KR102305413B1

KR102305413B1 - 고활성 변이형 효소를 고발현시킨 코리네형 세균 형질 전환체 및 이를 이용하는 4-히드록시 벤조산 또는 그 염의 제조 방법

Info

Publication number: KR102305413B1
Application number: KR1020167032000A
Authority: KR
Inventors: 히데아키 유가와; 마사유키 이누이; 가즈미 히라가; 마사코 스다; 료마 하시모토
Original assignee: 그린 케미칼즈 가부시키가이샤
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2021-09-27
Also published as: KR20170002451A; EP3147360A4; US20170073658A1; JPWO2015174446A1; WO2015174446A1; US10221409B2; US10738296B2; EP3147360A1; CN106459958B; CN106459958A; EP3147360B1; JP6327654B2; US20190136222A1

Abstract

하기의 (A) 또는 (B)의 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제는, 실용상 충분히 효율적으로 4-히드록시벤조산 또는 그 염을 생산할 수 있다:
(A) 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제(ubiC)에 있어서 아미노산 번호 80의 발린이, 1개 또는 복수 개의 다른 아미노산으로 치환된 변이 코리스메이트-피루베이트 라아제,
(B) 그 외 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서, 상기 발린과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산이 1개 또는 복수 개의 다른 아미노산으로 치환된 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제.

Description

고활성 변이형 효소를 고발현시킨 코리네형 세균 형질 전환체 및 이를 이용하는 4-히드록시 벤조산 또는 그 염의 제조 방법{CORYNEFORM BACTERIUM TRANSFORMANT HAVING HIGH LEVEL EXPRESSION OF HIGHLY ACTIVE VARIANT ENZYME AND PRODUCTION METHOD FOR 4-HYDROXYBENZOIC ACID USING SAME OR FOR SALT THEREOF}

본 발명은, 4-히드록시 벤조산 또는 그 염(이하, 「4-HBA」로 약칭할 수 있다)의 생산성을 향상시키기 위해 개질된 효소 변이체, 상기 효소 변이체를 고발현함으로써 4-HBA 생산성이 향산된 코리네형 세균 형질 전환체, 및 상기 형질 전환체를 이용한 효율적인 4-HBA의 제조 방법을 제공한다.

지구 온난화나 화석 자원의 고갈 문제를 배경으로, 재생 가능한 바이오매스 자원을 원료로 한 화학 제품의 제조는, 저탄소사회의 실현을 위한 새로운 산업으로서 주목받고 있다.

4-HBA는 액정 폴리머 원료 및 항균제인 파라벤 합성원료 등으로써 이용되고 있는 유용한 화학 물질이다.

현재, 4-HBA는 원유를 원료로 하여 화학적으로 생산되고 있다. 화학적인 4-HBA 제조 방법은, 예를 들면 페놀, 수산화칼륨 및 이산화탄소를 이용하여 고압 조건하에서 반응시키는 방법 등이 있다.

이러한 방법에서는, 원료가 되는 페놀이 화석 원료에 의존하고 있을 뿐 아니라, 반응 프로세스 중에서 강 알칼리나 이산화탄소, 고온 고압 조건을 필요로 하며, 제조 과정에서 발생되는 유해한 폐기액이 생기는 등, 환경에 큰 부하를 주고 있다.

그렇기 때문에, 재생 가능 자원을 원료로서, 에너지 절약 및 유해한 폐기액을 삭감한 환경 조화형 바이오법에 의한 4-HBA 제조 기술의 확립이 강하게 요구되고 있다.

그러나, 재생 가능 자원을 원료로 한 바이오법에 의한 4-HBA의 생산은, 젖산이나 에탄올의 생산에 비해, 원료가 되는 당으로부터의 대사 반응 단계 수가 매우 많기 때문에 생산성이 낮다. 또한, 생산물인 4-HBA에 의한 균의 증식 저해나, 세포 독성 등의 난점이 있다. 이 때문에, 공업적 생산은 실현되지 않는다.

4-HBA는, 방향족 아미노산 등의 합성에 관한 시킴산 경로의 중간체인 코리스미산으로부터 ubiC에 의해 코딩되는 코리스메이트-피루베이트 리아제에 의해 합성된다는 것이 대장균을 이용하여 밝혀지고 있다(비특허문헌 1, 특허문헌 1, 2).

지금까지, 대장균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자(ubiC)를 타종 미생물인 Klebsiella pneumoniae를 숙주로서 도입하여, 4-HBA를 생성하고자 하는 시도가 보고되어 있다(비특허문헌 3). 또한 시킴산 경로를 증강시킨 대장균에서의 4-HBA의 발효 생산이 보고되어 있다(비특허문헌 4). 4-HBA에 의한 증식 저해나 독성 회피를 시험해 보기 위해, 4-HBA 내성주의 선발이나, 이온 교환 수지 첨가 배양이 보고되어 있지만, 4-HBA의 생산성은 실용적으로 충분하지 않다(비특허문헌 2).

또한, 대장균 이외의 ubiC에 대해서는, Rhodobacter sphaeroides 유래의 것이 보고되어 있지만, 대장균을 숙주로 하여 해당 유전자를 고발현시킨 경우도, 또는 Rhodobacter sphaeroides를 숙주로 하여 해당 유전자를 고발현시킨 경우도, 어느 하나의 형질 전환체를 이용하더라도 4-HBA의 생성은 저농도이며, 실용상 충분하지 않다(특허문헌 3). 또한, 대장균의 ubiC 유전자 결손주를 해당 유전자가 서로 보완 가능하다라고 기재하고 있지만, 효소 활성치나 효소 여러 성질에 관한 기술 및 타생물 유래의 효소와의 비교에 관한 구체적인 기술은 어디에도 없다.

대장균 유래의 UbiC 효소는, 효소학적인 분석이 상세하게 이루어지고 있으며, 생성물인 4-HBA에 의해 강력하게 저해(생성물 저해)되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 2,5). 따라서, 4-HBA 고생산을 위해서는 고활성인 UbiC의 취득, 4-HBA에 의한 생성물 저해에 내성인 UbiC의 취득이 4-HBA 고생산주 구축에 있어 매우 중요하다.

특허문헌 1: 미국특허 6030819 특허문헌 2: 미국특허 6114157 특허문헌 3: 일본특허공개 2012-183048

비특허문헌 1: J. Bacteriol., 174, 5309-5316 (1992) 비특허문헌 2: Microbiology, 140, 897-904 (1994) 비특허문헌 3: Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 985-988 (1995) 비특허문헌 4: Biotechnol. Bioeng., 76, 376-390(2001) 비특허문헌 5: Biochimica et Biophysica Acta, 1594, 160-167 (2002)

본 발명은 실용적으로 충분히 높은 4-HBA 생성 활성을 가진 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제 효소, 이 효소를 고발현함으로써 효율적으로 4-HBA를 생산할 수 있는 형질 전환체 및 이 형질 전환체를 이용하여 효율적으로 4-HBA를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들이 연구를 거듭한 결과,

(A) 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제(ubiC)의 아미노산 번호 80의 발린, 또는

(B) 그 외 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서, 상기 발린과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 것과 같은 변이를 상기 ubiC 유전자에 도입함으로써 글루코오스나 코리스미산 등으로부터 4-HBA를 생산하는 능력이 향상된 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제가 얻어지는 것을 발견했다.

본 발명은 상기 지견에 따라 완성된 것으로, 이하의 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제, 형질 전환체, 및 4-HBA의 제조 방법을 제공한다.

1. 하기의 (A) 또는 (B)의 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제:

(A) 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제(ubiC)에 있어서 아미노산 번호 80의 발린이 1개 또는 복수 개의 다른 아미노산으로 치환된 변이 코리스메이트-피루베이트 라아제

(B)그 외 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서, 상기 발린과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산이 1개 또는 복수 개의 다른 아미노산으로 치환된 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제.

2. 상기 1에 있어서, 상기 (B)의 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제가,

(ⅰ) 프로비덴시아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서, 아미노산 번호 80의 발린(V),

(ⅱ) 에세리키아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서, 아미노산 번호 79의 이소류신(I), 또는

(ⅲ) 크로노박터속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서 아미노산 번호 79의 이소류신(I)이 1개 또는 복수 개의 다른 아미노산으로 치환된 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제.

3. 상기 1에 있어서, 하기의 (a), (b) 또는 (c)인 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제:

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린,

서열번호 2의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린,

서열번호 3의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 러스티기아니(Providencia rustigianii) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린,

서열번호 4의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스니비아(Providencia sneebia) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린,

서열번호 5의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린,

서열번호 6의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린, 혹은

서열번호 7의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 버호도그라나리에아(Providencia burhodogranariea) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린,

서열번호 8의 아미노산 서열로부터 이루어진 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 79의 이소류신, 또는

서열번호 9의 아미노산 서열로부터 이루어진 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 79의 이소류신을 1개 또는 복수 개의 다른 아미노산으로 치환한 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제,

(b) 치환에 의해 생성된 상기 아미노산 부분을 보유하면서, 서열번호 1~9 중 어느 하나의 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 이루어지고, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제,

(c) 서열번호 1~9 중 어느 하나의 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 이루어지고, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 있어서, 서열번호 1~7 중 어느 하나의 서열의 아미노산 번호 80의 발린, 또는 서열번호 8 혹은 9의 아미노산 번호 79의 이소류신과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산을 1개 또는 복수 개의 다른 아미노산으로 치환한 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제.

4. 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 치환에 의해 생성된 아미노산이 1개이며, 상기 아미노산이 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 및 아스파라긴인 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제.

5. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된, 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제를 코딩하는 DNA를 숙주의 코리네형 세균에 도입한 형질 전환체.

6. 상기 5에 있어서, 숙주의 코리네형 세균이 코리네박테리움 속 세균인 형질 전환체.

7. 상기 6에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰속 세균이, 코리네박테리움 R(FERM BP-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869인 형질 전환체.

8. 하기의 (C) 또는 (D)의 변이 DNA를 숙주의 코리네형 세균에 도입한 형질 전환체:

(C) 서열번호 10의 염기서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제(ubiC) 유전자에 있어서, 염기번호 240~242의 gtc를, 그것이 코딩하는 아미노산과는 다른 1개 또는 복수 개의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA,

(D) 그 외 코리스메이트-피루베이트 리아제를 코딩하는 유전자에 있어서, 상기 gtc에 대응하는 위치의 DNA 부분을, 그것이 코딩하는 아미노산과는 다른 1개 또는 복수 개의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA.

9. 상기 8에 있어서, 상기 (D)의 변이 DNA가

(ⅳ) 프로비덴시아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 240~242의 gtc,

(ⅴ) 에세리키아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 237~239의 atc, 또는

(ⅵ) 크로노박터속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 237~239의 atc를,

그것이 코딩하는 아미노산과는 다른 1개 또는 복수 개의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA인 형질 전환체.

10. 상기 8에 있어서, 하기의 (d), (e), 또는 (f)인 형질 전환체:

(d) 서열번호 10의 염기서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자,

서열번호 11의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스투아르티 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자,

서열번호 12의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 러스티기아니 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자,

서열번호 13의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스니비아 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자,

서열번호 14의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 레트게리 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자,

서열번호 15의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 알칼리파시엔스 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자, 혹은

서열번호 16의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 버호도그라나리에아 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기번호 240~242의 gtc를, 발린 이외의 1개 또는 복수 개의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA,

서열번호 17의 염기서열로부터 이루어진 에세리키아 콜라이 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 237~239의 atc를, 이소류신 이외의 1개 또는 복수 개의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA, 또는

서열번호 18의 염기서열로부터 이루어진 크로노박터 사카자키 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 237~239의 atc를, 이소류신 이외의 1개 또는 복수 개의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA,

(e) 치환에 의해 생성된 DNA 부분을 보유하면서, 서열번호 10~18 중 어느 하나의 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열로부터 이루어지고, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이 DNA, 또는

(f) 서열번호 10~18 중 어느 하나의 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열로부터 이루어지고, 또한, 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 있어서, 서열번호 10~16 중 어느 하나의 서열의 염기 번호 240~242의 gtc를, 발린 이외의 1개 또는 복수 개의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA, 또는 서열번호 17 혹은 18의 염기 번호 240~242의 gtc에 대응하는 DNA 부분을, 이소류신 이외의 1개 또는 복수 개의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA,

(단, 서열번호 10~16 중 어느 하나의 서열의 염기 번호 240~242의 gtc에 대응하는 DNA 부분은, 서열번호 10~16의 어느 하나의 서열의 염기 번호로부터 이루어진 DNA가 코딩하는 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산을 코딩하는 DNA을 가리키며, 서열번호 17 혹은 18의 염기번호 237~239의 gtc에 대응하는 DNA 부분은 서열번호 17 혹은 18의 염기서열로부터 이루어진 DNA가 코딩하는 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 79번 이소류신과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산을 코딩하는 DNA를 가리킨다)

11. 상기 8 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 치환에 의해 생성되는 DNA가 gca, tgc, acc, tcc 또는 aac인 형질 전환체.

