JPS6062983A - 発酵法によるｌ―ヒスチジンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ―ヒスチジンの製造法Info
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- JPS6062983A JPS6062983A JP17000683A JP17000683A JPS6062983A JP S6062983 A JPS6062983 A JP S6062983A JP 17000683 A JP17000683 A JP 17000683A JP 17000683 A JP17000683 A JP 17000683A JP S6062983 A JPS6062983 A JP S6062983A
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- recombinant dna
- dna
- bacteria
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明社、ヒスチジノールホスファターゼ（以下「Ｈ
Ｐ」と記す）遺伝子が組み込まれている組換えＤＮＡ
、数組換えＤＮＡを有する細菌及び該細菌を用いるＬ−
ヒスチジンの製造法に関する。
Ｐ」と記す）遺伝子が組み込まれている組換えＤＮＡ
、数組換えＤＮＡを有する細菌及び該細菌を用いるＬ−
ヒスチジンの製造法に関する。
Ｌ−ヒスチジン生成に関与する酵素の内、ヒスヒスチジ
ノールホスフエイトよ）生成する反応を触媒する酵素で
ある。
ノールホスフエイトよ）生成する反応を触媒する酵素で
ある。
我々は、大量のし一ヒスチジンを生産することが知られ
ているコリネＷ細菌に着目し、これをＤＮＡ細換え技術
を利用して更に生産性を高めるべく研究を開始した。そ
して、ついに上記Ｌ−ヒスチジン生産に関与するＩ（Ｐ
をコードする遺伝子（以下ｒＨＰ３ＩＬ伝子」と記す）
をコリネ型細菌より分離することに成功し、更にこれを
コリネ型細菌細胞内で増殖できるグラスミドベクターに
接続せしめて、コリネ型細菌細胞内に導入し、コリネ型
細菌のＬ−ヒスチジン生産性を著しく高めることに成功
した。
ているコリネＷ細菌に着目し、これをＤＮＡ細換え技術
を利用して更に生産性を高めるべく研究を開始した。そ
して、ついに上記Ｌ−ヒスチジン生産に関与するＩ（Ｐ
をコードする遺伝子（以下ｒＨＰ３ＩＬ伝子」と記す）
をコリネ型細菌より分離することに成功し、更にこれを
コリネ型細菌細胞内で増殖できるグラスミドベクターに
接続せしめて、コリネ型細菌細胞内に導入し、コリネ型
細菌のＬ−ヒスチジン生産性を著しく高めることに成功
した。
コリネ型細菌は好気性、グラム陽性桿菌であシ、非抗酸
性でパーデース・マニーアル・オブ・デタ−ミネティブ
バクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）に記載さ
れている。その内、特に以下に例示するよりなＬ−グル
タミン酸を大量に生産するものが知られていて、これら
はいずれも同−Ｍに属するものと考えられる。
性でパーデース・マニーアル・オブ・デタ−ミネティブ
バクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）に記載さ
れている。その内、特に以下に例示するよりなＬ−グル
タミン酸を大量に生産するものが知られていて、これら
はいずれも同−Ｍに属するものと考えられる。
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ１４０
２０ブレビバクゾリウム・ザラカロリティクム ＡＴＣ
Ｃ１４０６６ブレビバクテリウム・インマリオフィルム
ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ブレビバクテリウム・
ロゼラム ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・フ
ラバム ＡＴＣＣ１３８２６ブレビバクテリウム・チオ
グニタリス ＡＴＣＣ１９２４０コリネバクテリウム・
アセトアジドフィルム ＡＴＣＣ１３８７０コリネバク
テリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ１５８０６コ
リネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１コリ
ネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２，
１３０６０コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１
５９９０コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ
１７９６５ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
ＡＴＣＣ１５３５４コリネ型細菌には上記のようなグル
タミン酸生産性を有するもののほかに、グルタミン酸生
産性を失った変異株及び他の変異株も含まれる。
２０ブレビバクゾリウム・ザラカロリティクム ＡＴＣ
Ｃ１４０６６ブレビバクテリウム・インマリオフィルム
ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ブレビバクテリウム・
ロゼラム ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・フ
ラバム ＡＴＣＣ１３８２６ブレビバクテリウム・チオ
グニタリス ＡＴＣＣ１９２４０コリネバクテリウム・
