JP2003507022A - 高力価を有する1,3−プロパンジオールの生物的生産法 - Google Patents
高力価を有する1,3−プロパンジオールの生物的生産法Info
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Abstract
Description
への生物的転換(bioconversion)法を含む。
及び環状化合物の製造において利用性を有する可能性のあるモノマーである。
でホスフィン、水、一酸化炭素、水素及び酸の存在下に、エチレンオキシドを1
,3−プロパンジオールに転換することができるか、アクロレインの接触液相水
和及び続く還元によるか、あるいはグリセロールのような化合物から一酸化炭素
及び水素の存在下に、周期表の第VIII族の原子を有する触媒上で反応させる
ことができる。これらの方法により1,3−プロパンジオールを作ることは可能
であるが、それらは高価であり、且つ環境汚染物を含有する廃流を生ぜしめる。
紀を越える以前から既知であった。例えばシトロバクテル(Cytrobact
er)、クロスツリジウム(Clostridium)、エンテロバクテル(E
nterobacter)、イリオバクテル(Ilyobacter)、クレブ
シエラ(Klebsiella)、ラクトバシルス(Lactobacillu
s)及びペロバクテル(Pelobacter)の群において、1,3−プロパ
ンジオールを生産できるバクテリア株が見いだされた。研究されたそれぞれの場
合に、グリセロールは2段階の酵素触媒反応系列で1,3−プロパンジオールに
転換される。第1段階において、デヒドラターゼが3−ヒドロキシプロピオンア
ルデヒド(3−HPA)及び水へのグリセロールの転換、式1を触媒する。第2
段階において、3−HPAがNAD+−結合オキシドレダクターゼにより1,3
−プロパンジオールに還元される、式2。1,3−プロパンジオールはそれ以上
代謝されず、結果として グリセロール→3−HPA+H2O (式1) 3−HPA+NADH+H+→1,3−プロパンジオール+NAD+ (式2) 媒体中に堆積する。全体的反応は1還元当量(a reducing equi
valent)を補因子、還元されたβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオシ
ド(NADH)の形態で消費し、それはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
(NAD+)に酸化される。
、シトロバクテル・フレウンジイ(Citrobacter freundii
)及びクロスツリジウム・パステウリアヌム(Clostridium pas
teurianum)においては、グリセロールデヒドラターゼの3つの構造サ
ブユニットをコードする遺伝子(dhaB1−3又はdhaB、C及びE)が特
異的1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子(dh
aT)に隣接して位置している(図1を参照されたい)。これらの微生物の間で
遺伝子編成(genetic organization)はいくらか異なるが
、これらの遺伝子は、orfX及びorfZ(グリセロールデヒドラターゼのた
めのデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子)ならびにorfY及びo
rfW(未知の機能の遺伝子)も含む1つの群に集まっている。これらの微生物
の特異的1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT’s)はI
II型アルコールデヒドロゲナーゼの群に属することが知られており;それぞれ
保存されている鉄−結合モチーフを示し、且つ1,3−プロパンジオール及び3
−HPAのNAD+/NADH結合相互転換に関する優先性を有する。しかしな
がら、1,3−プロパンジオール及び3−HPAのNAD+/NADH結合相互
転換は、効率の低い速度論的パラメーターとはいえ、デヒドラターゼ酵素に特異
的に結合しないアルコールデヒドロゲナーゼによっても触媒される(例えばウマ
肝臓及びパン酵母アルコールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.1))。
グリセロールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.30)及びジオール[1,
2−プロパンジオール]デヒドラターゼ(E.C.4.2.1.28)は関連し
ているが異なる酵素であり、それらは異なる遺伝子によりコードされる。クレブ
シエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)及びサルモネラ
・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)からのジ
オールデヒドラターゼ遺伝子はグリセロールデヒドラターゼ遺伝子に似ており、
orfX及びorfZに類似の遺伝子を含む1つの群に集まっている(Dani
el et al.,FEMS Microbiol.Rev.22,553(
1999);Toraya and Mori,J.Biol.Chem.27
4,3372(1999);GenBank AF026270)。
グリセロールを単独の炭素源として用いて、且つ他の外因性還元当量受容物質の
不在下で行われる。これらの条件下で、例えばシトロバクテル、クロスツリジウ
ム及びクレブシエラの株においては、最初にNAD+−(もしくはNADP+−)
結合グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロールのジヒドロキシアセトン
(DHA)への酸化、式3を含むグリセロールに関する平行経路が働く。DHA
は、DHAキナーゼによるジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)へのリン酸
化(式4)に続き、 グリセロール+NAD+→DHA+NADH+H+ (式3) DHA+ATP→DHAP+ADP (式4) 生合成及び例えば解糖を介するATP生成の支持のために利用可能になる。1,
3−プロパンジオール経路と対照的に、この経路は細胞に炭素及びエネルギーを
与えることができ、NADHを消費するのではなく生産する。
e)及びシトロバクテル・フレウンジイの場合、グリセロールデヒドラターゼ(
dhaB)、1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)、グ
リセロールデヒドロゲナーゼ(dhaD)及びジヒドロキシアセトンキナーゼ(
dhaK)の機能的に結合した活性をコードする遺伝子はdhaレギュロンによ
り包含されている。dhaレギュロンは、クレブシエラ・ニューモニアエ及びシ
トロバクテル・フレウンジイの場合、転写アクチベータタンパク質をコードする
遺伝子(dhaR)も包含している。シトロバクテル及びクレブシエラからのd
haレギュロンはエシェリキア・コリ(Escherichia coli)に
おいて発現され、グルセロールを1,3−プロパンジオールに転換することが示
された。
方法も、工業的規模の生産には十分に適しておらず、それは化学的方法はエネル
ギー集約的であり、生物的方法は高価な出発材料であるグリセロールからの比較
的低い力価に限られるからである。これらの欠点は、低いエネルギー投入及び炭
水化物又は糖類のような安価な出発材料を必要とする方法を用いて、あるいはグ
リセロール法の代謝効率を向上させることにより、克服され得た。いずれの方法
の開発も、グリセロールへの糖類の、及び1,3−プロパンジオールへのグリセ
ロールの転換を担う遺伝子機構(genetic machinery)を操作
する能力を必要とするであろう。
ロール生産物質は酵母であるが、いくつかのバクテリア、他の菌・カビ及び藻類
も既知である。バクテリア及び酵母の両方はグルコース又は他の炭水化物を解糖
又はEmbden Meyerhof Parnas経路におけるフルクトース
−1,6−二リン酸経路を介して転換することによってグリセロールを生産する
が、ある種の藻類は葉緑体中に溶解した二酸化炭素又は重炭酸塩をカルビンサイ
クルの3−炭素中間体に転換する。1系列の段階において、3−炭素中間体であ
るホスホグリセリン酸はグリセルアルデヒド3−リン酸に転換され、それはその
ケト異性体であるジヒドロキシアセトンリン酸、そして究極的にはグリセロール
に容易に相互転換され得る。
icheniformis)及びラクトバシルス・リコペルシカ(Lactob
acillus lycopersica)がグリセロールを合成し、耐塩性藻
類ドゥナリエラ種(Dunaliella sp.)及びアステロモナス・グラ
シリス(Asteromonas gracilis)において、高い外部塩濃
度に対する保護のためにグリセロール生産が見いだされる。同様に、種々の耐浸
透圧性(osmotolerant)酵母が保護手段としてグリセロールを合成
する。サッカロミセスのほとんどの株はアルコール発酵の間にいくらかのグリセ
ロールを生産し、浸透圧ストレスの適用によりこれを生理学的に増加させること
ができる。本世紀初期に、亜硫酸塩もしくはアルカリのような「ステアリング試
薬(steering reagents)」が加えられたサッカロミセス培養
の使用により商業的グリセロール生産が達成された。不活性な錯体の生成を介し
て、ステアリング試薬はエタノールへのアセトアルデヒドの転換を遮断もしくは
阻害し;かくして過剰の還元当量(NADH)がグリセロールを生産するための
還元に利用され得るか、又はそのためにDHAPに向かって「ステアリングされ
る」。この方法は亜硫酸塩の故である酵母成長の部分的阻害により制限される。
種々の機構により過剰のNADH当量を生ぜしめるアルカリの使用により、この
制限を部分的に克服することができる。この実施の場合、アルカリはカニッツァ
ロ不均化を開始させて2当量のアセトアルデヒドからエタノールと酢酸を与える
。
GPD1)がS.ジアスタチクス(S.diastaticus)からクローニ
ングされ、配列決定された(Wang et al.,J.Bact.176,
7091−7095(1994))。DAR1遺伝子はシャトルベクター中にク
ローニングされ、E.コリを形質転換するために用いられ、そこで発現は活性な
酵素を生産した。Wang et al.(同上)はDAR1が細胞の浸透圧環
境(osmotic environment)により調節されることを認識し
たが、組換え微生物における1,3−プロパンジオール生産を増強するためにど
のように遺伝子を用い得るかを示唆してはいない。
n−グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼがサッカロミセス・セレビシア
エ(Saccharomyces cerevisiae)からクローニングさ
れ、且つ配列決定され(Larason et al.,Mol.Microb
iol.10,1101(1993))、Albertyn et al.(M
ol.Cell.Biol.14,4135(1994))はサッカロミセス・
セレビシアエからのグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするG
PD1のクローニングを記載している。Wang et al.(同上)と同様
に、Albertyn et al.及びLarason et al.の両方
はこの遺伝子の調節の浸透圧−感受性を認識しているが、組換え微生物中での1
,3−プロパンジオールの生産においてどのように遺伝子を用い得るかを示唆し
てはいない。
セス・セレビシアエから単離され、該タンパク質がGPP1及びGPP2遺伝子
によりコードされることが同定された(Norbeck et al.,J.B
iol.Chem.271,13875(1996))。G3PDHをコードす
る遺伝子と同様に、GPP2は浸透圧感受性(osmosensitive)で
あると思われる。
ロパンジオールへの1微生物転換(single microorganism
conversion)は望ましいが、そのような試みには克服されるべきか
なりの困難があることが実証されている。例えばGottschalk et
al(EP 373 230)は、シトロバクテル・フレウンジイ、クロスツリ
ジウム・アウトブチリクム(Clostridium autobutylic
um)、クロスツリジウム・ブチリクム(Clostridium butyl
icum)及びクレブシエラ・ニューモニアエを含む1,3−プロパンジオール
の生産に有用なほとんどの株の成長がフルクトース又はグルコースのような水素
供与体の存在により撹乱されると記載している。グリセロールとフルクトース又
はグルコースの共−発酵において1,3−プロパンジオールを生産するラクトバ
シルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)及びラクトバ
シルス・ブクネル(Lactobacillus buchner)の株は、グ
リセロールが唯一の炭素源として与えられると成長せず、休止細胞はグルコース
又はフルクトースを代謝できることが示されているが、それらは1,3−プロパ
ンジオールを生産しない(Veiga DA Cunha et al.,J.
Bacteriol.,174,1013(1992))。同様に、グリセロー
ル及びアセテートが与えられると1,3−プロパンジオールを生産するイリオバ
クテル・ポリトロプス(Ilyobacter polytropus)の株は
、フルクトース及びグルコースを含むグリセロール以外の炭素基質から1,3−
プロパンジオールを生産しないであろうことが示されている(Steib et
al.,Arch.Microbiol.140,139(1984))。最
後に、Tong et al.(Appl.Biochem.Biotech.
34,149(1992))は、グルセロールデヒドラターゼをコードするdh
aレギュロンを用いて形質転換された組換えエシェリキア・コリが外因性グルセ
ロールの不在下でグルコース又はキシロースから1,3−プロパンジオールを生
産しないことを記載した。
されており、その試みでは還元当量を与えることができる共−基質、典型的には
発酵可能な糖類がプロセス中に含まれる。グリセロール及びグルコースを共−発
酵させるシトロバクテル・フレウンジイ及びクレブシエラ・ニューモニアエ D
SM 4270の休止細胞に関する収率における向上が特許請求されている(G
ottschalk et al.,同上;ならびにTran−Dinh et
al.,DE 3734 764);しかしグリセロール及びグルコースを共
−発酵させるクレブシエラ・ニューモニアエ ATCC 25955の成長細胞
に関しては特許請求されておらず、それは1,3−プロパンジオールを生産しな
かった(I−T.Tong,Ph.D.Thesis,University
of Wisconsin−Madison(1992))。組換えエシエリキ
ア・コリによるグルセロールとグルコース又はフルクトースの共発酵に関する収
率の向上が報告されている;しかしながらグリセロールの不在下で1,3−プロ
パンジオールは生産されない(Tong et al.,同上)。これらの系に
おいては、1つの微生物が細胞保持又は成長のためのエネルギー及び炭素を与え
ながらNADH生成の源として炭水化物を用いている。これらの開示は、糖類が
1,3−プロパンジオールを生産する炭素の流れに入らないことを示唆している
。
ロール又はジヒドロキシアセトン以外の炭素基質の1,3−プロパンジオールへ
の転換が記載された(U.S.5,686,276;WO 9821339;W
O 9928480;及びWO 9821341(US 6013494))。
グリセロール又はグルコースのいずれかからの1,3−プロパンジオールの生産
に導く生物的プロセスにおける特別な欠点は、発酵を介して達成される生産物の
低い力価であった;かくして水性発酵ブイヨンから1,3−プロパンジオールを
得るためのエネルギー−集約的な分離プロセスが必要である。1,3−プロパン
ジオールへのグリセロールのフェドバッチ(fed batch)又はバッチ発
酵はクロスツリジウム・ブチリクムにより65g/L(Saint−Amans
et al.,Biotechnology Letters 16,831
(1994))、クロスツリジウム・ブチリクム突然変異株により71g/L(
Abbad−Andaloussi et al.,Appl,Environ
.Microbiol.61,4413(1995))、クレブシエラ・ニュー
モニアエにより61g/L(Homann et al.,Appl.Bicr
obiol.Biotechnol.33,121(1990))及びシトロバ
クテル・フレウンジイにより35g/L(Homann et al.,同上)
の最終的力価に導いた。グリセロール発酵から得られる力価を越えるグルコース
の1,3−プロパンジオールへの発酵はまだ開示されたことがない。
素基質から高い力価で、且つ1つの微生物によって1,3−プロパンジオールを
生物的に生産するやり方である。1,3−プロパンジオールの生物的生産は2−
段階連続反応のための基質としてグリセロールを必要とし、その反応ではデヒド
ラターゼ酵素(典型的には補酵素B12−依存性デヒドラターゼ)がグリセロール
を中間体である3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに転換し、それが次いでN
ADH−(もしくはNADPH)依存性オキシドレダクターゼにより1,3−プ
ロパンジオールに還元される。補因子が必要であることの複雑さは、1,3−プ
ロパンジオールの生産のためにこの反応系列を使用する工業的プロセスのために
全細胞触媒の使用を必要とする。
における、且つ1つの微生物の使用での発酵可能な炭素源の1,3−プロパンジ
オールへの直接の生物的転換を提供する。モデル基質としてグルコースを用い、
モデル宿主としてE.コリ(E.coli)を用いる。本発明の1つの側面にお
いて、1群の遺伝子(デヒドラターゼ活性、デヒドラターゼ再活性化因子、1,
3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)、グリセロール−3−
リン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセロール−3−ホスファターゼをコードする遺
伝子を含む)を発現する組換えE.コリがグリセロールから1,3−プロパンジ
オールへの発酵の力価に近い力価でグルコースを1,3−プロパンジオールに転
換する。
除去が、グルコースからの1,3−プロパンジオールの有意により高い力価を生
ずる。この予測されなかった力価における増加は経済性の向上及びかくしてグル
コースからの1,3−プロパンジオールの生産のための改良法を生ずる。
ロールの酸化状態におけるC3化合物(例えばグリセロール3−リン酸)あるい
は4)ジヒドロキシアセトンの酸化状態におけるC3化合物(例えばジヒドロキ
シアセトンリン酸又はグリセルアルデヒド3−リン酸)に容易に転換されるいず
れの炭素基質をも含むように一般的に応用され得る。dhaTマイナス株におけ
る1,3−プロパンジオールの生産は、3−HPAを1,3−プロパンジオール
に転換する非−特異的触媒活性を必要とする。3−HPAを1,3−プロパンジ
オールに転換する非−特異的触媒活性を担う単数もしくは複数の酵素及び/又は
単数もしくは複数の遺伝子の同定は、広範囲の炭素−含有基質からの基質を用い
る広範囲の宿主微生物における1,3−プロパンジオールの生産に導くであろう
。3−HPAを1,3−プロパンジオールに転換するこの非−特異的触媒活性の
使用が、増加する力価及び得られる向上した経済性のおかげで、グリセロール又
はジヒドロキシアセトンからの1,3−プロパンジオールの生産のための改良法
に導くであろうことも予測される。
離された核酸フラグメント; (b)配列番号:57のアミノ酸配列のすべて又は実質的部分をコードする単
離された核酸フラグメントに実質的に類似している単離された核酸フラグメント
; (c)配列番号:57のアミノ酸配列の少なくとも80%(at least
80% with)を有する少なくとも387個のアミノ酸のポリペプチドを
コードする単離された核酸フラグメント; (d)0.1XSSC、0.1%SDS、65℃のハイブリダイジェーション
条件下で(a)とハイブリダイジェーションし、2XSSC、0.1%SDS、
及び続いて0.1XSSC、0.1%SDSを用いて洗浄された単離された核酸
フラグメント;ならびに (d)(a)、(b)、(c)又は(d)に相補的である単離された核酸フラ
グ
メント より成る群から選ばれる、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの1,3−プロ
パンジオールへの転換のための非−特異的触媒活性をコードする核酸フラグメン
トとしてE.コリから単離された。あるいはまた、非特異的触媒活性は配列番号
:57に示されるポリペプチドにおいて具体化される。
含むキメラ遺伝子を構築することができる。このキメラ遺伝子を用いてシトロバ
クテル、エンテロバクテル(Enterobacter)、クロスツリジウム、
クレブシエラ、アエロバクテル(Aerobacter)、ラクトバシルス、ア
スペルギルス(Aspergillus)、サッカロミセス、シゾサッカロミセ
ス(Schizosaccharomyces)、チゴサッカロミセス(Zyg
osaccharomyces)、ピチア(Pichia)、クルイベロミセス
(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(
Hansenula)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ムコル
(Mucor)、トルロプシス(Torulopsis)、メチロバクテル(M
ethylobacter)、サルモネラ(Salmonella)、バシルス
(Bacillus)、アエロバクテル(Aerobacter)、ストレプト
ミセス(Streptomyces)、エシェリキア及びシュードモナス(Ps
eudomonas)より成る群から選ばれる微生物を形質転換することができ
る。E.コリが好ましい宿主である。
するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子;(b)グリセロール−
3−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺
伝子;(c)デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも
1つの遺伝子;(d)デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも1つ
の遺伝子;(e)3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオ
ールに転換するのに十分な非−特異的触媒活性をコードする少なくとも1つの内
因性遺伝子を含み、1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードす
る機能性dhaT遺伝子が存在しない1,3−プロパンジオールの生産に有用な
組換え微生物を提供する。好ましい態様は、dhaT遺伝子が存在しない組換え
微生物(好ましくはE.コリ)である。場合により組換え微生物は:(a)グリ
セロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子;(b)グリセ
ロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子;(c)
トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子よ
り成る群から選ばれる内因性遺伝子において突然変異(例えば欠失突然変異又は
点突然変異)を含んでいることができる。 ヌ 他の態様において、本発明は:(a)適した条件下で、dhaレギュロンを
含み且つ1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする機能
性dhaT遺伝子が欠けている組換えE.コリを単糖類、オリゴ糖類、多糖類及
び1−炭素基質より成る群から選ばれる少なくとも1つの炭素源と接触させ;(
b)(a)で生産される1,3−プロパンジオールを場合により回収することを
含む1,3−プロパンジオールの生産のための方法を含む。
−炭素基質より成る群から選ばれる少なくとも1つの炭素源と接触させ、それに
より1,3−プロパンジオールを生産し;(b)(a)で生産される1,3−プ
ロパンジオールを場合により回収することを含む、組換え微生物からの1,3−
プロパンジオールの生産のための方法も提供する。
も1つの遺伝子; (ii)デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも1つの遺
伝子; (iii)3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジ
オールに転換するのに十分な非−特異的触媒活性をコードする少なくとも1つの
内因性遺伝子 を含み;1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする機能性d
haT遺伝子が存在しない組換え微生物を、グリセロール及びジヒドロキシアセ
トンより成る群から選ばれる少なくとも1つの炭素源と接触させ、そこにおいて
1,3−プロパンジオールを生産し; (b)(a)で生産される1,3−プロパンジオールを場合により回収する ことを含む、組換え微生物からの1,3−プロパンジオールの生産のための方法
を提供することを目的とする。
ジオールの生産のためのこの態様において、段階は:(a)組換えE.コリを第
1の炭素源及び第2の炭素源と接触させ、該組換えE.コリは:(i)デヒドラ
ターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの外因性遺伝子;
(ii)デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも1つの外因性遺伝
子;(iii)3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオー
ルに転換するのに十分な非−特異的触媒活性をコードする少なくとも1つの外因
性遺伝子を含み、ここで組換えE.コリ中に1,3−プロパンジオールオキシド
レダクターゼ活性をコードする機能性dhaT遺伝子は存在せず、且つここで該
第1の炭素源はグリセロール及びジヒドロキシアセトンより成る群から選ばれ、
該第2の炭素源は単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び1−炭素基質より成る群から
選ばれ;(b)(a)で生産される1,3−プロパンジオールを場合により回収
する段階である。共−供給は連続的又は同時であることができる。共−供給の態
様において用いられる組換えE.コリはさらに:(a)(i)グリセロール−3
−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1
つの遺伝子;(ii)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする少なくとも1つの遺伝子;及び(iii)dhaR、orfY
、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3及びorfZの遺
伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも1つのサブセットより成る1組の外因
性遺伝子、ならびに(b)各遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有し:(
i)グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子;(i
i)グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝
子;及び(III)トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子より成る1組の内因性遺伝子を含むことができる。
異を有し:(i)グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子;及び(ii)グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子より成る2つの内因性遺伝子の1組;(b)グリセロール−
3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも
1つの外因性遺伝子;(c)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポ
リペプチドをコードする少なくとも1つの外因性遺伝子;ならびに(d)プラス
ミドpKP32を含む組換えE.コリ株KLP23ならびに(a)各遺伝子が遺
伝子を不活性化する突然変異を有し:(i)グリセロールキナーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子;(ii)グリセロールデヒドロゲナーゼ活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子;及び(iii)トリオースリン酸イ
ソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子より成る3つの内因性
遺伝子の組を含む組換えE.コリ株RJ8が含まれる。
をコードする少なくとも1つの遺伝子;(ii)グリセロール−3−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子;
(iii)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする少なくとも1つの遺伝子;及び(iv)デヒドラターゼ再活性化因子をコ
ードする少なくとも1つの遺伝子より成る1組の外因性遺伝子;ならびに(b)
3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオールに転換する非
−特異的触媒活性をコードする少なくとも1つの内因性遺伝子を含む組換えE.
