CN106459958A

CN106459958A - 使高活性突变型酶高表达的棒状细菌转化体及使用它的4‑羟基苯甲酸或其盐的制造方法

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Publication number: CN106459958A
Application number: CN201580024075.6A
Authority: CN
Inventors: 汤川英明; 乾将行; 平贺和三; 须田雅子; 桥本龙马
Original assignee: GREEN PHENOL TECHNOLOGY RES ASS
Current assignee: GREEN PHENOL TECHNOLOGY RES ASS
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2035-05-13
Also published as: US20170073658A1; US20190136222A1; WO2015174446A1; EP3147360A1; US10738296B2; KR20170002451A; CN106459958B; EP3147360B1; KR102305413B1; EP3147360A4; JPWO2015174446A1; US10221409B2; JP6327654B2

Abstract

一种下述的(A)或(B)的分支酸‑丙酮酸裂解酶突变体，在实用上能够充分且效率良好地生产4‑羟基苯甲酸或其盐。(A)在由序列号1的氨基酸序列构成的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的分支酸‑丙酮酸裂解酶(ubiC)中，氨基酸序号80的缬氨酸被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸‑丙酮酸裂解酶突变体；(B)在其他分支酸‑丙酮酸裂解酶中，与上述缬氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸‑丙酮酸裂解酶突变体。

Description

使高活性突变型酶高表达的棒状细菌转化体及使用它的4-羟基苯甲酸或其盐的制造方法

技术领域

本发明提供一种为提高4-羟基苯甲酸或其盐(以下，有时简称为“4-HBA”)生产率而改变的酶突变体、通过使该酶突变体高表达而4-HBA生产率得到提高的棒状细菌转化体、以及使用该转化体的高效的4-HBA的制造方法。

背景技术

在全球变暖和石化资源枯竭问题的背景下，以可再生的生物量资源为原料的化学品的制造作为面向实现低碳社会的新产业而受到关注。

4-HBA为利用于液晶的聚合物原料、作为抗菌剂的对羟基苯甲酸酯的合成原料等的有用的化学物质。

目前，4-HBA以原油为原料用化学手段来生产。化学手段的4-HBA制造方法，例如存在使用苯酚、氢氧化钾和二氧化碳在高压条件下反应的方法等。

这种方法不仅作为原料的苯酚依赖于化石原料，而且在反应工艺中需要强碱和二氧化碳、高温高压条件，会产生在制造过程中产生的有害废液等，而对环境造成很大的负担。

因此，强烈希望确立一种以可再生资源为原料，节约能源且削减有害废液的环境和谐型的利用生物法的4-HBA制造技术。

但是，以往的以可再生资源为原料的生物法进行的4-HBA的生产，与乳酸、乙醇的生产相比较，由于作为原料的糖的代谢反应阶段非常多，因此生产率低。另外，存在作为产物的4-HBA造成的细菌的增殖抑制、细胞毒性等难点。因此，无法实现工业性的生产。

使用大肠杆菌能够明确4-HBA由分支酸-丙酮酸裂解酶合成，所述分支酸-丙酮酸裂解酶从作为芳香族氨基酸等的合成相关的莽草酸途径的中间体的分支酸被ubiC编码(非专利文件1、2、专利文件1、2)。

迄今为止，报告了尝试将大肠杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因(ubiC)导入作为宿主的其他种类微生物的克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)来生成4-HBA的尝试(非专利文件3)。另外，报告了以增强了莽草酸途径的大肠杆菌发酵生产4-HBA(非专利文件4)。为了尝试4-HBA造成的增殖抑制、毒性避免，虽然报告了4-HBA抗性品系选育、离子交换树脂添加培养，但是4-HBA的生产率在实用上并不充分(非专利文件2)。

另外，关于大肠杆菌以外的ubiC，报告了类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)来源的ubiC，但不管以大肠杆菌为宿主使该基因高表达时、还是以类球红细菌为宿主使该基因高表达时，不管使用哪种转化体，4-HBA的生成均为低浓度，实用上并不能满足(专利文件3)。另外，虽然记载了该基因可与大肠杆菌的ubiC基因缺失株互补，但是既没有酶活性值和酶的诸性质相关的描述，也没有与其他生物来源的酶的比较相关的具体的描述。

已知对大肠杆菌来源的UbiC酶详细进行了酶学分析，其被作为产物的4-HBA强烈抑制(产物抑制)(非专利文件2、5)。因此，为了4-HBA高生产，高活性的UbiC的获取、对于4-HBA造成的产物抑制具有抗性的UbiC的获取，对于4-HBA高生产株构建极为重要。

非专利文件1：J.Bacteriol.,174,5309-5316(1992)

非专利文件2：Microbiology,140,897-904(1994)

非专利文件3：Appl.Microbiol.Biotechnol.,43,985-988(1995)

非专利文件4：Biotechnol.Bioeng.,76,376-390(2001)

非专利文件5：Biochimica et Biophysica Acta，1594,160-167(2002)

专利文件1：美国专利6030819号

专利文件2：美国专利6114157号

专利文件3：日本特开2012-183048号

发明内容

本发明的课题在于提供在具有实用上足够高的4-HBA生成活性的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体、能够通过使该酶高表达从而高效地生产4-HBA的转化体、以及能够使用该转化体高效地制造4-HBA的方法。

为了解决上述课题，本发明人等反复进行了研究，发现了通过将如以下(A)或(B)取代为其他氨基酸这样的突变导入其ubiC基因，从而可得到由葡萄糖、分支酸等生产4-HBA的能力得到提高的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，

(A)由序列号1的氨基酸序列构成的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)的氨基酸序号80的缬氨酸、或者

(B)在其他分支酸-丙酮酸裂解酶中，与上述缬氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸。

本发明是基于上述发现而完成的，提供以下的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体、转化体及4-HBA的制造方法。

第1项.一种下述的(A)或(B)的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，

(A)在由序列号1的氨基酸序列构成的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)中，氨基酸序号80的缬氨酸被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体

(B)在其他分支酸-丙酮酸裂解酶中，与上述缬氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体。

第2项.根据第1项所述的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，其中，所述(B)的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体为

(i)在普罗威登斯菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶中，氨基酸序号80的缬氨酸(V)被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体、

(ii)在埃希氏菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶中，氨基酸序号79的异亮氨酸(I)被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体、或者

(iii)在克罗诺杆菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶中，氨基酸序号79的异亮氨酸(I)被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体。

第3项.根据第1项所述的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，其中，其为下述的(a)、(b)或(c)，

(a)由序列号1的氨基酸序列构成的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号80的缬氨酸、由序列号2的氨基酸序列构成的斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号80的缬氨酸、由序列号3的氨基酸序列构成的拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号80的缬氨酸、由序列号4的氨基酸序列构成的斯尼比普罗威登斯菌(Providencia sneebia)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号80的缬氨酸、由序列号5的氨基酸序列构成的雷极普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号80的缬氨酸、由序列号6的氨基酸序列构成的产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号80的缬氨酸或由序列号7的氨基酸序列构成的布氏普罗威登斯菌(Providencia burhodogranariea)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号80的缬氨酸被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体、

由序列号8的氨基酸序列构成的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号79的异亮氨酸被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体、或者

由序列号9的氨基酸序列构成的阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号79的异亮氨酸被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体；

(b)保持通过取代生成的所述氨基酸部分，并由与序列号1～9中的任一个具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体；

(c)在由与序列号1～9中的任一个具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽中，将与序列号1～7中的任一个的氨基酸序号80的缬氨酸、或者序列号8或9的氨基酸序号79的异亮氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体。

第4项.根据第1～3项中任一项所述的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，其中，通过取代生成的氨基酸为一个，该氨基酸为丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸。

第5项.一种转化体，其为将编码第1～4项中任一项的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体的DNA导入宿主棒状细菌的转化体。

第6项.根据第5项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为棒状杆菌属细菌。

第7项.根据第6项所述的转化体，其中，谷氨酸棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌R(FERM BP-18976)、ATCC13032或ATCC13869。

第8项.一种转化体，其为将下述的(C)或(D)的DNA突变体导入宿主棒状细菌的转化体，

(C)在由序列号10的碱基序列构成的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)基因中，将碱基号240～242的gtc取代为编码与其编码的氨基酸不同的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体；

(D)在编码其他分支酸-丙酮酸裂解酶的基因中，将与上述gtc对应的位置的DNA部分取代为编码与其编码的氨基酸不同的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体。

第9项.根据第8项所述的转化体，其中，上述(D)的DNA突变体为

(iv)将普罗威登斯菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因的碱基号240～242的gtc取代为编码与其编码的氨基酸不同的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体、

(v)将埃希氏菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因的碱基号237～239的atc取代为编码与其编码的氨基酸不同的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体、或者

(vi)将克罗诺杆菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因的碱基号237～239的atc取代为编码与其编码的氨基酸不同的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体。

第10项.根据第8项所述的转化体，其中，其为下述的(d)、(e)或(f)，

(d)将由序列号10的碱基序列构成的菠萝泛菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因、由序列号11的碱基序列构成的斯氏普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因、由序列号12的碱基序列构成的拉氏普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因、由序列号13的碱基序列构成的斯尼比普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因、由序列号14的碱基序列构成的雷极普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因、由序列号15的碱基序列构成的产碱普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因或由序列号16的碱基序列构成的布氏普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因的碱基号240～242的gtc取代为编码缬氨酸以外的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体、

将由序列号17的碱基序列构成的大肠埃希氏菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因的碱基号237～239的atc取代为编码异亮氨酸以外的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体、或者

将由序列号18的碱基序列构成的阪崎肠杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因的碱基号237～239的atc取代为编码异亮氨酸以外的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体；

(e)编码保持通过取代生成的所述DNA部分，并由与序列号10～18中的任意一个具有90％以上的同一性的碱基序列构成，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA突变体；或者

(f)在编码由与序列号10～18中的任一个具有90％以上的同一性的碱基序列构成，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA突变体中，将序列号10～16中的任一个碱基号240～242的gtc取代为编码缬氨酸以外的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体、或者将与序列号17或18的碱基号237～239的atc对应的DNA部分取代为编码异亮氨酸以外的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体，

