JPS619290A - プラスミド及びそれを有する細菌 - Google Patents
プラスミド及びそれを有する細菌Info
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- JPS619290A JPS619290A JP59128830A JP12883084A JPS619290A JP S619290 A JPS619290 A JP S619290A JP 59128830 A JP59128830 A JP 59128830A JP 12883084 A JP12883084 A JP 12883084A JP S619290 A JPS619290 A JP S619290A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
この発明は、プラスミド及びそれを有する細菌に関し、
詳しくは、コリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミド
ベクターとそれを有するコリネ型細菌に関する。
詳しくは、コリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミド
ベクターとそれを有するコリネ型細菌に関する。
（従来の技術）
コリネ型細菌は、ブレビバクテリウム・フラバム等のグ
ルタミン酸等のアミノ酸を大量に生産するものを含み、
工業的に極めて重要な微生物群である。
ルタミン酸等のアミノ酸を大量に生産するものを含み、
工業的に極めて重要な微生物群である。
このようなコリネ型細菌を宿主として利用して、組換え
ＤＮＡ技術によりこれらのコリネ型細菌の発酵生産物の
生産性を高めるため、既にいくつかのプラスミドベクタ
ーが開発されている（欧州特許出願公開００９３６１１
）。これらのプラスミドベクターはいずれもコリネ型
細菌細胞内で増殖できるクリプテイック（Ｃｒｙｐｔｉ
ｅ ）プラスミドにグラスミド選別のだめのマーカー遺
伝子を挿入しようとするものであり、そのため、マーカ
ー遺伝子としす てエシェｌヒア属又はバチルス属等由来の遺伝子をコリ
ネ型細菌のプラスミドに挿入したものである。従って、
コリネ型細菌にとっては、異種ＤＮＡが組み込まれたも
のであシ従ってこのよりなプラスミドベクターを使用す
ることは異種のＤＮＡの組換え実験に属する。
ＤＮＡ技術によりこれらのコリネ型細菌の発酵生産物の
生産性を高めるため、既にいくつかのプラスミドベクタ
ーが開発されている（欧州特許出願公開００９３６１１
）。これらのプラスミドベクターはいずれもコリネ型
細菌細胞内で増殖できるクリプテイック（Ｃｒｙｐｔｉ
ｅ ）プラスミドにグラスミド選別のだめのマーカー遺
伝子を挿入しようとするものであり、そのため、マーカ
ー遺伝子としす てエシェｌヒア属又はバチルス属等由来の遺伝子をコリ
ネ型細菌のプラスミドに挿入したものである。従って、
コリネ型細菌にとっては、異種ＤＮＡが組み込まれたも
のであシ従ってこのよりなプラスミドベクターを使用す
ることは異種のＤＮＡの組換え実験に属する。
（発明が解決しようとする問題点）
従ってこの発明の目的は、コリネ型細菌細胞内で増殖し
うるものであって、同種細菌由来のマーカー遺伝子を有
する同種のＤＮＡのみから構成されるプラスミドベクタ
ーを得ることにある。
うるものであって、同種細菌由来のマーカー遺伝子を有
する同種のＤＮＡのみから構成されるプラスミドベクタ
ーを得ることにある。
（問題点を解決するための手段）
斜上の問題点を解決するため本発明者は、コリネ型細菌
細胞内で増殖し、同細胞内に導入されたときトリメトプ
リム耐性を表現するプラスミドを造成した。ここでトリ
メトプリム耐性を表現する遺伝子は、コリネ型細菌由来
のものである。トリメトプリムはジヒドロ葉酸の構造類
似体であシ、ジヒドロ葉酸還元酵素に対する阻害剤であ
る。
細胞内で増殖し、同細胞内に導入されたときトリメトプ
リム耐性を表現するプラスミドを造成した。ここでトリ
メトプリム耐性を表現する遺伝子は、コリネ型細菌由来
のものである。トリメトプリムはジヒドロ葉酸の構造類
似体であシ、ジヒドロ葉酸還元酵素に対する阻害剤であ
る。
コリネ型細菌細胞内に導入されたときトリメトプリム耐
性を表現する遺伝子は、以下のようにして得られる。先
ずコリネ型細菌より）リメトプリムに耐性を有する株を
選択するコリネ型細菌の野性株は通常トリメトプリムに
感受性であり、従ってトリメトプリム耐性株を得るには
変異株を誘導するのがよい。
性を表現する遺伝子は、以下のようにして得られる。先
ずコリネ型細菌より）リメトプリムに耐性を有する株を
選択するコリネ型細菌の野性株は通常トリメトプリムに
感受性であり、従ってトリメトプリム耐性株を得るには
変異株を誘導するのがよい。
トリメトプリム耐性変異株は、コリネ型細菌である親株
に、Ｘ−線、γ−線、紫外線等を照射するか、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン等の変異誘
起剤に曝した後、トリメトプリム耐性を獲得した株を選
別すればよい。トリメトプリム耐性を獲得した株は、例
えば最小培地（グルコ−づ２ｇＡ１ｔ、硫安１９７ｄｉ
、尿素帆２５ｙ／ｄｉ、 ＫＨ２ＰＯ４０，１ｇ／ｄｉ
、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０４１７ｄｉ、サイアミ
ン塩酸塩２００μＩμ、ビオチン５０μｙ／１１寒天１
．５９／ｄ／を含み、声７．０に調整したもの）等の培
地を用い、これに１００μＷよシ好ましくは２００μＷ
以上のトリメトプリムを添加し、この培地上に生育して
くる株を分離することによシ得られる。
に、Ｘ−線、γ−線、紫外線等を照射するか、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン等の変異誘
起剤に曝した後、トリメトプリム耐性を獲得した株を選
別すればよい。トリメトプリム耐性を獲得した株は、例
えば最小培地（グルコ−づ２ｇＡ１ｔ、硫安１９７ｄｉ
、尿素帆２５ｙ／ｄｉ、 ＫＨ２ＰＯ４０，１ｇ／ｄｉ
、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０４１７ｄｉ、サイアミ