12. 상기 8 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 숙주의 코리네형 세균이 코리네박테리움 속 세균인 형질 전환체.

13. 상기 12에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 속 세균이, 코리네박테리움 R(FERM BP-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869인 형질 전환체.

14. 코리네박테리움 글루타미쿰 HBA-47 (수탁번호 : NITE BP-01849) 형질 전환체.

15. 상기 5 내지 14 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체를, 당류, 형질 전환체가 대사에 의해 코리스미산을 생성할 수 있는 화합물, 및 코리스미산, 및 그들의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 원료 화합물을 포함하는 반응액 중에서 배양하는 공정과, 반응액 중 4-히드록시벤조산 또는 그 염을 회수하는 공정을 포함하는 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 제조 방법.

16. 상기 15에 있어서, 호기적, 또는 형질 전환체가 증식하지 않는 조건 하에서 형질 전환체를 배양하는 방법.

본 발명의 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제, 또는 상기 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자를 코딩하는 DNA를 도입한 코리네형 세균 형질 전환체를 이용한다면, 당류, 형질 전환체가 대사에 의해 코리스미산을 생성할 수 있는 화합물, 코리스미산, 또는 그것들의 염으로부터 4-HBA을 실용상 충분히 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 4-히드록시벤조에이트가 4종의 미생물(Corynebacterium glutamicum R, Escherichia coli JM109, Pseudomonas putida S12 ATCC700801, 및 Rhodobacter sphaeroides NBRC12203)의 증식에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

(1) 변이 코리스메이트 - 피루베이트 리아제

본 발명의 변이 코리스메이트-피루베이트는

(A) 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제(ubiC)에 있어서 아미노산 번호 80의 발린이 그 외 아미노산으로 치환된 것, 또는

(B) 그 외 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서, 상기 발린과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것이다.

상기 (B)의 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제로는,

(ⅲ) 크로노박터속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서 아미노산 번호 79의 이소류신(I)이, 다른 아미노산으로 치환된 것을 들 수 있다.

프로비덴시아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제로는,

서열번호 2의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제, 서열번호 3의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 러스티기아니(Providencia rustigianii) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제, 서열번호 4의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스니비아(Providencia sneebia)유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제, 서열번호 5의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri)유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제, 서열번호 6의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens)유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제, 서열번호 7의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 버호도그라나리에아(Providencia burhodogranariea)유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 등을 들 수 있다.

에세리키아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제으로는, 서열번호 8의 아미노산 서열로부터 이루어진 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 등을 들 수 있다.

크로노박터속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제으로는, 서열번호 9의 아미노산 서열로부터 이루어진 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 등을 들 수 있다.

상기 발린 또는 이소류신은, 다른 1개의 아미노산으로 치환되어 있어도 괜찮고, 다른 복수 개 (예를 들어, 2~8개, 2~6개, 2~3개, 또는 2개)의 아미노산으로 치환되어 있어도 괜찮지만, 1개의 아미노산으로 치환되어 있는 것이 바람직하다. 그 중에서도, 상기 발린 또는 이소류신이 알라닌(A), 시스테인(B), 트레오닌(T), 세린(S), 또는 아스파라긴(N)으로 치환되어 있는 것이 바람직하고, 알라닌(A), 또는 시스테인(C)으로 치환되어 있는 것이 더 바람직하다.

또한, 상기 발린 또는 이소류신의 치환 대신에, 상기 발린 또는 이소류신의 결실, 상기 발린 또는 이소류신의 N 말단 측에 인접한 1개 또는 복수 개 (예를 들어, 2~8개, 2~6개, 2~3개, 혹은 2개)의 아미노산의 결실, 또는 상기 발린 혹은 이소류신에 인접한 위치에의 1개 또는 복수 개 (예를 들어, 2~8개, 2~6개, 2~3개, 혹은 2개)의 아미노산의 삽입에 의해서도, 코리스메이트-피루베이트 리아제활성을 증대시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제에는, 변이에 의해 생성된 상기 아미노산 부분 (예를 들어, 상기 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 또는 아스파라긴)을 보유하면서, 서열번호 1~9의 어느 하나의 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 가지는 한편 코리스메이트-피루베이트 리아제활성을 갖는 폴리펩티드로부터 이루어진 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제가 포함된다. 즉, 상기 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서, 서열번호 1~7의 어느 하나의 서열의 아미노산 번호 80의 발린, 또는 서열번호 8 혹은 9의 아미노산 번호 79의 이소류신과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산은 발린 또는 이소류신 이외의 예를 들어, 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 또는 아스파라긴 등이 있다.

본 발명에 있어서, 「효소학적으로 상동이다」는 것은 해당 폴리펩티드의 효소 기능에 대해 동등하게 기여하는 것을 의미한다. 아미노산 서열의 얼라이먼트에 있어서, 동등한 위치에 존재하는 아미노산이 효소 기능에 대해 동등하게 기여하는 아미노산이 된다.

본 발명에 있어서, 아미노산 서열 및 염기서열의 동일성은, GENETYX ver.8 (GENETYX주식회사제네틱스제)에 의해 산출한 값이다.

코리스메이트-피루베이트 리아제는, 코리스산으로부터 피루브산을 이탈시켜 4-HBA를 생성하는 반응, 및 그 역반응을 촉매하는 효소이다.

코리스메이트-피루베이트 리아제 활성은, 「Microbiology, 140, 897-904 (1994)」에 기재된 방법을 개질하여 측정할 수 있다. 쉽게 설명하면, 시험용액에 피험효소를 첨가하고, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 0.5mM chorismate Ba salt, 0.2mM NADH, 0.2M NaCl, 5 Unit 락테이트 데히드로게나제를 포함시키고, 33℃에서 반응시키고, NADH에서 유래한 340nm의 흡광도의 감소를 추적함으로써 반응 초속도를 측정한다. chorismate Ba salt를 첨가하지 않은 계에 대해서도 마찬가지로 반응시키고, 백그라운드치로 한다. 두 측정치의 차이를 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성으로 하여, 효소 및 기질 첨가에 의존하는 NADH 유래의 340nm의 경시적, 직선적인 흡광도 감소가 인정된 경우에, 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 가진다고 판정한다. 효소 활성의 1unit은, 1분당 1마이크로몰의 4-HBA를 생산하게 하는 효소량으로 정의하고, 효소 반응의 초속도로부터 산출한다.

또한, 본 발명의 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제에는, 서열번호 1~9의 어느 하나의 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 가지는 한편 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 있어서, 서열번호 1~7의 어느 하나의 서열의 아미노산 번호 80의 발린, 또는 서열번호 8 혹은 9의 아미노산 번호 79의 이소류신과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산을, 다른 아미노산 (예를 들어, 상기 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 또는 아스파라긴, 특히 알라닌 또는 시스테인)으로 치환한 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제가 포함된다.

(2) 코리네박테리움 속 균 형질 전환체

상기 설명한 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제를 코딩하는 변이 DNA를 숙주의 코리네형 세균에 도입함으로써, 4-HBA를 고효율적으로 생산할 수 있는 형질 전환체가 얻어진다.

이런 변이 DNA로는,

(C) 서열번호 10의 염기서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제(ubiC) 유전자에 있어서, 염기 번호 240~242의 gtc, 또는

(D) 그 외 코리스메이트-피루베이트 리아제(ubiC) 유전자를 코딩하는 유전자에 있어서, 상기 gtc에 대응하는 위치의 DNA 부분을, 그것이 코딩하는 아미노산과는 다른 1개 또는 복수 개 (예를 들어, 2~8개, 2~6개, 2~3개, 또는 2개)의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분으로 치환한 변이 DNA를 들 수 있다.

상기 (D)의 변이 DNA로는,

(ⅵ) 크로노박터속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 237~239의 atc를, 1개 또는 복수 개 (예를 들어, 2~8개, 2~6개, 2~3개, 또는 2개)의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분으로 치환한 변이 DNA를 들 수 있다.

프로비덴시아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자로는, 서열번호 11의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스투아르티 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자, 서열번호 12의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 러스티기아니 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자, 서열번호 13의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스니비아 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자, 서열번호 14의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 레트게리 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자, 서열번호 15의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 알칼리파시엔스 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자, 서열번호 16의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 버호도그라나리에아 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자 등을 들 수 있다.

에세리키아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자로는, 서열번호 17의 염기서열로부터 이루어진 에세리키아 콜라이 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자를 들 수 있다.

크로노박터속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자로는, 서열번호 18의 염기서열로부터 이루어진 크로노박터 사카자키 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자를 들 수 있다.

특히, 1개의 아미노산을 코딩하는 DNA로 치환하는 것이 바람직하다. 그 중에서도, 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 또는 아스파라긴을 코딩하는 DNA로 치환하는 것이 바람직하고, 알라닌 또는 시스테인을 코딩하는 DNA로 치환하는 것이 바람직하다.

알라닌을 코딩하는 DNA로는 gca을 들 수 있고, 시스테인을 코딩하는 DNA로는 tgc을 들 수 있고, 트레오닌을 코딩하는 DNA로는 acc을 들 수 있고, 세린을 코딩하는 DNA로는 tcc을 들 수 있으며, 아스파라긴을 코딩하는 DNA로는 aac을 들 수 있다.

또한, 변이 DNA에는 상기 치환에 의해 생성된 발린 또는 이소류신 이외의 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 또는 아스파라긴, 특히 알라닌 또는 시스테인)을 코딩하는 DNA 부분을 보유하면서, 서열번호 10~18의 어느 하나의 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기서열로부터 이루어지거나, 또는 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이 DNA도 포함된다.

또한, 변이 DNA에는 상기 치환에 의해 생성된 발린 또는 이소류신 이외의 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 또는 아스파라긴, 특히 알라닌 또는 시스테인)을 코딩하는 DNA 부분을 보유하면서, 서열번호 10~18의 어느 하나의 염기서열로부터 이루어진 DNA와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이징하거나, 또는 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이 DNA도 포함한다.

본 발명에서 「스트린젠트한 조건」은, 6×SSC의 염농도의 하이브리디제이션 용액 중, 50~60℃의 온도 조건에서 16시간 하이브리디제이션을 실시하고, 0.1×SSC의 염농도의 용액에 세정을 실시하는 조건을 말한다.

또한, 변이 DNA에는 서열번호 10~16의 어느 하나의 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기서열로부터 이루어지고, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이 DNA에 있어서, 서열번호 10~16의 어느 하나의 서열의 염기번호 240~242의 gtc에 대응하는 DNA 부분을, 1개 또는 복수 개 (예를 들어, 2~8개, 2~6개, 2~3개, 또는 2개)의 발린 이외의 아미노산, 특히 1개의 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 또는 아스파라긴, 특히 알라닌 또는 시스테인)을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA가 포함된다.

「서열번호 10~16의 어느 하나의 서열의 염기번호 240~242의 gtc에 대응하는 DNA 부분」은 서열번호 10~16의 어느 하나의 염기서열로부터 이루어진 DNA가 코딩하는 아미노산 서열로부터 이루어진 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분을 말한다.

또한, 변이 DNA에는 서열번호 17 또는 18과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기서열로부터 이루어지고, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 있어서, 서열번호 17 또는 18의 염기번호 237~239의 atc에 대응하는 DNA 부분을, 1개 또는 복수 개 (예를 들어, 2~8개, 2~6개, 2~3개, 또는 2개)의 이소류신 이외의 아미노산, 특히 1개의 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 또는 아스파라긴, 특히 알라닌 또는 시스테인)을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA가 포함된다.

「서열번호 17 또는 18의 염기번호 237~239의 atc에 대응하는 DNA 부분」은 서열번호 17 또는 18의 염기서열로부터 이루어진 DNA가 코딩하는 아미노산 서열로부터 이루어진 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 79의 이소류신과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산을 코딩하는 DNA 부분을 말한다.