コリが含まれ、ここで組換えE.コリ中には1,3−プロパンジオールオキシド
レダクターゼ活性をコードする機能性dhaT遺伝子が存在しない。
有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子;(ii)グリセロー
ル−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つ
の遺伝子;及び(iii)dhaR、orfY、orfX、orfW、dhaB
1、dhaB2、dhaB3及びorfZの遺伝子産物をコードする遺伝子の少
なくとも1つのサブセットより成る1組の外因性遺伝子、ならびに(b)3−ヒ
ドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオールに転換する非−特異
的触媒活性をコードする少なくとも1つの内因性遺伝子を含む組換えE.コリで
あり、ここで組換えE.コリ中には1,3−プロパンジオールオキシドレダクタ
ーゼ活性をコードする機能性dhaT遺伝子が存在しない。この態様は、それぞ
れの遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有する1組の内因性遺伝子をさら
に含む組換えE.コリを用いる方法も包含し、該組は:(a)グリセロールキナ
ーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子;(b)グリセロールデヒド
ロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子;及び(c)トリオー
スリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子から成る。
ately disclosed)組換えE.コリを単糖類、オリゴ糖類、多糖
類及び1−炭素基質より成る群から選ばれる少なくとも1つの炭素源と接触させ
、それにより1,3−プロパンジオールを生産し;(b)(a)で生産される1
,3−プロパンジオールを場合により回収することを含む1,3−プロパンジオ
ールの生物的生産のための方法を含む。
をコードする少なくとも1つの外因性遺伝子;(ii)デヒドラターゼ再活性化
因子をコードする少なくとも1つの外因性遺伝子;(iii)3−ヒドロキシプ
ロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性
をコードする少なくとも1つの内因性遺伝子を含む開示したばかりの態様の組換
えE.コリをグリセロール及びジヒドロキシアセトンより成る群から選ばれる少
なくとも1つの炭素源と接触させ、(b)(a)で生産される1,3−プロパン
ジオールを場合により回収することを含む1,3−プロパンジオールの生物的生
産のためのさらに別の方法も包含する。
託から、本発明をさらに十分に理解することができる。
を表す。
発酵実験の間で比較される細胞外可溶性タンパク質(g/L)のグラフを表す。
実線の1つの場合、用いられた株はKLP23/pAH48/pKP32であっ
た。破線の他の場合、用いられた株はKLP23/pAH48/pDT29であ
った。
発酵実験の間で比較される細胞生存率[(生存細胞/mL)/OD550]のグ
ラフを表す。1つの場合(実線)、用いられた株はKLP23/pAH48/p
KP32であった。他の場合(破線)、用いられた株はKLP23/pAH48
/pDT29であった。
在下における2つの発酵実験の間で比較されるグルコースからのグリセロールの
収率のグラフを表す。1つの場合(実線)、用いられた株はKLP23/pAH
48/pKP32であった。他の場合(破線)、用いられた株はKLP23/p
AH48/pDT29であった。
ある。
クターゼ活性(非−特異的触媒活性)を示すバンドから抽出される可溶性タンパ
ク質画分を用いた2D−PAGE膜ブロットである。
.821−1.825(“Requirements for Patent
Applications Containing Nucleotide S
equences and/or Amino Acid Sequence
Disclosures−the Sequence Rules”)に示され
ている特許出願におけるヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列開示を管理してい
る規則に従い、World Intellectual Property O
rganization(WIPO) Standard ST2.5(198
8)ならびにEPO及びPCTの配列表条件(Administration
InstructionsのRules 5.2及び49.5(a−bis)及
びSection 208及びAnnex C)と一致するであろう。配列の記
載は、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるNucleic
Acids Res.13,3021−3030(1985)及びBioch
emical Journal 209,345−373(1984)に記載さ
れているIUPAC−IYUB標準に準拠して定義されるヌクレオチド配列記号
に関する1文字コード及びアミノ酸に関する3文字コードを含有する。
en,CT)中にサブクローニングされ、pHK28−26と命名されたpKP
1(クレブシエラ・ニューモニアエからのDNAを含有するコスミド)からの1
2.1kbのEcoRI−SalIフラグメントから決定されるヌクレオチド配
列を含有する。表1がさらに配列番号:1内で同定される遺伝子、対応する塩基
対及び関連する機能を詳細に示している。実施例1も参照されたい。
tional Recognition of the Deposit of
Microorganisms for the Purposes of
Patent Procedureの協約の下に以下の生物の寄託を行った: 配列番号:58はYahDに関して決定されるアミノ酸配列を含有する。 寄託者確認 国際寄託所参照(reference) 名 寄託の日付 グリセロールデヒドラターゼ酵素を ATCC 69789 1995年4月18日 コードするクレブシエラゲノムの1部 を含有する形質転換E.コリDH5α ジオールデヒドラターゼ酵素を ATCC 69790 1995年4月18日 コードするクレブシエラゲノムの1部 を含有するコスミドpKP4を含有する 形質転換E.コリDH5α E.コリMSP33.6 ATCC 98598 1997年11月25日 glpK突然変異株 ATCC 98597 1997年11月25日 E.コリRJF10m 寄託物は示した国際寄託所に少なくとも30年間保持され、それを開示してい
る特許が認可されると公共に利用可能とされるであろう。寄託物の利用可能性は
、政府の指令により認可される特許権の減損において本発明を実施する許諾を構
成しない。
Blvd.,Manassas,VA 20110−2209 U.S.A.
にあるAmerican Type Culture Collection国
際寄託所を指す。「ATCC番号」は、ATCCに寄託した際の培養物への受け
入れ番号である。
を用いて生物的に転換するための改良法を提供する。該方法は増加した力価、収
率及び細胞生存率ならびに発酵の間の細胞ライシスの減少を特徴とする。
む1,3−プロパンジオール発酵プロセスが培地中における高いレベルの3HP
A及び他のアルデヒド及びケトンを特徴とし、それが細胞生存率の減少と関連し
ているという観察に部分的に基づいている。本発明は、モデル宿主であるE.コ
リが、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオールに転換
できる内因性非−特異的触媒活性により、3−HPAを1,3−プロパンジオー
ルに転換できるという予期せぬ発見にも部分的に基づいている。本発明はさらに
、この非−特異的触媒活性を含み且つ機能性dhaTが欠けているE.コリ発酵
プロセスが発酵の間に細胞生存率の向上を生じ、機能性dhaTを含む発酵プロ
セスより高い1,3−プロパンジオールの力価及び/又は収率を与えるという予
期せぬ発見に部分的に基づいている。
3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性がないように野生−型dhaT
における突然変異を有しており、且つ3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1
,3−プロパンジオールに転換するのに十分な非−特異的触媒活性を含んでいる
。他の側面においては、グルコースがモデル基質であり、組換えE.コリがモデ
ル宿主である。この側面の場合、E.コリは3−ヒドロキシプロピオンアルデヒ
ドを1,3−プロパンジオールに転換するのに十分な内因性非−特異的触媒活性
を含んでいる。1つの態様の場合、非−特異的触媒活性はアルコールデヒドロゲ
ナーゼである。
ーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子:(b)グ
リセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なく
とも1つの遺伝子;(c)デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードす
る少なくとも1つの遺伝子;(d)デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少
なくとも1つの遺伝子;及び(e)3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,
3−プロパンジオールに転換するのに十分な非−特異的触媒活性をコードする少
なくとも1つの内因性遺伝子を含む1群の遺伝子を発現する組換えE.コリを提
供し;この微生物の使用は高い力価でグルコースを1,3−プロパンジオールに
転換する。本発明の他の側面において、この組換えE.コリ中の機能性dhaT
遺伝子の除去は、以前に得られたより予期せぬ程高いグルコースからの1,3−
プロパンジオールの力価を与える。
オールの生物的生産のための改良法を提供する。本発明の1つの側面において、
1,3−プロパンジオールへのグルコースの転換のための改良法は、クレブシエ
ラ・ニューモニアエdhaレギュロン遺伝子dhaR、orfY、dhaT、o
rfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3及びorfZを用いて
形質転換された宿主E.コリを含む組換え微生物の使用により達成され、これら
の遺伝子のすべては野生型クレブシエラ・ニューモニアエ中に存在すると同じ遺
伝子体制で配置される。発酵プロセスに関して得られる力価は、類似の発酵に関
して以前に報告されたいずれの力価よりも有意に高い。この向上は実施例6及び
実施例7で記載するプラスミドpDT29の使用に頼っている。
ーゼ、デヒドラターゼ再活性化因子及び又機能性dhaTをコードする遺伝子を
含有する組換えE.コリを用いる方法と比較して、グルコースからの1,3−プ
ロパンジオールの生産のためのさらに改良された方法が、G3PDH、G3Pホ
スファターゼ、デヒドラターゼ及びデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺
伝子を含有する組換えE.コリを用いて達成される。劇的に改良された方法は、
E.コリ中に存在する、アルコールデヒドロゲナーゼであると予測される非−特
異的触媒活性をコードする内因性遺伝子に頼っている。
ル力価の向上として明らかである。該方法における向上は、発酵ブイヨン中の細
胞外可溶性タンパク質濃度により決定される細胞ライシスの減少としても明らか
である。本発明のこの側面を図2に示す。さらに該方法における向上は、発酵の
経過に及ぶ長期間の細胞生存率(prolonged cell viabil
ity)として明らかである。本発明のこの側面を図3に示す。さらに本発明に
おける向上は収率の向上としても明らかである。1,3−プロパンジオールオキ
シドレダクターゼ(dhaT)を発現するE.コリ(例えばプラスミドpDT2
9を用いて形質転換されたE.コリKLP23)においては、グリセロールは3
−HPA以外の産物に代謝され得る。まさに対照的に、1,3−プロパンジオー
ルオキシドレダクターゼ(dhaT)を発現しないE.コリ(例えばプラスミド
pKP32を用いて形質転換されたE.コリKLP23)においては、グリセロ
ールは3−HPA以外の産物に代謝されない。この謎の経路が機能性dhaTの
存在もしくは不在に帰せられ得ることは、図4に示すようなグルコースからのグ
リセロールのより低い収率により示される。
用語が用いられ得る。
ドロキシアセトンリン酸(DHAP)のグリセロール−3−リン酸(G3P)へ
の転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す。生体内でG3PDHはN
ADH;NADPH;又はFAD−依存性であることができる。補因子特異的グ
リセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼを特定的に指す場合、「NADH−依
存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」、「NADPH−依存性グリ
セロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」及び「FAD−依存性グリセロール−
3−リン酸デヒドロゲナーゼ」の用語が用いられるであろう。NADH−依存性
及びNADPH−依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼがNADH
及びNADPHを互換的に用いることができるのが一般に実情なので(例えばg
psAによりコードされる遺伝子により)、NADH−依存性及びNADPH−
依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの用語は互換的に用いられる
であろう。NADH−依存性酵素(E.C.1.1.1.8)は例えばGPD1
(GenBank Z74071x2)又はGPD2(GenBank Z35
169x1)又はGPD3(GenBank G984182)又はDAR1(
GenBank Z74071x2)を含むいくつかの遺伝子によりコードされ
る。NADPH−依存性酵素(EC 1.1.1.94)はgpsA(GenB
ank U321643、(cds 197911−196892)G4667
46及びL45246)によりコードされる。FAD−依存性酵素(EC 1.
1.99.5)はGUT2(GenBank Z47047x23)又はglp
D(GenBank G147838)又はglpABC(GenBank M
20938)によりコードされる(引用することによりその記載事項が本明細書
の内容となるWO 9928480及びその中の引用文献を参照されたい)。
ァターゼ」又は「d,l−グリセロールホスファターゼ」及び「G3Pホスファ
ターゼ」という用語は、グリセロール−3−リン酸と水のグリセロールと無機リ
ン酸塩への転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す。G3Pホスファ
ターゼは例えばGPP1(GenBank Z47047x125)又はGPP
2(GenBank U18813x11)によりコードされる(引用すること
によりその記載事項が本明細書の内容となるWO 9928480及びその中の
引用文献を参照されたい)。
ル−3−リン酸とADPへの転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す
。高−エネルギーリン酸ドナーATPを生理学的代用物(例えばホスホエノール
ピルビン酸)により置き換えることができる。グリセロールキナーゼは例えばG
UT1(GenBank U11583x19)及びglpK(GenBank
L19201)によりコードされる(引用することによりその記載事項が本明
細書の内容となるWO 9928480及びその中の引用文献を参照されたい)
。
シアセトンへの(E.C.1.1.1.6)又はグリセロールのグリセルアルデ
ヒドへの(E.C.1.1.1.72)の転換を触媒する酵素活性を担うポリペ
プチドを指す。グリセロールのジヒドロキシアセトンへの転換を触媒する酵素活
性を担うポリペプチドは「ジヒドロキシアセトンレダクターゼ」とも言われる。
グリセロールデヒドロゲナーゼはNADH(E.C.1.1.1.6)、NAD
PH(E.C.1.1.1.72)又は他の補因子(例えばE.C.1.1.9
9.22)に依存性であることができる。NADH−依存性グリセロールデヒド
ロゲナーゼは例えばgldA(GenBank U00006)によりコードさ
れる(引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるWO 9928
480及びその中の引用文献を参照されたい)。
ロキシプロピオンアルデヒドへのグリセロール分子の転換を触媒する酵素活性を
指す。本発明の目的の場合、デヒドラターゼ酵素はグリセロールデヒドラターゼ
(E.C.4.2.1.30)及びジオールデヒドラターゼ(E.C.4.2.
1.28)を含み、それぞれグリセロール及び1,2−プロパンジオールの好ま
しい基質を有する。デヒドラターゼ酵素のための遺伝子はクレブシエラ・ニュー
モニアエ、シトロバクテル・フレウンジイ、クロスツリジウム・パステウリアヌ
ム、サルモネラ・チフィムリウム及びクレブシエラ・オキシトカにおいて同定さ
れている。それぞれの場合にデヒドラターゼは3つのサブユニット:大もしくは
「α」サブユニット、中もしくは「β」サブユニット及び小もしくは「γ」サブ
ユニットから構成されている。文献中で用いられる遺伝子命名法が多様なので、
同定を容易にするために比較チャートを表1に示す。遺伝子は例えばDanie
l et al.(FEMS Microbiol.Rev.22,553(1
999))及びToraya and Mori(J.Biol.Chem.2
74,3372(1999))にも記載されている。表1を参照すると、グリセ
ロールデヒドラターゼの大もしくは「α」サブユニットをコードする遺伝子はd
haB1、gldA及びdhaBを含み;中もしくは「β」サブユニットをコー
ドする遺伝子はdhaB2、gldB及びdhaCを含み;小もしくは「γ」サ
ブユニットをコードする遺伝子はdhaB3、gldC及びdhaEを含む。や
はり表1を参照すると、ジオールデヒドラターゼの大もしくは「α」サブユニッ
トをコードする遺伝子はpduC及びpddAを含み;中もしくは「β」サブユ
ニットをコードする遺伝子はpduD及びpddBを含み;小もしくは「γ」サ
ブユニットをコードする遺伝子はpduE及びpddCを含む。
基質による機構に基づく自殺不活性化を受け易い(Daniel et al.
