JPS58222033A - Ｄｎａ配列、組換えｄｎａ、コレラ毒素のサブユニツトａおよびｂ、および該サブユニツト含有製剤 - Google Patents
Ｄｎａ配列、組換えｄｎａ、コレラ毒素のサブユニツトａおよびｂ、および該サブユニツト含有製剤Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
“不発明はＤＮＡ配列、組換えＤＮＡ分子、コレラ毒素
のサブユニツｌ−ＡおよびＢの製造法、および該サブユ
ニットを含む組成物に関する。 コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ）のある
種の菌株か産生ずるホロトキシンＩ １１０１０ｔＯＸ
ｉｎ ）ハサフユニットＡおよびＢとして知られている
２種のタンパク質サブユニットからなることが知られて
いる。 そのサブユニツ）Ａ （ＣＴＡ〕は上皮細胞の浸透に感
応性で、その酵素作用により消化器管腔に体液がほとん
ど消失する症状をひき起すが、サブユニッ） Ｂ （Ｃ
ＴＢ）はホロトキシンを細胞壁上のモノシアロシルガン
グリオシドＧＭ ］ レセプタ一部位に結合させ、毒
性を示さず、高い免疫性を有する。 コレラ菌の中でホロトキシンを産生ずる菌株は。 例えば、よく知られているビブリオ・コレレ・ビオタイ
プＥトトル・セロタイプ・イナバ株（Ｖｉｂｒｉｏ ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ ｂｉｏ（ｙｐｅＥ Ｉ Ｔｏｒ ５ｅ
ｒｏｔｙ、ｐｅＩＮＡＢＡ ）およびホンダらの記載す
るコレラ毒素のサブユニットＢは産生ずるがサブユニッ
トＡは検出されないコレラ菌変位株（Ｐｒ６ｃ、 Ｎａ
ｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７６．２０５２−２０５６．
１９７９、 Ｔ、 Ｈｏｎｄａ ＆ Ｒ，Ａ、 Ｆｉ
ｎｋｅｌｓｔｅｉｎを参照）がある。 現在知られているコレラワクチンはビブリオ菌から抽出
されるリポポリサッカライド類またはビブリオ死菌の濃
厚懸濁液を含み、繰返し注射することにより、重度の被
暴接触感染に対しては一定限度の防御作用が認められる
が、流行期の制御手段としては効果がない。また、ボラ
ンティアの人達により、コレラから回復したのちは、類
似菌に対する抗体と高い抵抗性が生じるが異種菌株に対
しては抗体や抵抗性は生じないことが示されている。 コレラホロトキシンは高度に抗原性があり、唯一の免疫
型があることを考慮して、有効な抗毒免疫性は各種の血
清型または線型コレラ菌に対して防御力があることが提
唱されている。 この観点から、サブユニットＢは好ましいワクチン成分
であると認められ、経口または非経口投与により防護性
抗体を誘起させるものとみられ。 他の報告者はサブユニツ）Ｂ毒素またはあまり良くはな
いがトキソイドをベースとしたコレラワクチンを提案し
ている（ Ｊ、 ）ｌｏｌｍｇｒｅｎ ｅＬａｌ＋Ｎａ
ｔｕｒｅ ２６９．６０２ ６０３．１９７７、前記ｌ
１ｏｎｄａ ＆ Ｒ，Ａ、 Ｆｉｌｋｅｌｓｔｅｉｎ
（７）文献、およびＪ、 Ｈｏ１ｍｇｒｅｒ４ Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９２＋ ４１３−４１７゜１９８１を参
照）。 不発明前において−ホロトキシンは染色体遺伝子（ｃｔ
ｘ ）に特異性があることが知られており、またモズレ
イらは、大腸菌の相関的熱不安定性エンテロトキシン遺
伝子（ｅｌｔ）の２個のシストロンを表わすＤＮＡフラ
グメントは、各種の制限エンドヌクレアーゼで消化され
たコレラ菌全ＤＮＡの特異的ｃｔｘ遺伝子フラグメント
を検出するためのＤＮＡ／ＤＮＡ雑種形成（ｈｙｂｒ
１ｄｉｚａｔ ｉｏｎ ）実験においてプローブとして
使い得ることを示している。 不発明者らは、ホロトキシンを産生ずる毒性コレラ菌株
（該囚株の例は、アメリカ合衆国、メリイランド、ロツ
ヴイルのＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ３９０５０として寄託さ
れているビブリオ・コレレ・Ｅトトル・イナバ株（Ｖｉ
ｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅＥＩＴｏ ｒ Ｉ ＮＡＢ
Ａ ｌである）のＤＮＡをＣ１ａＩｚ７ドヌクレアーゼ
で消化すると＋ ＤＮＡの２つの異なったバンドを放出
し、それらはそれぞれ雑種形成うことを見出した。
バネ発明によれ
ば、上記のようにＣ１ａＩエンドヌクレアーゼ処理によ
って得られるｃ （ｘ Ａまたはｃｔｘ Ｂのいずれか
を含有するフラグメントを、Ｃ１ａ Ｉエンドヌクレア
ーゼで事前に開裂した適当なベクターに別々にまたは連
続して挿入することにより、大腸菌に１２株または無毒
性コレラ菌株なとの宿主微生物にクローニング担体を構
築させる。得られた菌株をコレラ毒性のサブユニツ）Ａ
またはサブユニツ）Ｈのいずれかまたは両者を製造する
ために用いる。 とくに、後記実施例に示すように、 ＣＬＸ Ａ遺伝子の主部分を含む１． ＯＸ １０
ｄｃｌａ■で発生したＤＮＡフラグメントをプラスミド
ｐＢＲ３２２でクローン化して得られる、第２図に示す
ように、１．０Ｘ１０ ダルトン挿入物の制限地図を
示す絹換えプラスミドｐＲＩＴｌ ０８４ ］、心 ｃｔｘＢ遺伝子を含む２．４５Ｘ１０ ｄ Ｃ１ａ
Ｉで発生したＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＢＲ３
２２でクローン化して得られる、第１図で示すように、
２，４５Ｘ１０ クルトン挿入物の制限地図を示す絹
換えプラスミドｐＲＩＴ１０８１０＝および ｃｔｘ ＡおよびｃＬｘＢの両遺伝子を含むフラグメン
トを＋ １．０ＸＩＯｄｃｌａＩＣＬｘＡ挿入物に０
゜７５Ｘ１０ ダルトンｃｌａＩ−Ｂｇｌｎ′ｃｔｘ
Ｂ挿入物を結合した形でプラスミドｐＢＲ３２２でクロ
ーン化して得られる。第３図に示すように、該挿入物の
制限地図を示す絹換えプラスミドｐＲＩＴ０８１４ が挙げられる。 大腸菌Ｋ１２株をプラスミドｐＲＩＴ］ ０８４ ］、
ｐＲＩＴｌ ０８１０およびｐＲＩＴｌ ０８１４をそ
れぞれ含ませて形質転換し、その形質転換菌株の培養物
を、アメリカ合衆国、メリイランド、ロツクヴイルのＡ
ＴＣＣに、それぞれＡＴＣＣ３９０５３、ＡＴＣＣ３９
０５１およびＡＴＣＣ３９Ｑ５２として寄託（ブタペス
ト条約下）している。 さらに、ＡＴＣＣ３９０５０から、５．］Ｘ］０６ｄＰ
ｓｔＩＤＮＡフラグメントをプラスミドベクターｐＢＲ
３２２でクローン化し１組換えプラスミドｐＲＩＴ １
０８２４を得ている。このプラスミドは上記ｐＲＩＴ１
０８１４と同じ数および配置でｃｔｘコード配列の中お
よび囲りに制限部位を有している。 上記の方法は例示のＡＴＣＣ３９０５０株に限定されず
、出発物質としてサブユニッ）Ａのみまたはサブユニツ
）Ｂのみを産生ずるコレラ菌株を用いれは、それぞれＣ
ＬＸ ＡシストロンまたはｃｔｘＢシストロンを含むＤ
ＮＡバンドが得られることは明らかである。 ２つの毒素遺伝子のコピーを含む古典的なコレラ菌株５
６９Ｂ （ＡＴＣＣ２５８７０１のＣ１ａ Ｉ？肖化Ｄ
ＮＡについてクローニングすね、ば゛、１．２５×１０
ｄのフラグメントをｃｔｘ Ａ配列を表現するものと
して選ばれるし、また０、８８Ｘ１０ ｄおよび／ま
たは０．７８Ｘｚｏ ｄのフラグメントをＣＬＸＢ配
列を表現するものとして選ばれる。 は サブユニットＡまた１Ｂのいずれがまたは両方は△ コレラワクチンの調製に有用セあり、この場合、サブユ
ニツ）Ａはトキソイドの形で用い乙必要があり、サブユ
ニットＢはあまり好ましくないが同様にトキソイドの形
で用いられる。 不発明の他の態様においては、クローン化Ｄ ＮＡフラ
グメントを、ｉｎ ｖｉｖｏ またはｉｎ ｖｉｔｒ
。 にて遺伝子操作によってトキソイド形状のサブユニツ）
ＡおよびＢの生成に用いられる。当該技術分野において
よく知られているその例としては、特定の制限部位また
は直接部位においてヌクレオチド塩基対を削除または挿
入して特異的な突然変異誘発を起して特定のアミノ酸を
変える技術がある。サラニ、ｊｎ ｖｉｔｒ６での遺伝
子操作、例えば大腸菌の相関的熱不安定性エンテロトキ
シン遺伝子を不発明のクローン化コレラ毒素遺伝子にて
−それらの対応するＸｂａＩ制限部位で組換える方法、
すなわち１例えば、コレラ毒素遺伝子プロモーター領域
、読みとりまたは信号どプチドおよび成熟サブユニット
Ａタンパク質の最初の９個のアミノ酸を対応するＬＴ配
列に置き換えるなどの方法により、ハイブリッド毒素分
子を創造することもできる。このハイブリッド毒素は主
としてコレラ毒素配列からなり、その発現は大腸菌菌体
内で青紫の合成に有利に働く大腸菌プロモータ゛−領域
により調整される。 経口または非経口投与用ワクチンとして有用なサブユニ
ットＢま°たはトキソイドを含有する医薬組成物は、常
法によって調製され１例えば、重炭酸すｌ−リウムなと
の制酸剤を配合し、あるいは活性成分を腸溶性コーティ
ングしたりマイクロカプセルに充填して得られる。また
トキソイドは毒素から容易に調製され、例えばホルムア
ルデヒド、あるいは好ましくはグルタルアルデヒドで処
理して得られる。 不発明のサブユニツ）ＡおよびＢはまたコレラ菌の環境
株の検出にも有用で、未知のコレラ菌株の全ＤＮＡを制
限酵素エンドヌクレアーゼで消化するかまたはコロニー
雑種形成により、該未知コレラ菌株におけるｃｔｘＡお
よび／または（Ｌｘ Ｂ遺伝子フラグメントを検出する
ＤＮＡ／ＤＮＡ雑種形成実験に放射線標識プローブとし
て用いることができる。 つきに実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。 実施例１ コレラ菌ＡＴＣＣ３９０５０株のＤＮＡの調製：コレラ
菌ＡＴＣＣ３９０５０株をシンケース培地（５ｙｎｃａ
ｓｅ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ
＆ｌ。 Ｊ、Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．９６．４４０−４４９． １９
６６を参照）中で定常状態まで生育させる。この菌体を
遠心回収し、洗浄後、０．０５ Ｍ ）ロメタミン、０
゜ＩＭＮａＣ／、０．２５ＭＥＤＴＡを含む緩衝液（Ｐ
Ｈ８，０１に懸濁させる。これに、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）を最終濃度１チ（ｗ ／ ｖ ）になる
まで加えて溶菌し、同量の緩衝液飽和フェノールにて２
回抽出する。２容量の冷エタノールにてＤＮＡを沈降さ
せ、ガラス棒で捲きとって回収し−ｌＸ５ＳＣ（標準食
塩クエン酸塩溶液）、すなわち０．１５ ＭＮａＣ／−
０，０１５Ｍクエン酸トリナトリウム混液（ｐＨ７，Ｑ
）に溶解させる。 トロメタミン緩衝液＋ｐＩ−１８，０）を最終濃度００
５Ｍまで加え、牛すい臓リボヌクレアーゼ（最終濃度１
０μｇ／ｇｔｌで３７℃にて１時曲インキュベートする
。この混液を同量の緩衝液飽和フエノ−ルにて２回抽出
し−ＤＮＡをエタノールで沈降させ＋ ｌＸ５ＳＣに
溶かし、ｌＸ５ＳＣで透析する。 得られたＤＮＡ試料６μｇをＣ１ａｌ工ンドヌクレアー
ゼ４５６単位にて３７°Ｃで３時間消化させて全量４０
μｌとする。 該ＣＩａＴ消化コレラ菌ＤＮＡを同量に２つに分け、１
係アガロースゲルの別々のスロットで電、気泳動に付す
〔電気泳動用緩衝液はへイワードらにより開示され（Ｈ
ａｙｗａｒｄ Ｇ、 Ｓ、 ＆ Ｓｍｉ ｔｈ Ｍ、
Ｑ、。 Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ−６３，３８３，１９７２を参
照）、０５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドを含有する
〕。 １１ｉｎｄ １１およびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア
ーセで順次消化したλファージのＤＮＡ試刺を同上のゲ
ルのイｌｉ］のスロットに涌し−コリイら＋ＣｏｒγＳ
、 ’ｉｋ Ａｄａｍｓ、 Ｊ、、 Ｃｅ１１１１．
７９５． １９７７）の値を用いて分子量マーカーとし
て用いる。 電気泳動後、ゲルを短波紫外線照射してＤＮＡフラグメ
ントを共像化して写真にとり、λフアージＤＮＡバンド
の相対的な移動が記録されるのを防ぐ。このゲル中のＤ
ＮＡフラグメントをサウサーン技術＋ ５ｏｕｔｈｅｒ
ｎ Ｅ、 Ｍ、 、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ。 ９８．５０３．１．９７５ ）によりニトロセルロース
フィルターに転写結合させる。 このフィルターを縦方向に２つに切り、フィルターの各
半分上に付けたＣ１ａＩ消化コレラ菌Ｖ）ＮＡの試料を
得る。 実施例２ ｅｌｔＡおよびｅｌｌ Ｂ遺伝子特異性ＤＮＡプローブ
の調製： カーノらの方法（Ｋａｈｎ Ｍ、 ｅｔａｌ、 Ｍｅｔ
ｂｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５ Ｂ、 ２
６ Ｂ−１ｇ ７ ｇ ）によりＣｓＣｌ密度勾配遠心
法にてｐＥＷＤ ２９９プラスミドＤＮＡを調製し、こ
のｐ ＥＷＤ ２９９プラスミドＤＮＡ５Ｑ〜１００μ
ｇを制限酵素エンドヌクレアーゼｌ４ｉｎｃｌｉ （ｅ
ｌＬＡ用）または制限酵素エンド８りＬ／７−−″ｊＨ
ｉ″ｄＩＩＩおよび１°ｏＲＩ （ｅｌｔ
’ＬＢ用）の過剰を用いて消化し、ついで７５％アク
リルアミドゲルにて電気泳動に付して、所望のＤＮＡフ
ラグメントを分離精製する。プラスミドＰＥＷＤ２９９
の構造および特徴はダラスらにより記載されている（Ｄ
ａｌｌａｓ Ｗ、 ＆ Ｃｏ１１． Ｊ、 Ｂａｃｔ
。 １．３９，８５０．１９７９）。 所望のフラグメント（ｅｌＬＡ遺伝子フラグメントは］
０００１）Ｐ ＤＮＡ７ラグメントーｅｌｔＢ遺伝子
フラグメントは（３ＱＱｂｐＤＮＡフラグメント）を含
むゲルの部分を小力で切り取り、透析膜面内に入れ＝
ＤＮＡを電気泳動によりゲル切片から溶出させる。該領
内で電気泳動緩衝液中に溶出されたＤＮＡをエタノール
で沈降させて回収濃縮する。この回収した［ＩＮＡを０
．ＯＩＭｈロメタミン緩衝潅（ｐＩ−Ｉ ７．０）２０
μｌに溶かす。 得られたｅｌｉＡおよびｅｌ ｔ Ｂ−）ｆ４伝子特異
性ＤＮＡフラグメントはモズレイら（Ｍｏｓｅｌｅｙ
Ｓ、 ＆Ｆａｌｋｏｗ Ｓ、 、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、 １４４． ４４４．１９８ＣＨの記載す
るものと同じである。 実施例３ ニック翻訳によるＤＮＡプローブフラグメントの標識： 実施例２にＣｅ載の方法で精製したｅｌＬＡおよびｅｌ
ｔＢＤＮＡフラグメントのアリクオツド０５μｇを別々
の反応混合液中で、ニック翻訳（ｎ１ｃｋｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ １として知られている方法（Ｒｉｇｂｙ
Ｐ、 ｅｔａｌ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ］
］ ３． ２３７．１９７７１によりニュー・イングラ
ンド・ヌクレフ ［１：）ｒｅｉｅｉｃｌｌ、 Ｆｅｄ