또한, 변이 DNA에는 서열번호 10~16의 어느 하나의 서열과 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이징하고, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 있어서, 서열번호 10~16의 어느 하나의 서열의 염기번호 240~242의 gtc에 대응하는 DNA 부분을, 1개 또는 복수 개 (예를 들어, 2~8개, 2~6개, 2~3개, 또는 2개)의 발린 이외의 아미노산, 특히 1개의 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 또는 아스파라긴, 특히 알라닌 또는 시스테인)을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA가 포함된다.

또한, 변이 DNA에는 서열번호 17 또는 18과 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이징하고, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 있어서, 서열번호 17 또는 18의 염기번호 237~239의 atc에 대응하는 DNA 부분을, 1개 또는 복수 개 (예를 들어, 2~8개, 2~6개, 2~3개, 또는 2개)의 이소류신 이외의 아미노산, 특히 1개의 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 시스테인, 트레오닌, 세린, 또는 아스파라긴, 특히 알라닌 또는 시스테인)을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA가 포함된다.

코리스메이트-피루베이트 리아제를 코딩하는 DNA와 90% 이상의 동일성을 갖거나, 또는 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이징하고, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유연체 DNA는, 예를 들어, 기본이 되는 DNA의 염기서열에 근거하여 통상적인 방법에 따라 설계한 프라이머 또는 프로브를 이용한 PCR 또는 하이브리디제이션에 의해, 다른 생물종의 DNA 라이브러리로부터 선택할 수 있으며, 이로 인해 높은 확률로 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 얻어진다.

숙주

코리네형 세균이란, 버지 메뉴얼 오브 디터미네이티브 박테리올로지[Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8,599 (1974)]에 정의되어 있는 일군의 미생물이며, 통상의 호기적 조건에서 증식하는 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적인 예를 들면, 코리네박테리움속균, 브레비박테리움속균, 아스로박터속균, 미코박테리움속균, 마이크로코쿠스속균 등을 들 수 있다. 코리네형 세균 중에서는 코리네박테리움속균이 바람직하다.

코리네박테리움속균으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerance), 코리네박테리움 알카놀리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum) 등을 들 수 있다.

그 중에서도, 안전하고 4-HBA 생산성이 높은 점에서, 코리네박테리움 글루타미쿰이 바람직하다. 적합한 균주로서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) R주(FERM BP-18976), ATCC13032주, ATCC13869주, ATCC13058주, ATCC13059주, ATCC13060주, ATCC13232주, ATCC13286주, ATCC13287주, ATCC13655주, ATCC13745주, ATCC13746주, ATCC13761주, ATCC14020주, ATCC31831주, MJ-233(FERM BP-1497), MJ-233AB-41(FERM BP-1498) 등을 들 수 있다. 이들 주는, 부다페스트 조약하에 국제기탁되어, 공개적으로 이용 가능하다.

그 중에서도, R주(FERM BP-18976), ATCC13032주, ATCC13869주가 바람직하다.

또한, 분자 생물학적 분류에 의해, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium) 등의 코리네형 세균도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 균명이 통일되어 있다 [Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum"DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41: 255-260 (1991), 코마가타 카즈오 등, 코리네형 세균의 분류, 발효 및 공업, 45: 944-963 (1987)].

브레비박테리움속 균으로는, 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) (예를 들면, ATCC6872주) 등을 들 수 있다. 이 주는, 부다페스트 조약하에 국제기탁되어, 공개적으로 이용 가능하다.

아스로박터속 균으로는, 아스로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis)(예를 들면, ATCC8010주, ATCC4336주, ATCC21056주, ATCC31250주, ATCC31738주, ATCC35698주) 등을 들 수 있다. 이들 주는, 부다페스트 조약하에 국제기탁되어, 공개적으로 이용 가능하다.

미코박테리움속 균으로는, 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)(예를 들면, ATCC19210주, ATCC27289주) 등을 들 수 있다. 이들 주는, 부다페스트 조약하에 국제기탁되어, 공개적으로 이용 가능하다.

마이크로코쿠스속 균으로는, 마이크로코쿠스 프류덴레이치이(Micrococcus freudenreichii)(예를 들면, No. 239주(FERM P-13221)), 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus leuteus)(예를 들면, No. 240주(FERM P-13222)), 마이크로코쿠스 우레아에(Micrococcus ureae)(예를 들면, IAM1010주), 마이크로코쿠스 로제우스(Micrococcus roseus)(예를 들면, IFO3764주) 등을 들 수 있다.

또한, 코리네형 세균은 야생주 외에, 그 변이주나 인위적인 유전자 재조합체라도 괜찮다. 예를 들면, 락테이트(젖산) 데히드로게나제(lactate dehydrogenase: LDH), 포스포에놀피루브산 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase), 말산데히드로게나제(malate dehydrogenase) 등의 유전자의 파괴주를 들 수 있다. 그 중에서도, 락테이트 데히드로게나제 유전자의 파괴주가 바람직하다. 이 유전자 파괴주는, 젖산 데히드로게나제 유전자가 파괴됨으로써, 피루브산에서 젖산으로의 대사 경로가 차단되어 있다. 그 중에서도, 코리네박테리움 글루타미쿰의, 특히 R(FERM BP-18976)주의 락테이트 데히드로게나제 유전자의 파괴주가 바람직하다.

이러한 유전자 파괴주는, 유전자 공학적 수법에 의해 통상적인 방법에 따라 제작할 수 있다. 예를 들면, WO2005/010182A1에, 젖산 데히드로게나제 파괴주, 및 그 제작방법이 기재되어 있다.

도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명자들은 코리네형 세균이 다른 세균에 비해 4-HBA에 대한 내성이 매우 높은 것을 발견했다. 또한, 코리네형 세균은 다른 호기성 세균에 비해 용균하기 어렵다. 이 점에서, 코리네형 세균은 본 발명의 방법에 의한 4-HBA 제조에 적합하다.

형질 전환체를 위한 벡터의 구축

PCR로 증폭한 코리스메이트-피루베이트 리아제 효소를 코딩하는 DNA는, 각각 숙주에서 증폭할 수 있는 적절한 벡터에 클로닝할 수 있다.

플라스미드 벡터로는, 코리네형 세균 내에서 자율 복제 기능을 담당하는 유전자를 포함하는 것이면 괜찮다. 그 구체적인 예로는, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) 2256 유래의 pAM330[일본특허공개 소58-67699호 공보], [Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903 (1984)] 및 [Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16: 265-267 (1985)], 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC3058 유래의 pHM1519 [Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903 (1984)] 및 pCRY30 [Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57: 759-764 (1991)], 코리네박테리움 글루타미쿰 T250 유래의 pCG4 [일본특허공개 소57 -183799호 공보], [Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol., 159: 306-311 (1984)], pAG1, pAG3, pAG14, pAG50[일본특허공개 소62-166890], pEK0, pEC5, pEKEx1[Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene 102: 93-98 (1991)] 등을 들 수 있다.

바람직한 프로모터로는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래의 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데히드로게나제A 유전자(gapA)의 프로모터 PgapA, 말레이트 데히드로게나제 유전자(mdh)의 프로모터 Pmdh, 락테이트 데히드로게나제A 유전자(ldhA)의 프로모터 PldhA 등을 들 수 있고, 그 중에서도 PgapA가 바람직하다.

바람직한 터미네이터로는, 대장균 rRNA 오페론의 rrnB T1T2 터미네이터, 대장균의 trpA 터미네이터, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)의 trp 터미네이터 등을 들 수 있고, 그 중에서도 rrnB T1T2 터미네이터가 바람직하다.

형질 전환

형질 전환 방법은, 공지의 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 이러한 공지의 방법으로, 예를 들면, 염화칼슘ㆍ염화루비듐법, 인산칼슘법, DEAE-덱스트란 개재 트란스펙션, 전기천공법 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 코리네형 세균에는 전기펄스법이 적합하고, 전기펄스법은 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다(Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)).

형질 전환체는, 미생물의 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 이용하여 배양하면 괜찮다. 이 배지로는, 통상적으로 탄소원, 질소원, 무기염류, 및 그 외 영양물질을 함유하는 천연 배지, 또는 합성 배지를 이용할 수 있다.

탄소원으로는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 만노스, 말토스, 만니톨, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 전분, 당밀, 소르비톨, 글리세린 등의 당질 또는 당알코올; 아세트산, 구연산, 젖산, 푸마르산, 말레산 또는 글루콘산 등의 유기산; 에탄올, 프로판올 등의 알코올을 들 수 있다. 탄소원은, 1종을 단독으로 사용할 수 있고, 또는 2종 이상을 금후에 사용해도 괜찮다. 배지 중 이들 탄소원의 농도는, 통상적으로 약 0.1~10(w/v%)일 수 있다.

질소원으로는 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 아세트산암모늄 등의 무기 또는 유기암모늄 화합물, 요소, 암모니아수, 질산나트륨, 질산칼륨 등을 들 수 있다. 또한, 콘 스티프 리쿼, 육즙, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 함질소 유기화합물 등도 이용할 수 있다. 질소원은, 1종을 단독으로 사용해도 괜찮고, 또한 2종 이상을 혼합하여 사용해도 괜찮다. 배지 중 질소원 농도는, 사용하는 질소 화합물에 따라 다르지만, 통상적으로 10(w/v%)일 수 있다.

무기염류로는, 예를 들면 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 질산제1철, 황산망간, 황산아연, 황산코발트, 또는 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 이들 무기염은, 1종을 단독으로 사용해도 좋고, 또한 2종 이상을 혼합해서 사용해도 괜찮다. 배지 중 무기염류 농도는, 사용하는 무기염에 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.1~1(w/v%)일 수 있다.

영양물질로서, 예를 들면 육즙, 펩톤, 폴리펩톤, 효모 추출물, 건조 효모, 콘 스티프 리쿼, 탈지분유, 탈지대두 염산 가수분해물, 또는 동식물이나 미생물 균체의 추출물이나 그들의 분해물 등을 얻을 수 있지만, 통상적으로, 약 0.1~10(w/v%)일 수 있다. 또한, 필요에 따라 비타민을 첨가 할 수도 있다. 비타민류로는, 예를 들면 비오틴, 티아민, 피리독신, 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등을 들 수 있다.

배지의 pH는 약 6~8이 바람직하다.

바람직한 미생물 배양 배지로는, A배지[Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182-196 (2004)], BT배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 (2004)] 등을 들 수 있다.

배양 온도는 약 15~45℃으로 하면 괜찮고, 배양 시간은 약 1~7일 일 수 있다.

숙주 염색체 유전자의 파괴 또는 결실

숙주의 코리네형 세균은, 그 염색체상에 존재하는 4-히드록시벤조에이트 히드록시라아제 유전자가 파괴되거나, 또는 결실되어 있는 것이 바람직하다. 4-히드록시벤조에이트 히드록시라아제를 파괴함으로써 생성된 4-HBA의 대사가 억제되고, 4-HBA의 생산성이 향상됨과 동시에 부생성물이 적어진다.

유전자의 부분 배열을 결실하고, 제대로 기능하는 효소 단백질을 생산하지 않도록 개변한 결실형 유전자를 제작하고, 상기 유전자를 포함하는 DNA로 세균을 형질 전환하고, 결실형 유전자와 염색체상의 유전자로 상동 재조합을 일으킴으로써, 염색체상의 유전자를 결실형 또는 파괴형 유전자로 치환할 수 있다. 결실형 또는 파괴형 유전자에 의해 코딩되는 효소 단백질은, 생성했다고 해도, 야생형 효소 단백질과는 다른 입체 구조를 가지며, 기능이 저하 또는 소실되어 있다. 이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 유전자 결실 또는 파괴는 이미 확립되어 있으며, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드, 접합 전달 가능한 플라스미드를 이용하는 방법, 숙주 내에서 복제 기점을 갖지 않는 수이사이드 벡터를 이용하는 방법 등이 있다(미국특허 제6303383호, 일본특허공개 평05-007491호).

(3) 4- HBA의 제조 방법

상기에 설명한 본 발명의 형질 전환체를, 당류, 형질 전환체가 대사에 의해 코리스미산을 생성할 수 있는 화합물, 및 코리스미산, 및 그들의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 원료 화합물을 함유하는 반응액 중에서 반응시키는 공정과, 반응액 중의 4-HBA를 회수하는 공정을 포함하는 방법에 의해 4-HBA를 제조할 수 있다.

원료 화합물은 형질 전환체가 세포 내에 도입할 수 있는 화합물인 것이 필요하며, 또한, 식물에 많이 포함되어 있는 등, 공업적으로 이용하기 쉬운 것이 바람직하다.