,FEMS Microbiol.Rev.22,553(1999))。「デ
ヒドラターゼ再活性化因子」という用語は、デヒドラターゼ活性の再活性化を担
うタンパク質を指す。「デヒドラターゼ再活性化活性」、「デヒドラターゼ活性
の再活性化」又は「デヒドラターゼ活性の再生」という用語は、基質への触媒作
用のできないデヒドラターゼを基質への触媒作用のできるものに転換する現象あ
るいはデヒドラターゼの不活性化を阻害する現象あるいは生体内におけるデヒド
ラターゼ酵素の有効半減期を延長する現象を指す。2つのタンパク質がデヒドラ
ターゼ再活性化因子として含まれるものとして同定されている(引用することに
よりその記載事項が本明細書の内容となるWO 9821341(US 601
3494)及びその中の引用文献;Daniel et al.,同上;Tor
aya and Mori,J.Biol.Chem.274,3372(19
99);及びTobimatsu et al.,J.Bacteriol.1
81,4110(1999)を参照されたい)。表1を参照すると、タンパク質
の1つをコードする遺伝子はorfZ、dhaB4、gdrA、pduG及びd
drAを含む。やはり表1を参照すると、2つのタンパク質の第2のものをコー
ドする遺伝子はorfX、orf2b、gdrB、pduH及びddrBを含む
。
オールデヒドロゲナーゼ」又は「DhaT」という用語は、3−HPAと1,3
−プロパンジオールの相互転換を触媒することができる酵素活性を担う単数もし
くは複数のポリペプチドを指し、但し、そのような活性をコードする単数もしく
は複数の遺伝子はその自然の(すなわち野生型の)背景(setting)にお
いてデヒドラターゼ酵素に物理的又は転写的に結合していることが見いだされて
おり;例えば該遺伝子はクレブシエラ・ニューモニアエからのdhaTの場合に
そうであるようにdhaレギュロン内で見いだされる。表1を参照すると、1,
3−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子はクレブシエラ
・ニューモニアエ、シトロバクテル・フレウンジイ及びクロスツリジウム・パス
テウリアヌムからのdhaTを含む。これらの遺伝子のそれぞれはIII型アル
コールデヒドロゲナーゼの群に属するポリペプチドをコードし、保存された鉄−
結合モチーフを示し、3−HPAと1,3−プロパンジオールのNAD+/NA
DH結合相互転換に関する優先性を有する(Johnson and Lin,
J.Bacteriol.169,2050(1987);Daniel et
al.,J.Bacteriol.177,2151(1995);及びLe
urs et al.,FEMS Microbiol.Lett.154,3
37(1997))。類似の物理的性質を有する酵素がラクトバシルス・ブレビ
ス及びラクトバシルス・ブクネリから単離されている(Veiga da Du
nha and Foster,Appl.Environ.Microbio
l.58,2005(1992))。
1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含むがこれらに限られない種
々の生物学的活性をコードする1組の関連遺伝子又は読取り枠を指す。典型的に
は、dhaレギュロンは本明細書に記載する読取り枠dhaR、orfY、dh
aT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3及びorfZ
を含む。
ルの相互転換を触媒するのに十分な酵素活性を担う単数もしくは複数のポリペプ
チドを指し、特に単数もしくは複数の1,3−プロパンジオールオキシドレダク
ターゼを含む。典型的には、これらの酵素はアルコールデヒドロゲナーゼである
。そのような酵素はNAD+/NADH以外の補因子を利用することができ、そ
れらにはFAD又はFMNのようなフラビンが含まれるがこれらに限られない。
単数もしくは複数の非−特異的アルコールデヒドロゲナーゼのための単数もしく
は複数の遺伝子は、例えば微生物E.コリKLP23内で内因的にコードされ、
且つ機能的に発現されることが見いだされる。
エネルギーの改変における酵素の触媒活性を指す。そのような活性を、適した条
件下で産物又は基質のいずれかの生産が行われ得る平衡における反応に適用し得
ることが理解される。
れ得る炭素源、そして特に単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び1−炭素基質又はそ
れらの混合物より成る群から選ばれる炭素源を指す。
or heterologous genes)を受容し、且つこれらの遺伝
子を発現して活性な遺伝子産物を生産できる微生物を指す。
n DNA)」、「異種遺伝子(heterologous gene)及び「
異種DNA(heterologous DNA)」という用語は、種々の手段
により宿主微生物内に置かれた、1つの生物にとって自然である(native
)遺伝物質を指す。問題の遺伝子は自然に存在する遺伝子、突然変異遺伝子又は
合成遺伝子であることができる。
細胞における新しい遺伝子の獲得を指す。獲得した遺伝子を染色体DNA中に組
込むか、又は染色体外複製配列として導入することができる。「形質転換細胞」
という用語は、形質転換の産物を指す。
を変更するプロセスを指す。
同種遺伝子(homologous genes)の余分のコピーを用いて形質
転換された微生物を指す。本発明の組換え微生物は、適した炭素基質からの1,
3−プロパンジオールの生産のためにグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナー
ゼ(GPD1)、グリセロール−3−ホスファターゼ(GPP2)、グリセロー
ルデヒドラターゼ(dhaB1、dhaB2及びdhaB3)、デヒドラターゼ
再活性化因子(orfZ及びorfX)ならびに場合により1,3−プロパンジ
オールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする異種遺伝子を発現する。
好ましい態様は、これらの遺伝子を用いて形質転換されているが機能性dhaT
を欠いているE.コリである。開示する遺伝子ならびに特に単数もしくは複数の
1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)を除く3−HPA
及び1,3−プロパンジオールの相互転換のための非−特異的触媒活性のための
遺伝子を含有するように、E.コリ以外の宿主微生物を形質転換することもでき
る。
領域に先行する(5’非−コード)及び続く(3’非−コード)調節配列を含む
。「自然の」及び「野生−型」という用語は、それ自身の調節配列を有して自然
に存在する遺伝子を指す。
は、遺伝子が転写及び翻訳の機構を介してアミノ酸配列を生産するプロセスを指
す。特定のアミノ酸配列をコードするプロセスは、コードされるアミノ酸におけ
る変化を引き起こさない塩基の変化を含み得るDNA配列、あるいは1つもしく
はそれより多くのアミノ酸を改変させ得るが、DNA配列によりコードされるタ
ンパク質の機能性に影響しない塩基の変化を含むDNA配列を含むと理解される
。従って本発明は特定の代表的配列以上のものを包含すると理解される。
分から取り出されるタンパク質又はDNA配列を指す。
、非−天然の、もしくは改変されたヌクレオチド塩基を含有することができるR
NAもしくはDNAのポリマーである。DNAのポリマーの形態における単離さ
れた核酸分子はcDNA、ゲノムDNA又は合成DNAの1つもしくはそれより
多いセグメントを含み得る。
る変化が1つもしくはそれより多いアミノ酸の置換を生ずるが、DNA配列によ
りコードされるタンパク質の機能性に影響しない核酸分子を指す。「実質的に類
似の」は、1つもしくはそれより多くのヌクレオチド塩基における変化がアンチ
センス又は共−抑制法(co−suppression technology
)により、遺伝子発現の改変を媒介する核酸分子の能力に影響しない核酸分子も
指す。「実質的に類似の」は、アンチセンスもしくは共−抑圧法による遺伝子発
現の改変あるいは得られるタンパク質分子の機能性の改変を媒介する能力に関連
して(vis−a−vis)、得られる転写産物の機能性に実質的に影響しない
、本発明の核酸分子の修正(例えば1つもしくはそれより多いヌクレオチド塩基
の欠失又は挿入)も指す。本発明は特定の代表的配列以上の物を包含する。
ードされるタンパク質の機能性に影響しない遺伝子における改変が普通であるこ
とは当該技術分野において周知である。本発明の目的のために、置換を以下の5
つの群の1つ内における交換として定義する: 1.小さい脂肪族の、非極性もしくはわずかに極性の残基:Ala、Ser、
Thr(Pro,Gly); 2.極性の、負に帯電した残基及びそれらのアミド:Asp、Asn、Glu
、Gln; 3.極性の、正に帯電した残基:His、Arg、Lys; 4.大きい脂肪族の、非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys
);及び 5.大きい芳香族残基:Phe、Tyr、Trp。
疎水性の低い残基(例えばグリシン)あるいはもっと疎水性の高い残基(例えば
バリン、ロイシンもしくはイソロイシン)をコードするコドンにより置換され得
る。同様に、1つの負に帯電した残基の別のもののために代わる置換(例えばグ
ルタミン酸のために代わるアスパラギン酸)あるいは1つの正に帯電した残基の
別のものために代わる置換(例えばアルギニンのために代わるリシン)を生ずる
変化も機能的に同等の産物を生産すると予測され得る。
レオチド変化もタンパク質の活性を改変するとは予測されない。
であり、コードされる産物の生物学的活性の保持の決定もそうである。さらに熟
練者には、本発明により包含される実質的に類似の配列が、緊縮条件(0.1X
SSC、0.1%SDS、65℃ならびに2XSSC、0.1%SDS及び続い
て0.1XSSC、0.1%SDSを用いる洗浄)下で本明細書に例示する配列
とハイブリダイジェーションするそれらの能力によっても定義されることがわか
る。本発明の好ましい実質的に類似の核酸フラグメントは、そのDNA配列が本
明細書に報告する核酸フラグメントのDNA配列と少なくとも80%同じである
核酸フラグメントである。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告す
る核酸フラグメントのDNA配列と少なくとも90%同じである。最も好ましい
のは、本明細書に報告する核酸フラグメントのDNA配列と少なくとも95%同
じ核酸フラグメントである。
オン強度の条件下で他の核酸フラグメントにアニーリングできる場合、cDNA
、ゲノムDNA又はRNAのような別の核酸フラグメントに「ハイブリダイジェ
ーション可能」である。ハイブリダイジェーション及び洗浄条件は周知であり、
Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis
,T.Molecular Cloning:A Laboratory Ma nual, Second Edition,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,Cold Spring Harb
or(1989)、特にその中のChapter 11及びTable 11.
1(引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる)に例示され
ている。温度及びイオン強度の条件はハイブリダイジェーションの「緊縮性」を
決定する。相同核酸に関する予備的スクリーニングのために、55oのTmに対
応する、例えば5XSSC、0.1%SDS、0.25%ミルク且つホルムアミ
ドなし;あるいは30%ホルムアミド、5XSSC、0.5%SDSの低緊縮性
性ハイブリダイジェーション条件を用いることができる。中緊縮性ハイブリダイ
ジェーション条件はもっと高いTm、例えば40%ホルムアミド及び5Xもしく
は6XSSCに対応する。ハイブリダイジェーションは、2つの核酸が相補配列
を含有することを必要とするが、ハイブリダイジェーションの緊縮性に依存して
、塩基間のミスマッチが可能である。ハイブリダイジェーションする核酸のため
の適した緊縮性は、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さ及び相補
性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列の間の類似性又は相同性の程度が
高い程、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのTmの値が大きい。
核酸ハイブリダイジェーションの相対的安定性(より高いTmに対応する)は以
下の順序で低下する:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。長さ
が100ヌクレオチドより長いハイブリッドのために、Tmを計算するための式
が誘導されている(Sambrook et al.,同上,9.50−9.5
1を参照されたい)。比較的短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを用いるハ
イブリダイジェーションの場合、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌ
クレオチドの長さがその特異性を決定する(Sambrook et al.,
同上,9.50−9.51を参照されたい)。1つの態様において、ハイブリダ
イジェーション可能な核酸のための長さは少なくとも約10ヌクレオチドである
。ハイブリダイジェーション可能な核酸のための好ましい最低の長さは少なくと
も約15ヌクレオチド;より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドであり;
そして最も好ましくは該長さは少なくとも30ヌクレオチドである。さらに熟練
者には、温度及び洗浄溶液塩濃度をプローブの長さのような因子に従って必要通
りに調整できることがわかるであろう。
コンピューター−自動化配列比較及びBLAST(Basic Local A
lignment Search Tool;Altschul et al.
,J.Mol.Biol.215:403−410(1993);www.nc
bi.nlm.nih.gov/BLAST/も参照されたい)のようなアルゴ
リズムを用いる同定により、ポリペプチド又は遺伝子の推定的同定を与えるのに
十分なポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列を含むアミノ
酸又はヌクレオチド配列を指す。一般に、ポリペプチド又は核酸配列を既知のタ
ンパク質又は遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、10もしくはそ
れより多い連続アミノ酸又は30もしくはそれより多いヌクレオチドの配列が必
要である。さらにヌクレオチド配列に関し、20〜30の連続ヌクレオチドを含
む遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定の配列−依存的方
法(例えばサザンハイブリダイジェーション)及び単離(例えばバクテリアコロ
ニー又はバクテリオファージプラークのその場ハイブリダイジェーション)にお
いて用いることができる。さらに、12〜15塩基の短いオリゴヌクレオチドを
PCRにおける増幅プライマーとして用い、プライマーを含む特定の核酸分子を
得ることができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、配列を含む
核酸分子の特異的同定及び/又は単離を与えるのに十分な配列を含む。本明細書
は、1つもしくはそれより多い特定のタンパク質をコードする部分的もしくは完
全なアミノ酸及びヌクレオチド配列を記載する。本明細書に報告する配列の恩恵
を受ける熟練者は今や、当該技術分野における熟練者に既知の目的のために、開
示される配列のすべて又は実質的部分を用いることができる。従って本発明は付
随する配列表において報告する完全な配列ならびに上記で限定した配列の実質的
部分を含む。
ヌクレオチド塩基間の関係を記述する。例えばDNAに関し、アデノシンはチミ
ンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って本発明は、付随
する配列表において報告する完全な配列ならびに実質的に類似の核酸配列に相補
的である単離された核酸分子も含む。
により決定される2つもしくはそれより多くのポリペプチド配列又は2つもしく
はそれより多くのポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野におい
て「同一性」も、場合次第でポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列の列(
strings)の間の対合により決定されるポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチド配列の間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」及び「類似性」は既
知の方法により容易に計算することができ、該方法には:Computatio
nal Molecular Biology;Lesk,A.M.,Ed.;
Oxford University Press:New York,198
8;Biocomputing:Informatics and Genom
e Projects;Smith,D.W.,Ed.;Academic P
ress:New York,1993;Computer Analysis
of Sequence Data,Part I;Griffin,A.M
.and Griffin,H.G.,Eds;Humana Press:N
ew Jersey,1994;Sequence Analysis in
Molecular Biology;von Heinje,G.,Ed.;
Academic Press:New York,1987;及びSeque
nce Analysis Primer;Gribskov,M.and D
evereux,J.,Eds.;Stockton Press:New Y
ork,1991に記載されている方法が含まれるがこれらに限られない。同一
性の決定の好ましい方法は、調べられている配列の間の最大の対合を与えるよう
に設計される。
ラムにおいて系統化されている。2つの配列の間の同一性及び類似性を決定する
好ましいコンピュータープログラム法には、ギャップクリエーションペナルティ
ー(gap creation penalty)=12及びギャップエクステ
ンションペナルティー(gap extension penalty)=4の
それらの標準的デフォールト値を有するNeedleman and Wuns
chアルゴリズムを用いるGCGプログラムパッケージ中に存在するGCG P
ileupプログラム(Devereux et al.,Nucleic A
cids Res.12:387−395(1984))、BLASTP、BL
ASTN及びFASTA(Pearson et al.,Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 85:2444−2448(1988)が含まれ
るがこれらに限られない。BLASTXプログラムはNCBI及び他の供給源か
ら公共的に入手可能である(BLAST Manual,Altschul e
t al.,Natl.Cent.Biotechnol.Inf.,Natl
.Library Med.(NCBI NLM)NIH,Bethesda,
Md.20894;Altschul et al.,J.Mol.Biol.