アセトアジドフィルム ＡＴＣＣ１３８７０コリネバク
テリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ１５８０６コ
リネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１コリ
ネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２，
１３０６０コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１
５９９０コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ
１７９６５ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
ＡＴＣＣ１５３５４コリネ型細菌には上記のようなグル
タミン酸生産性を有するもののほかに、グルタミン酸生
産性を失った変異株及び他の変異株も含まれる。
ＨＰ遺伝子を分離する方法は、コリネ型細菌のＨＰ遺伝
子を有している株より、まず染色体遺伝子を抽出しく例
えばＨ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、Ｍｉｕｒａ ＋Ｂｉ
ｏｃｈａｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７２６１９（
１９６３）の方法が使用できる）、これを適当な制限酵
素で切断する。
子を有している株より、まず染色体遺伝子を抽出しく例
えばＨ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、Ｍｉｕｒａ ＋Ｂｉ
ｏｃｈａｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７２６１９（
１９６３）の方法が使用できる）、これを適当な制限酵
素で切断する。
ついで、コリネ型細菌で増殖し得るプラスミドベクター
に接続し、得られ先組換えＤＮＡを用いてコリネ型細菌
のＨＰ欠損変異株を形質転挨せしめ、ＨＰ生成活性を保
有するにいたった菌株を分離し、それよ、９ＨＰ遺伝子
を分離できる。
に接続し、得られ先組換えＤＮＡを用いてコリネ型細菌
のＨＰ欠損変異株を形質転挨せしめ、ＨＰ生成活性を保
有するにいたった菌株を分離し、それよ、９ＨＰ遺伝子
を分離できる。
染色体遺伝子を切断するには、切断反応時間等を調節し
て、切断の程度を調節すれば、巾広い棹類の制限酵素が
使用できる。
て、切断の程度を調節すれば、巾広い棹類の制限酵素が
使用できる。
本発明にて使用されるプラスミドベクターは、コリネ型
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示ずれば以下のものがある。
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示ずれば以下のものがある。
（１） ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９参照
（２ン ｐＡＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５参
照（３） ｐＡＪ ６５５ （、） 宿主菌：エシェリヒア・コ！Ｊ ＡＪ １１８
８２（ＦＥＲＭ−Ｐ ６５１７＝ＦＥＲＭ−ＢＰ １３
６など）（ｂ） 分子量＝６．６メガメルトン （Ｃ） 制限酵素切断地図二第１図参照（ｄ） 性 質
： ｐＡＭ ３３０とｐＢＲ−３２５（Ｇｅｎｅ ４１
２１（１９７８））の複合プラスミド。
（２ン ｐＡＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５参
照（３） ｐＡＪ ６５５ （、） 宿主菌：エシェリヒア・コ！Ｊ ＡＪ １１８
８２（ＦＥＲＭ−Ｐ ６５１７＝ＦＥＲＭ−ＢＰ １３
６など）（ｂ） 分子量＝６．６メガメルトン （Ｃ） 制限酵素切断地図二第１図参照（ｄ） 性 質
： ｐＡＭ ３３０とｐＢＲ−３２５（Ｇｅｎｅ ４１
２１（１９７８））の複合プラスミド。
クロラムフェニコール耐性に与る。
（４）’ ＴＩＡＪ ６１１
（ａ） 宿主菌：エシェリヒアｅコリＡＪ １１８８４
（ＦＥＲＭ−Ｐ ６５１９＝ＦＥＲＭ−ＢＰ １３８な
ど）（ｂ） 分子量二６．６メガダルトン （Ｃ） 制限酵素切断地図：第２図参照（ｄ） 性 負
二ｐＡＭ ２８１とｐＢＲ３２５の複合プラスミド。
（ＦＥＲＭ−Ｐ ６５１９＝ＦＥＲＭ−ＢＰ １３８な
ど）（ｂ） 分子量二６．６メガダルトン （Ｃ） 制限酵素切断地図：第２図参照（ｄ） 性 負
二ｐＡＭ ２８１とｐＢＲ３２５の複合プラスミド。
クロラムフェニコール耐性ニ与ル。
（５） ｐＡＪ ４４０
（ａ） 宿主菌：バチルスズブチリスＡＪ １１９０１
（ＦＥＲＭ−ＢＰ １４０＝ＡＴＣＣ３９１３９など）
（ｂ） 分子量＝６，０メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第寺図参照 （ａ）性 質： ｐＡＭ ３３０とｐＵＢ １１０ （
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 。
（ＦＥＲＭ−ＢＰ １４０＝ＡＴＣＣ３９１３９など）
（ｂ） 分子量＝６，０メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第寺図参照 （ａ）性 質： ｐＡＭ ３３０とｐＵＢ １１０ （
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 。
１３４３１８（１９７８））の複合プラスミド・カナマ
イシン耐性に与る。
イシン耐性に与る。