其中，与序列号10～16中的任一个碱基号240～242的gtc对应的DNA部分是指编码如下氨基酸的DNA：即、与由序列号10～16中的任一个碱基序列构成的DNA编码的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号80的缬氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸，与序列号17或18的碱基号237～239的gtc对应的DNA部分是指编码如下氨基酸的DNA：即、与由序列号17或18的碱基序列构成的DNA编码的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸与由序列号17或18的碱基序列构成的DNA编码的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号79的异亮氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸。

第11项.根据第8～10项中任一项所述的转化体，其中，通过取代生成的DNA为gca、tgc、acc、tcc或aac。

第12项.根据第8～11项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为棒状杆菌属细菌。

第13项.根据第12项所述的转化体，其中，谷氨酸棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌R(FERM BP-18976)、ATCC13032或ATCC13869。

第14项.一种谷氨酸棒状杆菌HBA-47(保藏编号：NITE BP-01849)转化体。

第15项.一种4羟基苯甲酸或其盐的制造方法，其中，包括：在反应液中培养第5～14项中任一项所述的转化体的工序，所述反应液包括选自由糖类、转化体通过代谢生成分支酸的化合物和分支酸、以及它们的盐组成的组中的至少一种原料化合物；以及回收反应液中的4-羟基苯甲酸或其盐的工序。

第16项.根据第15项所述的方法，在好氧且转化体不增殖的条件下培养转化体。

通过使用本发明的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体、或者导入了编码该分支酸-丙酮酸裂解酶突变体基因的DNA的棒状细菌转化体，从而能够由糖类、转化体通过代谢生成分支酸的化合物、分支酸或者它们的盐在实用上充分高效地生产4-HBA。

附图说明

图1是表示4-羟基苯甲酸对四种微生物(谷氨酸棒状杆菌R、大肠埃希氏菌JM109、恶臭假单胞菌S12ATCC700801和类球红细菌NBRC12203)的增殖造成的影响的图。

具体实施方式

下面，对本发明进行详细说明。

(1)分支酸-丙酮酸裂解酶突变体

本发明的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体为

(A)在由序列号1的氨基酸序列构成的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)中，氨基酸序号80的缬氨酸被取代为其他氨基酸的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体、或者

(B)在其他分支酸-丙酮酸裂解酶中，与上述缬氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸被取代为其他氨基酸的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体。

作为上述(B)的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，可以举出

(i)在普罗威登斯菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶中，氨基酸序号80的缬氨酸(V)被取代为其他氨基酸的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体、

(ii)在埃希氏菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶中，氨基酸序号79的异亮氨酸(I)被取代为其他氨基酸的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体、或者

(iii)在克罗诺杆菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶中，氨基酸序号79的异亮氨酸(I)被取代为其他氨基酸的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体。

作为普罗威登斯菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶，可以举出由序列号2的氨基酸序列构成的斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶、由序列号3的氨基酸序列构成的拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶的、由序列号4的氨基酸序列构成的斯尼比普罗威登斯菌(Providencia sneebia)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶、由序列号5的氨基酸序列构成的雷极普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶、由序列号6的氨基酸序列构成的产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶、由序列号7的氨基酸序列构成的布氏普罗威登斯菌(Providenciaburhodogranariea)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶等。

作为埃希氏菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶，可以举出由序列号8的氨基酸序列构成的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶等。

作为克罗诺杆菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶，可以举出由序列号9的氨基酸序列构成的阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶等。

上述缬氨酸或异亮氨酸可以被另外一个氨基酸取代，也可以被另外多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)氨基酸取代，优选被一个氨基酸取代。其中，优选地，上述缬氨酸或异亮氨酸被取代为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、苏氨酸(T)、丝氨酸(A)或天冬酰胺酸(C)，更优选地，被取代为丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)。

另外，代替上述缬氨酸或异亮氨酸的取代，通过上述缬氨酸或异亮氨酸的缺失、与上述缬氨酸或异亮氨酸的N末端侧相邻的一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)氨基酸的缺失、或者向与上述缬氨酸或异亮氨酸相邻位置的一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)氨基酸的插入，也能够使分支酸-丙酮酸裂解酶活性增大。

另外，在本发明的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体中包含如下分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，即由保持通过突变产生的上述的氨基酸部分(例如，上述丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸)，并且与序列号1～9的任一个具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上的同一性，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽构成的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体。即，在该分支酸-丙酮酸裂解酶突变体中，与序列号1～7的任一个氨基酸序号80的缬氨酸、或者序列号8或9的氨基酸序号79的异亮氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸为缬氨酸或异亮氨酸以外的例如丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸等。

在本发明中，“在酶学上相同”是指对该多肽的酶功能作出同等的贡献。在氨基酸序列的排列中存在于同等的位置的氨基酸为对于酶功能作出同等的贡献的氨基酸。

在本发明中，氨基酸序列以及碱基序列的同一性是利用GENETYX ver.8(GENETYX株式会社ゼネティックス制造)计算出的值。

分支酸-丙酮酸裂解酶是对使丙酮酸从分支酸脱离而生成4-HBA的反应及其逆反应进行催化的酶。

分支酸-丙酮酸裂解酶活性可以改变“Microbiology,140,897-904(1994)”中记载的方法来测定。简单来说，向试验用液中添加被测酶，使其含有50mM Tris HCl(pH7.5)，0.5mM分支酸钡盐，0.2mM NADH，0.2M NaCl，5Unit乳酸脱氢酶，在33℃进行反应，通过追踪来源于NADH的340nm的吸光度的减少来测定反应初速度。对于不添加分支酸钡盐的体系也同样进行反应，作为背景值。将两个测定值的差作为分支酸-丙酮酸裂解酶活性，当确认到依赖于酶和基质的添加的、NADH来源的340nm的随时间变化的、线性的吸光度减少时，判定为具有分支酸丙酮酸裂解酶活性。酶活性的1unit定义为每1分钟产生1微摩尔的4-HBA的酶量，根据酶反应的初速度计算出。

另外，在本发明的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体中包含如下分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，即在与序列号1～9的任一个具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上的同一性，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽中，将与序列号1～7的任一个氨基酸序号80的缬氨酸、或者序列号8或9的氨基酸序号79的异亮氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸取代为其他氨基酸(例如，上述丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸，特别是丙氨酸或半胱氨酸)的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体。

(2)棒状杆菌属细菌转化体

通过将编码上述说明的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体的DNA突变体导入宿主棒状细菌，从而可得到能够以高效率生产4-HBA的转化体。

作为这种DNA突变体，可以举出将

(C)在由序列号10的碱基序列构成的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)基因中，碱基号240～242的gtc取代为编码与其编码的氨基酸不同的一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)氨基酸的DNA部分的DNA突变体、或者

(D)在编码其他分支酸-丙酮酸裂解酶的基因中，与上述gtc对应的位置的DNA部分取代为编码与其编码的氨基酸不同的一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)氨基酸的DNA部分的DNA突变体。

作为上述(D)的DNA突变体，可以举出将

(iv)普罗威登斯菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因的碱基号240～242的gtc取代为编码一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)其他氨基酸的DNA部分的DNA突变体、

(v)埃希氏菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因的碱基号237～239的atc取代为编码一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)其他氨基酸的DNA部分的DNA突变体、或者

(vi)克罗诺杆菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因的碱基号237～239的atc取代为编码一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)其他氨基酸的DNA部分的DNA突变体。

作为普罗威登斯菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以举出由序列号11的碱基序列构成的斯氏普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因、由序列号12的碱基序列构成的拉氏普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因、由序列号13的碱基序列构成的斯尼比普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因、由序列号14的碱基序列构成的雷极普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因、由序列号15的碱基序列构成的产碱普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因、由序列号16的碱基序列构成的布氏普罗威登斯菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因等。

作为埃希氏菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以举出由序列号17碱基序列构成的大肠埃希氏菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因等。

作为克罗诺杆菌属细菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以举出由序列号18碱基序列构成的阪崎肠杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因等。

特别地，优选由编码一个氨基酸的DNA取代。其中，优选地，由编码丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸的DNA取代，更优选地，由编码丙氨酸或半胱氨酸的DNA取代。

作为编码丙氨酸的DNA可以举出gca，作为编码半胱氨酸的DNA可以举出tgc，作为编码苏氨酸的DNA可以举出acc，作为编码丝氨酸的DNA可以举出tcc，作为编码天冬酰胺酸的DNA可以举出aac。

另外，在DNA突变体中还包含编码如下多肽的DNA突变体，即，所述多肽保持编码通过上述取代产生的、缬氨酸或异亮氨酸以外的氨基酸(例如，丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸，特别是丙氨酸或半胱氨酸)的DNA部分，并与序列号10～18的任一个具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上的同一性的碱基序列构成，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性。

另外，在DNA突变体中还包含编码如下多肽的DNA突变体，即，所述多肽保持编码通过上述取代产生的缬氨酸或异亮氨酸以外的氨基酸(例如，丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸，特别是丙氨酸或半胱氨酸)的DNA部分，并与序列号10～18的任一个碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性。

在本发明中，“严格的条件”是指在6×SSC的盐浓度的杂交溶液中，在50～60℃的温度条件下，进行16小时杂交，在0.1×SSC的盐浓度的溶液中进行清洗的条件。

另外，在DNA突变体中还包含如下DNA突变体，在编码由与序列号10～16的任一个具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上的同一性的碱基序列构成，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA中，将与序列号10～16的任一个碱基号240～242的gtc对应的DNA部分取代为编码一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)的缬氨酸以外的氨基酸、特别是一个氨基酸(例如，丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸，特别是丙氨酸或半胱氨酸)的DNA部分。

“与序列号10～16的任一个碱基号240～242的gtc对应的DNA部分”是指编码与由序列号10～16的任一个碱基序列构成的DNA编码的氨基酸序列构成的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号80的缬氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸的DNA部分。

另外，在DNA突变体中还包含如下DNA突变体，在编码由与序列号17或18具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上的同一性的碱基序列构成，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA中，将与序列号17或18的碱基号237～239的atc对应的DNA部分取代为编码一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)的异亮氨酸以外的氨基酸、特别是一个氨基酸(例如，丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸，特别是丙氨酸或半胱氨酸)的DNA部分。

“与序列号17或18的碱基号237～239的atc对应的DNA部分”是指编码与由序列号17或18的碱基序列构成的DNA编码的氨基酸序列构成的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号79的异亮氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸的DNA部分。

