de las mismas al ADN, que se ha notificado para la cepa K-12 de Escherichia coli (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 1970, 53, 159-162) y un método para preparar células competentes a partir de células que están en la fase de crecimiento, seguido por transformación con ADN, que se ha notificado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. y Young, F.E., Gene, 1977, 1:153-167). Alternativamente, también puede usarse un método para elaborar células receptoras de ADN en protoplastos o esferoplastos, que pueden captar fácilmente ADN recombinante, seguido por la introducción de un ADN recombinante en las células receptoras de ADN, que se sabe que puede aplicarse a Bacillus subtilis, actinomicetos y levaduras (Chang, S. y Choen, S.N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168:111-115; Bibb, M.J., Ward, J.M. y Hopwood, O.A., 1978, Nature, 274:398-400; Hinnen, A., Hicks, J.B. y Fink, G.R., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929-1933). Además, también puede usarse el método de pulsos eléctricos notificado para bacterias corineformes (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 2-207791).
Un aumento en la actividad de una proteína puede confirmarse midiendo la actividad de la proteína.
Un aumento en la actividad de una proteína también puede confirmarse confirmando un aumento en la expresión de un gen que codifica para la proteína. Un aumento en la expresión de un gen puede confirmarse confirmando un aumento en la cantidad de transcripción del gen o confirmando un aumento en la cantidad de una proteína expresada a partir del gen.
El aumento de la cantidad de transcripción de un gen puede confirmarse comparando la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen con la de una cepa sin modificar, tal como una cepa de tipo natural o cepa original. Los ejemplos del método para evaluar la cantidad de ARNm incluyen hibridación de tipo Northern, RT-PCR, etc. (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE.UU.), 2001). La cantidad de ARNm puede aumentarse, por ejemplo, hasta 1,5 veces o más, 2 veces o más, o 3 veces o más que la de un cepa sin modificar.
Un aumento en la cantidad de una proteína puede confirmarse mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (Ee .UU.), 2001). La cantidad de la proteína puede aumentarse, por ejemplo, hasta 1,5 veces o más, 2 veces o más, o 3 veces o más que la de una cepa sin modificar.
Los métodos mencionados anteriormente para aumentar la actividad de una proteína pueden usarse para la potenciación de las actividades de cualquier proteína, tal como enzimas biosintéticas de aminoácidos básicos y un sistema de excreción de lisina, y la potenciación de la expresión de cualquier gen, tal como genes que codifican para enzimas biosintéticas de aminoácidos básicos y un sistema de excreción de lisina.
<1-3> Método para reducir la actividad de una proteína
A continuación en el presente documento, se explicarán los métodos para reducir la actividad de una proteína.
La expresión “se reduce la actividad de una proteína” significa que se reduce la actividad de la proteína por célula en comparación con la de una cepa sin modificar, tal como una cepa de tipo natural o cepa original. El término “cepa sin modificar” usado en el presente documento se refiere a una cepa de control que no se ha modificado, de modo que se reduce la actividad de una proteína objetivo. Los ejemplos de la cepa sin modificar incluyen una cepa de tipo natural y cepa original. La expresión “se reduce la actividad de una proteína” también incluye un estado en el que la actividad de la proteína ha desaparecido por completo. Específicamente, la expresión “se reduce la actividad de una proteína” significa que se reduce el número de moléculas de la proteína por célula y/o que se reduce la función de cada molécula de la proteína en comparación con los de una cepa sin modificar. Es decir, el término “actividad” en la expresión “se reduce la actividad de una proteína” no se limita a la actividad catalítica de la proteína, sino que también puede significar la cantidad de transcripción de un gen (es decir, la cantidad de ARNm) que codifica para la proteína o la cantidad de traducción de la proteína (es decir, la cantidad de la proteína). La expresión “se reduce el número de moléculas de la proteína por célula” también incluye un estado en el que la proteína no existe en absoluto. La expresión “se reduce la función de cada molécula de la proteína” también incluye un estado en el que la función de cada proteína molécula ha desaparecido por completo. El grado de la reducción de la actividad de una proteína no está particularmente limitado, siempre que se reduzca la actividad en comparación con la de una cepa sin modificar. La actividad de una proteína puede reducirse, por ejemplo, hasta el 50% o menos, el 20% o menos, el 10% o menos, el 5% o menos o el 0% de la de una cepa sin modificar.
La modificación para reducir la actividad de una proteína puede lograrse, por ejemplo, reduciendo la expresión de un gen que codifica para la proteína. La expresión “se reduce la expresión de un gen” significa que se reduce la expresión del gen por célula en comparación con la de una cepa sin modificar, tal como una cepa de tipo natural y cepa original. La expresión “se reduce la expresión de un gen” puede significar específicamente que se reduce la cantidad de transcripción del gen (es decir, la cantidad de ARNm) y/o que se reduce la cantidad de traducción del gen (es decir, la cantidad de la proteína expresada a partir del gen). La expresión “se reduce la expresión de un gen” también incluye un estado en el que el gen no se expresa en absoluto. La expresión “se reduce la expresión de un gen” también se denomina “se atenúa la expresión de un gen”. La expresión de un gen puede reducirse, por ejemplo, hasta el 50% o menos, el 20% o menos, el 10% o menos, el 5% o menos o el 0% de la de una cepa sin modificar.
La reducción de expresión génica puede deberse a, por ejemplo, una reducción en la eficiencia de transcripción, una reducción en la eficiencia de traducción o una combinación de las mismas. La expresión de un gen puede reducirse modificando una secuencia de control de la expresión del gen, tal como promotor, secuencia Shine-Dalgarno (SD) (también denominada sitio de unión al ribosoma (RBS)) y región espaciadora entre el RBS y el codón de inicio del gen. Cuando se modifica una secuencia de control de la expresión, se modifican preferiblemente uno o más nucleótidos, más preferiblemente dos o más nucleótidos, de manera particularmente preferible tres o más nucleótidos de la secuencia de control de la expresión. Además, puede delecionarse la totalidad o una parte de una secuencia de control de la expresión. La expresión de un gen también puede reducirse, por ejemplo, manipulando un factor responsable del control de la expresión. Los ejemplos del factor responsable del control de la expresión incluyen moléculas bajas responsables del control de la transcripción o traducción (inductores, inhibidores, etc.), proteínas responsables del control de la transcripción o traducción (factores de transcripción etc.), ácidos nucleicos responsables del control de la transcripción o traducción (ARNip, etc.), etc. Además, la expresión de un gen también puede reducirse, por ejemplo, mediante la introducción de una mutación que reduce la expresión del gen en la región codificante del gen. Por ejemplo, la expresión de un gen puede reducirse reemplazando un codón en la región codificante del gen por un codón parecido usado con menos frecuencia en un huésped. Además, por ejemplo, la expresión génica puede reducirse debido a la alteración de un gen tal como se describirá más adelante.
La modificación para reducir la actividad de una proteína también puede lograrse, por ejemplo, alterando un gen que codifica para la proteína. La expresión “se altera un gen” significa que se modifica un gen de modo que no se produce una proteína que puede funcionar normalmente. La expresión “no se produce una proteína que funciona normalmente” incluye un estado en el que la proteína no se produce en absoluto a partir del gen y un estado en el que se produce a partir del gen la proteína cuya función (tal como actividad o propiedad) por molécula se reduce o eliminada.
La alteración de un gen puede lograrse, por ejemplo, delecionando la totalidad o una parte de la región codificante del gen en un cromosoma. Además, puede delecionarse la totalidad de un gen, incluyendo las secuencias aguas arriba y aguas abajo del gen en un cromosoma. La región que va a delecionarse puede ser cualquier región, tal como una región N-terminal, una región interna o una región C-terminal, siempre que pueda reducirse la actividad de la proteína. Habitualmente, la deleción de una región más larga puede inactivar con más seguridad el gen. Además, se prefiere que los marcos de lectura de las secuencias aguas arriba y aguas abajo de la región que va a delecionarse no sean el mismo.
La alteración de un gen puede lograrse, por ejemplo, mediante la introducción de una mutación para una sustitución de aminoácido (mutación de aminoácido), un codón de parada (mutación terminadora), una mutación del marco de lectura que añade o elimina uno o dos residuos de nucleótido o similares en la región codificante del gen en un cromosoma (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, EE.UU., 955511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 26 116, 20833-20839 (1991)).
La alteración de un gen también puede lograrse, por ejemplo, insertando otra secuencia en una región codificante del gen en un cromosoma. El sitio de la inserción puede estar en cualquier región del gen y, habitualmente, la inserción de una región más larga puede inactivar con más seguridad el gen. Se prefiere que los marcos de lectura de las secuencias aguas arriba y aguas abajo del sitio de inserción no sean el mismo. La otra secuencia no está particularmente limitada, siempre que se elija una secuencia que reduce o elimina la actividad de la proteína codificada, y los ejemplos de la misma incluyen, por ejemplo, un gen marcador tal como genes resistentes a los antibióticos y un gen útil para la producción de una sustancia objetivo.
Tal modificación de un gen en un cromosoma, tal como se describió anteriormente, puede lograrse, por ejemplo, preparando un gen de tipo deficiente modificado de modo que no pueda producir una proteína que funciona normalmente y transformando un huésped con un ADN recombinante que contiene el gen de tipo deficiente para provocar la recombinación homóloga entre el gen de tipo deficiente y el gen de tipo natural en un cromosoma y, por tanto, sustituir el gen de tipo deficiente por el gen de tipo natural en el cromosoma. En este procedimiento, si se incluye un gen marcador seleccionado según las características del huésped, tal como auxotrofia, en el ADN recombinante, la operación se vuelve más fácil. Los ejemplos del gen de tipo deficiente incluyen un gen que incluye la deleción de la totalidad o una parte del gen, un gen que incluye una mutación de aminoácido, un gen que incluye una mutación terminadora, un gen que incluye una mutación del marco de lectura y un gen que incluye la inserción de un transposón o gen marcador. La proteína codificada por el gen de tipo deficiente tiene una conformación diferente de la de la proteína de tipo natural, incluso si se produce, y, por tanto, se reduce o elimina la función de la misma. Tal alteración génica basándose en la sustitución génica utilizando recombinación homóloga ya se ha establecido, y existen métodos de uso de un ADN lineal, tales como un método denominado “ integración dirigida por Red” (Datsenko, K.A y Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)) y un método que utiliza la integración dirigida por Red en combinación con un sistema de escisión derivado del fago X (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) (remítase al documento W02005/010175), un método de uso de un plásmido que tiene un origen de replicación sensible a la temperatura, un método de uso de un plásmido capaz de realizar transferencia conjugativa, un método de utilización de un vector suicida que no tiene ningún origen de replicación que funcione en un huésped (patente estadounidense n.° 6.303.383, patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 05­ 007491), etc.