215:403−410(1990);Altschul et al.,“G
apped BLAST and PSI−BLAST:a new gene
ration of protein database search pr
ograms”,Nucleic Acids Res.25:3389−34
02(1997))。パーセント同一性の決定のための他の好ましい方法は、J
otun−Heinアルゴリズムを用いるDNASTARタンパク質整列案の方
法による(Hein et al.,Methods Enzymol.183
:626−645(1990))。整列に関するJotun−Hein法のため
のデフォールトパラメーターは:複数の整列の場合、ギャップペナルティー(g
ap penalty)=11、ギャップレングスペナルティー(gap le
ngth penalty)=3;対毎の整列の場合、ktuple=6である
。例えば、参照ヌクレオチド配列への少なくとも例えば95%の「同一性」を有
するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチド配列
が参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチド当たりに最高で5つの点突然変
異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に
同一であることを意味する。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に少なくとも
95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、
参照配列中のヌクレオチドの最高で5%を欠失させるか、又は他のヌクレオチド
で置換することができるか、あるいは参照配列中の合計ヌクレオチドの最高で5
%の数のヌクレオチドを参照配列中に挿入することができる。参照配列のこれら
の突然変異は、参照ヌクレオチド配列の5’もしくは3’末端位置、あるいはそ
れらの末端位置の間のどこかに、参照配列内で参照配列中のヌクレオチドの間に
個別に、あるいは1つもしくはそれより多い連続した群として散らばって存在す
ることができる。類似して、参照アミノ酸配列に少なくとも例えば95%の同一
性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドにより、ポリペプチド配列が参照ア
ミノ酸の各100アミノ酸当たりに最高で5つのアミノ酸改変を含み得ることを
除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列に同一であることを意味する。
言い換えると、参照アミノ酸配列に少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を
有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の最高で5%を
欠失させるか、又は他のアミノ酸で置換することができるか、あるいは参照配列
中の合計アミノ酸残基の最高で5%の数のアミノ酸を参照配列中に挿入すること
ができる。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカル
ボキシ末端位置あるいはそれらの末端位置の間のどこかに、参照配列内で参照配
列中の残基の間に個別に、又は1つもしくはそれより多い連続した群として散ら
ばって存在することができる。
て本来の、又は自然に存在するタンパク質又はポリペプチドを指す。本発明は組
換えDNA法を介して同種タンパク質を生産する微生物を含む。
程度を指す。第1のアミノ酸配列が第2のアミノ酸配列に同一である場合、第1
及び第2のアミノ酸配列は100%の相同性を示す。2つのポリペプチド間の相
同性は、両配列中の与えられる位置において対合するアミノ酸の合計数の一次関
数であり、例えば2つの配列の両方におけるアミノ酸の合計数の半分が同じ場合
、2つの配列は50%の相同性を示すと言われる。
クレオチド配列の変動を許す遺伝コードにおける分岐進化(divergenc
e)を指す。従って本発明は、配列番号:57に示すアミノ酸配列のすべてもし
くは実質的部分をコードするいずれの核酸分子にも関する。熟練者は、与えられ
るアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞
により示される「コドン−バイアス」を十分に承知している。従って宿主細胞に
おける発現を向上させるために遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用の頻
度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように遺伝子を設計するのが
望ましい。
lent changes)を生ずる配列における欠失、挿入又は置換のような
配列への修正も意図されている。例えば遺伝コードの縮重を反映するか、又は与
えられる部位において化学的に同等のアミノ酸の生産を生ずる遺伝子配列におけ
る改変が意図されている。かくして疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのた
めのコドンを、他の疎水性がより低い残基、例えばグリシン又はより疎水性の残
基、例えばバリン、ロイシンもしくはイソロイシンをコードするコドンによって
置換することができる。同様に、1つの負に帯電した残基の別のもののために代
わる置換、例えばグルタミン酸のために代わるアスパラギン酸の置換、あるいは
1つの正に帯電した残基の別のもののために代わる置換、例えばアルギニンのた
めに代わるリシンの置換を生ずる変化も生物学的に同等の産物を生産すると予測
される。タンパク質分子のN−末端もしくはC−末端部分の改変を生ずるヌクレ
オチド変化もタンパク質の活性を改変するとは予測されない。いくつかの場合に
は、タンパク質の生物学的活性への改変の影響を研究するために、配列の突然変
異体を作るのが実際に望ましいかも知れない。提案される修正のそれぞれは、十
分に当該技術分野における日常的熟練の範囲内であり、コードされる産物におけ
る生物学的活性の保持の決定もそうである。さらに熟練者には、本発明により包
含される配列が緊縮条件(0.1XSSC、0.1%SDS、65℃)下で本明
細書に例示される配列とハイブリダイジェーションするそれらの能力によっても
定義されることがわかる。
物への転写及び翻訳を指す。
細胞の中心代謝の一部ではなく、通常は環状2本鎖DNA分子の形態にある遺伝
子を保有している染色体外要素を指す。そのような要素は、いずれかの源から誘
導される1本−もしくは2本鎖DNAもしくはRNAの線状もしくは環状の自律
複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であることができ
、そこにおいては複数のヌクレオチド配列が適した3’非翻訳配列と共に選ばれ
た遺伝子産物のためのプロモーターフラグメント及びDNA配列を細胞中に導入
することができる独特の構造に結合もしくは組み合わされている。「形質転換カ
セット」は、異種遺伝子を含有し且つ異種遺伝子の他に特定の宿主細胞の形質転
換を助長する要素を有している特異的(specific)ベクターを指す。「
発現カセット」は、異種遺伝子を含有し且つ異種遺伝子の他に異種宿主における
その遺伝子の発現の増強を可能にする要素を有している特異的ベクターを指す。 組換え生物の構築 炭素基質の1,3−プロパンジオールへの転換のための酵素的経路をコードす
るであろう必要な遺伝子を含有する組換え生物を、当該技術分野において周知の
方法を用いて構築することができる。グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナー
ゼ(GPD1)、グリセロール−3−ホスファターゼ(GPP2)、グリセロー
ルデヒドラターゼ(dhaB1、dhaB2及びdhaB3)、デヒドラターゼ
再活性化因子(orfZ及びorfX)ならびに1,3−プロパンジオールオキ
シドレダクターゼ(dhaT)をコードする遺伝子をクレブシエラ又はサッカロ
ミセスのような本来の宿主から単離し、E.コリDH5α、ECL707、AA
200又はKLP23のような宿主株の形質転換に用いた。遺伝子の単離 バクテリアゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学の分野において
普通であり且つ周知である。例えば遺伝子の配列が既知の場合、制限エンドヌク
レアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的
なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR)(U.S.4,683,202)のような標準的
プライマー指向増幅法(primer directed amplifica
tion methods)を用いてDNAを増幅し、適したベクターを用いる
形質転換に適した量のDNAを得ることができる。
中に詰込まれていることができるコスミドライブラリを作り、適した宿主の形質
転換に用いることができる。コスミドベクターは大量のDNAを収容できる点で
独特である。一般にコスミドベクターは、異種DNAの詰込み及び続く環状化に
必要なcosDNA配列の少なくとも1つのコピーを有する。これらのベクター
はcos配列の他に、ColElのような複製起点及びアンピシリン又はネオマ
イシンに対して耐性の遺伝子のような薬剤耐性マーカーも含有しているであろう
。適したバクテリア宿主の形質転換のためのコスミドベクターの使用法は、引用
することによりその記載事項が本明細書の内容となるSambrook,J.e
t al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,Second Edition(1989) Cold Sp
ring Harbor Laboratory Pressに十分に記載され
ている。
ーゼを用いて異種DNAを単離し、コスミドベクターのcos領域に隣接して連
結する。線状化された異種DNAを含有するコスミドベクターを次いでバクテリ
オファージのようなDNA詰込み伝達体と反応させる。詰込みプロセスの間にc
os部位は切断され、異種DNAが細菌ウィルス粒子の頭部内に詰込まれる。次
いでこれらの粒子を用いてE.コリのような適した宿主細胞をトランスフェクシ
ョンする。細胞中に注入されると、異種DNAはcos付着末端の影響下で環状
化する。この方法で異種DNAの大きなセグメントを導入し、組換え宿主細胞に
おいて発現させることができる。グリセロールデヒドラターゼ(dhaB1、dhaB2及びdhaB3)、デヒ ドラターゼ再活性化因子(orfZ及びorfX)ならびに1,3−プロパンジ オールデヒドロゲナーゼ(dhaT)をコードする遺伝子の単離及びクローニン グ 本発明の範囲内でコスミドベクター及びコスミド形質転換法を用い、グリセロ
ールを1,3−プロパンジオールに処理(processing)することがで
きる遺伝子を保有していることが既知のバクテリア属から、ゲノムDNAの大き
なセグメントをクローニングした。特定的には、K.ニューモニアエからのゲノ
ムDNAを当該技術分野において周知の方法により単離し、コスミドベクターS
upercos 1中への挿入のために制限酵素Sau3Aを用いて消化し、G
igapackII詰込み抽出物を用いて詰込んだ。ベクターの構築に続き、コ
スミドDNAを用いてE.コリXL1−Blue MR細胞を形質転換した。グ
リセロールの存在下で細胞を成長させ、1,3−プロパンジオール生成に関して
培地を分析することにより、グリセロールを1,3−プロパンジオールに転換す
る能力に関して形質転換細胞をスクリーニングした。
P1及びpKP2と命名した。DNA配列決定は、C.フレウンジイからのグリ
セロールデヒドラターゼ遺伝子への広範囲の相同性を明らかにし、これらの形質
転換細胞がグリセロールデヒドラターゼ遺伝子をコードするDNAを含有するこ
とを示した。他の1,3−プロパンジオール陽性形質転換細胞を分析し、コスミ
ドをpKP4及びpKP5と命名した。DNA配列決定は、これらのコスミドが
ジオールデヒドラターゼ遺伝子をコードするDNAを保有していることを明らか
にした。
デヒドラターゼ遺伝子及びデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子の代替え的供給源
には、これらに限られるわけではないがシトロバクテル、クロスツリジア及びサ
ルモネラが含まれる(表1を参照されたい)。G3PDH及びG3Pホスファターゼをコードする遺伝子 本発明は宿主細胞におけるG3PDH及びG3Pホスファターゼ活性の発現に
適した遺伝子を提供する。
スから単離され、配列番号:53に示す塩基配列を有しており、配列番号:54
に示すアミノ酸配列をコードする(Wang et al.,同上)。同様に、
GPD2によりコードされるG3PDH活性もサッカロミセスから単離されてい
る(Eriksson et al.,Mol.Microbiol.17,9
5(1995))。
をコードするいずれの遺伝子も適していることが意図されており、ここでその活
性はジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)のグリセロール−3−リン酸(G
3P)への転換を触媒することができる。さらに、遺伝子DAR1、GPD1、
GPD2、GPD3及びgpsAに対応する、NADH−依存性G3PDH’s
のアミノ酸配列をコードするいずれの遺伝子も本発明において機能性であろうこ
とが意図されており、ここでそのアミノ酸配列は酵素の機能を改変しないアミノ
酸置換、欠失もしくは付加を包含していることができる。熟練者には、他の供給
源から単離されるG3PDHをコードする遺伝子も本発明で用いるのに適してい
るであろうことがわかるであろう。G3Pホスファターゼをコードする遺伝子は
既知である。例えばGPP2はサッカロミセス・セレビシアエから単離され、配
列番号:55により示される塩基配列を有しており、それは配列番号:56に示
されるアミノ酸配列をコードする(Norbeck et al.,J.Bio
l.Chem.271,13875(1996))。
子も方法において用いるのに適しており、ここでその活性はグリセロール−3−
リン酸とH2Oのグリセロールと無機リン酸塩への転換を触媒することができる
。さらに、G3Pホスファターゼ酵素の機能を改変しないアミノ酸置換、欠失も
しくは付加を包含するアミノ酸配列を含んで、遺伝子GPP2及びGPP1に対
応するG3Pホスファターゼのアミノ酸配列をコードするいずれの遺伝子も本発
明において機能性であろう。熟練者には、他の供給源から単離されるG3Pホス
ファターゼをコードする遺伝子も本発明で用いるのに適していることがわかるで
あろう。宿主細胞 1,3−プロパンジオールの組換え体生産のために適した宿主細胞は原核性又
は真核性であることができ、1,3−プロパンジオール経路のための活性な酵素
を発現する宿主細胞の能力によってのみ制限されるであろう。適した宿主細胞は
バクテリア、例えばシトロバクテル、エンテロバクテル、クロスツリジウム、ク
レブシエラ、アエロバクテル、ラクトバシルス、アスペルギルス、サッカロミセ
ス、シゾサッカロミセス、チゴサッカロミセス、ピチア、クルイベロミセス、カ
ンジダ、ハンセヌラ、デバリオミセス、ムコル、トルロプシス、メチロバクテル
、エシェリキア、サルモネラ、バシルス、ストレプトミセス及びシュードモナス
であろう。本発明において好ましいのはE.コリ、E.ブラッタエ(E.bla
ttae)、クレブシエラ、シトロバクテル及びアエロバクテルである。
ル生産者に転換することができる。
3−HPAの定常状態濃度を可能にする内因性dhaT−様活性の、宿主となる
可能性のある生物中における存在を決定する。
を欠失させるか、もしくは不活性化するために適した突然変異誘発を行う。非−
機能性もしくは欠失したdhaT−様活性の確証は、1〜2Mの1,3−プロパ
ンジオールの存在下における3−HPA堆積がないことにより検出され得る。
ールデヒドラターゼ及び付随する保持システムのための適した遺伝子ならびにc
)yqhDを発現させる。
産のための条件下における内因性dhaT−様酵素の発現もしくは抑制に関して
である。これらにはグリセロール、グルコース又は嫌気性(anaerobis
is)の存在も含まれる。ベクター及び発現カセット 本発明は、G3PDH、G3Pホスファターゼ、デヒドラターゼ及びデヒドラ
ターゼ再活性化因子の適した宿主細胞中へのクローニング、形質転換及び発現に
適した多様なベクターならびに形質転換及び発現カセットを提供する。適したベ
クターは用いられる微生物と適合性のものであろう。例えばバクテリア、ウィル
ス(例えばバクテリオファージT7又はM−13由来ファージ)、コスミド、酵
母又は植物から適したベクターを誘導することができる。そのようなベクターを
得、用いるための案は当該技術分野における者に既知である(Sambrook
et al.,Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual−volumes 1,2,3(Cold Spring
Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor
,NY,1989))。
配列、選択マーカー及び自律複製又は染色体組込みを可能にする配列を含有する
。適したベクターは転写開始調節を宿している遺伝子の領域5’及び転写の終結
を調節するDNAフラグメントの領域3’を含む。両調節領域が、形質転換され
る宿主細胞に同種である遺伝子に由来する場合に最も好ましい。そのような調節
領域は生産宿主として得られる特定の種に本来の(native)遺伝子に由来
する必要はない。
ぞれDAR1及びGPP2)の発現を推進するのに有用な開始調節領域又はプロ
モーターは多数であり、当該技術分野における熟練者に良く知られている。これ
らの遺伝子を推進できる実質的にいずれのプロモーターも本発明に適しており、
CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、G
APDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO及びTPI(サッ
カロミセス中における発現に有用);AOX1(ピチア中における発現に有用)
;ならびにlac、trp、λPL、λPR、T7、tac及びtrc(E.コリ
中における発現に有用)が含まれるがこれらに限られない。
終結部位は不必要であり得る;しかしながら含まれるとしたらそれが最も好まし
い。
ずるように、酵素をコードするDNAを開始コドンを介して選ばれた発現調節領
域に操作可能に結合させる。
れらはpAH48と一緒に用いられるように設計されている。pDT29及びp
KP32の本質的要素はクレブシエラ・ニューモニアエから単離されたdhaレ
ギュロンに由来する。pDT29は、その配列が配列番号:1内に含有されてい
るヌクレオチドである読取り枠dhaR、orfY、dhaT、orfX、or
fW、dhaB1、dhaB2及びdhaB3を含有する。pKP32は同じ供
給源からの、pDT29上に存在すると同じ読取り枠の組を含有し、pKP32
にはdhaTが欠けていることが異なる。pAH48は宿主細胞中にDAR1及
びGPP2遺伝子を導入するために用いられる伝達体であり、さらに特定的には
サッカロミセス・セレビシアエから単離されるDAR1及びGPP2遺伝子を含
む。1,3−プロパンジオールの生産のための適した宿主の形質転換及び遺伝子の発 現 適したカセットが構築されると、それらは適した宿主細胞の形質転換に用いら
れる。G3PDH、G3Pホスファターゼ、デヒドラターゼ及びデヒドラターゼ
再活性化因子をコードする遺伝子を含有するカセットの宿主細胞中への導入は既
知の方法により、例えば形質転換(例えばカルシウム−透過細胞(calciu
m−permeabilized cell)、エレクトロポレーションを用い
る)により、あるいは組換えファージウィルスを用いるトランスフェクションに
より行うことができる(Sambrook et al.,同上)。
用いてE.コリを形質転換した。突然変異体 本方法が、例示する細胞の他に、1,3−プロパンジオールの生産を増強する
ように特別に設計された1つもしくは複数の突然変異を有する細胞を利用できる
であろうことが意図されている。通常は炭素供給材料を非−生産的経路に転じる
か、あるいは有意なカタボライト抑制を示す細胞を、これらの表現型の欠点(p
henotypic deficiencies)を避けるように突然変異させ
ることができた。例えば多くの野生型細胞は培地中のグルコース及び副産物から
のカタボライト抑制を受け易く、グルコース抑制に対して耐性である1,3−プ
ロパンジオール生産の可能なこれらの野生型生物の突然変異株が本発明において
特に有用であろうことが意図されている。
生型細胞を放射線又は化学的突然変異原のような多様な作因に暴露し、次いで所
望の表現型に関してスクリーニングすることができる。放射線を介して突然変異
を作る場合、紫外(UV)又は電離線を用いることができる。遺伝子突然変異の
ために適した短波UV波長は200nm〜300nmの範囲内に含まれ、254
nmが好ましいであろう。この波長内のUV線は主にグアニジン及びシトシンか
らアデニン及びチミジンまでの核酸配列内で変化を引き起こす。すべての細胞は
ほとんどのUV誘導突然変異を修復するDNA修復機構を有しているので、修復
プロセスを中断させて有効な突然変異の数を最大にするためにカフェイン及び他
の阻害剤のような試薬を加えることができる。300nm〜400nm領域内の
光を用いる長波UV突然変異も可能であるが、一般にDNAと相互作用するプソ
ラレン染料のような種々の活性化剤と一緒に用いないと短波UV光程有効でない
。 化学的薬剤を用いる突然変異誘発も突然変異体の形成に有効であり、通常用
いられる物質には非複製DNAに影響する化学品、例えばHNO2及びNH2OH
ならびに複製DNAに影響する薬剤、例えばフレームシフト突然変異を引き起こ
すことで注目され得るアクリジン染料が含まれる。放射線又は化学的薬剤を用い
て突然変異体を作るための特定的方法は当該技術分野において十分に実証されて
いる。例えば引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるThom
as D.Brock in Biotechnology:A Textbo
ok of Industrial Microbiology,Second
Edition(1989) Sinauer Associates,In
c.,Sunderland,M.A.又はDeshpande,Mukund
V.,Appl.Biochem.Biotechnol.36,227(1
992)を参照されたい。
より選択することができる。所望の産物もしくは中間体を生産する能力に関して
突然変異誘発された細胞を選択する場合、ランダムスクリーニングが最も普通で
ある。あるいは又、突然変異誘発された集団を耐性のコロニーのみが成長できる
選択培地上で成長させることにより、突然変異体の選択的単離を行うこともでき
る。突然変異体選択の方法は高度に開発され、且つ工業的微生物学の分野におい
て周知である。例えばBrock,同上;DeMancilha et al.