당류로는 글루코스가 적합하지만, 대사에 의해 글루코스를 생성할 수 있는 당류도 사용할 수 있다. 이러한 당류에는 글루코스 단위를 갖는 올리고당 또는 다당류가 포함된다. 이러한 당류로는 프럭토스, 만노스, 아라비노스, 자일로스, 갈락토스 등의 단당류; 셀로비오스, 자당, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 자이로비오스 등의 2당류; 덱스트린 또는 가용성 전분 등의 다당류 등을 들 수 있다.

또한, 대사에 의해 코리스미산을 생성할 수 있는 화합물로는 퀸산, 시킴산 등을 들 수 있다.

또한, 예를 들면 이들의 원료 화합물을 포함하는 원료로, 당밀도 이용할 수 있다. 또한, 짚(볏짚, 큰 밀짚, 작은 밀짚, 라이밀짚, 오트밀짚 등), 버개스, 콘 스토버 등의 비가식(非可食) 농산폐기물이나 스위치그래스, 네피아그래스, 미스칸사스 등의 에너지 작물 및 톱밥, 파지 등을 당화 효소 등으로 당화시킨, 글루코스 등의 복수의 당을 포함하는 당화액을 이용할 수도 있다. 그 중에서도, 원료 화합물로는 글루코스, 코리스미산, 퀸산, 시킴산이 바람직하다.

미생물의 증식

반응에 앞서, 형질 전환체를 호기적 조건하에서 온도 25~38℃로, 약 12~48시간 배양하여 증식시키는 것이 바람직하다.

배양용 배지

반응에 앞서, 형질 전환체의 호기적 배양에 이용하는 배지는 탄소원, 질소원, 무기염류 및 그 외 영양물질 등을 함유하는 천연 배지 또는 합성 배지를 이용할 수 있다.

탄소원으로서 당류(글루코스, 프럭토스, 만노스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스 같은 단당; 수크로스, 말토스, 락토스, 셀로비오스, 자이로비오스, 트레할로스와 같은 2당; 전분과 같은 다당; 당밀 등), 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 글리세린과 같은 당알코올; 아세트산, 구연산, 젖산, 푸마르산, 말레산, 글루콘산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올과 같은 알코올; 노말 파라핀과 같은 탄화수소 등도 이용할 수 있다.

탄소원은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

질소원으로는 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 아세트산암모늄과 같은 무기 또는 유기암모늄 화합물, 요소, 암모니아수, 질산나트륨, 질산칼륨 등을 사용할 수 있다. 또한, 콘 스티프 리쿼, 육즙, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 함질소 유기화합물 등도 사용할 수 있다. 질소원은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 질소원의 배지 중 농도는, 사용하는 질소 화합물에 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.1~10(w/v%)일 수 있다.

무기염류로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 질산제1철, 황산망간, 황산아연, 황산코발트, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 무기염은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 무기염류의 배지 중 농도는, 사용하는 무기염에 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.01~1(w/v%)일 수 있다.

영양물질로는 육즙, 펩톤, 폴리펩톤, 효모 추출물, 건조 효모, 콘 스티프 리쿼, 탈지분유, 탈지대두 염산 가수분해물, 동식물 또는 미생물 균체 추출물이나 그들의 분해물 등을 들 수 있다. 영양물질의 배지 중 농도는, 사용하는 영양물질에 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.1~10(w/v%)일 수 있다.

또한, 필요에 따라 비타민류를 첨가할 수도 있다. 비타민류로는 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등을 들 수 있다.

배지의 pH는 약 6~8이 바람직하다.

구체적인 바람직한 코리네형 세균용 배지로는 A배지[Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182-196 (2004)], BT배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 (2004)] 등을 들 수 있다. 이들 배지에서, 당류 농도를 상기 범위로 하여 이용하면 괜찮다.

반응액

반응액으로는 탄소원, 질소원 및 무기염류 등을 함유하는 천연 반응액 또는 합성 반응액을 이용할 수 있다.

탄소원으로는, 상기 설명한 원료 화합물 또는 이를 포함하는 당밀이나 당화액 등을 이용할 수 있다. 또한, 탄소원으로서 당류 외에 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 글리세린과 같은 당알코올; 아세트산, 구연산, 젖산, 푸마르산, 말레산, 글루콘산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올과 같은 알코올; 노말 파라핀과 같은 탄화수소 등도 이용할 수 있다.

반응액 중의 원료 화합물의 농도는 약 1~20(w/v%)가 바람직하고, 약 2~10(w/v%)이 보다 바람직하고, 약 2~5(w/v%)가 더욱 바람직하다.

또한, 원료 화합물을 포함하는 전체 탄소원의 농도는, 약 2~5(w/v%)일 수 있다.

질소원으로는 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 아세트산암모늄과 같은 무기 또는 유기암모늄 화합물, 요소, 암모니아수, 질산나트륨, 질산칼륨 등을 사용할 수 있다. 또한 콘 스티프 리쿼, 육즙, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 함질소 유기화합물 등도 사용할 수 있다. 질소원은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 질소원의 반응액 중의 농도는, 사용하는 질소 화합물에 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.1~10(w/v%)일 수 있다.

무기염류로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 질산제1철, 황산 망간, 황산 아연, 황산 코발트, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 무기염은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 무기염류의 반응액 중의 농도는, 사용하는 무기염 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.01~1(w/v%)일 수 있다.

반응액의 pH는 약 6~8이 바람직하다.

구체적인 바람직한 코리네형 세균용 반응액으로는, 상술한 BT배지 등을 들 수 있다. 이들 배지에 있어서, 당류 농도를 상기 범위로 하여 이용하면 괜찮다.

반응 조건

반응 온도, 즉 형질 전환체의 생존 온도는, 약 20~50℃가 바람직하고, 약 25~47℃가 보다 바람직하다. 상기 온도 범위이면, 효율적으로 4-HBA를 제조할 수 있다.

또한, 반응 시간은, 약 1~7일간이 바람직하며, 약 1~3일간이 보다 바람직하다.

배양은 배치식, 유가식, 연속식의 어느 것이어도 괜찮다. 그 중에서도, 배치식이 바람직하다.

반응은 호기적 조건에서 실시해도 괜찮고, 환원 조건에서 실시해도 괜찮다. 본 발명의 형질 전환체 자체의 4-HBA 생산 능력은 호기적 조건 쪽이 높다. 그러나, 호기적 조건하에서는 형질 전환체가 증식하기 때문에, 원료 화합물이 증식을 위해 소비되고, 그만큼 4-HBA 제조 효율이 저하된다.

따라서, 호기적, 또한 형질 전환체가 증식하지 않는 조건하에서 반응시키는 것이 바람직하다. 본 발명에서 증식하지 않는 것에는, 실질적으로 증식하지 않는 것, 또는 거의 증식하지 않는 것이 포함된다. 예를 들면, 미생물의 증식에 필수 화합물인 비오틴, 티아민 등 비타민류, 질소원 등의 1종 이상을 결핍, 혹은 제한시킨 반응액을 이용함으로써, 형질 전환체의 증식을 회피 또는 억제할 수 있다.

또한, 환원 조건에서는, 코리네형 세균은 실질적으로 증식하지 않기 때문에, 원료 화합물이 증식을 위해 소비되지 않는 만큼, 4-HBA 제조 효율이 높아진다.

환원조건은, 반응액의 산화 환원전위로 규정된다. 반응액의 산화환원전위는 약-200mV ~ -500mV가 바람직하고, 약-150mV ~ -500mV가 보다 바람직하다.

반응액의 환원상태는 간편하게는 레자주린 지시약(환원상태이면, 청색에서 무색으로 탈색)으로 측정할 수 있지만, 정확하게는 산화환원전위차계(예를 들면, BROADLEY JAMES사제, ORP Electrodes)를 이용하여 측정할 수 있다.

환원 조건에 있는 반응액의 조정 방법은, 공지의 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 반응액의 액체 매체로서, 증류수 등 대신 반응액용 수용액을 사용해도 괜찮고, 반응액용 수용액의 조정 방법은, 예를 들면 황산 환원 미생물 등의 절대 혐기성 미생물의 배양액 조정 방법(Pfennig, N. et al. (1981): The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats Isolation and Identification of bacteria, Ed.by Starr, M. P. et al., p926- 940, Berlin, Springer Verlag)이나 「농예 화학 실험서 제3권, 교토대학 농학부 농예 화학 교실편, 1990년 제26쇄, 산업도서 주식회사 출판」등을 참조하여 목적하는 환원 조건하의 수용액을 얻을 수 있다.

구체적으로는, 증류수 등을 가열 처리나 감압 처리하여 용해 가스를 제거함으로써, 환원 조건의 반응액용 수용액을 얻을 수 있다. 이 경우, 약 10mmHg 이하, 바람직하게는 약 5mmHg 이하, 보다 바람직하게는 약 3mmHg 이하의 감압 하에서, 약 1~60분 정도, 바람직하게는 약 5~40분 정도, 증류수 등을 처리함으로써 용해 가스, 특히 용해 산소를 제거하여 환원 조건하에서의 반응액용 수용액을 만들 수 있다.

또한, 적당한 환원제(예를 들면, 티오글리콜산, 아스코르빈산, 시스테인염산염, 메르캅토아세트산, 티오아세트산, 글루타티온, 황화 소다 등)를 첨가하여 환원 조건의 반응액용 수용액을 조정할 수도 있다.

이들 방법을 적절히 조합하는 것도 유효한 환원 조건의 반응액용 수용액의 조정 방법이다.

환원 조건하에서 반응시키는 경우, 반응 중에도 반응액을 환원 조건으로 유지하는 것이 바람직하다. 반응 도중에서의 환원 조건을 유지하기 위해, 반응계 밖에서 산소의 혼입을 가능한 한 방지하는 것이 바람직하며, 구체적으로는, 반응계를 질소 가스 등의 불활성 가스나 탄산 가스 등으로 봉입하는 방법을 들 수 있다. 산소 혼입을 보다 효과적으로 방지하는 방법으로는, 반응 도중에 본 발명의 호기성 세균의 균체 내의 대사 기능을 효율적으로 기능시키기 위해, 반응계의 pH 유지 조정액의 첨가나 각종 영양소 용해액을 적절하게 첨가할 필요가 생기는 경우도 있지만, 이러한 경우에는 첨가 용액에서 산소를 미리 제거해 두는 것이 유효하다.

4- HBA의 회수

상기와 같이 하여 배양함으로써, 반응액 중에 4-HBA가 생산된다. 반응액을 회수함으로써 4-HBA를 회수할 수 있지만, 공지의 방법으로 4-HBA를 반응액으로부터 분리할 수도 있다. 이러한 공지의 방법으로는, 결정석출법, 막 분리법, 유기 용매 추출법, 각종 흡착법 (이온 교환 수지법, 합성 흡착제 등을 사용) 등을 들 수 있다.

(4) 코리스메이트 - 피루베이트 리아제활성의 향상 방법

본 발명은,

(A) 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제(ubiC)에 있어서, 아미노산번호 80의 발린, 또는

(B) 그 외 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서, 상기 발린과 효소학적으로 상동인 위치의 아미노산을 1개 또는 복수 개의 다른 아미노산으로 치환함으로써, 코리스메이트-피루베이트 리아제활성을 향상, 또는 증대시키는 방법을 포함한다.

코리스메이트-피루베이트 리아제, 및 변이 방법은, 상기 설명한 것과 같다.

본 발명은 본 발명의 효과를 나타내는 한, 본 발명의 기술적 범위 내에 있어서 상기 구성을 여러가지로 조합한 형태를 포함한다.

실시예

다음으로는, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 어떠한 한정되는 것이 아니라, 많은 변형이 본 발명의 기술적 사상내에서 해당 분야에 있어 통상의 지식을 가진 자에 의해 가능하다.

[실시예 1]

4- HBA 생산 유전자의 클로닝과 발현계의 구축 (야생형 및 변이형)

(1) Pantoea ananatis 유래의 염색체 DNA의 추출

판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) LMG 20103으로부터의 염색체 DNA 추출은, LMG Bacteria Culture Medium No.1 배지[Beef extract 1g, Yeast extract 2g, Peptone 5g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.4로 조정]에, 백금이(白金耳)를 이용하여 식균한 후, 대수증식기까지 28℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사(Amersham社)제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

(2) Pantoea ananatis 유래의 4- HBA 생산 유전자의 클로닝

4-히드록시벤조산 생산 유전자(코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자)를 코딩하는 ubiC 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 따라 증폭했다.