La modificación para reducir la actividad de una proteína también puede lograrse, por ejemplo, mediante un tratamiento de mutagénesis. Los ejemplos del tratamiento de mutagénesis incluyen irradiación de rayos X o ultravioleta y tratamiento con un agente de mutación, tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanosulfonato de etilo (EMS) y metanosulfonato de metilo (MMS).
Cuando una proteína funciona como un complejo que consiste en una pluralidad de subunidades, puede modificarse la totalidad o una parte de la pluralidad de subunidades, siempre que se reduzca eventualmente la actividad de la proteína. Es decir, por ejemplo, puede alterarse la totalidad o una parte de una pluralidad de genes que codifican para las subunidades respectivas, o similares. Además, cuando hay una pluralidad de isozimas de una proteína, puede reducirse la totalidad o una parte de las actividades de la pluralidad de isozimas, siempre que se reduzca eventualmente la actividad de la proteína. Es decir, por ejemplo, puede alterarse la totalidad o una parte de una pluralidad de genes que codifican para las isozimas respectivas, o similares.
Una reducción en la actividad de una proteína puede confirmarse midiendo la actividad de la proteína.
Una reducción en la actividad de una proteína también puede confirmarse confirmando una reducción en la expresión de un gen que codifica para la proteína. Una reducción en la expresión de un gen puede confirmarse confirmando una reducción en la cantidad de transcripción del gen o una reducción en la cantidad de la proteína expresada a partir del gen.
Una reducción en la cantidad de transcripción de un gen puede confirmarse comparando la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen con la de una cepa sin modificar. Los ejemplos del método para evaluar la cantidad de ARNm incluyen hibridación de tipo Northern, RT-PCR, etc. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE.UU.), 2001). La cantidad de ARNm puede reducirse, por ejemplo, hasta el 50% o menos, el 20% o menos, el 10% o menos, el 5% o menos o el 0% de la de una cepa sin modificar.
Una reducción en la cantidad de una proteína puede confirmarse mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE.UU.) 2001). La cantidad de la proteína puede reducirse, por ejemplo, hasta el 50% o menos, el 20% o menos, el 10% o menos, el 5% o menos o el 0% de la de una cepa sin modificar.
La alteración de un gen puede confirmarse determinando la secuencia de nucleótidos de la totalidad o una parte del gen, el mapa de enzimas de restricción, la longitud completa o similares del gen, dependiendo del medio usado para la alteración.
Los métodos mencionados anteriormente para reducir la actividad de una proteína, tal como se mencionó anteriormente, pueden aplicarse para la reducción de las actividades de cualquier proteína, tal como enzimas que catalizan una reacción que se bifurca lejos de la ruta biosintética de un aminoácido básico objetivo para generar un compuesto distinto del aminoácido básico objetivo, y para la reducción de la expresión de cualquier gen, tal como genes que codifican para enzimas que catalizan una reacción que se bifurca lejos de la ruta biosintética de un aminoácido básico objetivo para generar un compuesto distinto del aminoácido básico objetivo.
<2> Etapa de fermentación
La etapa de fermentación es una etapa de cultivar un microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico en un medio de cultivo para obtener un caldo de fermentación que contiene el aminoácido básico, en la que la etapa se lleva a cabo de modo que la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo se controla a 300 mM o menor durante al menos un periodo parcial de cultivo. La etapa de fermentación se lleva a cabo de modo que los iones bicarbonato y/o iones carbonato sirven como contraiones para el aminoácido básico. Un método de fermentación de este tipo también se denomina “fermentación con carbonato”. Mediante la fermentación con carbonato, puede producirse un aminoácido básico mediante fermentación a la vez que se reduce la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro usada, que se han usado convencionalmente como contraiones para un aminoácido básico.
La fermentación con carbonato puede llevarse a cabo, por ejemplo, tal como se describe en el documento US2002-0025564A, el documento EP1813677A y la patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.° 2002-65287.
Específicamente, la fermentación con carbonato puede llevarse a cabo, por ejemplo, de modo que haya un periodo de cultivo en el que 20 mM o más, preferiblemente 30 mM o más, más preferiblemente 40 mM o más de iones bicarbonato y/o iones carbonato estén presentes en el medio de cultivo. Cada una de las concentraciones ejemplificadas anteriormente se interpretan como la concentración total de iones bicarbonato e iones carbonato. La expresión “hay un periodo de cultivo en el que están presentes iones bicarbonato y/o iones carbonato en un medio de cultivo a una determinada concentración” significa que están presentes iones bicarbonato y/o iones carbonato en el medio de cultivo a la determinada concentración durante al menos un periodo parcial de cultivo. Es decir, los iones bicarbonato y/o iones carbonato pueden estar presentes en el medio de cultivo a la concentración ejemplificada anteriormente a lo largo del periodo completo de cultivo o durante un periodo parcial de cultivo. El “periodo parcial” no está particularmente limitado siempre que se logre una productividad deseada del aminoácido básico. El “periodo parcial” puede ser, por ejemplo, un periodo del 10% o más, el 20% o más, el 30% o más, el 50% o más, el 70% o más o el 90% o más del periodo completo de cultivo. Cuando el cultivo se realiza por separado como cultivo de siembra y cultivo principal, el término “periodo completo de cultivo” se refiere al periodo completo del cultivo principal. Es preferible que los iones bicarbonato y/o iones carbonato estén presentes en el medio de cultivo a la concentración ejemplificada anteriormente durante a un periodo en el que se produce el aminoácido básico. Es decir, por ejemplo, cuando la etapa de fermentación comprende una etapa de proliferación de la bacteria productora del aminoácido básico (periodo de crecimiento) y una etapa de producción del aminoácido básico (periodo de producción), es preferible que los iones bicarbonato y/o iones carbonato estén presentes en el medio de cultivo a la concentración ejemplificada anteriormente al menos durante el periodo de producción. El término “periodo de crecimiento” se refiere a un periodo en el que la fuente de carbono se utiliza principalmente para el crecimiento de células, y puede referirse específicamente a un periodo hasta el punto de tiempo de 3 h, 6 h o 10 h después del inicio del cultivo. El término “periodo de producción” se refiere a un periodo en el que la fuente de carbono se utiliza principalmente para la producción de una sustancia, y puede referirse específicamente a un periodo desde el punto de tiempo de 3 h, 6 h o 10 h después del inicio del cultivo.
Puede hacerse que los iones bicarbonato y/o iones carbonato existan en el medio de cultivo controlando que la presión interna del tanque de fermentación sea positiva, suministrando gas de dióxido de carbono al medio de cultivo o una combinación de los mismos. La presión interna del tanque de fermentación durante la fermentación puede controlarse para que sea positiva, por ejemplo, haciendo que la presión de suministro de gas sea mayor que la presión de gases de escape. Si la presión interna del tanque de fermentación se controla para que sea positiva, el gas de dióxido de carbono generado mediante la fermentación se disuelve en el medio de cultivo para generar iones bicarbonato y/o iones carbonato, y estos pueden servir como contraiones para el aminoácido básico. La presión interna del tanque de fermentación puede ser específicamente, por ejemplo, de 0,03 a 0,2 MPa, preferiblemente de 0,05 a 0,15 MPa, más preferiblemente de 0,1 a 0,3 MPa, en cuanto a presión manométrica (diferencia de presión con respecto a la presión atmosférica). El gas de dióxido de carbono puede suministrarse al medio de cultivo, por ejemplo, burbujeando gas de dióxido de carbono puro o un gas mixto que contiene gas de dióxido de carbono al medio de cultivo. Los ejemplos del gas mixto que contiene gas de dióxido de carbono incluyen un gas mixto que contiene el 5% v/v o más de gas de dióxido de carbono. La presión interna en el tanque de fermentación, el volumen de suministro de gas de dióxido de carbono y el volumen de aireación limitado pueden establecerse de manera apropiada según diversas condiciones, tales como el pH del medio de cultivo, la concentración de iones bicarbonato y/o carbonato en el medio de cultivo y la concentración de amoniaco en el medio de cultivo.
En los métodos convencionales para producir un aminoácido básico, se añade habitualmente una cantidad suficiente de sulfato de amonio y/o cloruro de amonio al medio de cultivo como fuente de contraiones para el aminoácido básico, o se añaden productos de descomposición del ácido sulfúrico y/o productos de descomposición del ácido clorhídrico de proteínas, etc., como componentes nutritivos al medio de cultivo. Por tanto, está presente una gran cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro en el medio de cultivo y la concentración de los iones carbonato débilmente ácidos es extremadamente baja, es decir, es del orden de ppm.
Por el contrario, la fermentación con carbonato tiene la característica de que se reduce la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro usada, de modo que el gas de dióxido de carbono liberado mediante un microorganismo durante la fermentación y/o el gas de dióxido de carbono suministrado externamente se disuelve en el medio de cultivo y se usa como contraiones para el aminoácido básico. Es decir, en la fermentación con carbonato, uno de los objetos es reducir la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro usada y, por tanto, no es necesario añadir iones sulfato o iones cloruro al medio de cultivo en una cantidad mayor de la requerida para el crecimiento del microorganismo productor de aminoácido básico. Se prefiere alimentar sulfato de amonio o similares al medio de cultivo en una etapa temprana del cultivo en una cantidad requerida para el crecimiento, y la alimentación se finaliza a la mitad del cultivo. Alternativamente, puede alimentarse sulfato de amonio o similares al medio de cultivo a la vez que se mantiene el equilibrio con respecto a la cantidad de iones carbonato y/o iones bicarbonato disueltos en el medio de cultivo. Al reducir la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro usada, puede disminuirse la concentración de iones sulfato y/o iones cloruro en el medio de cultivo. Al disminuir la concentración de iones sulfato y/o iones cloruro, puede hacerse que los iones bicarbonato y/o iones carbonato existan más fácilmente en el medio de cultivo. Es decir, en la fermentación con carbonato, puede suprimirse el pH del medio de cultivo para hacer que los iones bicarbonato y/o iones carbonato existan en el medio de cultivo en una cantidad requerida como contraiones para el aminoácido básico para que sea menor en comparación con los métodos convencionales. La concentración molar total de iones sulfato e iones cloruro contenidos en el medio de cultivo puede ser específicamente, por ejemplo, de 900 mM o menor, preferiblemente de 700 mM o menor, más preferiblemente de 500 mM o menor, de manera adicionalmente preferible de 300 mM o menor, de manera adicionalmente preferible de 200 mM o menor, de manera particularmente preferible de 100 mM o menor.