（６） ｐＡＪ １８４４
（ａ） ？１主菌：エシェリヒア・コ！ｊ ＡＪ １１
８８３（ＦＥＲＭ−Ｐ ６５１９＝ＦＥＲＭ−ＢＰ １
３７など）（ｂ） 分子量：５．４メガ〆ルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第邊図参照 （ｄ） 性 質： ｐＨＭ １５１９とｐＢＲ３２５の
複合プラスミド。
８８３（ＦＥＲＭ−Ｐ ６５１９＝ＦＥＲＭ−ＢＰ １
３７など）（ｂ） 分子量：５．４メガ〆ルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第邊図参照 （ｄ） 性 質： ｐＨＭ １５１９とｐＢＲ３２５の
複合プラスミド。
クロラムフェニコール耐性に与る。
（７） ｐＡＪ ３１４８
（ａ） 宿主菌：コリネバクテリウム・グルタミクムＳ
Ｒ８２０３，ＡＴＣＣ３９１３７など（ｂ） 分子量＝
６．６メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第５図参照（ｄ） 性 質
二ｐＩ（Ｍ１５１９とｐＵＢ １１０との複合プラスミ
ド。
Ｒ８２０３，ＡＴＣＣ３９１３７など（ｂ） 分子量＝
６．６メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第５図参照（ｄ） 性 質
二ｐＩ（Ｍ１５１９とｐＵＢ １１０との複合プラスミ
ド。
カナマイシン耐性に与る。
コリネ型細菌細胞内で増殖可能なプラスミドのその他の
例としてはｐＣＧ １ （特開昭５７−１３４５００）
、ｐＣＧ ２ （特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ
４ 、 Ｉ）ＣＧ １１ （特開昭５７−１８３７９９
）があり、これらはいずれも当然使用可能であろう。
例としてはｐＣＧ １ （特開昭５７−１３４５００）
、ｐＣＧ ２ （特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ
４ 、 Ｉ）ＣＧ １１ （特開昭５７−１８３７９９
）があり、これらはいずれも当然使用可能であろう。
ベクターＤＮＡは、染色体遺伝子を切断した際に用いら
れた制限酵素によ多切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体Ｄ
ＮＡフラグメントとのライダージョン反応に伺される。
れた制限酵素によ多切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体Ｄ
ＮＡフラグメントとのライダージョン反応に伺される。
このようにして得られた、染色体ＤＮＡとベクターシラ
スミドとの組換えＤＮＡをコリネ型細菌に属する受容菌
へ導入するには、エシェリヒア・コリに−１２について
報告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ。
スミドとの組換えＤＮＡをコリネ型細菌に属する受容菌
へ導入するには、エシェリヒア・コリに−１２について
報告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ。
Ｍ、 ａｎｄ Ｈｉｇａ、 Ａ、 、Ｊ、Ｍｏ１． Ｂ
ｉｏｌ、 、 ５３１５９（１９７０））受容菌細胞を
塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法、
またバチルス・ズブリについて報告されている様に（Ｄ
ｕｎｃａｎ、 ｒ Ｃ，Ｈ，、Ｗｉｌｓｏｎ ＋Ｇ、Ａ
、 ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ ＊ Ｆ、Ｅ、 ｒ Ｇｅｎｅ
＋上、 １５３（１９７７））細胞がＤＮＡを取シ込
み得る様になる増殖段階（いわゆるコンピテントセル）
に導入する方法により可能である。あるいは、バチルス
・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られてい
る様に（Ｃｈａｎｇ ＋ Ｓ、 ａｎｄ Ｃｈｏｅｎ
＊ Ｓ、Ｎ、 ＋ Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ。
ｉｏｌ、 、 ５３１５９（１９７０））受容菌細胞を
塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法、
またバチルス・ズブリについて報告されている様に（Ｄ
ｕｎｃａｎ、 ｒ Ｃ，Ｈ，、Ｗｉｌｓｏｎ ＋Ｇ、Ａ
、 ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ ＊ Ｆ、Ｅ、 ｒ Ｇｅｎｅ
＋上、 １５３（１９７７））細胞がＤＮＡを取シ込
み得る様になる増殖段階（いわゆるコンピテントセル）
に導入する方法により可能である。あるいは、バチルス
・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られてい
る様に（Ｃｈａｎｇ ＋ Ｓ、 ａｎｄ Ｃｈｏｅｎ
＊ Ｓ、Ｎ、 ＋ Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、 、 １６８ 、１１１（１９７９） ：
Ｂｉｂｂ 、 Ｍ、Ｊ、 、 Ｗａｒｄ。
Ｂｉｂｂ 、 Ｍ、Ｊ、 、 Ｗａｒｄ。
Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ ｒ Ｏ，Ａ、 、
Ｎａｔｕｒｅ ｒ ２７４ ＋ ３９８（１９７８）
； Ｈｉｎｎｅｎ ＊ Ａ、 ｒ Ｈｉｃｋｓ 、Ｊ
、Ｂ、 ａｎｄ Ｆｉｎｋ＋Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ 、 ７５１