另外，在DNA突变体中还包含如下DNA突变体，在编码由与序列号10～16的任一个在严格的条件下杂交，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA中，将与序列号10～16的任一个碱基号240～242的gtc对应的DNA部分取代为编码一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)缬氨酸以外的氨基酸、特别是一个氨基酸(例如，丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸，特别是丙氨酸或半胱氨酸)的DNA部分。

另外，在DNA突变体中还包含如下DNA突变体，在编码由与序列号17或18在严格的条件下杂交，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA中，将与序列号17或18的碱基号237～239的atc对应的DNA部分取代为编码一个或多个(例如，2～8个、2～6个、2～3个或2个)异亮氨酸以外的氨基酸、特别是一个氨基酸(例如，丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸，特别是丙氨酸或半胱氨酸)的DNA部分。

编码与编码分支酸-丙酮酸裂解酶的DNA具有90％以上的同一性、或者在严格的条件下杂交、且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的同源物DNA，例如可以通过使用基于原来的DNA的碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交，从其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。

宿主

棒状细菌是指伯杰氏系统细菌学手册[Bargeys Manual of DeterminativeBacteriology,Vol.8,599(1974)]中定义的一组微生物，只要是在通常的好氧条件下增殖的棒状细菌则没有特别限定。如果列举具体例，可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。

作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒状杆菌、有效棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerance)、解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。

其中，从安全且4-HBA生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒状杆菌。作为优选的菌株，可以列举：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株(FERM BP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等。这些菌株在布达佩斯条约下被国际保藏，是公众能够利用的。

其中，优选R株(FERM BP 18976)、ATCC13032株、ATCC13869株。

此外，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl,W.et al.,Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T,“Brevibacterium flavum”DSM20411,“Brevibacteriumlactofermentum”DSM20412and DSM1412,and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.Int J Syst Bacteriol.41:255260.(1991)，駒形和男ら,コリネフォルム細菌の分類,発酵と工業,45:944963(1987)]。

作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(例如ATCC6872株)等。该菌株在布达佩斯条约下被国际保藏，是公众能够利用的。

作为节杆菌属菌，可以列举球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(例如ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株)等。这些菌株在布达佩斯条约下被国际保藏，是公众能够利用的。

作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如ATCC19210株、ATCC27289株)等。这些菌株在布达佩斯条约下被国际保藏，是公众能够利用的。

作为微球菌属菌，可以列举弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)(例如No.239株(FERM P 13221))、藤黄微球菌(Micrococcus leuteus)(例如No.240株(FERM P13222))、脲微球菌(Micrococcus ureae)(例如IAM1010株)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(例如IFO3764株)等。

另外，除了野生株以外，棒状细菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。例如，可以列举乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)等的基因的破坏株。其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒杆菌的、特别是R(FERM BP18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。

这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，在WO2005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。

如图1所示，本发明人等发现棒状细菌与其他细菌相比，对于4-HBA的抗性极高。另外，棒状细菌与其他好氧性细菌相比，难以溶菌。从这点来看，棒状细菌适于利用本发明方法的4-HBA的制造。

用于转化体的载体的构建

将通过PCR扩增得到的编码分支酸-丙酮酸裂解酶的DNA分别克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。

作为质粒载体，只要是包含在棒状细菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举：乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)2256来源的pAM330[日本特开昭58 67699号公报]、[Miwa,K.et al.,Cryptic plasmids inglutamic acid producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和[Yamaguchi,R.et al.,Determination of the complete nucleotide sequence of ttheBrevibacterium lactofermentum plasmid pAM330and the analysis of its geneticinformation.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265267(1985)]、谷氨酸棒状杆菌ATCC13058来源的pHM1519[Miwa,K.et al.,Cryptic plasmids in glutamic acid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和pCRY30[Kurusu,Y.et al.,Identification of plasmid partition function in coryneformbacteria.Appl.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒状杆菌T250来源的pCG4[日本特开昭57-183799号公报]、[Katsumata,R.et al.,Protoplast transformationof glutamate producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306 311(1984)]、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭62-166890]、pEK0、pEC5、pEKEx1[Eikmanns,B.J.et al.,A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttlevectors for cloning,controlled gene expression,and promoter probing.Gene,102:93-98(1991)]等。

作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒状杆菌R来源的甘油醛3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(ldhA)的启动子PldhA等，其中，优选PgapA。

作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB T1T2终止子。

转化

转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法进行[Kurusu,Y.et al.,Electroporationtransformation system for Coryneform bacteria by auxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447(1990)]。

转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。

作为碳源，可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1～10(w/v％)即可。

作为氮源，可以列举：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，还可以利用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为10(w/v％)即可。

作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.1～1(w/v％)即可。

作为营养物质，例如可以得到肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等，通常设定为约0.1～10(w/v％)即可。进而，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，例如可以列举生物素、硫胺素、吡哆醇、泛酸、肌醇、尼克酸等。

培养基的pH优选约6～8。

作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui,M.et al.,Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,ATP dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。

培养温度设定为约15℃～45℃即可，培养时间设定为约1～7天即可。

宿主染色体基因的破坏或缺失

宿主棒状细菌中，优选存在于其染色体上的4-羟基苯甲酸羟化酶基因被破坏或发生缺失。通过破坏4-羟基苯甲酸羟化酶所生成的4-HBA的代谢被抑制，4-HBA的生产率提高的同时副产物减少。

制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因与染色体上的基因之间引起同源重组，由此能够将染色体上的基因取代成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因取代所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。

(3)4-HBA的制造方法

可以通过包括：在反应液中培养上述说明的本发明的转化体的工序，所述反应液含有选自由糖类、转化体通过代谢可生成分支酸的化合物和分支酸、以及它们的盐组成的组中的至少一种原料化合物；以及回收反应液中的4-HBA的工序的方法来制造4-HBA。

原料化合物为需要使转化体进入细胞内的化合物，另外，优选在植物中大量包含等、工业上易于利用的原料化合物。

作为糖类，优选葡萄糖，但是还可以使用通过代谢可生成葡萄糖的糖类。在这样的糖类中包含具有葡萄糖单位的低聚糖或多糖类。作为这样的糖类，可以列举果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖等单糖类；纤维二糖，蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、木二糖等二糖类；糊精或可溶性淀粉等多糖类等。

另外，作为通过代谢可生成分支酸的化合物，可以列举喹酸、莽草酸等。

另外，作为例如包括这些原料化合物的原料，还可以使用糖蜜。另外，还可以使用将秸秆(水稻秸秆、大麦秸秆、小麦秸秆、黑麦秸秆、燕麦秸秆等)、甘蔗渣、玉米秸秆等非可食农产品废弃物、柳枝稷、象草、芒草等能源作物、木屑、废纸等通过糖化酶等糖化的、包含葡萄糖等多种糖的糖化液。其中，作为原料化合物，优选葡萄糖、分支酸、喹酸、莽草酸。

微生物的增殖

在反应之前，优选将转化体在好氧条件下、在温度约25℃～38℃下培养约12～48小时而使其增殖。

培养用培养基

反应之前的转化体的好氧培养中使用的培养基，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。

作为碳源，还可以使用糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等)；甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。

碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。

作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，还可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～10(w/v％)即可。

作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～1(w/v％)即可。

作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～10(w/v％)即可。

进而，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。

培养基的pH优选约6～8。

作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举A培养基[Inui,M.et al.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,ATP dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。

反应液

作为反应液，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类等的天然反应液或合成反应液。

作为碳源，使用上述说明的原料化合物或包含该原料化合物的糖蜜、糖化液等即可。作为碳源，除了糖类以外，还可以使用甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。

碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。

反应液中的原料化合物的浓度优选约1～20(w/v％)，更优选约2～10(w/v％)，进一步优选约2～5(w/v％)。

另外，包括原料化合物的全部碳源的浓度设定为约2～5(w/v％)即可。

作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，还可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在反应液中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～10(w/v％)即可。

作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐在反应液中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～1(w/v％)即可。

反应液的pH优选约6～8。

作为具体的优选的棒状细菌用反应液，可以列举前述的BT培养基等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。

反应条件

反应温度即转化体的存活温度优选约20℃～50℃，更优选约25℃～47℃。如果为上述温度范围，则能够高效地制造4-HBA。

另外，反应时间优选约1～7天，更优选约1～3天。

培养可以是分批式培养、流加式培养、连续式培养中的任何一种。其中，优选分批式培养。

反应可以在好氧条件下进行，也可以在还原条件下进行。本发明的转化体自身的4-HBA生产能力在好氧条件下更高。但是，由于在好氧条件下转化体增殖，因此原料化合物因增殖而消耗，导致4-HBA制造效率下降。

因此，优选在好氧且转化体不增殖的条件下进行反应。本发明中的不增殖包括实质上不增殖或几乎不增殖。例如，通过使用使微生物的增殖所必须的化合物的生物素、硫胺素等维生素类等、氮源等的一种以上缺失或限制的反应液，从而能够避免或抑制转化体的增殖。

另外，在还原条件下，由于棒状细菌实质上不增殖，原料化合物不因增殖而被消耗，因此4-HBA制造效率提高。

还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV～-500mV，更优选约-150mV～-500mV。

反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEY JAMES公司制造，ORP Electrodes)能够准确地测定。

处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液的液体介质，反应液用水溶液的制备方法例如参考硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig,N et.al.(1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria,In The Prokaryotes,AHandbook on Habitats,Isolation and Identification of Bacteria,Ed.by Starr,M.P.et.al.p.926 940,Berlin,Springer Verlag.)或“農芸化学実験書第三巻、京都大学農学部農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版(农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版)”等，能够得到期望的还原条件下的水溶液。

具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理而将溶解气体除去，由此得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约10mmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下，将蒸馏水等处理约1～60分钟、优选约5～40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而得到还原条件下的反应液用水溶液。

另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。

将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。

在还原条件下发生反应时，反应过程中也优选将反应液维持在还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的好氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的pH调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。

4-HBA的回收

通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出4-HBA。可以通过回收反应液来回收4-HBA，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出4-HBA。作为这种公知的方法，可以列举晶析法、膜分离法、有机溶剂提取法、各种吸附法(使用离子交换树脂、合成吸附材料等)等。

(4)分支酸-丙酮酸裂解酶活性的提高方法

本发明包含通过将

(A)在由序列号1的氨基酸序列构成的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)中，氨基酸序号80的缬氨酸取代为一个或多个其他氨基酸，从而使分支酸-丙酮酸裂解酶活性提高或增大的方法、或者