PCR 시, ubiC 유전자를 클론화할 수 있도록 ubiC 유전자를 포함하는 유전자 서열, 서열번호 10 (Pantoea ananatis ubiC 유전자)를 근거로 하여, 각각 하기 한 쌍의 프라이머를 합성해서 사용했다.

Pantoea ananatis ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-1); 5'-CTCTCATATGACGCAAGACCCGCT-3' (서열번호 19)

(b-1); 5'-CTCTCATATGTTAACCTTGATCACGATAGAGCG-3' (서열번호 20)

또한, 프라이머(a-1) 및 (b-1)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Providencia rustigianii ubiC 유전자 증폭용 프라이머

실제 PCR은, Veriti 써머 사이클러 (어플라이드바이오시스템즈사제)를 이용하고, 반응 시약으로서 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(다카라바이오주식회사제)를 이용하여, 아래의 조건에서 실시했다.

반응액:

PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl

5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl

dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl

주형 DNA 1μl (DNA 함유량 1μg 이하)

상기 기재된 2종 프라이머*) 각각 1μl (최종 농도 0.2μM)

멸균 증류수 32μl

이상을 혼합하여, 50μl의 반응액을 PCR에 걸었다.

PCR 사이클:

변성 과정: 98℃ 10초

어닐링 과정: 50℃ 5초

확장 과정: 68℃ 31초

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 실시했다.

상기에서 생성한 반응액 10μl을 0.8% 아가로스겔에 의해 전기영동을 실시하여, Pantoea ananatis주 유래의 ubiC 유전자의 약 0.5-kb의 유전자의 DNA단편을 검출할 수 있었다. 각 DNA 단편은 NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-Up(다카라바이오주식회사제)에 의해 정제했다.

(3) 4- 히드록시벤조산 생산 유전자( 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 유전자) 발현 플라스미드의 구축

상기 항 (2)에 나타낸 PCR에 따라 증폭한 Pantoea ananatis주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편 10μl 및 PgapA 프로모터를 포함하는 클로닝 벡터 pCRB209[국제공개 WO2012/033112] 2μl를 각각 제한효소 NdeI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리함으로써 제한효소를 실활시킨 후, 양자를 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가제 10×완충액 1μl, T4 DNA 리가제(다카라바이오주식회사제) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수에서 10μl으로 하여, 15℃에서 3시간 반응시켜 결합시켰다.

얻어진 라이게이션액을, 염화칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)]에 따라 에세리키아 콜라이 HST02를 형질 전환하여, 카나마이신 50μg/ml을 포함하는 LB 한천배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

각각 배지상의 생육주를 통상적인 방법에 따라 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출, 상기 플라스미드를 제한효소로 각각 절단하여, 삽입단편을 확인했다. 이 결과, 플라스미드 pCRB209 약 5.1-kb의 DNA단편 외에 Pantoea ananatis주 유래의 ubiC 유전자의 약 0.5-kb 삽입단편이 인정되었다.

Pantoea ananatis주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드을 pHBA22로 명명했다.

(4) 4- 히드록시벤조산 생산 유전자( 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 유전자) 도입주의 구축

상기 플라스미드 pHBA22을 이용하여, 전기펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447 (1990) 및 Res. Microbiol., Vol. 144, 181-185 (1993)]에 따라, 코리네박테리움 글루타미쿰 R주를 형질 전환하여, 카나마이신 50μg/ml을 포함하는 A 한천배지에 도포했다.

상기 배지상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출, 상기 플라스미드를 제한효소로 절단하여, 삽입 플라스미드를 확인했다. 이 결과, 상기에서 제작된 플라스미드 pHBA22의 도입이 인정되었다.

얻어진 주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) pHBA22로 명명했다.

(5) 4- 히드록시벤조산 생산 유전자(코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자) 의 부위특이적변이 도입 플라스미드의 구축

상기 플라스미드 pHBA22를 이용하여 V80 부위를 2종의 아미노산에 치환한 변이체를 Inverse PCR법에 따라 작성하고, 부위특이적변이가 도입되는 플라스미드 얻고, 이들을 각각 pHBA23, pHBA24로 명명했다.

PCR 시, ubiC유전자의 V80 부위에 변이를 도입하기 위해, 서열번호 10 (Pantoea ananatis ubiC 유전자)를 근거로 하여, 각각 하기 프라이머를 합성해서 사용했다.

Pantoea ananatis ubiC 유전자 변이도입용 프라이머

(a-2); 5'-CGAGAAgcaATTCTCTACGGGGATG-3' (서열번호 21)

(b-2); 5'-CAGCCAGAAACGCTGATCG-3' (서열번호 22)

(a-3); 5'-tgcATTCTCTACGGGGATGAGG-3' (서열번호 23)

(b-3); 5'-TTCTCGCAGCCAGAAACGCTG-3' (서열번호 24)

실제 PCR은, Veriti 써머 사이클러(어플라이드바이오시스템즈사제)를 이용하고, 반응 시약으로서 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(다카라바이오주식회사제)를 이용하여, 아래의 조건에서 실시했다.

반응액:

PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl

5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl

dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl

주형 DNA 1μl (DNA 함유량 1μg 이하)

상기 기재된 2종 프라이머*) 각각 1μl (최종 농도 0.2μM)

멸균 증류수 32μl

이상을 혼합하여, 이 50μl의 반응액을 PCR에 걸었다.

*) pHBA23(V80A)를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-2)와 (b-2)의 조합, pHBA24(V80C)를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-3)와 (b-3)의 조합으로 실시했다.

PCR 사이클:

변성 과정: 98℃ 10초

어닐링 과정: 50℃ 5초

확장 과정: 68℃ 338초

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 실시했다.

상기에서 생성한 반응액 10μl을 0.8% 아가로스겔에 의해 전기영동을 실시하여, Pantoea ananatis주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 5.6-kb의 DNA단편을 검출할 수 있었다. 각 DNA단편은 NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(다카라바이오주식회사제)에 의해 정제했다.

정제한 증폭산물을 T4 Polynucleotide Kinase(다카라바이오주식회사제)를 이용하여 인산화처리를 한 후, NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-Up(다카라바이오주식회사제)에 의해 정제했다. 얻어진 인산화처리된 DNA 단편을 이용하여 DNA Ligation Kit(다카라바이오주식회사제)에 의해 결합(self-ligation)시켰다. 얻어진 라이게이션 액을 염화칼슘법 [J. mol. Biol. 53 : 159-162 (1970)]에 따라 에세리키아 콜라이 HST02를 형질 전환하여, 카나마이신 50μg/ml을 포함하는 LB 한천배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨 및 1.5% 한천]에 도포하였다. 배지상의 생육주를 통상적인 방법에 따라 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출, 상기 플라스미드의 염기서열을 서열 분석함으로써, ubiC 유전자의 V80 부위에의 변이도입을 확인했다.

얻어진 플라스미드를 pHBA23, pHBA24로 명명했다. 또한, 본 플라스미드의 유전자 재조합의 개요는, 표 1에 정리하여 나타냈다.

[표 1]

(6) 4- 히드록시벤조산 생산 유전자( 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 유전자) 도입주의 구축

상기 플라스미드 pHBA22~pHBA24을 이용하여, 전기펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447 (1990) 및 Res. Microbiol., Vol. 144, 181-185 (1993)]에 따라, 코리네박테리움 글루타미쿰 R주를 형질 전환하여, 카나마이신 50μg/ml을 포함하는 A 한천배지에 도포했다.

이 배지상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출, 상기 플라스미드를 제한효소로 절단하여, 삽입 플라스미드를 확인했다. 이 결과, 상기에서 제작된 플라스미드 pHBA22~pHBA24의 도입이 인정되었다.

얻어진 주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) HBA-22~HBA-24로 명명했다. 또한, 본 주의 유전자 재조합의 개요는, 표 2에 정리하여 나타냈다.

[표 2]

[실시예 2]

코리네박테리움 글루타미쿰 4- 히드록시벤조산 생산 유전자 도입주에 의한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성 비교

실시예 1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 HBA-22(V80, 야생형), 및 HBA-23(V80A), HBA-24(V80C)에 대해, 초음파 파쇄한 세포 파쇄액을 이용하여 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 비교했다.

구체적으로는, 상기 각 주를, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁]에 도포하고, 33℃, 15시간 어두운 곳에 정치(置)했다.

상기 플레이트상에서 증식한 각 주를, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 액체배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g를 증류수 1L에 용해] 10ml가 들어있는 시험관에 한 백금이로 식균하고, 33℃에서 15시간, 호기적으로 진탕배양을 실시했다.

이렇게 하여 배양 증식된 각각의 균체를, 원심 분리(4℃, 8,000rpm, 10분)에 의해 회수했다. 초음파 처리로 균체 세포를 파쇄한 후, 원심 분리(4℃, 15,000rpm, 20분)에 의해 얻은 세포 파쇄 상청을 조효소액으로 이용하고, 이하의 방법에 따라 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 측정했다.

조효소액, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5mM chorismate Ba salt, 0.2mM NADH, 0.2M NaCl, 5 Unit lactate dehydrogenase를 혼합하고, 33℃에서 반응시켜, NADH에서 유래한 340nm의 흡광도 감소를 추적하여, 반응 초속도를 분석했다. 반응 초속도와 단백질 농도에서 비활성을 산출했다(1분당, 1마이크로몰의 4-HBA를 생산시키는 효소량을 1 unit으로 정의했다). (또한, 반응액을 필터여과 후, 발생한 4-HBA는 HPLC에 의해 4-HBA의 피크를 직접 검출하여(Cosmosil C18 ARII (Nacalai Tesque), 이동상(移動相) 20% 메탄올, 0.07% 과염소산), 양 검정법에 의한 정량성이 차이가 없음을 별도로 확인했다.)

그 결과, 표3에 나타낸 바와 같이 V80 (야생형)과 비교하여, V80A 변이체 및 V80C 변이체가 높은 활성을 나타냈다.

[표 3]

[실시예 3]

코리네박테리움 글루타미쿰 4- 히드록시벤조산 생산 유전자 도입주에 의한 글루코스로부터의 4-히드록시벤조산제조

실시예 1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 HBA-22(V80, 야생형), 및 HBA-23(V80A), HBA-24(V80C)주를, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄ㆍ7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄ㆍ2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁]에 도포하고, 33℃, 15시간 어두운 곳에 정치했다.

상기 플레이트상에서 증식한 Corynebacterium glutamicum/4-HBA 생산 유전자 도입주를 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 액체배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄ㆍ7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄ㆍ2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) 비오틴 용액 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g을 증류수 1L에 용해] 10ml에, 2% 탄산칼슘이 들어있는 시험관에 한 백금이로 식균하고, 33℃, 24시간, 200rpm의 조건하에서 호기적으로 진탕배양을 실시했다.

상기 조건에서 증식하여 얻어진 배양액을 원심 분리(4℃, 15,000rpm, 10분)하고, 얻어진 상청액을 이용하여 4-HBA를 HPLC에 의해 정량했다.

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, HBA-23(V80A)주, HBA-24(V80C)주가 HBA-22(야생형)주 보다도 각각 약 2.3배, 약1.6배 높은 4-HBA 생산농도를 나타냈다.

[표 4]

[실시예 4]

Providencia속 세균 유래의 염색체 DNA의 추출, 4- 히드록시벤조산 생산 유전자(코리스메이트-피루베이트 리아제유전자 )의 클로닝 , 4- 히드록시벤조산 생산 유전자 발현 플라스미드의 구축, 4- 히드록시벤조산 생산 유전자 도입주의 구축, 4-히드록시벤조산 생산 유전자 부위특이적변이 도입주의 구축, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 4- 히드록시벤조산 생산 유전자 도입주에 의한 글 루코스로부터의 4-히드록시벤조산 제조

(1) 미생물로부터의 염색체 DNA의 추출

프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii) ATCC 25827로부터의 염색체 DNA 추출은, ATCC Medium No.3 배지[Peptone 5g, Beef extract 3g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 6.8로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수증식기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 취급설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

프로비덴시아 러스티지아니이(Providencia rustigianii) JCM 3953로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.12 배지[Peptone 5g, Beef extract 3g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0으로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수증식기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 취급설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

에세리키아 콜라이(Escherichia coli) K12 MG1655로부터의 염색체 DNA 추출은, LB배지[Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수증식기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii) JCM 1233로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.12 배지[Peptone 5g, Beef extract 3g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 취급설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

(2) 4- 히드록시벤조산 생산 유전자( 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 유전자)의 클로닝

4-히드록시벤조산 생산 유전자(코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자)를 코딩하는 ubiC 유전자를 포함하는 DNA단편을 이하의 PCR법에 따라 증폭했다.