En la fermentación con carbonato, el pH del medio de cultivo no está particularmente limitado, siempre que se haga que los iones bicarbonato y/o iones carbonato existan en el medio de cultivo a una concentración deseada y se logre una productividad deseada del aminoácido básico. El pH del medio de cultivo puede establecerse de manera apropiada según diversas condiciones, tales como el pH del medio de cultivo, la concentración de iones bicarbonato y/o carbonato en el medio de cultivo y la concentración de amoniaco en el medio de cultivo. El pH del medio de cultivo puede controlarse a, por ejemplo, de 6,5 a 9,0, preferiblemente de 7,2 a 9,0, durante el cultivo. El pH del medio de cultivo puede controlarse al valor ejemplificado anteriormente durante al menos un periodo parcial de cultivo. Es decir, el pH del medio de cultivo puede controlarse al valor ejemplificado anteriormente a lo largo del periodo completo de cultivo o durante un periodo parcial de cultivo. Las descripciones respecto al periodo de cultivo, en las que están presentes iones bicarbonato y/o iones carbonato en un medio de cultivo, pueden aplicarse, haciendo los cambios necesarios, al “periodo parcial” durante el que se controla el pH del medio de cultivo. Es decir, por ejemplo, el pH del medio de cultivo puede controlarse al valor ejemplificado anteriormente durante un periodo en el que se produce el aminoácido básico. Además, el pH del medio de cultivo puede ser, por ejemplo, de 7,2 o mayor, preferiblemente de 7,2 a 9,0, al finalizar el cultivo. Es decir, el pH del medio de cultivo puede controlarse para lograr el valor de pH ejemplificado anteriormente al finalizar el cultivo. El pH del medio de cultivo puede controlarse, por ejemplo, directamente usando el propio valor de pH como indicador o indirectamente controlando la concentración total de amoniaco (documento W02006/038695).
Además, el medio de cultivo puede contener aniones distintos de iones bicarbonato y/o iones carbonato (también denominados otros aniones). Se prefiere que las concentraciones de los otros aniones en el medio de cultivo sean bajas, siempre que estén presentes en las cantidades requeridas para el crecimiento del microorganismo productor de aminoácido básico. Los ejemplos de los otros aniones incluyen iones cloruro, iones sulfato, iones fosfato, iones de ácidos orgánicos e iones hidróxido. La concentración molar total de estos otros aniones puede ser específicamente, por ejemplo, de 900 mM o menor, preferiblemente de 700 mM o menor, más preferiblemente de 500 mM o menor, todavía más preferiblemente de 300 mM o menor, de manera particularmente preferible de 200 mM o menor, de 100 mM o menor, de 50 mM o menor o de 20 mM o menor.
Además, el medio de cultivo puede contener cationes distintos del aminoácido básico (también denominados otros cationes). Los ejemplos de los otros cationes incluyen iones de K, iones de Na, iones de Mg e iones de Ca que se originan en los componentes del medio de cultivo. La concentración molar total de los otros cationes puede ser específicamente, por ejemplo, el 50% o menor, preferiblemente el 10% o menor, más preferiblemente el 5% o menor, de manera particularmente preferible el 2% o menor de la concentración molar de los cationes totales.
La etapa de fermentación de la presente invención se lleva a cabo de modo que la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo se controla a 300 mM o menor durante al menos un periodo parcial de cultivo.
En la fermentación con carbonato, es preferible controlar la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo a una concentración a la que no se inhiba la producción del aminoácido básico (documento W02006/038695, documento W02015/050234). El término “concentración total de amoniaco” se refiere a la concentración total de amoniaco no disociado (NH3) e iones amonio (NH4+). Los ejemplos de la concentración total de amoniaco a la que “no se inhibe la producción del aminoácido básico” incluyen, por ejemplo, una concentración total de amoniaco que proporciona un rendimiento y/o una productividad correspondientes a preferiblemente el 50% o más, más preferiblemente el 70% o más, de manera particularmente preferible el 90% o más del rendimiento y/o de la productividad que pueden obtenerse en la producción del aminoácido básico en condiciones óptimas. La concentración total de amoniaco en el medio de cultivo puede ser específicamente, por ejemplo, de 300 mM o menor, de 250 mM o menor, de 200 mM o menor, de 100 mM o menor o de 50 mM o menor. El grado de disociación del amoniaco disminuye a medida que aumenta el pH. El amoniaco no disociado es más tóxico para los microorganismos en comparación con los iones amonio. Por tanto, el límite superior de la concentración total de amoniaco también depende del pH del caldo de fermentación. Es decir, a medida que aumenta el pH del caldo de fermentación, disminuye la concentración total de amoniaco aceptable. Por tanto, la concentración total de amoniaco a la que “no se inhibe la producción del aminoácido básico” se determina preferiblemente para cada valor de pH específico. Sin embargo, el intervalo de concentración total de amoniaco que es aceptable al nivel pH más alto durante el cultivo puede usarse como el intervalo de concentración total de amoniaco a lo largo del periodo completo de cultivo. La concentración total de amoniaco en el medio de cultivo puede controlarse a la concentración ejemplificada anteriormente durante al menos un periodo parcial de cultivo. Es decir, la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo puede controlarse a la concentración ejemplificada anteriormente a lo largo del periodo completo de cultivo o durante un periodo parcial de cultivo. Las descripciones respecto al periodo de cultivo, en las que están presentes iones bicarbonato y/o iones carbonato en un medio de cultivo, pueden aplicarse, haciendo los cambios necesarios, al “periodo parcial” durante el que se controla la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo. Es decir, por ejemplo, la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo puede controlarse a la concentración ejemplificada anteriormente durante un periodo en el que se produce el aminoácido básico. Además, los ejemplos específicos del “periodo parcial” durante el que la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo incluyen un periodo durante el que el pH del medio de cultivo aumenta debido a la escasez de contraiones, tales como iones sulfato e iones cloruro, con respecto a la acumulación del aminoácido básico.
Mientras tanto, la concentración total de amoniaco como fuente de nitrógeno requerida para el crecimiento del microorganismo productor de aminoácido básico y la producción del aminoácido básico no está particularmente limitada, y puede establecerse de manera apropiada, siempre que el agotamiento de amoniaco no continúe durante el cultivo y no se produzca la disminución de la productividad del aminoácido básico debido a la escasez de la fuente de nitrógeno. Por ejemplo, la concentración de amoniaco puede medirse a lo largo del tiempo durante el cultivo y, si se agota el amoniaco en el medio de cultivo, puede añadirse una pequeña cantidad de amoniaco al medio de cultivo. La concentración de amoniaco después de la adición de amoniaco puede ser específicamente, por ejemplo, preferiblemente de 1 mM o mayor, más preferiblemente de 10 mM o mayor, de manera particularmente preferible de 20 mM o mayor como la concentración total de amoniaco .
La concentración total de amoniaco en el medio de cultivo puede controlarse, por ejemplo, usando un aparato para controlar el amoniaco y un método para controlar el amoniaco descrito en el documento W02015/050234.
El medio de cultivo que va a usarse no está particularmente limitado, siempre que se produzca un aminoácido básico mediante fermentación con carbonato. El medio de cultivo puede contener diversos componentes orgánicos e inorgánicos, tales como fuente de carbono, fuente de nitrógeno y oligoelementos, según se requiera. Los tipos y las concentraciones de los componentes del medio de cultivo pueden determinarse de manera apropiada según diversas condiciones, tales como el tipo de microorganismo productor de aminoácido básico y el tipo de aminoácido básico que va a producirse.
La fuente de carbono no está particularmente limitada, siempre que el microorganismo productor de aminoácido básico pueda utilizarla para producir un aminoácido básico. Los ejemplos específicos de la fuente de carbono incluyen, por ejemplo, sacáridos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, lactosa, galactosa, arabinosa, melazas residuales, hidrolizados de almidones e hidrolizados de biomasa, ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico, alcoholes tales como etanol, glicerol y glicerol en bruto, hidrocarburos tales como metano y ácidos alifáticos. Como fuente de carbono, puede usarse una sola clase de fuente de carbono, o pueden usarse dos o más clases de fuentes de carbono en combinación.
Los ejemplos específicos de la fuente de nitrógeno incluyen, por ejemplo, fuente de nitrógeno inorgánico tales como sales de amonio, amoniaco y urea, y fuente de nitrógeno orgánico tales como peptona, extracto de levadura, extracto de carne y productos de descomposición de proteínas de soja. Como fuente de nitrógeno, puede usarse una sola clase de fuente de nitrógeno, o pueden usarse dos o más clases de fuentes de nitrógeno en combinación.
Los ejemplos específicos del oligoelemento incluyen, por ejemplo, aminoácidos, vitaminas y elementos metálicos traza. Como oligoelemento, puede usarse una sola clase de componente, o pueden usarse dos o más clases de componentes en combinación.
Cuando se usa un mutante auxótrofo que requiere un aminoácido o similar para el crecimiento del mismo, es preferible suministrar un nutriente requerido al medio de cultivo. Por ejemplo, en muchos de los microorganismos productores de L-lisina, se potencia la ruta biosintética de L-lisina y se atenúa la capacidad de descomposición de L-lisina. Cuando se cultiva un microorganismo productor de L-lisina de este tipo, por ejemplo, se añaden preferiblemente una o más clases de aminoácidos seleccionados de L-treonina, L-homoserina, L-isoleucina y L-metionina al medio de cultivo.
Las condiciones de cultivo no están particularmente limitadas, siempre que se produzca un aminoácido básico mediante fermentación con carbonato. Las condiciones de cultivo pueden determinarse de manera apropiada según diversas condiciones, tales como el tipo de microorganismo productor de aminoácido básico. El cultivo puede realizarse, por ejemplo, de manera aerobia mediante aireación del cultivo o agitación del cultivo usando un medio líquido. La temperatura del cultivo puede ser, por ejemplo, de 20 a 45°C, preferiblemente de 25 a 37°C. El periodo de cultivo puede ser, por ejemplo, de 10 a 120 horas. El cultivo puede realizarse como un cultivo discontinuo, un cultivo semicontinuo, un cultivo continuo o una combinación de los mismos. Además, las células del microorganismo pueden recogerse a partir del caldo de fermentación y reutilizarse (patente francesa n.° 2669935). El cultivo también puede realizarse por separado como cultivo previo y cultivo principal.