(B)在其他分支酸-丙酮酸裂解酶中，与上述缬氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸取代为一个或多个其他氨基酸，从而使分支酸-丙酮酸裂解酶活性提高或增大的方法。

分支酸-丙酮酸裂解酶以及突变的方法如上述说明所示。

只要达到本发明的效果，在本发明的技术范围内，本发明包括各种组合上述的构成的方式。

实施例

下面，列举实施例对本发明进一步具体说明，本发明并不被这些实施例所限定，诸多变形是在本发明的技术思想内本领域技术人员可实施的。

[实施例1]

4-HBA生产基因的克隆和表达系统的构建(野生型和突变型)

(1)菠萝泛菌来源的染色体DNA的提取

从菠萝泛菌(Pantoea ananatis)LMG 20103中提取染色体DNA的操作如下进行：向LMG Bacteria Culture Medium No.1培养基[将1g的牛肉提取物、2g的酵母提取物、5g的蛋白胨、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.4]中使用白金环接种后，在28℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cellsand Tissue DNA Isolation Kit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

(2)菠萝泛菌来源的4-HBA生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包括编码4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

当PCR时，基于为克隆ubiC基因而包含ubiC基因的基因序列、序列号10(菠萝泛菌ubiC基因)，分别合成下述一对引物来使用。

菠萝泛菌ubiC基因扩增用引物

(a-1)；5’-CTCTCATATGACGCAAGACCCGCT-3’

(序列号19)

(b-1)；5’-CTCTCATATGTTAACCTTGATCACGATAGAGCG-3’

(序列号20)

另外，引物(a-1)和(b-1)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

实际的PCR使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制造)，使用PrimeSTAR GXLDNA Polymerase(宝生物工程株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。

反应液：

将以上混合，将该50μl的反应液供于PCR。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：50℃ 5秒

延伸过程：68℃ 31秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述生成的反应液进行电泳，能够检测到菠萝泛菌株来源ubiC基因约0.5-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物工程株式会社制造)提纯。

(3)4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)表达质粒的构建

将通过上述项(2)所示的PCR扩增的10μl包括菠萝泛菌株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段和2μl的含有PgapA启动子的克隆载体pCRB209[国际公开WO2012/033112]分别由限制性内切酶NdeI切割，通过在70℃处理10分钟而使限制性内切酶失活后，将两者混合，对其中添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、1unit的T4 DNA连接酶(宝生物工程株式会社制造)的各成分，利用灭菌蒸馏水使其为10μl，在15℃使其反应3小时来结合。

以得到的连接液利用氯化钙法〔Journal of Molecular Biology,53,159(1970)〕转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。

通过常规方法对各个培养基上的增殖株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。其结果是除了确认到质粒pCRB209约5.1-kb的DNA片段以外，还确认到菠萝泛菌株来源ubiC基因约0.5-kb的插入片段。

将包含菠萝泛菌株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA22。

(4)4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)导入株的构建

使用上述的质粒pHBA22，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.、Vol.54、443-447(1990)和Res.Microbiol.、Vol.144、181-185(1993)]，转化谷氨酸棒状杆菌R株，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。

通过常规方法对该培养基上的增殖株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入质粒。其结果是确认了上述制作的质粒pHBA22的导入。

将得到的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)HBA-22。

(5)4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的定点突变导入质粒的构建

使用上述的质粒pHBA22，通过Inverse PCR法制作将V80位点取代为两种氨基酸的突变体，得到导入了定点突变的质粒，将这些分别命名为pHBA23、pHBA24。

当PCR时，基于应在ubiC基因的V80位点导入突变的、序列号10(菠萝泛菌ubiC基因)，分别合成下述引物来使用。

菠萝泛菌ubiC基因突变导入用引物

(a-2)；5’-CGAGAAgcaATTCTCTACGGGGATG-3’(序列号21)

(b-2)；5’-CAGCCAGAAACGCTGATCG-3’(序列号22)

(a-3)；5’-tgcATTCTCTACGGGGATGAGG-3’(序列号23)

(b-3)；5’-TTCTCGCAGCCAGAAACGCTG-3’(序列号24)

反应液：

将以上混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pHBA23(V80A)时以引物(a-2)与(b-2)的组合进行，扩增pHBA24(V80C)时以引物(a-3)与(b-3)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：50℃ 5秒

延伸过程：68℃ 338秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述生成的反应液进行电泳，能够检测到包括菠萝泛菌株来源ubiC基因的约5.6-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCRClean-Up(宝生物工程株式会社制造)提纯。

将提纯的扩增产物使用T4 Polynucleotide Kinase(宝生物工程株式会社制造)进行磷酸化处理之后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物工程株式会社制造)提纯。使用得到的磷酸化处理结束的DNA片段通过DNA Ligation Kit(宝生物工程株式会社制造)使其结合(自连接)。对得到的连接液利用氯化钙法〔J.Mol.Biol,53:159-162(1970)〕转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。通过常规方法对培养基上的增殖株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，通过对该质粒的碱基序列进行序列分析，从而确认了向ubiC基因的V80位点的突变导入。

将得到的质粒命名为pHBA23、pHBA24。此外，本质粒的基因重组的概要在表1中汇总示出。

[表1]

菠萝泛菌来源4-HBA生成基因突变导入质粒

质粒名	导入的突变的种类	序号80的氨基酸	氨基酸序号80的密码子
				pHBA22	无(野生型)	缬氨酸	gtc
pHBA23	V80A	丙氨酸	gca
				pHBA24	V80C	半胱氨酸	tgc

(6)4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)导入株的构建

使用上述的质粒pHBA22～pHBA24，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.、Vol.54、443-447(1990)和Res.Microbiol.、Vol.144、181-185(1993)]，转化谷氨酸棒状杆菌R株，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。

通过常规方法对该培养基上的增殖株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入质粒。其结果是确认了上述制作的质粒pHBA22～pHBA24的导入。

将得到的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)HBA-22～HBA-24。此外，本菌株的基因重组的概要在表2中汇总示出。

[表2]

菠萝泛菌来源4-HBA生成基因(突变体)导入株

[实施例2]

基于谷氨酸棒状杆菌4-羟基苯甲酸生产基因导入株的、分支酸-丙酮酸裂解酶活性比较

对于在实施例1中制作的谷氨酸棒状杆菌HBA-22(V80、野生型)以及HBA-23(V80A)、HBA-24(V80C)，使用超声波破碎过的细胞破碎液，对分支酸-丙酮酸裂解酶活性进行了比较。

具体而言，将上述各菌株涂布到含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[2g的(NH₂)₂CO、7g的(NH₄)₂SO₄、0.5g的KH₂PO₄、0.5g的K₂HPO₄、0.5g的MgSO₄·7H₂O、1ml的0.06％(w/v)FeSO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖、15g的琼脂悬浊于1L蒸馏水中]上，在33℃下于暗处静置15小时。

将一白金环的上述培养皿中增殖的各菌株接种到装有10ml的含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基[2g的(NH₂)₂CO、7g的(NH₄)₂SO₄、0.5g的KH₂PO₄、0.5g的K₂HPO₄、0.5g的MgSO₄·7H₂O、1ml的0.06％(w/v)FeSO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖溶解于1L蒸馏水中]的试管中，在33℃下在好氧条件下进行15小时的振荡培养。

将这样培养增殖的各个菌体通过离心分离(4℃、8000rpm、10分钟)进行回收。利用超声波处理破碎菌体细胞后，将通过离心分离(4℃、15000rpm、20分钟)得到的细胞破碎上清液用作粗酶液，通过以下的方法测定分支酸-丙酮酸裂解酶活性。

混合粗酶液、50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5mM分支酸钡盐、0.2mM NADH、0.2M NaCl、5Unit乳酸脱氢酶，在33℃下进行反应，追踪来源于NADH的340nm的吸光度减少，分析反应初速度。根据反应初速度与蛋白浓度计算出比活力(将每分钟产生1微摩尔的4-HBA的酶量定义为1unit)。(此外，另行确认了将反应液用过滤器过滤后，生成的4-HBA通过HPLC直接检测出4-HBA的峰值(Cosmosil C18 ARII(Nacalai tesque)、层析20％甲醇、0.07％过氯酸)，利用两种测定方法的定量性并无区别。)

其结果如表3所示，与V80(野生型)相比较，V80A突变体以及V80C突变体示出高活性。

[表3]

谷氨酸棒状杆菌菠萝泛菌来源4-HBA生成基因(突变体)导入株的分支酸-丙酮酸裂解酶活性比较

[实施例3]

基于谷氨酸棒状杆菌4-羟基苯甲酸生产基因导入株的、自葡萄糖的4-羟基苯甲酸制造

将实施例1中制作的谷氨酸棒状杆菌HBA-22(野生型)以及HBA-23(V80A)株、HBA-24(V80C)株，涂布到含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[2g的(NH₂)₂CO、7g的(NH₄)₂SO₄、0.5g的KH₂PO₄、0.5g的K₂HPO₄、0.5g的MgSO₄·7H₂O、1ml的0.06％(w/v)FeSO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖、15g的琼脂悬浊于1L蒸馏水中]上，在33℃下于暗处静置15小时。

将一白金环的上述培养皿中增殖的谷氨酸棒状杆菌/4-HBA生产基因导入株，接种到装有10ml的含有卡那霉素50μg/ml A液体培养基[2g的(NH₂)₂CO、7g的(NH₄)₂SO₄、0.5g的KH₂PO₄、0.5g的K₂HPO₄、0.5g的MgSO₄·7H₂O、1ml的0.06％(w/v)FeSO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖溶解于1L蒸馏水中]、进而装有2％碳酸钙的试管中，在33℃下、200rpm的条件下，在好氧条件下进行24小时的振荡培养。

将上述条件下增殖得到的培养液进行离心分离(4℃、15000rpm、10分钟)，使用得到的上清液通过HPLC对4-HBA进行定量。

其结果如表4所示，HBA-23(V80A)株、HBA-24(V80C)株相比HBA-22(野生型)分别示出约2.3倍、约1.6倍的高4-HBA生产浓度。

[表4]

基于谷氨酸棒状杆菌4-HBA生产基因导入株(菠萝泛菌来源ubiC导入株)的、自葡萄糖的4-HBA生产实验

[实施例4]