ン塩酸塩２００μＩμ、ビオチン５０μｙ／１１寒天１
．５９／ｄ／を含み、声７．０に調整したもの）等の培
地を用い、これに１００μＷよシ好ましくは２００μＷ
以上のトリメトプリムを添加し、この培地上に生育して
くる株を分離することによシ得られる。
トリメトプリム耐性を表現する遺伝子を分離する方法は
、コリネ型細菌のトリメトプリム耐性を表現する遺伝子
を有している株よシ、まず染色体遺伝子を抽出しく例え
ばＨ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、 Ｍｉｕｒａ＋Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７２６１９ （
１９６３）の方法が使用できる）、これを適当な制限酵
素で切断する。
、コリネ型細菌のトリメトプリム耐性を表現する遺伝子
を有している株よシ、まず染色体遺伝子を抽出しく例え
ばＨ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、 Ｍｉｕｒａ＋Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７２６１９ （
１９６３）の方法が使用できる）、これを適当な制限酵
素で切断する。
染色体遺伝子を切断するには、切断反応時間等を調節し
て、切断の程度を調節すれば、巾広い種類 □の制
限酵素が使用できる。制限酵素によシ切断された染色体
遺伝子は、ついで、コリネ型細菌で増殖し得るプラスミ
ドベクターに接続し、得られた組換えＤＮＡを用いてコ
リネ型細菌を形質転換せしめ、トリメトプリム耐性を保
有するにいたった菌株を分離し、それよシトリメトプリ
ム耐性を表現する遺伝子を分離できる。
て、切断の程度を調節すれば、巾広い種類 □の制
限酵素が使用できる。制限酵素によシ切断された染色体
遺伝子は、ついで、コリネ型細菌で増殖し得るプラスミ
ドベクターに接続し、得られた組換えＤＮＡを用いてコ
リネ型細菌を形質転換せしめ、トリメトプリム耐性を保
有するにいたった菌株を分離し、それよシトリメトプリ
ム耐性を表現する遺伝子を分離できる。
この際用いられるコリネ型細菌は、トリメトプリムに感
受性のものでアシ、従って、トリメトプリム耐性を表現
する遺伝子を有する形質転換株は、上述の通りトリメト
プリム耐性株として得られる。
受性のものでアシ、従って、トリメトプリム耐性を表現
する遺伝子を有する形質転換株は、上述の通りトリメト
プリム耐性株として得られる。
コリネ型細菌は好気性、グラム陽性桿菌であり、非抗酸
性でパーデース・マニュアル・オブ・デターミネティブ
バクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）に記載さ
れている。その内、特に以下に例示するよりなＬ−グル
タミン酸を大量に生産するものが知られていて、これら
はいずれも同−ｍに属するものと考えられる。
性でパーデース・マニュアル・オブ・デターミネティブ
バクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）に記載さ
れている。その内、特に以下に例示するよりなＬ−グル
タミン酸を大量に生産するものが知られていて、これら
はいずれも同−ｍに属するものと考えられる。
ブレビバクテリウム・ディパリカタム ＡＴＣＣ
１４０２０ブレビバクテリウム・サラカロリティクム
ＡＴＣＣ１４０６６プレビパクテリウム・インマリオフ
ィルム ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ブレビバクテ
リウム・ロゼラム ＡＴＣＣ１３８２５グ
レヒハクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１
３８２６プレピパクテリウム・チオグニタリス
ＡＴＣＣ１９２４０コリネバクテリウム・アセトアジド
フィルムＡＴＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・アセ
トグルタミクム ＡＴＣＣ１５８０６コリネパクテリ
ウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１コリ
ネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３
０３２，１３０６０コリネバクテリウム・リリウム
ＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メ
ラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５ミクロバクテ
リウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４コ
リネ型細菌には上記のようなグルタミン酸生産性を有す
るもののほかに、グルタミン酸生産性を失った変異株及
び他の変異株も含まれる。
１４０２０ブレビバクテリウム・サラカロリティクム
ＡＴＣＣ１４０６６プレビパクテリウム・インマリオフ
ィルム ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ブレビバクテ
リウム・ロゼラム ＡＴＣＣ１３８２５グ
レヒハクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１
３８２６プレピパクテリウム・チオグニタリス
ＡＴＣＣ１９２４０コリネバクテリウム・アセトアジド
フィルムＡＴＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・アセ
トグルタミクム ＡＴＣＣ１５８０６コリネパクテリ
ウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１コリ
ネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３
０３２，１３０６０コリネバクテリウム・リリウム
ＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メ
ラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５ミクロバクテ
リウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４コ
リネ型細菌には上記のようなグルタミン酸生産性を有す
るもののほかに、グルタミン酸生産性を失った変異株及
び他の変異株も含まれる。
コリネ型細菌細胞内で増殖しうるようなプラスミドとす
るためには、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子はコ
リネ型細菌細胞内で増殖しりるノラスミドの複製開始領
域ＤＮＡと接続される。複製開始領域ＤＮＡとしては、
コリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドの野性型の
ものの全部又はその複製開始領域を含むＤＮＡ断片が使
用できる。更にこれら野性型グラスミド又はその複製開
始領域を含むＤＮＡ断片にコリネ型細菌由来のＤＮＡが
接続されたものも複製開始領域ＤＮＡとして使用できる
。
るためには、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子はコ
リネ型細菌細胞内で増殖しりるノラスミドの複製開始領
域ＤＮＡと接続される。複製開始領域ＤＮＡとしては、
コリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドの野性型の
ものの全部又はその複製開始領域を含むＤＮＡ断片が使
用できる。更にこれら野性型グラスミド又はその複製開
始領域を含むＤＮＡ断片にコリネ型細菌由来のＤＮＡが
接続されたものも複製開始領域ＤＮＡとして使用できる
。
コリネ型細菌細胞内で増殖しうる野性型プラスミドとし
ては、特開昭５８−６７６９９に記載されているｐ、に
Ｍ２Ｂ５、ｐＡＭ ２８６、特開昭５８−７７８９５に
記載されているｐＨＭ１５１９、特開昭５７−１３４５
００に記載されているｐＣＧ １、特開昭５８−３５１
９７に記載されているｐＣＧ ２、特開昭５７−１８３
７９９に記載されているｐＣＧ４、ｐｃｃ １１等が知
られている。
ては、特開昭５８−６７６９９に記載されているｐ、に
Ｍ２Ｂ５、ｐＡＭ ２８６、特開昭５８−７７８９５に
記載されているｐＨＭ１５１９、特開昭５７−１３４５
００に記載されているｐＣＧ １、特開昭５８−３５１
９７に記載されているｐＣＧ ２、特開昭５７−１８３
７９９に記載されているｐＣＧ４、ｐｃｃ １１等が知
られている。
複製開始領域ＤＮＡを有するプラスミドは、トリメトプ
リム耐性を表現するＤＮＡと接続するため、・１
染色体遺伝子を切断した際に用いられた制限酵素によシ
切断される。染色体ＤＮＡ切断フラグメント及び切断さ
れたプラスミドＤＮＡはそのまま、あるいは必要があれ
ばそれぞれの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドを接続せしめて、ついでプラスミドＤＮＡと
染色体ＤＮＡフラグメントとのライダージョン反応に付
される。
リム耐性を表現するＤＮＡと接続するため、・１
染色体遺伝子を切断した際に用いられた制限酵素によシ
切断される。染色体ＤＮＡ切断フラグメント及び切断さ
れたプラスミドＤＮＡはそのまま、あるいは必要があれ
ばそれぞれの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドを接続せしめて、ついでプラスミドＤＮＡと
染色体ＤＮＡフラグメントとのライダージョン反応に付
される。
このようにして得られた、染色体ＤＮＡとグラスミドＤ
ＮＡとの組換えＤＮＡをコリネ型細菌に属する受容菌へ
導入するには、エシェリヒア・コリに−１２について報
告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ 、 Ｍ。
ＮＡとの組換えＤＮＡをコリネ型細菌に属する受容菌へ
導入するには、エシェリヒア・コリに−１２について報
告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ 、 Ｍ。
ａｎｄ Ｈｌｇａ ＋ Ａ。、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｒｉ
ｏｔ、 、 ５３１５９（１９７０））受容菌細胞を塩
化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法、ま
たバチルス・ズブチリスについて報告されている様に（
Ｄｕｎｅａｎ ＋ Ｃ，Ｈ，、Ｗｉｌｓｏｎ＋Ｇ、Ａ、
ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ ＋ Ｆ、Ｅ、 ＋ Ｇｅｎｅ
ｔ １ ＋ １５３（１９７７））細胞がＤＮＡを取シ
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンピテントセル
）に導入する方法にょ９可能である。あるいは、バチル
ス・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られて
いる様に（Ｃｈａｎｇ ＊ Ｓ、 ａｎｄ Ｃｈｏｅｎ
＋ Ｓ、Ｎ、’ ！ Ｍｏ１ｅｅ、 Ｇｅｎ。
ｏｔ、 、 ５３１５９（１９７０））受容菌細胞を塩
化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法、ま
たバチルス・ズブチリスについて報告されている様に（
Ｄｕｎｅａｎ ＋ Ｃ，Ｈ，、Ｗｉｌｓｏｎ＋Ｇ、Ａ、
ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ ＋ Ｆ、Ｅ、 ＋ Ｇｅｎｅ
ｔ １ ＋ １５３（１９７７））細胞がＤＮＡを取シ
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンピテントセル
）に導入する方法にょ９可能である。あるいは、バチル
ス・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られて
いる様に（Ｃｈａｎｇ ＊ Ｓ、 ａｎｄ Ｃｈｏｅｎ
＋ Ｓ、Ｎ、’ ！ Ｍｏ１ｅｅ、 Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔｌ−リ５８ 、１１１（１９７９） ： Ｂ