Al cultivar el microorganismo productor de aminoácido básico tal como se describió anteriormente, un aminoácido básico se acumula en el medio de cultivo y, por tanto, se obtiene un caldo de fermentación que contiene el aminoácido básico. El caldo de fermentación contiene además iones bicarbonato y/o iones carbonato. Los iones bicarbonato y/o iones carbonato contenidos en el caldo de fermentación pueden funcionar como contraiones del aminoácido básico. Es decir, la expresión “ la etapa de fermentación se lleva a cabo de modo que los iones bicarbonato y/o iones carbonato sirven como contraiones para el aminoácido básico” puede significar específicamente que se obtiene un caldo de fermentación que contiene iones bicarbonato y/o iones carbonato mediante la etapa de fermentación. La concentración de iones bicarbonato y/o iones carbonato contenidos en el caldo de fermentación no está particularmente limitada. La concentración de iones bicarbonato y/o iones carbonato contenidos en el caldo de fermentación puede ser, por ejemplo, de 20 mM o más, preferiblemente de 30 mM o más, más preferiblemente de 40 mM o más. Cada una de las concentraciones ejemplificadas anteriormente se interpretan como la concentración total de iones bicarbonato e iones carbonato. La concentración de iones bicarbonato y/o iones carbonato contenidos en el caldo de fermentación también puede ser, por ejemplo, una concentración tal que la razón de normalidad mostrada en la siguiente ecuación se vuelve de 5 o más, de 10 o más o de 20 o más a de 100 o menos, de 90 o menos o de 80 o menos, o está dentro de un intervalo definido por cualquier combinación de estos intervalos.
Razón de normalidad = (normalidad de Iones bicarbonato e Iones carbonato / normalidad de cationes totales) x 100
La producción del aminoácido básico puede confirmarse mediante métodos conocidos usados para la detección o identificación de compuestos. Los ejemplos de tales métodos incluyen, por ejemplo, HPLC, CL/Em , CG/EM y RMN. Estos métodos pueden usarse independientemente o pueden usarse en una combinación apropiada.
<3> Etapa de tratamiento térmico presurizado
La etapa de tratamiento térmico presurizado es una etapa de someter el caldo de fermentación obtenido en la etapa de fermentación a un tratamiento térmico bajo una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, en la que la temperatura del tratamiento térmico es de 60°C o mayor. Este tratamiento también se denomina “tratamiento térmico presurizado”. Dicho de otro modo, la etapa de tratamiento térmico presurizado es una etapa de calentar el caldo de fermentación obtenido en la etapa de fermentación mientras se aplica sobre el mismo una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación. En la etapa de tratamiento térmico presurizado, la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación debido al calentamiento puede evitarse mediante presurización. La expresión “generación de gas de dióxido de carbono a partir de un caldo de fermentación” significa que se gasifican sustancias de dióxido de carbono disueltas en el caldo de fermentación y se liberan a partir del caldo de fermentación. El término “sustancias de dióxido de carbono” se refiere en conjunto a molécula de dióxido de carbono, molécula de ácido carbónico, ion carbonato e ion bicarbonato. La generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación también se denomina “descarboxilación”.
La presión mínima requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación también se denomina “presión requerida”. Es decir, la presión del tratamiento térmico presurizado es igual a o mayor que la presión requerida. La presión del tratamiento térmico presurizado no está particularmente limitada, siempre que sea igual a o mayor que la presión requerida. La presión del tratamiento térmico presurizado puede ser, por ejemplo, el 101% o más, el 103% o más, el 105% o más, el 110% o más, el 115% o más, el 120% o más o el 130% o más de la presión requerida, para evitar suficientemente la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación. En la presente invención, el término “presión” se refiere a presión manométrica (diferencia de presión con respecto a la presión atmosférica), a menos que se indique lo contrario.
La presión requerida puede determinarse de manera apropiada según diversas condiciones, tales como la composición del caldo de fermentación, el pH del caldo de fermentación y la temperatura del tratamiento térmico presurizado.
La presión requerida puede calcularse (determinarse), específicamente, por ejemplo, usando la(s) concentración/concentraciones de componente(s) en el caldo de fermentación (tal como el aminoácido básico, CO2, NH3, K, Mg, Cl, SO4, ácido acético y ácido succínico) y la temperatura como variables. Es decir, en primer lugar, puede calcularse el pH del caldo de fermentación a una determinada temperatura usando la(s) concentración/concentraciones de componente(s) en el caldo de fermentación (tal como el aminoácido básico, CO2, NH3, K, Mg, Cl, SO4, ácido acético y ácido succínico) y la temperatura como variables. A continuación, puede determinarse el estado disociativo del aminoácido básico usando el pH y la temperatura como variables. Suponiendo que se gasifican los iones HCO3 que no pueden retener el aminoácido básico como contraiones a la temperatura del tratamiento térmico presurizado (es decir, iones HCO3 que pierden contraiones debido al calentamiento), puede calcularse la razón de abundancia (tasa de existencia) de iones HCO3 que no pueden retener el aminoácido básico como contraiones a la temperatura del tratamiento térmico presurizado basándose en el estado disociativo del aminoácido básico, la concentración del aminoácido básico y la concentración de CO2, y puede calcularse la presión parcial de dióxido de carbono según la ley de Henry. Es decir, puede calcularse la presión parcial de dióxido de carbono usando la(s) concentración/concentraciones de componente(s) en el caldo de fermentación (tal como el aminoácido básico, CO2, NH3, K, Mg, Cl, SO4, ácido acético y ácido succínico) y la temperatura como variables. El/Los tipo(s) de componente(s) usado(s) como variable(s) no está(n) particularmente limitado(s), siempre que pueda determinarse la presión requerida. El/Los tipo(s) de componente(s) usado(s) como variable(s) puede(n) determinarse de manera apropiada según diversas condiciones, tales como la composición del caldo de fermentación. Por ejemplo, puede usarse la totalidad o una parte de los componentes seleccionados del aminoácido básico, CO2, NH3, K, Mg, Cl, SO4, ácido acético y ácido succínico como variable(s). Los ejemplos específicos de una parte de los componentes incluyen, por ejemplo, el aminoácido básico, CO2, NH3, Cl y SO4 . La presión parcial de vapor de agua puede calcularse, por ejemplo, usando la ecuación de Wagner. El valor total de la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de vapor de agua puede considerarse como la presión requerida. Específicamente, por ejemplo, cuando el aminoácido básico es L-lisina, la presión requerida puede calcularse según los procedimientos descritos en el ejemplo 2. Además, en los casos de aminoácidos básicos distintos de L-lisina, la presión requerida puede calcularse según los procedimientos descritos en el ejemplo 2 con una modificación apropiada. La concentración de cada componente puede determinarse, por ejemplo, mediante tales métodos conocidos usados para la detección o identificación de compuestos tal como se describió anteriormente. Además, particularmente, la concentración de cada ion puede determinarse, por ejemplo, mediante cromatografía iónica.
Además, usando los procedimientos mencionados anteriormente, la presión requerida para una composición de caldo de fermentación específica también puede obtenerse como una ecuación aproximada. Específicamente, por ejemplo, la presión requerida para el caldo de fermentación de lisina mostrado en la tabla 5 descrita más adelante puede expresarse como la siguiente ecuación (ejemplo 4). En la ecuación, “temperatura” representa la temperatura (°C) del tratamiento térmico presurizado.
Presión requerida (kPa) = 1,99 x 10-3 x temperatura254
Alternativamente, puede medirse la presión requerida. Es decir, la presión del tratamiento térmico presurizado puede ser igual a o mayor que, por ejemplo, la presión requerida que va a medirse. La presión requerida puede medirse, específicamente, como la presión de una fase gaseosa en un recipiente sellado observada cuando el caldo de fermentación se coloca en el recipiente sellado y se ajusta (calienta) a la temperatura del tratamiento térmico presurizado. Es decir, el término “presión requerida que va a medirse” puede referirse específicamente a la presión de una fase gaseosa en un recipiente sellado observada cuando el caldo de fermentación se coloca en el recipiente sellado y se ajusta (calienta) a la temperatura del tratamiento térmico presurizado. Los ejemplos de un recipiente sellado de este tipo incluyen reactores de la serie TEM-V (Taiatsu Techno). El volumen del caldo de fermentación colocado en el recipiente sellado no está particularmente limitado, siempre que la presión requerida pueda medirse con la exactitud deseada. El caldo de fermentación puede colocarse en el recipiente sellado, por ejemplo, de modo que la porosidad del aparato se vuelva un valor tal como se describe a continuación. El término “porosidad del aparato” se refiere a la razón del volumen de la fase gaseosa en el recipiente sellado con respecto al volumen interno del recipiente sellado. Se prefiere que la porosidad del aparato sea baja. La porosidad del aparato puede ser, por ejemplo, del 2% v/v al 10% v/v o específicamente del 6% v/v. La fase gaseosa inicial (la fase gaseosa antes del calentamiento) en el método de medición mencionado anteriormente debe ser aire.
La presión requerida puede determinarse cada vez (cada vez que se lleva a cabo la etapa de fermentación) o puede determinarse de manera preliminar. Cuando la presión requerida se determina de manera preliminar, la presión requerida puede determinarse usando, por ejemplo, un caldo de fermentación obtenido de una manera similar o un caldo de fermentación modelo preparado como una composición similar. El método de la presente invención puede comprender o no una etapa de determinar la presión requerida (también denominada “etapa de determinación de la presión”). La etapa de determinación de la presión puede llevarse a cabo antes de la etapa (B). Incidentalmente, con respecto al significado de la expresión “ la presión del tratamiento térmico presurizado es igual a o mayor que la presión requerida que va a determinarse mediante un determinado medio”, es suficiente que la presión del tratamiento térmico presurizado sea igual a o mayor que la presión requerida que debe obtenerse, siempre que se use el determinado medio, independientemente de si realmente se usa el determina medio o no.