PCR 시, ubiC 유전자를 클론화할 수 있도록 ubiC 유전자를 포함하는 유전자 서열, 서열번호 11(Providencia stuartii ubiC 유전자), 서열번호 12(Providencia rustigianii ubiC 유전자), 서열번호 17(Escherichia coli ubiC 유전자) 및 서열번호 18(Cronobacter sakazakii ubiC 유전자)를 근거로 하여, 각각 하기 한 쌍의 프라이머를 합성해서 사용했다.

Providencia stuartii ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-21); 5'-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTATCTCTCAC-3' (서열번호 25)

(b-21); 5'-CTCTCATATGTCCCTCCATTTGTTGTGCTC-3' (서열번호 26)

또한, 프라이머(a-21) 및 (b-21)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Providencia rustigianii ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-22); 5'-CTCTCATATGCATGAAACAATTTTTACCCATCATCC-3' (서열번호 27)

(b-22); 5'-CTCTCATATGGATTATGTTAGATAGTTATCTATATGCAGGTG-3' (서열번호 28)

또한, 프라이머(a-22) 및 (b-22)는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Escherichia coli ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-23); 5'-CTCTCATATGTCACACCCCGCGTTAA-3' (서열번호 29)

(b-23); 5'-CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGACGCC-3' (서열번호 30)

또한, 프라이머(a-23) 및 (b-23)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Cronobacter sakazakii ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-24); 5'-CTCTCATATGTCCCATCCCGCGCTGAG-3' (서열번호 31)

(b-24); 5'-CTCTCATATGTATTCTGCGTCAGGCTCCAC-3' (서열번호 32)

또한, 프라이머(a-24) 및 (b-24)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

주형 DNA는, Providencia rustigianii JCM 3953, Providencia stuartii ATCC 25827, Escherichia coli MG 1655, Cronobacter sakazakii JCM 1233에서 추출한 염색체 DNA를 이용했다.

실제 PCR은, Veriti 써머 사이클러(Thermal cycler)(어플라이드바이오시스템즈사제)를 이용하고, 반응 시약으로서 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(다카라바이오주식회사제)를 이용하여, 아래의 조건에서 실시했다.

반응액:

PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl

5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl

dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl

주형 DNA 1μl (DNA 함유량 1μg 이하)

상기 기재된 2종 프라이머*) 각각 1μl (최종 농도 0.2μM)

멸균 증류수 32μl

이상을 혼합하여, 50μl의 반응액을 PCR에 걸었다.

*) Providencia stuartii ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-21)와 (b-21)의 조합, Providencia rustigianii ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-22)와 (b-22)의 조합, Escherichia coli 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-23)와 (b-23)의 조합, Cronobacter sakazakii 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-24)와 (b-24)의 조합으로 실시했다.

PCR 사이클:

변성 과정: 98℃ 10초

어닐링 과정: 50℃ 5초

확장 과정: 68℃

Providencia stuartii ubiC 유전자 32초

Providencia rustigianii ubiC 유전자 31초

Escherichia coli ubiC 유전자 30초

Cronobacter sakazakii ubiC 유전자 32초

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 실시했다.

상기에서 생성한 반응액 10μl을 0.8% 아가로스겔에 의해 전기영동을 실시하여, Providencia stuartii주 유래의 ubiC 유전자, Providencia rustigianii주 유래의 ubiC 유전자, Escherichia coli주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb의 DNA단편을 검출할 수 있었다.

Cronobacter sakazakii주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.6-kb의 DNA단편을 검출할 수 있었다.

각 DNA단편은 NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(다카라바이오주식회사제)에 의해 정제했다.

상기 항에 나타낸 PCR에 따라 증폭한 Providencia stuartii주 유래의 ubiC 유전자, Providencia rustigianii주 유래의 ubiC 유전자, Escherichia coli주 유래의 약 0.5-kb DNA단편, 혹은 Cronobacter sakazakii ubiC 유전자 유래의 약 0.6-kb DNA단편을 포함하는 10μl 및 PgapA 프로모터를 포함하는 클로닝 벡터 pCRB209[국제공개 WO2012/033112] 2μl를 각각 제한효소 NdeI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리함으로써 제한효소를 실활시킨 후, 양자를 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가제 10×완충액 1μl, T4 DNA 리가제(다카라바이오주식회사제) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수에서 10μl으로 하여, 15℃에서 3시간 반응시켜 결합시켰다.

얻어진 라이게이션 액을 염화칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)]에 따라 에세리키아 콜라이 HST02를 형질 전환하여, 카나마이신 50μg/ml을 포함하는 LB 한천배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

각각 배지상의 생육주를 통상적인 방법에 따라 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출, 상기 플라스미드를 제한효소로 각각 절단하여, 삽입단편을 확인했다. 이 결과, 플라스미드 pCRB209 약 5.1-kb의 DNA단편 외에, Providencia stuartii주 유래의 ubiC 유전자의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Providencia rustigianii주 유래의 ubiC 유전자의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Escherichia coli주 유래의 ubiC 유전자의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Cronobacter sakazakii주 유래의 ubiC 유전자의 경우, 길이 약 0.6-kb 삽입단편이 인정되었다.

Providencia stuartii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA42, Providencia rustigianii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA45, Escherichia coli주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA48, Cronobacter sakazakii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA51로 각각 명명했다.

(4) 4- 히드록시벤조산 생산 유전자( 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 유전자) 의 부위 특이적 변이도입 플라스미드의 구축

또한, 상기 플라스미드 pHBA42를 이용하여, V80부위를 A(알라닌), C(시스테인)에 치환한 변이체를 Inverse PCR법에 따라 작성하고, 부위특이적변이가 도입된 플라스미드를 얻어, 이들을 각각 pHBA43, pHBA44로 명명했다.

PCR 시, ubiC유전자의 V80부위에 변이를 도입할 수 있도록 서열번호 11 (Providencia stuartii ubiC 유전자)를 근거로 하여 각각 하기의 프라이머를 합성하여 사용하였다.

Providencia stuartii ubiC 유전자 변이 도입용 프라이머

(a-25); 5'-gcaATTATGTATGGTGATAATATTCCATGGTTACTTG-3' (서열번호 33)

(a-26); 5'-tgcATTATGTATGGTGATAATATTCCATGGTTACTTG-3' (서열번호 34)

(b-25); 5'-TTCACGTAACCAATAATATTCACTGACAG-3' (서열번호 35)

마찬가지로, 상기 플라스미드 pHBA45를 이용하여 V80부위를 A(알라닌), C(시스테인)에 치환한 변이체를 Inverse PCR법에 따라 작성하고, 부위특이적변이가 도입된 플라스미드를 얻어, 이들을 각각 pHBA46, pHBA47로 명명했다.

PCR 시, ubiC유전자의 V80부위에 변이를 도입할 수 있도록 서열번호 12 (Providencia rustigianii ubiC 유전자)를 근거로 하여 각각 하기의 프라이머를 합성하여 사용하였다.

Providencia rustigianii ubiC 유전자 변이 도입용 프라이머

(a-27); 5'-ATTATGTATGGGGATAATATTCCGTGG-3' (서열번호 36)

(b-27); 5'-gcaTTCTCGCAACCAGTAACGTTG-3' (서열번호 37)

(b-28); 5'-tgcTTCTCGCAACCAGTAACGTTG-3' (서열번호 38)

마찬가지로, 상기 플라스미드 pHBA48를 이용하여 I(이소류신)79부위를 A(알라닌), C(시스테인)에 치환한 변이체를 PCR법에 따라 작성하고, 부위특이적변이가 도입된 플라스미드를 얻어, 이들을 각각 pHBA49, pHBA50로 명명했다.

PCR 시, ubiC유전자의 I(이소류신)79부위에 변이를 도입할 수 있도록 서열번호 17 (Escherichia coli ubiC 유전자)를 근거로 하여 각각 하기의 프라이머를 합성하여 사용하였다.

Escherichia coli ubiC 유전자 변이 도입용 프라이머

(a-29); 5'-gcaTTGTTATGTGCCGATGGTGAAC-3' (서열번호 39)

(a-30); 5'-tgcTTGTTATGTGCCGATGGTGAAC-3' (서열번호 40)

(b-29); 5'-TTCACGTAACCAGTAACGAGAC-3' (서열번호 41)

마찬가지로, 상기 플라스미드 pHBA51를 이용하여 I79부위를 A(알라닌), C(시스테인)에 치환한 변이체를 PCR법에 따라 작성하고, 부위특이적변이가 도입된 플라스미드를 얻어, 이들을 각각 pHBA52, pHBA53로 명명했다.

PCR 시, ubiC유전자의 I79부위에 변이를 도입할 수 있도록 서열번호 18 (Cronobacter sakazakii ubiC 유전자)를 근거로 하여 각각 하기의 프라이머를 합성하여 사용하였다.

Cronobacter sakazakii ubiC 유전자 변이 도입용 프라이머

(a-31); 5'-gcaCTGCTGTGCGGCGACG-3' (서열번호 42)

(a-32); 5'-tgcCTGCTGTGCGGCGACG-3' (서열번호 43)

(b-31); 5'-TTCGCGCAGCCAGTAGCG-3' (서열번호 44)

반응액:

PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl

5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl

dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl

주형 DNA 1μl (DNA 함유량 1μg 이하)

상기 기재된 2종 프라이머*) 각각 1μl (최종 농도 0.2μM)

멸균 증류수 32μl

이상을 혼합하여, 이 50μl의 반응액을 PCR에 걸었다.

*) pHBA43를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-25)와 (b-25)의 조합, pHBA44를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-26)와 (b-25)의 조합, pHBA46를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-27)와 (b-27)의 조합, pHBA47를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-27)와 (b-28)의 조합, pHBA49를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-29)와 (b-29)의 조합, pHBA50를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-30)와 (b-29)의 조합, pHBA52를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-31)와 (b-31)의 조합, pHBA53를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-32)와 (b-31)의 조합으로 실시했다.

PCR 사이클:

변성 과정: 98℃ 10초

어닐링 과정: 50℃ 5초

확장 과정: 68℃

Providencia stuartii (pHBA43,pHBA44) 339초

Providencia rustigianii (pHBA46,pHBA47) 338초

Escherichia coli (pHBA49,pHBA50) 337초

Cronobacter sakazakii (pHBA52,pHBA53) 339초

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 실시했다.

상기에서 생성한 반응액 10μl을 0.8% 아가로스겔에 의해 전기영동을 실시하여, Providencia stuartii주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 5.7-kb, Providencia rustigianii주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 5.6-kb, Escherichia coli주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 5.6-kb, Cronobacter sakazakii주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 5.7-kb의 DNA단편을 검출할 수 있었다. 각 DNA단편은 NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(다카라바이오주식회사제)에 의해 정제했다.

정제한 증폭산물을 T4 Polynucleotide Kinase(다카라바이오주식회사제)를 이용하여 인산화처리를 한 후, NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(다카라바이오주식회사제)에 의해 정제했다. 얻어진 인산화처리된 DNA단편을 이용하여 DNA Ligation Kit(다카라바이오주식회사제)에 의해 결합(self-ligation)시켰다. 얻어진 라이게이션 액을 염화칼슘법 [J. mol. Biol. 53 : 159-162 (1970)]에 따라 에세리키아 콜라이 HST02를 형질 전환하여, 카나마이신 50μg/ml을 포함하는 LB 한천배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨 및 1.5% 한천]에 도포하였다. 배지상의 생육주를 통상적인 방법에 따라 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출, 상기 플라스미드의 염기서열을 서열 분석함으로써, ubiC 유전자의 V80 부위에의 변이도입을 확인했다.

얻어진 플라스미드를 pHBA43, pHBA44, pHBA46, pHBA47, pHBA49, pHBA50, pHBA52, pHBA53로 명명했다. 또한, 본 플라스미드의 유전자 재조합의 개요는, 표 5에 정리하여 나타냈다.

[표 5]

도입한 변이의 종류의 란 A는 알라닌에의 변이를 나타내고, C는 시스테인에의 변이를 나타낸다. 또한, V는 발린의 변이를 나타내고, I는 이소류신의 변이를 나타낸다.

또한, 80은 아미노산 번호 80을 나타내며, 79는 아미노산 번호 79를 나타낸다.

