JPS61104791A - テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド - Google Patents
テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミドInfo
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- JPS61104791A JPS61104791A JP59226651A JP22665184A JPS61104791A JP S61104791 A JPS61104791 A JP S61104791A JP 59226651 A JP59226651 A JP 59226651A JP 22665184 A JP22665184 A JP 22665184A JP S61104791 A JPS61104791 A JP S61104791A
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のテト
ラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤＩ’ＬＡ断
片、該ＤＮＡ断片と同菌種の微生物細胞内で増殖可能な
プラスミドの自律複製のために必要な遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片とを有する新規ベクタープラスミド及び該ベクタ
ープラスミド會含有する微生物に関する。
ラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤＩ’ＬＡ断
片、該ＤＮＡ断片と同菌種の微生物細胞内で増殖可能な
プラスミドの自律複製のために必要な遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片とを有する新規ベクタープラスミド及び該ベクタ
ープラスミド會含有する微生物に関する。
尚、グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、大意にＬ−グ
ルタミンａｔ−生産することが知られており、またその
変異株により、Ｌ−リジン等のアミノ酸、イノシン酸等
のプリ／ヌクレオチドが生産されている。
ルタミンａｔ−生産することが知られており、またその
変異株により、Ｌ−リジン等のアミノ酸、イノシン酸等
のプリ／ヌクレオチドが生産されている。
（従来の技術）
工業的に極めて有用なグルタミン酸生韮性コリネ型細菌
について、遺伝子工学の手法を用いた育 。
について、遺伝子工学の手法を用いた育 。
種改良が試みられている。それにより同菌ａを宿 ′主
とするに適したベクタープラスミドが、棟々開発されて
きた。この開発の中で最も重要なことは、ベクタープラ
スミド保持菌を効率よく識別することであゃ、このこと
は実用上必要不可欠である。
とするに適したベクタープラスミドが、棟々開発されて
きた。この開発の中で最も重要なことは、ベクタープラ
スミド保持菌を効率よく識別することであゃ、このこと
は実用上必要不可欠である。
そのため様々な選択マーカーを有したベクタープラスミ
ドが試作されている。
ドが試作されている。
これらのベクタープラスミドの中で異種菌白米の選択マ
ーカーを利用したものとしては、以下のものがある。
ーカーを利用したものとしては、以下のものがある。
■ プラスミドｐＯＥ５４ ：大腸菌プラスミドｐＧＡ
２２由来のテトラサイクリン耐性、クロラムフェニコー
ル耐性、カナマイ７ノ耐性を選択マーカーとしている。
２２由来のテトラサイクリン耐性、クロラムフェニコー
ル耐性、カナマイ７ノ耐性を選択マーカーとしている。
（特開昭５８−１０５９９９号、特開昭５８−１２６７
８９号） ■ プラスミドＩ）ＣＢ１０１ ：スタフイロコツカ
ス由来のプラスミドｆ）ＵＢＩＩＯのカナマイシン耐性
を選択マーカーとしている。（％開昭５８−１０５９９
９号） ■ プラスミドｐＥｔｈｒｌ： 大腸菌のスレオニンオ
ペロンの発現による栄養要求性の回復を選択マーカーと
している。（特開昭５８−１０５９９９号）■ プラス
ミドｐＡＪ４３：大腸菌プラスミドｐＢ几３２５由来の
クロラムフェニコール耐性ｋｙｌｌ択マーカーとしてい
る。（特開昭５９−１２００９０号）■ プラスミドｐ
ＡＪ６５５ ：大腸菌プラスミドｐＢＲ３２５由来の
クロラムフェニコール耐性を選択マーカーとしている。
８９号） ■ プラスミドＩ）ＣＢ１０１ ：スタフイロコツカ
ス由来のプラスミドｆ）ＵＢＩＩＯのカナマイシン耐性
を選択マーカーとしている。（％開昭５８−１０５９９
９号） ■ プラスミドｐＥｔｈｒｌ： 大腸菌のスレオニンオ
ペロンの発現による栄養要求性の回復を選択マーカーと
している。（特開昭５８−１０５９９９号）■ プラス
ミドｐＡＪ４３：大腸菌プラスミドｐＢ几３２５由来の
クロラムフェニコール耐性ｋｙｌｌ択マーカーとしてい
る。（特開昭５９−１２００９０号）■ プラスミドｐ
ＡＪ６５５ ：大腸菌プラスミドｐＢＲ３２５由来の
クロラムフェニコール耐性を選択マーカーとしている。
（特開昭５８−２１６１９９号、特開昭５９−１２００
９０号） ■ プラスミドｐＡＪ４４０、プラスミドＩ）ＡＪ３１
４８：スタフィロコッカス由来のシラスミドｐＵＢ １
１０のカナマイシン耐性ｔａ択マーカーとしている（％
開昭５８−２１６１９９号） 以上のプラスミドは、主に大腸菌や枯草菌で用いられて
いるベクタープラスミドの薬剤耐性遺伝子を利用したも
のである。
９０号） ■ プラスミドｐＡＪ４４０、プラスミドＩ）ＡＪ３１
４８：スタフィロコッカス由来のシラスミドｐＵＢ １
１０のカナマイシン耐性ｔａ択マーカーとしている（％
開昭５８−２１６１９９号） 以上のプラスミドは、主に大腸菌や枯草菌で用いられて
いるベクタープラスミドの薬剤耐性遺伝子を利用したも
のである。
またグルタミン酸生産性コリネ型細菌由来の選択マーカ
ーを利用した細菌へのベクタープラスミドとしては、以
下のものがある。
ーを利用した細菌へのベクタープラスミドとしては、以
下のものがある。
■ プラスミドＩ）ＯＧＩＩ：コリネバクテリウムのプ
ラスミドｐＯＧ ４由来のストレプトマイシンおよびス
ペクチノマイシン耐性を選択マーカーとしている。（特
開昭５７−１８３７９９号、特開昭５８−１０５９９９
号） ■ グラスミドＰＣＢＩＯＩ、プラスミドｐ、ｇｔｈｒ
ｌ ニブ２スミドｐＣＧ４由来のストレプトマイシン
およびスペクチノマイシン耐性を選択マーカーとしてい
る。（特開昭５ｓ−ｉｏｓす９９号）グルタミン酸生産
性コリネ型細菌の薬剤耐性遺伝子としては、ストレプト
マイクンおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子しか発見
されていない。
ラスミドｐＯＧ ４由来のストレプトマイシンおよびス
ペクチノマイシン耐性を選択マーカーとしている。（特
開昭５７−１８３７９９号、特開昭５８−１０５９９９
号） ■ グラスミドＰＣＢＩＯＩ、プラスミドｐ、ｇｔｈｒ
ｌ ニブ２スミドｐＣＧ４由来のストレプトマイシン
およびスペクチノマイシン耐性を選択マーカーとしてい
る。（特開昭５ｓ−ｉｏｓす９９号）グルタミン酸生産
性コリネ型細菌の薬剤耐性遺伝子としては、ストレプト
マイクンおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子しか発見
されていない。
故に前述したプラスミドは、全て同薬剤耐性遺伝子を利
用しているものであり、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌由来の薬剤耐性遺伝子を利用したベクタープラスミド
は、未だ開発されていない。
用しているものであり、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌由来の薬剤耐性遺伝子を利用したベクタープラスミド
は、未だ開発されていない。
（発明が解決しようとする問題点）
グルタミン酸生産性コリネ凰細菌では、実用的なベクタ
ーグラスミドの開発が遅れている。これが、同菌種の遺
伝子工学の手法による育種改良を遅らせている原因の一
つになっている。従って他の菌種と同様に同菌種におい
ても、薬剤耐性を選択マーカーとしたよシ実用性の高い
ベクタープラスミドを開発する必要がある。
ーグラスミドの開発が遅れている。これが、同菌種の遺
伝子工学の手法による育種改良を遅らせている原因の一
つになっている。従って他の菌種と同様に同菌種におい
ても、薬剤耐性を選択マーカーとしたよシ実用性の高い
ベクタープラスミドを開発する必要がある。
ところでテトラサイクリン耐性を選択マーカーとした同
菌稿のベクターシラスミドとしては、プラスミドｐＯＥ
５４が開発されているたけである。これは、大腸菌のプ
ラスミドｐＧＡ２２由来のテトラサイクリン耐性を選択
マーカーとしている。しかしこのプラスミドによって宿
主のグルタミン酸生産性コリネ型細菌に付与されるテト
ラサイクリン耐性度は小さく、宿主のテトラサイクリン
による最小生育阻止ＩＩ度を０．１μｆ／ｎｄから３．
２μＳ’／ｄに増大させただけであった。これは大腸菌
でテトラサイクリン耐性形質転換株を選択するために一
般に用いられている培地中のテトラサイクリン濃度ｌＯ
μ？／ｍｌに比べると、かなり低い濃度である。
菌稿のベクターシラスミドとしては、プラスミドｐＯＥ
５４が開発されているたけである。これは、大腸菌のプ
ラスミドｐＧＡ２２由来のテトラサイクリン耐性を選択
マーカーとしている。しかしこのプラスミドによって宿
主のグルタミン酸生産性コリネ型細菌に付与されるテト
ラサイクリン耐性度は小さく、宿主のテトラサイクリン
による最小生育阻止ＩＩ度を０．１μｆ／ｎｄから３．
２μＳ’／ｄに増大させただけであった。これは大腸菌
でテトラサイクリン耐性形質転換株を選択するために一
般に用いられている培地中のテトラサイクリン濃度ｌＯ
μ？／ｍｌに比べると、かなり低い濃度である。
大腸菌のプラスミドｐＧＡ２２由来のテトラサイクリン
耐性遺伝子は、大腸菌の細胞内ではその機能を充分発揮
でき、宿主に高い耐性度を付与することができるがグル
タミン酸生産性コリネ型細菌の細胞内では該遺伝子は、
発現はするがその機能を充分発揮することができず、宿
主に付与でさる酊性度も低い。その為に、同菌種におい
てテトラサイクリン耐性を選択マーカーとして、プ・ラ
スミドＰＧＡ２２による形質転換株を選択する場合、非
形質転換株が混入するり能性が高い。
耐性遺伝子は、大腸菌の細胞内ではその機能を充分発揮
でき、宿主に高い耐性度を付与することができるがグル
タミン酸生産性コリネ型細菌の細胞内では該遺伝子は、
発現はするがその機能を充分発揮することができず、宿
主に付与でさる酊性度も低い。その為に、同菌種におい
てテトラサイクリン耐性を選択マーカーとして、プ・ラ
スミドＰＧＡ２２による形質転換株を選択する場合、非
形質転換株が混入するり能性が高い。
従って、グルタミン酸生産性コリネ型細菌の細胞中でそ
の機能を充分発揮できるように、同菌種由米のテトラサ
イクリン耐性遺伝子を分離し、該遺伝子を利用したベク
タープラスミドを開発する必要がめった。
の機能を充分発揮できるように、同菌種由米のテトラサ
イクリン耐性遺伝子を分離し、該遺伝子を利用したベク
タープラスミドを開発する必要がめった。
（問題を解決する為の手段および作用）本発明者らは、
グルタミン生産性コリネ型細菌由来のテトラサイクリン
耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離し、史、
に該ＤＮＡ断片と同菌種の細胞内で増殖可能なプラスミ
ドの自律複製のために必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片と
を有する新規ベクターシラスミドを開発し、本発明を完
成した。
グルタミン生産性コリネ型細菌由来のテトラサイクリン
耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離し、史、
に該ＤＮＡ断片と同菌種の細胞内で増殖可能なプラスミ
ドの自律複製のために必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片と