La presión del tratamiento térmico presurizado puede ser específicamente de, por ejemplo, 100 kPa o mayor, 200 kPa o mayor, 300 kPa o mayor, 400 kPa o mayor, 500 kPa o mayor, 600 kPa o mayor, 700 kPa o mayor, 800 kPa o mayor, 900 kPa o mayor, 1000 kPa o mayor, 1100 kPa o mayor o 1200 kPa o mayor. El límite superior de la presión del tratamiento térmico presurizado no está particularmente limitado, y es suficiente que la presión sea igual a o menor que la presión máxima que puede usarse en el aparato que va a usarse. La presión del tratamiento térmico presurizado puede ser específicamente de, por ejemplo, 3000 kPa o menor, 2000 kPa o menor o 1500 kPa o menor. La presión del tratamiento térmico presurizado también puede estar dentro de un intervalo definido mediante cualquier combinación de intervalos mencionados anteriormente.
Si se llevó a cabo el tratamiento térmico presurizado con una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, es decir, si la presión del tratamiento térmico presurizado fuera una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, podría considerarse basándose en, por ejemplo, el cambio en el pH del caldo de fermentación antes y después del tratamiento térmico presurizado. Es decir, el pH del caldo de fermentación aumenta si se genera gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación. Así, por ejemplo, cuando el valor aumentado del pH del caldo de fermentación observado tras llevar a cabo el tratamiento térmico presurizado bajo una determinada presión es de 0,3 o menos, 0,2 o menos, 0,1 o menos o 0,05 o menos, la determinada presión puede considerarse como una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación. Además, si se llevara a cabo el tratamiento térmico presurizado con una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, es decir, si la presión del tratamiento térmico presurizado fuera una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, puede confirmarse, por ejemplo, confirmando la presencia o ausencia de espumación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación tras el tratamiento térmico presurizado. Es decir, cuando no se observa espumación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación tras llevar a cabo el tratamiento térmico presurizado bajo una determinada presión, la determinada presión puede considerarse como una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación.
La temperatura del tratamiento térmico presurizado tampoco está limitada tal como se define en las reivindicaciones, siempre que se obtenga un efecto de evitación de la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida. La temperatura del tratamiento térmico presurizado es mayor que la temperatura del caldo de fermentación obtenido mediante la etapa de fermentación, es decir, mayor que la temperatura del cultivo. La temperatura del tratamiento térmico presurizado puede ser una temperatura a la que se esteriliza el microorganismo productor de aminoácido básico en el caldo de fermentación. Es decir, el tratamiento térmico presurizado también puede servir como un tratamiento de esterilización. La temperatura del tratamiento térmico presurizado es de 60°C o mayor y, por ejemplo, puede ser de 80°C o mayor, 100°C o mayor, 105°C o mayor, 110°C o mayor, 115°C o mayor, 120°C o mayor o 125°C o mayor. La temperatura del tratamiento térmico presurizado también puede ser, por ejemplo, de 60°C a 130°C, de 80°C a 130°C, de 100°C a 130°C, de 110°C a 130°C o de 115°C a 125°C.
Los medios para llevar a cabo el tratamiento térmico presurizado no están particularmente limitados. El tratamiento térmico presurizado puede llevarse a cabo en un recipiente apropiado con el que puedan lograrse el calentamiento y la presurización. Un recipiente de este tipo también se denomina “recipiente de presión”. El tratamiento térmico presurizado se lleva a cabo en condiciones en las que no hay presente sustancialmente fase gaseosa en el recipiente de presión. Es decir, dicho de otro modo, el tratamiento térmico presurizado se lleva a cabo en condiciones en las que el recipiente de presión está sustancialmente lleno con el caldo de fermentación. La expresión “no hay presente sustancialmente fase gaseosa en un recipiente de presión” significa que el volumen de una fase gaseosa presente en el recipiente de presión tras el tratamiento térmico presurizado es del 1% v/v o menor, del 0,5% v/v o menor, del 0,1% v/v o menor o 0 del volumen interno del recipiente sellado. El tratamiento térmico presurizado puede llevarse a cabo, por ejemplo, suministrando el caldo de fermentación bajo presurización al recipiente de presión, o presurizando el caldo de fermentación llenado en el recipiente de presión usando un pistón o similares. En este momento, se calienta el caldo de fermentación en el recipiente de presión. Por ejemplo, el caldo de fermentación puede calentarse usando una función de calentamiento equipada en el recipiente de presión, o el caldo de fermentación puede calentarse junto con el recipiente de presión desde el exterior del recipiente de presión usando un equipo de calentamiento externo. La forma y el tipo del recipiente de presión no están particularmente limitados. Los ejemplos del recipiente de presión incluyen una tubería o un tubo de retención (una tubería o un tubo para retener un objeto en los mismos) y un tanque. Es decir, por ejemplo, es suficiente que el caldo de fermentación se suministre al recipiente de presión, tal como una tubería o un tubo de retención, con una presión de alimentación de líquido igual a o mayor que la presión requerida. La introducción del caldo de fermentación al recipiente de presión y la descarga del caldo de fermentación a partir del recipiente de presión pueden llevarse a cabo de manera intermitente o continua, de modo que se obtenga un determinado tiempo de retención (periodo de tratamiento). Es decir, el tratamiento térmico presurizado puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un método continuo o un método discontinuo. Al llevar a cabo el tratamiento térmico presurizado con una presión igual a o mayor que la presión requerida, puede evitarse la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación. Cuando el tratamiento térmico presurizado se lleva a cabo mediante un método continuo, evitando la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, también se obtiene un efecto adicional de que puede mantenerse constante la velocidad de flujo.
El periodo del tratamiento térmico presurizado no está particularmente limitado, siempre que se obtenga un efecto de evitación de la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida. El periodo puede determinarse de manera apropiada según diversas condiciones, tales como la temperatura y la presión del tratamiento térmico presurizado. El periodo del tratamiento térmico presurizado puede ser un periodo con el que se esteriliza el microorganismo productor de aminoácido básico en el caldo de fermentación. El periodo del tratamiento térmico presurizado puede ser de, por ejemplo, 30 segundos o más largo, 1 minuto o más largo, 2 minutos o más largo, 3 minutos o más largo, 5 minutos o más largo o 10 minutos o más largo, puede ser de 120 minutos o más corto, 90 minutos o más corto, 60 minutos o más corto, 30 minutos o más corto o 15 minutos o más corto, o puede estar dentro de un intervalo definido por cualquier combinación de estos intervalos. El periodo del tratamiento térmico presurizado también puede ser, por ejemplo, de 30 segundos a 60 minutos, de 1 minuto a 30 minutos o de 2 minutos a 15 minutos. Cuando el tratamiento térmico presurizado se lleva a cabo mediante un método continuo, es suficiente que se determine la velocidad de flujo de modo que se obtenga un determinado periodo de tratamiento.
Mediante el tratamiento térmico presurizado, puede evitarse la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida. El término “cantidad de un aminoácido básico contenida” se refiere a la cantidad, tal como la concentración, del aminoácido básico contenida en el caldo de fermentación. Los ejemplos de la “evitación de la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida” incluyen la evitación de la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida durante el tratamiento térmico presurizado y después del tratamiento térmico presurizado. Los ejemplos específicos de la “evitación de la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida” incluyen la evitación de la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida tras el calentamiento durante el tratamiento térmico presurizado y el calentamiento después del tratamiento térmico presurizado. Los ejemplos específicos de la “evitación de la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida después del tratamiento térmico presurizado” incluyen la evitación de la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida tras llevar a cabo un tratamiento, tal como descarboxilación, después del tratamiento térmico presurizado. La evitación de la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida después del tratamiento térmico presurizado puede deberse a la esterilización del microorganismo productor de aminoácido básico en el caldo de fermentación durante el tratamiento térmico presurizado.
Mediante el tratamiento térmico presurizado, se obtiene un caldo de fermentación tratado con el tratamiento térmico presurizado (caldo de fermentación tratado térmicamente presurizado).
<4> Otros tratamientos
El caldo de fermentación tratado térmicamente presurizado puede someterse adicionalmente a otro tratamiento. Los ejemplos del otro tratamiento incluyen descarboxilación, retirada de células, purificación, concentración y secado. Estos tratamientos pueden llevarse a cabo independientemente o en cualquier combinación apropiada. La expresión “un caldo de fermentación tratado térmicamente presurizado se somete adicionalmente a otro tratamiento” no se limita a casos en los que el caldo de fermentación tratado térmicamente presurizado en sí mismo se somete a otro tratamiento, sino que también incluye casos en los que un producto sometido a tratamiento adicional del caldo de fermentación tratado térmicamente presurizado se somete a otro tratamiento. Es decir, por ejemplo, la expresión “un caldo de fermentación tratado térmicamente presurizado se somete adicionalmente a un tratamiento de descarboxilación” no se limita a casos en los que el caldo de fermentación tratado térmicamente presurizado en sí mismo se somete a un tratamiento de descarboxilación, sino que también incluye casos en los que el caldo de fermentación tratado térmicamente presurizado se somete a un tratamiento distinto de tratamiento de descarboxilación, tal como retirada de células, y luego se somete a un tratamiento de descarboxilación. En la presente invención, el término “producto de fermentación” incluye el caldo de fermentación tratado térmicamente presurizado en sí mismo y cualquier producto obtenido a partir del mismo y que contiene el aminoácido básico. Los ejemplos específicos del “producto de fermentación” incluyen el caldo de fermentación (en el presente documento, el caldo de fermentación tratado térmicamente presurizado), un sobrenadante del caldo de fermentación, productos de descarboxilación del mismo, productos concentrados del mismo, productos secados del mismo y productos procesados del mismo. Los ejemplos específicos de tales productos secados o procesados incluyen productos granulados secados que contienen el aminoácido básico.