ｉｂｂ 、 Ｍ、Ｊ、 、 Ｗａｒｄ。
ｉｂｂ 、 Ｍ、Ｊ、 、 Ｗａｒｄ。
Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ ＋ Ｏ，Ａ、 ＋
Ｎａｔｕｒｅ ＋ ２７４ ＋ ３９８（１９７８）：
Ｈｉｎｎｅｎ ＊ Ａ、ｅ Ｈｉｃｋｓ ＊
Ｊ、Ｂ、ａｎｄ Ｆｉｎｋ。
Ｎａｔｕｒｅ ＋ ２７４ ＋ ３９８（１９７８）：
Ｈｉｎｎｅｎ ＊ Ａ、ｅ Ｈｉｃｋｓ ＊
Ｊ、Ｂ、ａｎｄ Ｆｉｎｋ。
Ｇ、Ｒ，ｅ Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ 、７５ １９２９（１９７８））、ＤＮＡ受
容菌を、プラスミドＤＮＡを容易に取シ込−むプロトプ
ラストまたはスフェロプラストにしてプラスミドをＤＮ
Ａ受容菌に導入することも可能である。
ＵＳＡ 、７５ １９２９（１９７８））、ＤＮＡ受
容菌を、プラスミドＤＮＡを容易に取シ込−むプロトプ
ラストまたはスフェロプラストにしてプラスミドをＤＮ
Ａ受容菌に導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
シラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをとり込
ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコール
またはポリビニルアルコールのかわシに、カルブキシメ
チルセルロース、デキストラン、フィコール、ゾルロニ
ックＦ６８（セルパ社）などの添加によってＤＮＡのと
９込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
シラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをとり込
ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコール
またはポリビニルアルコールのかわシに、カルブキシメ
チルセルロース、デキストラン、フィコール、ゾルロニ
ックＦ６８（セルパ社）などの添加によってＤＮＡのと
９込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
形質転換の後、トリメトプリム耐性を獲得した菌株を所
望の形質転換株として分離する。このような形質転換株
は、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子が組み込まれ
ている組換えＤＮＡを有している。組換えＤＮＡを単離
する方法は、例えば形質転換株をリゾチーム・ＳＤ８処
理により溶菌させ、フェノール処理ののち、２容のエタ
ノールを加えてＤＮＡを沈殿回収する。
望の形質転換株として分離する。このような形質転換株
は、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子が組み込まれ
ている組換えＤＮＡを有している。組換えＤＮＡを単離
する方法は、例えば形質転換株をリゾチーム・ＳＤ８処
理により溶菌させ、フェノール処理ののち、２容のエタ
ノールを加えてＤＮＡを沈殿回収する。
（作用）
このようにして得られたコリネ型細菌細胞内で増殖し同
細胞内に導入されたときトリメトプリム耐性を表現する
プラスミドは、異種のＤＮＡを含んでいないので、コリ
ネ型細菌由来の遺伝子を挿入してコリネ型細菌によシ発
現させるのに特に適し□ ている。挿入、発現される遺
伝子としては、アミノ酸生合成に関与する遺伝子等が考
えられる。
細胞内に導入されたときトリメトプリム耐性を表現する
プラスミドは、異種のＤＮＡを含んでいないので、コリ
ネ型細菌由来の遺伝子を挿入してコリネ型細菌によシ発
現させるのに特に適し□ ている。挿入、発現される遺
伝子としては、アミノ酸生合成に関与する遺伝子等が考
えられる。
〈実施例１〉
（１） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＣＭＧ培地（ｄプ） ｙ １ ｇｏｄ’、酵母エキス１
ｇＡｌｔ ％グルコース帆５ ｌ／ｄｉ、及びＮａＣ
ｔＯ，５ｇ／ｄｉを含み、ｐＨ７，２に調整したもの）
に植菌し、３０℃で約３時間振盪培養を行ない、対数増
殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾチーム・ＳＤＳで
溶菌させたのち、通常のフェノール処理法により、染色
体ＤＮＡを抽出精製し、最終的に３．０ｍｙのＤＮＡを
得た。
ＣＭＧ培地（ｄプ） ｙ １ ｇｏｄ’、酵母エキス１
ｇＡｌｔ ％グルコース帆５ ｌ／ｄｉ、及びＮａＣ
ｔＯ，５ｇ／ｄｉを含み、ｐＨ７，２に調整したもの）
に植菌し、３０℃で約３時間振盪培養を行ない、対数増
殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾチーム・ＳＤＳで
溶菌させたのち、通常のフェノール処理法により、染色
体ＤＮＡを抽出精製し、最終的に３．０ｍｙのＤＮＡを
得た。
（２） ベクターとしてｐＡＭ ３３０を用いた。ｐ
ＡＭ３３０は次の様にして調製した。
ＡＭ３３０は次の様にして調製した。
ｔ スｐＡＭ ３３０をプラスミドとして保有するブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９を１０（ＩＪのＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数
増殖期後期まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処理に
よシ溶菌させ、３０，０００ Ｘ 、９３０分の超遠心
によシ上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタ
ノールを加えてＤＮＡを沈澱物として回収した。これを
少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸塩、２０ ｍ
Ｍ ＮａＣ１、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）に溶
解後、アガロースダル電気泳動にかけ分離後、切シ出し