,Food Chem.14,313(1984)を参照されたい。
ができる。そのような方法は当該技術分野における熟練者に既知であり、実施例
4及び実施例8で例示する。1,3−プロパンジオール生産経路における改変 代表的酵素経路。グルコースからの1,3−プロパンジオールの生産は以下の
系列の段階により行われ得る。この系列は当該技術分野における熟練者に既知の
複数の経路の代表であり、図5に示されている。1系列の段階においてグルコー
スが解糖経路の酵素によりジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)と3−ホス
ホ−グリセルアルデヒド(3−PG)に転換される。次いでDHAPのジヒドロ
キシアセトン(DHA)への加水分解及び続く還元あるいはDHAPのグリセロ
ール3−リン酸(G3P)への還元及び続く加水分解によりグリセロールが生成
する。加水分解段階は、それらの基質に関して非−特異的であることが知られて
いるいずれかの数の細胞ホスファターゼにより触媒され得るか、あるいは組換え
により活性を宿主中に導入することができる。還元段階はNAD+(又はNAD
P+)結合宿主酵素により触媒され得るか、あるいは組換えにより宿主中に活性
を導入することができる。dhaレギュロンが式3の可逆的反応を触媒するグリ
セロールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.6)を含有することは注目に
値する。
アルデヒド(3−HPA)を介して1,3−プロパンジオールに転換される。中
間体3−HPAは宿主によりコードされ得るか、又は組換えにより宿主中に導入
され得るデヒドラターゼ酵素によりグリセロールから生産される、式1。このデ
ヒドラターゼはグリセロールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.30)、ジ
オールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.28)又はこの変換を触媒するこ
とができる他のいずれかの酵素であることができる。グリセロールデヒドラター
ゼはdhaレギュロンによりコードされるが、ジオールデヒドラターゼはコード
されない。1,3−プロパンジオールはNAD+−(もしくはNADP+)結合宿
主酵素により3−HPAから生産されるか、あるいは組換えにより活性を宿主中
に導入することができる、式2。1,3−プロパンジオールの生産におけるこの
最終的反応は1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1
.202)又は他のアルコールデヒドロゲナーゼにより触媒され得る。炭素チャンネリングに影響する突然変異及び形質転換。 1,3−プロパンジオー
ル生産経路における変異を含む多様な突然変異微生物が本発明において有用であ
ろう。例えばトリオースリン酸イソメラーゼ突然変異(tpi−)の本発明の微
生物中への導入は、炭素チャンネリングにより性能を向上させるための突然変異
の利用の例である。トリオースリン酸イソメラーゼはDAHPの3−ホスホグリ
セルアルデヒドへの転換を担う酵素であり、そのままではグルコースからグリセ
ロール及び1,3−プロパンジオールへの主経路からの炭素の流れの分岐を許す
(図5)。かくして欠失突然変異(tpi−)は当該技術分野において記載され
ている効率を越えて所望の経路の全体的代謝効率を増強する。同様に、1,3−
プロパンジオール生産経路の中間体に関する別の経路を遮断する突然変異も本発
明にとって有用であろう。例えばグリセロールキナーゼの除去はG3Pホスファ
ターゼの作用によりG3Pから生成するグリセロールがATPを失ってG3Pに
再−転換されるのを妨げる(図5)。又、グリセロールデヒドロゲナーゼ(例え
ばgldA)の除去は、NADH−依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲ
ナーゼの作用によりDHAPから生成するグリセロールがジヒドロキシアセトン
に転換されるのを妨げる(図5)。突然変異を構造遺伝子に向け、酵素活性の活
性を損なうか、もしくは向上させることができるか、あるいはプロモーター領域
及びリボソーム結合部位を含むを含む調節遺伝子に向け、酵素活性の発現レベル
を調節することができる。
増強のために特定の酵素活性を調節することが意図されている。かくして1,3
−プロパンジオールの生産を向上させる全細胞触媒の修正を予定する(anti
cipate)ことは本発明の範囲内である。
−HPA及び最終的に1,3−プロパンジオールに動く、糖基質からの1,3−
プロパンジオールの生産のための好ましい経路を利用する。本生産株は、炭素の
非−生産的化合物への分岐を妨げる種々の欠失突然変異を導入することにより、
経路の代謝効率を最大にするように操作されている。上記の通りグリセロールは
、グリセロールデヒドロゲナーゼ又はグリセロールキナーゼを介するDHA又は
G3Pへの変換により、3HPAへの転換から分岐させられ得る(図5)。従っ
て、本生産株はgldA及びglpK遺伝子における欠失突然変異を含有する。
同様に、DHAPはトリオースリン酸イソメラーゼによって3−PGに分岐させ
られ得、かくして本生産微生物はこの遺伝子における欠失突然変異も含有する。
本方法にはさらにグリセロールの3HPAへの転換のためのデヒドラターゼ酵素
も導入され、それはdhaレギュロンのorfX及びorfZによりコードされ
る再活性化因子と共同して機能する(図5)。3HPAの1,3−プロパンジオ
ールへの転換は典型的には1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼを介
して行われるが、本方法は最終的産物である1,3−プロパンジオールのより高
い力価及び収率を与える非−特異的触媒活性を利用する(図5)。そのような方
法では、200g/Lの力価が期待される場合に少なくとも10g/Lの1,3
−プロパンジオールの力価が達成される。
セロール又はジヒドロキシアセトンを利用することができ、その場合経路は最後
の3つの基質、グリセロール→3HPA→1,3−プロパンジオールのみを含む
。そのような方法では、非−特異的触媒活性(アルコールデヒドロゲナーゼであ
ることが予測される)が支持されてオキシドレダクターゼがやはり排除されるが
、欠失突然変異の必要は、培養にグリセロールを加えることのエネルギーの考慮
により取り消される。そのような方法では、200g/Lの力価が期待される場
合に少なくとも71g/Lの1,3−プロパンジオールの力価が達成される。
活性の欠失又は突然変異により修正されている野生型微生物の突然変異体を提供
することは、本発明の範囲内である。例えば自然にはdhaレギュロンのすべて
の要素を含有する微生物を操作し、1,3−プロパンジオールオキシドレダクタ
ーゼ活性をコードするdhaT遺伝子を不活性化することができる。これらの微
生物は、アルコールデヒドロゲナーゼであることが予測される内因性触媒活性の
存在により媒介され、1,3−プロパンジオールのより高い収率及び力価を与え
るであろうことが予測される。そのような微生物の例にはクレブシエラ種、シト
ロバクテル種及びクロスツリジウム種が含まれるがこれらに限られない。培地及び炭素基質 本発明における発酵培地は適した炭素基質を含有しなければならない。適した
基質には単糖類、例えばグルコース及びフルクトース、オリゴ糖類、例えばラク
トース又はスクロース、多糖類、例えば澱粉又はセルロースあるいはそれらの混
合物ならびに再生可能な供給材料、例えばチーズホエー透過物、コーンスティー
プリカー(cornsteep liquor)、てんさいの糖みつ及び大麦の
麦芽からの非精製混合物が含まれ得るがこれらに限られない。さらに炭素基質は
1−炭素基質、例えば二酸化炭素又はメタノールであることもでき、それに関し
ては重要生化学的中間体への代謝的転換が示されている。1炭素源(例えばメタ
ノール、ホルムアルデヒド又はギ酸塩)からのグリセロール生産はメチロトロー
フイースト(methylotrophic yeasts)(K.Yamad
a et al.,Agric.Biol.Chem.53(2),541−5
43(1989))及びバクテリア(Hunter et al.,Bioch
emistry 24,4148−4155(1985))において報告されて
いる。これらの微生物はメタンからギ酸塩までの酸化状態における範囲の1炭素
化合物を同化し、グリセロールを生産することができる。炭素同化の経路はリブ
ロース一リン酸を介するか、セリンを介するか、あるいはキシルロース−一リン
酸を介するものであることができる(Gottschalk,Bacteria
l Metabolism,Second Edition,Springer
−Verlag:New York(1986))。リブロース一リン酸経路は
、6−炭素糖を生成するギ酸塩とリブロース−5−リン酸との縮合を含み、6−
炭素糖はフルクトース及び結局は3−炭素産物であるグリセルアルデヒド−3−
リン酸となる。同様に、セリン経路は1−炭素化合物をメチレンテトラヒドロフ
ォレートを介して解糖経路中に同化する。
物、例えばメチルアミン、グルコサミン及び多様なアミノ酸を代謝活性のために
使用することも知られている。例えばメチロトローフ酵母はメチルアミンからの
炭素を使用してトレハロース又はグリセロールを生成させることが知られている
(Bellion et al.,Microb.Growth C1 Com
pd.,[Int.Symp.],7th(1993),415−32.Edi
tor(s):Murrell,J.Collin;Kelly,Don P.
Publisher:Intercept,Andover,UK)。同様に、
カンジダの種々の種はアラニン又はオレイン酸を代謝するであろう(Sulte
r et al.,Arch.Microbiol.153(5),485−4
89(1990))。従って、本発明で使用される炭素の源は多様な炭素−含有
基質を含むことができ、微生物又はプロセスの選択のみによって制限されるであ
ろうことが意図されている。
において適していることが意図されているが、好ましい炭素基質は、プロセスが
内因性グリセロールを生産することを目的としている場合はグルコース、フルク
トース、スクロース又はメタノールであり、プロセスがグリセロール又はジヒド
ロキシアセトン供給材料を予定している場合はグリセロール又はジヒドロキシア
セトンである。
技術分野における熟練者に既知の、培養物の成長及び1,3−プロパンジオール
生産のために必要な酵素経路の促進に適した他の成分を含有しなければならない
。Co(II)塩及び/又はビタミンB12又はそれらの前駆体が特に注目される
。
補因子である。補酵素B12の合成は原核生物、例えばエシェリキア・ブラッタエ
、クレブシエラ種、シトロバクテル種及びクロスツリジウム種において見いださ
れ、そのいくつかは初めから該化合物を合成することができ、他は部分的反応を
行うことができる。例えばE.コリはコリン環構造を組み立てることができない
が、コビンアミドのコリノイドへの転換を触媒することができ、5’−デオキシ
アデノシル基を導入することができる。かくしてE.コリ発酵においては補酵素
B12前駆体、例えばビタミンB12を与えることが必要であることが当該技術分野
において既知である。
の生成と符合するように段階的に(staged)加えることができるか、ある
いは1つの、もしくは複数のボーラス添加物として加えることができる。細胞塊
(OD550)に供給されるビタミンB12(mg)の好ましい比率は0.06〜
0.60である。細胞塊(OD550)に供給されるビタミンB12(mg)の最
も好ましい比率は0.12〜0.48である。
B12を生合成できる他の微生物も適した生産細胞であり、これらの微生物へのB 12 の添加は不必要であろうことが意図されている。培養条件 : 典型的には、適した培地中において35℃で細胞を成長させる。本発明におけ
る好ましい成長培地は普通の商業的に調製される培地、例えばLuria Be
rtani(LB)ブイヨン、Sabouraud Dextrose(SD)
ブイヨン又はYeast培地(YM)ブイヨンである。他の限定された(def
ined)、又は合成の成長培地も用いることができ、特定の微生物の成長に適
した培地は微生物学又は発酵科学の技術分野における熟練者に既知であろう。カ
タボライト抑制を直接もしくは間接的に調節することが知られている薬剤、例え
ばサイクリックアデノシン2’:3’−一リン酸の使用を反応培地中に導入する
こともできる。同様に、1,3−プロバンジオール生産の増強に導く酵素活性を
調節することが知られている薬剤(例えばメチルビオローゲン)の使用を遺伝子
操作と一緒に、もしくはその代りに用いることができる。
pH8.0が初期条件として好ましい。
的条件が好ましい。
−バッチ発酵を行うことができる。バッチ及び連続発酵 : 本プロセスは発酵のバッチ法を用いる。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が
発酵の開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変に合わない閉鎖系である。か
くして発酵の開始時に培地に所望の1種もしくは複数種の微生物を接種し、系に
何も加えずに発酵を起こさせる。しかしながら、典型的には「バッチ」発酵は炭
素源の添加に関するバッチであり、多くの場合、pH及び酸素濃度のような因子
の制御における試みが成される。バッチ系では、系の代謝産物及びバイオマス組
成が発酵が止められる時点まで一定に変化する。バッチ培養内では、細胞が静的
誘導期を介して高成長対数期に、そして最後に成長速度が減じるか又は止まる定
常期に加減する(moderate)。処理されないと、定常期における細胞は
終局的に死ぬであろう。対数期における細胞は一般に最終的産物もしくは中間体
の生産の大部分を担う。
本発明において適しており、発酵の進行と共に基質を増加させて加えることを除
いて、典型的なバッチ系を含んでいる。フェド−バッチ系は、カタボライト抑制
が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、及び培地中に限られた量の基質がある
ことが望ましい場合に有用である。フェド−バッチ系における実際の基質濃度の
測定は困難であり、従って測定可能な因子、例えばpH、溶解酸素及びCO2の
ような廃ガスの分圧の変化に基づいて見積もられる。バッチ及びフェド−バッチ
発酵は当該技術分野において普通且つ周知であり、Brock,同上に例を見い
だすことができる。
意図されている。連続発酵は、限定された発酵培地がバイオリアクターに連続的
に加えられ、等量の条件調節された培地(conditioned media
)が処理のために同時に取り出される開放系である。連続発酵は一般に、細胞が
主に対数期成長にある一定の高い密度に培養を保持する。
つかの因子の調節を可能にする。例えば1つの方法は炭素源又は窒素レベルのよ
うな制限栄養素を固定された比率に保持し、他のすべてのパラメーターの加減を
許すであろう。他の系では、培地の濁度により測定される細胞濃度を一定に保ち
ながら、成長に影響する複数の因子を連続的に変えることができる。連続系は定
常状態成長条件を保持するように努め、かくして培地が取り出される故の細胞の
損失を発酵における細胞成長速度に対して釣り合わせねばならない。連続発酵法
のための栄養素及び成長因子の調節の方法ならびに産物生成の速度を最大にする
ための方法は工業的微生物学の技術分野において周知であり、多様な方法がBr
ock,同上に詳細に記載されている。
に発酵のいずれの既知の様式も適していることが意図されている。さらに、細胞
を全細胞触媒として基質上に固定化し、1,3−プロパンジオール生産のための
発酵条件に供することができることが意図されている。1,3−プロパンジオールの同定及び精製 : 発酵培地からの1,3−プロパンジオールの精製法は当該技術分野において既
知である。例えば有機溶媒を用いる抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィーに
反応混合物を供することにより、細胞培地からプロパンジオールを得ることがで
きる(U.S.5,356,812)。この方法のために特に優れた有機溶媒は
シクロヘキサンである(U.S.5,008,473)。
,3−プロパンジオールを直接同定することができる。本発明において好ましい
のは、無勾配様式で0.01N硫酸の移動相を用いる分析的イオン交換カラム上
で発酵培地を分析する方法である。
。以下の実施例において用いるのに適した方法は、Sambrook,J.et
al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,Second Edition,Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press(1989)に見いだされ得る。
周知である。以下の実施例において用いるのに適した方法は、Manual o f Methods for General Bacteriology (P
hillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph
N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.
Wood,Noel R.Krieg and G.Briggs Phill
ips,eds),American Society for Microb
iology,Washington,D.C.(1994)又はThomas
D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology ,Second E
dition(1989)Sinauer Associates,Inc.,
Sunderland,MAに見いだされ得る。バクテリア細胞の成長及び保持
のために用いられるすべての試薬及び材料は、他にことわらない限りAldri
ch Chemicals(Milwaukee,WI),DIFCO Lab
oratories(Detroit,MI)、GIBCO/BRL(Gait
hersburg,MD)又はSigma Chemical Company
(St.Louis,MO)から得た。
)を意味し、「min」は単数もしくは複数の分を意味し、「sec」は単数も
しくは複数の秒を意味し、「d」は単数もしくは複数の日を意味し、「mL」は
ミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、50ampはmL当たりに
50μgのアンピシリンを意味し、LB−50ampはmL当たりに50μgの
アンピシリンを含有するLuria−Bertaniブイヨンを意味する。
素に基づく選択率であり、「nd」は検出されないである。
ャートに挙げる:
物中のデヒドラターゼ活性を決定した。典型的には、フレンチプレス及び続いて
細胞デブリスの遠心を用いる細胞破壊により無−細胞抽出物を調製した。アルデ
ヒドのメチルベンゾ−2−チアゾロンヒドラゾンとの反応に基づくアッセイはF
orage and Foster(Biochim.Biophys.Act
a 569,249(1979))に記載されている。
980))は、デヒドラターゼの再活性化を測定するアッセイを開示している。
デヒドラターゼ活性はトルエン処理された全細胞において、ATPを用いて、及
び用いずに、グリセロール又は1,2−プロパンジオールを基質として用いて決
定された。ATPを添加した産物生成対ATPを添加しない産物生成の比率によ
り再活性化を決定した。産物生成(グリセロール又は1,2−プロパンジオール
を基質として用いる場合のそれぞれ3−HPA又はプロビオンアルデヒド)をH
PLCを用いて直接、あるいはメチルベンゾ−2−チアゾロンヒドラゾン試薬を
用いて間接的に測定した。あるいは又、NADH結合アルコールデヒドロゲナー
ゼを用いるアルデヒドのそのそれぞれのアルコールへの転換をカップリングさせ
、NADHの消失を監視することにより、産物生成を決定した。1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼに関するアッセイ : 1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼと呼ばれることもある1,3−プ
ロパンジオールオキシドレダクターゼの活性を、記載されている通りに(Joh
nson and Lin,J.Bacteriol.169,2050(19
87))、溶液中又はスラブゲル中で無−細胞抽出物に関し、1,3−プロパン
ジオール及びNAD+を基質として用いて決定した。あるいは又、NADHの消
失により3−HPAとNADHの1,3−プロパンジオールとNAD+への転換
を決定した。スラブゲルアッセイは、サイズ分離のおかげで、1,3−プロパン
ジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)の活性を非−特異的アルコールデヒ
ドロゲナーゼの活性と分離するという利点の可能性を有する。シトロバクテル・
フレンジイ、クレブシエラ・ニューモニアエ及びクロスツリジウム・パステウリ
アヌムからの1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)の本
来の分子量は異常に大きく、330,000〜440,000ダルトンの大きさ
である。ラクトバシルス・ブレビス及びラクトバシルス・ブクネリは、既知の1
,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)の性質に類似の性質
を有するデヒドラターゼ関連1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼを
含有する。グリセロール3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性に関するアッセイ : Bell et al.(J.Biol.Chem.250,7153(19
75))により公開されている方法からの下記で修正する方法を用いた。この方
法は、5mM DTTを含む0.1M Tris/HCl、pH7.5緩衝液中
に0.2mM NADH、2.0mM ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP
)及び酵素を含有するキュベット中で、1.0mLの合計容積において30℃で
無−細胞抽出物試料をインキュベーションすることを含んだ。最初に酵素とNA
DHの反応のバックグラウンド速度を340nmにおいて少なくとも3分間決定
した。続いて第2の基質であるDHAPを加え、時間を経た吸収の変化をさらに
少なくとも3分間監視した。総速度からバックグラウンド速度を引き去ることに
よりG3PDH活性を限定した。グリセロール−3−ホスファターゼ活性に関するアッセイ : ビス−Tris又はMES及びマグネシウム緩衝液、pH6.5中で抽出物を
有機ホスフェート基質と一緒にインキュベーションすることにより酵素活性に関
するアッセイを行った。用いられた基質は1−α−グリセロールリン酸又はd,
l−α−グリセロールリン酸であった。アッセイにおける試薬の最終的濃度は:
緩衝液(20mM、ビス−Tris又は50mM MES);MgCl2(10
mM);及び基質(20mM)である。試料中の合計タンパク質が低く、酸クエ
ンチを用いて可視の沈殿が起こらない場合、キュベット中で簡単に試料をアッセ
イした。この方法は、20mM 基質(50μL、200mM)、50mM M
ES、10mM MgCl2、pH6.5緩衝液を含有するキュベット中で酵素
試料をインキュベーションすることを含んだ。最終的ホスファターゼアッセイ容
積は0.5mLであった。酵素−含有試料を反応混合物に加え;キュベットの内
容物を混合し、次いでキュベットをT=37℃で5〜120分間、循環水浴中に
入れ、時間の長さは酵素試料におけるホスファターゼ活性が2〜0.02U/m
Lのどの範囲であるかに依存した。酸モリブデート試薬(0.4mL)の添加に
より酵素反応をクエンチングした。Fiske SubbaRow試薬(0.1
mL)及び蒸留水(1.5mL)を加えた後、溶液を混合し、発色させた。完全
に発色させるために10分の後、Cary 219 UV/可視分光光度計を用
いて試料の吸収を660nmで読んだ。無機リン酸塩原液(0.65mM)を用
い、0.026〜0.130μモル/mLの範囲の最終的無機リン酸塩濃度を有
する6つの標準を調製することにより作られた標準曲線に、放出された無機リン
酸塩の量を比較した。グリセロールキナーゼ活性に関するアッセイ : 適した量の酵素、典型的には無−細胞粗抽出物を、40mM ATP、20m
M MgSO4、21mMの均一に13C標識されたグリセロール(99%、Ca
mbridge Isotope Laboratories)及び0.1M
Tris−HCl、pH9を含有する反応混合物に、25℃で75分間加えた。 13 C−NMR(125MHz)によりグリセロールのグリセロール3−リン酸へ
の転換を検出した:グリセロール(63.11ppm,δ,J=41Hz及び7
2.66ppm,t,J=41Hz);グリセロール3−リン酸(62.93p
pm,δ,J=41Hz;65.31ppm,br d,J=43Hz;及び7
2.66ppm,dt,J=6,41Hz)。NADH−結合グリセロールデヒドロゲナーゼアッセイ : E.コリ株からの無−細胞抽出物中のNADH−結合グリセロールデヒドロゲ
ナーゼ活性(gldA)を、非−変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタ
ンパク質分離の後に決定した。グリセロールとNAD+のジヒドロキシアセトン
とNADHへの転換を、フェナジンメトサルフェート(PMS)を媒介物として
用い、3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテ
トラゾリウムブロミド(MTT)の濃く着色したホルマザンへの転換とカップリ
ングさせた(Tang et al.,J.Bacteriol.140,18
2(1997))。
16% TG、1.5mm、15レーンゲル)を用いて標準的方法により、二重
に行われた。50mM Tris又は炭酸カリウム緩衝液、pH9を用いて10
分間、3回洗浄することにより、残留グリセロールをゲルから除去した。50m
M Tris又は炭酸カリウム、pH9、60mg 硫酸アンモニウム、75m
g NAD+、1.5mg MTT及び0.5mg PMSを含有する15mL
のアッセイ溶液中で、グリセロール(約0.16Mの最終的濃度)を含む、及び
含まない2重のゲルを展開(developed)した。
セロールデヒドロゲナーゼ(dhaD)に対して誘起されたポリクローナル抗体
との反応により、E.コリ株中のNADH−結合グリセロールデヒドロゲナーゼ
活性(gldA)の存在又は不在も決定した。1,3−プロパンジオールの単離及び同定 : HPLCによりグリセロールの1,3−プロパンジオールへの転換を監視した
。分析は標準的方法及びクロマトグラフィーの技術分野における熟練者に利用可
能な材料を用いて行われた。1つの適した方法は、UV(210nm)及びRI
検出を用いるWaters Maxima 820 HPLCシステムを使用し
た。Shodex SH−1011P プレカラム(6mmx50mm)が備え
られ、50℃で温度制御されたShodex SH−1011カラム(8mmx
300mm、Waters,Milford,MAから購入)上に、移動相とし
て0.01N H2SO4を用い、0.5mL/分の流量で試料を注入した。定量
的分析が望まれている場合、外部標準として既知量のトリメチル酢酸を用いて試
料を調製した。典型的には、グルコース(RI検出)、グリセロール、1,3−
プロパンジオール(RI検出)及びトリメチル酢酸(UV及びRI検出)の保持
時間は、それぞれ15.27分、20.67分、26.08分及び35.03分
であった。
方法及びGC/MSの技術分野における熟練者に利用可能な材料を用いて行われ
た。1つの適した方法は、Hewlett Packard 5971 Ser
ies質量選択的検出器(EI)及びHP−INNOWaxカラム(長さ30m
、内径0.25mm、フィルム厚さ0.25ミクロン)に連結されたHewle
tt Packard 5890 Series IIガスクロマトグラフを用
いた。生成した1,3−プロパンジオールの保持時間及び質量スペクトルを基準
の1,3−プロパンジオール(m/e:57,58)のそれに比較した。
料(例えば培養上澄み液)に30μLの濃(70%v/v)過塩素酸を加えた。
混合の後、試料を凍結乾燥した。ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセト
アミド:ピリジンの1:1混合物(300μL)を凍結乾燥された材料に加え、
激しく混合し、65℃において1時間置いた。遠心により不溶性材料を除いて試
料を透明にした。得られる液体は2相に分かれ、その上の方を分析に用いた。試
料をDB−5カラム(48m、内径0.25mm、フィルム厚さ0.25μm;
J&W Scientificから)上でクロマトグラフィーにかけ、培養上澄
み液から得た1,3−プロパンジオール誘導体の保持時間及び質量スペクトルを
基準の標準試料から得たそれに比較した。TMS−誘導体化1,3−プロパンジ
オールの質量スペクトルは205、177、130及び115AMUの特徴的イ
オンを含有する。細胞ライシス : 発酵ブイヨン中の細胞外可溶性タンパク質濃度を測定することにより、細胞ラ
イシスを見積もった。細胞を分離するために、発酵槽試料を卓上遠心機において
遠心した(典型的には、Eppendorf,Model 5415C 微量遠
心機において12,000rpmで3〜5分)。得られる上澄み液を商業的に入
手可能な試薬を用い、Bradford法によってタンパク質濃度に関して分析
した(Bio−Rad Protein Assay,Bio−Rad,Her
cules,CA)。生存率 : 発酵槽から得た細胞を、非−選択的LB寒天平板上で、適した希釈において平
板培養することにより、細胞生存率を決定した。発酵槽ブイヨンのmL当たりの
生存細胞をOD550(AU)で割った比率を用いることにより、発酵槽実験の
間で細胞生存率を比較した。
スクリーニングにおいて、合成S12培地を用いた。S12培地は:10mM
硫酸アンモニウム、50mM リン酸カリウム緩衝液、pH7.0、2mM M
gCl2、0.7mM CaCl2、50μM MnCl2、1μM FeCl3、
1μM ZnCl、1.7μM CuSO4、2.5μM CoCl2、2.4μ
M Na2MoO4及び2μM チアミン塩酸塩を含有する。
0mM MOPS/KOH緩衝液、pH7.5;5mM リン酸カリウム緩衝液
、pH7.5;2mM MgCl2;0.7mM CaCl2;50μM MnC
l2;1μM FeCl3;1μM ZnCl;1.72μM CuSO4;2.