普罗威登斯菌属细菌来源的染色体DNA的提取、4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸- 丙酮酸裂解酶基因)的克隆、4-羟基苯甲酸生产基因表达质粒的构建、4-羟基苯甲酸生产基因导入株的构建、4-羟基苯甲酸生产基因的定点突变导入株的构建、基于谷氨酸棒状杆菌 4-羟基苯甲酸生产基因导入株的自葡萄糖的4-羟基苯甲酸制造

(1)从微生物中提取染色体DNA

从斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)ATCC 25827中提取染色体DNA的操作如下进行：向ATCC Medium No.3培养基[将5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为6.8]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA IsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii)JCM 3953中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCM Medium No.12培养基[将5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNAIsolation Kit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从大肠埃希氏菌(Escherichia coli)K12 MG1655中提取染色体DNA的操作如下进行：向LB培养基[将10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)JCM 1233中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCM Medium No.12培养基[将5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNAIsolation Kit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

(2)4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的克隆

当PCR时，基于为克隆ubiC基因而包含ubiC基因的基因序列、序列号11(斯氏普罗威登斯菌ubiC基因)、序列号12(拉氏普罗威登斯菌ubiC基因)、序列号17(大肠埃希氏菌ubiC基因)、以及序列号18(阪崎肠杆菌ubiC基因)，分别合成下述一对引物来使用。

斯氏普罗威登斯菌ubiC基因扩增用引物

(a-21)；5’-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTATCTCTCAC-3’(序列号25)

(b-21)；5’-CTCTCATATGTCCCTCCATTTGTTGTGCTC-3’(序列号26)

另外，引物(a-21)和(b-21)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

拉氏普罗威登斯菌ubiC基因扩增用引物

(a-22)；5’-CTCTCATATGCATGAAACAATTTTTACCCATCATCC-3’(序列号27)

(b-22)；5’-CTCTCATATGGATTATGTTAGATAGTTATCTATATGCAGGTG-3’

(序列号28)

另外，引物(a-22)和(b-22)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

大肠埃希氏菌ubiC基因扩增用引物

(a-23)；5’-CTCTCATATGTCACACCCCGCGTTAA-3’(序列号29)

(b-23)；5’-CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGACGCC-3’(序列号30)

另外，引物(a-23)和(b-23)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

阪崎肠杆菌ubiC基因扩增用引物

(a-24)；5’-CTCTCATATGTCCCATCCCGCGCTGAG-3’(序列号31)

(b-24)；5’-CTCTCATATGTATTCTGCGTCAGGCTCCAC-3’(序列号32)

另外，引物(a-24)和(b-24)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

模板DNA使用从拉氏普罗威登斯菌JCM 3953、斯氏普罗威登斯菌ATCC 25827、大肠埃希氏菌MG1655、阪崎肠杆菌JCM 1233中提取的染色体DNA。

反应液：

将以上混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增斯氏普罗威登斯菌ubiC基因时以引物(a-21)与(b-21)的组合，扩增拉氏普罗威登斯菌ubiC基因时以引物(a-22)与(b-22)的组合，扩增大肠埃希氏菌ubiC基因时以引物(a-23)与(b-23)的组合，扩增阪崎肠杆菌ubiC基因时以引物(a-24)与(b-24)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：50℃ 5秒

延伸过程：68℃

斯氏普罗威登斯菌ubiC基因 32秒

拉氏普罗威登斯菌ubiC基因 31秒

大肠埃希氏菌ubiC基因 30秒

阪崎肠杆菌ubiC基因 32秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述生成的反应液进行电泳，在斯氏普罗威登斯菌株来源ubiC基因、拉氏普罗威登斯菌ubiC基因、大肠埃希氏菌ubiC的情况下，能够检测到约0.5-kb的DNA片段。在阪崎肠杆菌ubiC基因的情况下，能够检测到约0.6-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物工程株式会社制造)提纯。

将通过上述项所示的PCR扩增的10μl包括斯氏普罗威登斯菌株来源ubiC基因、拉氏普罗威登斯菌ubiC基因、大肠埃希氏菌ubiC来源的约0.5-kb的各DNA片段或阪崎肠杆菌ubiC基因来源的约0.6-kb的DNA片段和2μl的含有PgapA启动子的克隆载体pCRB209[国际公开WO2012/033112]分别由限制性内切酶NdeI切割，通过在70℃处理10分钟而使限制性内切酶失活后，将两者混合，对其中添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、1unit的T4 DNA连接酶(宝生物工程株式会社制造)的各成分，利用灭菌蒸馏水使其为10μl，在15℃使其反应3小时来结合。

以得到的连接液利用氯化钙法〔Journal of Molecular Biology,53,159(1970)〕转化大肠埃希氏菌HST02株，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。

通过常规方法对各个培养基上的增值株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。其结果是除了确认到质粒pCRB209约5.1-kb的DNA片段以外，在斯氏普罗威登斯菌株来源ubiC基因的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在拉氏普罗威登斯菌株来源ubiC基因的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在大肠埃希氏菌株来源ubiC基因的情况下，还确认到约0.5-kb的插入片段，在阪崎肠杆菌株来源ubiC基因的情况下，还确认到约0.6-kb的DNA片段。

将包含斯氏普罗威登斯菌株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA42，将包含拉氏普罗威登斯菌株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA45，将包含大肠埃希氏菌株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA48，将包含阪崎肠杆菌株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA51。

(4)4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的基因定点突变导入质粒的构建

另外，使用上述的质粒pHBA42，通过Inverse PCR法制作将V80位点取代为A(丙氨酸)、C(半胱氨酸)的突变体，得到导入了定点突变的质粒，将这些分别命名为pHBA43、pHBA44。

当PCR时，基于应对ubiC基因的V80位点导入突变的、序列号11(斯氏普罗威登斯菌ubiC基因)，分别合成下述引物来使用。

斯氏普罗威登斯菌ubiC基因突变导入用引物

(a-25)；5’-gcaATTATGTATGGTGATAATATTCCATGGTTACTTG-3’(序列号33)

(a-26)；5’-tgcATTATGTATGGTGATAATATTCCATGGTTACTTG-3’(序列号34)

(b-25)；5’-TTCACGTAACCAATAATATTCACTGACAG-3’(序列号35)

同样地，使用上述的质粒pHBA45，通过Inverse PCR法制作将V80位点取代为A(丙氨酸)、C(半胱氨酸)的突变体，得到导入了定点突变的质粒，将这些分别命名为pHBA46、pHBA47。

当PCR时，基于应对ubiC基因的V80位点导入突变的、序列号12(拉氏普罗威登斯菌ubiC基因)，分别合成下述引物来使用。

拉氏普罗威登斯菌ubiC基因突变导入用引物

(a-27)；5’-ATTATGTATGGGGATAATATTCCGTGG-3’(序列号36)

(b-27)；5’-gcaTTCTCGCAACCAGTAACGTTG-3’(序列号37)

(b-28)；5’-tgcTTCTCGCAACCAGTAACGTTG-3’(序列号38)

同样地，使用上述的质粒pHBA48，通过PCR法制作将I(异亮氨酸)79位点取代为A(丙氨酸)、C(半胱氨酸)的突变体，得到导入了定点突变的质粒，将这些分别命名为pHBA49、pHBA50。

当PCR时，基于应对ubiC基因的I(异亮氨酸)79位点导入突变的、序列号17(大肠埃希氏菌ubiC基因)，分别合成下述引物来使用。

大肠埃希氏菌ubiC基因突变导入用引物

(a-29)；5’-gcaTTGTTATGTGCCGATGGTGAAC-3’(序列号39)

(a-30)；5’-tgcTTGTTATGTGCCGATGGTGAAC-3’(序列号40)

(b-29)；5’-TTCACGTAACCAGTAACGAGAC-3’(序列号41)

同样地，使用上述的质粒pHBA51，通过PCR法制作将I79位点取代为A(丙氨酸)、C(半胱氨酸)的突变体，得到导入了定点突变的质粒，将这些分别命名为pHBA52、pHBA53。

当PCR时，基于应对ubiC基因的I79位点导入突变的、序列号18(阪崎肠杆菌ubiC基因)，分别合成下述引物来使用。

阪崎肠杆菌ubiC基因突变导入用引物

(a-31)；5’-gcaCTGCTGTGCGGCGACG-3’(序列号42)

(a-32)；5’-tgcCTGCTGTGCGGCGACG-3’(序列号43)

(b-31)；5’-TTCGCGCAGCCAGTAGCG-3’(序列号44)

反应液：

将以上混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pHBA43时以引物(a-25)与(b-25)的组合，扩增pHBA44时以引物(a-26)与(b-25)的组合，扩增pHBA46时以引物(a-27)与(b-27)的组合，扩增pHBA47时以引物(a-27)与(b-28)的组合，扩增pHBA49时以引物(a-29)与(b-29)的组合，扩增pHBA50时以引物(a-30)与(b-29)的组合，扩增pHBA52时以引物(a-31)与(b-31)的组合，扩增pHBA53时以引物(a-32)与(b-31)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：50℃ 5秒

延伸过程：68℃

斯氏普罗威登斯菌(pHBA43,pHBA44) 339秒

拉氏普罗威登斯菌(pHBA46,pHBA47) 338秒

大肠埃希氏菌(pHBA49,pHBA50) 337秒

阪崎肠杆菌(pHBA52,pHBA53) 339秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述生成的反应液进行电泳，在斯氏普罗威登斯菌株来源ubiC基因的情况下能够检测到约5.7-kb的DNA片段，在拉氏普罗威登斯菌株来源ubiC基因的情况下能够检测到约5.6-kb的DNA片段，在大肠埃希氏菌株来源ubiC基因的情况下能够检测到约,5.6-kb的DNA片段，在阪崎肠杆菌株来源ubiC基因的情况下能够检测到约5.7-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物工程株式会社制造)提纯。

将提纯的扩增产物使用T4 Polynucleotide Kinase(宝生物工程株式会社制造)进行磷酸化处理之后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物工程株式会社制造)提纯。使用得到的磷酸化处理结束的DNA片段通过DNA Ligation Kit(宝生物工程株式会社制造)使其结合(自连接)。对得到的连接液利用氯化钙法〔J.Mol.Biol,53:159-162(1970)〕转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。通过常规方法对培养基上的增殖株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，通过对该质粒的碱基序列进行序列分析，从而确认了向ubiC基因的V80位点或I79位点的突变导入。

将得到的质粒命名为pHBA43、pHBA44、pHBA46、pHBA47、pHBA49、pHBA50、pHBA52、pHBA53。此外，本质粒的基因重组的概要在表5中汇总示出。