てｐＡＭ ３３０プラスミドＤＮＡ約１５μｇを得た。
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９を１０（ＩＪのＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数
増殖期後期まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処理に
よシ溶菌させ、３０，０００ Ｘ 、９３０分の超遠心
によシ上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタ
ノールを加えてＤＮＡを沈澱物として回収した。これを
少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸塩、２０ ｍ
Ｍ ＮａＣ１、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）に溶
解後、アガロースダル電気泳動にかけ分離後、切シ出し
てｐＡＭ ３３０プラスミドＤＮＡ約１５μｇを得た。
（３） （１）で得た染色体ＤＮＡ ２０μｇと（２
）で得たプラスミドＤＮＡ １０μｇとを制限エンドヌ
クレアー−１！＃Ｍｂ。
）で得たプラスミドＤＮＡ １０μｇとを制限エンドヌ
クレアー−１！＃Ｍｂ。
■でそれぞれを３７℃、３０分間処理し、部分切断した
。６５℃、１０分の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴ
Ｐ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来の
ＤＮＡリガーゼによって１０℃。
。６５℃、１０分の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴ
Ｐ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来の
ＤＮＡリガーゼによって１０℃。
２４時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行った。６５℃、５分の
熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反
応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。
熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反
応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。
（４）トリメトプリム感受性のブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＪ １２０３６を受容菌として用
いた。
クトファーメンタムＡＪ １２０３６を受容菌として用
いた。
形質転換の方法としては、ゾロドプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５ゴのＣＭＧ液
体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを
０．６ユニツ）／ｒｎｌ添加後、さらに１．５時間振盪
培養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を帆５Ｍシュ
ークロース、２０ｍＭマレ ゛イン酸、２０ｍＭ塩
化マグネシウム、３．５％−ｅナツセイブｏ ス（Ｄｉ
ｆｃｏ ）からなるＳＭＭＰ培地（ｐＨ６，５）０．５
１ｎｊ！で洗浄した。次いで１０−ｌのリゾチームを含
むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトプラス
ト化を図った。６０００ｘｇ、１０分間遠心分離後、プ
ロトゲラストをＳＭＭＰで洗浄しＱ、５ｍｌのＳＭＭＰ
に再度懸濁した。この様にして得られたゾロドプラスト
と（３）で調製したＤＮＡ １０μｓを５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ存在下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度
が３０俤になる様に添加した後、ＤＮＡをゾロドプラス
トに取シ込ませる為に室温に２分間放置した。このプロ
トプラストをＳＭＭＰ 培地１ ｍｌで洗浄後、ＳＭＭ
Ｐ培地１ｒＬｌに再懸濁し、形質発現の為、３０℃で２
時間培養した。この培養１ｔｐＨ７−０のプロトシラス
ト再生培地上に塗布した。ゾロトノラスト再生培地は蒸
留水１ｔあたシトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン１２Ｉ。
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５ゴのＣＭＧ液
体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを
０．６ユニツ）／ｒｎｌ添加後、さらに１．５時間振盪
培養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を帆５Ｍシュ
ークロース、２０ｍＭマレ ゛イン酸、２０ｍＭ塩
化マグネシウム、３．５％−ｅナツセイブｏ ス（Ｄｉ
ｆｃｏ ）からなるＳＭＭＰ培地（ｐＨ６，５）０．５
１ｎｊ！で洗浄した。次いで１０−ｌのリゾチームを含
むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトプラス
ト化を図った。６０００ｘｇ、１０分間遠心分離後、プ
ロトゲラストをＳＭＭＰで洗浄しＱ、５ｍｌのＳＭＭＰ
に再度懸濁した。この様にして得られたゾロドプラスト
と（３）で調製したＤＮＡ １０μｓを５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ存在下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度
が３０俤になる様に添加した後、ＤＮＡをゾロドプラス
トに取シ込ませる為に室温に２分間放置した。このプロ