53μM CoCl2;2.42μM Na2MoO4;2μM チアミン塩酸塩
;0.01% 酵母抽出物;0.01% カザアミノ酸;0.8μg/mL ビ
タミンB12;及び50μg/mL アンピシリンから成る。必要な場合、培地A
に0.2%のグリセロール又は0.2%のグリセロールと0.2%のD−グルコ
ースを補足した。細胞 : 文献でK.アエロゲネス(K.aerogenes)又はアエロバクテル・ア
エロゲネス(Aerobacter aerogenes)としても知られるク
レブシエラ・ニューモニアエECL2106(Ruch et al.,J.B
acteriol.124,348(1975))をE.C.C.Lin(Ha
rvard Medical School,Cambridge,MA)から
入手し、実験室培養として保持した。
ype Culture Collection(Manassas,VA)か
ら購入した。
ルデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子を含有する、クレブシエラ・ニューモ
ニアエATCC25955から単離されたコスミドDNAを用いて形質転換した
。グリセロールデヒドラターゼを含有するコスミドをpKP1及びpKP2と同
定し、ジオールデヒドラターゼ酵素を含有するコスミドをpKP4と同定した。
形質転換されたDH5α細胞をDH5α−pKP1、DH5α−pKP2及びD
H5α−pKP4と同定した。
crobiol.135,1255(1989))をE.C.C.Lin(Ha
rvard Medical School,Cambridge,MA)から
入手し、同様にクレブシエラ・ニューモニアエからのコスミドDNAを用いて形
質転換した。これらの形質転換細胞を、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含
有するECL707−pKP1及びECL707−pKP2ならびにジオールデ
ヒドラターゼ遺伝子を含有するECL707−pKP4と同定した。
on et al.,J.Gen.Microbiol.62,329(197
0))をE.coli Genetic Stock Center,Yale
University(New Haven,CT)から購入し、クレブシエ
ラコスミドDNAを用いて形質転換し、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含
有する組換え微生物AA200−pKP1及びAA200−pKP2ならびにジ
オールデヒドラターゼ遺伝子を含有するAA200−pKP4を得た。DH5α : K.ニューモニアエDNAを用いてトランスフェクションされたE.コリXL
1−Blue MRの約1,000のコロニーを含有する6つの形質転換平板を
5mLのLB培地を用いて洗浄し、遠心した。バクテリアをペレット化し、5m
L LB培地+グリセロール中に再懸濁させた。アリコート(50μL)を、0
.2% グリセロール+mL当たりに400ngのビタミンB12+0.001%
酵母抽出物+50ampを含むS12合成培地を含有する15mLの管中に接
種した。最上まで管を培地で満たし、パラフィルムでくるみ、30℃でインキュ
ベーションした。48h後にわずかな濁りが観測された。78h及び132hに
おいて上記の通りに産物分布に関して分析されたアリコートは1,3−プロパン
ジオールに関して陽性であり、後者の時点には増加した量の1,3−プロパンジ
オールを含有した。
系列的に希釈し、シングルコロニーを単離するためにLB−50amp平板上に
平板培養した。48のシングルコロニーを単離し、再度1,3−プロパンジオー
ルの生産に関して調べた。6つの独立したクローンからコスミドDNAを単離し
、E.コリ株DH5α中に形質転換した。形質転換細胞を再度1,3−プロパン
ジオールの生産に関して調べた。2つの形質転換細胞をさらに特性化し、DH5
α−pKP1及びDH5α−pKP2と称した。
にサブクローニングされたpKP1からの12.1kb EcoRI−SalI
フラグメントを配列決定し、pHK28−26と命名した(配列番号:1)。配
列決定は、グリセロールデヒドラターゼをコードするdhaオペロン及び調節に
必要な遺伝子の関連する読取り枠の遺伝子座を明らかにした。配列番号:1に言
及すると、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするdhaK1に関する読取
り枠のフラグメントが塩基1−399に見いだされ(相補配列(complem
ent));グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする読取り枠dhaDが塩
基1010−2107に見いだされ;リプレッサーをコードする読取り枠dha
Rが塩基2209−4134に見いだされ;未知の機能のタンパク質をコードす
る読取り枠orfWが塩基4112−4642に見いだされ(相補配列);デヒ
ドラターゼ再活性化タンパク質をコードする読取り枠orfXが塩基4643−
4996に見いだされ(相補配列);1,3−プロパンジオールオキシドレダク
ターゼをコードする読取り枠dhaTが塩基5017−6180に見いだされ(
相補配列);未知の機能のタンパク質をコードする読取り枠orfYが塩基62
02−6630に見いだされ(相補配列);アルファサブユニットグリセロール
デヒドラターゼをコードする読取り枠dhaB1が塩基7044−8711に見
いだされ;ベータサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードする読取り
枠dhaB2が塩基8724−9308に見いだされ;ガンマサブユニットグリ
セロールデヒドラターゼをコードする読取り枠dhaB3が塩基9311−97
36に見いだされ;デヒドラターゼ再活性化タンパク質をコードする読取り枠d
haBXが塩基9749−11572に見いだされ;グリセロール吸収促進タン
パク質をコードするglpFに関する読取り枠のフラグメントが塩基11626
−12145に見いだされる。
ションされたE.コリXL1−Blue MRのシングルコロニーを200μL
のS15培地(硫酸アンモニウム、10mM;リン酸カリウム緩衝液、pH7.
0、1mM;MOPS/KOH緩衝液、pH7.0、50mM;MgCl2、2
mM;CaCl2、0.7mM;MnCl2、50μM;FeCl3、1μM;Z
nCl、1μM;CuSO4、1.72μM;CoCl2、2.53μM;Na2
MoO4、2.42μM;及びチアミン塩酸塩、2μM)+0.2%のグリセロ
ール+400ng/mLのビタミンB12+0.001%の酵母抽出物+50μg
/mLのアンピシリンを含有するミクロタイターウェル中に接種した。ミクロタ
イターウェルの他に、LB−50ampを含有するマスター平板にも接種した。
96h後、100μLを採取し、0.2ミクロンナイロン膜フィルターを含有す
るRainin遠心管中で遠心した。バクテリアを保留し、濾液をHPLC分析
のために処理した。約240のコロニーをスクリーニングした後に1,3−プロ
パンジオール生産を示す陽性のクローンを同定した。3つの陽性のクローンを同
定し、その中の2つをLB−50amp上で成長させ、その中の1つは成長させ
なかった。LB−50amp上で成長した2つの陽性のクローンの1つから単離
され、1,3−プロパンジオールの生産に関して立証されたシングルコロニーを
pKP4と称した。pKP4を含有するE.コリ株からコスミドDNAを単離し
、E.コリ株DH5αを形質転換した。DH5α−pKP4と称される独立した
形質転換細胞を1,3−プロパンジオールの生産に関して立証した。ECL707 : E.コリ株ECL707をpKP1、pKP2、pKP4の1つに対応するコ
スミドK.ニューモニアエDNA又はSupercosベクターのみを用いて形
質転換し、それぞれECL707−pKP1、ECL707−pKP2、ECL
707−pKP4及びECL707−scと命名した。ECL707は、それぞ
れATP−依存性グリセロールキナーゼ、NAD+−結合グリセロールデヒドロ
ゲナーゼ及びホスホエノールピルビン酸−依存性ホスホトランスフェラーゼシス
テムのジヒドロキシアセトンのための酵素IIをコードするglpK、gld及
びptsDが欠失している。
シングルコロニー及びSupercosベクターのみ(負の対照標準)の形質転
換の5つのシングルコロニーをマスターLB−50amp平板に移した。これら
の単離物を、それらがデヒドラターゼ活性を含有しているかどうかを決定するた
めに、グリセロールを1,3−プロパンジオールに転換するそれらの能力に関し
ても調べた。無菌のつまようじを用い、0.2%のグリセロール又は0.2%の
グリセロールと0.2%のD−グルコースが補足された200μLの培地Aを含
有するミクロタイター平板に形質転換細胞を移した。30℃における48hの間
のインキュベーションの後、ミクロタイター平板ウェルの内容物を0.45ミク
ロンナイロンフィルターを介して濾過し、HPLCによりクロマトグラフィーに
かけた。これらの試験の結果を表2に示す。
ミドK.ニューモニアエDNA及びSupercosベクターのみを用いて形質
転換し、それぞれAA200−pKP1、AA200−pKP2、AA200−
pKP4及びAA200−scと命名した。株AA200はトリオースリン酸イ
ソメラーゼが欠失している(tpi-)。
の20のシングルコロニー及びエンプティーベクター形質転換の5つのシングル
コロニーを単離し、グリセロールを1,3−プロパンジオールに転換するそれら
の能力に関して調べた。これらの試験の結果を表3に示す。
ystems,Minneapolis,MN)を用いてE.コリFM5(AT
CC 53911)ゲノムDNAを調製した。部分的glpF及びグリセロール
キナーゼ(glpK)遺伝子を含有する1.0kbのDNAフラグメントをFM
5ゲノムDNAから、プライマー配列番号:2及び配列番号:3を用い、PCR
(Mullis and Faloona,Methods Enzymol.
155,335(1987))により増幅した。部分的glpK及びglpX遺
伝子を含有する1.1kbのDNAフラグメントをFM5ゲノムDNAから、プ
ライマー配列番号:4及び配列番号:5を用い、PCRにより増幅した。プライ
マー配列番号:4中にMunI部位を導入した。プライマー配列番号:4の5’
末端はプライマー配列番号:3の逆相補配列であり、続くオーバーラップエクス
テンションPCR(overlap extension PCR)を可能にし
た。オーバーラップエクステンション法(Horton et al.,Bio
Techniques 8,528(1990))による遺伝子スプライシン
グを用い、鋳型としての上記の2つのPCRフラグメント及びプライマー配列番
号:2及び配列番号:5を用いるPCRによって2.1kbのフラグメントを形
成した。このフラグメントは1.5kbのglpK遺伝子の中心領域からの0.