を有する新規ベクターシラスミドを開発し、本発明を完
成した。
グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、ダラム染色陽性、
非運動性、好気性で胞子をつくらず、ビオチンを要求す
る。更に同細菌は、ビオチン制限培地で、または高濃度
ビオチン含有培地では界面活性剤の添加によシ培地中に
Ｌ−グルタミン酸を著量蓄積する。その複製的な微生物
としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、またはミクロノ９クテリウム属に属する微生物が挙
けられる。
非運動性、好気性で胞子をつくらず、ビオチンを要求す
る。更に同細菌は、ビオチン制限培地で、または高濃度
ビオチン含有培地では界面活性剤の添加によシ培地中に
Ｌ−グルタミン酸を著量蓄積する。その複製的な微生物
としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、またはミクロノ９クテリウム属に属する微生物が挙
けられる。
グルタミン酸生産性コリネ型細菌の細胞内で自律複製可
能なシラスミｒの具体例としては、プラスミドｐＡＧ
１ 、 ｐＡＧ ３等があげられる。これらのプラスミ
ドは、本発明者らが分離した新規グラスミドであり、特
願昭５９−１７２３９５ジ、特願昭５９−１７２３９６
号でそれぞれ開示したものである。これらのシラスミド
を保持する菌株コリネバクテリウム・メラセコラ（（３
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ ｌ ２２２４３ （微工研条寄第５６０号）、コリ
ネバクテリウム・メラセコラ（（３ｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） ２２２２０
（微工研条苛！５５９号）は、微生物工業技術研究所
に寄託されている。
能なシラスミｒの具体例としては、プラスミドｐＡＧ
１ 、 ｐＡＧ ３等があげられる。これらのプラスミ
ドは、本発明者らが分離した新規グラスミドであり、特
願昭５９−１７２３９５ジ、特願昭５９−１７２３９６
号でそれぞれ開示したものである。これらのシラスミド
を保持する菌株コリネバクテリウム・メラセコラ（（３
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ ｌ ２２２４３ （微工研条寄第５６０号）、コリ
ネバクテリウム・メラセコラ（（３ｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） ２２２２０
（微工研条苛！５５９号）は、微生物工業技術研究所
に寄託されている。
本発明のグルタミン酸生産性コリネ型細菌由来でテトラ
サイクリン耐性に関与する遺伝子を宮むＤＮＡ断片とは
、同菌種より分離されたテトラサイクリン耐性に関与す
る遺伝子を含むＤＮＡ断片である。
サイクリン耐性に関与する遺伝子を宮むＤＮＡ断片とは
、同菌種より分離されたテトラサイクリン耐性に関与す
る遺伝子を含むＤＮＡ断片である。
具体的には、プラスミドｐＡＧ１ 、 ｐＡＧｌ２ 、
ｐＡＧｌ４゜ｐＡＧ ３１ 、 ｐＡＧ３２ 、 ｐ
ＡＧ５０由来のＤＮＡ断片で、そのＤＮＡ上に存在する
遺伝子が同菌種の細胞内で発現して宿主をテトラサイク
リン耐性にする性質を有するものであればよい、、また
これらのＤＮＡ断片でその一部のＤＮＡを、遺伝子工学
の手法によシ変頁して、その結果得られたＤＮＡ断片を
適当なプラスミドに組み込んで宿主に移入することによ
って、その宿主をテトラサイクリン耐性とすることもで
き、このようなりＮＡｌｌＴ片も本発明のＤＮＡ断片に
含まれる。
ｐＡＧｌ４゜ｐＡＧ ３１ 、 ｐＡＧ３２ 、 ｐ
ＡＧ５０由来のＤＮＡ断片で、そのＤＮＡ上に存在する
遺伝子が同菌種の細胞内で発現して宿主をテトラサイク
リン耐性にする性質を有するものであればよい、、また
これらのＤＮＡ断片でその一部のＤＮＡを、遺伝子工学
の手法によシ変頁して、その結果得られたＤＮＡ断片を
適当なプラスミドに組み込んで宿主に移入することによ
って、その宿主をテトラサイクリン耐性とすることもで
き、このようなりＮＡｌｌＴ片も本発明のＤＮＡ断片に
含まれる。
また本発明における新規ベクタープラスミドの具体例と
しては、シラスミｒｐＡＧ１の幅小化によって得られた
シラスミ、ドｐＡＧ１２ 、 ｐＡＧｌ ４ 、 ｐＡ
Ｇ３１ 。
しては、シラスミｒｐＡＧ１の幅小化によって得られた
シラスミ、ドｐＡＧ１２ 、 ｐＡＧｌ ４ 、 ｐＡ
Ｇ３１ 。
ｐＡＧ３２およびプラスミドｐＡＧ１４由来のテトラサ
イクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片とプラスミドｐＡ
ｏ ３とより作成された組換えプラスミドｐＡＧ５０が
挙げられる。
イクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片とプラスミドｐＡ
ｏ ３とより作成された組換えプラスミドｐＡＧ５０が
挙げられる。
本発明のベクタープラスミドは、グルタミン酸生産性コ
リネ型細菌由来のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝
子を含むＤＮＡ断片を有するもので 。
リネ型細菌由来のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝
子を含むＤＮＡ断片を有するもので 。
あり、該ベクタープラスミドによってテトラサイクリン
耐性に形質転換されたグルタミン酸生産性コリネ型細菌
のテトラサイクリン最小生育阻止濃度は、１０μｆ／ｒ
ｄ以上となる。一方、同菌釉のテトラサイクリン最小生
育阻止濃度は、一般に１μｍ／耐前後である。従って、
テトラサイクリン濃度１０μｔ／ｍｅの培地を用いるこ
とにより、上述のベクターシラスミドにより形質転換さ
れた菌株のみを確実に選択することができる。これは、
同菌種の遺伝子操作を行う上で極めて有利である。
耐性に形質転換されたグルタミン酸生産性コリネ型細菌
のテトラサイクリン最小生育阻止濃度は、１０μｆ／ｒ
ｄ以上となる。一方、同菌釉のテトラサイクリン最小生
育阻止濃度は、一般に１μｍ／耐前後である。従って、
テトラサイクリン濃度１０μｔ／ｍｅの培地を用いるこ
とにより、上述のベクターシラスミドにより形質転換さ
れた菌株のみを確実に選択することができる。これは、
同菌種の遺伝子操作を行う上で極めて有利である。
尚、本文中で用いる制限酵素の名称は、次の１種から得
られる制限酵素の略称である。
られる制限酵素の略称である。
ＥｃｏＲＩ ：エシエリヒアーコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌ ｉＩＬＹ１３） ＢａｍＨＩ ：ノ々チルス・アミロリクエファシェンス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｉ月Ｂｇ’ｌ ＩＩ ：バチルス・グロビギイ（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ −ｇｌｏｈｉｇｉｉ）Ｈａｅｌｌｌ
： ヘモフィラス・エジプテイウス（Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ・ａｅｇｙｐｔｉｕｓ ）Ｈｉｎｄｎｌ：ヘモ
フィラス・インフルエンザａｄ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ ）ｐｓｉ ［：
プロビデンシア・ステニア−ティー１６４ （Ｐｒｏｖ
ｉｄｅｎｃｉａ ５ｔｕａｒｔｉｉ １６４ ））（ｂ
ａ ｌ ：キサ／トモナスーパドリ０（ａｎｔｈｏｍｏ
ｎａｓｂａｄｒｉｉ ） 以下、各組換えベクタープラスミドおよびテトラサイク
リン耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片について、
更に詳しく説明する。
ｈｉａ ｃｏｌ ｉＩＬＹ１３） ＢａｍＨＩ ：ノ々チルス・アミロリクエファシェンス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｉ月Ｂｇ’ｌ ＩＩ ：バチルス・グロビギイ（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ −ｇｌｏｈｉｇｉｉ）Ｈａｅｌｌｌ
： ヘモフィラス・エジプテイウス（Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ・ａｅｇｙｐｔｉｕｓ ）Ｈｉｎｄｎｌ：ヘモ
フィラス・インフルエンザａｄ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ ）ｐｓｉ ［：
プロビデンシア・ステニア−ティー１６４ （Ｐｒｏｖ
ｉｄｅｎｃｉａ ５ｔｕａｒｔｉｉ １６４ ））（ｂ
ａ ｌ ：キサ／トモナスーパドリ０（ａｎｔｈｏｍｏ
ｎａｓｂａｄｒｉｉ ） 以下、各組換えベクタープラスミドおよびテトラサイク
リン耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片について、
更に詳しく説明する。
プラスミドｐＡＧ１２ 、 ｐＡＧｌ ４プラスミドｐ
ＡＧ１２ 、 ｐＡＧｌ４は、プラスミドｐＡＧｌより
、次の様にして作製することができる。プラスミドｐＡ
Ｇ１は、その保有面コリネノ々クテリウム・メラセコラ
（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ ） ２２２４３ （微工研条寄第５６０号）の
培養菌体よシ、リゾチウム・ＳＤＳ処理、同浴菌液のフ
ェノール・クロロホルム処理、同処理液のエタノール沈
殿処理、同沈澱物質のエチジウムブロマイドを含む塩化
セシウム平衡密度勾配遠心により、容易に分離精製され
る。プラスミドｐＡＧ１には、制限酵素ＥｃｏＲＩの切
断部位が８箇所存在しており、これらを利用して、シラ
スミドｐＡＧ１を縮小化する。シラスミドｐＡＧ１を制
限酵素ＦＸｃｏ几Ｉで完全消化して直鎖状にした後、Ｔ
４ファージＤＮＡリガーゼを作用させ、環状のＤＮ人分
子を作製する。目的とするテトラサイクリン耐性遺伝子
及び自律複製のだめに必櫟な遺伝子を含むプラスミドは
、同反応液を用いてグルタミン酸生産性コリネ型細菌を
形質転換した後、その中からテトラサイクリン耐性の形
質転換株を分離し、これらの形質転換株の保有するプラ
スミドを解析することによって取得される。ＤＮＡリガ
ーゼ反応物による形質転換は、通常枯卑菌等で用いられ
ているプロトプラストを用いたりし實転換体により、実
施することができる。
ＡＧ１２ 、 ｐＡＧｌ４は、プラスミドｐＡＧｌより
、次の様にして作製することができる。プラスミドｐＡ
Ｇ１は、その保有面コリネノ々クテリウム・メラセコラ
（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ ） ２２２４３ （微工研条寄第５６０号）の
培養菌体よシ、リゾチウム・ＳＤＳ処理、同浴菌液のフ
ェノール・クロロホルム処理、同処理液のエタノール沈
殿処理、同沈澱物質のエチジウムブロマイドを含む塩化
セシウム平衡密度勾配遠心により、容易に分離精製され
る。プラスミドｐＡＧ１には、制限酵素ＥｃｏＲＩの切
断部位が８箇所存在しており、これらを利用して、シラ
スミドｐＡＧ１を縮小化する。シラスミドｐＡＧ１を制
限酵素ＦＸｃｏ几Ｉで完全消化して直鎖状にした後、Ｔ
４ファージＤＮＡリガーゼを作用させ、環状のＤＮ人分
子を作製する。目的とするテトラサイクリン耐性遺伝子
及び自律複製のだめに必櫟な遺伝子を含むプラスミドは
、同反応液を用いてグルタミン酸生産性コリネ型細菌を
形質転換した後、その中からテトラサイクリン耐性の形
質転換株を分離し、これらの形質転換株の保有するプラ
スミドを解析することによって取得される。ＤＮＡリガ
ーゼ反応物による形質転換は、通常枯卑菌等で用いられ
ているプロトプラストを用いたりし實転換体により、実
施することができる。
こうして得られる形質転換株の保有するプラスミドＤＮ
Ａは、前記に示した方法により培養菌体から分離精製で