(5) 4- 히드록시벤조산 생산 유전자( 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 유전자) 도입주의 구축

상기 플라스미드 pHBA42, pHBA43, pHBA44, pHBA45, pHBA46, pHBA47, pHBA48, pHBA49, pHBA50, pHBA51, pHBA52 및 pHBA53을 이용하여, 전기펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447 (1990) 및 Res. Microbiol., Vol. 144, 181-185 (1993)]에 따라, 코리네박테리움 글루타미쿰 R주를 형질 전환하여, 카나마이신 50μg/ml을 포함하는 A 한천배지에 도포했다.

이 배지상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출, 상기 플라스미드를 제한효소로 절단하여, 삽입 플라스미드를 확인했다. 이 결과, 상기에서 제작된 플라스미드 pHBA42, pHBA43, pHBA44, pHBA45, pHBA46, pHBA47, pHBA48, pHBA49, pHBA50, pHBA51, pHBA52 및 pHBA53의 도입이 인정되었다.

얻어진 주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) HBA42, HBA43, HBA44, HBA45, HBA46, HBA47, HBA48, HBA49, HBA50, HBA51, HBA52 및 HBA53으로 명명했다. 또한, 본 플라스미드의 유전자 재조합의 개요는, 표 6에 정리하여 나타냈다.

[표 6]

상기 얻어진 Corynebacterium glutamicum/4-HBA 생산 유전자 도입주(HBA42, HBA43, HBA44, HBA45, HBA46, HBA47, HBA48, HBA49, HBA50, HBA51, HBA52 및 HBA53)를, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁]에 도포하고, 33℃, 15시간 어두운 곳에 정치(置)했다.

상기 플레이트상에서 증식한 Corynebacterium glutamicum/4-HBA 생산 유전자 도입주를 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 액체배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g을 증류수 1L에 용해] 10ml에 2% 탄산칼슘이 들어있는 시험관에 한 백금이로 식균하고, 33℃에서 24시간, 호기적으로 진탕배양했다.

상기 조건으로 증식되어 얻어진 배양액을 원심 분리(4℃, 15,000rpm, 10분)하고, 얻어진 상청액을 이용하여 4-HBA를 HPLC에 의해 정량했다.

이 결과, Corynebacterium glutamicum HBA-1, HBA-42~53주는, 모두 표 7에 나타낸 바와 같이 목적으로 하는 4-HBA를 생성했다. Providencia stuartii 유래의 ubiC 변이 도입주 중, HBA-43(V80A), HBA-44(V80C)주에 의한 4-HBA 생성 능력은 HBA-42(야생형)보다도 증대하였고, 우수했다. Providencia rustigianii 유래의 ubiC 변이 도입주 중, HBA-46(V80A), HBA-47(V80C)주에 의한 4-HBA 생성 능력은 HBA-45(야생형)보다도 증대하였고, 우수했다. Escherichia coli 유래의 ubiC 변이 도입주 중, HBA-49(I79A), HBA-50(I79C)에 의한 4-HBA 생성 능력은 HBA-48(야생형)보다도 증대하였고, 우수했다.

Cronobacter sakazakii 유래의 ubiC 변이 도입주 중, HBA-52(I79A), HBA-53(I79C)주에 의한 4-HBA 생성 능력은 HBA-51(야생형)보다도 증대하였고, 우수했다. 또한, 동일한 실험을 Corynebacterium glutamicum 야생주(빈 벡터만을 갖는 컨트롤)에 대해 실시했을 때, 4-HBA 생성은 인정되지 않았다.

배양상청 중의 가장 4-HBA 생성 능력이 우수한 것은 Providencia rustigianii 유래 ubiC의 V80C 변이체를 고발현시킨 재배열주였다(HBA-47주).

이상으로, V80에서의 변이(V80A, V80C)가 코리스메이트-피루베이트 리아제 효소활성을 증대시키는 것이, Pantoea ananatis, Providencia stuartii, Providencia rustigianii 및 Cronobacter sakazakii 유래의 ubiC 변이체 분석에 의해 나타났다.

게다가, Escherichia coli 및 Cronobacter sakazakii 유래 ubiC의 경우는 상동성 비교에 의해, 상기 V80에 해당하는 아미노산 잔기가 I79이지만, 상기 부위에 있어서의 같은 변이(I79A, I79C)가 상기와 마찬가지로 코리스메이트- 피루베이트 리아제 효소활성을 증대시키는 것이 나타났다. 상기 부위에 있어서, 상기 변이는 많은 코리스메이트-피루베이트 리아제 효소활성을 증대시키는 중요한 변이이며, 또한 상기 변이체를 고발현시킨 코리네 박테리움 글루타미쿰 재조합주는 4-HBA의 생성 능력이 증대하는 것이 증명되었다.

[표 7]

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) HBA-47는, 일본 치바현 기사 라즈시 카즈사카마타리 2-5-8(우편번호 292-0818)의 독립행정법인 제품 평가 기술 기반기구 특허 미생물 기탁센터에 기탁했다(일본 내 기탁의 수탁일: 2014년 4월 25일, 수탁번호: NITE BP-01849). 이 주는, 부다페스트 조약 하에서 국제 기탁되어 있고, 37 CFR1.808에 규정된 조건하에서 공개적으로 이용 가능하다.

본 발명을 이용한다면, 미생물을 이용하여 실용적인 효율로 글루코스 등으로부터 4-HBA을 제조할 수 있다.