トプラストをＳＭＭＰ 培地１ ｍｌで洗浄後、ＳＭＭ
Ｐ培地１ｒＬｌに再懸濁し、形質発現の為、３０℃で２
時間培養した。この培養１ｔｐＨ７−０のプロトシラス
ト再生培地上に塗布した。ゾロトノラスト再生培地は蒸
留水１ｔあたシトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン１２Ｉ。
ＫＣｌ Ｏ，５ｇ、グルコース１０ ｐ 、 ＭｇＣｌ
２・６Ｈ２０Ｂ−Ｌ １１ 、ＣａＣ４２・２Ｈ２０
２−２ｇ 、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ１カザ
ミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）１ｙ。
２・６Ｈ２０Ｂ−Ｌ １１ 、ＣａＣ４２・２Ｈ２０
２−２ｇ 、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ１カザ
ミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）１ｙ。
Ｋ２）ＩＰＯ４０，２、！９、コハク酸ナトリウム１３
５ｇ、寒天８ｇ及びトリメトプリム（Ｓｉｇｍａ社）２
５４／Ｉｌｌを含む。
５ｇ、寒天８ｇ及びトリメトプリム（Ｓｉｇｍａ社）２
５４／Ｉｌｌを含む。
３０℃で１週間培養後、約１００個のコロニーが出現し
てきたので、これをトリメトプリムを含む最小培地（２
チグルコース、１ｔＩ）硫酸アンモニウム、０．２５％
尿素、０，１％シん酸二水素カリウム、０．０４％硫酸
マグネシウム７水塩、２ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐｍマン
ガンイオン、２００μｇμサイアミン塩酸塩、５０μ９
μビオチン、ＰＨ７，０１寒天１．８％、トリメトプリ
ム５０μ、９，４＋）にレプリカし、トリメトプリム耐
性１株を得た。
てきたので、これをトリメトプリムを含む最小培地（２
チグルコース、１ｔＩ）硫酸アンモニウム、０．２５％
尿素、０，１％シん酸二水素カリウム、０．０４％硫酸
マグネシウム７水塩、２ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐｍマン
ガンイオン、２００μｇμサイアミン塩酸塩、５０μ９
μビオチン、ＰＨ７，０１寒天１．８％、トリメトプリ
ム５０μ、９，４＋）にレプリカし、トリメトプリム耐
性１株を得た。
（５） これらの株よシ（２）で述べた方法により、
溶菌液を調製し、アガロースダル電気泳動法により、プ
ラスミドＤＮＡを検出したところ、ベクターの（６）
ＡＪ １２１４７が有するプラスミド（１）ＡＪ ２
２８ ）上にトリメトゲリム耐性遺伝子が存在すること
を確認するため、このプラスミドＤＮＡを用いブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２０３６を
再度、形質転換した。
溶菌液を調製し、アガロースダル電気泳動法により、プ
ラスミドＤＮＡを検出したところ、ベクターの（６）
ＡＪ １２１４７が有するプラスミド（１）ＡＪ ２
２８ ）上にトリメトゲリム耐性遺伝子が存在すること
を確認するため、このプラスミドＤＮＡを用いブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２０３６を
再度、形質転換した。
生じたトリメトプリム耐性を有するコロニーのうちそれ
ぞれ１０個を釣９上げアガロース電気泳動法によりプラ
スミドＤＮＡを検出したところ、これらのいずれにもｐ
ＡＪ ２２８と同じ大きさのプラスミドが存在してい１
゜上記組換えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現
する遺伝子が存在することが明らかとなった。
ぞれ１０個を釣９上げアガロース電気泳動法によりプラ
スミドＤＮＡを検出したところ、これらのいずれにもｐ
ＡＪ ２２８と同じ大きさのプラスミドが存在してい１
゜上記組換えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現
する遺伝子が存在することが明らかとなった。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２
１４６は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＪ １２０３６をｉ、ｏ ｏ ｏμｇＡｌのＮ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジンに０℃にて
２０分間接触せしめて変異処理し、最小培地（グルコー
ス２９７泡、硫安１に包、尿素帆２５み儒・ＫＨ２ＰＯ
４０，Ｉ Ｖｄｌ 、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０４
ＥＩＡＩ、サイアミン塩酸塩２００μｇμ、ビオチン５
０μｇμ、２ ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐｍマンガンイオ
ン、寒天１．５ｇＡＩｇを含み、ｐＨ７，０１ｃ調整し
たもの）にトリメトプリム１００μに佃を加えた培地で
生育しうる背 菌株として分離したものである。
１４６は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＪ １２０３６をｉ、ｏ ｏ ｏμｇＡｌのＮ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジンに０℃にて
２０分間接触せしめて変異処理し、最小培地（グルコー
ス２９７泡、硫安１に包、尿素帆２５み儒・ＫＨ２ＰＯ
４０，Ｉ Ｖｄｌ 、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０４
ＥＩＡＩ、サイアミン塩酸塩２００μｇμ、ビオチン５
０μｇμ、２ ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐｍマンガンイオ
ン、寒天１．５ｇＡＩｇを含み、ｐＨ７，０１ｃ調整し
たもの）にトリメトプリム１００μに佃を加えた培地で
生育しうる背 菌株として分離したものである。