[表5]

4-HBA生成基因突变导入质粒

导入的突变的种类＊栏的A表示向丙氨酸的突变，C表示向半胱氨酸的突变。另外，V表示缬氨酸的突变，I表示异亮氨酸的突变。另外，80表示氨基酸序号80，79表示氨基酸序号79。

(5)4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)导入株的构建

使用上述的质粒pHBA42、pHBA43、pHBA44、pHBA45、pHBA46、pHBA47、pHBA48、pHBA49、pHBA50、pHBA51、pHBA52和pHBA53，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.、Vol.54、443-447(1990)和Res.Microbiol.、Vol.144、181-185(1993)]，转化谷氨酸棒状杆菌R株，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。

通过常规方法对该培养基上的增殖株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入质粒。其结果是确认了上述制作的质粒pHBA42、pHBA43、pHBA44、pHBA45、pHBA46、pHBA47、pHBA48、pHBA49、pHBA50、pHBA51、pHBA52和pHBA53的导入。

将得到的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)HBA-42、HBA-43、HBA-44、HBA-45、HBA-46、HBA-47、HBA-48、HBA-49、HBA-50、HBA-51、HBA-52和HBA-53。此外，本质粒的基因重组的概要在表6中汇总示出。

[表6]

菠萝泛菌来源4-HBA生成基因(突变体)导入株

将如上述得到的谷氨酸棒状杆菌/4-HBA生产基因导入株(HBA-42、HBA-43、HBA-44、HBA-45、HBA-46、HBA-47、HBA-48、HBA-49、HBA-50、HBA-51、HBA-52和HBA-53)涂布到含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[2g的(NH₂)₂CO、7g的(NH₄)₂SO₄、0.5g的KH₂PO₄、0.5g的K₂HPO₄、0.5g的MgSO₄·7H₂O、1ml的0.06％(w/v)FeSO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖、15g的琼脂悬浊于1L蒸馏水中]上，在33℃下于暗处静置15小时。

将一白金环的上述培养皿中增殖的谷氨酸棒状杆菌/4-HBA生产基因导入株，接种到装有10ml含有卡那霉素50μg/ml的A液体培养基[2g的(NH₂)₂CO、7g的(NH₄)₂SO₄、0.5g的KH₂PO₄、0.5g的K₂HPO₄、0.5g的MgSO₄·7H₂O、1ml的0.06％(w/v)FeSO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖溶解于1L蒸馏水中]、进而装有2％碳酸钙的试管中，在33℃下在好氧条件下进行24小时的振荡培养。

其结果是谷氨酸棒状杆菌HBA-42～53株均如表7所示生成了目标4-HBA。斯氏普罗威登斯菌来源的ubiC突变导入株之中，HBA-43(V80A)、HBA-44(V80C)株的4-HBA生成能力比HBA-42(野生型)增大且更优异。拉氏普罗威登斯菌来源的ubiC突变导入株之中，HBA-46(V80A)、HBA-47(V80C)株的4-HBA生成能力比HBA-45(野生型)增大且更优异。大肠埃希氏菌来源的ubiC突变导入株之中，HBA-49(I79A)、HBA-50(I79C)株的4-HBA生成能力比HBA-48(野生型)增大且更优异。

阪崎肠杆菌来源的ubiC突变导入株之中，HBA-52(I79A)、HBA-53(I79C)株的4-HBA生成能力比HBA-51(野生型)增大且更优异。另外，对谷氨酸棒状杆菌野生株(仅具有空载体的对照物)进行了同样的实验，结果是未确认到4-HBA生成。

培养上清液中的4-HBA生成能力最优异的是使拉氏普罗威登斯菌来源的ubiC的V80C突变体高表达的重组株(HBA-47株)。

根据上述，通过菠萝泛菌、斯氏普罗威登斯菌、拉氏普罗威登斯菌i和阪崎肠杆菌来源的ubiC突变体分析而明确了V80中的突变(V80A、V80C)使分支酸-丙酮酸裂解酶活性增大。

进而，在大肠埃希氏菌和阪崎肠杆菌来源ubiC的情况下，根据同源性比较，与上述V80相当的氨基酸残基为I79，但是已经明确该位点中的同样的突变(I79A、I79C)与上述同样使分支酸-丙酮酸裂解酶活性增大。该位点中的上述突变为迫使很多分支酸-丙酮酸裂解酶活性增大的重要的突变，且证明了使该突变体高表达的谷氨酸棒状杆菌的重组株的4-HBA的生成能力增大。

[表7]

导入谷氨酸棒状杆菌各种4-HBA生成基因的株的自葡萄糖的4-HBA生成实验

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)HBA-47在日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8(邮政编码292-0818)的NPMD-国家技术评估学会专利微生物保藏中心(独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心)保藏(国内保藏的保藏日：2014年4月25日、保藏编号：NITE BP-01849)。该菌株在布达佩斯条约下被国际保藏，在37CFR1.808规定的条件下可被公众利用。

通过利用本发明，能够使用微生物以实用的效率由葡萄糖等制造4-HBA。

序列表

<110> 绿色苯酚开发株式会社

<120> 使高活性突变型酶高表达的棒状细菌转化体及使用它的4 羟基苯甲酸或其盐的制造方法

<130> C01F5262

<150> JP2014-100875

<151> 2014-05-14

<160> 44

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 170

<212> PRT

<213> 菠萝泛菌

<400> 1

Met Thr Gln Asp Pro Leu Arg Ser Leu Arg Ser Leu Asn Trp Leu Ala

1 5 10 15

Leu Asp Asp Ala Ala Leu Thr Gln Pro Leu Arg Asp Trp Leu Met Glu

20 25 30

Glu Asp Ser Met Thr Arg Arg Phe Glu Gln His Cys Gln Lys Val Arg

35 40 45

Val Glu Pro Val Arg Glu Asp Phe Ile Ser Ala Asp Glu Leu Gly Asp

50 55 60

Glu Gly Ala Leu Leu Pro Ala Asp Gln Arg Phe Trp Leu Arg Glu Val

65 70 75 80

Ile Leu Tyr Gly Asp Glu Glu Pro Trp Leu Ala Gly Arg Thr Leu Val

85 90 95

Pro Glu Ser Thr Leu Asn Gly Pro Glu Ala Met Leu Gln Gln Leu Gly

100 105 110

Thr Arg Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Ser Ser Ser Thr Leu Thr Arg

115 120 125

Asp Phe Ile Glu Pro Gly Arg Val Asp Ala Leu Trp Gly Arg Arg Ser

130 135 140

Arg Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu

145 150 155 160

Pro Ala Ser Pro Leu Tyr Arg Asp Gln Gly

165 170

<210> 2

<211> 168

<212> PRT

<213> 斯氏普罗威登斯菌

<400> 2

Met Asp Glu Thr Leu Phe Ile Ser His Pro Ile Thr Trp Leu Ser Glu

1 5 10 15

Asp Asp Asp Leu Val Pro Glu Asn Val Leu Asp Trp Leu His Glu Leu

20 25 30

Gly Ser Met Thr Lys Arg Leu Glu Gln His Cys Gln Arg Val Thr Val

35 40 45

Val Pro Tyr Thr Gln Arg Tyr Val Thr Gln Glu Ala Leu Ser Glu Glu

50 55 60

Glu Ala Ala Cys Leu Pro Val Ser Glu Tyr Tyr Trp Leu Arg Glu Val

65 70 75 80

Ile Met Tyr Gly Asp Asn Ile Pro Trp Leu Leu Gly Arg Thr Leu Ile

85 90 95

Pro Gln Glu Thr Leu Thr Gly Glu Asp Arg Lys Leu Ile Asp Ile Gly

100 105 110

Ala Val Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Ser His Asp Asn Leu Ser Arg

115 120 125

Asp Tyr Ile His Ile Gly Gln Gln Asn Leu Arg Trp Ile Arg Arg Ser

130 135 140

Leu Leu Arg Leu Ser Glu Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu

145 150 155 160

Pro Glu Ser Pro Ala Tyr Lys Arg

165

<210> 3

<211> 167

<212> PRT

<213> 拉氏普罗威登斯菌

<400> 3

Met His Glu Thr Ile Phe Thr His His Pro Ile Asp Trp Leu Asn Glu

1 5 10 15

Asp Asp Glu Ser Val Pro Asn Ser Val Leu Asp Trp Leu Gln Glu Arg

20 25 30

Gly Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln His Cys Gln Lys Val Thr Val

35 40 45

Ile Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Ile Thr Pro Glu Met Leu Ser Ala Asp

50 55 60

Glu Ala Glu Arg Leu Pro Glu Ser Gln Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Val

65 70 75 80

Ile Met Tyr Gly Asp Asn Ile Pro Trp Leu Ile Gly Arg Thr Leu Ile

85 90 95

Pro Glu Glu Thr Leu Thr Asn Asp Asp Lys Lys Leu Val Asp Ile Gly

100 105 110

Arg Val Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Ser His Asp Ser Leu Thr Arg

115 120 125

Asp Tyr Ile Asp Ile Gly Thr Ser Ala Asp Arg Trp Val Arg Arg Ser

130 135 140

Leu Leu Arg Leu Ser Gln Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Ile Phe Leu

145 150 155 160

Pro Glu Ser Pro Ala Tyr Arg

165

<210> 4

<211> 168

<212> PRT

<213> 斯尼比普罗威登斯菌

<400> 4

Met Asp Asp Thr Leu Phe Thr Ser His Pro Ile Thr Trp Leu Ser Glu

1 5 10 15

Thr Asp Asn Val Ile Pro Glu Asn Met Leu Ser Trp Leu Gln Glu Leu

20 25 30

Gly Ser Met Thr Lys Arg Leu Glu Gln Tyr Cys Gln Ser Leu Thr Val

35 40 45

Thr Pro Tyr Val Gln Lys Tyr Val Ser Arg Asn Met Leu Ser Asp Asp

50 55 60

Glu Ala Gln Cys Leu Pro Glu Ser Ser Ser Tyr Trp Leu Arg Glu Val

65 70 75 80

Ile Ile Tyr Gly Asp Asn Ile Pro Trp Leu Leu Gly Arg Thr Leu Ile

85 90 95

Pro Gln Glu Thr Leu Ser Gly Asp Asp Gln Arg Ile Val Asp Ile Gly

100 105 110

Thr Leu Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Ser His Asp Asn Leu Thr Arg