き、更に各徨制限酵素で消化して生成するＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル
電気泳動で解析することにより、その構造を知ることが
できる。形質転換株からそれぞれ分離されたプラスミド
が、プラスミドｐＡ（）１２．ｐＡＧｌ４である。第３
図、第４図にそれぞれプラスミドＩ）ＡＧ１２，１）Ａ
Ｇ１４の制限酵素地図を示す。シラスミドｐＡＧ１２．
ｐＡＧ１４は、プラスミドｐＡＧ１由来の２つのＥｃｏ
ＲＩ断片がそれぞれ逆方向、順方向に結合した組換えプ
ラスミドである。
Ａは、前記に示した方法により培養菌体から分離精製で
き、更に各徨制限酵素で消化して生成するＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル
電気泳動で解析することにより、その構造を知ることが
できる。形質転換株からそれぞれ分離されたプラスミド
が、プラスミドｐＡ（）１２．ｐＡＧｌ４である。第３
図、第４図にそれぞれプラスミドＩ）ＡＧ１２，１）Ａ
Ｇ１４の制限酵素地図を示す。シラスミドｐＡＧ１２．
ｐＡＧ１４は、プラスミドｐＡＧ１由来の２つのＥｃｏ
ＲＩ断片がそれぞれ逆方向、順方向に結合した組換えプ
ラスミドである。
両シラスミド共、制限酵素Ｘｂａ Ｉの切断部位が、１
箇所である。また、テトラサイクリン耐性を選択マーカ
ーとして使用することができるので、グルタミン酸生産
性コリネ型細菌において、同シラスミドによる形質転換
株をより一層効率良く選択することができる。
箇所である。また、テトラサイクリン耐性を選択マーカ
ーとして使用することができるので、グルタミン酸生産
性コリネ型細菌において、同シラスミドによる形質転換
株をより一層効率良く選択することができる。
プラスミドｐＡＧ３１ 、 ｐＡＧ３２ズラスミドｐＡ
Ｇ３１ 、 ｐＡＧ３２は、次の様にして、プラスミド
ｐＡＧ１２をより縮小化することにより、作製すること
ができる。前述の様にして得られたシラスミドｐＡＧ１
２のプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ” （Ｔ
、 Ｉ 、Ｔ ＩＫＯＨＯＮＢＮＫＯ、Ｅ 、Ｖ、Ｋ
ＡＲＡＭＯＶ 、 Ｂ、Ａ。
Ｇ３１ 、 ｐＡＧ３２は、次の様にして、プラスミド
ｐＡＧ１２をより縮小化することにより、作製すること
ができる。前述の様にして得られたシラスミドｐＡＧ１
２のプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ” （Ｔ
、 Ｉ 、Ｔ ＩＫＯＨＯＮＢＮＫＯ、Ｅ 、Ｖ、Ｋ
ＡＲＡＭＯＶ 、 Ｂ、Ａ。
ＺＡＶＩＺＩＯＮ ａｎｄ Ｂ、Ｓ、ＮＡＲＯＤＩ
ＴＳＫＹ ： Ｇｅｎｅ 、４ 。
ＴＳＫＹ ： Ｇｅｎｅ 、４ 。
１９５−２１２ ＜ １９７８ ） ）で部分消化して
鎖状にした後、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼを作用させ
環状ＤＮＡ分子を作製する。この反応液の中からの目的
とするテトラサイクリン耐性遺伝子及び自律複製だめに
必要な遺伝子を含むプラスミドは、同反応ｒＬを用いて
グルタミン酸生産性コリネ型細菌を形質転換してテトラ
サイクリン耐性の形質転換株を分離し、これらの形質転
換株の保有するプラスミドを解析することにより取得さ
れる。
鎖状にした後、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼを作用させ
環状ＤＮＡ分子を作製する。この反応液の中からの目的
とするテトラサイクリン耐性遺伝子及び自律複製だめに
必要な遺伝子を含むプラスミドは、同反応ｒＬを用いて
グルタミン酸生産性コリネ型細菌を形質転換してテトラ
サイクリン耐性の形質転換株を分離し、これらの形質転
換株の保有するプラスミドを解析することにより取得さ
れる。
この様にして得られる形質転換株の保有するシラスミド
は、前記に示した方法により培養菌体から分離精製でき
、史に各種制限酵素で消化して生成するＤＮＡ断片をア
ガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル電
気泳動により解析することにより、′その構造を知るこ
とができる。形質転換株からそれぞれ分離されたシラス
ミドが゛、シラスミドｐＡＧ３１ 、 ｐＡＧ３２であ
る。第５図、第６図にそれぞれプラスミドｐＡＧ３１
、 ｐＡＧ３２の制限酵素地図を示す。プラスミドｐＡ
Ｇ３１ 、 ｐＡＧ３２は、プラスミドｐＡＧ１２の２
つの１ｃｏＲＩ断片が靴小されながらそれぞれ順方向、
逆方向に結合した組換えシラスミドである。プラスミド
ｐＡＧ３１は、制限酵素ＢａｍＨＩ、 ＥｃｏＲＩによ
る切断部位が各１箇所であり、シラスミドｐＡＧ３２は
、制限酵素Ｂ ａｒｎＨＩ ＋ ｇｃｏ几Ｉ。
は、前記に示した方法により培養菌体から分離精製でき
、史に各種制限酵素で消化して生成するＤＮＡ断片をア
ガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル電
気泳動により解析することにより、′その構造を知るこ
とができる。形質転換株からそれぞれ分離されたシラス
ミドが゛、シラスミドｐＡＧ３１ 、 ｐＡＧ３２であ
る。第５図、第６図にそれぞれプラスミドｐＡＧ３１
、 ｐＡＧ３２の制限酵素地図を示す。プラスミドｐＡ
Ｇ３１ 、 ｐＡＧ３２は、プラスミドｐＡＧ１２の２
つの１ｃｏＲＩ断片が靴小されながらそれぞれ順方向、
逆方向に結合した組換えシラスミドである。プラスミド
ｐＡＧ３１は、制限酵素ＢａｍＨＩ、 ＥｃｏＲＩによ
る切断部位が各１箇所であり、シラスミドｐＡＧ３２は
、制限酵素Ｂ ａｒｎＨＩ ＋ ｇｃｏ几Ｉ。
Ｈｉｎｄｌｌｌによる切断部位が各１箇所である。両プ
ラスミド共、一般によく用いられている制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩの切断部位が１箇所である為、同部位へのＤＮＡ断
片のクローニングが容易である。更にテトラサイクリン
耐性を選択マーカーとして使用することができるので、
ＤＮＡ断片のクローン化を、グルタミン酸生産性コリネ
型細菌において、より一層効率良〈実施することができ
る。
ラスミド共、一般によく用いられている制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩの切断部位が１箇所である為、同部位へのＤＮＡ断
片のクローニングが容易である。更にテトラサイクリン
耐性を選択マーカーとして使用することができるので、
ＤＮＡ断片のクローン化を、グルタミン酸生産性コリネ
型細菌において、より一層効率良〈実施することができ
る。
プラスミドｐＡＧ５０
プラスミドｐＡｏｓｏは、プラスミドｐＡＧ３の制限酵
素ＢａｍＨＩの唯一の切断部位に、前述のプラスミドｐ
ＡＧ１４のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含
むＢａｍＨＩ −Ｂｇｌ ＩＩ断片を、両者の同一接着
末端を利用して結合せしめた組換えプラスミドである。
素ＢａｍＨＩの唯一の切断部位に、前述のプラスミドｐ
ＡＧ１４のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含
むＢａｍＨＩ −Ｂｇｌ ＩＩ断片を、両者の同一接着
末端を利用して結合せしめた組換えプラスミドである。
プラスミドｐＡＧ３は、本発明者らによシ先にコリネバ
クテリウム・メラセコラ（ＱｏｒｙｎｅｂａＣｔｅｒｉ
ｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） ２２２２０ （倣工
研条寄第５５９号）ニジ分離されたものである。
クテリウム・メラセコラ（ＱｏｒｙｎｅｂａＣｔｅｒｉ
ｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） ２２２２０ （倣工
研条寄第５５９号）ニジ分離されたものである。
先づＴ４ファージＤＮＡハガーゼ存在下で、プラスミ）
’Ｉ）ＡＧ３のＢａｍＨＩ断片とテトラサイクリン耐性
プラスミドｐＡＧ １４のＢａｍＨＩ Ｂｇｌ■断片
とを反応させる。次にこの反応液からのプラスミドｐＡ
Ｇ５０の選択は、上記リガーゼ反応液を用いてグルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌を形質転換してテトラサイクリ
ン耐性形質転換株を分離し、これらの形質転換株の保有
するプラスミドを解析することによって行なわｎる。第
７図にｐＡＧ５０の制限酵素地図を示す。プラスミドＩ
）ＡＧ５０は、制、限酵索ＢａｍＨＩ、 ｇｃｏＲＬ
Ｈｉｎｄｌｌｌ、 ８ａｌ Ｉ 、 ＸｂａｌのｙＪ［
ｅｒ部位が各１箇所である。更にテトラサイクリン耐性
を選択マーカーとして使用することができるので、ＤＮ
Ａ断片のクローン化を、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌においてより一層効率よく実施することができる。
’Ｉ）ＡＧ３のＢａｍＨＩ断片とテトラサイクリン耐性
プラスミドｐＡＧ １４のＢａｍＨＩ Ｂｇｌ■断片
とを反応させる。次にこの反応液からのプラスミドｐＡ
Ｇ５０の選択は、上記リガーゼ反応液を用いてグルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌を形質転換してテトラサイクリ
ン耐性形質転換株を分離し、これらの形質転換株の保有
するプラスミドを解析することによって行なわｎる。第
７図にｐＡＧ５０の制限酵素地図を示す。プラスミドＩ
）ＡＧ５０は、制、限酵索ＢａｍＨＩ、 ｇｃｏＲＬ
Ｈｉｎｄｌｌｌ、 ８ａｌ Ｉ 、 ＸｂａｌのｙＪ［
ｅｒ部位が各１箇所である。更にテトラサイクリン耐性
を選択マーカーとして使用することができるので、ＤＮ
Ａ断片のクローン化を、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌においてより一層効率よく実施することができる。
尚、上記の形質転換実験では、宿主のグルタミン酸生産
性コリネ型細菌の具体例として、コリネバクテリウム・
メラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ ） ２２２４３ （微工研条寄第５６
０号）のプラスミドキュアート株、又はコリネバクテリ
ウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｌａｓａｅｃｏｌａ ） ８０１ （微工研条寄
第５５８号）を用いた。本来プラスミドを保有していな
いグルタミン酸生産性コリネ型細菌の具体例として用い
たコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉＩｊＴＩｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） ８０
１ （微工研条寄第５５８号）は、新たに土壌から分離
された菌株である。その苗字的性質と分類同定理由は、
以下の通りである。
性コリネ型細菌の具体例として、コリネバクテリウム・
メラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ ） ２２２４３ （微工研条寄第５６
０号）のプラスミドキュアート株、又はコリネバクテリ
ウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｌａｓａｅｃｏｌａ ） ８０１ （微工研条寄
第５５８号）を用いた。本来プラスミドを保有していな
いグルタミン酸生産性コリネ型細菌の具体例として用い
たコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉＩｊＴＩｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） ８０
１ （微工研条寄第５５８号）は、新たに土壌から分離
された菌株である。その苗字的性質と分類同定理由は、
以下の通りである。
菌学的性質
ｆｉｌ 顎微鏡による所見
辿乞（０，５−１，０）Ｘ（０，８−２，０）ミクロン
の桿菌で、大小不同のものを含む。スナツピングディビ