９２９（１９７８））、ＤＮＡ受容菌を、プラスミドＤ
ＮＡを容易に取シ込むプロトシラストまたはスフェロプ
ラストにしてプラスミドをＤＮＡ受容菌に導入すること
も可能である。
Ｎａｔｕｒｅ ｒ ２７４ ＋ ３９８（１９７８）
； Ｈｉｎｎｅｎ ＊ Ａ、 ｒ Ｈｉｃｋｓ 、Ｊ
、Ｂ、 ａｎｄ Ｆｉｎｋ＋Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ 、 ７５１
９２９（１９７８））、ＤＮＡ受容菌を、プラスミドＤ
ＮＡを容易に取シ込むプロトシラストまたはスフェロプ
ラストにしてプラスミドをＤＮＡ受容菌に導入すること
も可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
ゲラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをと如込
１せる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコール
またはポリビニルアルコールのかわシに、カルボキシメ
チルセルロース、デキストラン、フィコール、ゾルロニ
ックＦ６８ （セルバ社）などの添加ニヨってＤＮＡの
とり込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
ゲラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをと如込
１せる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコール
またはポリビニルアルコールのかわシに、カルボキシメ
チルセルロース、デキストラン、フィコール、ゾルロニ
ックＦ６８ （セルバ社）などの添加ニヨってＤＮＡの
とり込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
形〃転換の後、ＩＩＰ生産性を獲得し、捷たは、さらに
プラスミドベクターが有しているマーカーとしての性質
を発現する菌株を所望の形質転換株として分離する。こ
のような形質転換株は、ＨＰ遺伝子が組み込壕れている
組換えＤＮＡを有している。乱換えＤＮＡを単離する方
法は、例えば菌株をリゾチームＳＤＳ処理によシ溶菌さ
せ、フェノール処理ののち、２容のエタノールを加えて
ＤＮＡを沈ミ殿回収する。
プラスミドベクターが有しているマーカーとしての性質
を発現する菌株を所望の形質転換株として分離する。こ
のような形質転換株は、ＨＰ遺伝子が組み込壕れている
組換えＤＮＡを有している。乱換えＤＮＡを単離する方
法は、例えば菌株をリゾチームＳＤＳ処理によシ溶菌さ
せ、フェノール処理ののち、２容のエタノールを加えて
ＤＮＡを沈ミ殿回収する。
得られたＬ−ヒスチジン生産菌を培養する方法は、従来
のし一ヒスチジン生座菌の培養方法と特に変らない。即
ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に
必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含
有する通常のものである。炭素源としては、グルコース
、シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱
粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源と
しては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム
塩その他が使用できる。
のし一ヒスチジン生座菌の培養方法と特に変らない。即
ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に
必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含
有する通常のものである。炭素源としては、グルコース
、シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱
粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源と
しては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム
塩その他が使用できる。
培養は好気的条件下で培地の−及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にＬ−ヒスチジンの生産蓄積が停止するまで
行なわれる。
つ、実質的にＬ−ヒスチジンの生産蓄積が停止するまで
行なわれる。
かくして培養液中には著量のし一ヒスチジンが生成蓄積
される。培養液よりＬ−ヒスチジンを採取するには、通
常の方法が適用できる。
される。培養液よりＬ−ヒスチジンを採取するには、通
常の方法が適用できる。
実施例
（１）ＨＰ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調整ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９よ
り変異誘導されたストレプトマイシン耐性変異株ＡＪ１
２０３６を１１のＣＭＧ培地（ペプトン１１１／ｄｌｚ
酵母エキスＩＩ汐１１ グルコース０．５ｇ／ｄｉ 、
及びＮａ（、ｔ（１，５９７ｄｌを含み、ｐｌ（７，２
に調整したもの）に植菌し、３０℃で約３時間振盪培養
を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾ
チーム・ＳＤＳで溶菌させたのち、通常のフェノール処
理法によシ、染色体ＤＮＡを抽出精製し、最終的に３．
２〜のＤＮＡを得た。
テリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９よ
り変異誘導されたストレプトマイシン耐性変異株ＡＪ１
２０３６を１１のＣＭＧ培地（ペプトン１１１／ｄｌｚ
酵母エキスＩＩ汐１１ グルコース０．５ｇ／ｄｉ 、
及びＮａ（、ｔ（１，５９７ｄｌを含み、ｐｌ（７，２
に調整したもの）に植菌し、３０℃で約３時間振盪培養
を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾ
チーム・ＳＤＳで溶菌させたのち、通常のフェノール処
理法によシ、染色体ＤＮＡを抽出精製し、最終的に３．
２〜のＤＮＡを得た。
（２） ベクターＤＮＡの調製
ベクターとしてｐＡＪ １８４４ （分子量５．４メガ
ダルトン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した
。
ダルトン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した
。
まずｐＡＪ １８４４をプラスミドとして保有するブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２０３
７（ＦＥＲＭ−Ｐ ｑ２３４ ）を１００ ｍｌのＣＭ
Ｇ培地に接種し、３０℃で対数増殖期後期まで培養した
のち、リゾチームＳＤＳ処理によシ溶菌させ、３０，０
ＯＯＸＦ３０分の超遠心によシ上消を得た。フェノール
処理ののち、２容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱回
収した。これを少量のＴＥＮ緩衝液（２０ＩＴＩＭトリ
ス塩酸塩、２０ ｍＭ ＮａＣ６，１ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８，０）に溶解後、アガロースゲル電気泳動にか
け分離後、切り出してｐＡＪ １８４４ ｆラスミドＤ
ＮＡ約１５μ９を得た。
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２０３
７（ＦＥＲＭ−Ｐ ｑ２３４ ）を１００ ｍｌのＣＭ
Ｇ培地に接種し、３０℃で対数増殖期後期まで培養した
のち、リゾチームＳＤＳ処理によシ溶菌させ、３０，０
ＯＯＸＦ３０分の超遠心によシ上消を得た。フェノール
処理ののち、２容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱回
収した。これを少量のＴＥＮ緩衝液（２０ＩＴＩＭトリ
ス塩酸塩、２０ ｍＭ ＮａＣ６，１ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８，０）に溶解後、アガロースゲル電気泳動にか
け分離後、切り出してｐＡＪ １８４４ ｆラスミドＤ
ＮＡ約１５μ９を得た。
（３）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡ ２０μＩと（２）で得たグラスミドＤ
ＮＡ １０μｌとを制限エンドヌクレアーゼｐｓｔ １
でそれぞれを３７℃、１時間処理し、完全に切断した。
た染色体ＤＮＡ ２０μＩと（２）で得たグラスミドＤ
ＮＡ １０μｌとを制限エンドヌクレアーゼｐｓｔ １
でそれぞれを３７℃、１時間処理し、完全に切断した。
６５℃、１０分の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴＰ
及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤ
ＮＡリガーゼによって１０℃。
及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤ
ＮＡリガーゼによって１０℃。
２４時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行った。６５℃、５分の
熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反
応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。
熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反
応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。
（４）ＨＰ遺伝子のクローニング
ＨＰ遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムＡＪ １２０７４を受容萌として用いた。
ーメンタムＡＪ １２０７４を受容萌として用いた。
形質転換の方法としては、ゾロトプラストトランスフォ
ーメーシＢン法を用いた。まず、菌株を５ｒＩＬｌのＣ
ＭＧ液体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリ
ンＧを０．６ユニツ） ／ ｒｕｌ添加後、さらに１．
５時間振盪培養し、遠心分離によシ菌体を集め、菌体を
０．５Ｍシェークロース、２０ｒｒＭマレイン酸、２０
ｍＭ塩化マグネシウム、３．５％ペナッセイブロス（Ｄ
ｉｆｃｏ ）からなる８ＭＭＰ培地（ｐＨ６，５）０、
５１ｆＬｌで洗浄した。次いで１０ｍν簀のリゾチーム
を含むＳＭＶＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトプ
ラスト化を図った。６０００ Ｘ １ ％ １０分間遠
心分離後、プロトプラストをＳＭＭＰで洗浄し０．５
ｍＪのＳＭＭＰに再度懸濁した。この様にして得られた
プロトプラストと（３）で調製したＤＮＡ １０μｇを
５ｍＭＥＤＴＡ存在下で混合し、Ｉリエチレングリコー