115 120 125

Asp Tyr Ile His Ile Gly Gln Gln Glu Gln Arg Trp Leu Arg Arg Ser

130 135 140

Arg Leu Arg Leu Ser Asn Asn Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu

145 150 155 160

Pro Glu Ser Pro Ala Tyr Lys Arg

165

<210> 5

<211> 167

<212> PRT

<213> 雷极普罗威登斯菌

<400> 5

Met Asp Glu Thr Leu Phe Thr Ser Gln Pro Ile His Trp Leu Ala Glu

1 5 10 15

Asn Asp Lys Ile Val Pro Ala Asn Val Leu Asp Trp Leu Leu Glu Leu

20 25 30

Gly Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln His Ser Gln Gln Val Thr Val

35 40 45

Ile Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Ile Thr Gln Asp Lys Leu Ser Ala Asp

50 55 60

Glu Met Leu Ser Leu Pro Glu Ser Gln Arg Tyr Trp Val Arg Glu Val

65 70 75 80

Val Met Tyr Gly Asp Gly Ile Pro Trp Leu Leu Gly Arg Thr Ile Ile

85 90 95

Pro Glu Glu Thr Leu Thr Asp Asp Asp Gln Gln Leu Val Asp Ile Gly

100 105 110

Arg Met Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Ser Arg Asp Ser Leu Thr Arg

115 120 125

Asp Tyr Ile His Ile Gly Ser Cys Ala Asn Arg Trp Val Arg Cys Ser

130 135 140

Arg Leu Arg Leu Ser Asp Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Ile Phe Leu

145 150 155 160

Pro Glu Ser Pro Ala Tyr Arg

165

<210> 6

<211> 167

<212> PRT

<213> 产碱普罗威登斯菌

<400> 6

Met His Glu Thr Ile Phe Thr Ser His Pro Ile Ser Trp Phe Val Glu

1 5 10 15

Gly Glu Glu Ser Val Pro Glu Asn Val Leu Gly Trp Leu Gln Glu Gln

20 25 30

Arg Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln His Cys Gln Lys Val Thr Val

35 40 45

Ile Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Ile Ser Leu Asp Met Leu Thr Thr Asp

50 55 60

Glu Gln Lys Cys Leu Pro Ile Ser Glu Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Val

65 70 75 80

Ile Met Tyr Gly Asp Asn Ile Pro Trp Leu Ile Gly Arg Thr Leu Ile

85 90 95

Pro Glu Glu Thr Leu Thr Asp Asn Asp Lys Lys Leu Val Glu Leu Gly

100 105 110

Arg Val Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Ser His Glu His Leu Thr Arg

115 120 125

Asp Tyr Ile Glu Met Gly Thr Ser Ala Asp Arg Trp Val Arg Arg Ser

130 135 140

Leu Leu Arg Leu Ser Gln Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Ile Phe Leu

145 150 155 160

Pro Glu Ser Pro Ala Tyr Arg

165

<210> 7

<211> 168

<212> PRT

<213> 布氏普罗威登斯菌

<400> 7

Met Asp Glu Thr Leu Phe Thr Ser His Pro Ile Thr Trp Leu Pro Glu

1 5 10 15

Ala Asp Asp Leu Val Pro Asp Asn Ile Leu Asp Trp Leu His Glu Leu

20 25 30

Gly Ser Met Thr Lys Arg Leu Glu Gln His Cys Gln Cys Val Thr Val

35 40 45

Ile Pro Cys Ala Gln Arg Tyr Val Thr Lys Glu Ala Leu Ser Asp Asp

50 55 60

Glu Thr Gln Cys Leu Pro Val Ser Glu Tyr Tyr Trp Leu Arg Glu Val

65 70 75 80

Ile Met Tyr Gly Asp Asn Ile Pro Trp Leu Leu Gly Arg Thr Leu Ile

85 90 95

Pro Gln Glu Thr Leu Thr Gly Glu Asp Gln Lys Leu Ile Asp Ile Gly

100 105 110

Ala Val Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Ser His Asp Asn Leu Thr Arg

115 120 125

Asp Tyr Ile His Ile Gly Gln Gln Asn Ser Arg Trp Leu Arg Arg Ser

130 135 140

Arg Leu Arg Leu Ser Asn Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu

145 150 155 160

Pro Glu Ser Pro Ala Tyr Lys Arg

165

<210> 8

<211> 165

<212> PRT

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 8

Met Ser His Pro Ala Leu Thr Gln Leu Arg Ala Leu Arg Tyr Cys Lys

1 5 10 15

Glu Ile Pro Ala Leu Asp Pro Gln Leu Leu Asp Trp Leu Leu Leu Glu

20 25 30

Asp Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln Gln Gly Lys Thr Val Ser Val

35 40 45

Thr Met Ile Arg Glu Gly Phe Val Glu Gln Asn Glu Ile Pro Glu Glu

50 55 60

Leu Pro Leu Leu Pro Lys Glu Ser Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Ile Leu

65 70 75 80

Leu Cys Ala Asp Gly Glu Pro Trp Leu Ala Gly Arg Thr Val Val Pro

85 90 95

Val Ser Thr Leu Ser Gly Pro Glu Leu Ala Leu Gln Lys Leu Gly Lys

100 105 110

Thr Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser Thr Leu Thr Arg Asp

115 120 125

Phe Ile Glu Ile Gly Arg Asp Ala Gly Leu Trp Gly Arg Arg Ser Arg

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu Pro

145 150 155 160

Ala Ser Pro Leu Tyr

165

<210> 9

<211> 169

<212> PRT

<213> 阪崎肠杆菌

<400> 9

Met Ser His Pro Ala Leu Arg Gln Leu Arg Ala Leu Ser Phe Phe Asp

1 5 10 15

Asp Ile Ser Thr Leu Asp Ser Ser Leu Leu Asp Trp Leu Met Leu Glu

20 25 30

Asp Ser Met Thr Arg Arg Phe Glu Gly Phe Cys Glu Arg Val Thr Val

35 40 45

Asp Met Leu Phe Glu Gly Phe Val Gly Pro Glu Ala Leu Glu Glu Glu

50 55 60

Gly Glu Phe Leu Pro Asp Glu Pro Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Ile Leu