8kbの欠失を示した。全体として、このフラグメントはMunIクローニング
部位(部分的glpK内)の両側上に1.0kb及び1.1kbのフランキング
領域を有し、相同的組換えによる染色体遺伝子置換を可能にした。
アーゼ(mung bean nuclease)を用いて)、Zero Bl
unt PCR Cloning Kit(Invitrogen,San D
iego,CA)を用いてpCR−Bluntベクター中にクロヘニングし、カ
ナマイシン及びゼオシン耐性遺伝子を含有する5.6kbのプラスミドpRN1
00を得た。バクテリオファージ P1 loxP部位(Snaith et
al.,Gene 166,173(1995))によりフランキングされたク
ロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するpLoxCat1からの1.2kbの
HincIIフラグメント(未公開の結果)を用い、プラスミドpRN100中
のglpKフラグメントを、それをMunI−消化された(且つ平滑末端化され
た)プラスミドpRN100に連結することにより分断し、6.9kbのプラス
ミドpRN101−1を得た。R6K起点を含有する376bpのフラグメント
を、プライマー配列番号:6及び配列番号:7を用いてベクターpGP704(
Miller and Mekalanos,J.Bacteriol.170
,2575−2583(1988))からPCRにより増幅し、平滑末端化し、
pRN101−1からの5.3kbのAsp718−AatIIフラグメント(
平滑末端化された)に連結し、カナマイシン及びクロラムフェニコール耐性遺伝
子を含有する5.7kbのプラスミドpRN102−1を得た。pRN102−
1の形成のための、R6K起点を用いるpRN101−1中のColE1起点領
域の置換は、ほとんどのゼオシン耐性遺伝子の欠失も含んだ。pRN102−1
複製のための宿主は、R6K起点の機能のために必要なpir遺伝子を含有する
E.コリSY327(Miller and Mekalanos,J.Bac
teriol.170,2575−2583(1988))であった。クロラムフェニコール耐性遺伝子分断(interrupt)を有するグリセロ ールキナーゼ突然変異体RJF10mの操作 : E.コリFM5を非−複製組込みプラスミドpRN102−1を用いて電気形
質転換し(electrotransformed)、クロラムフェニコール−
耐性(12.5μL/mL)及びカナマイシン−感受性(30μg/mL)であ
る形質転換細胞をさらに1mMのグリセロールを含有するM9最少培地上で、グ
リセロール非−使用(non−utilization)に関してスクリーニン
グした。1つのそのような突然変異体、RJF10mからのゲノムDNAのEc
oRI消化は、サザン分析(Southern,J.Mol.Biol.98,
503−517(1975))を介して無損傷のglpK遺伝子を用いて精査す
ると、それが二重−交差組込み体(double−crossover int
egrant)(glpK遺伝子置換)であることを示し、それはクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子内における追加のEcoRI部位の存在のおかげで、2つの
予測される7.9kb及び2.0kbバンドが観察されたからである。野生型対
照標準は1つの予測された9.4kbバンドを与えた。突然変異体RJF10m
の13CNMR分析は、それが13C−標識されたグリセロールとATPをグリセロ
ール−3−リン酸に転換できないことを確証した。このglpK突然変異体をさ
らに、プライマーの組合わせ、配列番号:8と配列番号:9、配列番号:10と
配列番号:11及び配列番号:8と配列番号:11を用いるゲノムPCRにより
分析し、それらはそれぞれ予測される2.3kb、2.4kb及び4.0kbの
PCRフラグメントを与えた。野生型対照標準は、プライマー配列番号:8及び
配列番号:11を用い、予測される3.5kbのバンドを与えた。glpK突然
変異体RJF10mをプラスミドpAH48を用いて電気形質転換し、グルコー
スからのグリセロール生産を可能にした。glpK突然変異体、E.コリRJF
10mを1997年11月24日に、Budapest条約の協約下に、ATC
Cに寄託した。クロラムフェニコール耐性遺伝子分断が除去されたグリセロールキナーゼ突然変 異体RJF10の操作 : YENB培地(0.75% 酵母抽出物、0.8% 栄養ブイヨン)上で37
℃において終夜成長させた後、IPTG−誘導lacUV5プロモーターの調節
下のバクテリオファージP1 Creリコンビナーゼ遺伝子、温度−感受性pS
C101レプリコン及びアンピシリン耐性遺伝子を含有するプラスミドpJW1
68(未公開の結果)を用い、水懸濁液中のE.コリRJF10mを電気形質転
換した。SOC培地中で30℃において発芽後成長させ、カルベニシリン(50
μg/mL)及びIPTG(1mM)が補足されたLB寒天培地上で30℃(p
JW168複製のために許される温度)において、形質転換細胞を選択した。C
reリコンビナーゼにより媒介されるloxP部位における組換えを介する染色
体クロラムフェニコール耐性遺伝子の切除を可能にするために、カルベニシリン
及びIPTGが補足された新しいLB寒天培地上で30℃において、プールされ
たコロニーの2回連続終夜転移を行った(Hoess and Abremsk
i,J.Mol.Biol.181,351−362(1985))。得られる
コロニーをカルベニシリン及びIPTGが補足されたLB寒天培地ならびにクロ
ラムフェニコール(12.5μg/mL)が補足されたLB寒天上にレプリカ平
板培養し、カルベニシリン−耐性且つクロラムフェニコール−感受性で、マーカ
ー遺伝子の除去を示すコロニーを同定した。1つのそのようなコロニーの終夜3
0℃培養物を用い、10mLのLB培地に接種した。30℃で0.6AUのOD
(600nm)まで成長させ、培養物を37℃で終夜インキュベーションした。
いくつかの希釈物をあらかじめ温められたLB寒天培地上で平板培養し、平板を
42℃(pJW168複製のために許されない温度)で終夜インキュベーション
した。得られるコロニーをLB寒天培地及びカルベニシリン(75μg/mL)
が補足されたLB寒天培地上にレプリカ平板培養し、カルベニシリン−感受性で
あり、プラスミドpJW168の喪失を示すコロニーを同定した。1つのそのよ
うなglpK突然変異体、RJF10をプライマー配列番号:8及び配列番号:
11を用いるゲノムPCRによりさらに分析し、予測される3.0kbバンドを
得、マーカー遺伝子の切除を確証した。1mMグリセロールを含有するM9最少
培地上で成長しないことにより、突然変異体RJF10によるグリセロール非−
使用が確証された。glpK突然変異体RJF10をプラスミドpAH48を用
いて電気形質転換し、グルコースからのグリセロール生産を可能にした。
2及び配列番号:13を用いるPCR(K.B.Mullis and F.A
.Faloona,Meth.Enzymol.155,335−350(19
87))によりE.コリからgldA遺伝子を単離し、pUC18中のSph1
及びXba1部位の間にクローニングし(T.Maniatis(1982)M
olecular Cloning:A Laboratory Manual
.Cold Spring Harbor,Cold Spring Harb
or,NY)、pKP8を形成した。pKP8をgldA遺伝子内のユニークS
al1及びNco1部位において切断し、末端をKlenowを用いて平滑化し
、連結し、gldAの中間における109bpの欠失及びユニークSal1部位
の再生を生じ、pKP9を形成した。カナマイシン耐性を与える遺伝子(kan
)を含有し、翻訳開始コドンの上流に約400bpsのDNA及び翻訳停止コド
ンの下流に約100bpsのDNAを含む1.4kbのDNAフラグメントを、
末端Sal1部位が導入されたプライマー配列番号:14及び配列番号:15を
用いるPCRによりpET−28a(+)(Novagen,Madison,
Wis)から単離し、pKP9のユニークSal1部位中にサブクローニングし
、pKP13を形成した。gldA翻訳開始コドンの204bps下流で始まり
、gldA翻訳停止コドンの178bps上流で終わり、kan挿入片を含有す
る2.1kbのDNAフラグメントを、それぞれ末端Sph1及びXba1部位
が導入されたプライマー配列番号:16及び配列番号:17を用いるPCRによ
りpKP13から単離し、pMAK705(Genencor Interna
tional,Palo Alto,CA)中のSph1及びXba1部位の間
にサブクローニングし、pMP33を形成した。pMP33を用いてE.コリF
M5を形質転換し、pMAK705複製のために許される温度である30℃で2
0μg/mLのkan上において選択した。20μg/mLのkanが補足され
た液体培地中で30℃において、1つのコロニーを終夜拡大させた(expan
ded)。約32,000の細胞を20μg/mLのkan上で平板培養し、p
MAK705複製のための制限温度である44℃において16時間インキュベー
ションした。44℃で成長する形質転換細胞は染色体中に組込まれたプラスミド
を有し、約0.0001の頻度で存在する。PCR及びサザンブロット(E.M
.Southern,J.Mol.Biol.98,503−517(1975
))分析を用い、形質転換細胞における染色体組込み結果(event)の性質
を決定した。ウェスタンブロット分析(Towbin et al.,Proc
.Natl.Acad.Sci.76,4350(1979))を用い、gld
Aの産物であるグリセロールデヒドロゲナーゼタンパク質が形質転換細胞中で生
産されるかどうかを決定した。活性アッセイを用い、グリセロールデヒドロゲナ
ーゼ活性が形質転換細胞中に残っているかどうかを決定した。フェナジンメトサ
ルフェートを媒介物として用い、グリセロールとNAD+のジヒドロキシアセト
ンとNADHへの転換をテトラゾリウム色素、MTT[3−(4,5−ジメチル
チアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド]の濃く
着色するホルマザンへの転換にカップリングさせることにより、未変性ゲル上で
のグリセロールデヒドロゲナーゼバンドにおける活性を決定した。グリセロール
デヒドロゲナーゼは30mM 硫酸アンモニウム及び100mM Tris、p
H9の存在も必要とする(Tang et al.,J.Bacteriol.
140,182(1997))。分析された8つの形質転換細胞の中で6つがg
ldAノックアウトであると決定された。E.コリMSP33.6を1997年
11月24日に、ブタペスト条約の協約下に、ATCCに寄託した。
翻訳停止コドンの下流に220bpsのDNAを含む1.6kbのDNAフラグ
メントを、それぞれ末端Sph1及びXba1部位が導入されたプライマー配列
番号:18及び配列番号:19を用いるPCRによりE.コリから単離し、pU
C18のSph1及びXba1部位の間にクローニングし、pQN2を形成した
。pQN2をgldA遺伝子内のユニークSal1及びNco1部位において切
断し、末端をKlenowを用いて平滑化し、連結し、gldAの中間における
109bpの欠失及びユニークSal1部位の再生を生じ、pQNを形成した。
カナマイシン耐性を与える遺伝子(kan)を含有し、loxP部位によりフラ
ンキングされた1.2kbのDNAフラグメントをpLoxKan2(Gene
ncor International,Palo Alto,CA)からSt
u1/Xho1フラグメントとして単離し、Klenowを用いて末端を平滑化
し、pQN4中に、Klenowを用いる平滑化の後にSal1部位においてサ
ブクローニングし、pQN8を形成した。R6K複製起点を含有する0.4kb
のDNAフラグメントを、それぞれ末端Sph1及びXba1部位が導入された
プライマー配列番号:20及び配列番号:21を用いるPCRによりpGP70
4(Miller and Mekalanos,J.Bacteriol.1
70,2575−2583(1988))から単離し、pQN8からのgldA
::kanカセットを含有する2.8kbのSph1/Xba1 DNAフラグ
メントに連結し、pKP22を形成した。クロラムフェニコール耐性を与える遺
伝子(cam)を含有し、loxP部位によりフランキングされた1.0kbの
DNAフラグメントを、pLoxCat2(Genencor Interna
tional,Palo Alto,CA)からXba1フラグメントとして単
離し、pKP22中にXba1部位においてサブクローニングし、pKP23を
形成した。glpK−であるE.コリ株RJF10(実施例2を参照されたい)
をpKP23を用いて形質転換し、表現型kanRcamSを有する形質転換細
胞を単離し、二重交差組込みを示し、それをサザンブロット分析により確証した
。グリセロールデヒドロゲナーゼゲル活性アッセイ(実施例3に記載した通り)
は、これらの形質転換細胞中に活性なグリセロールデヒドロゲナーゼが存在しな
いことを示した。実施例2に記載した通りにCre−生産プラスミドpJW16
8を用いて染色体からkanマーカーを除去し、株KLP23を得た。表現型k
anSを有するいくつかの単離物はグリセロールデヒドロゲナーゼ活性を示さず
、サザンブロット分析はkanマーカーの喪失を確証した。
グリセロール3−ホスファターゼ(gpp2)のための発現カセットの構築: サッカロミセス・セレビシアエ染色体Vラムダクローン6592(GenBa
nk,受け入れ番号U18813x11)をATCCから得た。5’末端にBa
mHI−RBS−XbaI部位及び3’末端にSmaI部位が導入された合成プ
ライマー(配列番号:22及び配列番号:23)を用いる、標的DNAとしての
ラムダクローンからのクローニングにより、グリセロール3−リン酸ホスファタ
ーゼ遺伝子(GPP2)をクローニングした。産物をpCR−Script(S
tratagene,Madison,WI)中にSrfI部位においてサブク
ローニングし、GPP2を含有するプラスミドpAH15を形成した。プラスミ
ドpAH15はpCR−Script SK+中のlacプロモーターからの発
現に関して不活性な配向でGPP遺伝子を含有する。GPP2遺伝子を含有する
pAH15からのBamHI−SmaIフラグメントをpBlueScript
II SK+中に挿入し、プラスミドpAH19を形成した。pAH19はla
cプロモーターからの発現に関して正しい配向でGPP2遺伝子を含有する。G
PP2遺伝子を含有するpAH19からのXbaI−PstIフラグメントをp
PHOX2中に挿入し、プラスミドpAH21を作った。pAH21/DH5α
は発現プラスミドである。グリセロール3−リン酸デヒドロゲナーゼ(DAR1)のための発現カセットの 構築 : 合成プライマー(配列番号:24及び配列番号:25)を用いるゲノムS.セ
レビシアエDNAからのPCRクローニングにより、DAR1を単離した。成功
したPCRクローニングは、DAR1の5’末端にNcoI部位を置き、Nco
I中のATGがDAR1イニシエーターメチオニンである。DAR1の3’末端
にBamHI部位が翻訳ターミネーターに続いて導入されている。PCRフラグ
メントをNcoI+BamHIを用いて消化し、発現プラスミドpTrc99A
(Pharmacia,Piscataway,NJ)内の同じ部位中にクロー
ニングし、pDAR1Aを得た。
マー(配列番号:26と配列番号:27)のアニーリングにより得たSpeI−
RBS−NcoIリンカーをpDAR1AのNcoI部位中に挿入し、pAH4
0を作った。プラスミドpAH40は、pTrc99A(Pharmacia,
Piscataway,NJ)のtrcプロモーターからの発現に関して正しい
配向で新しいRBS及びDAR1遺伝子を含有する。pDAR1AからのNco
I−BamHIフラグメント及び合成プライマー(配列番号:28と配列番号:
29)のアニーリングにより得た第2の組のSpeI−RBS−NcoIリンカ
ーをpBC−SK+(Stratagene,Madison,WI)のSpe
I−BamHI部位中に挿入し、プラスミドpAH42を作った。プラスミドp
AH42はクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。dar1及びgpp2のための発現カセットの構築 : DAR1及びGPP2のための発現カセットを、標準的分子生物学的方法を用
い、上記のそれぞれのDAR1及びGPP2サブクローンから組み立てた。リボ
ソーム結合部位(RBS)及びGPP2遺伝子を含有するpAH19からのBa
mHI−PstIフラグメントをpAH40中に挿入し、pAH43を作った。
RBS及びGPP2遺伝子を含有するpAH19からのBamHI−PstIフ
ラグメントをpAH42中に挿入し、pAH45を作った。
成プライマーGATCCAGGAAACAGA(配列番号:30)をCTAGT
CTGTTTCCTG(配列番号:31)と、GPP2遺伝子を含有するpAH
19からのXbaI−PstIフラグメントにアニーリングすることにより得た
BamHI−RBS−SpeIリンカーをpAH40のBamHI−PstI部
位中に挿入し、pAH48を作った。プラスミドpAH48は、pTrc99A
(Pharmacia,Piscataway,NJ)のtrcプロモーターか
らの発現に関して正しい配向でDAR1遺伝子、修正RBS及びGPP2遺伝子
を含有する。E.コリの形質転換 : 本明細書に記載するプラスミドを、標準的な分子生物学的方法を用いてE.コ
リDH5α、FM5及びKLP23中に形質転換した。形質転換細胞をそれらの
DNA RFLPパターンにより実証した。
発現ベクターpTacIQの構築: lacIq遺伝子(Farabaugh,Nature 274(5673)
,765−769(1978))及びtacプロモーター(Amann et
al.,Gene 25,167−178(1983))をpBR322(Su
tcliffe,Cold Spring Harb.Symp.Quant.
Biol.43,77−90(1979))の制限エンドヌクレアーゼ部位Ec
oRI中に挿入することにより、E.コリ発現ベクターpTacIQを調製した
。多重クローニング部位(a multiple cloning site)
及びターミネーター配列(配列番号:32)がEcoRIからSphIまでpB
R322配列に取って代わる(replaces)。グリセロールデヒドラターゼ遺伝子(dhaB1、2、3、X)のサブクローニ ング : 5’末端にEcoRI部位及び3’末端にXbaI部位が導入されたプライマ
ー(配列番号:33及び配列番号:34)を用いるPCRにより、dhaB3遺
伝子のための読取り枠をpHK28−26から増幅した。産物をpLitmus
29(New England Biolab,Inc.,Beverly,M
A)中にサブクローニングし、dhaB3を含有するプラスミドpDHAB3を
形成した。
B3及びdhaBXに関する全コード領域を含有する領域を、制限酵素KpnI
及びEcoRIを用いてpBluescriptIIKS+(Stratage
ne,La Jolla,CA)中にクローニングし、プラスミドpM7を作っ
た。
子を除去し、5.9kbフラグメントを精製し、それをプラスミドpDHAB3
からの325−bpのApaI−XbaIフラグメントと連結し、dhaB1、
dhaB2及びdhaB3を含有するpM11を作った。
baI部位が導入されたプライマー(配列番号:35及び配列番号:36)を用
いるPCRにより、dhaB1遺伝子のための読取り枠をpHK28−26から
増幅した。産物をpLitmus28(New England Biolab
,Inc.,Beverly,MA)中にサブクローニングし、dhaB1を含
有するプラスミドpDT1を形成した。
pM11からのNotI−XbaIフラグメントをpDT1中に挿入し、dha
B発現プラスミド、pDT2を作った。pDT2からのdhaB(1、2、3)
遺伝子を含有するHindIII−XbaIフラグメントをpTacIQ中に挿
入し、pDT3を作った。1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子(dhaT)のサブクローニ ング : 1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(dhaT)遺伝子を含有するp
HK28−26のKpnI−SacIフラグメントをpBluescriptI
I KS+中にサブクローニングし、プラスミドpAH1を作った。鋳型DNA
としてのpAH1ならびに5’末端にXbaI部位及び3’末端にBamHI部
位が導入された合成プライマー(配列番号:37と配列番号:38)からのPC
Rにより、dhaT遺伝子を増幅した。産物をpCR−Script(Stra
tagene)中にSrfI部位においてサブクローニングし、dhaTを含有
するプラスミドpAH4及びpAH5を形成した。プラスミドpAH4はpCR
−Script中のlacプロモーターからの発現に関して正しい配向でdha
T遺伝子を含有し、pAH5は反対の配向でdhaT遺伝子を含有する。dha
T遺伝子を含有するpAH4からのXbaI−BamHIフラクメントをpTa
cIQ中に挿入し、プラスミドpAH8を形成した。RBS及びdhaT遺伝子
を含有するpAH8からのHindII−BamHIフラグメントをpBlue
scriptIIKS+中に挿入し、pAH11を作った。dhaT及びdhaB(1、2、3)のための発現カセットの構築 : 標準的な分子生物学的方法を用い、dhaT及びdhaB(1、2、3)のた
めの発現カセットを前記のそれぞれのdhaB(1、2、3)及びdhaTサブ
クローンから組み立てた。pDT3からのdhaB(1、2、3)遺伝子を含有
するSpeI−SacIフラグメントをpAH11中にSpeI−SacI部位
において挿入し、pAH24を作った。制限酵素SalI−XbaIで消化され
たpAH5中にSalI−XbaIリンカー(配列番号:39及び配列番号:4
0)を挿入し、pDT16を作った。リンカーはXbaI部位を破壊する。次い
でpDT16からの1kbのSalI−MluIフラグメントをpAH24中に
挿入し、現存するSalI−MluIフラグメントに取って代わらせ、pDT1
8を作った。pDT18からのSalI−NotIフラグメント及びpM7から
のNotI−XbaIフラグメントをpCL1920(配列番号:41)中に挿
入することにより、pDT21を構築した。ストレプトミセスからのグルコース
イソメラーゼプロモーター配列(配列番号:42)をPCRによりクローニング
し、pLitmus28のEcoRI−HinDIII部位中に挿入し、pDT