El tratamiento de descarboxilación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante calentamiento, concentración, despresurización, reducción del pH o una combinación de los mismos. Los medios para el tratamiento de descarboxilación pueden seleccionarse de manera apropiada según, por ejemplo, diversas condiciones, tales como el tipo del producto que va a producirse. Como medios para el tratamiento de descarboxilación, particularmente, el calentamiento es un ejemplo preferido. Cuando el tratamiento de descarboxilación se lleva a cabo mediante un medio distinto de despresurización, el tratamiento de descarboxilación puede llevarse a cabo, por ejemplo, a presión atmosférica (es decir, en un sistema abierto). Cuando el tratamiento de descarboxilación se lleva a cabo mediante calentamiento, la temperatura de calentamiento no está particularmente limitada y puede ser, por ejemplo, de 40°C a 100°C, preferiblemente de 60°C a 90°C. Cuando el tratamiento de descarboxilación se lleva a cabo mediante despresurización, la presión en la fase gaseosa durante la despresurización no está particularmente limitada y puede ser de, por ejemplo, 600 kPa o menor, preferiblemente de 40 kPa a 200 kPa, en cuanto a presión absoluta. Una reducción del pH puede llevarse a cabo mediante la adición de un ácido fuerte, tal como ácido clorhídrico. Mediante el tratamiento de descarboxilación, pueden eliminarse sustancias de dióxido de carbono, tales como iones bicarbonato e iones carbonato, a partir del caldo de fermentación. Es decir, el término “producto de descarboxilación” se refiere a un producto a partir del cual se han eliminado sustancias de dióxido de carbono, tales como iones bicarbonato e iones carbonato. Cuando el tratamiento de descarboxilación se lleva a cabo mediante un medio distinto de reducción del pH, el pH aumenta debido a la descarboxilación. Sin embargo, se espera que se evite suficientemente la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida en el caldo de fermentación después del tratamiento térmico presurizado incluso si aumenta el pH.
El tratamiento de retirada de células puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración o una combinación de las mismas.
La recogida (purificación) del aminoácido básico puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos usados para la separación y purificación de compuestos. Los ejemplos de tales métodos incluyen, por ejemplo, método de resina de intercambio iónico, método de tratamiento con membrana, método de precipitación y método de cristalización. Estos métodos pueden usarse independientemente o en cualquier combinación apropiada. Cuando el aminoácido básico también se acumula en células del microorganismo, por ejemplo, las células pueden alterarse con ondas ultrasónicas o similares, puede obtenerse un sobrenadante retirando las células a partir de la suspensión con células alteradas mediante centrifugación, y el aminoácido básico puede recogerse a partir del sobrenadante mediante el método de resina de intercambio iónico o similares. Cuando el aminoácido básico precipita en el medio de cultivo, puede recogerse mediante centrifugación, filtración o similares. El aminoácido básico precipitado en el medio de cultivo también puede recogerse junto con el aminoácido básico que se disuelve en el medio de cultivo, después de que cristalice el aminoácido básico que se disuelve en el medio de cultivo. El aminoácido básico que va a recogerse puede ser un compuesto libre, una sal del mismo o una mezcla de los mismos. Es decir, en la presente invención, el término “aminoácido básico” puede referirse al aminoácido como compuesto libre, a una sal del mismo o a una mezcla de los mismos. Los ejemplos de la sal incluyen, por ejemplo, carbonato, bicarbonato, clorhidrato y sulfato.
El aminoácido básico recogido puede contener, por ejemplo, componentes tales como células microbianas, componentes del medio de cultivo, humedad y metabolitos subproductos del microorganismo, además del aminoácido básico. El aminoácido básico también puede purificarse en un grado deseado. La pureza del aminoácido básico recogido puede ser de, por ejemplo, el 30% (p/p) o mayor, el 50% (p/p) o mayor, el 70% (p/p) o mayor, el 80% (p/p) o mayor, el 90% (p/p) o mayor o el 95% (p/p) o mayor.
El aminoácido básico puede proporcionarse como, por ejemplo, un producto granulado secado que contiene el aminoácido básico. Por ejemplo, puede proporcionarse L-lisina como, por ejemplo, un producto granulado secado que contiene L-lisina.
Los ejemplos de métodos para producir un producto granulado secado que contiene L-lisina incluyen el método descrito en la patente estadounidense n.° 7.416.740. Específicamente, puede producirse un producto granulado secado que contiene L-lisina usando un caldo de fermentación de L-lisina que tiene una razón equivalente de anión/L-lisina de 0,68 a 0,95, preferiblemente de 0,68 a 0,90, más preferiblemente de 0,68 a 0,86 como materia prima. El término “razón equivalente de anión/L-lisina” se refiere a un valor calculado basándose en la siguiente ecuación a partir de las cantidades de L-lisina (L-Lys), ion sulfato, ion cloruro, ion amonio, ion sodio, ion potasio, ion magnesio e ion calcio contenidas. En la ecuación, “[]” representa la concentración molar.
Razón equivalente de anión/L-lisina = (2x[S042-]+[C|-]-[NH4+H N a+H K ]-2x[Mg2+]-2x[Ca2+])/[L-Lys]
Es decir, la razón equivalente de anión/L-lisina del caldo de fermentación de L-lisina tratado térmicamente presurizado puede ajustarse para estar dentro del intervalo ejemplificado anteriormente según se requiera, y luego puede producirse un producto granulado secado que contiene L-lisina. La razón equivalente de anión/L-lisina puede aumentarse, por ejemplo, mediante la adición de ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, la adición de una disolución acuosa de L-lisina que tiene una alta razón equivalente de anión/L-lisina (por ejemplo, mayor de 0,95) o una combinación de los mismos. Los ejemplos de la disolución acuosa de L-lisina que tiene una razón equivalente de anión/L-lisina mayor de 0,95 incluyen disoluciones acuosas de L-lisina cuyo pH es de neutro a ácido, tales como disoluciones acuosas de L-lisina que pueden obtenerse mediante un método de fermentación distinto de la fermentación con carbonato. La razón equivalente de anión/L-lisina puede disminuirse, por ejemplo, mediante la adición de una disolución acuosa de L-lisina que tiene una baja razón equivalente de anión/L-lisina (por ejemplo, menor de 0,68). Los ejemplos de la disolución acuosa de L-lisina que tiene una razón equivalente de anión/L-lisina menor de 0,68 incluyen una disolución acuosa de base de L-lisina (L-lisina como compuesto libre). Además, el caldo de fermentación de L-lisina tratado térmicamente presurizado puede someterse a un tratamiento, tal como descarboxilación y concentración, y luego usarse para la producción de un producto granulado secado. Mediante este método, se obtiene un producto granulado secado que contiene L-lisina y que tiene una razón equivalente de anión/L-lisina de 0,68 a 0,95, preferiblemente de 0,68 a 0,90, más preferiblemente de 0,68 a 0,86. La cantidad de L-lisina contenida en este producto granulado secado puede ser, por ejemplo, del 40 al 85%, preferiblemente del 50 al 85%, más preferiblemente del 60 al 85% en peso con respecto al sólido total en este producto granulado secado. El contenido de humedad de este producto granulado secado puede ser, por ejemplo, del 5% o menor en peso con respecto a la cantidad total de este producto granulado secado. La producción de un producto granulado secado a partir del caldo de fermentación de L-lisina tratado térmicamente presurizado puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos usados para la producción de un producto granulado secado que contiene un L-aminoácido. Los ejemplos de tales métodos incluyen, por ejemplo, un método de solidificar un caldo de fermentación y luego someter el producto solidificado a granulación y un método de granular directamente y secar un caldo de fermentación usando un inóculo (documento US 7.416.740).
Ejemplos
A continuación en el presente documento, la presente invención se explicará más específicamente con referencia a los ejemplos.
Ejemplo de referencia 1: dependencia de la temperatura de la disminución de la concentración de lisina en el caldo de fermentación de lisina
Se llevó a cabo la fermentación con carbonato, según el método descrito en el documento US2002-025564A, para obtener un caldo de fermentación de pH 8,3 que contenía lisina (también denominado “caldo de fermentación de lisina”). Se colocó el caldo de fermentación de lisina en un reactor y se agitó a 20°C, 40°C o 60°C, y se confirmó la transición de la concentración de lisina. Los resultados se muestran en la tabla 1. En la tabla, la concentración de lisina se muestra como un valor relativo con respecto a la concentración inicial de lisina (= concentración de lisina / concentración inicial de lisina). Una mayor temperatura dio como resultado un avance más rápido de la disminución de la concentración de lisina, y se redujo la tasa de disminución con el paso del tiempo. Se midió la concentración de lisina con HPLC (lo mismo se aplica a continuación en el presente documento).
Tabla 1: transición de la concentración de lisina
Figure imgf000027_0001
Ejemplo de referencia 2: dependencia del pH de la diminución de la concentración de lisina en el caldo de fermentación de lisina
Se añadió HCl al caldo de fermentación de lisina (pH 8,3) obtenido en el ejemplo de referencia 1 para preparar caldos de fermentación de lisina de pH 4,5, pH 5,5 y pH 7,0. Se agitaron cada uno del caldo de fermentación de lisina (pH 8,3) y los caldos de fermentación de lisina con el pH ajustado (pH 4,5, pH 5,5 y pH 7,0) a 60°C, y se confirmó la transición de la concentración de lisina. Los resultados se muestran en la tabla 2. En la tabla, la concentración de lisina se muestra como un valor relativo con respecto a la concentración inicial de lisina (= concentración de lisina / concentración inicial de lisina). Un mayor pH dio como resultado un avance más rápido de la disminución de la concentración de lisina y no hubo disminución de la concentración de lisina a pH 5,5 o menor.
Tabla 2: Transición de la concentración de lisina
Figure imgf000027_0002
Ejemplo 1: supresión de la disminución de la concentración de lisina a alta presión
Se sometió el caldo de fermentación de lisina (pH 8,3) obtenido en el ejemplo de referencia 1 a un tratamiento térmico presurizado en una tubería de retención (tubo de retención) en las siguientes condiciones: a una temperatura de 60°C a una presión de 0,1 MPa, a una temperatura de 120°C a una presión de 0,2 MPa o a una temperatura de 120°C a una presión de 1,5 MPa, y se confirmaron la transición de la concentración de lisina antes y después del tratamiento y el pH antes y después del tratamiento. Los resultados se muestran en la tabla 3. En la tabla, la concentración de lisina se muestra como un valor relativo con respecto a la concentración inicial de lisina (= concentración de lisina / concentración inicial de lisina). En las condiciones con una temperatura de 60°C y una presión de 0,1 MPa (condiciones experimentales 1 y 2) y las condiciones con una temperatura de 120°C y una presión de 0,2 MPa (condiciones experimentales 2, 3, 4, 5, 6 y 7), hubo una disminución de la concentración de lisina. En cambio, en las condiciones con una temperatura de 120°C y una presión de 1,5 MPa (condiciones experimentales 8 y 9), se suprimió la disminución de la concentración de lisina. Se mostró que se generó gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación de lisina en las condiciones con una temperatura de 60°C y una presión de 0,1 MPa (condiciones experimentales 1 y 2) y las condiciones con una temperatura de 120°C y una presión de 0,2 MPa (condiciones experimentales 2, 3, 4, 5, 6 y 7), puesto que se observó un aumento del pH. En cambio, se mostró que se evitó la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación de lisina en las condiciones con una temperatura de 120°C y una presión de 1,5 MPa (condiciones experimentales 8 y 9), puesto que no se observó ningún aumento del pH. A partir de lo anterior, se reveló que al someter un caldo de fermentación que puede obtenerse mediante fermentación con carbonato y que contiene un aminoácido básico a un tratamiento térmico bajo una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, puede evitarse la disminución de la cantidad del aminoácido básico contenida en el caldo de fermentación durante el tratamiento térmico.