65 70 75 80

Leu Cys Gly Asp Gly Val Pro Trp Leu Val Gly Arg Thr Leu Val Pro

85 90 95

Glu Ser Thr Leu Cys Gly Pro Glu Leu Ala Leu Gln Gln Leu Gly Thr

100 105 110

Thr Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser Thr Leu Thr Arg Asp

115 120 125

Phe Ile Gln Pro Gly Arg Ser Asp Glu Leu Trp Gly Arg Arg Ser Leu

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu Pro

145 150 155 160

Ala Ser Pro Leu Tyr Gly Glu Glu Lys

165

<210> 10

<211> 513

<212> DNA

<213> 菠萝泛菌

<400> 10

atgacgcaag acccgctccg ttcgttacgt tcacttaact ggctggcgct ggacgatgcc 60

gcattgacgc aaccgcttcg tgactggcta atggaagagg attccatgac gcgacgcttt 120

gaacagcatt gccagaaggt cagggtggaa cctgtacgtg aggactttat ctccgccgat 180

gaactcggcg atgaaggggc attactccct gccgatcagc gtttctggct gcgagaagtc 240

attctctacg gggatgagga accttggctg gcagggcgca cgctggtgcc agaaagtacc 300

ctcaacggcc cggaagcgat gttacagcaa ctcggtacgc gcccgctggg gcgttatctg 360

ttctcgtcat caacgctgac ccgcgatttc attgagcctg gccgcgttga tgcgctctgg 420

ggacgccgct cgcgcctgcg actgtcaggg aaaccgctgc tgttaacgga actgttttta 480

ccggcttcgc cgctctatcg tgatcaaggt taa 513

<210> 11

<211> 507

<212> DNA

<213> 斯氏普罗威登斯菌

<400> 11

atggatgaaa cgctttttat ctctcacccg ataacatggc tatcagaaga tgatgacctt 60

gttcctgaaa atgttttaga ttggctacat gaactagggt cgatgacaaa acgcttagag 120

cagcattgcc aacgtgtcac ggttgttcct tatacgcaac gttatgtgac tcaagaggca 180

ttgagcgaag aagaagcggc gtgtttacct gtcagtgaat attattggtt acgtgaagtc 240

attatgtatg gtgataatat tccatggtta cttggacgaa cgttaattcc acaggagaca 300

ttgactggtg aagaccggaa acttattgat atcggtgctg taccgttagg gcgttatctc 360

tttagccatg ataatctttc ccgtgattat attcatatag ggcagcaaaa tttgcgatgg 420

atccgccgct ctctattaag attatctgaa aaacctttat tattaaccga actgttttta 480

cctgaatcac ctgcatataa aagataa 507

<210> 12

<211> 504

<212> DNA

<213> 拉氏普罗威登斯菌

<400> 12

atgcatgaaa caatttttac ccatcatccc attgattggc taaacgagga tgatgagtca 60

gttcctaaca gtgtactaga ttggctgcaa gagcgtggtt caatgactaa acggttcgag 120

cagcattgcc aaaaagtcac ggtaattccc tatttagagc gctatatcac tccagagatg 180

ctgagcgctg atgaagccga gcgtttaccc gaaagtcaac gttactggtt gcgagaagtc 240

attatgtatg gggataatat tccgtggttg ataggcagaa cattgatccc tgaagagacc 300

ctcaccaacg atgataaaaa gctggtggac attggtcgtg tgccattagg gcgttacctt 360

tttagtcatg atagtcttac ccgagattat attgatattg gcaccagtgc ggatcgttgg 420

gtgcgacgtt ctctgctgag attatctcaa aagcccttat tattaactga aatattttta 480

cctgaatcac ctgcatatag ataa 504

<210> 13

<211> 507

<212> DNA

<213> 斯尼比普罗威登斯菌

<400> 13

atggatgata cgctttttac ctctcacccg ataacatggt tatcagagac tgataatgtt 60

attcctgaaa atatgttaag ttggttacaa gaactcgggt caatgacaaa gcgcttagaa 120

caatattgcc agtctttgac tgtcacccct tatgtgcaaa aatatgtttc cagaaacatg 180

ctgagtgatg atgaagctca atgtttacct gaaagctcaa gttattggct aagagaagtg 240

attatctatg gggataatat cccttggttg ctagggcgaa cgctaattcc gcaagaaaca 300

ttgagtggcg atgaccaaag aattgtcgat attggtacgc tgcctttagg ccgttatcta 360

tttagtcatg ataatctgac tcgtgattat attcatattg ggcaacagga gcagcgatgg 420

ctgcgtcgtt cgcgattaag gctatcgaat aatcctttat tattaactga attgttttta 480

cctgaatcac ctgcatataa aagataa 507

<210> 14

<211> 504

<212> DNA

<213> 雷极普罗威登斯菌

<400> 14

atggatgaaa cgctttttac ttctcagccg attcactggc tggcggagaa cgataaaata 60

gtgcctgcca atgtattaga ttggctatta gagctcggct ccatgacaaa acgttttgag 120

cagcatagcc agcaagttac cgtgatacct tatttagagc gctatataac acaagataag 180

ctgagtgcag atgaaatgct gtctttacct gaaagccaac gttattgggt cagagaagtt 240

gtcatgtatg gagatggtat cccttggtta ctgggccgaa cgataatccc tgaagaaaca 300

ctgactgatg atgaccagca actggtagat attgggagaa tgccgttagg gcgttattta 360

tttagccgtg acagcttaac tcgagattat attcatattg gttcttgcgc aaaccgttgg 420

gtacgttgtt ctcggttaag attatcggat aaacccttac tattaacaga aatattttta 480

cctgaatcac ctgcatatcg ttaa 504

<210> 15

<211> 504

<212> DNA

<213> 产碱普罗威登斯菌

<400> 15

atgcatgaaa cgatttttac ctctcatcct ataagttggt tcgtagaagg cgaagagagt 60

gttcctgaaa atgtattagg ttggttgcaa gagcaaaggt cgatgaccaa acggtttgag 120

cagcattgtc agaaagtgac ggtgatacct tatttagaac gctatatctc actggatatg 180

ctcaccaccg acgaacaaaa atgcttacca attagtgagc gttattggct acgggaagtg 240

attatgtatg gggataatat cccttggttg attggcagaa cgctgatccc agaagagacg 300

ctcaccgata atgacaaaaa attagtcgag cttgggcgag tcccattagg gcgctatctc 360

tttagtcatg aacacctaac ccgagattat attgaaatgg gcaccagtgc tgaccgctgg 420

gttcgccgtt ccttacttag actgtcccaa aaaccattat tattaaccga aatattttta 480

cctgaatcac ctgcatatag ataa 504

<210> 16

<211> 507

<212> DNA

<213> 布氏普罗威登斯菌

<400> 16

atggatgaaa cgctttttac ctctcacccg ataacgtggc taccagaggc cgatgacctt 60

gttcctgata atattttaga ctggttgcat gagcttgggt caatgacaaa acgtttagag 120

cagcactgcc agtgtgttac cgttatccct tgtgcgcagc gatatgtgac taaagaagct 180

ctcagtgatg atgaaactca atgtttaccg gtgagtgagt actattggtt acgggaggtt 240

attatgtatg gtgataatat tccctggtta ctcggccgaa cactaattcc gcaagaaaca 300

ttgaccggtg aagaccaaaa gctcattgat attggtgctg taccattagg gcgttatcta 360

tttagtcatg ataatcttac ccgggattat attcatatag ggcagcaaaa ttctcgatgg 420

ctccgtcgct ctcgattaag gttatcaaac aaaccgttat tattaactga attattttta 480

cctgaatcac ctgcttataa aagataa 507

<210> 17

<211> 498

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 17

atgtcacacc ccgcgttaac gcaactgcgt gcgctgcgct attgtaaaga gatccctgcc 60

ctggatccgc aactgctcga ctggctgttg ctggaggatt ccatgacaaa acgttttgaa 120

cagcagggaa aaacggtaag cgtgacgatg atccgcgaag ggtttgtcga gcagaatgaa 180

atccccgaag aactgccgct gctgccgaaa gagtctcgtt actggttacg tgaaattttg 240

ttatgtgccg atggtgaacc gtggcttgcc ggtcgtaccg tcgttcctgt gtcaacgtta 300

agcgggccgg agctggcgtt acaaaaattg ggtaaaacgc cgttaggacg ctatctgttc 360

acatcatcga cattaacccg ggactttatt gagataggcc gtgatgccgg gctgtggggg 420

cgacgttccc gcctgcgatt aagcggtaaa ccgctgttgc taacagaact gtttttaccg 480

gcgtcaccgt tgtactaa 498

<210> 18

<211> 510

<212> DNA

<213> 阪崎肠杆菌

<400> 18

atgtcccatc ccgcgctgag acaactgcgc gcgttgtcct tttttgacga tatcagcacg 60

cttgatagtt cgctgctcga ctggctgatg ctggaagatt ccatgacccg ccgtttcgaa 120

ggcttttgcg agcgcgtgac ggtcgacatg ctgtttgagg gctttgtcgg ccccgaggcg 180

ctggaggaag agggcgagtt tttgcctgat gagccgcgct actggctgcg cgaaatcctg 240

ctgtgcggcg acggcgtgcc gtggctggtt gggcgcacgc tggtgccgga gtctacactt 300

tgtgggccgg agctggcgtt gcagcagctc ggtaccacgc cgctgggccg ttatctgttt 360

acctcatcca ccctcacgcg tgattttatc cagccgggcc gcagcgacga actctgggga 420

cgccgctctc tgctgaggct ttccggcaaa ccgctgctgc tgactgaact gtttttacct 480

gcatcaccct tgtacggaga ggaaaaataa 510

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 19

ctctcatatg acgcaagacc cgct 24

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 20

ctctcatatg ttaaccttga tcacgataga gcg 33

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 21

cgagaagcaa ttctctacgg ggatg 25

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 22

cagccagaaa cgctgatcg 19

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 23

tgcattctct acggggatga gg 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 24

ttctcgcagc cagaaacgct g 21

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 25

ctctcatatg gatgaaacgc tttttatctc tcac 34

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 26

ctctcatatg tccctccatt tgttgtgctc 30

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 27

ctctcatatg catgaaacaa tttttaccca tcatcc 36

<210> 28

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 28

ctctcatatg gattatgtta gatagttatc tatatgcagg tg 42

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 29

ctctcatatg tcacaccccg cgttaa 26

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 30

ctctcatatg ttagtacaac ggtgacgcc 29

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 31

ctctcatatg tcccatcccg cgctgag 27

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 32

ctctcatatg tattctgcgt caggctccac 30

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 33

gcaattatgt atggtgataa tattccatgg ttacttg 37

<210> 34

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 34

tgcattatgt atggtgataa tattccatgg ttacttg 37

<210> 35

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 35

ttcacgtaac caataatatt cactgacag 29

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 36

attatgtatg gggataatat tccgtgg 27

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 37

gcattctcgc aaccagtaac gttg 24

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 38

tgcttctcgc aaccagtaac gttg 24

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 39

gcattgttat gtgccgatgg tgaac 25

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 40

tgcttgttat gtgccgatgg tgaac 25

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 41

ttcacgtaac cagtaacgag ac 22

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 42

gcactgctgt gcggcgacg 19

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 43

tgcctgctgt gcggcgacg 19

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR 引物

<400> 44

ttcgcgcagc cagtagcg 18

Claims

1.一种下述的(A)或(B)的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，

(A)在由序列号1的氨基酸序列构成的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)中，氨基酸序号80的缬氨酸被一个或多个其他氨基酸取代的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，

2.根据权利要求1所述的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，其中，所述(B)的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体为

3.根据权利要求1所述的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，其中，其为下述的(a)、(b)或(c)，

4.根据权利要求1～3中任一项所述的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体，其中，通过取代生成的氨基酸为一个，该氨基酸为丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或天冬酰胺酸。

5.一种转化体，其为将编码权利要求1～4中任一项的分支酸-丙酮酸裂解酶突变体的DNA导入宿主棒状细菌的转化体。

6.根据权利要求5所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为棒状杆菌属细菌。

7.根据权利要求6所述的转化体，其中，谷氨酸棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌R(FERM BP-18976)、ATCC13032或ATCC13869。

8.一种转化体，其为将下述的(C)或(D)的DNA突变体导入宿主棒状细菌的转化体，

9.根据权利要求8所述的转化体，其中，上述(D)的DNA突变体为

10.根据权利要求8所述的转化体，其中，其为下述的(d)、(e)或(f)，

(e)编码如下多肽的DNA突变体，该多肽为保持通过取代生成的所述DNA部分，并由与序列号10～18中的任一个具有90％以上的同一性的碱基序列构成，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽；或者

(f)在编码由与序列号10～18的任一个具有90％以上的同一性的碱基序列构成，且具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA突变体中，将序列号10～16中的任一个碱基号240～242的gtc取代为编码缬氨酸以外的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体、或者将与序列号17或18的碱基号237～239的atc对应的DNA部分取代为编码异亮氨酸以外的一个或多个氨基酸的DNA部分的DNA突变体，

其中，与序列号10～16中的任一个碱基号240～242的gtc对应的DNA部分是指编码如下氨基酸的DNA：即、与由序列号10～16中的任一个碱基序列构成的DNA编码的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号80的缬氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸，与序列号17或18的碱基号237～239的gtc对应的DNA部分是指编码如下氨基酸的DNA：即、与由序列号17或18的碱基序列构成的DNA编码的分支酸-丙酮酸裂解酶的氨基酸序号79的异亮氨酸在酶学上相同的位置的氨基酸。

11.根据权利要求8～10中任一项所述的转化体，其中，通过取代生成的DNA为gca、tgc、acc、tcc或aac。

12.根据权利要求8～11中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为棒状杆菌属细菌。

13.根据权利要求12所述的转化体，其中，谷氨酸棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌R(FERM BP-18976)、ATCC13032或ATCC13869。

14.一种谷氨酸棒状杆菌HBA-47(保藏编号：NITE BP-01849)转化体。

15.一种4-羟基苯甲酸或其盐的制造方法，其中，包括：在反应液中培养权利要求5～14中任一项所述的转化体的工序，所述反应液包括选自由糖类、转化体通过代谢生成分支酸的化合物和分支酸、以及它们的盐组成的组中的至少一种原料化合物；以及回收反应液中的4-羟基苯甲酸或其盐的工序。

16.根据权利要求15所述的方法，在好氧且转化体不增殖的条件下培养转化体。