、 Ｒｅｐ、 Ｇｅｒｍａｎｙ ）により供給されるキ
ット（ＮＥＫ−００４）および反応条件を用いて、デオ
キシシチジン５１−トリホスフェート （α−Ｐ ）で
標識する。 このように標識されたＤＮＡフラグメントの特異的活性
は、ｅｌｔＡＤＮＡにはＤＮＡＱ、５ｕｇ当り２．３Ｘ
］ Ｏｃｐｍ＝ ｅｌｔＢＤＮＡにはＤ Ｎ Ａ Ｑ
。 ５μｇ当り３．１４Ｘ ］、 Ｏｃｐｍである。この標
識ＤＮＡは使用する前に１００℃で１０〜１５分間加熱
して変性する。 実施例４ フィルター結合Ｄ Ｎ ＡのｅｌＬＡプローブによる雑
種形成： 実施例１で調製した変性コレラ菌ＤＮＡフラグメントヲ
含有するニトロセルロースフィルターの］ツノ半分ヲ、
５ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ（ｌ ｍＭＥＩ’）ＴＡ Ｏ，１％
（ｗ／ｖ］ＳＤＳ、ｐＨ，８，Ｑ）−デンハルトに記載
＋ Ｄｅｎｈａｒｄｔ Ｄ、 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｌｉｈｙｓ、 Ｒｅｓ。 Ｃｏｍ＋ｎ、 ２３ 、 ６４１．１９６６１の溶液（
１００倍濃度溶液として調製）１％（Ｖ／Ｖ）および２
５％（ｖ／ｖ）脱イオンホルムアミドを含有する予備雑
種形成溶液中で３７℃にて１時間インキュベートする。 このフィルターを同じ組成〔たた゛し、熱変性サケ血清
ＤＮＡ２５μｇ、／ｍｅ および実施例３で調製した
放射線活性変性ｅｌＬＡプローブを希釈して最終比活性
９Ｘ１０ ｃｐｍ／ｍｔとしたものを含有）の雑種形
成溶液に入れる。これを３７℃で３６時間インキュベー
トしたのち、放射線活性プローブＤＮＡを除いた原作は
上記雑種形成溶液と同じ組成の溶液中で３７℃にて２５
分間２回インキュベートする。このフィルターを２ｘｓ
ｓＣ藩液中て室温で２５分間２１回すすき、空気乾燥す
る。乾燥フィルターをＸ線フィルム（富士写真フィルム
）に、該放射線活性プローブＤＮＡがコレラ菌ＤＮＡの
結合した変性フラグメントに雑種形成したフィルターの
領域に対応するフィルムの部分を暗色にするのに充分な
時間曝らす。 このｅｌｔＡプローブでインキュベートしたフィルター
に曝したＸ線フィルムを調べたところ、該ｅｌｔＡ遺伝
子フラグメントはコレラ菌ＡＴＣＣ３９０５０株のＣ１
ａＩ消化全ＤＮＡの単一ハンドにのみ特異的に雑種形成
することがわかる。このＤＮＡフラグメントは、λＤＮ
Ａフラグメントの相対移動と比べることにより、推定分
子量１．０×６ ． １０ タルトンを有している。これらの雑種形成ニット
Ａの構造遺伝子配列を特定する。（：ｔａＡシストロン
の全部または１部を発現する。 実施例５ フィルター結合ＤＮＡのｅｌｔＢプローブによる雑種形
成： ホルムアミド濃度２０％（Ｖ ／Ｖ ）を用いかつｅｌ
ｔＢプローブＤＮＡを雑種形成溶液中の最終比活性１．
２ Ｘ １０ Ｃｐｍ ／ｍｅとなるように希釈した
以外はＡｉｌ記と同様の方法で結合した変性コレラ菌Ｄ
ＮＡを含むフィルターの残り半分に対して放射線活性ｅ
ｌｔ ＢプローブＤＮＡを雑種形成させる・このｃｌ
のサブユニツｌ−ＡおよびＢの製造法、および該サブユ
ニットを含む組成物に関する。 コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ）のある
種の菌株か産生ずるホロトキシンＩ １１０１０ｔＯＸ
ｉｎ ）ハサフユニットＡおよびＢとして知られている
２種のタンパク質サブユニットからなることが知られて
いる。 そのサブユニツ）Ａ （ＣＴＡ〕は上皮細胞の浸透に感
応性で、その酵素作用により消化器管腔に体液がほとん
ど消失する症状をひき起すが、サブユニッ） Ｂ （Ｃ
ＴＢ）はホロトキシンを細胞壁上のモノシアロシルガン
グリオシドＧＭ ］ レセプタ一部位に結合させ、毒
性を示さず、高い免疫性を有する。 コレラ菌の中でホロトキシンを産生ずる菌株は。 例えば、よく知られているビブリオ・コレレ・ビオタイ
プＥトトル・セロタイプ・イナバ株（Ｖｉｂｒｉｏ ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ ｂｉｏ（ｙｐｅＥ Ｉ Ｔｏｒ ５ｅ
ｒｏｔｙ、ｐｅＩＮＡＢＡ ）およびホンダらの記載す
るコレラ毒素のサブユニットＢは産生ずるがサブユニッ
トＡは検出されないコレラ菌変位株（Ｐｒ６ｃ、 Ｎａ
ｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７６．２０５２−２０５６．
１９７９、 Ｔ、 Ｈｏｎｄａ ＆ Ｒ，Ａ、 Ｆｉ
ｎｋｅｌｓｔｅｉｎを参照）がある。 現在知られているコレラワクチンはビブリオ菌から抽出
されるリポポリサッカライド類またはビブリオ死菌の濃
厚懸濁液を含み、繰返し注射することにより、重度の被
暴接触感染に対しては一定限度の防御作用が認められる
が、流行期の制御手段としては効果がない。また、ボラ
ンティアの人達により、コレラから回復したのちは、類
似菌に対する抗体と高い抵抗性が生じるが異種菌株に対
しては抗体や抵抗性は生じないことが示されている。 コレラホロトキシンは高度に抗原性があり、唯一の免疫
型があることを考慮して、有効な抗毒免疫性は各種の血
清型または線型コレラ菌に対して防御力があることが提
唱されている。 この観点から、サブユニットＢは好ましいワクチン成分
であると認められ、経口または非経口投与により防護性
抗体を誘起させるものとみられ。 他の報告者はサブユニツ）Ｂ毒素またはあまり良くはな
いがトキソイドをベースとしたコレラワクチンを提案し
ている（ Ｊ、 ）ｌｏｌｍｇｒｅｎ ｅＬａｌ＋Ｎａ
ｔｕｒｅ ２６９．６０２ ６０３．１９７７、前記ｌ
１ｏｎｄａ ＆ Ｒ，Ａ、 Ｆｉｌｋｅｌｓｔｅｉｎ
（７）文献、およびＪ、 Ｈｏ１ｍｇｒｅｒ４ Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９２＋ ４１３−４１７゜１９８１を参
照）。 不発明前において−ホロトキシンは染色体遺伝子（ｃｔ
ｘ ）に特異性があることが知られており、またモズレ
イらは、大腸菌の相関的熱不安定性エンテロトキシン遺
伝子（ｅｌｔ）の２個のシストロンを表わすＤＮＡフラ
グメントは、各種の制限エンドヌクレアーゼで消化され
たコレラ菌全ＤＮＡの特異的ｃｔｘ遺伝子フラグメント
を検出するためのＤＮＡ／ＤＮＡ雑種形成（ｈｙｂｒ
１ｄｉｚａｔ ｉｏｎ ）実験においてプローブとして
使い得ることを示している。 不発明者らは、ホロトキシンを産生ずる毒性コレラ菌株
（該囚株の例は、アメリカ合衆国、メリイランド、ロツ
ヴイルのＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ３９０５０として寄託さ
れているビブリオ・コレレ・Ｅトトル・イナバ株（Ｖｉ
ｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅＥＩＴｏ ｒ Ｉ ＮＡＢ
Ａ ｌである）のＤＮＡをＣ１ａＩｚ７ドヌクレアーゼ
で消化すると＋ ＤＮＡの２つの異なったバンドを放出
し、それらはそれぞれ雑種形成うことを見出した。
バネ発明によれ
ば、上記のようにＣ１ａＩエンドヌクレアーゼ処理によ
って得られるｃ （ｘ Ａまたはｃｔｘ Ｂのいずれか
を含有するフラグメントを、Ｃ１ａ Ｉエンドヌクレア
ーゼで事前に開裂した適当なベクターに別々にまたは連
続して挿入することにより、大腸菌に１２株または無毒
性コレラ菌株なとの宿主微生物にクローニング担体を構
築させる。得られた菌株をコレラ毒性のサブユニツ）Ａ
またはサブユニツ）Ｈのいずれかまたは両者を製造する
ために用いる。 とくに、後記実施例に示すように、 ＣＬＸ Ａ遺伝子の主部分を含む１． ＯＸ １０
ｄｃｌａ■で発生したＤＮＡフラグメントをプラスミド
ｐＢＲ３２２でクローン化して得られる、第２図に示す
ように、１．０Ｘ１０ ダルトン挿入物の制限地図を
示す絹換えプラスミドｐＲＩＴｌ ０８４ ］、心 ｃｔｘＢ遺伝子を含む２．４５Ｘ１０ ｄ Ｃ１ａ
Ｉで発生したＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＢＲ３
２２でクローン化して得られる、第１図で示すように、
２，４５Ｘ１０ クルトン挿入物の制限地図を示す絹
換えプラスミドｐＲＩＴ１０８１０＝および ｃｔｘ ＡおよびｃＬｘＢの両遺伝子を含むフラグメン
トを＋ １．０ＸＩＯｄｃｌａＩＣＬｘＡ挿入物に０
゜７５Ｘ１０ ダルトンｃｌａＩ−Ｂｇｌｎ′ｃｔｘ
Ｂ挿入物を結合した形でプラスミドｐＢＲ３２２でクロ
ーン化して得られる。第３図に示すように、該挿入物の
制限地図を示す絹換えプラスミドｐＲＩＴ０８１４ が挙げられる。 大腸菌Ｋ１２株をプラスミドｐＲＩＴ］ ０８４ ］、
ｐＲＩＴｌ ０８１０およびｐＲＩＴｌ ０８１４をそ
れぞれ含ませて形質転換し、その形質転換菌株の培養物
を、アメリカ合衆国、メリイランド、ロツクヴイルのＡ
ＴＣＣに、それぞれＡＴＣＣ３９０５３、ＡＴＣＣ３９
０５１およびＡＴＣＣ３９Ｑ５２として寄託（ブタペス
ト条約下）している。 さらに、ＡＴＣＣ３９０５０から、５．］Ｘ］０６ｄＰ
ｓｔＩＤＮＡフラグメントをプラスミドベクターｐＢＲ
３２２でクローン化し１組換えプラスミドｐＲＩＴ １
０８２４を得ている。このプラスミドは上記ｐＲＩＴ１
０８１４と同じ数および配置でｃｔｘコード配列の中お
よび囲りに制限部位を有している。 上記の方法は例示のＡＴＣＣ３９０５０株に限定されず
、出発物質としてサブユニッ）Ａのみまたはサブユニツ
）Ｂのみを産生ずるコレラ菌株を用いれは、それぞれＣ
ＬＸ ＡシストロンまたはｃｔｘＢシストロンを含むＤ
ＮＡバンドが得られることは明らかである。 ２つの毒素遺伝子のコピーを含む古典的なコレラ菌株５
６９Ｂ （ＡＴＣＣ２５８７０１のＣ１ａ Ｉ？肖化Ｄ
ＮＡについてクローニングすね、ば゛、１．２５×１０
ｄのフラグメントをｃｔｘ Ａ配列を表現するものと
して選ばれるし、また０、８８Ｘ１０ ｄおよび／ま
たは０．７８Ｘｚｏ ｄのフラグメントをＣＬＸＢ配
列を表現するものとして選ばれる。 は サブユニットＡまた１Ｂのいずれがまたは両方は△ コレラワクチンの調製に有用セあり、この場合、サブユ
ニツ）Ａはトキソイドの形で用い乙必要があり、サブユ
ニットＢはあまり好ましくないが同様にトキソイドの形
で用いられる。 不発明の他の態様においては、クローン化Ｄ ＮＡフラ
グメントを、ｉｎ ｖｉｖｏ またはｉｎ ｖｉｔｒ
。 にて遺伝子操作によってトキソイド形状のサブユニツ）
ＡおよびＢの生成に用いられる。当該技術分野において
よく知られているその例としては、特定の制限部位また
は直接部位においてヌクレオチド塩基対を削除または挿
入して特異的な突然変異誘発を起して特定のアミノ酸を
変える技術がある。サラニ、ｊｎ ｖｉｔｒ６での遺伝
子操作、例えば大腸菌の相関的熱不安定性エンテロトキ
シン遺伝子を不発明のクローン化コレラ毒素遺伝子にて
−それらの対応するＸｂａＩ制限部位で組換える方法、
すなわち１例えば、コレラ毒素遺伝子プロモーター領域
、読みとりまたは信号どプチドおよび成熟サブユニット
Ａタンパク質の最初の９個のアミノ酸を対応するＬＴ配
列に置き換えるなどの方法により、ハイブリッド毒素分
子を創造することもできる。このハイブリッド毒素は主
としてコレラ毒素配列からなり、その発現は大腸菌菌体
内で青紫の合成に有利に働く大腸菌プロモータ゛−領域
により調整される。 経口または非経口投与用ワクチンとして有用なサブユニ
ットＢま°たはトキソイドを含有する医薬組成物は、常
法によって調製され１例えば、重炭酸すｌ−リウムなと
の制酸剤を配合し、あるいは活性成分を腸溶性コーティ
ングしたりマイクロカプセルに充填して得られる。また
トキソイドは毒素から容易に調製され、例えばホルムア
ルデヒド、あるいは好ましくはグルタルアルデヒドで処
理して得られる。 不発明のサブユニツ）ＡおよびＢはまたコレラ菌の環境
株の検出にも有用で、未知のコレラ菌株の全ＤＮＡを制
限酵素エンドヌクレアーゼで消化するかまたはコロニー
雑種形成により、該未知コレラ菌株におけるｃｔｘＡお
よび／または（Ｌｘ Ｂ遺伝子フラグメントを検出する
ＤＮＡ／ＤＮＡ雑種形成実験に放射線標識プローブとし
て用いることができる。 つきに実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。 実施例１ コレラ菌ＡＴＣＣ３９０５０株のＤＮＡの調製：コレラ
菌ＡＴＣＣ３９０５０株をシンケース培地（５ｙｎｃａ
ｓｅ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ
＆ｌ。 Ｊ、Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．９６．４４０−４４９． １９
６６を参照）中で定常状態まで生育させる。この菌体を
遠心回収し、洗浄後、０．０５ Ｍ ）ロメタミン、０
゜ＩＭＮａＣ／、０．２５ＭＥＤＴＡを含む緩衝液（Ｐ
Ｈ８，０１に懸濁させる。これに、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）を最終濃度１チ（ｗ ／ ｖ ）になる
まで加えて溶菌し、同量の緩衝液飽和フェノールにて２
回抽出する。２容量の冷エタノールにてＤＮＡを沈降さ
せ、ガラス棒で捲きとって回収し−ｌＸ５ＳＣ（標準食
塩クエン酸塩溶液）、すなわち０．１５ ＭＮａＣ／−
０，０１５Ｍクエン酸トリナトリウム混液（ｐＨ７，Ｑ
）に溶解させる。 トロメタミン緩衝液＋ｐＩ−１８，０）を最終濃度００
５Ｍまで加え、牛すい臓リボヌクレアーゼ（最終濃度１
０μｇ／ｇｔｌで３７℃にて１時曲インキュベートする
。この混液を同量の緩衝液飽和フエノ−ルにて２回抽出
し−ＤＮＡをエタノールで沈降させ＋ ｌＸ５ＳＣに
溶かし、ｌＸ５ＳＣで透析する。 得られたＤＮＡ試料６μｇをＣ１ａｌ工ンドヌクレアー
ゼ４５６単位にて３７°Ｃで３時間消化させて全量４０
μｌとする。 該ＣＩａＴ消化コレラ菌ＤＮＡを同量に２つに分け、１
係アガロースゲルの別々のスロットで電、気泳動に付す
〔電気泳動用緩衝液はへイワードらにより開示され（Ｈ
ａｙｗａｒｄ Ｇ、 Ｓ、 ＆ Ｓｍｉ ｔｈ Ｍ、
Ｑ、。 Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ−６３，３８３，１９７２を参
照）、０５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドを含有する
〕。 １１ｉｎｄ １１およびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア
ーセで順次消化したλファージのＤＮＡ試刺を同上のゲ
ルのイｌｉ］のスロットに涌し−コリイら＋ＣｏｒγＳ
、 ’ｉｋ Ａｄａｍｓ、 Ｊ、、 Ｃｅ１１１１．
７９５． １９７７）の値を用いて分子量マーカーとし
て用いる。 電気泳動後、ゲルを短波紫外線照射してＤＮＡフラグメ
ントを共像化して写真にとり、λフアージＤＮＡバンド
の相対的な移動が記録されるのを防ぐ。このゲル中のＤ
ＮＡフラグメントをサウサーン技術＋ ５ｏｕｔｈｅｒ
ｎ Ｅ、 Ｍ、 、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ。 ９８．５０３．１．９７５ ）によりニトロセルロース