ジョンによるＶ字状配列と多形性を示す。ダラム染色陽
性、非運動性で、胞子をつくらない。
の桿菌で、大小不同のものを含む。スナツピングディビ
ジョンによるＶ字状配列と多形性を示す。ダラム染色陽
性、非運動性で、胞子をつくらない。
（２）培養による所見
ブ・イヨン寒天平板上の集落は、辺縁のはつきりした正
円形で、不透明で光沢があり、色は黄色である。寒天斜
面上では接Ｐ！Ａ線に沿って線状に旺盛な生育を示し、
臭気や培地の着色はない。寒天穿 □刺培養では、最上
部で旺盛な生育を示す。液体ブイヨン培地では均質に濁
り、表面にリングを形成する。
円形で、不透明で光沢があり、色は黄色である。寒天斜
面上では接Ｐ！Ａ線に沿って線状に旺盛な生育を示し、
臭気や培地の着色はない。寒天穿 □刺培養では、最上
部で旺盛な生育を示す。液体ブイヨン培地では均質に濁
り、表面にリングを形成する。
（３）生理的性質
ａ１温度＝２５℃−３７℃で生育する。
ｂ 、、ｐＨ： ｐＨ６−ｐＨ９で生育可能である。
Ｃ１耐熱性：１０％スキムミルク中で５５℃前後で１５
分程度の耐熱性を有する。
分程度の耐熱性を有する。
ｄ１好気性である。
ｅ、ゼラチンを液化しない。
ｆｌ リトマスミルクヲ変化させない。
ｇ１インドールを生産しない。
ｈｌ フォーゲス・プロスカラエル試験（ｖｏｇｅｓ
−Ｐｒｏｓ Ｋａｕｅｒ ｔｅｓｔ ） ：陰性。
−Ｐｒｏｓ Ｋａｕｅｒ ｔｅｓｔ ） ：陰性。
１％硫化水素を生成しない。
ｊ１メチルレッド試験：陽性。
ｋ、硝酸塩還元性：陰性。
１、クエン酸全利用しない。
ｍ１デンプンを液化しない。
ｎ１ウレアーゼ生成：陽性。
０、カタラーゼ生成：陽性。
ｐ、各棟炭水化物からの酸の生成ニゲルコース、フラク
トース、７ユークロース、マルトース、マンノースよシ
酸を生成するが、マンニトール、キシロース、アラビノ
ース、ラフィノース、ラクトースからは酸を生成しない
。
トース、７ユークロース、マルトース、マンノースよシ
酸を生成するが、マンニトール、キシロース、アラビノ
ース、ラフィノース、ラクトースからは酸を生成しない
。
ｑｌ ビチオンを要求する。
ｒｌ ビオチン制限培地で、または高濃度ビオチン含有
培地では界面活性剤の添加により、培地中にＬ−グルタ
ミン酸を著量蓄積する。
培地では界面活性剤の添加により、培地中にＬ−グルタ
ミン酸を著量蓄積する。
上記の菌学的性質を有する８０１菌についてその分類学
上の位置を、パーシーズ・マニュアル・オプ・デターミ
ネイディブ・バクテリオロジー第８版（Ｂｅｒｇｅｙｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙｇｉｇｈｔｈ ｌｉ：ｄｉｔ
ｉｏｎ ）および登録番号５７６６９０の特許を参照し
、更にコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） （
ＡＴＯＯ１７９６５）をタイプカルチャーとして比較検
討した結果、８０１株は、コリネバクテリウム・メラセ
コラ（Ｃｏｒｙｎ−ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓ
ｓｅｃｏｌａ ）に極めてよく一致していた、それ故、
８０１株をコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）
と同定した。尚、コリネパクテリウＡ−メラセコラ（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ
） ８０１は、微生物工業研究所に寄託され、その寄
託番号は、微工研条寄第５５８号である。
上の位置を、パーシーズ・マニュアル・オプ・デターミ
ネイディブ・バクテリオロジー第８版（Ｂｅｒｇｅｙｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙｇｉｇｈｔｈ ｌｉ：ｄｉｔ
ｉｏｎ ）および登録番号５７６６９０の特許を参照し
、更にコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） （
ＡＴＯＯ１７９６５）をタイプカルチャーとして比較検
討した結果、８０１株は、コリネバクテリウム・メラセ
コラ（Ｃｏｒｙｎ−ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓ
ｓｅｃｏｌａ ）に極めてよく一致していた、それ故、
８０１株をコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）
と同定した。尚、コリネパクテリウＡ−メラセコラ（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ
） ８０１は、微生物工業研究所に寄託され、その寄
託番号は、微工研条寄第５５８号である。
ＤＮＡ断片
グルタミン酸生並性コリネ型細菌由来のテトラサイクリ
ン耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片は、具体的に
は次の様にして取り出すことができる。プラスミドｐＡ
Ｇ３の制限酵素ＢａｍＨＩの唯一の切断部位に、プラス
ミドｆ）ＡＧ １４の約３．２キロベースの大きさのＢ
ａｍＨＩ −Ｂｇｌ ＩＩ断片を組込む。この様にして
作製された組換えグラスミド１）ＡＧ５０は、宿主をテ
トラサイクリン耐性に形質転換することができ、この能
力が約３．２キロベースの大きさのＢａｍＨＩ Ｂｇ
Ｉ ＩＩ断片上の遺伝子に備わっていることが解る。
ン耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片は、具体的に
は次の様にして取り出すことができる。プラスミドｐＡ
Ｇ３の制限酵素ＢａｍＨＩの唯一の切断部位に、プラス
ミドｆ）ＡＧ １４の約３．２キロベースの大きさのＢ
ａｍＨＩ −Ｂｇｌ ＩＩ断片を組込む。この様にして
作製された組換えグラスミド１）ＡＧ５０は、宿主をテ
トラサイクリン耐性に形質転換することができ、この能
力が約３．２キロベースの大きさのＢａｍＨＩ Ｂｇ
Ｉ ＩＩ断片上の遺伝子に備わっていることが解る。
この事実は、グルタミン酸生産性コリネ２！！細菌由米
のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ
断片を、具体的なりＮＡ断片として利用可能な状態に分
離できたことを示している。更に同ＤＮＡ断片を、約２
．１キロベースの大きさのＥｃｏＲＩ Ｓａｌ Ｉ断
片として取り出すことも可能である。なぜならば、プラ
スミドｐＡＧ５０は、制限酵素ＥｃｏＲＩ ｌ ８ａ
Ｉ Ｉのそれぞれの唯一の切断部位へ外来ＤＮＡ Ｍ片
を組み込んでも、テトラサイクリン耐性形質転換能を失
なわなかったからである。
のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ
断片を、具体的なりＮＡ断片として利用可能な状態に分
離できたことを示している。更に同ＤＮＡ断片を、約２
．１キロベースの大きさのＥｃｏＲＩ Ｓａｌ Ｉ断
片として取り出すことも可能である。なぜならば、プラ
スミドｐＡＧ５０は、制限酵素ＥｃｏＲＩ ｌ ８ａ
Ｉ Ｉのそれぞれの唯一の切断部位へ外来ＤＮＡ Ｍ片
を組み込んでも、テトラサイクリン耐性形質転換能を失
なわなかったからである。
現在の遺伝子工学の技術では、制限酵素切断部分をなく
したり、他の制限酵素切断部分に変更したりする等、Ｄ
ＮＡ断片の一部を変更することは、容易である。故に、
上述のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片においても、同様の操作を行ったＤＮＡ断片を
新たに作製することは、容易である。従って、その様に
一部を変更したＤＮＡ断片でちっても、テトラサイクリ
ン耐性形質転換能を有したＤＮＡ断片であれば本発明の
目的は達成される。
したり、他の制限酵素切断部分に変更したりする等、Ｄ
ＮＡ断片の一部を変更することは、容易である。故に、
上述のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片においても、同様の操作を行ったＤＮＡ断片を
新たに作製することは、容易である。従って、その様に
一部を変更したＤＮＡ断片でちっても、テトラサイクリ
ン耐性形質転換能を有したＤＮＡ断片であれば本発明の
目的は達成される。
テトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断
片は、後述する如く実用上利用価値が極めて高い。ベク
タープラスミドの安定性を増したり、コピー数を変化さ
せる事は、実用上玉安なこと問題である。なぜならばれ
々の宿主に対し、目的に合った複製特性を有するベクタ
ープラスミドがそれぞれ必要となるからである。一方グ
ルタミン威生産性コリネ型細菌において、選択マーカー
を持たないプラスミドは、比較的容易に見い出される。
片は、後述する如く実用上利用価値が極めて高い。ベク
タープラスミドの安定性を増したり、コピー数を変化さ
せる事は、実用上玉安なこと問題である。なぜならばれ
々の宿主に対し、目的に合った複製特性を有するベクタ
ープラスミドがそれぞれ必要となるからである。一方グ
ルタミン威生産性コリネ型細菌において、選択マーカー
を持たないプラスミドは、比較的容易に見い出される。
従って、それらのプラスミドの中から目的に合った複製
特性を有したプラスミドを選抜して、その自律複製に必
要な遺伝子を含むＤＮＡＮＡ断片淑り出し、テトラサイ
クリン耐性に関与する遺伝子ヲ営むＤＮＡ断片と結合さ
せることにより、癌択マーカーを有し目的に合った複製
特性をもつ耕たなベクターシラスミドを作製することが
できる。つまり、本発明のグルタミン酸生産性コリネ型
細酌由米のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含
むＤＮＡ断片を利用することにより、目的に合った複製
特性を有し、かつテトラサイクリン耐性の選択マーカー
を甘したベクタープラスミドを種々開発することが、極
めて容易になった。
特性を有したプラスミドを選抜して、その自律複製に必
要な遺伝子を含むＤＮＡＮＡ断片淑り出し、テトラサイ
クリン耐性に関与する遺伝子ヲ営むＤＮＡ断片と結合さ
せることにより、癌択マーカーを有し目的に合った複製
特性をもつ耕たなベクターシラスミドを作製することが
できる。つまり、本発明のグルタミン酸生産性コリネ型
細酌由米のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含
むＤＮＡ断片を利用することにより、目的に合った複製
特性を有し、かつテトラサイクリン耐性の選択マーカー
を甘したベクタープラスミドを種々開発することが、極
めて容易になった。
以下実、Ｍｊ例により、本発明を具体的に説明する。
（実施ｉ）す）
１、 プラスミドｐＡＧ１２ 、 ｐＡＧ１４の作製＋
ｌ） コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎ
ｅ−ｔ＋ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ
） ２２２４３ （微工研条寄第５６０号）菌体からの
１ラスミドｐＡＧ １の分離上記菌株を、半合成培地（
（ＮＨ４ｈ８０４１０ ｔ、尿素３ ？ 、ＫｚＨＰＯ
ｉ １ ｔ、Ｎａ（３ｔ５０’Ｈ１ｓ ＭｇＳＯ４・？
Ｈ雪０４００■、Ｍｎ３Ｏ４”４−６ＨｚＯ２”’ｉ、
Ｆｅ３Ｏ４・４ ６Ｈ＊０２ｔｔｔｙ、グルコ−；ｘ、
２０ ！ｊ、 ビオチｙ ５ｏ ｔｔｆｓ ｆ ７
ミン塩酸塩２００μ２、酵母エキス１ｔを純水に溶かし
て１ｔとし、ｐＨ７、２ＫｖＩ４整シタ培地） テ、３
２℃、１晩振盪培養し、その種培養８ｄを２００−の前
記半合成培地に移植して、３２℃で５時間振盪培養した
。
ｌ） コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎ
ｅ−ｔ＋ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ
） ２２２４３ （微工研条寄第５６０号）菌体からの
１ラスミドｐＡＧ １の分離上記菌株を、半合成培地（
（ＮＨ４ｈ８０４１０ ｔ、尿素３ ？ 、ＫｚＨＰＯ