<110> Green Phenol Technology Research Association <120> CORYNEFORM BACTERIUM TRANSFORMANT HAVING HIGH LEVEL EXPRESSION OF HIGHLY ACTIVE VARIANT ENZYME AND PRODUCTION METHOD FOR 4-HYDROXYBENZOIC ACID USING SAME OR FOR SALT THEREOF <130> P16-4191 <150> JP 2014100875 <151> 2014-05-14 <160> 44 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 170 <212> PRT <213> Pantoea ananatis <400> 1 Met Thr Gln Asp Pro Leu Arg Ser Leu Arg Ser Leu Asn Trp Leu Ala 1 5 10 15 Leu Asp Asp Ala Ala Leu Thr Gln Pro Leu Arg Asp Trp Leu Met Glu 20 25 30 Glu Asp Ser Met Thr Arg Arg Phe Glu Gln His Cys Gln Lys Val Arg 35 40 45 Val Glu Pro Val Arg Glu Asp Phe Ile Ser Ala Asp Glu Leu Gly Asp 50 55 60 Glu Gly Ala Leu Leu Pro Ala Asp Gln Arg Phe Trp Leu Arg Glu Val 65 70 75 80 Ile Leu Tyr Gly Asp Glu Glu Pro Trp Leu Ala Gly Arg Thr Leu Val 85 90 95 Pro Glu Ser Thr Leu Asn Gly Pro Glu Ala Met Leu Gln Gln Leu Gly 100 105 110 Thr Arg Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Ser Ser Ser Thr Leu Thr Arg 115 120 125 Asp Phe Ile Glu Pro Gly Arg Val 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Ile Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Ile Thr Gln Asp Lys Leu Ser Ala Asp 50 55 60 Glu Met Leu Ser Leu Pro Glu Ser Gln Arg Tyr Trp Val Arg Glu Val 65 70 75 80 Val Met Tyr Gly Asp Gly Ile Pro Trp Leu Leu Gly Arg Thr Ile Ile 85 90 95 Pro Glu Glu Thr Leu Thr Asp Asp Asp Gln Gln Leu Val Asp Ile Gly 100 105 110 Arg Met Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Ser Arg Asp Ser Leu Thr Arg 115 120 125 Asp Tyr Ile His Ile Gly Ser Cys Ala Asn Arg Trp Val Arg Cys Ser 130 135 140 Arg Leu Arg Leu Ser Asp Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Ile Phe Leu 145 150 155 160 Pro Glu Ser Pro Ala Tyr Arg 165 <210> 6 <211> 167 <212> PRT <213> Providencia alcalifaciens <400> 6 Met His Glu Thr Ile Phe Thr Ser His Pro Ile Ser Trp Phe Val Glu 1 5 10 15 Gly Glu Glu Ser Val Pro Glu Asn Val Leu Gly Trp Leu Gln Glu Gln 20 25 30 Arg Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln His Cys Gln Lys Val Thr Val 35 40 45 Ile Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Ile Ser Leu Asp Met Leu Thr Thr Asp 50 55 60 Glu Gln Lys Cys Leu Pro Ile Ser Glu Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Val 65 70 75 80 Ile Met Tyr Gly Asp Asn Ile Pro Trp Leu Ile Gly Arg Thr Leu Ile 85 90 95 Pro Glu Glu Thr Leu Thr Asp Asn Asp Lys Lys Leu Val Glu Leu Gly 100 105 110 Arg Val Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Ser His Glu His Leu Thr Arg 115 120 125 Asp Tyr Ile Glu Met Gly Thr Ser Ala Asp Arg Trp Val Arg Arg Ser 130 135 140 Leu Leu Arg Leu Ser Gln Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Ile Phe Leu 145 150 155 160 Pro Glu Ser Pro Ala Tyr Arg 165 <210> 7 <211> 168 <212> PRT <213> Providencia burhodogranariea <400> 7 Met Asp Glu Thr Leu Phe Thr Ser His Pro Ile Thr Trp Leu Pro Glu 1 5 10 15 Ala Asp Asp Leu Val Pro Asp Asn Ile Leu Asp Trp Leu His Glu Leu 20 25 30 Gly Ser Met Thr Lys Arg Leu Glu Gln His Cys Gln Cys Val Thr Val 35 40 45 Ile Pro Cys Ala Gln Arg Tyr Val Thr Lys Glu Ala Leu Ser Asp Asp 50 55 60 Glu Thr Gln Cys Leu Pro Val Ser Glu Tyr Tyr Trp Leu Arg Glu Val 65 70 75 80 Ile Met Tyr Gly Asp Asn Ile Pro Trp Leu Leu Gly Arg Thr Leu Ile 85 90 95 Pro Gln Glu Thr Leu Thr Gly Glu Asp Gln Lys Leu Ile Asp Ile Gly 100 105 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Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu Pro 145 150 155 160 Ala Ser Pro Leu Tyr 165 <210> 9 <211> 169 <212> PRT <213> Cronobacter sakazakii <400> 9 Met Ser His Pro Ala Leu Arg Gln Leu Arg Ala Leu Ser Phe Phe Asp 1 5 10 15 Asp Ile Ser Thr Leu Asp Ser Ser Leu Leu Asp Trp Leu Met Leu Glu 20 25 30 Asp Ser Met Thr Arg Arg Phe Glu Gly Phe Cys Glu Arg Val Thr Val 35 40 45 Asp Met Leu Phe Glu Gly Phe Val Gly Pro Glu Ala Leu Glu Glu Glu 50 55 60 Gly Glu Phe Leu Pro Asp Glu Pro Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Ile Leu 65 70 75 80 Leu Cys Gly Asp Gly Val Pro Trp Leu Val Gly Arg Thr Leu Val Pro 85 90 95 Glu Ser Thr Leu Cys Gly Pro Glu Leu Ala Leu Gln Gln Leu Gly Thr 100 105 110 Thr Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser Thr Leu Thr Arg Asp 115 120 125 Phe Ile Gln Pro Gly Arg Ser Asp Glu Leu Trp Gly Arg Arg Ser Leu 130 135 140 Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu Pro 145 150 155 160 Ala Ser Pro Leu Tyr Gly Glu Glu Lys 165 <210> 10 <211> 513 <212> DNA <213> Pantoea 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cttggacgaa cgttaattcc acaggagaca 300 ttgactggtg aagaccggaa acttattgat atcggtgctg taccgttagg gcgttatctc 360 tttagccatg ataatctttc ccgtgattat attcatatag ggcagcaaaa tttgcgatgg 420 atccgccgct ctctattaag attatctgaa aaacctttat tattaaccga actgttttta 480 cctgaatcac ctgcatataa aagataa 507 <210> 12 <211> 504 <212> DNA <213> Providencia rustigianii <400> 12 atgcatgaaa caatttttac ccatcatccc attgattggc taaacgagga tgatgagtca 60 gttcctaaca gtgtactaga ttggctgcaa gagcgtggtt caatgactaa acggttcgag 120 cagcattgcc aaaaagtcac ggtaattccc tatttagagc gctatatcac tccagagatg 180 ctgagcgctg atgaagccga gcgtttaccc gaaagtcaac gttactggtt gcgagaagtc 240 attatgtatg gggataatat tccgtggttg ataggcagaa cattgatccc tgaagagacc 300 ctcaccaacg atgataaaaa gctggtggac attggtcgtg tgccattagg gcgttacctt 360 tttagtcatg atagtcttac ccgagattat attgatattg gcaccagtgc ggatcgttgg 420 gtgcgacgtt ctctgctgag attatctcaa aagcccttat tattaactga aatattttta 480 cctgaatcac ctgcatatag ataa 504 <210> 13 <211> 507 <212> DNA <213> Providencia sneebia <400> 13 atggatgata cgctttttac ctctcacccg ataacatggt tatcagagac tgataatgtt 60 attcctgaaa atatgttaag ttggttacaa gaactcgggt caatgacaaa gcgcttagaa 120 caatattgcc agtctttgac tgtcacccct tatgtgcaaa aatatgtttc cagaaacatg 180 ctgagtgatg atgaagctca atgtttacct gaaagctcaa gttattggct aagagaagtg 240 attatctatg gggataatat cccttggttg ctagggcgaa cgctaattcc gcaagaaaca 300 ttgagtggcg atgaccaaag aattgtcgat attggtacgc tgcctttagg ccgttatcta 360 tttagtcatg ataatctgac tcgtgattat attcatattg ggcaacagga gcagcgatgg 420 ctgcgtcgtt cgcgattaag gctatcgaat aatcctttat tattaactga attgttttta 480 cctgaatcac ctgcatataa aagataa 507 <210> 14 <211> 504 <212> DNA <213> Providencia rettgeri <400> 14 atggatgaaa cgctttttac ttctcagccg attcactggc tggcggagaa cgataaaata 60 gtgcctgcca atgtattaga ttggctatta gagctcggct ccatgacaaa acgttttgag 120 cagcatagcc agcaagttac cgtgatacct tatttagagc gctatataac acaagataag 180 ctgagtgcag atgaaatgct gtctttacct gaaagccaac gttattgggt cagagaagtt 240 gtcatgtatg gagatggtat cccttggtta ctgggccgaa cgataatccc tgaagaaaca 300 ctgactgatg atgaccagca actggtagat attgggagaa tgccgttagg gcgttattta 360 tttagccgtg acagcttaac tcgagattat attcatattg gttcttgcgc aaaccgttgg 420 gtacgttgtt ctcggttaag attatcggat aaacccttac tattaacaga aatattttta 480 cctgaatcac ctgcatatcg ttaa 504 <210> 15 <211> 504 <212> DNA <213> Providencia alcalifaciens <400> 15 atgcatgaaa cgatttttac ctctcatcct ataagttggt tcgtagaagg cgaagagagt 60 gttcctgaaa atgtattagg ttggttgcaa gagcaaaggt cgatgaccaa acggtttgag 120 cagcattgtc agaaagtgac ggtgatacct tatttagaac gctatatctc actggatatg 180 ctcaccaccg acgaacaaaa atgcttacca attagtgagc gttattggct acgggaagtg 240 attatgtatg gggataatat cccttggttg attggcagaa cgctgatccc agaagagacg 300 ctcaccgata atgacaaaaa attagtcgag cttgggcgag tcccattagg gcgctatctc 360 tttagtcatg aacacctaac ccgagattat attgaaatgg gcaccagtgc tgaccgctgg 420 gttcgccgtt ccttacttag actgtcccaa aaaccattat tattaaccga aatattttta 480 cctgaatcac ctgcatatag ataa 504 <210> 16 <211> 507 <212> DNA <213> Providencia burhodogranariea <400> 16 atggatgaaa cgctttttac ctctcacccg ataacgtggc taccagaggc cgatgacctt 60 gttcctgata atattttaga ctggttgcat gagcttgggt caatgacaaa acgtttagag 120 cagcactgcc agtgtgttac cgttatccct tgtgcgcagc gatatgtgac taaagaagct 180 ctcagtgatg atgaaactca atgtttaccg gtgagtgagt actattggtt acgggaggtt 240 attatgtatg gtgataatat tccctggtta ctcggccgaa cactaattcc gcaagaaaca 300 ttgaccggtg aagaccaaaa gctcattgat attggtgctg taccattagg gcgttatcta 360 tttagtcatg ataatcttac ccgggattat attcatatag ggcagcaaaa ttctcgatgg 420 ctccgtcgct ctcgattaag gttatcaaac aaaccgttat tattaactga attattttta 480 cctgaatcac ctgcttataa aagataa 507 <210> 17 <211> 498 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 17 atgtcacacc ccgcgttaac gcaactgcgt gcgctgcgct attgtaaaga gatccctgcc 60 ctggatccgc aactgctcga ctggctgttg ctggaggatt ccatgacaaa acgttttgaa 120 cagcagggaa aaacggtaag cgtgacgatg atccgcgaag ggtttgtcga gcagaatgaa 180 atccccgaag aactgccgct gctgccgaaa gagtctcgtt actggttacg tgaaattttg 240 ttatgtgccg atggtgaacc gtggcttgcc ggtcgtaccg tcgttcctgt gtcaacgtta 300 agcgggccgg agctggcgtt acaaaaattg ggtaaaacgc cgttaggacg ctatctgttc 360 acatcatcga cattaacccg ggactttatt gagataggcc gtgatgccgg gctgtggggg 420 cgacgttccc gcctgcgatt aagcggtaaa ccgctgttgc taacagaact gtttttaccg 480 gcgtcaccgt tgtactaa 498 <210> 18 <211> 510 <212> DNA <213> Cronobacter sakazakii <400> 18 atgtcccatc ccgcgctgag acaactgcgc gcgttgtcct tttttgacga tatcagcacg 60 cttgatagtt cgctgctcga ctggctgatg ctggaagatt ccatgacccg ccgtttcgaa 120 ggcttttgcg agcgcgtgac ggtcgacatg ctgtttgagg gctttgtcgg ccccgaggcg 180 ctggaggaag agggcgagtt tttgcctgat gagccgcgct actggctgcg cgaaatcctg 240 ctgtgcggcg acggcgtgcc gtggctggtt gggcgcacgc tggtgccgga gtctacactt 300 tgtgggccgg agctggcgtt gcagcagctc ggtaccacgc cgctgggccg ttatctgttt 360 acctcatcca ccctcacgcg tgattttatc cagccgggcc gcagcgacga actctgggga 420 cgccgctctc tgctgaggct ttccggcaaa ccgctgctgc tgactgaact gtttttacct 480 gcatcaccct tgtacggaga ggaaaaataa 510 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 ctctcatatg acgcaagacc cgct 24 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 ctctcatatg ttaaccttga tcacgataga gcg 33 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 cgagaagcaa ttctctacgg ggatg 25 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 cagccagaaa cgctgatcg 19 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 tgcattctct acggggatga gg 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 ttctcgcagc cagaaacgct g 21 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 ctctcatatg gatgaaacgc tttttatctc tcac 34 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 26 ctctcatatg tccctccatt tgttgtgctc 30 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 ctctcatatg catgaaacaa tttttaccca tcatcc 36 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 28 ctctcatatg gattatgtta gatagttatc tatatgcagg tg 42 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 29 ctctcatatg tcacaccccg cgttaa 26 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 30 ctctcatatg ttagtacaac ggtgacgcc 29 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 ctctcatatg tcccatcccg cgctgag 27 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 32 ctctcatatg tattctgcgt caggctccac 30 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 gcaattatgt atggtgataa tattccatgg ttacttg 37 <210> 34 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 34 tgcattatgt atggtgataa tattccatgg ttacttg 37 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 35 ttcacgtaac caataatatt cactgacag 29 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 36 attatgtatg gggataatat tccgtgg 27 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 37 gcattctcgc aaccagtaac gttg 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 38 tgcttctcgc aaccagtaac gttg 24 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 39 gcattgttat gtgccgatgg tgaac 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 40 tgcttgttat gtgccgatgg tgaac 25 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 41 ttcacgtaac cagtaacgag ac 22 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 42 gcactgctgt gcggcgacg 19 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 43 tgcctgctgt gcggcgacg 19 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 44 ttcgcgcagc cagtagcg 18

Claims

하기의 (A) 또는 (B)의 코리스메이트-피루베이트 리아제:
(A) 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제(ubiC)에 있어서 아미노산 번호 80의 발린을, 1개의 알라닌 또는 시스테인으로 치환시킨 변이 코리스메이트-피루베이트 라아제,
(B) (i) 프로비덴시아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서, 아미노산 번호 80의 발린(V),
(ⅱ) 에세리키아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서, 아미노산 번호 79의 이소류신(I), 또는
(ⅲ) 크로노박터속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제에 있어서 아미노산 번호 79의 이소류신(I)이,
1개의 알라닌 또는 시스테인으로 치환된, 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제.
삭제
청구항 1에 있어서, 하기의 (a)의 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린, 서열번호 2의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린, 서열번호 3의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 러스티기아니(Providencia rustigianii) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린, 서열번호 4의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스니비아(Providencia sneebia) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린, 서열번호 5의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린, 서열번호 6의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens)유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린, 혹은 서열번호 7의 아미노산 서열로부터 이루어진 프로비덴시아 버호도그라나리에아(Providencia burhodogranariea) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 80의 발린,
서열번호 8의 아미노산 서열로부터 이루어진 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 79의 이소류신, 또는
서열번호 9의 아미노산 서열로부터 이루어진 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제의 아미노산 번호 79의 이소류신을,
1개의 알라닌 또는 시스테인으로 치환시킨, 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제.
삭제
청구항 1 또는 3에 따른 변이 코리스메이트-피루베이트 리아제를 코딩하는 DNA를 숙주인 코리네형 세균에 도입한 형질 전환체.
청구항 5에 있어서, 숙주인 코리네형 세균이 코리네박테리움 속 세균인 형질 전환체.
청구항 6에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰속 세균이, 코리네박테리움 R(FERM BP-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869인 형질 전환체.
하기의 (C) 또는 (D)의 변이 DNA를 숙주인 코리네형 세균에 도입한 형질 전환체:
(C) 서열번호 10의 염기서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제(ubiC) 유전자에 있어서, 염기번호 238~240의 gtc를, 1개의 알라닌 또는 시스테인을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA,
(D) (ⅳ) 프로비덴시아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 238~240의 발린을 코딩하는 DNA 부분,
(ⅴ) 에세리키아속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 235~237의 이소류신을 코딩하는 DNA 부분, 또는
(ⅵ) 크로노박터속 세균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 235~237의 이소류신을 코딩하는 DNA 부분을,
1개의 알라닌 또는 시스테인을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA.
삭제
청구항 8에 있어서, 변이 DNA가 하기의 (d)인 형질 전환체:
(d) 서열번호 10의 염기서열로부터 이루어진 판토에아 아나나티스 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기번호 238~240의 gtc, 서열번호 11의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스투아르티 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기번호 238~240의 gtc, 서열번호 12의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 러스티기아니 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기번호 238~240의 gtc, 서열번호 13의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 스니비아 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기번호 238~240의 gtg, 서열번호 14의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 레트게리 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기번호 238~240의 gtt, 서열번호 15의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 알칼리파시엔스 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기번호 238~240의 gtg, 혹은 서열번호 16의 염기서열로부터 이루어진 프로비덴시아 버호도그라나리에아 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기번호 238~240의 gtt를, 1개의 알라닌 또는 시스테인을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA,
서열번호 17의 염기서열로부터 이루어진 에세리키아 콜라이 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 235~237의 att를, 1개의 알라닌 또는 시스테인을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA, 또는
서열번호 18의 염기서열로부터 이루어진 크로노박터 사카자키 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자의 염기 번호 235~237의 atc를, 1개의 알라닌 또는 시스테인을 코딩하는 DNA 부분으로 치환시킨 변이 DNA.
청구항 8 또는 10에 있어서, 치환에 의해 생성되는 DNA가 gca 또는 tgc인 형질 전환체.
청구항 8 또는 10에 있어서, 숙주인 코리네형 세균이 코리네박테리움 속 세균인 형질 전환체.
청구항 12에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 속 세균이, 코리네박테리움 글루타미쿰 R(FERM BP-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869인 형질 전환체.
코리네박테리움 글루타미쿰 HBA-47 (수탁번호 : NITE BP-01849) 형질 전환체.
청구항 8, 10 및 14 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체를, 당류, 형질 전환체가 대사에 의해 코리스미산을 생성할 수 있는 화합물, 및 코리스미산, 및 그들의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 원료 화합물을 포함하는 반응액 중에서 배양하는 공정과, 반응액 중 4-히드록시벤조산 또는 그 염을 회수하는 공정을 포함하는 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 제조 방법.
청구항 15에 있어서, 호기적, 또는 형질 전환체가 증식하지 않는 조건 하에서 형질 전환체를 배양하는 방법.