フィルターに転写結合させる。 このフィルターを縦方向に２つに切り、フィルターの各
半分上に付けたＣ１ａＩ消化コレラ菌Ｖ）ＮＡの試料を
得る。 実施例２ ｅｌｔＡおよびｅｌｌ Ｂ遺伝子特異性ＤＮＡプローブ
の調製： カーノらの方法（Ｋａｈｎ Ｍ、 ｅｔａｌ、 Ｍｅｔ
ｂｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５ Ｂ、 ２
６ Ｂ−１ｇ ７ ｇ ）によりＣｓＣｌ密度勾配遠心
法にてｐＥＷＤ ２９９プラスミドＤＮＡを調製し、こ
のｐ ＥＷＤ ２９９プラスミドＤＮＡ５Ｑ〜１００μ
ｇを制限酵素エンドヌクレアーゼｌ４ｉｎｃｌｉ （ｅ
ｌＬＡ用）または制限酵素エンド８りＬ／７−−″ｊＨ
ｉ″ｄＩＩＩおよび１°ｏＲＩ （ｅｌｔ
’ＬＢ用）の過剰を用いて消化し、ついで７５％アク
リルアミドゲルにて電気泳動に付して、所望のＤＮＡフ
ラグメントを分離精製する。プラスミドＰＥＷＤ２９９
の構造および特徴はダラスらにより記載されている（Ｄ
ａｌｌａｓ Ｗ、 ＆ Ｃｏ１１． Ｊ、 Ｂａｃｔ
。 １．３９，８５０．１９７９）。 所望のフラグメント（ｅｌＬＡ遺伝子フラグメントは］
０００１）Ｐ ＤＮＡ７ラグメントーｅｌｔＢ遺伝子
フラグメントは（３ＱＱｂｐＤＮＡフラグメント）を含
むゲルの部分を小力で切り取り、透析膜面内に入れ＝
ＤＮＡを電気泳動によりゲル切片から溶出させる。該領
内で電気泳動緩衝液中に溶出されたＤＮＡをエタノール
で沈降させて回収濃縮する。この回収した［ＩＮＡを０
．ＯＩＭｈロメタミン緩衝潅（ｐＩ−Ｉ ７．０）２０
μｌに溶かす。 得られたｅｌｉＡおよびｅｌ ｔ Ｂ−）ｆ４伝子特異
性ＤＮＡフラグメントはモズレイら（Ｍｏｓｅｌｅｙ
Ｓ、 ＆Ｆａｌｋｏｗ Ｓ、 、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、 １４４． ４４４．１９８ＣＨの記載す
るものと同じである。 実施例３ ニック翻訳によるＤＮＡプローブフラグメントの標識： 実施例２にＣｅ載の方法で精製したｅｌＬＡおよびｅｌ
ｔＢＤＮＡフラグメントのアリクオツド０５μｇを別々
の反応混合液中で、ニック翻訳（ｎ１ｃｋｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ １として知られている方法（Ｒｉｇｂｙ
Ｐ、 ｅｔａｌ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ］
］ ３． ２３７．１９７７１によりニュー・イングラ
ンド・ヌクレフ ［１：）ｒｅｉｅｉｃｌｌ、 Ｆｅｄ
、 Ｒｅｐ、 Ｇｅｒｍａｎｙ ）により供給されるキ
ット（ＮＥＫ−００４）および反応条件を用いて、デオ
キシシチジン５１−トリホスフェート （α−Ｐ ）で
標識する。 このように標識されたＤＮＡフラグメントの特異的活性
は、ｅｌｔＡＤＮＡにはＤＮＡＱ、５ｕｇ当り２．３Ｘ
］ Ｏｃｐｍ＝ ｅｌｔＢＤＮＡにはＤ Ｎ Ａ Ｑ
。 ５μｇ当り３．１４Ｘ ］、 Ｏｃｐｍである。この標
識ＤＮＡは使用する前に１００℃で１０〜１５分間加熱
して変性する。 実施例４ フィルター結合Ｄ Ｎ ＡのｅｌＬＡプローブによる雑
種形成： 実施例１で調製した変性コレラ菌ＤＮＡフラグメントヲ
含有するニトロセルロースフィルターの］ツノ半分ヲ、
５ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ（ｌ ｍＭＥＩ’）ＴＡ Ｏ，１％
（ｗ／ｖ］ＳＤＳ、ｐＨ，８，Ｑ）−デンハルトに記載
＋ Ｄｅｎｈａｒｄｔ Ｄ、 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｌｉｈｙｓ、 Ｒｅｓ。 Ｃｏｍ＋ｎ、 ２３ 、 ６４１．１９６６１の溶液（
１００倍濃度溶液として調製）１％（Ｖ／Ｖ）および２
５％（ｖ／ｖ）脱イオンホルムアミドを含有する予備雑
種形成溶液中で３７℃にて１時間インキュベートする。 このフィルターを同じ組成〔たた゛し、熱変性サケ血清
ＤＮＡ２５μｇ、／ｍｅ および実施例３で調製した
放射線活性変性ｅｌＬＡプローブを希釈して最終比活性
９Ｘ１０ ｃｐｍ／ｍｔとしたものを含有）の雑種形
成溶液に入れる。これを３７℃で３６時間インキュベー
トしたのち、放射線活性プローブＤＮＡを除いた原作は
上記雑種形成溶液と同じ組成の溶液中で３７℃にて２５
分間２回インキュベートする。このフィルターを２ｘｓ
ｓＣ藩液中て室温で２５分間２１回すすき、空気乾燥す
る。乾燥フィルターをＸ線フィルム（富士写真フィルム
）に、該放射線活性プローブＤＮＡがコレラ菌ＤＮＡの
結合した変性フラグメントに雑種形成したフィルターの
領域に対応するフィルムの部分を暗色にするのに充分な
時間曝らす。 このｅｌｔＡプローブでインキュベートしたフィルター
に曝したＸ線フィルムを調べたところ、該ｅｌｔＡ遺伝
子フラグメントはコレラ菌ＡＴＣＣ３９０５０株のＣ１
ａＩ消化全ＤＮＡの単一ハンドにのみ特異的に雑種形成
することがわかる。このＤＮＡフラグメントは、λＤＮ
Ａフラグメントの相対移動と比べることにより、推定分
子量１．０×６ ． １０ タルトンを有している。これらの雑種形成ニット
Ａの構造遺伝子配列を特定する。（：ｔａＡシストロン
の全部または１部を発現する。 実施例５ フィルター結合ＤＮＡのｅｌｔＢプローブによる雑種形
成： ホルムアミド濃度２０％（Ｖ ／Ｖ ）を用いかつｅｌ
ｔＢプローブＤＮＡを雑種形成溶液中の最終比活性１．
２ Ｘ １０ Ｃｐｍ ／ｍｅとなるように希釈した
以外はＡｉｌ記と同様の方法で結合した変性コレラ菌Ｄ
ＮＡを含むフィルターの残り半分に対して放射線活性ｅ
ｌｔ ＢプローブＤＮＡを雑種形成させる・このｃｌ
【
Ｂプローブは、これらの条件下に、推定分子Ｍ２．４５
Ｘ １０ タルトンを有するＣ１ａｌ消化コレラ菌
ＡＴＣＣ３９０５０株ＤＮＡの単一バンドにのみ特異的
に雑種形成する。 これらの雑種形成条件でｅ１ｔＢプローブに対して相同
を示すコレラ菌ＤＮＡ配列はコレラ毒素のサブユニット
Ｂの構造遺伝子配列を特定するｃｔｘ１３シストロンの
全部または１部を発現する。 実施例６ コレラ菌全ＤＮＡからｃＬｘＡまたはｃｔｘ Ｂ遺伝子
配列のいずれかを含むＤＮＡフラグメントの増殖： 実施例１で得られた全ＤＮＡのアリクオツド６３μｇを
全反応液Ｎ４００μｌ中にてＣ１ａ Ｉエンドヌクレア
ーゼ５００単位を用いて３７℃で３時間消化する。この
消化ＤＮＡを１％（ｗ ／ Ｖ １アガロースゲルで電
気泳動に付す。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌＴエンド
ヌクレアーゼで消化したλファージのＤＮＡ試刺および
ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ 、：ｃンドヌクレアーゼ
で消化したｐＷＥＤＱ ２０ （Ｗ。 Ｄａｌｌａｓ ｅｔａｌ、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、 １３９． ８５０．１９７９）のＤＮＡ試刺を同
じゲルの別々のスロットを通して分子量マーカーとして
用いる。分子量２，４５Ｘ１０ ｄおよび１．０Ｘ１
０ ｄに対応する該Ｃ１ａｒエンドヌクレアーゼ消化
からのコレラ菌ＤＮＡフラグメントの位置を分子量マー
カーに対比して推定し、これら２点の各々の点およびそ
の上下において該ゲルから５個の１ ａｍ切片を切り出
す。各ゲル切片におけるＤＮＡは透析膜の閉じた鎖の中
で電気泳動により回収する。この液を６餞からとり、０
４５μミリポアフィルタ−を通してアガロースフラグメ
ントを除き、同量のイソプロパツールで沈降させること
によりＤＮＡを回収する。この沈降物を０．ＯＩＭ）ロ
メタミン緩衝液（ｐＩ−１７，Ｑ ）に溶かし、２倍量
のエタノールにて再沈降させる。得られた各ゲル切片か
らのＤＮＡは最後に０．０１Ｍ）ロメタミン−０，００
１ＭＥＤ Ｔ Ａ緩衝液（ｐＩ−１７，０１２０μｌに
溶解する。 各Ｄ Ｎ Ａ 溶液試料１μｌについて、カファトスら
の点雑種形成法（ｄｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ ｉｏ
ｎｍｅｌｌｏｄ ）（Ｋａｆａｔｏｓ Ｆ、 ｅｔａｌ
、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 ７． １５４
１．１９７９１により、上記実施例２〜５に記載の雑種
形成条件および放射線活性ｅｌｔＡおよびｅｌｔＢプロ
ーブＤＮＡを用イテ、ｃｔｘＡまたはｃｔｘＢ遺伝子配
列の含量を試験する。 ］、０Ｘ１０ ｄＤＮＡに対応する２個のＤＮＡ試料
は他の３つの試料に比べてより強（ｅｌＬＡプローブで
雑種形成することがわかる。 同様に−２，４５Ｘ１０ ｄＤＮＡに対応する２個の
ＤＮＡ試料はｅｌｔＢプローブでより強く雑種形成する
。 実施例７ ｃｔｘＢ遺伝子配列を富化したＤＮＡのクローニング： ＣｓＣｌ！密度勾配遠心法によって調製したｐＢＲ３２
２プラスミドＤＮＡのアリクオツド５μｇをＣ１ａ Ｉ
エンドヌクレアーゼ６６単位にて全反応液量１００μｌ
中３７℃で２時間消化する。プラスミドＤＮＡ３μｇを
含む上記消化試料６０μｍ１こグリシン緩衝液（０１Ｍ
グリシ７−１ｍＭＭｇＣ１２６Ｈ２０、Ｏ，ｌ ｍＭＺ
ｎ ＳＯ４−７Ｈ２０、ＰＨ１０，５１１００μｌおよ
び牛腸アルカリホスファターゼ０３単位を加える。この
混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、同量のフ
ェノールで２回抽出し、さらにエーテルで３回抽出し１
このち、エタノールでＤＮＡを沈降させる。ＰＢＲ３２
２ＤＮＡを０．０１Ｍ）ロメタミンＨＣ１Ｑ、□ Ｑ
Ｉ ＭＥ ＤＴＡ緩衝液（ＰＨ７，０１に溶解する。 ｅｌＬＢプローブに最も強い雑種形成信号を示す実施例
６て得・られた２つのＤＮＡフラクションＱＪ各アリク
オツドｌＯμｌをＣ１ａＩで消化したアルカリホスファ
ターゼ処理ｐＢＲ３２２ＤＮＡ□、４μｇと混合し、こ
の混液をトロメタミン緩衝液にて最終容Ｍ３０μ！・に
し、同量のフェノールで抽）、 出し、さらにエーテルで３回抽出したのち、エタノール
で沈降させ、得られたＤＮＡを０．０１．Ｍトロメラミ
ンＨＣｌ−０，００１ＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７，０）
２０μｌに溶解する。 このコレラ菌ＤＮＡフラグメントとＰＢＲ３２２ＤＮＡ
の混合物をＴ４−ＤＮＡリガーゼでインキュベートとし
て結紮する。このＤＮＡ混合物１０ ｆｉｔ １ｃＴ４
−ＤＮＡリガーゼカクテル１０μｌを加えて２０ｍＭト
ロメタミンｌｌＣｌ、ｌＱｍＭＭｇＣＡ’ ２ ・６Ｈ
２０−１０ｍ Ｍジチオスレイトール、１２ｍＭデオキ
シアデノシントリホスフェート、牛血清アルブミン５０
μｇ／ｍｌ！およびＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｌｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 Ｆｅｄ。 Ｒｅｐ、 Ｇｅｒｍａｎｙ Ｉ Ｑ、 ５単位を含む溶
液（ＰＩ−Ｉ ７．６）を得る。 このリガーゼ含有混液を１５℃で４時間インキュベート
して−Ｃ１ａＩ消化ｐＢＲ３２２ＤＮＡにコレラ菌ＤＮ
Ａフラグメントを結紮して絹換え分子を形成する。 この全語％ＤＮＡ混合物２０μノを用いて、コーエンら
の方法（Ｃｏｈｅｎ Ｓ、 ｅｔａｌ、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＩＪ、 Ｓ、６９．２１１０−
１９７２’にヨリ調製シタ大腸’［Ｋ １２株Ｍ Ｍ
２９４ （Ｄ ＣａＣ／２処理コンピテント菌（Ｂａｃ
ｋｍａｎ Ｋ、 ｅＬａｌ、 Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ−７３＋ ４
１７４、１９７６に記載）を形質転換する。この形質転
換培養物をアンピシリン２００μｇ／ａｎｔを含む固形
寒天培地に拡け、ＰＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを保持
する菌体を収集する。全形質転換培養物から約１０００
のアンピシリン耐性コロニーが得られる。 実施例８ ｃｔｘ Ｂ遺伝子配列について形質転換コロニーのスク
リーニング： 実施例７で得られたアンピシリン耐性形質転換コロニー
を、シャージンらの方法ｒＧｅｒｇｅｎ Ｊ。 ｅｔａｌ、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ７
． ２］ ］ ５、】９７９）によりｅｌｔ Ｂプロー
ブに対して雑種形成するＤＮＡ配列の存在についてスク
リーニングする。 固形寒天培地上に生えた形質転換体コロニーはアンピシ
リン含有培地の２重プレートの表面に一定配列で移行す
る。このプレートを３７℃でインキュベートする。６対
の一方のプレートの表面に滅菌沖紙（Ｗｈａｔｍａｎ
５４１ ）’をおき、そのｐ紙をはがして寒天表面か
ら生育菌をはがし取る。この方法により、固形寒天培地
に生えたコロニーのレプリカを濾紙上に得る。この濾紙
を３７℃で１５分子８Ｊ乾燥し、エタノール洗浄を行な
４つない以外は上記シャージンらの方法に供する。 かく処理した濾紙を実施例５と同じ条件にて放射線活性
ｅｌｔＢプローブＤＮＡで雑種形成させ、種々の時間に
わたってＸ線フィルムに曝らす。 １０コロニーは他のものより明らかに暗色が強く、それ
らを２重寒天プレートより回収する。これら雑種形成陽
性を示す１０コロニー中、４コロニーはテトラサイクリ
ン感応性で、異種のＤＮＡフラグメントによるｐＢＲ３
２２のベクターへのテトラサイクリン耐性遺伝子の挿入
不活を示す。 これら４つのコロニ〜からバーンボイムらの方法 （Ｂ
ｉ ｒｎｂｏｉｍ Ｉ土 ＆： Ｄｏｌｙ Ｊ、
、 Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、７，７５１３，１
９７．９）によりプラスミドＤＮＡを調製し、Ｃ１ａＩ
エンドヌクレアーゼによる制限分析をしたところ、各試
料において、ＰＢＲ３２２ヘクタ一１１分子ｆ１２．４
５ Ｘ ］ ０’ ｄヲ有するＤＮＡ挿入物を保持して
いた。かく単離しタコロニー（７Ｊ ］ ッＬｔＭＭ２
９４ （ｐＲＩＴｌ ０８１０）の特性を持ち、その培
養物をＡＴＣＣ３９０５】として寄−託している。 実施例９ ＡＴＣＣ３９０５１株の特性の検討： ＣｓＣ１−臭化エチジウム密度勾配遠心法によりＡＴＣ
Ｃ３９０５１株からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵
素エンドヌクレアーゼ分析に付す。 この２．４５Ｘ１０ ダルトン（Ｌ：ＩａＩＤＮＡ挿
入物は、第１図に示すようなｐＢＲ３２２ベクターＤＮ
Ａと相対した制限部位および配向性を有する点に特徴が
ある。 この菌株はさらにスベンナホルムらの酵素連結免疫吸着
アッセイ（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ Ａ、 ＆Ｉ−１ｏ
１ｍｌ−１ｏ１． 、 Ｃｕｒｒ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、 ］、 ｌ ９． ｌ ９７１３１において純コレ