ｉ １ ｔ、Ｎａ（３ｔ５０’Ｈ１ｓ ＭｇＳＯ４・？
Ｈ雪０４００■、Ｍｎ３Ｏ４”４−６ＨｚＯ２”’ｉ、
Ｆｅ３Ｏ４・４ ６Ｈ＊０２ｔｔｔｙ、グルコ−；ｘ、
２０ ！ｊ、 ビオチｙ ５ｏ ｔｔｆｓ ｆ ７
ミン塩酸塩２００μ２、酵母エキス１ｔを純水に溶かし
て１ｔとし、ｐＨ７、２ＫｖＩ４整シタ培地） テ、３
２℃、１晩振盪培養し、その種培養８ｄを２００−の前
記半合成培地に移植して、３２℃で５時間振盪培養した
。
培養液から菌体を集菌し、リゾチウム液〔５０ｍＭグル
コース、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ２５ ｍＭ ）
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ（ｈ
ｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａ
ｎｅ ： Ｔｒｉｓ ）、ｔ Ｏｍｙ／ｍｌリゾチウム
、ｐＨ８，０） ｌＯａ／ Ｋ懸濁し４２℃で１時間反
応させた。本反応液にアルカＩＪ ＳＤＳ ｇ （０，
２Ｎ ＮａＯＨ，１％ ８Ｄ８ （８ｏｄｉｕｍ Ｄ
ｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ ） ） ２０ｄを添加攪
拌の後、水中に５分装置いた。次に本反応液に、氷冷し
た酢酸カリウム溶ｆｉ（５Ｍ酢酸カリウム水溶液６０ｒ
ｔｔｌｚ酢ＣＲ１１，５ｒｒｔｅｓ純水２８．５−の混
合液）１５ｄを添加攪拌の後、水中に１０分間装いた。
コース、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ２５ ｍＭ ）
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ（ｈ
ｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａ
ｎｅ ： Ｔｒｉｓ ）、ｔ Ｏｍｙ／ｍｌリゾチウム
、ｐＨ８，０） ｌＯａ／ Ｋ懸濁し４２℃で１時間反
応させた。本反応液にアルカＩＪ ＳＤＳ ｇ （０，
２Ｎ ＮａＯＨ，１％ ８Ｄ８ （８ｏｄｉｕｍ Ｄ
ｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ ） ） ２０ｄを添加攪
拌の後、水中に５分装置いた。次に本反応液に、氷冷し
た酢酸カリウム溶ｆｉ（５Ｍ酢酸カリウム水溶液６０ｒ
ｔｔｌｚ酢ＣＲ１１，５ｒｒｔｅｓ純水２８．５−の混
合液）１５ｄを添加攪拌の後、水中に１０分間装いた。
溶菌物の全量を遠心管に移し、４℃、５分間、１２．０
０Ｏｒｐｍ （１３０００ｔ ）の遠心分離を行い、上
澄液を回収した。これを等容のフェノール・クロロホル
ム液（１：１）で抽出して水）＃！、Ｊｔ回収した。
０Ｏｒｐｍ （１３０００ｔ ）の遠心分離を行い、上
澄液を回収した。これを等容のフェノール・クロロホル
ム液（１：１）で抽出して水）＃！、Ｊｔ回収した。
これに２倍容のエタノールを酢加攪拌して、５分間室温
に甑き、２０℃、１０分間、１０．００Ｏｒｐｍ（１１
，０００ｆ ）の遠心分離を行った。得られた沈澱物を
、７０％エタノール水溶液で洗浄の後減圧乾燥して、Ｔ
Ｅ緩ｇ＃液（１０ｍＭ’ Ｔｒｉｓ 、 Ｉ Ｍ Ｅ
ＤＴＡ ｒ ｐＨ７，５） ２０−で、ふたたび溶解し
た。この奴に、１０■／−エチジウムブロマイド水浴ｆ
ｔ１．２ｍｌと塩化セシウム２３．６ ｒとを加えて静
かに溶解し、４１１，０００ｒｐｍ （１００，０００
？ ） １５℃で４８時間遠心分離した。
に甑き、２０℃、１０分間、１０．００Ｏｒｐｍ（１１
，０００ｆ ）の遠心分離を行った。得られた沈澱物を
、７０％エタノール水溶液で洗浄の後減圧乾燥して、Ｔ
Ｅ緩ｇ＃液（１０ｍＭ’ Ｔｒｉｓ 、 Ｉ Ｍ Ｅ
ＤＴＡ ｒ ｐＨ７，５） ２０−で、ふたたび溶解し
た。この奴に、１０■／−エチジウムブロマイド水浴ｆ
ｔ１．２ｍｌと塩化セシウム２３．６ ｒとを加えて静
かに溶解し、４１１，０００ｒｐｍ （１００，０００
？ ） １５℃で４８時間遠心分離した。
プラスミドＩ）ＡＧＩは、紫外線照射にょシ遠心チュー
ブ中、２本のバンドの下方として見い出され、このバン
ドを退心チューブの側面から注射器で抜き取ることによ
り、プラスミドｐＡＧ１を分離した。
ブ中、２本のバンドの下方として見い出され、このバン
ドを退心チューブの側面から注射器で抜き取ることによ
り、プラスミドｐＡＧ１を分離した。
次でこの分画液を等容量のイソゾロビルアルコールで４
回抽出して、エチジウムプロマイｙｔ除去し、その後に
ＴＥ緩衝液に対して透析して、ＤＮＡ濃ＦＬ５０μＷ／
ｙｄのプラスミドＧ）ＡＧ ｌの透析液１ｍを得た。
回抽出して、エチジウムプロマイｙｔ除去し、その後に
ＴＥ緩衝液に対して透析して、ＤＮＡ濃ＦＬ５０μＷ／
ｙｄのプラスミドＧ）ＡＧ ｌの透析液１ｍを得た。
（２１プラスミドｐＡＧ１の試験管内組換え実施例の（
１）で調製したプラスミドｐＡＧ １のＤＮＡｏ、５ｔ
ｔｔに対して、１０ｕの制限酵素ＥｉｃｏｌＩを加え、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯｔ（ＰＨ７，４）、ｌ Ｏ
ｍＭ Ｍｇ３０４．１００ ｍＭ ＮａＣ１の緩衝液
４０μを中で、３７℃にて２時間反応させた。その後７
０℃で１０分間加熱して反応を停止させた。この反応液
２０μｔと３ｕのＴ４ファージＤＮＡリガーゼとを、５
０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈｏｔ（＋）Ｈ７，４）、１０
ｍＭ Ｍｇ０ｔｚ、１０ｍＭＤｉｔｈ−ｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏｌ、１ ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、 １
ｍＭ ＡＴＰ、 ０．１１ｎｆ／ｍｌ Ｂ８Ａ
（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ）の緩
衝液５０μを中で、１５℃にて一晩反応させた。
１）で調製したプラスミドｐＡＧ １のＤＮＡｏ、５ｔ
ｔｔに対して、１０ｕの制限酵素ＥｉｃｏｌＩを加え、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯｔ（ＰＨ７，４）、ｌ Ｏ
ｍＭ Ｍｇ３０４．１００ ｍＭ ＮａＣ１の緩衝液
４０μを中で、３７℃にて２時間反応させた。その後７
０℃で１０分間加熱して反応を停止させた。この反応液
２０μｔと３ｕのＴ４ファージＤＮＡリガーゼとを、５
０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈｏｔ（＋）Ｈ７，４）、１０
ｍＭ Ｍｇ０ｔｚ、１０ｍＭＤｉｔｈ−ｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏｌ、１ ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、 １
ｍＭ ＡＴＰ、 ０．１１ｎｆ／ｍｌ Ｂ８Ａ
（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ）の緩
衝液５０μを中で、１５℃にて一晩反応させた。
（３） シラスミドｐＡＧ１２ 、 ＰＡＧ１４の取
得実施例１の（２）で作成したプラスミドｐＡＧ１由来
の組換えＤＮＡにより、コリネバクテリウム・メラ
“セコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌ
ａｓｓｅｃｏｌａ ） ２２２４３ （微工研条寄第５
６０号）のプラスミドキュアート株を形質転換した。得
られたテトラサイクリン耐性形質転換株の保有するシラ
スミド全解析することにより、プラスミドＰＡＧ１２．
ｐＡＧ１４を取得した。以下上記実験について詳しく
説明する。
得実施例１の（２）で作成したプラスミドｐＡＧ１由来
の組換えＤＮＡにより、コリネバクテリウム・メラ
“セコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌ
ａｓｓｅｃｏｌａ ） ２２２４３ （微工研条寄第５
６０号）のプラスミドキュアート株を形質転換した。得
られたテトラサイクリン耐性形質転換株の保有するシラ
スミド全解析することにより、プラスミドＰＡＧ１２．
ｐＡＧ１４を取得した。以下上記実験について詳しく
説明する。
（プラスミドのキユアリング）コリネバクテリウム・メ
ラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ ）２２２４３ （微工研条寄第５６０
号）をＬＧ培地（トリプトン１０ｆ１酵母エキス５？、
ＮａＣ１５？、グルコース２ｆを純水に溶かして１ｔと
し、ｐＨ７，２に調整した培地）５４に１白金耳植菌し
て、３７℃で一晩振盪培養した。この培＊ａを無菌水で
希釈してＬＧ寒天培地（ＬＧ培地に１．５％寒天を添加
した培地）に塗布し、３２℃で２日間培養した。生じた
コロニー１００個を増り、テトラサイクリン１０μｔ／
ｒｄを含有するＬＧ寒天培地に釣菌した。３２℃で２日
間培養してテトラサイクリン怒受性株を選択した。得ら
れた２株のテトラサイクリン感受性株について、前記と
同様なプラスミドの単離法によシブラスミドｐＡＧ１の
存在を調べた。その結果得られた２株のテトラサイタリ
ン感受性株は、いずれもプラスミドを保持していなかっ
た。これらの一方の株を以後の形質転換実験の宿主とし
て用いた。
ラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ ）２２２４３ （微工研条寄第５６０
号）をＬＧ培地（トリプトン１０ｆ１酵母エキス５？、
ＮａＣ１５？、グルコース２ｆを純水に溶かして１ｔと
し、ｐＨ７，２に調整した培地）５４に１白金耳植菌し
て、３７℃で一晩振盪培養した。この培＊ａを無菌水で
希釈してＬＧ寒天培地（ＬＧ培地に１．５％寒天を添加
した培地）に塗布し、３２℃で２日間培養した。生じた
コロニー１００個を増り、テトラサイクリン１０μｔ／
ｒｄを含有するＬＧ寒天培地に釣菌した。３２℃で２日
間培養してテトラサイクリン怒受性株を選択した。得ら
れた２株のテトラサイクリン感受性株について、前記と
同様なプラスミドの単離法によシブラスミドｐＡＧ１の
存在を調べた。その結果得られた２株のテトラサイタリ
ン感受性株は、いずれもプラスミドを保持していなかっ
た。これらの一方の株を以後の形質転換実験の宿主とし
て用いた。
（形質転換）コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ
） ２２２４３ （微工研条寄第５６０号）よシ前記の
操作で分離したプラスミＰキュアート株を、前記半合成
培地で３２℃、１２時間撮俄培養し、その培養液０．５
ｄを同じ半合成培地５０−に植菌して３２℃で振盪培養
した。日立分光光度計（２２８型）で波長６６０ｎｍに
おける吸光１ｋ Ｃ０Ｄ）を測定し、ＯＤが０．２にな
った時点で培養液にペニシリンＧｆ、０．３単位／ｄの
濃度になるように６Σ加した。これを更に３２℃で１．
５時間培養を続けた。
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ
） ２２２４３ （微工研条寄第５６０号）よシ前記の
操作で分離したプラスミＰキュアート株を、前記半合成
培地で３２℃、１２時間撮俄培養し、その培養液０．５
ｄを同じ半合成培地５０−に植菌して３２℃で振盪培養
した。日立分光光度計（２２８型）で波長６６０ｎｍに
おける吸光１ｋ Ｃ０Ｄ）を測定し、ＯＤが０．２にな
った時点で培養液にペニシリンＧｆ、０．３単位／ｄの
濃度になるように６Σ加した。これを更に３２℃で１．
５時間培養を続けた。
その培養液より集菌し、几培地〔グルコース５？、カザ
ミノ酸１０？、酵母エキスＩＯＳ’、Ｋ２ＨＰＯ４０，
３５ｆ、Ｋ２ＨＰＯ４０、１５Ｆ、クユークロース１．
３７？、Ｎ−）リス（）・イドロキゾメチル）メチル−
２−アミノエタンスルホン１７（ＴＢＳ：Ｎ−Ｔｒｉｓ
（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ｍｅｔｈｙｌ