ルを最終濃度が３０％になる様に添加した後、ＤＮＡを
プロトシラストに取シ込ませる為に室温に２分間放置し
た。このプロトゲラストをＳＭＭＰ培地１ｄで洗浄後、
ＳＭＭＰ培地１１１Ｌｌに再懸濁し、形質発現の為、３
０℃で２時間培養した。この培養液をｐｌ４７．０のプ
ロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト再
生培地は蒸留水１！あた。９）リス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン１２ ＃ 、 ＫＣｌ ０．５．９ 。
ーメーシＢン法を用いた。まず、菌株を５ｒＩＬｌのＣ
ＭＧ液体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリ
ンＧを０．６ユニツ） ／ ｒｕｌ添加後、さらに１．
５時間振盪培養し、遠心分離によシ菌体を集め、菌体を
０．５Ｍシェークロース、２０ｒｒＭマレイン酸、２０
ｍＭ塩化マグネシウム、３．５％ペナッセイブロス（Ｄ
ｉｆｃｏ ）からなる８ＭＭＰ培地（ｐＨ６，５）０、
５１ｆＬｌで洗浄した。次いで１０ｍν簀のリゾチーム
を含むＳＭＶＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトプ
ラスト化を図った。６０００ Ｘ １ ％ １０分間遠
心分離後、プロトプラストをＳＭＭＰで洗浄し０．５
ｍＪのＳＭＭＰに再度懸濁した。この様にして得られた
プロトプラストと（３）で調製したＤＮＡ １０μｇを
５ｍＭＥＤＴＡ存在下で混合し、Ｉリエチレングリコー
ルを最終濃度が３０％になる様に添加した後、ＤＮＡを
プロトシラストに取シ込ませる為に室温に２分間放置し
た。このプロトゲラストをＳＭＭＰ培地１ｄで洗浄後、
ＳＭＭＰ培地１１１Ｌｌに再懸濁し、形質発現の為、３
０℃で２時間培養した。この培養液をｐｌ４７．０のプ
ロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト再
生培地は蒸留水１！あた。９）リス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン１２ ＃ 、 ＫＣｌ ０．５．９ 。
グルコース１０ ｊ＊ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０Ｂ、 １
ｇ 、 ＣａＣｌ２・２Ｈ２０２，２１９、ベグトン
４１１粉末酵母エキス４ｇ。
ｇ 、 ＣａＣｌ２・２Ｈ２０２，２１９、ベグトン
４１１粉末酵母エキス４ｇ。
カブミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）１！Ｉ、に２ＨＰＯ４０，
２Ｉ！、コハク酸ナトリウム１３５ｇ、寒天８ｇ及びク
ロラムフェニコール３μｆｌ／′ＴＩＬｇ ヲ含ｔｒ。
２Ｉ！、コハク酸ナトリウム１３５ｇ、寒天８ｇ及びク
ロラムフェニコール３μｆｌ／′ＴＩＬｇ ヲ含ｔｒ。
３０℃で２週間培養後、約１０． ＯＯ０個のクロラム
フェニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれをヒ
スチジンを含まない培地（Ｈ１ｓ欠培地：２チグルコー
ス、１ｅＩｂ硫酸アンモニウム、０．２５チ尿素、０．
１チシん酸二水素カリウム、０．０４％硫酸マグネシウ
ム７水塩、２ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐｍマンガンイオン
、２００μｇμサイアミン塩酸塩、５０μ≠ビオチン、
Ｐｔｔ ７．０、寒天１．８係）にレプリカし、クロラ
ムフェニコール削性で力）つヒスチジン要求性の消失し
た９株を得た。
フェニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれをヒ
スチジンを含まない培地（Ｈ１ｓ欠培地：２チグルコー
ス、１ｅＩｂ硫酸アンモニウム、０．２５チ尿素、０．
１チシん酸二水素カリウム、０．０４％硫酸マグネシウ
ム７水塩、２ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐｍマンガンイオン
、２００μｇμサイアミン塩酸塩、５０μ≠ビオチン、
Ｐｔｔ ７．０、寒天１．８係）にレプリカし、クロラ
ムフェニコール削性で力）つヒスチジン要求性の消失し
た９株を得た。
（５） 形質転換株のプラスミド解析
これらの株よシ（２）で述べた方法によシ、溶菌液を幽
製し、アガロースダル電気泳動法により、プラスミドＤ
ＮＡを検出したところ、２株でベクターのｐＡＪ １８
４４よシも明らかに大きなプラスミド力く検出された。
製し、アガロースダル電気泳動法により、プラスミドＤ
ＮＡを検出したところ、２株でベクターのｐＡＪ １８
４４よシも明らかに大きなプラスミド力く検出された。
これらのうちの代表法をＡＪ １２０７５（ＦＥＲＭ−
Ｐ ’７２３１；−）と名付けた・（６）Ｎ）ランスホ
ーメーシ冒ン ＡＪ １２０７５が有するプラスミド（ｐＡＪ ７１５
）上にＨＰ遺伝子が存在することを確認するだめ、こ
のプラスミドＤＮＡを用いプレビパクテ１ノウム・ラク
トファーメンタムＡＪ １２０７４を再度、形質転換し
た。
Ｐ ’７２３１；−）と名付けた・（６）Ｎ）ランスホ
ーメーシ冒ン ＡＪ １２０７５が有するプラスミド（ｐＡＪ ７１５
）上にＨＰ遺伝子が存在することを確認するだめ、こ
のプラスミドＤＮＡを用いプレビパクテ１ノウム・ラク
トファーメンタムＡＪ １２０７４を再度、形質転換し
た。
化シタクロラムフェニコール耐性コロニーのう！
ちそれぞれ１０個を釣シ上げヒスチジン要求性をテスト
したところ、これらのいずれも要求性が消失しており、
上記組換えプラスミド上にＨＰ遺伝子が存在することが