ラ毒素頃対する高い抗体と反応するタンパク質を産生ず
る特徴を有し、それはＧＭＩガングリオシドレセプター
に対するコレラ毒素のサブユニツ）Ｂタンパクの結合に
基づいている。 ＡＴＣＣ３９０５１株の培養菌体をフランス製受圧器を
通し、３０００Ｘｇで４℃、３０分間遠心して澄明化し
て得られる抽出物はこのエライサアツセイ （Ｅｌｉｓ
ａ ａｓｓａｙ ） によりサブユニットＢタンパク
の強い陽性を示すことがわかった。 このクローン化挿入物の特徴を検討するために、さらｌ
’−ｐＲＩＴｌ ０８１０ Ｄ ＮＡをＣ１ａ Ｉおよ
び１１ｉｎｃ ＩＩ上エンドクレアーゼで順次消化し、
その０．２Ｘ１０ ｄフラグメントをアクリルアミド
ゲルでの電気泳動および該フラグメント含有ゲル切片の
電気溶出によって精製する。この精製フラグメント０５
μｇを実施例３に記載のニック翻訳により Ｐで標識
してプローブとして用いるために比活性１．９６Ｘ１０
Ｃｐｍｌｏ、５μｇとした。 ＡＴＣＣ３９０５０株の全ＤＮＡを各種エンドヌクレア
ーゼで消化し、その試料をアガロースゲルでの電気泳動
、変性、ついでニトロセルロースフィルターへの転移を
行なう。これらのフィルターを放射線活性変性Ｃ１ａ
Ｉ −Ｈｉｎｃ：［プローブＤＮＡを用い、雑種形成溶
液からホルムアミドを除いたＤＮＡ／ＤＮＡ雑種形成の
ストリンジェンυ条件で６５℃にて１８時間インキュベ
ートする。 Ｘ線フィルムを該雑種形成ニトロセルロースフィルター
に曝して実験したところ、より弱いストリンジェント条
件でｅｌｔＢプローブで行なった実施例５でのビブリオ
Ｃ１ａ Ｉ −Ｈｉｎｃ ■プローブと全く同じビブリ
オＤＮＡのバンドが現われた。こ）結果よりクローン化
ＤＮＡはコレラ菌起原のものであることが判明した。 実施例１０ ｃｔｘ Ａ遺伝子配列を富化したコレラ菌のＤＮＡのク
ローニング： 実施例７に記載の２つのＣＩａＩ消化ＤＮＡフラクショ
ン（ｅｌｔＡプローブに最も強い雑種形成信号を示す）
各１０μｇをＣ１ａＩ消化アルカリホスフアターゼ処理
ｐＢＲ３２２ＤＮＡ０４μｇと混合する。 このＤＮＡ混合物を実施例７と同様にしてフェノール抽
出、アルコール沈降、溶解およびＴ４ −Ｄ Ｎ Ａ
ＩＪガーゼによる結ｉを行ない、大腸菌に１２株のＣａ
Ｃｌ２処理菌体ＭＭ２９４の形質転換に用イル。この形
質転換培養物をアンピシリン含有培地で３７℃にてイン
キュベートして約４０００コロニー全部を回収する。 上記アンピシリン耐性コロニーを実施例８に記載の方法
および条件にてｅｌｔＡプローブに雑種形成するＤ Ｎ
Ａ配列の存否をスクリーニングする。 ２つのコロニーがｅｌＬＡプローブに陽性反応を示しテ
トラサイクリン感応性であった。これら２つのコロニー
から前記バーンボイムらの方法でプラスミドＤＮＡを調
製し、Ｃ１ａｌエンドヌクレアーゼ消化により、ｐＢＲ
３２２ベクターフラグメントに加えて］、ＯＸ］Ｏｄの
ＤＮＡフラグメントを放出する。上記２つのコロニーは
ＭＭ２９４ｔＰＲＩＴ１０８４］）およびＭＭ ２９４
（ｐＲＩＴ １０８５１）との特徴を示した。ＭＭ２
９４ｒＰＲＩＴ］０８４］）の培養物はＡＴＣＣ３９０
５３として寄託している。 実施例１】 ・ ＡＴＣＣ３９０５３株の特徴の検討：ＣｓＣ１−
臭化エチジウム密度勾配遠心法によりＡＴＣＣ３９０５
３株からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素エンドヌ
クレアーゼ分析に付す。 この］、０Ｘ１０ ダルドアＣ１ａＩＤＮＡ挿入物ハ
。 第２図に示すようなｐＢＲ３２２ベクターＤＮＡと相対
したＢｓＬＥ］’）およびＸｂａｌ制限部位および配向
性を有する点に特徴がある。このＣ１ａＩ挿入物ＤＮＡ
はさらにＥｃ ｏＲＩ 、ＢａｍＨ■、ｌｌ１ｎｄｌＴ
、ＰｓＬ：［，５ａｃＪ−ＰｖｕＩ＋Ｘｈｏ：［、Ａｖ
ａ■−Ｂｇｌ］’Ｊ−Ｈｐａｌ：、Ｓｍａ ■、Ｈｉｎ
ｃ［−Ｐｖｕｌ’ＪまたはＳａｌ ■エンドヌクレアー
ゼについて制限部位を有しない点に特徴がある。 ＰＲＩＴＩ Ｏｓ ４１（７１）精製ＤＮＡをＣＩａＩ
Ｉンドヌクレアーセで消化し、その１．０ＸＩＱ ｄ
フラグメントをアクリルアミドゲルでの電気泳動および
電気溶出によって精製する。この精製ＤＮＡＱ５μｇを
実施例３に記載のニック翻訳により Ｐｌ。 で標識してプローブとして用いる。 ＡＴＣＣ３９０５０株の全ＤＮＡを各種エンドヌクレア
ーゼで消化し、その試別をアガロースゲルテの電気泳動
、変性、ついてニトロセルロースフィルターへの転移を
行なう。このフィルターに固定したビブリオＤＮＡに対
する変性Ｃ１ａｌプローブＤＮＡフラグメントの雑種形
成のためにストリンジェント条件下でインキュベートす
ると、このプローブは緩やかな雑種形成条件下にｅｌｔ
Ａプローブで検出されたものと同じビブリオＤＮＡバン
ドを現わした。この結果よりクローン化ＤＮＡはヒブリ
オ起原のものであることが判明した。 実施例］２ ｐＲＩＴｌ ０８１２の構築： 実施例９で得たｐＲＩＴ １０８１０のプラスミドＤＮ
Ａのアリクオツド２！５１ｚｇをＣＩａＩエンドヌクレ
アーゼ５５単位で３７℃にて３時間消化し、ついでＢｇ
ｌ■■エンドヌクレアーゼ２４単位で３７°Ｃにて２時
間消化する。この消化ＤＮＡを１係アガロースゲルで電
気泳動に付し−ｃｔｘＢ遺伝子配夕１１を含む０．７５
Ｘ１０ ダルトンｃｌａ Ｉ −Ｂｇｌ ］’１１）
ＮＡフラグメントをゲルから切り出し、電気溶出にてそ
のＤＮＡを回収する。 ｐＢＲ３２７（５ｏｂｅｒｏｎ Ｘ、ｅｔａｌ、Ｇｅｎ
ｅ ９゜２８７．１９８０）のプラスミドＤＮＡ２．
５ｆｌをＣ１ａＩ工ンドヌクレアーゼ１１単位で３７℃
にて２５時間、ついでＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ８
単位で３７℃にて２時間消化する。この消化ＤＮＡをフ
ェノールで２回、エーテルで３回抽出し、エタノール沈
降後、００１Ｍトロメタミン緩衝液（ｐＨ７，Ｑ）に溶
解させる。この精製Ｃ１ａＩ−Ｂｇｌ ｆ（ｃｔｘＢＤ
ＮＡフラグメントのアリクオツド０４μｇを前層結紮条
件下にｐＢＲ３２７（７） Ｃ１ａＩおよびＢａｍＨＩ
消化ＤＮＡ０．２μｇにて結綽する。 この結゛％ＤＮＡ混合物を大腸菌Ｋ１２株のＣａ（Ｊ２
処理コンピテント菌ＭＭ２９４の形質転換に用いる。形
質転換体はアンピシリン２００μｇ／ ｍｌ含有の固形
寒天培地上で選出する。 かく単離したコロニーの］つは、ｐＲＩＴｌ ０８１０
から精製したＣ１ａ Ｉ −Ｂｇｌ ’ｆ（フラグメン
トの挿入物を有するｐＢＲ３２７Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩ
フラグメントから主としてなるプラスミドｐ ＲＩ Ｔ
１０８］２を含むことを示した。このプラスミドは第３
（ン１に示す制限地図を有している点で特徴がある。 実施例１３ ＣＬＸＡおよびｃｔｘＢフラグメントの結合−ｐＲＩ
Ｔ １０８ ］ ４ （７）構築：実施例Ｊ１で得たｐ
ＲＩＴｌ ０８４１のプラスミドＩ） Ｎ Ａのアリク
オツド５１μｇをＣＩａＩエンドヌクレアーゼ２７単位
で３７℃にて１８時間消化する。この消化Ｔ）ＮＡを１
係アガロースゲルで電気泳動に付し、］、０Ｘ１０
ダルトンＣ１ａＩＤＮＡフラグメントを含むゲル切片を
得る。このゲル切片を電気泳動およびエタノール沈降に
付して該ＤＮＡを回収する。 実施例】２で得られたｐＲＩＴＩ Ｏ８１２の精製ＤＮ
Ａのアリクオツド２８６μｇをＣ１ａｌ工ンドヌクレア
ーゼＪ１単位で３７℃にて２時間消化し。 ついで実施例７に記載の牛腸アルカリホスファターゼ０
２５却位で処理する。かく処理されたＤＮＡをフェノー
ル抽出、ついでエタノール沈降を行なう。このＤＮＡの
アリクオツド０４μｇを実施例７に記載の語間条件下に
ＰＲＩＴＩ ０８４１がら単離した精製Ｃ１ａＩＤＮＡ
フラグメントｏ５μｇで結紮する。この結％ＤＮＡ混合
物の半分を、アンピシリン２００μｇ／ｍｌを含む固形
寒天培地上で選出した大腸菌に１２株のＣａＣ７２処理
コンピテント菌ＭＭ２９４の形質転換に用いる。１２コ
ロニーから前記バーげイムらの方法によりプラスミドＤ
ＮＡを調製し、ＰｓｔＩおよびＸｂａ Ｉエンドヌクレ
アーゼでＪｌｌｉｉｉ次制限する。得られたプラスミド
の１つは所望の配向でｐＲＩＴｌ ０．８１２上に１０
×１０ ダルトンＣ１ａＩフラグメントの挿入を示す制
限フラグメントパターンを力えており−このものの特徴
をさらに検討した。 このクローンからＣｓＣ／臭化エチジウム遠心法により
プラスミドＤＮＡを調製する。このクローンＭＭ２９４
（ｐＲＺＴｌ ｏｓ Ｉ ４）（ＩＪブラフ、ミド１ ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ分析により、第３図に
示す構造を有する。ＭＭ ２９４ （ｐＲＩＴ ＩＯ２
１４）の培養物はＡＴＣＣ３９０５２として寄託してい
る。 上記結合工程を第３図に示す。 絹換えプラスミドｐＲＩＴ１ｏ ８１４に対するＰＲＩ
Ｔ１０８４１からの１．ＯＸ］ＯダルトンＣ１ａＩＤＮ
Ａフラグメントの配向は、ＣｌａＩ部位にてｃｔｘ Ａ
配列とｃｔｘＢ配列とが並置する、すな′わち、コレラ
毒素の構造遺伝子を特定する完全シ又 ストロンを再形成すると推論される。 実施例１４ ＡＴＣＣ３９０５２株のｉｎ ｖｉｖｏ 活性：実施
例９で得られた全タンパク１０〜１３ｍ９／ｍｌを含む
ＡＴＣＣ３９０５２株の培養菌体の抽出試料１ ｔｇｔ
を１０匹の成人家兎の語間腸ループに注射する。このル
ープを１８時間後に検査し、各ループについて集積した
液を測った。 率≦０５は感応陰性、≧０５は陽性とし、第１、
表に示すように、ＡＴＣＣ３９０５２株からの抽
出物は１０匹中９匹で感応陽性を示した。 これに対し、ＭＭ２９４株（ＰＢＲ３２２）の抽出物で
は試験した５匹の動物ではいずれも有意な液体蓄積は認
められなかった。精製コレラ毒性１１００ｎ／ループの
注射では８匹の家兎中８匹に感応陽性が認められたが、
精製毒素Ｌｏｎｇ／ループでは８菌中３匹において陽性
であった。ＡＴＣＣ３９０５１株（ｐＲＩＴｌ ０８１
０）およびＡＴＣＣ３９０５３株（ｐＲＩＴｌ ０８４
１１の抽出物ではそれぞれ４匹および５匹の家兎で試験
していずれも陰性であった。この結果より、ＡＴＣＣ３
９０５２株（ＰＲＩＴＩ ０８１４）の抽出物はコレラ
毒素と同様に家兎腸内での液体蓄積を誘発し得る物質を
含むことが判明した。このｐＲＩＴｌ ０８１４上のｃ
ｔｘ Ａおよび（ｔｘＢシストロンは共通してＣＩａＩ
部位に正しく再結１がなされ、コレラホロトキシンの合
成を特定する機能的な構造遺伝子を保持している。これ
らの結果を第１表に示す。 第１表（成人家兎腸ルー／試験） 実施例１５ コレラ菌ＡＴＣＣ３９０５０からＣ１ＸＡおヨヒｃｔｘ
Ｂの両者を含むＰｓＬ Ｉ Ｄ Ｎ Ａフラグメント
のクローニング： ｃＬｘＡおよびｃｔｘ Ｂシストロンをコードするクロ
ーン化Ｃ１ａ Ｉ Ｄ Ｎ Ａフラグメントの完全性を
証明するために、両シストロンを包含するＤＮＡフラグ
メントをＡＴＣＣ３９０５０株がら直接クローン化する
。前記実施例１〜５に記載の方法により、ｅｌｔ Ａお
よびｅｌｔＢプローブを用いテｐｓｔ■エンドヌクレア
ーゼで消化したＡＴＣＣ３９０５０の全ＤＮＡを分析し
たところ、 ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢシストロンの両
方とも計算値の分子量５３ＸＩＯｄを有するＤＮＡフラ
グメントに存在した。 このフラグメントを実施例６の方法によりＰｓｔ■エン
ドヌクレアーゼ１００単位でＡＴＣＣ３９０５０ＤＮＡ
５０μｇを消化して富化し、実施例９に記載ノコレラ菌
ＤＮＡのＣ１ａＩ−ＨｉｎｄＴｃｔｘ Ｂプローブで最
も強い雑種形成感応を示すフラクションのアリクオツド
６μｌをＰｓｔＩで事前に消化したｐＢＲ３２２プラス
ミドＤＮＡＱ、４Ａｇに結鷲する。この結電ＤＮＡ混合
物を大腸菌に１２株ＭＭ２９４に形質転換し、テトラサ
イクリン１５μｇ ／ ｍｌを加えた固形寒天培地上で
形質転換コロニーを選別する。
、。 これらのコロニー（約１４０００１をワットマン（Ｗｈ
ａｔｍａｎ ）５４１ Ｆ５紙に転移させ、コノ’Ｆ５
紙を実施例８と同様に処理したのち、実施例１１に記載
の放射線活性（ＥｘＡフラグメントプローブにて雑種形
成させる。 １１コロニーがｃｏｘ Ａプローブに雑種形成反応陽性
でかつＰ１３Ｒ３２２ベクターのＰｓｔ工部位にて異種
のＤＮＡフラグメントの挿入で示されるテトラサイクリ
ン耐性−アンピシリン感応性であっ１こ。これらのクロ
ーンの１つ−ＭＭ２９４株［ＰＲＩＴ １０８２４）
からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素分析に付す。 このｐＲＩＴＩ Ｏ８２４出し、その１つはＰＲＩＴＩ
Ｏｓ 】ｏで事前にクローン化した１、ＯＸＩ Ｏｄ
ｃｔｘＢフラグメントに対応する大きさで、他の１つ
はｐＲＩＴ １０８４ ］で事前にクローン化した２、
４５ＸＩ Ｏｄ ｃｔｘＡフラグメントに対応する。さ
らに、これらｐＲＩＴ１０８２４からの１．ＯＸ］Ｏｄ
および２．４５ Ｘ１０ｄｃＩａＩフラグメントは、別
途ｐＲＩＴｌ ０８］０およびｐＲＩＴ］ ０８４１で
クローン化したフラグメントと同じ数および位置の制限
部位を有している。さらに、実施例１３に記載のｐＲＩ
ＴＩＱ８２４およびｐＲＩＴＩ Ｏ８１４の制限酵素消
化を比較すれば、酵素に対する制限フラグメントの数、
またはＣｔＸシストロンの中または囲りで切開する結合
において差異はない。ＰＲＩＴＩ ０８２４の制限地図
を第４図に示す。 実施例１６ ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢ’シストロンノＤ Ｎ Ａ配列
：ｃｔｘＡおよびｃｔｘ Ｂシストロンに対応するＤＮ
Ａのヌクレオチド配列はマキサムらの化学的変法（Ｍａ
ｘａｍ ＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５．４９９−５６０．１９
８０）により決定する。精製した制限フラグメントを変
換キネ−ジョン（’ｅｘｃｈａｎｇｅ ｋｉｎａｔ ｉ
ｏｎ ］またはリン酸化シテいない末端を直接キネ−ジ
ョンすることによりが末端を Ｐで標識する。別法とし
ては、３′末端をターミナルトランスフェラーゼおよび
α−Ｐ−コルデイセピンｔ Ｃ，Ｐ、 Ｔｕ ＆ Ｓ、
Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ。 Ｇｅｎｅ １０．］ ］７７−１８３．１９８０を用い
て標識する。さらに制限酵素エンドヌクレアーゼで開裂
して唯一の末端を標識したフラグメントを得、ポリアク
リルアミドゲルで精製する。ジメチル硫酸塩、ヒドラジ
ンおよび水酸化ナトリウムと反応させてそれぞれグアニ
ン、ピリミジンおよびアデニンにて開裂する。ピペリジ
ン開裂後、その生成物を薄い８％または２０％ポリアク
リルアミドゲルｆ Ｓａｎｇｅｒ ＆： Ｃｏｕｌｓｏ
ｎ、 ＦＥＢＳ ｌ ｅｔｃ、 ８７゜−＝ １０７．１９７８）にて分離する。そのゲルの自動レン
トゲン写真からの配列を読みとる。 配列決定の高い正確性を期すため（乙重複するＤＮＡ配
列を異なった標識の末端とできるだけ連続させたＤＮＡ
の両ストランドから読む。その組換プラスミド、標識用
に選ばれた制限部位および各決定において読んだ配列の