−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ
） ５．７３グ、Ｍｇ０ｔｚ ０．９５ Ｓ’、０ａ
Ｏｔ２１．１１ｆを純水に溶かしてＩＬとし、ＮａＯＨ
でｐＨ７，２に調整した培地〕５罰に懸濁した。この菌
懸次欣４．５−に、３η／ ｍｌ ｍ ＩＬのりゾチウ
ムを含有するＢ培地（ミリポアフィルタ−で除菌した。
ミノ酸１０？、酵母エキスＩＯＳ’、Ｋ２ＨＰＯ４０，
３５ｆ、Ｋ２ＨＰＯ４０、１５Ｆ、クユークロース１．
３７？、Ｎ−）リス（）・イドロキゾメチル）メチル−
２−アミノエタンスルホン１７（ＴＢＳ：Ｎ−Ｔｒｉｓ
（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ｍｅｔｈｙｌ
−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ
） ５．７３グ、Ｍｇ０ｔｚ ０．９５ Ｓ’、０ａ
Ｏｔ２１．１１ｆを純水に溶かしてＩＬとし、ＮａＯＨ
でｐＨ７，２に調整した培地〕５罰に懸濁した。この菌
懸次欣４．５−に、３η／ ｍｌ ｍ ＩＬのりゾチウ
ムを含有するＢ培地（ミリポアフィルタ−で除菌した。
）０．５ｍ６を添加して、３５℃で５時間静置反応させ
た。プロトプラスト化した細胞ｆ ７．００Ｏｒｐｍ
（４５００ｆ ）、５℃、７分間で遠心分離して回収し
、几培地５−に懸７種した。同様の操作を更にもう一度
行った後、几培地５１！ｌに再懸濁してプロトゲラスト
菌液とした。
た。プロトプラスト化した細胞ｆ ７．００Ｏｒｐｍ
（４５００ｆ ）、５℃、７分間で遠心分離して回収し
、几培地５−に懸７種した。同様の操作を更にもう一度
行った後、几培地５１！ｌに再懸濁してプロトゲラスト
菌液とした。
実施例１の（２）で得られたりガーゼ反応液５０μｔと
２倍濃度ＴａＭＯ液（ＴＳＭＯ液は、ＴＢＳ ２５ｍＭ
、シュータｏ−ｘ Ｏ，４Ｍ％ ＭｇＯ１ｚ ｊＯｍＭ
ｓ ０ａＯｔ２３０ｍＭを言み、Ｎ５ＯＨでｐＨ７，２
に調整した水浴液である。）５０μｔとの混合液を上記
プロトプラスト菌液０．５ｒｒｔｌに添加混会した。そ
の後史にＰＥＧ液（ＴＳＭＯｉにポリエチレングリコー
ル６．０００（Ｐｏ１ｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏ
ｌ ６０００ ） ｔ ４０ｚ濃度に溶解する。〕１．
５ｍ／ｉ添加してゆるやかに混和し、２分間室温で静置
した。その後Ｒ−ＰＶＰ液〔Ｒ培地にポリビニルピロリ
ドン（ＰＶＰ ： ＰｏＪｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏ
ｌｉｄｏｎｅ ） ４０ｒｌｔを添加する。〕５−を添
加して、４．００Ｏｒｐｍ（１８００Ｓ’ ）で１０分
間遠心分離して上澄液を除去した。同様の遠心分離条件
で洗浄操作を爽にもう一度行った後、沈降したプロトプ
ラストを０−５ｖｔｌのａ−ｐｖｐａでゆるやかに懸濁
した。３時間、３０℃に保った後、几−ＰＶＰ液で希釈
し、一定量をテトラサイクリン１０μ２／Ｎ／濃度を含
む再生培地（重層寒天培地を用いる。下層寒天培地は、
Ｒ培地にＰＶＰ ４０９／ｌ、寒天１５グ／ｌを添加し
て作製する。上層寒天培地は、ＰＶＰ ４０グ／１．寒
天６１／ｌを添加して作製する。プロトプラスト懸濁液
を溶けた上層寒天培地３ｄと混合して、下層寒天培地上
に１層する。）に植菌し、３２℃で４日培養した。
２倍濃度ＴａＭＯ液（ＴＳＭＯ液は、ＴＢＳ ２５ｍＭ
、シュータｏ−ｘ Ｏ，４Ｍ％ ＭｇＯ１ｚ ｊＯｍＭ
ｓ ０ａＯｔ２３０ｍＭを言み、Ｎ５ＯＨでｐＨ７，２
に調整した水浴液である。）５０μｔとの混合液を上記
プロトプラスト菌液０．５ｒｒｔｌに添加混会した。そ
の後史にＰＥＧ液（ＴＳＭＯｉにポリエチレングリコー
ル６．０００（Ｐｏ１ｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏ
ｌ ６０００ ） ｔ ４０ｚ濃度に溶解する。〕１．
５ｍ／ｉ添加してゆるやかに混和し、２分間室温で静置
した。その後Ｒ−ＰＶＰ液〔Ｒ培地にポリビニルピロリ
ドン（ＰＶＰ ： ＰｏＪｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏ
ｌｉｄｏｎｅ ） ４０ｒｌｔを添加する。〕５−を添
加して、４．００Ｏｒｐｍ（１８００Ｓ’ ）で１０分
間遠心分離して上澄液を除去した。同様の遠心分離条件
で洗浄操作を爽にもう一度行った後、沈降したプロトプ
ラストを０−５ｖｔｌのａ−ｐｖｐａでゆるやかに懸濁
した。３時間、３０℃に保った後、几−ＰＶＰ液で希釈
し、一定量をテトラサイクリン１０μ２／Ｎ／濃度を含
む再生培地（重層寒天培地を用いる。下層寒天培地は、
Ｒ培地にＰＶＰ ４０９／ｌ、寒天１５グ／ｌを添加し
て作製する。上層寒天培地は、ＰＶＰ ４０グ／１．寒
天６１／ｌを添加して作製する。プロトプラスト懸濁液
を溶けた上層寒天培地３ｄと混合して、下層寒天培地上
に１層する。）に植菌し、３２℃で４日培養した。
出現したテトラサイクリン耐性形質転換株から任意に１
０株を選び、テトラサイクリン１０μｆＺａｇｅ度を含
むＬＧ摩天培地上で純化した後、実施 ・例１の（１
）でプラスミドｐＡＧ １を分離した方法により、各菌
株からプラスミドを分離した。各プラスミドＤＮＡ ０
．５μｍに過剰の制限酵素（ＷｃｏＲＩ 。
０株を選び、テトラサイクリン１０μｆＺａｇｅ度を含
むＬＧ摩天培地上で純化した後、実施 ・例１の（１
）でプラスミドｐＡＧ １を分離した方法により、各菌
株からプラスミドを分離した。各プラスミドＤＮＡ ０
．５μｍに過剰の制限酵素（ＷｃｏＲＩ 。
ＨｉｎｄＩ［ｌ 、 Ｐｓｔ Ｉ ｅ ＢａｍＨｌ ＊
Ｂｇｌ Ｉｆは、ニラボンジーン社製、Ｘｂａｌはぺ
七スダリサーチラボラトリー社製を用いた。）を各々の
制限酵素の適正条件にて反応させた。消化した試料は、
常法に従い１％アガロースゲル電気泳動または、４％ポ
リアクリルアミドゲル電気に供し、巾１σ当り５ｖの一
定電圧で４時間泳動を行った。泳動の終ったゲルを１μ
ｍ／ｄエチジウムブロマイド溶液に浸漬して３０分間染
色した後、紫外線をゲルに照射して生成断片の数を判定
し、各断片の泳動距離から各々の分子量を算出した。次
にそれらを加算して、各プラスミドの分子量を求めた。
Ｂｇｌ Ｉｆは、ニラボンジーン社製、Ｘｂａｌはぺ
七スダリサーチラボラトリー社製を用いた。）を各々の
制限酵素の適正条件にて反応させた。消化した試料は、
常法に従い１％アガロースゲル電気泳動または、４％ポ
リアクリルアミドゲル電気に供し、巾１σ当り５ｖの一
定電圧で４時間泳動を行った。泳動の終ったゲルを１μ
ｍ／ｄエチジウムブロマイド溶液に浸漬して３０分間染
色した後、紫外線をゲルに照射して生成断片の数を判定
し、各断片の泳動距離から各々の分子量を算出した。次
にそれらを加算して、各プラスミドの分子量を求めた。
尚、分子がこれｔｌ 同一アガロースゲル上で同時に泳
動したジムダファージ（λｐｈａｇｅ ） ＤＮＡの制
限酵素）１ｉｎｄｌｌ［による消化断片の既知分子１、
または同一ポリアクリルアミドゲル上で同時に泳動した
ファイ・エックス１７４フアージ（φＸ ｌ ７４ ｐ
ｈａｇｅ ） ＤＮＡの制限酵素）１ａｅ［［による消
化断片の既知分子量に基づいて算出した。更に複数の制
限酵素処理によって生じた消化断片を解析することによ
り、各シラスミド分子中の各制限酵素切断部位を決定し
た。本実験で得られたプラスミドは全てプラスミドｐＡ
Ｇ１２又はシラスミドｐＡＧ１４であり、それらの制限
酵素地図は、それぞれ第３図、＠４図である。
動したジムダファージ（λｐｈａｇｅ ） ＤＮＡの制
限酵素）１ｉｎｄｌｌ［による消化断片の既知分子１、
または同一ポリアクリルアミドゲル上で同時に泳動した
ファイ・エックス１７４フアージ（φＸ ｌ ７４ ｐ
ｈａｇｅ ） ＤＮＡの制限酵素）１ａｅ［［による消
化断片の既知分子量に基づいて算出した。更に複数の制
限酵素処理によって生じた消化断片を解析することによ
り、各シラスミド分子中の各制限酵素切断部位を決定し
た。本実験で得られたプラスミドは全てプラスミドｐＡ
Ｇ１２又はシラスミドｐＡＧ１４であり、それらの制限
酵素地図は、それぞれ第３図、＠４図である。
これらのプラスミドＤＮＡ ’ｉ用いて、前記と同様な
方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）
２２２４３ （微工研条寄第５６０号）のプラスミドキ
ュアー１株を形質転換した。得られたテトラサイクリン
耐性株について、それらが保有するプラスミドを解析し
た結果、それらのプラスミドは、供与プラスミＰと比べ
て、制限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミドで
あった。
方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）
２２２４３ （微工研条寄第５６０号）のプラスミドキ
ュアー１株を形質転換した。得られたテトラサイクリン
耐性株について、それらが保有するプラスミドを解析し
た結果、それらのプラスミドは、供与プラスミＰと比べ
て、制限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミドで
あった。
２、 プラスミドｐＡＧ３１ 、 ｐＡＧ３２の作製（
１１プラスミドｐＡＧ１２の試験管内組換え実施例１の
（３）で調製したプラスミドｐＡＧ１２のＤＮＡ ２μ
？に対して、１０ｕの制限酵素ＥＣＯＲＩを加え、２５
ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｔ （ｐＨ８，６）、２ ｍ Ｍ
ＭｇＳＯ４，４０％グリセロールの緩歯液８０μを中で
、３７℃にて９０分間反応させ、その後７０℃にて１０
分間加熱して反応を停止させた。次に咋６〈ナトリウム
を最終濃度３００ｍＭになるように加え、艮に２倍容の
エタノールを加えて攪拌の後−３０℃にて３時間保持し
た。その後、１２．００Ｏｒｐｍ（８９００ｆ？）で１
０分間遠心分離して、ＤＮＡの沈澱を回収した。減圧乾
燥後得られたＤＮＡ全量と３ｕのＴ４ファージＤＮＡリ
ガーゼとを、５０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＯｔ（ｐ Ｈ７，
４）、１０ ｍＭ ＭｇＯ１ｚ、ｌ ＯｍＭ（Ｄｉｔ
ｈｉＯｔｈｒｅｉｔｏｌ、 １ ｍＭ Ｓｐｅｒｍ
ｉｄｉｎｅ、１ ｎｌＭＡＴＰ％０．１ ｍｆ／／ｍ
ｌ ＢＳＡ （Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ
ａｌｂｕｍｉｎ ） の緩ｉ液５０μを中で、
１５℃にで一晩反応させた。その後７０℃にて１０分間
加熱することにより反応を停止させた。
１１プラスミドｐＡＧ１２の試験管内組換え実施例１の
（３）で調製したプラスミドｐＡＧ１２のＤＮＡ ２μ
？に対して、１０ｕの制限酵素ＥＣＯＲＩを加え、２５
ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｔ （ｐＨ８，６）、２ ｍ Ｍ
ＭｇＳＯ４，４０％グリセロールの緩歯液８０μを中で
、３７℃にて９０分間反応させ、その後７０℃にて１０
分間加熱して反応を停止させた。次に咋６〈ナトリウム
を最終濃度３００ｍＭになるように加え、艮に２倍容の
エタノールを加えて攪拌の後−３０℃にて３時間保持し
た。その後、１２．００Ｏｒｐｍ（８９００ｆ？）で１
０分間遠心分離して、ＤＮＡの沈澱を回収した。減圧乾
燥後得られたＤＮＡ全量と３ｕのＴ４ファージＤＮＡリ
ガーゼとを、５０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＯｔ（ｐ Ｈ７，
４）、１０ ｍＭ ＭｇＯ１ｚ、ｌ ＯｍＭ（Ｄｉｔ
ｈｉＯｔｈｒｅｉｔｏｌ、 １ ｍＭ Ｓｐｅｒｍ
ｉｄｉｎｅ、１ ｎｌＭＡＴＰ％０．１ ｍｆ／／ｍ
ｌ ＢＳＡ （Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ
ａｌｂｕｍｉｎ ） の緩ｉ液５０μを中で、
１５℃にで一晩反応させた。その後７０℃にて１０分間