Tabla 3
Figure imgf000028_0001
Temp., Temperatura
Pres., Presión
Conc. de Lys, Concentración de lisina (concentración / concentración inicial)
Cond., Condiciones experimentales
Ejemplo 2: cálculo de la presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación de lisina
Se calculó la presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación de lisina usando una ecuación según los siguientes procedimientos.
<1> Simulación del pH
La presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación depende del estado disociativo de cada ion contenido en el caldo de fermentación. El estado disociativo de cada ion contenido en el caldo de fermentación depende del pH del caldo de fermentación. Así, para calcular la presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, es necesario determinar el pH del caldo de fermentación para determinar el estado disociativo de cada ion contenido en el caldo de fermentación. El pH del caldo de fermentación puede depender de la temperatura del caldo de fermentación. Sin embargo, la medición del pH en condiciones con una temperatura superior a 100°C requiere un aparato sellado resistente a la presión, la medición directa del pH del caldo de fermentación en tales condiciones de alta temperatura es difícil. Por tanto, en primer lugar, se derivó una ecuación para calcular el pH del caldo de fermentación a cada temperatura.
<1 -1> Relación entre la constante de disociación del ácido K y la temperatura
La relación mostrada en la siguiente ecuación (1) se mantiene para la energía libre de Gibbs y la constante de equilibrio (constante de disociación del ácido K).
AG = - R T x \n K • • • ( 1 )
La relación mostrada en la siguiente ecuación (2) se mantiene para la energía libre de Gibbs y el cambio de entalpia.
Figure imgf000029_0001
Se obtuvo la siguiente ecuación (3) a partir de las ecuaciones (1) y (2). La ecuación (3) indica que la constante de disociación del ácido K es una función de la temperatura.
Figure imgf000029_0002
Así, para Lys y CO2 entre los iones contenidos en el caldo de fermentación de lisina, en el que se supone que Lys y CO2 afectan significativamente al cálculo de la presión requerida cuando el equilibrio de disociación cambia de una región de pH neutra a débilmente alcalina dependiendo de la temperatura, se usaron los valores de pK mostrados en las siguientes ecuaciones (4-1) a (4-5) (L. N. Plummer y E. Busenberg. Geochim. Cosmochim. Acta 46, 1011-1040 (1982)) como los valores de pK que incluyen un factor de temperatura. Mediante la reorganización de las ecuaciones (4-1) a (4-5), se obtiene la constante de disociación del ácido K como una función de la temperatura.
Figure imgf000029_0004
)
ln Kco , = -248,4208 U86~’511 38,92561 x ln Temp{K]~ 0,0749001 x Temp\K]- 1298907 • (4-5)
Temp[K\ \Temp[K\f
<1-2> Simulación del pH
Se simuló el pH usando las constantes de disociación del ácido K de Lys y CO2 obtenidas anteriormente. Para la simulación, también se usaron las concentraciones de NH3, K, Mg, Cl, SO4, ácido acético y ácido succínico, que pueden estar contenidos en el caldo de fermentación de lisina en grandes cantidades, así como de Lys y CO2. Aunque se supuso que cada una de las constantes de disociación del ácido K de NH3 y de los ácidos orgánicos también son una función de la temperatura, en la simulación, se trató el NH3 como si pKnh3 fuera de 9,24 (valor constante) y se trataron cada uno de los ácidos orgánicos como ácido fuerte monovalente.
Puesto que la concentración total de iones en una disolución cumple la neutralidad eléctrica, se obtiene la siguiente ecuación (5). En la ecuación, cada “C” representa la concentración molar (lo mismo se aplica a continuación en el presente documento).
Figure imgf000029_0003
Cada concentración de ion de lisina en la ecuación (5) se calcula a partir de las siguientes ecuaciones (6-1) a (6-3). En las ecuaciones, KLys,1, KLys,2 y KLys,3 son funciones de la temperatura obtenidas a partir de las ecuaciones (4-1) a (4-3). En las ecuaciones, “CLys” representa la concentración molar total de lisina, es decir, la concentración molar total de molécula de lisina (lisina que no está ionizada) e ion de lisina.
Figure imgf000030_0001
Las concentraciones de ion carbonato e ion bicarbonato en la ecuación (5) se calculan a partir de las siguientes ecuaciones (7-1) a (7-2). En las ecuaciones, Kco2,i y Kco2,2 son funciones de la temperatura obtenidas a partir de las ecuaciones (4-4) a (4-5). En las ecuaciones, “Cco2 “ representa la concentración molar total de sustancias de dióxido de carbono, es decir, la concentración molar total de molécula de dióxido de carbono, molécula de ácido carbónico, ion carbonato e ion bicarbonato.
Figure imgf000030_0002
Se obtuvo la solución (Ch+) de la ecuación (5) usando el método de Newton. Específicamente, se diferenció la ecuación (5) y se repitió el cálculo de Ch+ con Excel, para calcular una Ch+ estacionaria.
Es decir, se obtuvo la siguiente ecuación (8) diferenciando la ecuación (5).
Figure imgf000030_0003
Cada parámetro en la ecuación (8) se calcula a partir de las siguientes ecuaciones (9-1) a (9-8).
Figure imgf000031_0001
A partir de las soluciones de las ecuaciones (5) y (8), se repitió el cálculo mencionado anteriormente basándose en la siguiente ecuación (10) hasta que Ch+ fuera constante. El cálculo de Ch+ estacionaria se lleva a cabo para cada composición del caldo de fermentación y cada temperatura. Es decir, en el presente documento, se calculó la Ch+ estacionaria a cada temperatura para el caldo de fermentación de lisina obtenido en el ejemplo de referencia 1 (la composición se muestra en la tabla 4 descrita más adelante). En la figura 1 se muestra un cambio de Ch+ cuando se lleva a cabo el cálculo repetido para este caldo de fermentación de lisina a 35°C.
Figure imgf000031_0002
Finalmente, se calculó el pH basándose en la siguiente ecuación (11) usando el valor de Ch+ confirmado como estacionario. Es decir, en el presente documento, se calculó el pH a cada temperatura para el caldo de fermentación de lisina obtenido en el ejemplo de referencia 1 (la composición se muestra en la tabla 4 descrita más adelante).
<1-3> Verificación de los resultados de la simulación del pH
Se ajustó la temperatura del caldo de fermentación de lisina obtenido en el ejemplo de referencia 1 (la composición se muestra en la tabla 4 descrita más adelante) con un baño de aceite de 120°C y se midió el pH cuando la temperatura alcanzó una determinada temperatura (25, 35, 42, 53, 60 y 70°C). Puesto que se consideró que la composición del caldo de fermentación cambia si se gasifica el HCO3 contenido en el caldo de fermentación debido al calentamiento, se llevó a cabo la medición del pH dentro de un intervalo de temperatura en el que no se observaba espumación. Específicamente, en este experimento, se estableció el límite superior a 70°C puesto que, aparentemente, se observaba espumación en condiciones con una temperatura de 70°C o mayor. En la figura 2 se muestran los valores medidos y los valores simulados. La diferencia entre los valores medidos y los valores simulados fue de 0,1 o menor, es decir, se observó una fuerte correlación entre ellos. A partir de lo anterior, se consideró que la exactitud de esta simulación del pH es suficientemente alta, y puede determinarse de manera aproximada el pH del caldo de fermentación de lisina a cada temperatura mediante esta simulación del pH.
<2> Construcción del simulador de presión requerida
<2-1> Suposición para construir el modelo de simulación de la presión requerida
Se estableció un método para calcular de manera aproximada el pH basándose en la composición del caldo de fermentación en <1>. Como resultado, usando el valor de pK, que es una función de la temperatura, y la simulación del pH a una temperatura prevista, puede calcularse el estado disociativo de Lys a la temperatura prevista. Como ejemplo, en la figura 3 se muestran curvas de disociación de Lys a 38°C y 120°C. Por ejemplo, en el caso de pH 8, aunque aproximadamente el 80% de Lys está cargada eléctricamente como Lys+ a 38°C, la razón de abundancia (tasa de existencia) de Lys+ y Lys± cambia a aproximadamente 1:1 a 120°C.
A partir de los resultados del análisis del estado disociativo, se obtuvieron las siguientes suposiciones (1) y (2).
<Suposición (1)>
Puesto que Lys está contenida en una gran cantidad en el caldo de fermentación de lisina, los iones HCO3 se disuelven en el caldo de fermentación como contraiones de los iones de Lys en el caso de pH 8 a 38°C. En cambio, cuando el caldo de fermentación de lisina se calienta hasta 120°C, aproximadamente la mitad de la Lys pierde la carga eléctrica para quedar presente como Lys± y, por tanto, se generan iones HCO3 que no retienen Lys como contraiones. Se supuso que se gasificaron estos iones HCO3 que no retenían Lys. En la figura 4 se muestran imágenes del balance de iones a 38°C y 120°C.
<Suposición (2)>
Se sabe que la ley de Henry se mantiene para una disolución diluida que contiene un soluto volátil. Se supuso que la ley de Henry también se mantiene para el caldo de fermentación de lisina.
<2-2> Construcción del modelo de simulación de la presión requerida
Suponiendo que, basándose en las suposiciones (1) y (2), la ley de Henry se mantiene para los iones HCO3 que perdieron contraiones debido al calentamiento, se construyó un modelo de simulación para calcular una presión requerida para evitar la gasificación de estos iones HCO3. Se construyó el modelo de simulación para 120°C.