範囲を第５図に示す。 これらの方法で導かれたＤＮＡ配列は、第６図に示すよ
うに、１１４８ヌクレオチドからなり、そのうち１〜７
７７ヌクレオチドはサブユニットＡをコードする配列（
第７図に示す）であり、７７４〜１１４８ヌクレオチド
はサブユニットＢをコードする配列（第８図に示す）で
ある。不発明の配列では、大腸菌の熱不安定性エンテロ
トキシンのサブユニッ）ＡおよびＢタンパク質の公知の
アミノ酸配列（５ｐｉｃｅｒ Ｅ、 ＆Ｃｏ１１． 、
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、 Ｓ、 ７８． ５０．
ｌ ９８１を参照）に対応する伸長領域が存在し、
そのようなタンパク質配列の決定における誤りや省略を
常に除外しているということが重要である。また、コド
ンやアミノ酸の変化がコレラ菌の異なった菌株にはサブ
ユニットＡおよびＢにともにあり得るのであって、不発
明では上記配列に限定されず、上記配列の機能的に均等
なすべてのものを含むことに留意すべきであＺ、具体的
な例としては、本発明のＥｌ）ル・ビブリオ株のサブユ
ニットＢタンパク質配列と古典的ビブリオ菌株５６９Ｂ
（Ａ〒ＣＣ２５８７０１のサブユニツ）Ｂタンパク質の
ライによって決定された公知のアミノ酸配列（Ｌａｉ・
Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２５２． ７２４９．
１９７７１と比較すると、その熟成アミノ酸配列におい
て１Ｅｌ ２１４７．５４および７０の位置で５個のア
ミノ酸の違いがある。 さらに−サブユニットＡタンパク質をコードする配列は
ＣＩａＩ部位を通り、ｃｔｘ Ａ遺伝子フラグメントの
末端をマークし、いわゆるｃｔｘＢ遺伝子遺伝子フラグ
メントラレオチド７７７に延びそこで終っていることも
注量すべきである。 実施例１７ ワクチンの調製： 大腸菌ＡＴＣＣ３９０５１株を前記シンケース培地中で
定常状態になるまで生育させる。この培養物を遠心、濾
過し、その′Ｆｉ故を濃縮、透析、ついて水酸化アルミ
ニウムに吸着させる。水洗後、コレラ毒素のサブユニッ
トＢの溶液を０，１Ｍクエン酸ナトリウムで溶出し、リ
ン酸緩衝液でｐＨ７２に緩衝化し、抗毒素２００単位／
ｌｓｔを含む２ ｍｌバイアルに分け、凍結乾燥する。 新たに再水化したバイアルを経口投与用に用いる。ワク
チン化は第１回目ののち３０日間ブースター投与し、各
投与はボロ０耐中重炭酸ナトリウム２ｇを含む溶液を事
前に経口投与する方法で行なう。
Ｂプローブは、これらの条件下に、推定分子Ｍ２．４５
Ｘ １０ タルトンを有するＣ１ａｌ消化コレラ菌
ＡＴＣＣ３９０５０株ＤＮＡの単一バンドにのみ特異的
に雑種形成する。 これらの雑種形成条件でｅ１ｔＢプローブに対して相同
を示すコレラ菌ＤＮＡ配列はコレラ毒素のサブユニット
Ｂの構造遺伝子配列を特定するｃｔｘ１３シストロンの
全部または１部を発現する。 実施例６ コレラ菌全ＤＮＡからｃＬｘＡまたはｃｔｘ Ｂ遺伝子
配列のいずれかを含むＤＮＡフラグメントの増殖： 実施例１で得られた全ＤＮＡのアリクオツド６３μｇを
全反応液Ｎ４００μｌ中にてＣ１ａ Ｉエンドヌクレア
ーゼ５００単位を用いて３７℃で３時間消化する。この
消化ＤＮＡを１％（ｗ ／ Ｖ １アガロースゲルで電
気泳動に付す。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌＴエンド
ヌクレアーゼで消化したλファージのＤＮＡ試刺および
ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ 、：ｃンドヌクレアーゼ
で消化したｐＷＥＤＱ ２０ （Ｗ。 Ｄａｌｌａｓ ｅｔａｌ、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、 １３９． ８５０．１９７９）のＤＮＡ試刺を同
じゲルの別々のスロットを通して分子量マーカーとして
用いる。分子量２，４５Ｘ１０ ｄおよび１．０Ｘ１
０ ｄに対応する該Ｃ１ａｒエンドヌクレアーゼ消化
からのコレラ菌ＤＮＡフラグメントの位置を分子量マー
カーに対比して推定し、これら２点の各々の点およびそ
の上下において該ゲルから５個の１ ａｍ切片を切り出
す。各ゲル切片におけるＤＮＡは透析膜の閉じた鎖の中
で電気泳動により回収する。この液を６餞からとり、０
４５μミリポアフィルタ−を通してアガロースフラグメ
ントを除き、同量のイソプロパツールで沈降させること
によりＤＮＡを回収する。この沈降物を０．ＯＩＭ）ロ
メタミン緩衝液（ｐＩ−１７，Ｑ ）に溶かし、２倍量
のエタノールにて再沈降させる。得られた各ゲル切片か
らのＤＮＡは最後に０．０１Ｍ）ロメタミン−０，００
１ＭＥＤ Ｔ Ａ緩衝液（ｐＩ−１７，０１２０μｌに
溶解する。 各Ｄ Ｎ Ａ 溶液試料１μｌについて、カファトスら
の点雑種形成法（ｄｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ ｉｏ
ｎｍｅｌｌｏｄ ）（Ｋａｆａｔｏｓ Ｆ、 ｅｔａｌ
、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 ７． １５４
１．１９７９１により、上記実施例２〜５に記載の雑種
形成条件および放射線活性ｅｌｔＡおよびｅｌｔＢプロ
ーブＤＮＡを用イテ、ｃｔｘＡまたはｃｔｘＢ遺伝子配
列の含量を試験する。 ］、０Ｘ１０ ｄＤＮＡに対応する２個のＤＮＡ試料
は他の３つの試料に比べてより強（ｅｌＬＡプローブで
雑種形成することがわかる。 同様に−２，４５Ｘ１０ ｄＤＮＡに対応する２個の
ＤＮＡ試料はｅｌｔＢプローブでより強く雑種形成する
。 実施例７ ｃｔｘＢ遺伝子配列を富化したＤＮＡのクローニング： ＣｓＣｌ！密度勾配遠心法によって調製したｐＢＲ３２
２プラスミドＤＮＡのアリクオツド５μｇをＣ１ａ Ｉ
エンドヌクレアーゼ６６単位にて全反応液量１００μｌ
中３７℃で２時間消化する。プラスミドＤＮＡ３μｇを
含む上記消化試料６０μｍ１こグリシン緩衝液（０１Ｍ
グリシ７−１ｍＭＭｇＣ１２６Ｈ２０、Ｏ，ｌ ｍＭＺ
ｎ ＳＯ４−７Ｈ２０、ＰＨ１０，５１１００μｌおよ
び牛腸アルカリホスファターゼ０３単位を加える。この
混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、同量のフ
ェノールで２回抽出し、さらにエーテルで３回抽出し１
このち、エタノールでＤＮＡを沈降させる。ＰＢＲ３２
２ＤＮＡを０．０１Ｍ）ロメタミンＨＣ１Ｑ、□ Ｑ
Ｉ ＭＥ ＤＴＡ緩衝液（ＰＨ７，０１に溶解する。 ｅｌＬＢプローブに最も強い雑種形成信号を示す実施例
６て得・られた２つのＤＮＡフラクションＱＪ各アリク
オツドｌＯμｌをＣ１ａＩで消化したアルカリホスファ
ターゼ処理ｐＢＲ３２２ＤＮＡ□、４μｇと混合し、こ
の混液をトロメタミン緩衝液にて最終容Ｍ３０μ！・に
し、同量のフェノールで抽）、 出し、さらにエーテルで３回抽出したのち、エタノール
で沈降させ、得られたＤＮＡを０．０１．Ｍトロメラミ
ンＨＣｌ−０，００１ＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７，０）
２０μｌに溶解する。 このコレラ菌ＤＮＡフラグメントとＰＢＲ３２２ＤＮＡ
の混合物をＴ４−ＤＮＡリガーゼでインキュベートとし
て結紮する。このＤＮＡ混合物１０ ｆｉｔ １ｃＴ４
−ＤＮＡリガーゼカクテル１０μｌを加えて２０ｍＭト
ロメタミンｌｌＣｌ、ｌＱｍＭＭｇＣＡ’ ２ ・６Ｈ
２０−１０ｍ Ｍジチオスレイトール、１２ｍＭデオキ
シアデノシントリホスフェート、牛血清アルブミン５０
μｇ／ｍｌ！およびＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｌｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 Ｆｅｄ。 Ｒｅｐ、 Ｇｅｒｍａｎｙ Ｉ Ｑ、 ５単位を含む溶
液（ＰＩ−Ｉ ７．６）を得る。 このリガーゼ含有混液を１５℃で４時間インキュベート
して−Ｃ１ａＩ消化ｐＢＲ３２２ＤＮＡにコレラ菌ＤＮ
Ａフラグメントを結紮して絹換え分子を形成する。 この全語％ＤＮＡ混合物２０μノを用いて、コーエンら
の方法（Ｃｏｈｅｎ Ｓ、 ｅｔａｌ、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＩＪ、 Ｓ、６９．２１１０−
１９７２’にヨリ調製シタ大腸’［Ｋ １２株Ｍ Ｍ
２９４ （Ｄ ＣａＣ／２処理コンピテント菌（Ｂａｃ
ｋｍａｎ Ｋ、 ｅＬａｌ、 Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ−７３＋ ４
１７４、１９７６に記載）を形質転換する。この形質転
換培養物をアンピシリン２００μｇ／ａｎｔを含む固形
寒天培地に拡け、ＰＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを保持
する菌体を収集する。全形質転換培養物から約１０００
のアンピシリン耐性コロニーが得られる。 実施例８ ｃｔｘ Ｂ遺伝子配列について形質転換コロニーのスク
リーニング： 実施例７で得られたアンピシリン耐性形質転換コロニー
を、シャージンらの方法ｒＧｅｒｇｅｎ Ｊ。 ｅｔａｌ、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ７
． ２］ ］ ５、】９７９）によりｅｌｔ Ｂプロー
ブに対して雑種形成するＤＮＡ配列の存在についてスク
リーニングする。 固形寒天培地上に生えた形質転換体コロニーはアンピシ
リン含有培地の２重プレートの表面に一定配列で移行す
る。このプレートを３７℃でインキュベートする。６対
の一方のプレートの表面に滅菌沖紙（Ｗｈａｔｍａｎ
５４１ ）’をおき、そのｐ紙をはがして寒天表面か
ら生育菌をはがし取る。この方法により、固形寒天培地
に生えたコロニーのレプリカを濾紙上に得る。この濾紙
を３７℃で１５分子８Ｊ乾燥し、エタノール洗浄を行な
４つない以外は上記シャージンらの方法に供する。 かく処理した濾紙を実施例５と同じ条件にて放射線活性
ｅｌｔＢプローブＤＮＡで雑種形成させ、種々の時間に
わたってＸ線フィルムに曝らす。 １０コロニーは他のものより明らかに暗色が強く、それ
らを２重寒天プレートより回収する。これら雑種形成陽
性を示す１０コロニー中、４コロニーはテトラサイクリ
ン感応性で、異種のＤＮＡフラグメントによるｐＢＲ３
２２のベクターへのテトラサイクリン耐性遺伝子の挿入
不活を示す。 これら４つのコロニ〜からバーンボイムらの方法 （Ｂ
ｉ ｒｎｂｏｉｍ Ｉ土 ＆： Ｄｏｌｙ Ｊ、
、 Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、７，７５１３，１
９７．９）によりプラスミドＤＮＡを調製し、Ｃ１ａＩ
エンドヌクレアーゼによる制限分析をしたところ、各試
料において、ＰＢＲ３２２ヘクタ一１１分子ｆ１２．４
５ Ｘ ］ ０’ ｄヲ有するＤＮＡ挿入物を保持して
いた。かく単離しタコロニー（７Ｊ ］ ッＬｔＭＭ２
９４ （ｐＲＩＴｌ ０８１０）の特性を持ち、その培
養物をＡＴＣＣ３９０５】として寄−託している。 実施例９ ＡＴＣＣ３９０５１株の特性の検討： ＣｓＣ１−臭化エチジウム密度勾配遠心法によりＡＴＣ
Ｃ３９０５１株からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵
素エンドヌクレアーゼ分析に付す。 この２．４５Ｘ１０ ダルトン（Ｌ：ＩａＩＤＮＡ挿
入物は、第１図に示すようなｐＢＲ３２２ベクターＤＮ
Ａと相対した制限部位および配向性を有する点に特徴が
ある。 この菌株はさらにスベンナホルムらの酵素連結免疫吸着
アッセイ（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ Ａ、 ＆Ｉ−１ｏ
１ｍｌ−１ｏ１． 、 Ｃｕｒｒ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、 ］、 ｌ ９． ｌ ９７１３１において純コレ
ラ毒素頃対する高い抗体と反応するタンパク質を産生ず
る特徴を有し、それはＧＭＩガングリオシドレセプター
に対するコレラ毒素のサブユニツ）Ｂタンパクの結合に
基づいている。 ＡＴＣＣ３９０５１株の培養菌体をフランス製受圧器を
通し、３０００Ｘｇで４℃、３０分間遠心して澄明化し
て得られる抽出物はこのエライサアツセイ （Ｅｌｉｓ
ａ ａｓｓａｙ ） によりサブユニットＢタンパク
の強い陽性を示すことがわかった。 このクローン化挿入物の特徴を検討するために、さらｌ
’−ｐＲＩＴｌ ０８１０ Ｄ ＮＡをＣ１ａ Ｉおよ
び１１ｉｎｃ ＩＩ上エンドクレアーゼで順次消化し、
その０．２Ｘ１０ ｄフラグメントをアクリルアミド
ゲルでの電気泳動および該フラグメント含有ゲル切片の
電気溶出によって精製する。この精製フラグメント０５
μｇを実施例３に記載のニック翻訳により Ｐで標識
してプローブとして用いるために比活性１．９６Ｘ１０
Ｃｐｍｌｏ、５μｇとした。 ＡＴＣＣ３９０５０株の全ＤＮＡを各種エンドヌクレア
ーゼで消化し、その試料をアガロースゲルでの電気泳動
、変性、ついでニトロセルロースフィルターへの転移を
行なう。これらのフィルターを放射線活性変性Ｃ１ａ
Ｉ −Ｈｉｎｃ：［プローブＤＮＡを用い、雑種形成溶
液からホルムアミドを除いたＤＮＡ／ＤＮＡ雑種形成の
ストリンジェンυ条件で６５℃にて１８時間インキュベ
ートする。 Ｘ線フィルムを該雑種形成ニトロセルロースフィルター
に曝して実験したところ、より弱いストリンジェント条
件でｅｌｔＢプローブで行なった実施例５でのビブリオ
Ｃ１ａ Ｉ −Ｈｉｎｃ ■プローブと全く同じビブリ
オＤＮＡのバンドが現われた。こ）結果よりクローン化
ＤＮＡはコレラ菌起原のものであることが判明した。 実施例１０ ｃｔｘ Ａ遺伝子配列を富化したコレラ菌のＤＮＡのク
ローニング： 実施例７に記載の２つのＣＩａＩ消化ＤＮＡフラクショ
ン（ｅｌｔＡプローブに最も強い雑種形成信号を示す）
各１０μｇをＣ１ａＩ消化アルカリホスフアターゼ処理
ｐＢＲ３２２ＤＮＡ０４μｇと混合する。 このＤＮＡ混合物を実施例７と同様にしてフェノール抽
出、アルコール沈降、溶解およびＴ４ −Ｄ Ｎ Ａ
ＩＪガーゼによる結ｉを行ない、大腸菌に１２株のＣａ
Ｃｌ２処理菌体ＭＭ２９４の形質転換に用イル。この形
質転換培養物をアンピシリン含有培地で３７℃にてイン
キュベートして約４０００コロニー全部を回収する。 上記アンピシリン耐性コロニーを実施例８に記載の方法
および条件にてｅｌｔＡプローブに雑種形成するＤ Ｎ
Ａ配列の存否をスクリーニングする。 ２つのコロニーがｅｌＬＡプローブに陽性反応を示しテ
トラサイクリン感応性であった。これら２つのコロニー
から前記バーンボイムらの方法でプラスミドＤＮＡを調
製し、Ｃ１ａｌエンドヌクレアーゼ消化により、ｐＢＲ
３２２ベクターフラグメントに加えて］、ＯＸ］Ｏｄの
ＤＮＡフラグメントを放出する。上記２つのコロニーは
ＭＭ２９４ｔＰＲＩＴ１０８４］）およびＭＭ ２９４
（ｐＲＩＴ １０８５１）との特徴を示した。ＭＭ２
９４ｒＰＲＩＴ］０８４］）の培養物はＡＴＣＣ３９０
５３として寄託している。 実施例１】 ・ ＡＴＣＣ３９０５３株の特徴の検討：ＣｓＣ１−
臭化エチジウム密度勾配遠心法によりＡＴＣＣ３９０５