加熱することにより反応を停止させた。
（２） プラスミド１）ＡＧ３１ 、−ｆｌＡＧ３２
の取得実施例２の（１）で得られたりガーゼ反応液５ｏ
μｔＶを用いて、実施例１と同じ操作によシ、コリネバ
クテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） ２２２４３ （微工
研条寄第５６０号）のプラスミドキュアート株をテトラ
サイクリン耐性が付与される様に形質転換した。得られ
たテトラサイクリン耐性形質転換株について、実施例１
の（３）の方法により、各形質転換株の保有するプラス
ミドを解析した結果、プラスミドｐＡＧ３１ 、 ｐＡ
Ｇ３２を取得することができた。これらのプラスミドの
制限酵素地図を、それぞれ第５図、第６図に示す。
の取得実施例２の（１）で得られたりガーゼ反応液５ｏ
μｔＶを用いて、実施例１と同じ操作によシ、コリネバ
クテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） ２２２４３ （微工
研条寄第５６０号）のプラスミドキュアート株をテトラ
サイクリン耐性が付与される様に形質転換した。得られ
たテトラサイクリン耐性形質転換株について、実施例１
の（３）の方法により、各形質転換株の保有するプラス
ミドを解析した結果、プラスミドｐＡＧ３１ 、 ｐＡ
Ｇ３２を取得することができた。これらのプラスミドの
制限酵素地図を、それぞれ第５図、第６図に示す。
これらのプラスミドＤＮＡを用いて、前記と同様な方法
で、コリネ°ノ々クテリウム、メラセコラ唸北−念（Ｏ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ ） ２２２４３ （微工研条寄第５６０号）のプラ
スミドキュアート株を形質転換した。得られたテトラサ
イクリン耐性株について、それらが保有するシラスミド
を解析した結果、それらのプラスミドは、供与プラスミ
ドと比べて、制限酵素切断様式で同一と判定されるプラ
スミドであった。
で、コリネ°ノ々クテリウム、メラセコラ唸北−念（Ｏ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ ） ２２２４３ （微工研条寄第５６０号）のプラ
スミドキュアート株を形質転換した。得られたテトラサ
イクリン耐性株について、それらが保有するシラスミド
を解析した結果、それらのプラスミドは、供与プラスミ
ドと比べて、制限酵素切断様式で同一と判定されるプラ
スミドであった。
３、 プラスミドｐＡＧ５０の作製
プラスミドｐＡＧ１４のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ。
Ｂｇｌｎで切断し、同ＤＮＡ断片混合物の中からアガロ
ースゲル電気泳動により、テトラサイクリン耐性に関与
する遺伝子を含む約３．２キロベースのＤＮ１％Ｌ断片
を分離した。次に同ＤＮＡ断片とプラスミドｐ ＡＧ３
の制限酵素３３ ａｍＨｌ切断断片との混合物に、Ｔ４
７アージＤＮＡＩＪガーゼを作用さぜた。次に同リガー
ゼ反応液に工９、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ ） ８０１ （微工研条寄第８０１号）を形質転換
し、テトラサイクリン耐性株を取得した。同形質転換株
の保有するプラスミドを分離し解析した結果、プラスミ
ドｐＡ０５０を取得することができた。以下呼細に説明
する。
ースゲル電気泳動により、テトラサイクリン耐性に関与
する遺伝子を含む約３．２キロベースのＤＮ１％Ｌ断片
を分離した。次に同ＤＮＡ断片とプラスミドｐ ＡＧ３
の制限酵素３３ ａｍＨｌ切断断片との混合物に、Ｔ４
７アージＤＮＡＩＪガーゼを作用さぜた。次に同リガー
ゼ反応液に工９、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｏ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ ） ８０１ （微工研条寄第８０１号）を形質転換
し、テトラサイクリン耐性株を取得した。同形質転換株
の保有するプラスミドを分離し解析した結果、プラスミ
ドｐＡ０５０を取得することができた。以下呼細に説明
する。
（１）テトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片の分離 実施例１の（３）で調製したプラスミドｐＡＧ１４のＤ
ＮＡ ２０μｉに対して、１００ ｕの制限酵素１３ａ
ｍ）（１，Ｂｇｌｕをそれぞれ加えて、１０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＯ２（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ４，５０ｍＭ Ｎａ１ｌ。
ＮＡ断片の分離 実施例１の（３）で調製したプラスミドｐＡＧ１４のＤ
ＮＡ ２０μｉに対して、１００ ｕの制限酵素１３ａ
ｍ）（１，Ｂｇｌｕをそれぞれ加えて、１０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＯ２（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ４，５０ｍＭ Ｎａ１ｌ。
１ ｍＭ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌの緩衝液１
０ＯｘＪ中で、３７℃にて２時間反応させた。消化した
試料は、実施例１の（３）の方法により、１％アガロー
スゲル電気泳動に供した。たたし、ベセスグ・リサーチ
・ラゼラトリース社製のＬＭＰ Ａｇａｒｏｓｅを使用
し、４℃で電気泳動した。次に、エチジウムブロマイド
で染色したアガロースを紫外線照射下に置き、テトラサ
イクリン耐性に関与する遺伝子を含む約３．２キロベー
スのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近のアガロース
ゲルを切り出した。同アガロースにそのＮ量の３倍量の
ＴＢ緩Ｏｋｇ、を加えて、６５℃で１０分間保持し、ア
ガロースゲルを完全にとかした。次に、等容のフェノー
ルを添加して、攪拌の後、水層を回収した。同水層に等
容のフェノールクロロホルム（１：１）液を添加して、
攪拌の後、水層を回収した。同水層に等容のクロロホル
ムを添加して、攪拌の後、水層を回収した。同水層に、
酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになるように添加
し、更に２倍容のエタノールを加えて＆拌の後、−３０
℃にて３時間保持した。その後、１０．００Ｏｒｐｍ
（９，０００？ ）で１０分間遠心分離して、ＤＮＡの
沈澱を回収し、同沈澱を減圧乾燥した。
０ＯｘＪ中で、３７℃にて２時間反応させた。消化した
試料は、実施例１の（３）の方法により、１％アガロー
スゲル電気泳動に供した。たたし、ベセスグ・リサーチ
・ラゼラトリース社製のＬＭＰ Ａｇａｒｏｓｅを使用
し、４℃で電気泳動した。次に、エチジウムブロマイド
で染色したアガロースを紫外線照射下に置き、テトラサ
イクリン耐性に関与する遺伝子を含む約３．２キロベー
スのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近のアガロース
ゲルを切り出した。同アガロースにそのＮ量の３倍量の
ＴＢ緩Ｏｋｇ、を加えて、６５℃で１０分間保持し、ア
ガロースゲルを完全にとかした。次に、等容のフェノー
ルを添加して、攪拌の後、水層を回収した。同水層に等
容のフェノールクロロホルム（１：１）液を添加して、
攪拌の後、水層を回収した。同水層に等容のクロロホル
ムを添加して、攪拌の後、水層を回収した。同水層に、
酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになるように添加
し、更に２倍容のエタノールを加えて＆拌の後、−３０
℃にて３時間保持した。その後、１０．００Ｏｒｐｍ
（９，０００？ ）で１０分間遠心分離して、ＤＮＡの
沈澱を回収し、同沈澱を減圧乾燥した。
（２） シラスミドｐＡＧ３のｖ、１ ’Ｊｕと制限
都素Ｆ３ａｍＨＩ処理 実施例１の（１）の方法により、コリネバクテリウムＯ
メラセコラｉホ捧（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）２２２２０ （微工研条寄第
５５９号）から分離４６製したプラスミドｐＡＧ３のＤ
ＮＡ ４μｔに対して、２０Ｕの制限酵素ＢａｍＨＩ
を加えて、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈｏｔ（ｐＨ７，
４）、１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ Ｎａ１ｌ
。
都素Ｆ３ａｍＨＩ処理 実施例１の（１）の方法により、コリネバクテリウムＯ
メラセコラｉホ捧（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）２２２２０ （微工研条寄第
５５９号）から分離４６製したプラスミドｐＡＧ３のＤ
ＮＡ ４μｔに対して、２０Ｕの制限酵素ＢａｍＨＩ
を加えて、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈｏｔ（ｐＨ７，
４）、１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ Ｎａ１ｌ
。
１ｍＭ Ｄ口ｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌの緩衝液１００
μを中で、３７℃にて２時間反応させた。そこへ等容の
７エノール・クロロホルム（１：１）液を添加して攪拌
の後、水層を回収した。更に等容のクロロホルムを添加
して攪拌の後、水層を回収した。そこへ＝Ｖナトリウム
を最終濃度３００ｍＭになるように加え、仄に２倍容の
エタノールを添加して、−３０℃にて３時間保持した後
、１２．００Ｏｒｐｍ （８９００ｆ ）で１０分間遠
心分離してＤＮＡの沈澱を回収し、これを減圧乾燥した
。
μを中で、３７℃にて２時間反応させた。そこへ等容の
７エノール・クロロホルム（１：１）液を添加して攪拌
の後、水層を回収した。更に等容のクロロホルムを添加
して攪拌の後、水層を回収した。そこへ＝Ｖナトリウム
を最終濃度３００ｍＭになるように加え、仄に２倍容の
エタノールを添加して、−３０℃にて３時間保持した後
、１２．００Ｏｒｐｍ （８９００ｆ ）で１０分間遠
心分離してＤＮＡの沈澱を回収し、これを減圧乾燥した
。
（３） プラスミドｐＡＧ５０の取得実施例３の＋１
１ 、 ＋２１で調製したそれぞれのＤＮＡ全量と３ｕ
のＴ４ファージＤＮＡリガーゼとを５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−Ｈｏｔ（ｐＨ７，４）、ｌ Ｏ’ｍＭ Ｍｇ０４．
１０＋ｎＭｌ）ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、 １
ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、 １ ｍＭＡＴＰ、
０．１ ｍｑ／ｙｔｌ ＢＳＡの緩衝液Ｓｏμを中
で、１５℃にて一晩反応させた。その後７０℃にて１０
分間加熱して反応を停止させた。
１ 、 ＋２１で調製したそれぞれのＤＮＡ全量と３ｕ
のＴ４ファージＤＮＡリガーゼとを５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−Ｈｏｔ（ｐＨ７，４）、ｌ Ｏ’ｍＭ Ｍｇ０４．
１０＋ｎＭｌ）ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、 １
ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、 １ ｍＭＡＴＰ、
０．１ ｍｑ／ｙｔｌ ＢＳＡの緩衝液Ｓｏμを中
で、１５℃にて一晩反応させた。その後７０℃にて１０
分間加熱して反応を停止させた。
同リガーゼ反応液５０μｔを用いて、実施例１の（３）
と同じ形質転換操作によりコリネ／ζクテリウム・メラ