明らかとなった。
したところ、これらのいずれも要求性が消失しており、
上記組換えプラスミド上にＨＰ遺伝子が存在することが
明らかとなった。
（７）形質転換株のヒスチジン生産能
上に示したプロトプラスト形質転換法を用いて、ヒスチ
ジン生殖能を有し、１，２．４− ）リアゾール−３−
アラニン耐性突然変異株ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムＡＪ １２０７６にｐＡＪ ７１５を導入
した。形質転換株をクロラムフェニコール耐性で選択し
、得られたＡＪ １２０７７（ＦＥＲＭ−Ｐγ２３１）
及び上記のＡＪ １２０７５をヒスチジン生産培地（グ
ル：Ｉ−ス１０１／Ａｌｌ 、（ＮＨ４）２Ｓｏ４５
ｇｏａｌ 、 ＫＨ２ＰＯ４０，ＩＶｄｔ 、 Ｍｇ５
０４−７Ｈ２００，２１１／ｄｔ 、 ＦｅＳＯ４”７
Ｈ２０１０ｍＶＡ 、 ＭｎＳＯ４・７Ｈ２０１０１ｎ
９／ｆ／、チアミｙ −ＨＣ６５０μｙμ、ビオチン５
０μＩμ、大豆蛋白酸加水分解液（［味液Ｊ ） ｉ
２ ｓ ｒｖＡ （全窒素として）、ｐＨ７−２、Ｃａ
ＣＯ５５１７’ｄｌ ） ２０ ｍｌに植菌し、３０℃
７２時間撮盪培養した。培養後、遠心上清上のＬ−ヒス
チジンをマイクロバイオアッセイ法によシ定量した。結
果を第１表に示した。
ジン生殖能を有し、１，２．４− ）リアゾール−３−
アラニン耐性突然変異株ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムＡＪ １２０７６にｐＡＪ ７１５を導入
した。形質転換株をクロラムフェニコール耐性で選択し
、得られたＡＪ １２０７７（ＦＥＲＭ−Ｐγ２３１）
及び上記のＡＪ １２０７５をヒスチジン生産培地（グ
ル：Ｉ−ス１０１／Ａｌｌ 、（ＮＨ４）２Ｓｏ４５
ｇｏａｌ 、 ＫＨ２ＰＯ４０，ＩＶｄｔ 、 Ｍｇ５
０４−７Ｈ２００，２１１／ｄｔ 、 ＦｅＳＯ４”７
Ｈ２０１０ｍＶＡ 、 ＭｎＳＯ４・７Ｈ２０１０１ｎ
９／ｆ／、チアミｙ −ＨＣ６５０μｙμ、ビオチン５
０μＩμ、大豆蛋白酸加水分解液（［味液Ｊ ） ｉ
２ ｓ ｒｖＡ （全窒素として）、ｐＨ７−２、Ｃａ
ＣＯ５５１７’ｄｌ ） ２０ ｍｌに植菌し、３０℃
７２時間撮盪培養した。培養後、遠心上清上のＬ−ヒス
チジンをマイクロバイオアッセイ法によシ定量した。結
果を第１表に示した。
第１表
菌 株 Ｌ−ヒスチジン 蓄積量
ＡＪ １２０７６５０ ｍ９／ｄｅ
ＡＪ １２０７７ １３０ 〜／ｄ７！ＡＪ １２０７
４ ０ ｍ９／ｄｅ ＡＪ １２０７５ ３ ｍｇ／ｄｌＶ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０
７４は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡ
ＴＣＣ１３８６９を２，０００μシ毎のＮ−メチル＋
Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンに０℃にて２０
分間接触せしめて変異処理し、Ｈ１Ｂ欠培地で生育しえ
ずＨ１ｓ欠培地にＬ−ヒスチジノール１０η々ｅを加え
た培地で生育しうる菌株として分離したものである。ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２０
７６は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡ
ＴＣＣ１３８６９を１，０００μシ包のＮ−メチル−Ｎ
′−二トローＮ−ニトロソグアニジンに０℃にて２０分
間接触せしめて変異処理し、最小培地（グルコース２１
７ｄｌ、硫安１１７ｄｉ、尿素０、２５１１ＡＩＩ 、
ＫＨ２ＰＯ４０，１１／／ａｔ 、 ＭｇＳＯ４−７
Ｈ２００，０４ｇ／ｄ／！、サイアミン塩酸塩２００
ｔｔＩμ、ビオチン５０ ｔｔ９／Ａ 、 寒天１．５
９７ｄｌヲ含ミ、ｐＨ７，０ＫＨｕしたもの）にＤＬ
−１，２，４〜トリアゾール−３−アラニン１ ｒｒｙ
／ｍｌを加えた培地で生育しうる菌株として分離したも
のである。
４ ０ ｍ９／ｄｅ ＡＪ １２０７５ ３ ｍｇ／ｄｌＶ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０
７４は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡ
ＴＣＣ１３８６９を２，０００μシ毎のＮ−メチル＋
Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンに０℃にて２０
分間接触せしめて変異処理し、Ｈ１Ｂ欠培地で生育しえ
ずＨ１ｓ欠培地にＬ−ヒスチジノール１０η々ｅを加え
た培地で生育しうる菌株として分離したものである。ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２０
７６は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡ
ＴＣＣ１３８６９を１，０００μシ包のＮ−メチル−Ｎ
′−二トローＮ−ニトロソグアニジンに０℃にて２０分
間接触せしめて変異処理し、最小培地（グルコース２１
７ｄｌ、硫安１１７ｄｉ、尿素０、２５１１ＡＩＩ 、
ＫＨ２ＰＯ４０，１１／／ａｔ 、 ＭｇＳＯ４−７
Ｈ２００，０４ｇ／ｄ／！、サイアミン塩酸塩２００
ｔｔＩμ、ビオチン５０ ｔｔ９／Ａ 、 寒天１．５
９７ｄｌヲ含ミ、ｐＨ７，０ＫＨｕしたもの）にＤＬ
−１，２，４〜トリアゾール−３−アラニン１ ｒｒｙ
／ｍｌを加えた培地で生育しうる菌株として分離したも
のである。
ＡＪ １２０７４及びＡＪ１２０７６は、それぞれＡＪ
１２０７５又はＡＪ １２０７７よシ宿主細胞を損う
ことなく宿主細胞中の複合シラスミドを除去することに