３株からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素エンドヌ
クレアーゼ分析に付す。 この］、０Ｘ１０ ダルドアＣ１ａＩＤＮＡ挿入物ハ
。 第２図に示すようなｐＢＲ３２２ベクターＤＮＡと相対
したＢｓＬＥ］’）およびＸｂａｌ制限部位および配向
性を有する点に特徴がある。このＣ１ａＩ挿入物ＤＮＡ
はさらにＥｃ ｏＲＩ 、ＢａｍＨ■、ｌｌ１ｎｄｌＴ
、ＰｓＬ：［，５ａｃＪ−ＰｖｕＩ＋Ｘｈｏ：［、Ａｖ
ａ■−Ｂｇｌ］’Ｊ−Ｈｐａｌ：、Ｓｍａ ■、Ｈｉｎ
ｃ［−Ｐｖｕｌ’ＪまたはＳａｌ ■エンドヌクレアー
ゼについて制限部位を有しない点に特徴がある。 ＰＲＩＴＩ Ｏｓ ４１（７１）精製ＤＮＡをＣＩａＩ
Ｉンドヌクレアーセで消化し、その１．０ＸＩＱ ｄ
フラグメントをアクリルアミドゲルでの電気泳動および
電気溶出によって精製する。この精製ＤＮＡＱ５μｇを
実施例３に記載のニック翻訳により Ｐｌ。 で標識してプローブとして用いる。 ＡＴＣＣ３９０５０株の全ＤＮＡを各種エンドヌクレア
ーゼで消化し、その試別をアガロースゲルテの電気泳動
、変性、ついてニトロセルロースフィルターへの転移を
行なう。このフィルターに固定したビブリオＤＮＡに対
する変性Ｃ１ａｌプローブＤＮＡフラグメントの雑種形
成のためにストリンジェント条件下でインキュベートす
ると、このプローブは緩やかな雑種形成条件下にｅｌｔ
Ａプローブで検出されたものと同じビブリオＤＮＡバン
ドを現わした。この結果よりクローン化ＤＮＡはヒブリ
オ起原のものであることが判明した。 実施例］２ ｐＲＩＴｌ ０８１２の構築： 実施例９で得たｐＲＩＴ １０８１０のプラスミドＤＮ
Ａのアリクオツド２！５１ｚｇをＣＩａＩエンドヌクレ
アーゼ５５単位で３７℃にて３時間消化し、ついでＢｇ
ｌ■■エンドヌクレアーゼ２４単位で３７°Ｃにて２時
間消化する。この消化ＤＮＡを１係アガロースゲルで電
気泳動に付し−ｃｔｘＢ遺伝子配夕１１を含む０．７５
Ｘ１０ ダルトンｃｌａ Ｉ −Ｂｇｌ ］’１１）
ＮＡフラグメントをゲルから切り出し、電気溶出にてそ
のＤＮＡを回収する。 ｐＢＲ３２７（５ｏｂｅｒｏｎ Ｘ、ｅｔａｌ、Ｇｅｎ
ｅ ９゜２８７．１９８０）のプラスミドＤＮＡ２．
５ｆｌをＣ１ａＩ工ンドヌクレアーゼ１１単位で３７℃
にて２５時間、ついでＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ８
単位で３７℃にて２時間消化する。この消化ＤＮＡをフ
ェノールで２回、エーテルで３回抽出し、エタノール沈
降後、００１Ｍトロメタミン緩衝液（ｐＨ７，Ｑ）に溶
解させる。この精製Ｃ１ａＩ−Ｂｇｌ ｆ（ｃｔｘＢＤ
ＮＡフラグメントのアリクオツド０４μｇを前層結紮条
件下にｐＢＲ３２７（７） Ｃ１ａＩおよびＢａｍＨＩ
消化ＤＮＡ０．２μｇにて結綽する。 この結゛％ＤＮＡ混合物を大腸菌Ｋ１２株のＣａ（Ｊ２
処理コンピテント菌ＭＭ２９４の形質転換に用いる。形
質転換体はアンピシリン２００μｇ／ ｍｌ含有の固形
寒天培地上で選出する。 かく単離したコロニーの］つは、ｐＲＩＴｌ ０８１０
から精製したＣ１ａ Ｉ −Ｂｇｌ ’ｆ（フラグメン
トの挿入物を有するｐＢＲ３２７Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩ
フラグメントから主としてなるプラスミドｐ ＲＩ Ｔ
１０８］２を含むことを示した。このプラスミドは第３
（ン１に示す制限地図を有している点で特徴がある。 実施例１３ ＣＬＸＡおよびｃｔｘＢフラグメントの結合−ｐＲＩ
Ｔ １０８ ］ ４ （７）構築：実施例Ｊ１で得たｐ
ＲＩＴｌ ０８４１のプラスミドＩ） Ｎ Ａのアリク
オツド５１μｇをＣＩａＩエンドヌクレアーゼ２７単位
で３７℃にて１８時間消化する。この消化Ｔ）ＮＡを１
係アガロースゲルで電気泳動に付し、］、０Ｘ１０
ダルトンＣ１ａＩＤＮＡフラグメントを含むゲル切片を
得る。このゲル切片を電気泳動およびエタノール沈降に
付して該ＤＮＡを回収する。 実施例】２で得られたｐＲＩＴＩ Ｏ８１２の精製ＤＮ
Ａのアリクオツド２８６μｇをＣ１ａｌ工ンドヌクレア
ーゼＪ１単位で３７℃にて２時間消化し。 ついで実施例７に記載の牛腸アルカリホスファターゼ０
２５却位で処理する。かく処理されたＤＮＡをフェノー
ル抽出、ついでエタノール沈降を行なう。このＤＮＡの
アリクオツド０４μｇを実施例７に記載の語間条件下に
ＰＲＩＴＩ ０８４１がら単離した精製Ｃ１ａＩＤＮＡ
フラグメントｏ５μｇで結紮する。この結％ＤＮＡ混合
物の半分を、アンピシリン２００μｇ／ｍｌを含む固形
寒天培地上で選出した大腸菌に１２株のＣａＣ７２処理
コンピテント菌ＭＭ２９４の形質転換に用いる。１２コ
ロニーから前記バーげイムらの方法によりプラスミドＤ
ＮＡを調製し、ＰｓｔＩおよびＸｂａ Ｉエンドヌクレ
アーゼでＪｌｌｉｉｉ次制限する。得られたプラスミド
の１つは所望の配向でｐＲＩＴｌ ０．８１２上に１０
×１０ ダルトンＣ１ａＩフラグメントの挿入を示す制
限フラグメントパターンを力えており−このものの特徴
をさらに検討した。 このクローンからＣｓＣ／臭化エチジウム遠心法により
プラスミドＤＮＡを調製する。このクローンＭＭ２９４
（ｐＲＺＴｌ ｏｓ Ｉ ４）（ＩＪブラフ、ミド１ ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ分析により、第３図に
示す構造を有する。ＭＭ ２９４ （ｐＲＩＴ ＩＯ２
１４）の培養物はＡＴＣＣ３９０５２として寄託してい
る。 上記結合工程を第３図に示す。 絹換えプラスミドｐＲＩＴ１ｏ ８１４に対するＰＲＩ
Ｔ１０８４１からの１．ＯＸ］ＯダルトンＣ１ａＩＤＮ
Ａフラグメントの配向は、ＣｌａＩ部位にてｃｔｘ Ａ
配列とｃｔｘＢ配列とが並置する、すな′わち、コレラ
毒素の構造遺伝子を特定する完全シ又 ストロンを再形成すると推論される。 実施例１４ ＡＴＣＣ３９０５２株のｉｎ ｖｉｖｏ 活性：実施
例９で得られた全タンパク１０〜１３ｍ９／ｍｌを含む
ＡＴＣＣ３９０５２株の培養菌体の抽出試料１ ｔｇｔ
を１０匹の成人家兎の語間腸ループに注射する。このル
ープを１８時間後に検査し、各ループについて集積した
液を測った。 率≦０５は感応陰性、≧０５は陽性とし、第１、
表に示すように、ＡＴＣＣ３９０５２株からの抽
出物は１０匹中９匹で感応陽性を示した。 これに対し、ＭＭ２９４株（ＰＢＲ３２２）の抽出物で
は試験した５匹の動物ではいずれも有意な液体蓄積は認
められなかった。精製コレラ毒性１１００ｎ／ループの
注射では８匹の家兎中８匹に感応陽性が認められたが、
精製毒素Ｌｏｎｇ／ループでは８菌中３匹において陽性
であった。ＡＴＣＣ３９０５１株（ｐＲＩＴｌ ０８１
０）およびＡＴＣＣ３９０５３株（ｐＲＩＴｌ ０８４
１１の抽出物ではそれぞれ４匹および５匹の家兎で試験
していずれも陰性であった。この結果より、ＡＴＣＣ３
９０５２株（ＰＲＩＴＩ ０８１４）の抽出物はコレラ
毒素と同様に家兎腸内での液体蓄積を誘発し得る物質を
含むことが判明した。このｐＲＩＴｌ ０８１４上のｃ
ｔｘ Ａおよび（ｔｘＢシストロンは共通してＣＩａＩ
部位に正しく再結１がなされ、コレラホロトキシンの合
成を特定する機能的な構造遺伝子を保持している。これ
らの結果を第１表に示す。 第１表（成人家兎腸ルー／試験） 実施例１５ コレラ菌ＡＴＣＣ３９０５０からＣ１ＸＡおヨヒｃｔｘ
Ｂの両者を含むＰｓＬ Ｉ Ｄ Ｎ Ａフラグメント
のクローニング： ｃＬｘＡおよびｃｔｘ Ｂシストロンをコードするクロ
ーン化Ｃ１ａ Ｉ Ｄ Ｎ Ａフラグメントの完全性を
証明するために、両シストロンを包含するＤＮＡフラグ
メントをＡＴＣＣ３９０５０株がら直接クローン化する
。前記実施例１〜５に記載の方法により、ｅｌｔ Ａお
よびｅｌｔＢプローブを用いテｐｓｔ■エンドヌクレア
ーゼで消化したＡＴＣＣ３９０５０の全ＤＮＡを分析し
たところ、 ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢシストロンの両
方とも計算値の分子量５３ＸＩＯｄを有するＤＮＡフラ
グメントに存在した。 このフラグメントを実施例６の方法によりＰｓｔ■エン
ドヌクレアーゼ１００単位でＡＴＣＣ３９０５０ＤＮＡ
５０μｇを消化して富化し、実施例９に記載ノコレラ菌
ＤＮＡのＣ１ａＩ−ＨｉｎｄＴｃｔｘ Ｂプローブで最
も強い雑種形成感応を示すフラクションのアリクオツド
６μｌをＰｓｔＩで事前に消化したｐＢＲ３２２プラス
ミドＤＮＡＱ、４Ａｇに結鷲する。この結電ＤＮＡ混合
物を大腸菌に１２株ＭＭ２９４に形質転換し、テトラサ
イクリン１５μｇ ／ ｍｌを加えた固形寒天培地上で
形質転換コロニーを選別する。
、。 これらのコロニー（約１４０００１をワットマン（Ｗｈ
ａｔｍａｎ ）５４１ Ｆ５紙に転移させ、コノ’Ｆ５
紙を実施例８と同様に処理したのち、実施例１１に記載
の放射線活性（ＥｘＡフラグメントプローブにて雑種形
成させる。 １１コロニーがｃｏｘ Ａプローブに雑種形成反応陽性
でかつＰ１３Ｒ３２２ベクターのＰｓｔ工部位にて異種
のＤＮＡフラグメントの挿入で示されるテトラサイクリ
ン耐性−アンピシリン感応性であっ１こ。これらのクロ
ーンの１つ−ＭＭ２９４株［ＰＲＩＴ １０８２４）
からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素分析に付す。 このｐＲＩＴＩ Ｏ８２４出し、その１つはＰＲＩＴＩ
Ｏｓ 】ｏで事前にクローン化した１、ＯＸＩ Ｏｄ
ｃｔｘＢフラグメントに対応する大きさで、他の１つ
はｐＲＩＴ １０８４ ］で事前にクローン化した２、
４５ＸＩ Ｏｄ ｃｔｘＡフラグメントに対応する。さ
らに、これらｐＲＩＴ１０８２４からの１．ＯＸ］Ｏｄ
および２．４５ Ｘ１０ｄｃＩａＩフラグメントは、別
途ｐＲＩＴｌ ０８］０およびｐＲＩＴ］ ０８４１で
クローン化したフラグメントと同じ数および位置の制限
部位を有している。さらに、実施例１３に記載のｐＲＩ
ＴＩＱ８２４およびｐＲＩＴＩ Ｏ８１４の制限酵素消
化を比較すれば、酵素に対する制限フラグメントの数、
またはＣｔＸシストロンの中または囲りで切開する結合
において差異はない。ＰＲＩＴＩ ０８２４の制限地図
を第４図に示す。 実施例１６ ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢ’シストロンノＤ Ｎ Ａ配列
：ｃｔｘＡおよびｃｔｘ Ｂシストロンに対応するＤＮ
Ａのヌクレオチド配列はマキサムらの化学的変法（Ｍａ
ｘａｍ ＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５．４９９−５６０．１９
８０）により決定する。精製した制限フラグメントを変
換キネ−ジョン（’ｅｘｃｈａｎｇｅ ｋｉｎａｔ ｉ
ｏｎ ］またはリン酸化シテいない末端を直接キネ−ジ
ョンすることによりが末端を Ｐで標識する。別法とし
ては、３′末端をターミナルトランスフェラーゼおよび
α−Ｐ−コルデイセピンｔ Ｃ，Ｐ、 Ｔｕ ＆ Ｓ、
Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ。 Ｇｅｎｅ １０．］ ］７７−１８３．１９８０を用い
て標識する。さらに制限酵素エンドヌクレアーゼで開裂
して唯一の末端を標識したフラグメントを得、ポリアク
リルアミドゲルで精製する。ジメチル硫酸塩、ヒドラジ
ンおよび水酸化ナトリウムと反応させてそれぞれグアニ
ン、ピリミジンおよびアデニンにて開裂する。ピペリジ
ン開裂後、その生成物を薄い８％または２０％ポリアク
リルアミドゲルｆ Ｓａｎｇｅｒ ＆： Ｃｏｕｌｓｏ
ｎ、 ＦＥＢＳ ｌ ｅｔｃ、 ８７゜−＝ １０７．１９７８）にて分離する。そのゲルの自動レン
トゲン写真からの配列を読みとる。 配列決定の高い正確性を期すため（乙重複するＤＮＡ配
列を異なった標識の末端とできるだけ連続させたＤＮＡ
の両ストランドから読む。その組換プラスミド、標識用
に選ばれた制限部位および各決定において読んだ配列の
範囲を第５図に示す。 これらの方法で導かれたＤＮＡ配列は、第６図に示すよ
うに、１１４８ヌクレオチドからなり、そのうち１〜７
７７ヌクレオチドはサブユニットＡをコードする配列（
第７図に示す）であり、７７４〜１１４８ヌクレオチド
はサブユニットＢをコードする配列（第８図に示す）で
ある。不発明の配列では、大腸菌の熱不安定性エンテロ
トキシンのサブユニッ）ＡおよびＢタンパク質の公知の
アミノ酸配列（５ｐｉｃｅｒ Ｅ、 ＆Ｃｏ１１． 、
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、 Ｓ、 ７８． ５０．
ｌ ９８１を参照）に対応する伸長領域が存在し、
そのようなタンパク質配列の決定における誤りや省略を
常に除外しているということが重要である。また、コド
ンやアミノ酸の変化がコレラ菌の異なった菌株にはサブ
ユニットＡおよびＢにともにあり得るのであって、不発
明では上記配列に限定されず、上記配列の機能的に均等
なすべてのものを含むことに留意すべきであＺ、具体的
な例としては、本発明のＥｌ）ル・ビブリオ株のサブユ
ニットＢタンパク質配列と古典的ビブリオ菌株５６９Ｂ
（Ａ〒ＣＣ２５８７０１のサブユニツ）Ｂタンパク質の
ライによって決定された公知のアミノ酸配列（Ｌａｉ・
Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２５２． ７２４９．
１９７７１と比較すると、その熟成アミノ酸配列におい
て１Ｅｌ ２１４７．５４および７０の位置で５個のア
ミノ酸の違いがある。 さらに−サブユニットＡタンパク質をコードする配列は
ＣＩａＩ部位を通り、ｃｔｘ Ａ遺伝子フラグメントの
末端をマークし、いわゆるｃｔｘＢ遺伝子遺伝子フラグ
メントラレオチド７７７に延びそこで終っていることも
注量すべきである。 実施例１７ ワクチンの調製： 大腸菌ＡＴＣＣ３９０５１株を前記シンケース培地中で
定常状態になるまで生育させる。この培養物を遠心、濾
過し、その′Ｆｉ故を濃縮、透析、ついて水酸化アルミ
ニウムに吸着させる。水洗後、コレラ毒素のサブユニッ
トＢの溶液を０，１Ｍクエン酸ナトリウムで溶出し、リ
ン酸緩衝液でｐＨ７２に緩衝化し、抗毒素２００単位／
ｌｓｔを含む２ ｍｌバイアルに分け、凍結乾燥する。 新たに再水化したバイアルを経口投与用に用いる。ワク
チン化は第１回目ののち３０日間ブースター投与し、各
投与はボロ０耐中重炭酸ナトリウム２ｇを含む溶液を事
前に経口投与する方法で行なう。
第１図は不発明の組換えプラスミドｐＲＩＴＩＱ８］０
の２．４５Ｘ１０ ダルトン挿入物の制限地図、第２
図は組換えプラスミドＰＲＩＴＩ Ｏ８４１の１．０Ｘ
１０ ダルトン挿入物の制限地図、第３図は組換えプ
ラスミドＰＲＩＴＩ ０８１２およびｐＲＩＴｌ ０８
］ ４の構築過程および制限地図、第４図は絹換えプ
ラスミドＰＲＩＴＩ Ｏｓ ２４の制限地図、第５図は
本発明のコレラ毒素のサブユニットＡおよびＢをコード
するＤＮＡ配列の制限部位とその決定において読まれた
配列の範囲、第６図はサブユニットＡおよびＢをコード
するＤＮＡ配列、第７図はサブユニツ）Ａをコードする
ＤＮＡ配列、第８図はサブユニツ）ＢをコードするＤＮ
Ａ配列をそれぞれ示す。 特許出願人 スミス・クライン−アール・アイ・ティ代