セコラ奪吋（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌ
ａｓｓｅｃｏｌａ ） ８０１（微工研条寄第５５９号
）のテトラサイクリン耐性形質転換株を取得した。ただ
し、再生培地による培養は、７日間とした。得られたテ
トラサイクリン耐性形質転換株について、実施例１の（
３）の方法により、各様の保有するプラスミドを解析し
た結果、シラスミドｐＡＧ５０を取得することができた
。
と同じ形質転換操作によりコリネ／ζクテリウム・メラ
セコラ奪吋（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌ
ａｓｓｅｃｏｌａ ） ８０１（微工研条寄第５５９号
）のテトラサイクリン耐性形質転換株を取得した。ただ
し、再生培地による培養は、７日間とした。得られたテ
トラサイクリン耐性形質転換株について、実施例１の（
３）の方法により、各様の保有するプラスミドを解析し
た結果、シラスミドｐＡＧ５０を取得することができた
。
このプラスミドの制限酵素地図を、第７図に示す。
このプラスミドＤＮＡ１用いて、前記と同様な方法で、
コリネノ々クテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎ−ｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） ８０
１ （微工研条寄第５５８号）を、形質転換した。得ら
れたテトラサイクリン耐性形質転換株について、それら
が保有するプラスミドを解析した結果、それらのシラス
ミドは、供与プラスミドと比べて制限酵素切断様式で同
一と判定されるプラスミドであった。
コリネノ々クテリウム・メラセコラ（Ｏｏｒｙｎ−ｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） ８０
１ （微工研条寄第５５８号）を、形質転換した。得ら
れたテトラサイクリン耐性形質転換株について、それら
が保有するプラスミドを解析した結果、それらのシラス
ミドは、供与プラスミドと比べて制限酵素切断様式で同
一と判定されるプラスミドであった。
（発明の効果）
本発明により、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来で
テトラサイクリン耐性ｔＳ択マーカーとした同菌種のベ
クタープラスミドをり１（々作製することができる。こ
の様にして作製されたベクターシラスミドによる形質転
換体はテトラサイクリン耐性によシ選択することができ
極めて便利であり、本発明によシ作製されたベクタープ
ラスミドを用いることにより、グルタミン偵生産性コリ
ネ型細菌を宿主として任意の遺伝子を含むＤＮＡ断片を
容易にクローン化することが可能となった。
テトラサイクリン耐性ｔＳ択マーカーとした同菌種のベ
クタープラスミドをり１（々作製することができる。こ
の様にして作製されたベクターシラスミドによる形質転
換体はテトラサイクリン耐性によシ選択することができ
極めて便利であり、本発明によシ作製されたベクタープ
ラスミドを用いることにより、グルタミン偵生産性コリ
ネ型細菌を宿主として任意の遺伝子を含むＤＮＡ断片を
容易にクローン化することが可能となった。
また、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を
取シ出して利用できるようになったので、その断片を次
の様に利用することも可能である。
取シ出して利用できるようになったので、その断片を次
の様に利用することも可能である。
先づ、種々の複製特性を有しかつテトラサイクリン耐性
の選択マーカーを有した新規ベクタープラスミドを開発
することができる。また他の薬剤耐性遺伝子を言むＤＮ
Ａ断片と組み合せることにより、シラスミドｐ ＢＨ３
２２の如く、挿入不活化を利用した組み換えシラスミド
検出法を実施できるベクタープラスミドも開発すること
ができる。
の選択マーカーを有した新規ベクタープラスミドを開発
することができる。また他の薬剤耐性遺伝子を言むＤＮ
Ａ断片と組み合せることにより、シラスミドｐ ＢＨ３
２２の如く、挿入不活化を利用した組み換えシラスミド
検出法を実施できるベクタープラスミドも開発すること
ができる。
＠１図は、シラスミドｐＡＧ１の制限酵素地図である。
第２図は、シラスミドｐＡＧ３の制限酵素地図である。
第３図は、プラスミドｐＡＯ１２の制限酵素地図である
。第４図は、プラスミドＰＡＧ１４の制限酵素地図であ
る。第５図は、プラスミドｐＡＧ３１の制限酵素地図で
ある。第６図は、シラスミドｐＡＧ３２の制限酵素地図
である。第７図は、シラスミド１人０５０の制限酵素地
図である。 特許、出願人 旭化成工業株式会社 第１図 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ （０，０／４．８ ）第３図 （１０，６）Ｐｓｔｌ ）１ｉｎｄｌｌｌ（５，６） 第４図 （５，５）ＢＱＬＩＩ ＥｃｏＲＩ（５，ｌＪ第５図 ＢａｍＨＩ（０，０／８．４） 第７図
。第４図は、プラスミドＰＡＧ１４の制限酵素地図であ
る。第５図は、プラスミドｐＡＧ３１の制限酵素地図で
ある。第６図は、シラスミドｐＡＧ３２の制限酵素地図
である。第７図は、シラスミド１人０５０の制限酵素地
図である。 特許、出願人 旭化成工業株式会社 第１図 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ （０，０／４．８ ）第３図 （１０，６）Ｐｓｔｌ ）１ｉｎｄｌｌｌ（５，６） 第４図 （５，５）ＢＱＬＩＩ ＥｃｏＲＩ（５，ｌＪ第５図 ＢａｍＨＩ（０，０／８．４） 第７図
Claims (3)
- （１）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来で、テトラ
サイクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片 - （２）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来で、テトラ
サイクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ
）と、同菌種の細胞内で増殖可能なプラスミドの自律複
製のために必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを有
する新規ベクタープラスミド - （３）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来でテトラサ
イクリン耐性に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）
と同菌種の細胞内で増殖可能なプラスミドの自律複製の
ために必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを有する
新規ベクタ−プラスミドを含有する微生物
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59226651A JPS61104791A (ja) | 1984-10-30 | 1984-10-30 | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
| GB8520632A GB2165546B (en) | 1984-08-21 | 1985-08-16 | A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom |
| FR858512538A FR2569421B1 (fr) | 1984-08-21 | 1985-08-20 | Plasmide et fragment d'adn comprenant un gene pour la resistance a la tetracycline, culture de microorganisme contenant le plasmide precite et microorganisme contenant ledit fragment d'adn |
| KR1019850006032A KR890003083B1 (ko) | 1984-08-21 | 1985-08-21 | 테트라시클린 내성 유전자를 함유한 플라스미드, 이로 부터 유도된 dna단편, 및 이 dna단편을 함유한 미생물 및 이들의 제조방법 |
| US07/492,227 US5158891A (en) | 1984-08-21 | 1990-03-13 | Plasmid containing a gene for tetracycline resistance and DNA fragments derived therefrom |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59226651A JPS61104791A (ja) | 1984-10-30 | 1984-10-30 | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61104791A true JPS61104791A (ja) | 1986-05-23 |
| JPH0224518B2 JPH0224518B2 (ja) | 1990-05-29 |
Family
ID=16848519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59226651A Granted JPS61104791A (ja) | 1984-08-21 | 1984-10-30 | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61104791A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0467312U (ja) * | 1990-10-23 | 1992-06-15 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59179081A (ja) * | 1983-03-29 | 1984-10-11 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | プラスミドｐＴＰ１１０２ |
| JPS59179080A (ja) * | 1983-03-29 | 1984-10-11 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | プラスミドｐＴＰ１１０１ |
| JPS6152290A (ja) * | 1984-08-21 | 1986-03-14 | Asahi Chem Ind Co Ltd | プラスミドｐＡＧ／ |
-
1984
- 1984-10-30 JP JP59226651A patent/JPS61104791A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59179081A (ja) * | 1983-03-29 | 1984-10-11 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | プラスミドｐＴＰ１１０２ |
| JPS59179080A (ja) * | 1983-03-29 | 1984-10-11 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | プラスミドｐＴＰ１１０１ |
| JPS6152290A (ja) * | 1984-08-21 | 1986-03-14 | Asahi Chem Ind Co Ltd | プラスミドｐＡＧ／ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0224518B2 (ja) | 1990-05-29 |
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