ＡＪ １２０３６は、ＡＪ・１２１４７よシ宿主細胞を
損うことなく宿主細胞中の複合プラスミドを除去すると
とによシ容易に得られる。即ち、グラスミドは宿主より
自然に失なわれることもあるし、「除去」操作によって
除くこともできる（ Ｂａｃｔ、 Ｒ６Ｖ、 。
損うことなく宿主細胞中の複合プラスミドを除去すると
とによシ容易に得られる。即ち、グラスミドは宿主より
自然に失なわれることもあるし、「除去」操作によって
除くこともできる（ Ｂａｃｔ、 Ｒ６Ｖ、 。
亜、 ＋３６１−４０５ （１９７２））。除去操作の
一例は以下の通りである：宿主の生育を不完全に阻害す
る濃度（２−５０μＷ）のアクリジンオレンジを含む培
地に、１ ｍｌ当り約１０．細胞程度になる様に少量の
菌株を接種し宿主菌の生育を不完全に阻害してから２７
−３７℃で一夜培養する（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
＋８８ 、２６１ （１９６４）） 、培養液を寒天培
地に塗布し、２７−３７℃で一夜培養する。
一例は以下の通りである：宿主の生育を不完全に阻害す
る濃度（２−５０μＷ）のアクリジンオレンジを含む培
地に、１ ｍｌ当り約１０．細胞程度になる様に少量の
菌株を接種し宿主菌の生育を不完全に阻害してから２７
−３７℃で一夜培養する（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
＋８８ 、２６１ （１９６４）） 、培養液を寒天培
地に塗布し、２７−３７℃で一夜培養する。
培地上に出現したコロニーのうち、トリメトプリム（５
０μ９７ｆｎｌ）に感受性を示す株プラスミドが除去さ
れている株で即ち、ＡＪ １２０３６である。
０μ９７ｆｎｌ）に感受性を示す株プラスミドが除去さ
れている株で即ち、ＡＪ １２０３６である。
（７） ＰＡＪ ２２８ ＤＮＡの性質（ａ） ｐ
ＡＪ ２２８の分子量の決定はアガロースダル電気泳動
によった。
ＡＪ ２２８の分子量の決定はアガロースダル電気泳動
によった。
アガロースダル電気泳動はシャー７°（Ｐ、Ａ、 ５ｈ
ａｒｐ） ’らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １２ 、３０５５ （１９７３））によ、ｐ、ｏ、
ｓ％ｒルを用い、ダル長さα当、９．５Ｖで１５時間、
定電圧で泳動した。分子量はｐＡＪ ２２８を１ケ所切
断する制限酵素Ｃ１ａ １０．５ユニツトをｐＡＪ ２
２８０．５μＩに３７℃、１時間反応させ、切断し、直
線状にした後、分子量既知の分子量マーカー、λファー
ジのＨｉｎｄ ｍフラグメント（ＢＲＬ社）との移動度
の比較によって算出し、５．１Ｍｄと計算された。
ａｒｐ） ’らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １２ 、３０５５ （１９７３））によ、ｐ、ｏ、
ｓ％ｒルを用い、ダル長さα当、９．５Ｖで１５時間、
定電圧で泳動した。分子量はｐＡＪ ２２８を１ケ所切
断する制限酵素Ｃ１ａ １０．５ユニツトをｐＡＪ ２
２８０．５μＩに３７℃、１時間反応させ、切断し、直
線状にした後、分子量既知の分子量マーカー、λファー
ジのＨｉｎｄ ｍフラグメント（ＢＲＬ社）との移動度
の比較によって算出し、５．１Ｍｄと計算された。
また、同様の方法で市販されている各種制限酵素による
切断箇所を第１表に示した。
切断箇所を第１表に示した。
第１表
制限酵素 切断箇所の数
Ａｖａ Ｉ ５
ＢａｍＨＩ’ ０
Ｂｅｔ Ｉ ４
Ｂｇｌ ＩＩ ０
ＢｓｔＥ ｎ ３
Ｃ１ａ Ｉ １
ｇｃｏＲＩ ０
Ｈａｅ Ｉｆ ４
Ｈｉｎｄｌｌｌ ２
Ｈｐａ ＩＩ
Ｋｐｎ Ｉ ０
Ｍ１ｕ Ｉ ２
Ｍ８ｔ Ｉ Ｉ
Ｐｉｔ ｌ ０
Ｐｖｕ Ｉ ０
８ａｌ Ｉ ０
８ｅａ Ｉ ２
Ｓｍａ ｌ １
ｓｐｈ ｌ ｌ
５ｓｔ ｌ ０
８ｓｔ ＩＩ ０
Ｘｂａ’ ｌ Ｉ
Ｘｍａ Ｉ Ｉ
Ｘｏｒ Ｉｆ ０
（ｂ） ＰＡＪ ２２８ ＤＮＡの制限酵素切断地図
の作成制限酵素はＢＲＬの市販品を使用し、制限酵素に
よるｐＡＪ ２２８ ＤＮＡの切断は、少なくとも３倍
過剰以上の酵素を使用して、各酵素毎に指定された条件
で行なった。制限酵素切断地図作成のためにプラスミド
ＤＮＡを１種以上の制限酵素で切断する場合には、第１
の制限酵素切断断片を分離用アガロースデルよりタナ力
らの方法（Ｔ、 Ｔａｎａｋａ、 ｒ Ｂ。
の作成制限酵素はＢＲＬの市販品を使用し、制限酵素に
よるｐＡＪ ２２８ ＤＮＡの切断は、少なくとも３倍
過剰以上の酵素を使用して、各酵素毎に指定された条件
で行なった。制限酵素切断地図作成のためにプラスミド
ＤＮＡを１種以上の制限酵素で切断する場合には、第１
の制限酵素切断断片を分離用アガロースデルよりタナ力
らの方法（Ｔ、 Ｔａｎａｋａ、 ｒ Ｂ。
Ｗｅｉａｂｌｕｍ、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ＋
１２１ ＋ ３５４ （１９７５））によシ単離後、
エタノール沈澱によシ濃縮し第２の制限酵素で切断した
。切断断片をアガロースダル電気泳動にかけ、分子量を
算出し、制限酵素切断地図を作成した。
１２１ ＋ ３５４ （１９７５））によシ単離後、
エタノール沈澱によシ濃縮し第２の制限酵素で切断した
。切断断片をアガロースダル電気泳動にかけ、分子量を
算出し、制限酵素切断地図を作成した。
（ｃ） ｐＡＪ ２２８のコピー数の測定ｐＡＪ ２
２８を保持するブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムＡＪ １２１４７をトリメトプリム５０μＷを含む
５ゴのＣＭＧ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養後、
その０．Ｉ ＦｒＬｌをトリメトプリム５０μに何を含
む５ｄのＣＭＧ液体培地に再度接種した。
２８を保持するブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムＡＪ １２１４７をトリメトプリム５０μＷを含む
５ゴのＣＭＧ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養後、
その０．Ｉ ＦｒＬｌをトリメトプリム５０μに何を含