理人升埋士青山 葆Ｉｂｈ２名 第６図 １０ ２０ ＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡ ＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴ６０
７０ ＴＧＣＡＡＡＴＧＡＴ ＧＡＴＡＡＧＴＴＡＴｌｌｏ
１２０ ＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＴ１６０
１７０ ＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＴ２１０
２２０ ＧＡＣＧＧＧＡＴＴＴ ＧＴＴＡＧＧＣＡＣＧ２６０
２７０ ＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡＣＴＴＡＧＴＧ３１０
３２０ ＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴ ＡＴＧＴＴＡＴＡＧＣ３６０
３７０ ＴＧＴＡＴＴＡＧＧＧ ＧＣＡＴＡＣＡＧＴＣ４１０
４２０ ＴＡＧＧＴＧＧＧＡＴ ＴＣＣＡＴＡＣＴＣＣ４６０
４７０ ＧＧＧＧＴＧＣＴＴＧ ＡＴＧＡＡＣＡＡＴＴ５１０
５２０ ＴＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＴＡＧＡＴＡＴＴＧ５６０
５７０ ＧＴＴＴＣＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＡ６１０
６２０ ＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＴＴＧＴＧＧＧＡＡ６６０
６７０ ＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡ ＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣ７１０
７２０ ＣＴＡＡＡＧＴＴＡＡ ＡＡＧＡＣＡＡＡＴＡ７６０
７７０ ＣＡＴＡＡＴＡＧＡＡ ＴＴＡＡＧＧＡＴＧＡ８１０
Ｂ２０ ＴＴＴＡＣＡＧＴＴＴ ＴＡＣＴＡＴＣＴＴＣ８６０
８７０ ＴＡＣＴＧＡＴＴＴＧ ＴＧＴＧＣＡＧＡＡＴ９１０
９２０ ＡＴＡＡＧＡＴＡＴＴ ＴＴＣＧＴＡＴＡＣＡ９６０
９７０ ＡＴＣＡＴＴＡＣＴＴ ＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧｌｏｌ
ｏ １０２０ ＴＣＡＡＣＡＴＡＴＡ ＧＡＴＴＣＡＣＭＡ１０６０
１０７０ ＴＧＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴｌｌｌｏ
１１２０ ＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡ ＣＧＣＣＴＣＡＴＧＣ３０４
０５０ ＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴ ＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴ Ｃ
ＡＴＴＴＴＣＡＴＡ８０ ９０
１００ＡＴＣＧＧＧＣＡＧＡ ＴＴＣＴＡＧＡ
ＣＣＴ ＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡ１３０
１４０ １５０２３０ ２４
０ ２５０ＡＴＧＡＴＧＧＡＴＡ ＴＧ
ＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＴ２８０
２９０ ３００ＧＧＴＣＡＡＡＣＴ
Ａ ＴＡＴＴＧＴＣＴＧＧ ＴＣＡＴＴＣＴＡＣＴ
３３０ ３４０ ３５０ＣＡ
ＣＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＴＡ ＡＣＧＴＴ
ＡＡＴＧＡ３８０ ３９０、
４００ＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡ ＴＧＡＡＣＡＡＧＡ
Ａ ＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴ４３０ ４
４０ ４５０ＣＡＡＡＴＡＴＡＴＧ
ＧＡＴＧＧＴＡＴＣＧ ＡＧＴＴＣＡＴＴＴＴ４８０
４９０ ５００ＡＣＡＴＣ
ＧＴＡＡＴ ＡＧＧＧＧＣＴＡＣＡ ＧＡＧＡＴＡ
ＧＡＴＡ５３０ ５４０ ５
５０ＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＴＴＡＴ Ｇ
ＧＡＴＴＧＧＣＡＧ５８０ ’ ５９０
６００ＧＣＴＴＧＧＡＧＧＧ ＡＡＧＡ
ＧＣＣＧＴＧ ＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴ６３０
６４０ ６５０ＴＧＣＴＣＣＡＡＧ
Ａ ＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡ ＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧ
６８０ ６９０ ７００
ＴＡＧＧＴＧＴＡＡＡ ＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＡ
ＴＡＣＣＡＡＴ７３０ ７４０
７５０ＴＴＴＴＣＡＧＧＣ’ｒ ＡＴＣＡＡＴＣ
ＴＧＡ ＴＡＴＴＧＡＴＡＣＡ７８０
７９０ ．８００ＡＴＴＡＴＧＡＴＴＡ
ＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴ ＴＧＧ’Ｉ’ＧＴＴＴＴＴ
８３０ ８４０ ８５０ＡＧ
ＣＡＴＡＴＧＣＡ ＣＡＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＣＡＡ
ＡＡＴＡＴ８８０ ８９０
９００ＡＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＴＡＴＡＴ
ＡＣＧＣＴＡＡＡＴＧ９３０ ９４０
９５０ＧＡＡＴＣＴＣＴＡＧ ＣＴＧＧＡ
ＡＡＡＡＧ ＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴ９８０
９９０ １０００ＴＧＣＡＡＴＴＴＴＴ
ＣＡＡＧＴＡＧＡＡＧ ＴＡＣＣＡＡＧＴＡＧ１
０３０ １０４０ １０５０１１
３０ １１４０ １１５０ＧＡＴ
ＴＧＣＣＧＣＡ ＡＴＴＡＧＴＡＴＧＧ ＣＡＡＡ
ＴＴＡＡ第７図 １０ ２０ ＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡ ＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴ６０
７０ ＴＧＣＡＡＡＴＧＡＴ ＧＡＴＡＡＧＴＴＡＴｌｌｏ
１２０ ＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＴ１６０
１７０ ＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣＭＡＴＧＡＡＴＡＴ２１０
２２０ ＧＡＣＧＧＧＡＴＴＴ ＧＴＴＡＧＧＣＡＣＧ２６０
２７０ ＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡＣＴＴＡＧＴＧ３１０
３２０ ＴＡＴ’ｒＡＴＡＴＡＴ ＡＴＧＴＴＡＴＡＧＣ３６
０３７０ ＴＧＴＡＴＴＡＧＧＧ ＧＣＡＴＡＣＡＧＴＣ４１０
４２０ ＴＡＧＧＴＧＧＧＡＴ ＴＣＣＡＴＡＣＴＣＣ４６０４
７０ ＧＧＧＧＴＧＣＴＴＧ ＡＴＧＡＡＣＡＡＴＴ５１０
５２０ ＴＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＴＡＧＡＴＡＴＴＧ５６０
５７０ ＧＴＴＴＣＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＡ６１０
６２０ ＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＴＴＧＴＧＧＧＡＡ６６０
６７０ ＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡ ＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣ７１０
７２０ ＣＴＡＡＡＧＴＴＭ ＡＡＧＡＣＡＡＡＴＡ７６０
７７０ ＣＡＴＡＡＴＡＧＡＡ ＴＴＡＡＧＧＡＴＧ八３０
へ ４０ ５０ＧＴＴＴＴＴ
ＴＡＴＴ ＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴ ＣＡＴＴＴＴＣＡＴ
Ａ８０ ９０ １００ＡＴＣＧ
ＧＧＣＡＧＡ ＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴ ＣＣＴＧＡＴＧ
ＡＡＡ１３０ １４０ １５
０ＡＴＧＣＣＡＡＧＡＧ ＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡ ＧＴ
ＡＣＴＴＴＧＡＣ１８０１９０２００ ＣＡＡＣＣＴＴＴＡＴ ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＡ ＧＡＧ
ＧＡＡＣＴＣＡ２３０ ２４０
２５０ＡＴＧＡＴＧＧＡＴＡ ＴＧＴＴＴＣＣＡ
ＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＴ２８０ ２９０
３００ＧＧＴＣＡＡＡＣＴＡ ＴＡＴＴ
ＧＴＣＴＧＧ ＴＣＡＴＴＣＴＡＣＴ３３０
３４０ ３５０ＣＡＣＴＧＣＡＣＣＣ
ＡＡＣＡＴＧＴＴＴＡ ＡＣＧＴＴＡＡＴＧＡ３８０
３９０ ４００ＣＴＣＡＴＣ
ＣＡＧＡ ＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡ ＧＴＴＴＣＴＧＣＴ
Ｔ４３０ ４４０ ４５０Ｃ
ＡＡＡＴＡＴＡＴＧ ＧＡＴＧＧＴＡＴＣＧ ＡＧＴＴ
ＣＡＴＴＴＴ４８０ ４９０
５００ＡＣＡＴＣＧＴＡＡＴ ＡＧＧＧＧＣＴＡＣＡ
ＧＡＧＡＴＡＧＡＴＡ５３０ ５４０
５５０ＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧ
ＧＴＴＡ、Ｔ ＧＧＡＴＴＧＧＣＡＧ５８０
５９０ ６００ＧＣＴＴＧＧＡＧＧ
Ｇ ＡＡＧＡＧＣＣＧＴＧ ＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴ６
３０ ６４０ ６５０ＴＧＣ
ＴＣＣＡＡＧＡ ＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡ ＧＴＡＡＰＡ
ＣＴＴＧ
フロ８０ ６９０
７００ＴＡＧＧＴＧＴＡＡＡ ＡＴＴＣＣＴＴ
ＧＡＣＧＡＡＴＡＣＣＡＡＴ７３０ ７４
０ ７５０ＴＴＴＴＣＡＧＧＣＴ ＡＴ
ＣＡＡＴＣＴＧＡ ＴＡＴＴＧＡＴＡＣＡ８０ ＡＴＴＡＴＧＡ
の２．４５Ｘ１０ ダルトン挿入物の制限地図、第２
図は組換えプラスミドＰＲＩＴＩ Ｏ８４１の１．０Ｘ
１０ ダルトン挿入物の制限地図、第３図は組換えプ
ラスミドＰＲＩＴＩ ０８１２およびｐＲＩＴｌ ０８
］ ４の構築過程および制限地図、第４図は絹換えプ
ラスミドＰＲＩＴＩ Ｏｓ ２４の制限地図、第５図は
本発明のコレラ毒素のサブユニットＡおよびＢをコード
するＤＮＡ配列の制限部位とその決定において読まれた
配列の範囲、第６図はサブユニットＡおよびＢをコード
するＤＮＡ配列、第７図はサブユニツ）Ａをコードする
ＤＮＡ配列、第８図はサブユニツ）ＢをコードするＤＮ
Ａ配列をそれぞれ示す。 特許出願人 スミス・クライン−アール・アイ・ティ代
理人升埋士青山 葆Ｉｂｈ２名 第６図 １０ ２０ ＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡ ＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴ６０
７０ ＴＧＣＡＡＡＴＧＡＴ ＧＡＴＡＡＧＴＴＡＴｌｌｏ
１２０ ＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＴ１６０
１７０ ＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＴ２１０
２２０ ＧＡＣＧＧＧＡＴＴＴ ＧＴＴＡＧＧＣＡＣＧ２６０
２７０ ＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡＣＴＴＡＧＴＧ３１０
３２０ ＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴ ＡＴＧＴＴＡＴＡＧＣ３６０
３７０ ＴＧＴＡＴＴＡＧＧＧ ＧＣＡＴＡＣＡＧＴＣ４１０
４２０ ＴＡＧＧＴＧＧＧＡＴ ＴＣＣＡＴＡＣＴＣＣ４６０
４７０ ＧＧＧＧＴＧＣＴＴＧ ＡＴＧＡＡＣＡＡＴＴ５１０
５２０ ＴＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＴＡＧＡＴＡＴＴＧ５６０
５７０ ＧＴＴＴＣＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＡ６１０
６２０ ＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＴＴＧＴＧＧＧＡＡ６６０
６７０ ＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡ ＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣ７１０
７２０ ＣＴＡＡＡＧＴＴＡＡ ＡＡＧＡＣＡＡＡＴＡ７６０
７７０ ＣＡＴＡＡＴＡＧＡＡ ＴＴＡＡＧＧＡＴＧＡ８１０
Ｂ２０ ＴＴＴＡＣＡＧＴＴＴ ＴＡＣＴＡＴＣＴＴＣ８６０
８７０ ＴＡＣＴＧＡＴＴＴＧ ＴＧＴＧＣＡＧＡＡＴ９１０
９２０ ＡＴＡＡＧＡＴＡＴＴ ＴＴＣＧＴＡＴＡＣＡ９６０
９７０ ＡＴＣＡＴＴＡＣＴＴ ＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧｌｏｌ
ｏ １０２０ ＴＣＡＡＣＡＴＡＴＡ ＧＡＴＴＣＡＣＭＡ１０６０
１０７０ ＴＧＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴｌｌｌｏ
１１２０ ＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡ ＣＧＣＣＴＣＡＴＧＣ３０４
０５０ ＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴ ＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴ Ｃ
ＡＴＴＴＴＣＡＴＡ８０ ９０
１００ＡＴＣＧＧＧＣＡＧＡ ＴＴＣＴＡＧＡ
ＣＣＴ ＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡ１３０
１４０ １５０２３０ ２４
０ ２５０ＡＴＧＡＴＧＧＡＴＡ ＴＧ
ＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＴ２８０
２９０ ３００ＧＧＴＣＡＡＡＣＴ