<2-2-1> Cálculo del estado disociativo de Lys a 120°C
En la figura 5 se muestra el estado disociativo de Lys a 120°C. Puesto que el pH del caldo de fermentación de lisina usado para la simulación es de 7 a 7,5 a 120°C (figura 2), se calculó la razón de abundancia de Lys+ a un determinado pH desde pH 7 hasta pH 7,5 basándose en la siguiente ecuación usando el estado disociativo de Lys a pH 7 como referencia, suponiendo que la curva de disociación puede aproximarse de manera lineal dentro de un intervalo de desde pH 7 hasta pH 7,5. El término “razón de abundancia de Lys+” se refiere a la razón (razón molar) de Lys+ con respecto a la cantidad total de lisina.
Figure imgf000032_0001
<2-2-2> Cálculo de la razón de abundancia de iones HCO3 que no retienen contraiones
Se calculó la razón de abundancia de iones HCO3 que no retienen contraiones en el caldo de fermentación de lisina calentado hasta 120°C basándose en la siguiente ecuación. En la ecuación, “concentración de HCO3” representa la concentración total de iones HCO3, es decir, la concentración total de iones HCO3 que retienen contraiones e iones HCO3 que no retienen contraiones. La “concentración de HCO3” puede medirse, por ejemplo, mediante cromatografía iónica. En las ecuaciones, “concentración de Lys” representa la concentración total de lisina, incluyendo tanto la lisina que está ionizada como la lisina que no está ionizada. El término “razón de abundancia de iones HCO3 que no retienen contraiones” se refiere a la razón (razón molar) de iones HCO3 que no retienen contraiones con respecto a la cantidad total de iones HCO3. El término “ iones HCO3 que no retienen contraiones” a la que se hace referencia en el presente documento se refiere a iones HCO3 que perdieron los contraiones debido al calentamiento.
Razón de abundancia de iones H C 03 que no retienen contraiones=
concentración de H C 03 concentración de Lys -p
61 146,19X -
Figure imgf000033_0001
concentración de H C 03
61
<2-2-3> Cálculo de la presión parcial de dióxido de carbono Pco2
Se calculó la presión parcial de dióxido de carbono Pco2 basándose en la siguiente ecuación usando la constante de Henry a 120°C (Aleksander Dhima, Jean-Charles de Hemptinne y Jacques Jose, Ind. Eng. Chem. Res. 1999, 38, 3144­ 3161).
Figure imgf000033_0002
<2-2-4> Cálculo de la presión parcial de vapor de agua
Se calculó la presión parcial de vapor de agua Ph2o basándose en la siguiente ecuación usando la ecuación de Wagner.
Figure imgf000033_0003
<2-2-5> Cálculo de la presión requerida
Se calculó la presión requerida P basándose en la siguiente ecuación.
Ejemplo 3: verificación comparativa de valores experimentales y valores calculados de presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación de lisina
<1> Cálculo de valores calculados
Para el caldo de fermentación de lisina (pH 8,3) obtenido en el ejemplo de referencia 1, se calculó la presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación en un intervalo de desde 60°C hasta 130°C basándose en la ecuación mostrada en el ejemplo 2. La composición de este caldo de fermentación de lisina se muestra en la tabla 4.
Tabla 4: composición del caldo de fermentación [%]
Figure imgf000034_0002
<2> Medición de valores experimentales
Se colocó el caldo de fermentación de lisina (pH 8,3) obtenido en el ejemplo de referencia 1 en un reactor de alta presión y alta temperatura (TEM-V, Taiatsu Techno), de modo que la porosidad del aparato (la razón de la fase gaseosa) se volvió del 6% v/v, se selló y se calentó hasta 60°C, 80°C, l0o°C, 105°C, 1l0°C, 1l5°C, 120°C, 125°C y 130°C. Se midió la presión de la fase gaseosa a cada una de esas temperaturas y se consideró como la presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación a esa temperatura.
<3> Comparación entre los valores experimentales y los valores calculados
En la figura 6 se muestran los valores calculados y los valores experimentales. Los valores calculados y los valores experimentales concordaron bien entre sí. Por tanto, se indicó que la ecuación mostrada en el ejemplo 2 puede usarse para calcular la presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación.
Ejemplo 4: ejemplo de cálculo de la presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación de lisina
Para un caldo de fermentación de lisina modelo (concentración de lisina, 11 g/dl; pH 9,0) mostrado en la tabla 5, se calculó la presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación en un intervalo de desde 25°C hasta 130°C basándose en la ecuación mostrada en el ejemplo 2. Se convirtieron los resultados del cálculo a una ecuación aproximada y en la figura 7 se muestra la ecuación aproximada obtenida. En el caso del caldo de fermentación de lisina modelo usado en este ejemplo (concentración de lisina, 11 g/dl; pH 9,0), puesto que el pH es mayor y la concentración de lisina es menor que en el caso del caldo de fermentación de lisina usado en el ejemplo 3 (concentración de lisina, 13,93 g/dl; pH 8,3), la concentración de CO2 requerido es baja y, por tanto, también se calculó que la presión requerida para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación de lisina era baja. Según esta ecuación aproximada, la presión requerida se expresó de la siguiente manera.
Presión requerida (kPa) = 1,99 x 10~3 x temperatura254
Tabla 5: composición del caldo de fermentación [%]
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0002
Ejemplo 5: supresión de la disminución de la concentración de lisina durante la descarboxilación después del tratamiento térmico presurizado
Se colocó el caldo de fermentación de lisina (pH 8,3) obtenido en el ejemplo de referencia 1 en un reactor, se sometió a un tratamiento térmico presurizado en una tubería de retención (tubo de retención) a 120°C y 0,1 MPa y luego se calentó a 60°C durante 24 horas a presión atmosférica. Como control, se calentó el caldo de fermentación de lisina (pH 8,3) obtenido en el ejemplo de referencia 1 a 60°C durante 24 horas a presión atmosférica sin someter a ningún tratamiento térmico presurizado. Se confirmó la transición de la concentración de lisina para cada condición. Los resultados se muestran en la tabla 6. Se mostró que al someter el caldo de fermentación a un tratamiento térmico presurizado, puede suprimirse la disminución de la concentración de lisina durante un procedimiento de purificación posterior.
Tabla 6: efecto de tratamiento a alta temperatura y alta presión sobre la disminución de la concentración de lisina
Figure imgf000035_0001
Aplicabilidad industrial
Según la presente invención, puede evitarse una disminución de la cantidad de un aminoácido básico contenida en un caldo de fermentación que puede obtenerse mediante fermentación con carbonato y, por tanto, puede producirse eficazmente el aminoácido básico o un producto de fermentación que contiene el mismo.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Método para producir un aminoácido básico o un producto de fermentación que contiene el aminoácido básico, comprendiendo el método las siguientes etapas (A) y (B):
    (A) una etapa de cultivar un microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico en un medio de cultivo, de modo que los iones bicarbonato y/o iones carbonato sirven como contraiones para el aminoácido básico, para obtener un caldo de fermentación que contiene el aminoácido básico, en el que la etapa se lleva a cabo de modo que la concentración total de amoniaco en el medio de cultivo se controla a 300 mM o menor durante al menos un periodo parcial de cultivo;
    (B) una etapa de someter el caldo de fermentación a un tratamiento térmico bajo una presión suficiente para evitar la generación de gas de dióxido de carbono a partir del caldo de fermentación, en el que la temperatura del tratamiento térmico es de 60°C o mayor.
  2. 2. Método según la reivindicación 1,
    en el que la presión es una presión igual a o mayor que el valor total de la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de vapor de agua a la temperatura del tratamiento térmico en cuanto a presión manométrica, y
    en el que la presión parcial de dióxido de carbono es un valor determinado usando las concentraciones del aminoácido básico, CO2, NH3, K, Mg, Cl, SO4, ácido acético y ácido succínico en el caldo de fermentación y la temperatura del tratamiento térmico como variables.
  3. 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la presión es una presión igual a o mayor que la presión mostrada en la siguiente ecuación en cuanto a presión manométrica:
    Presión (kPa) = 1,99 x 10-3 x tem peratura2-54
    en el que “temperatura” en la ecuación representa la temperatura (°C) del tratamiento térmico.
  4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la presión es una presión igual a o mayor que la presión de una fase gaseosa en un recipiente sellado observada cuando el caldo de fermentación se coloca en el recipiente sellado, de modo que la porosidad del aparato se vuelve del 6% v/v y se ajusta a la temperatura del tratamiento térmico en cuanto a presión manométrica.
  5. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la presión es de 400 kPa o mayor en cuanto a presión manométrica, en el que, opcionalmente, la presión es de 1000 kPa o mayor en cuanto a presión manométrica.
  6. 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la temperatura del tratamiento térmico es de 80°C a 130°C, en el que, opcionalmente, la temperatura del tratamiento térmico es de 100°C a 130°C.
  7. 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa (B) se lleva a cabo en un recipiente de presión en condiciones en las que no hay presente sustancialmente fase gaseosa en el recipiente de presión.
  8. 8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además una etapa de someter el caldo de fermentación tratado térmicamente a un tratamiento de descarboxilación.
  9. 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa (A) se lleva a cabo mientras se controla el pH del medio de cultivo a de 7,2 a 9,0 durante al menos un periodo parcial de cultivo.
  10. 10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa (A) se lleva a cabo de modo que el pH del medio de cultivo al finalizar el cultivo es de 7,2 o mayor.
  11. 11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa (A) se lleva a cabo de modo que los iones bicarbonato y/o iones carbonato están presentes en el medio de cultivo a una concentración de 20 mM o más durante al menos un periodo parcial de cultivo controlando que la presión interna de un tanque de fermentación sea positiva y/o suministrando gas de dióxido de carbono al medio de cultivo.
  12. 12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la etapa (A) se lleva a cabo de modo que la concentración de aniones distintos de iones bicarbonato y/o iones carbonato en el medio de cultivo es de 900 mM o menor.
  13. 13. Método según la reivindicación 11 ó 12, en el que la presión interna del tanque de fermentación es de 0,03 a 0,2 MPa en cuanto a presión manométrica.
  14. 14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el aminoácido básico es L-lisina.
  15. 15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el microorganismo es una bacteria corineforme o Escherichia coli.
  16. 16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el producto de fermentación se selecciona del caldo de fermentación, un sobrenadante del caldo de fermentación, un producto de descarboxilación del mismo, un producto concentrado del mismo, un producto secado del mismo y un producto procesado del mismo.
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