よシ容易に得られる。即ち、シラスミドは宿主よシ自然
に失なわれることもあるし、「除去」操作によって除く
こともできる（Ｂａｃｔ、Ｒｅｖ、 、 ３６ 、 ｐ
３６１−４０５（１９７２））。除去操作の一例は以下
の通シである：宿主の生育を不完全に阻害する濃度（２
−５０μル郁）のアクリジンオレンジを含む培地に、ｌ
ｔ／当シ約１０４細胞程度に々る様に少量の菌株を接種
し宿主菌の生育を不完全に阻害してから２７−３７℃で
一夜培養する（Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、 ＋ ８８．
２６１（１９６４））。培養液を寒天培地に塗布し、２
７−３７℃で一夜培養する。
１２０７５又はＡＪ １２０７７よシ宿主細胞を損う
ことなく宿主細胞中の複合シラスミドを除去することに
よシ容易に得られる。即ち、シラスミドは宿主よシ自然
に失なわれることもあるし、「除去」操作によって除く
こともできる（Ｂａｃｔ、Ｒｅｖ、 、 ３６ 、 ｐ
３６１−４０５（１９７２））。除去操作の一例は以下
の通シである：宿主の生育を不完全に阻害する濃度（２
−５０μル郁）のアクリジンオレンジを含む培地に、ｌ
ｔ／当シ約１０４細胞程度に々る様に少量の菌株を接種
し宿主菌の生育を不完全に阻害してから２７−３７℃で
一夜培養する（Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、 ＋ ８８．
２６１（１９６４））。培養液を寒天培地に塗布し、２
７−３７℃で一夜培養する。
培地上に出現したコロニーのうち、クロラムフェンコー
ル（１０μｇＡＬｌ）に感受性を示す株プラスミドが除
去されている株で即ち、ＡＪ １２０７４及びＡＪ １
２０７６である。
ル（１０μｇＡＬｌ）に感受性を示す株プラスミドが除
去されている株で即ち、ＡＪ １２０７４及びＡＪ １
２０７６である。
第１図二複合シラスミドｐＡＪ ６５５の制限酵素切断
地図 第２図：複合プラスミドｐＡＪ ６１１の制限酵素切断
地図 新地図 第５図：複合プラスミドｐＡＪ ３１４８の制限酵素切
新地図。 特許出石人 味の素株式会社 第２図 第３ン］ 第４図 ＞（ＨＸｂａＩ 第５図 ＞（：ＸＯｒエエ
地図 第２図：複合プラスミドｐＡＪ ６１１の制限酵素切断
地図 新地図 第５図：複合プラスミドｐＡＪ ３１４８の制限酵素切
新地図。 特許出石人 味の素株式会社 第２図 第３ン］ 第４図 ＞（ＨＸｂａＩ 第５図 ＞（：ＸＯｒエエ
Claims (3)
- （１） ヒスチジノールホスファターゼをコードする遺
伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖し得るグラスミドベク
ターに接続されている組換えＤＮＡ 。 - （２） ヒスチジノールホスファターゼをコードする遺
伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖し得るグラスミドベク
ターに接続されている組換えＤＮＡを有するコリネ型組
−０ - （３） ヒスチジノールホスファターゼをコードする遺
伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖し得るプラスミドベク
ターに接続されている組換えＤＮＡを有するコリネ型細
菌を培養することを！徴とするＬ−ヒスチジンの製造法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17000683A JPS6062983A (ja) | 1983-09-14 | 1983-09-14 | 発酵法によるｌ―ヒスチジンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17000683A JPS6062983A (ja) | 1983-09-14 | 1983-09-14 | 発酵法によるｌ―ヒスチジンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6062983A true JPS6062983A (ja) | 1985-04-11 |
| JPH0526467B2 JPH0526467B2 (ja) | 1993-04-16 |
Family
ID=15896837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17000683A Granted JPS6062983A (ja) | 1983-09-14 | 1983-09-14 | 発酵法によるｌ―ヒスチジンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6062983A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58126789A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | レースレオニンの製造法 |
-
1983
- 1983-09-14 JP JP17000683A patent/JPS6062983A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58126789A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | レースレオニンの製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0526467B2 (ja) | 1993-04-16 |
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