Ａ ＴＡＴＴＧＴＣＴＧＧ ＴＣＡＴＴＣＴＡＣＴ
３３０ ３４０ ３５０ＣＡ
ＣＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＴＡ ＡＣＧＴＴ
ＡＡＴＧＡ３８０ ３９０、
４００ＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡ ＴＧＡＡＣＡＡＧＡ
Ａ ＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴ４３０ ４
４０ ４５０ＣＡＡＡＴＡＴＡＴＧ
ＧＡＴＧＧＴＡＴＣＧ ＡＧＴＴＣＡＴＴＴＴ４８０
４９０ ５００ＡＣＡＴＣ
ＧＴＡＡＴ ＡＧＧＧＧＣＴＡＣＡ ＧＡＧＡＴＡ
ＧＡＴＡ５３０ ５４０ ５
５０ＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＴＴＡＴ Ｇ
ＧＡＴＴＧＧＣＡＧ５８０ ’ ５９０
６００ＧＣＴＴＧＧＡＧＧＧ ＡＡＧＡ
ＧＣＣＧＴＧ ＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴ６３０
６４０ ６５０ＴＧＣＴＣＣＡＡＧ
Ａ ＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡ ＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧ
６８０ ６９０ ７００
ＴＡＧＧＴＧＴＡＡＡ ＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＡ
ＴＡＣＣＡＡＴ７３０ ７４０
７５０ＴＴＴＴＣＡＧＧＣ’ｒ ＡＴＣＡＡＴＣ
ＴＧＡ ＴＡＴＴＧＡＴＡＣＡ７８０
７９０ ．８００ＡＴＴＡＴＧＡＴＴＡ
ＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴ ＴＧＧ’Ｉ’ＧＴＴＴＴＴ
８３０ ８４０ ８５０ＡＧ
ＣＡＴＡＴＧＣＡ ＣＡＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＣＡＡ
ＡＡＴＡＴ８８０ ８９０
９００ＡＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＴＡＴＡＴ
ＡＣＧＣＴＡＡＡＴＧ９３０ ９４０
９５０ＧＡＡＴＣＴＣＴＡＧ ＣＴＧＧＡ
ＡＡＡＡＧ ＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴ９８０
９９０ １０００ＴＧＣＡＡＴＴＴＴＴ
ＣＡＡＧＴＡＧＡＡＧ ＴＡＣＣＡＡＧＴＡＧ１
０３０ １０４０ １０５０１１
３０ １１４０ １１５０ＧＡＴ
ＴＧＣＣＧＣＡ ＡＴＴＡＧＴＡＴＧＧ ＣＡＡＡ
ＴＴＡＡ第７図 １０ ２０ ＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡ ＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴ６０
７０ ＴＧＣＡＡＡＴＧＡＴ ＧＡＴＡＡＧＴＴＡＴｌｌｏ
１２０ ＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＴ１６０
１７０ ＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣＭＡＴＧＡＡＴＡＴ２１０
２２０ ＧＡＣＧＧＧＡＴＴＴ ＧＴＴＡＧＧＣＡＣＧ２６０
２７０ ＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡＣＴＴＡＧＴＧ３１０
３２０ ＴＡＴ’ｒＡＴＡＴＡＴ ＡＴＧＴＴＡＴＡＧＣ３６
０３７０ ＴＧＴＡＴＴＡＧＧＧ ＧＣＡＴＡＣＡＧＴＣ４１０
４２０ ＴＡＧＧＴＧＧＧＡＴ ＴＣＣＡＴＡＣＴＣＣ４６０４
７０ ＧＧＧＧＴＧＣＴＴＧ ＡＴＧＡＡＣＡＡＴＴ５１０
５２０ ＴＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＴＡＧＡＴＡＴＴＧ５６０
５７０ ＧＴＴＴＣＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＡ６１０
６２０ ＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＴＴＧＴＧＧＧＡＡ６６０
６７０ ＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡ ＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣ７１０
７２０ ＣＴＡＡＡＧＴＴＭ ＡＡＧＡＣＡＡＡＴＡ７６０
７７０ ＣＡＴＡＡＴＡＧＡＡ ＴＴＡＡＧＧＡＴＧ八３０
へ ４０ ５０ＧＴＴＴＴＴ
ＴＡＴＴ ＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴ ＣＡＴＴＴＴＣＡＴ
Ａ８０ ９０ １００ＡＴＣＧ
ＧＧＣＡＧＡ ＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴ ＣＣＴＧＡＴＧ
ＡＡＡ１３０ １４０ １５
０ＡＴＧＣＣＡＡＧＡＧ ＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡ ＧＴ
ＡＣＴＴＴＧＡＣ１８０１９０２００ ＣＡＡＣＣＴＴＴＡＴ ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＡ ＧＡＧ
ＧＡＡＣＴＣＡ２３０ ２４０
２５０ＡＴＧＡＴＧＧＡＴＡ ＴＧＴＴＴＣＣＡ
ＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＴ２８０ ２９０
３００ＧＧＴＣＡＡＡＣＴＡ ＴＡＴＴ
ＧＴＣＴＧＧ ＴＣＡＴＴＣＴＡＣＴ３３０
３４０ ３５０ＣＡＣＴＧＣＡＣＣＣ
ＡＡＣＡＴＧＴＴＴＡ ＡＣＧＴＴＡＡＴＧＡ３８０
３９０ ４００ＣＴＣＡＴＣ
ＣＡＧＡ ＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡ ＧＴＴＴＣＴＧＣＴ
Ｔ４３０ ４４０ ４５０Ｃ
ＡＡＡＴＡＴＡＴＧ ＧＡＴＧＧＴＡＴＣＧ ＡＧＴＴ
ＣＡＴＴＴＴ４８０ ４９０
５００ＡＣＡＴＣＧＴＡＡＴ ＡＧＧＧＧＣＴＡＣＡ
ＧＡＧＡＴＡＧＡＴＡ５３０ ５４０
５５０ＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧ
ＧＴＴＡ、Ｔ ＧＧＡＴＴＧＧＣＡＧ５８０
５９０ ６００ＧＣＴＴＧＧＡＧＧ
Ｇ ＡＡＧＡＧＣＣＧＴＧ ＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴ６
３０ ６４０ ６５０ＴＧＣ
ＴＣＣＡＡＧＡ ＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡ ＧＴＡＡＰＡ
ＣＴＴＧ
フロ８０ ６９０
７００ＴＡＧＧＴＧＴＡＡＡ ＡＴＴＣＣＴＴ
ＧＡＣＧＡＡＴＡＣＣＡＡＴ７３０ ７４
０ ７５０ＴＴＴＴＣＡＧＧＣＴ ＡＴ
ＣＡＡＴＣＴＧＡ ＴＡＴＴＧＡＴＡＣＡ８０ ＡＴＴＡＴＧＡ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）コレラ毒素のサブユニットＡおよびＢの全部また
は１部をコードする少なくとも１部分からなるＤＮＡ配
列。 （２）実質的に第６図に示すＤＮＡ配列、およびコレラ
毒素のサブユニットＡおよびＢの全部または１部をコー
ドする該Ｄ Ｎ Ａ配列のフラグメントおよび誘導体か
ら選ばれるＤＮＡ配列。 （３）前記第（１）項のＤＮＡ配列からなる糾換えＤＮ
Ａ分子。 （４）該コレラ毒素のサブユニッ）ＡおよびＢの全部ま
たは１部をコードするＤＮＡ配列が発現調節配列に連結
されている第（３）項の絹換えＤＮＡ分子。 （５）絹換えＤＮＡ分子ＰＲＩＴＩ Ｏ’８ ］ ４゜
（６）第４項の絹換えＤＮＡ分子の少な（とも１っで形
質転換し１こ宿主。 （７）大腸菌ＡＴＣＣ３９０５２株 （８）コレラ毒素のサブユニツ）Ａの全部または１部を
コードする少なくとも１部分からなる第（１）項のＤＮ
Ａ配列。 （９）実質的に第７図に示すＤＮＡ配列、およびコレラ
毒素のサブユニットＡの全部または１部をコードするｉ
Ｄ Ｎ Ａ配列のフラグメントおよび誘導体から選ば
れる第（２）項のＤＮＡ配列のフラグメント。 （１０１第８項のＤＮＡ配列からなる絹換えＤＮＡ分子
・ ０１）該コレラ毒素のサブユニツ）Ａの全部または１部
をコードするＤＮＡ配列が発現調節配列に連結されてい
る第（，１０１項の紹換えＤＮＡ分子。 （１２）絹換えＤＮＡ分子ｐＲＩＴ］Ｑ３゜（］３）第
（１１）項の絹換えＤＮＡ分子の少な（とも１つで形質
転換した宿主。 （１４）大腸菌ＡＴＣＣ３９０５３株 Ｃ】５）コレラ毒素のサブユニットＢの全部または１部
をコードする少なくとも１部分からなる第（１）項のＤ
ＮＡ配列。 （１６）実質的に第８図に示すＴｆｆＮＡ配列、および
コレラ毒素のザブユニツ）Ｂの全部または１部をコード
する該ＤＮＡ配列のフラグメントおよび誘専体から選は
れる第（２）項のＤＮＡ配列のフラグメント。 （１７）第（］５）項のＤＮＡ配列からなる絹換えＤＮ
Ａ分子。 ＋］８）ｉコレラ毒素のサブユニットＢの全部または１
部をコードするＤＮＡ配列が発現調節配列に連結されて
いる第（１７）項の絹換えＤＮＡ分子。 （１９）組換えＤＮＡ分子ｐＲＩＴ １０８１０−（２
０）第４１３＋］：１ｉｉの絹換えＤ Ｎ Ａ分子の少
なくとも１って形質転換した宿主。 （２１）大腸菌ＡＴＣＣ３９０５１株。 （２２）第（１３）項による宿主によって産生されるコ
レラ毒素のサブユニットＡの゛トキソイドの有効量） を含むヒトにおけるコレラ菌感染防御機能増進用組成物
。 （２３）該コレラ毒素のサブユニットＡが大腸菌９ＴＣ
Ｃ３９０５３株により産生されたものである第（２２）
項の組成物。 （２４）第（２０）項による宿主によって産生きれるコ
レラ毒素のサブユニツ）Ｂのトキソイドの有効量を含む
ヒトにおけるコレラ菌感染防御機能増進用組成物。 （２５）第（２０）項による宿主によって産生されるコ
レラ毒素のサブユニツ）Ｂの有効量を含むヒトにおける
コレラ菌感染防御機能増進用組成物。 （２６）該コレラ毒素のサブユニットＩ３が犬Ｆｌｉ＋
ＭＡＴＣＣ３９０５１株により産生されたものである第
（２４）または（２５）項の組成物。 （２７）第（６）項による宿主によって産生されるコレ
ラ毒素のサブユニットＡおよびＢのトキソイドの有効量
を含むヒトにおけるコレラ菌感染防御機能増進用組成ｖ
ｆｉ。 ３２８）該コレラ毒素もサブーー・ン）ＡおよびＢが大
腸菌ＡＴＣ０３９０５２株によって産生されたものであ
る第（２７１項の組成物。 （２９）コレラ毒素のサブユニットＡを産生ずるコレラ
菌株のＤＮＡをＣ１ａｌエンドヌクレアーゼで消化し、
ｅｌｔＡプローブに対して特異的な雑種形成能を有する
フラグメントを単離し、該フラグメントをＣ１ａｌ工ン
ドヌクレアーゼ制限部位を有し事前にＣ１ａＩにて消化
したベクターと混合し、該フラグメントを挿入すること
を特徴とする第（１０）、（１１）または（１２）項の
絹換えＤＮＡ分子を調製する方法。 （３０）第（３）、（４）または（５）項の絹換えＤＮ
Ａ分子を調製し一該絹換えＤＮＡ分子を用いて適当な宿
主を形質転換させ、該形質転換宿主を培養し、コレラ毒
素のサブユニットＡを採取することを特徴とするコレラ
毒素のサブユニツ）Ａの製造方法。 （３］）ｉｌｌなベクター０）ｃｌａＩエンドヌクレア
ーゼ制限部位に該絹換えＤＮＡ分子を挿入する第（３０
）項の方法、 （３２）該ベクターがプラスミドｐＢＲ３２２である第
（３１１項の方法。 （３３）該宿主が大腸菌に１２株または一無毒性コレラ
菌株である第（３０）項の方法。 （３４）コレラ毒素のサブユニツ）Ｂを産生ずるコレラ
菌株のＤＮＡをＣＩａＩエンドヌクレアーゼで消化し、
ｅｌＬＢプローブに特異的な雑種形成能を有するフラグ
メントを単離し、該フラグメントをＣ１ａ Ｉエンドヌ
クレアーゼ制限部位を有し事前にＣ１ａｌにて消化した
ベクターと混合し、該フラグメントを挿入することを特
徴とする第（１７Ｌ （１８１または（１９）項の絹換
えＤＮＡ分子を調製する方法。 （３５）第（１７）、（１８）または（１９）項の絹換
えＤＮＡ分子を調製し、該組換えＤＮＡ分子を用いて適
当な宿主を形質転換させ、該形質転換宿主を培養し、コ
レラ毒素のサブユニツ）Ｂを採取することを特徴とする
コレラ毒素のサブユニットＡの製造方法。 （３６）適当なベクターのＣ１ａｌ工ンドヌクレアーゼ
制限部位に該組換えＤＮＡ分子を挿入する第（３５）項
の方法。 ＋３７）ｉベクターがプラスミドｐ−ＢＲ３２２である
第（３５）項の方法。 （３８）該宿主が大腸菌に１２株または非毒性コレラ菌
株である第（３５）項の方法。 Ｃ３９）コレラ毒素のサブユニットＢをコードするＤ
Ｎ Ａ配列をＣ１ａＩエンドヌクレアーゼおよびサブユ
ニットＢをコードする配列を切断しないエンドヌクＬ’
７− セにて順次消化し、得られたフラグメントを単
離し、該フラグメントを、Ｃｏａｌエンドヌクレアーゼ
および第２の適当なエンドヌクレアーゼにて順次消化処
理した適当なベクターに挿入して組換えＤＮＡ分子を得
、ついでこれをＣ１ａＩエンドヌクレアーゼで消化する
がマタｌｒ Ｃｌ ａ Ｉエンドヌクレアーゼおよび第
２のエンドヌクレアーゼで順次消化し、さらに、コレラ
毒素のサブユニットを産生ずるコレラ菌株からＣ］ａＩ
エンドヌクレアーセ′消化かまたはＣ１ａＴエンドヌク
レアーセおよび第２のエンドヌクレアーゼでｊｌい次消
化して？↓）られるフラグメンと絹換えることを特徴と
する第（３）、（４）または（５）項の紐換えＤＮＡ分
子を調製する方法。 （４０）第（３）、（４）または（５）項の絹換えＤＮ
Ａ分子を調製し、該組換えＤＮＡ分子を用いて適当な宿
主を形質転換させ、該形質転換宿主を培養し、コレラ毒
素のサブユニットＡおよびＢを採取することを特徴とす
るコレラ毒素のサブユニッ）ＡおよびＢの製造方法。 （４］）サフユニッ）Ａの構造遺伝子配列を含むフラグ
メントを適当なベクターのＣ１ａＩ工ンドヌクレアーゼ
制限部位に挿入することからなる第（４ｏ）項の方法。 （４２）該ヘクターカプラスミトｐＲＩＴ１０８１２で
ある第（４１）項の方法。 （４３）該宿主が大腸菌Ｋ１２株または無毒性コレラ菌
株である第（４０）項の方法。 （４４）一群のＤＮＡ配列をスクリーニングして、第（
８）または（９）項のＤＮＡ配列に雑種形成するものを
決定することを特徴とする一群のＩ）ＮＡＡ配列らコレ
ラ毒素のサブユニットＡをコードするＤＮＡ配列を検索
する方法。 （４５）一群のＤＮＡ配列をスクリーニングして、第（
１５）または（Ｊ６）項のＤＮＡ配列に雑種形成するＤ
ＮＡ配列を決定することを特徴とする一群のＤＮＡ配列
からコレラ毒素のサブユニットＢをコードするＤＮＡ配
列を検索する方法。 （４６）一群のＤＮＡ配列をスクリーニングして、第（
１）または（２）項のＤＮＡ配列に雑種形成するＤＮＡ
配列を決定することを特徴とする一群のＤＮＡ配列から
コレラ毒素のサブユニッ）ＡおよびＢをコードするＤＮ
Ａ配列を検索する方法。
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