む５ｄのＣＭＧ液体培地に再度接種した。
３０℃で対数増殖期の初期まで培養し１０００μＷにな
るようにアンピシリンを添加後、さらに２時間培養し、
遠心分離によシ菌体を集め１０９／Ｍのリゾチームを含
むトリス・ＥＤＴＡ−ＮａＣｔバッファー１．５Ｍに懸
濁し３７℃で２時間インキュベート後、ＳＤＳ （最終
濃度４％）を添加し６５℃、２０分間溶菌した。プロト
プラストは完全に溶菌したことを確認した後、フェノー
ル抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え一２０℃で
ＤＮＡ沈澱させ、沈澱物を少量のトリス・ＥＤＴＡ−Ｎ
ａＣｔバッファーに懸濁した。このＤＮＡ溶液をリボヌ
クレアーゼで処理（リゾヌクレアーゼ１ ｓ ｏ ｔｔ
Ｖｆｎｌで３７℃、６０分間反応）後、再度フェノール
抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え、−２０℃で
ＤＮＡ沈澱させ、沈澱物を少量のトリス・ＥＤＴＡ−Ｎ
ａＣｔバッファーに懸濁後０．８％のアガロースゲル電
気泳動にかけ、泳動ネガフィルムをデンシトメーターに
かけ、染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡの割合を測定し
、染色体ＤＮＡの分子量を３．ＯＸ １０ ダルトン
、ｐＡＪ２２８ ヲ５．ＯＸ １０ ダルトンとして
計算によ多コピー数を求めたところ、染色体あたり１６
コピー存在することか判明した。同様の方法で求めたＰ
ＡＭ３３０のコピー数も１５コピーであっ・た。
るようにアンピシリンを添加後、さらに２時間培養し、
遠心分離によシ菌体を集め１０９／Ｍのリゾチームを含
むトリス・ＥＤＴＡ−ＮａＣｔバッファー１．５Ｍに懸
濁し３７℃で２時間インキュベート後、ＳＤＳ （最終
濃度４％）を添加し６５℃、２０分間溶菌した。プロト
プラストは完全に溶菌したことを確認した後、フェノー
ル抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え一２０℃で
ＤＮＡ沈澱させ、沈澱物を少量のトリス・ＥＤＴＡ−Ｎ
ａＣｔバッファーに懸濁した。このＤＮＡ溶液をリボヌ
クレアーゼで処理（リゾヌクレアーゼ１ ｓ ｏ ｔｔ
Ｖｆｎｌで３７℃、６０分間反応）後、再度フェノール
抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え、−２０℃で
ＤＮＡ沈澱させ、沈澱物を少量のトリス・ＥＤＴＡ−Ｎ
ａＣｔバッファーに懸濁後０．８％のアガロースゲル電
気泳動にかけ、泳動ネガフィルムをデンシトメーターに
かけ、染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡの割合を測定し
、染色体ＤＮＡの分子量を３．ＯＸ １０ ダルトン
、ｐＡＪ２２８ ヲ５．ＯＸ １０ ダルトンとして
計算によ多コピー数を求めたところ、染色体あたり１６
コピー存在することか判明した。同様の方法で求めたＰ
ＡＭ３３０のコピー数も１５コピーであっ・た。
実施例２
実施例１に示したプロトプラスト形質転換法を用いて、
コリネバクテリウム・グルタミヵム（ＡＴＣＣ１３０６
０）をｐＡＪ ２２８を用いて形質転換した後、トリメ
トノリム耐性で選択し、形質転換株を得た。
コリネバクテリウム・グルタミヵム（ＡＴＣＣ１３０６
０）をｐＡＪ ２２８を用いて形質転換した後、トリメ
トノリム耐性で選択し、形質転換株を得た。
また、アガロース電気泳動にょシ、形質転換株がｐＡＪ
２２８を有していることを確認した。
２２８を有していることを確認した。
第１図はプラスミドｐＡＪ ２２８の制限酵素切断地図
である。
である。
Claims (2)
- （１）コリネ型細菌細胞内で増殖し同細胞内に導入され
たときトリメトプリム耐性を表現するプラスミド。 - （２）コリネ型細菌細胞内で増殖し同細胞内に導入され
たときトリメトプリム耐性を表現するプラスミドを有す
るコリネ型細菌。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59128830A JPS619290A (ja) | 1984-06-22 | 1984-06-22 | プラスミド及びそれを有する細菌 |
| EP19850107645 EP0169377B1 (en) | 1984-06-22 | 1985-06-20 | Plasmid and bacteria containing the same |
| DE8585107645T DE3585341D1 (de) | 1984-06-22 | 1985-06-20 | Plasmid und die es enthaltenden bakterien. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59128830A JPS619290A (ja) | 1984-06-22 | 1984-06-22 | プラスミド及びそれを有する細菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS619290A true JPS619290A (ja) | 1986-01-16 |
| JPH0446560B2 JPH0446560B2 (ja) | 1992-07-30 |
Family
ID=14994457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59128830A Granted JPS619290A (ja) | 1984-06-22 | 1984-06-22 | プラスミド及びそれを有する細菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS619290A (ja) |
-
1984
- 1984-06-22 JP JP59128830A patent/JPS619290A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0446560B2 (ja) | 1992-07-30 |
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