5を構築した。pDT5のEcoRI−PvuIIフラグメントをpCL192
0のEcoRI−PvuI部位中に挿入することにより、pCL1925を構築
した。pDT21のHinDIII−MluIIフラグメント及びpDT21の
MluI−XbaIフラグメントをpCL1925のHinDIII−XbaI
部位中にクローニングすることにより、pDT24を構築した。dhaT及びdhaB(1、2、3、X)のための発現カセットの構築 : pDT18からのSalI−NotIフラグメント及びpM7からのNotI
−XbaIフラグメントをpCL1920(配列番号:41)中に挿入すること
により、pDT21を構築した。ストレプトミセスからのグルコースイソメラー
ゼプロモーター配列(配列番号:42)をPCRによりクローニングし、pLi
tmus28のEcoRI−HinDIII部位中に挿入し、pDT5を構築し
た。pDT5のEcoRI−PvuIIフラグメントをpCL1920のEco
RI−PvuI部位中に挿入することにより、pCL1925を構築した。pD
T21のHinDIII−MluIIフラグメント及びpDT21のMluI−
XbaIフラグメントをpCL1925のHinDIII−XbaI部位中にク
ローニングすることにより、pDT24を構築した。dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW及びdhaB(1、2、3 、X)のための発現カセットの構築 : pHK28−26のSacI−EcoRIフラグメントをpCL1925のS
acI−EcoRI部位中に挿入することにより、pDT29を構築した。dhaR、orfY、orfX、orfW及びdhaB(1、2、3、X)のた めの発現カセットの構築 : PCR−媒介オーバーラップエクステンションとして既知の方法により、遺伝
子dhaTの最初の5つ及び最後の5つのコドン(及び停止コドン)を除くすべ
てが欠失しているプラスミドpDT29の誘導体を構築した。pDT29を鋳型
として用い、以下のプライマーを用いて2つの一次PCR産物を形成した: 配列番号:43=5’GAC GCA ACA GTA TTC CGT CG
C3’; 配列番号:44=5’ATG AGC TAT CGT ATG TTC CG
C CAG GCA TTC TGA GTG TTA ACG3’; 配列番号:45=5’GCC TGG CGG AAC ATA CGA TA
G CTC ATA ATA TAC3’; 配列番号:46=5’CGG GGC GCT GGG CCA GTA CT
G3’。
(ユニークScaI部位まで)、orfYのすべて及びdhaTの最初の5つの
コドンを含む核酸を包含する産物を形成した。配列番号:43を配列番号:44
と対にし、1348bps且つdhaTの最後の5つのコドン(及び停止コドン
)、orfXのすべて、orfWのすべて及び5’dhaR(ユニークSapI
部位まで)を含む核酸を包含する産物を形成した。配列番号:44の5’末端に
おける15の塩基は配列番号:45の15塩基部分の逆相補配列である尾部を構
成する。同様に、配列番号:45の5’末端における11の塩基は、配列番号:
44の11塩基部分の逆相補配列である尾部を構成する。かくして2つの一次P
CR産物をアニーリング(26bp尾部オーバーラップを介する)及びPCRに
よる伸長(extending)の後に一緒にし、2253bpsの第3の核酸
産物を形成した。この第3のPCR産物をSapI及びScaIを用いて消化し
、やはりSapI及びScaIを用いて消化されたpDT29中に連結し、プラ
スミドpKP32を形成し、それはdhaT内における大きな読取り枠内欠失(
in−frame deletion)を除いてpDT29と同じである。
2を発酵槽への播種のために、200mg/Lのカルベニシリン(もしくはアン
ピシリン)及び50mg/Lのスペクチノマイシンを含有する2YT培地(10
g/L 酵母抽出物、16g/L トリプトン及び10g/L NaCl)中で
予備−培養した。KLP23/pAH48/pKP32は、dhaTが欠失して
いることを除いてKLP23/pAH48/pDT29と同じである。
材料(frozen stocks)(凍結保護剤として10%DMSO)から
培養を開始し、250rpmにおける震盪機中で35℃において、約1.0AU
のOD550に達するまで成長させ、発酵槽への播種に用いた。発酵培地 : 以下の成分を発酵槽中で一緒に滅菌した:45g KH2PO4、12g クエ
ン酸、12g MgSO4・7H2O、30g 酵母抽出物、2.0g クエン酸
第2鉄アンモニウム、消泡剤としての5mL Mazu DF204、1.2g
CaCl2・2H2O及び7.3mL 硫酸。20〜28%のNH4OHを用い
てpHを6.8に上げ、以下の成分を加えた:1.2g カルベニシリンもしく
はアンピシリン、0.30g スペクチノマイシン、60mLの微量栄養素の溶
液及びグルコース(60〜67重量%供給材料から)。接種の後、容積は6.0
Lであり、グルコース濃度は10g/Lであった。微量栄養素の溶液は(g/L
):クエン酸.H2O(4.0)、MnSO4・H2O(3.0)、NaCl(1
.0)、FeSO4・7H2O(0.10)、CoCl2・6H2O(0.10)、
ZnSO4・7H2O(0.10)、CuSO4・5H2O(0.010)、H3B
O3(0.010)及びNa2MoO4・2H2O(0.010)を含有した。発酵成長 : 上記の培地を用いて15Lの撹拌されたタンク発酵槽を調製した。温度を35
℃で制御し、アンモニア水(20〜28重量%)を用いてpHを6.8に調節し
た。空気流量(1分当たりに6〜12標準リットルの最小値に設定)及び撹拌機
速度(350〜690rpmの最小値に設定)に関する初期値は、OUR値が約
140ミリモル/L/hに達したら溶解酸素(DO)制御が開始されるように設
定された。背圧は0.5バールで制御された。DO制御は10%に設定された。
小さな逸脱を除き、グルコースは60%もしくは67%(重量)供給材料を用い
て0g/L〜10g/Lにおいて保持された。下記に記す通りにビタミンB12又
は補酵素B12を加えた。KLP23/pAH48/pDT29を用いる発酵 : E.コリ株KLP23/pAH48/pDT29を用いるグルコースの1,3
−プロパンジオール(1,3−PD)への転換の代表的な発酵の概略を表4に示
す。ビタミンB12(0.075g/L、500mL)を、接種から3時間後に開
始して16mL/hの速度で供給した。1,3−プロパンジオールの収率は24
重量%(消費されたグルコースのg当たりの1,3−プロパンジオールのg)で
あり、68g/Lの1,3−プロパンジオールの力価が得られた。
ビタミンB12の2倍濃度の添加又はボーラス添加において類似の結果が得られた
。得られた最高の力価は77g/Lであった。KLP23/pAH48/pKP32を用いる改良された発酵 : E.コリ株KLP23/pAH48/pKP32を用いるグルコースの1,3
−プロパンジオール(1,3−PD)への転換の代表的な発酵の概略を表5に示
す。ビタミンB12(0.150g/L、500mL)を、接種から3時間後に開
始して16mL/hの速度で供給した。36h後、2Lの発酵ブイヨンをパージ
し、グルコース供給材料の連続的添加を可能にした。1,3−プロパンジオール
の収率は26重量%(消費されたグルコースのg当たりの1,3−プロパンジオ
ールのg)であり、112g/Lの1,3−プロパンジオールの力価が得られた
。
分の濃度の添加又はボーラス添加において類似の結果が得られた。得られた最高
の力価は114g/Lであった。
ystems,Minneapolis,MN)を用いてE.コリKLP23ゲ
ノムDNAを調製した。cdh及びトリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)
遺伝子の3’末端を含有する1.0kbのDNAフラグメントを、プライマー配
列番号:47及び配列番号:48を用いてKLP23ゲノムDNAからPCR(
Mullis and Faloona,Methods Enzymol.1
55,335−350(1987))により増幅した。tpiAの5’末端、y
iiQ及びyiiR遺伝子の5’末端を含有する1.0kbのDNAフラグメン
トを、プライマー配列番号:49及び配列番号:50を用い、KLP23ゲノム
DNAからPCRにより増幅した。プライマー配列番号:49中にはScaI部
位が導入された。プライマー配列番号:49の5’末端はプライマー配列番号:
48の逆相補配列であり、続くオーバーラップエクステンションPCRを可能に
した。オーバーラップエクステンション法(Horton et al.,Bi
o Techniques 8,528−535(1990))による遺伝子切
除を用い、鋳型として上記の2つのPCRフラグメント及びプライマー配列番号
:47及び配列番号:50を用いるPCRにより2.0kbのフラグメントを形
成した。このフラグメントは、768bpのtpiA構造遺伝子の73%の欠失
を示した。全体としてこのフラグメントは(部分的tpiA内の)ScaIクロ
ーニング部位の両側上に1.0kbのフランキング領域を有し、相同的組換えに
よる染色体遺伝子置換を可能にした。
unt PCR Cloning Kit(Invitrogen,San D
iego,CA)を用いてpCR−Bluntベクター中にクローニングし、カ
ナマイシン及びゼオシン耐性遺伝子を含有する5.5kbのプラスミドpRN1
06−2を得た。バクテリオファージP1 loxP部位(Snaith et
al.,Gene 166,173−174(1995))によりフランキン
グされたクロラムフェニコール−耐性遺伝子を含有するpLoxCat1(未公
開の結果)からの1.2kbのHincIIフラグメントを用い、プラスミドp
RN106−2中のtpiAフラグメントを、それをScaI−消化プラスミド
pRN106−2に連結することにより分断し、6.8kbのプラスミドpRN
107−1を得た。線状DNA形質転換によるトリオースリン酸イソメラーゼ突然変異体RJ8mの 操作 : 鋳型としてpRN107−1ならびにプライマー配列番号:47及び配列番号
:50を用い、tpiAフランキング領域及びloxP−CmR−loxPカセ
ットを含有する3.2kbフラグメントをPCR増幅し、ゲル−抽出した。最高
で1μgのこの3.2kbの線状DNAフラグメントを用いてE.コリKLP2
3を電気形質転換し、クロラムフェニコール−耐性(12.5μg/mL)且つ
カナマイシン−感受性(30μg/mL)である形質転換細胞をM9最少培地上
で、1mMグルコース上における劣ったグルコース使用に関して、1mMグルコ
ネート上における正常なグルコネート使用に関して、および1mMグルセロール
上における宿主KLP23のグリセロール非−使用表現型を確かめるためにさら
にスクリーニングした。1つのそのような突然変異体、RJ8mからのゲノムD
NAのEcoRI消化は、無損傷のtpiA遺伝子を用い、サザン分析(Sou
thern,J.Mol.Biol.98,503−517(1975))を介
して精査すると、それが二重−交差組込み体(tpiA遺伝子置換)であること
を示し、それはクロラムフェニコール耐性遺伝子内における追加のEcoRI部
位の存在のおかげで2つの予測される6.6kb及び3.0kbバンドが観察さ
れるからであった。予測通り、宿主KLP23及び野生−型FM5対照標準は、
それぞれ単独の8.9kb及び9.4kbバンドを与えた。このtpiA突然変
異体をプライマー配列番号:51及び配列番号:52を用いるゲノムPCRによ
りさらに分析し、それは予測される4.6kbのPCRフラグメントを与えたが
、同じプライマー対に関し、宿主KLP23及び野生−型FM5株は両方とも予
測される3.9kbのPCRフラグメントを与えた。tpiA突然変異体RJ8
m及び宿主KLP23からの無−細胞抽出物を、基質としてグリセルアルデヒド
3−リン酸を用いてtpiA活性に関して調べると、RJ8mの場合には活性が
観察されなかった。プラスミドpAH48を用いてtpiA突然変異体RJ8m
を電気形質転換し、グルコースからのグリセロール生産を可能にし、又、プラス
ミドpAH48とpDT29もしくはpKP32の両方を用いて電気形質転換し
、グルコースからの1,3−プロパンジオール生産を可能にした。RJ8mから
クロラムフェニコール耐性マーカーを除去してRJ8を得た。
H48/pKP32を発酵槽への播種のために予備−培養した。RJ8/pAH
48/pKP32は、dhaTが欠失していることを除いてRJ8/pAH48
/pDT29と同じである。発酵槽培地 : 発酵槽培地は実施例7に記載した通りであった。発酵成長 : 発酵槽成長は、空気流量(分当たりに5〜6標準リットルの最小値に設定)及
び撹拌機速度(300〜690rpmの最小値に設定)に関する初期値を、OU
R値が60〜100ミリモル/L/hに達したら溶解酸素(DO)制御が開始さ
れるように設定したことを除いて、実施例7に記載した通りであった。下記に記
す通りにビタミンB12又は補酵素B12を加えた。RJ8/pAH48/pDT29を用いる発酵 : E.コリ株RJ8/pAH48/pDT29を用いるグルコースの1,3−プ
ロパンジオール(1,3−PD)への転換の代表的な発酵の概略を表6に示す。
ビタミンB12は、2、8及び26hにそれぞれ2、16及び16mgのボーラス
添加として与えた。1,3−プロパンジオールの収率は35重量%(消費された
グルコースのg当たりの1,3−プロパンジオールのg)であり、50.1g/
Lの1,3−プロパンジオールの力価が得られた。
ロパンジオール(1,3−PD)への転換の代表的な発酵の概略を表7に示す。
ビタミンB12は、約26及び44時間にそれぞれ48及び16mgのボーラス添
加として与えた。1,3−プロパンジオールの収率は34重量%(消費されたグ
ルコースのg当たりの1,3−プロパンジオールのg)であり、129g/Lの
1,3−プロパンジオールの力価が得られた。
い、発酵条件下で、ビタミンB12の添加及び3−ヒドロキシプロピオンアルデヒ
ド(3−HPA)の生産の後に非−特異的触媒活性がE.コリ中に存在するが、
前には存在しないことを示した。グリセロール−生産及び1,3−プロバンジオ
ール−生産プラスミド、それぞれpAH48及びpKP32を含有する組換えE
.コリ株を10Lの発酵槽において、本質的に実施例7に記載した通りに、しか
しビタミンB12の不在下で成長させた。タンクが約100のOD550に達したら
ビタミンB12ボーラス(48mg)を加えた。ビタミンB12の添加の直前及び2
h後に細胞のアリコートをタンクから採取した。遠心により細胞を回収し、新し
いタンパク質合成を妨げるために150μg/mLのクロラムフェニコールを含
有するPBS緩衝液中にそれらの最初の容積まで再懸濁させた。最終的容積が、
約10のOD550において50mLとなるのに適した容積のクロラムフェニコー
ル処理細胞を、反応混合物(10g/L グルコース、10g/L グリセロー
ル、1mg/L 補酵素B12及び150μg/mL クロラムフェニコールを含
有するPBS緩衝液)を含有する250mLのバフルドフラスコ(baffle
d flasks)に加えた。光から保護されたフラスコを35℃で250rp
mにおいて震盪させた。時間の経過に及んでHPLC分析のためのアリコートを
採取した。ビタミンB12添加の前もしくは後に発酵槽から回収された細胞を含有
するフラスコ中で、3−HPAの時間−依存的生産が観察された。まさに対照的
に、ビタミンB12添加の後に発酵槽から回収された細胞を含有するフラスコのみ
において、有意なレベルの1,3−プロパンジオールが観察された。無−細胞抽出物中における非−特異的触媒活性の検出 : 未変性ゲル活性染色アッセイ(native gel activity s
tain assay)を用い、無−細胞抽出物中における非−特異的触媒活性
を示した。ビタミンB12の添加の前及び後に、グリセロール−生産及び1,3−
プロパンジオール−生産プラスミド、それぞれpAH48及びpKP32を含有
する組換えE.コリ株を用いる代表的な10−L発酵から細胞を回収し;フレン
チプレスを用いる細胞破壊により無−細胞抽出物を調製した。無−細胞抽出物、
純粋なクレブシエラ・ニューモニアエ1,3−プロパンジオールデヒドロゲナー
ゼ(dhaT)の試料及び分子量標準を未変性勾配ポリアクリルアミドゲルに適
用し、その上で移動させた(run out)。次いでゲルを基質1,3−プロ
パンジオールとNAD+又はエタノールとNAD+に暴露した。予想通り、1,3
−プロパンジオールが基質であるゲルにおいては、DhaTに関する活性染色が
観察され、それは未変性ゲル上を約340Kdalにおいて移動した。この活性
は純粋なクレブシエラ・ニューモニアエ1,3−プロパンジオールデヒドロゲナ
ーゼが適用されたレーンのみで観察された。対照的に、1,3−プロパンジオー
ルが基質であり、ビタミンB12−後無細胞抽出物が適用された場合、約90Kd
alにおいて非−特異的触媒活性が観察された。基質としてエタノールが用いら
れると、DhaTバンドも非−特異的触媒活性バンドも見えず、ビタミンB12添
加の前及び後に約120Kdalにおいて別のバンドが見いだされた。この新し
いバンドは、典型的にはすべての生物において見いだされる、基質としてエタノ
ールに対して特異性を有するアルコールデヒドロゲナーゼを示すのが最もありそ
うなことである。
ルアッセイは、活性が低く、E.コリに関して十分に特性化され且つすべての生
物で見いだされる、基質としてエタノールに対して特異性を有するアルコールデ
ヒドロゲナーゼと活性が異なっているらしい構築物における1,3−プロパンジ
オールの還元の測定で、より高い感度及び精度を与える。デヒドロゲナーゼアッ
セイは、デヒドロゲナーゼが1,3−プロパンジオール(又は他のアルコール)
からNAD+への電子の伝達を触媒するという原理で働く。次いでPMS(フェ
ナジンメトサルフェート)がNADHとゲル中で沈殿を形成するテトラゾリウム
ブロミド色素(MTT、3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,
5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)の間の電子伝達をカップリングさせる
。基質中に数時間から終夜浸した後、ゲルを洗浄して試薬及び可溶性の色素を除
去する。ゲル上の活性デヒドロゲナーゼがあるバンドにおいて、不溶性の青い色
素が生成する。アッセイの種々の側面がJohnson and Lin(J.
Bacteriol.169:2050(1987))により記載されている。 E.コリにおける非−特異的触媒活性の精製及び同定 : 実施例7のKLP23/pAH48/pKP32を用いる改良法で記載した典
型的な1,3−プロパンジオール生産実験の最後から収穫した細胞につき、非−
特異的触媒活性の大規模な部分的精製を行った。細胞ペレット(16g)を洗浄
し、20mL 50mM Hepes緩衝液、pH7.5中に3回再懸濁させた
。音波処理により懸濁液中の細胞をライシスさせた。遠心(15分、20,00
0xg、10℃)により無−細胞抽出物を得、氷上で撹拌しながら250mgの
プロタミンサルフェートを加えることにより、上澄み液をさらに透明にした。遠
心(20分、20,000xg、10℃)によって得た上澄み液を、Hepes
緩衝液を用いて平衡化されたSuperdexR200分取等級カラム(6x6
0cm)に通過させることにより分別した。10mLづつの画分を集め、それぞ
れのアリコートを10,000MWカットオフCentriconR膜を用いて
25分の1に濃縮してから、未変性ゲル活性染色によりアッセイした。画分10
7−112において非−特異的触媒活性が同定され、画分108−109におい
てピーク活性が同定された。画分108及び109のもっと大きなアリコート(
7mLづつ)を50分の1に濃縮し、12−レーンの未変性ゲルのすべてのレー
ン上に負荷した。ゲルを半分に切り、半分をデヒドロゲナーゼ活性に関して染色
し、そこには暗青色のバンドが現れ、それは非−特異的触媒活性を示した。未染
色のゲルを上から下に染色ゲルと並べ、非−特異的触媒活性のバンドに対応する
バンドを未染色ゲル上で切った。ゲルのストリップを粉砕し、粉砕された粒子を
0.5mLの2D−負荷緩衝液中に沈め、95℃に5分間加熱し、遠心してゲル
粒子を除去することにより、可溶性タンパク質を抽出した。Swiss 2Dデ
ータベース(http://www.expasy.ch/ch2d/;Ton
ella et al.Electrophoresis 19:1960−1
971(1998))においてE.コリ抽出物の2D−PAGEのために記載さ
れている条件を用い、2−次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D−PAG
E)のために、上澄み液を等電点電気泳動(IEF)ストリップ上に負荷した。
エレクトロブロッティングによりゲルをPVDF膜に移した。コロイドブルー(
Colloidal blue)ゲル染色を用いて膜をタンパク質に関して染色
した。非−特異的触媒活性を同定するために用いられた染色されたブロットを図
6に示す。アミノ末端ペプチド配列決定のための標準的方法を用いてスポットを
同定した。1つのスポット(スポットA)のみがオキシドレダクターゼ活性をコ
ードした。スポットA(図6)の19サイクルは、FASTA探索機(sear
ch tool)により、推定オキシドレダクターゼ活性を有するE.コリの読
取り枠であるyqhDのアミノ−末端と100%の同一性適合(identit
y match)を与えた。yqhDによりコードされるタンパク質に関する完
全アミノ酸配列を配列番号:57に示し;対応するDNA配列を配列番号:58
に示す。yqhD遺伝子は、おそらくNADH−依存性ブタノールデヒドロゲナ
ーゼ2であるクロスツリジウム中の遺伝子adhBに40%の同一性を有する。 E.コリKLP23中のyqhDの遺伝子破壊 : 生化学的アッセイ及びアミノ−末端アミノ酸配列決定は、非−特異的触媒活性
がE.コリyqhD遺伝子によりコードされるかも知れないことを示唆した。未
知の機能のこの遺伝子は仮定的オキシドレダクターゼをコードし、dhaT遺伝
子によりコードされるシトロバクテル・フレウンジイ及びクレブシエラ・ニュー
モニアエ1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ中にも見いだされる2つの
アルコールデヒドロゲナーゼの特徴(signature)を含有する。
ングDNA配列及び906bpの3’−フランキングDNA配列をE.コリKL
P23(実施例4)ゲノムDNAから、Taqポリメラーゼ及び以下のプライマ
ーを用いるPCRにおいて増幅した: (配列番号:59)5’−GCGGTACCGTTGCTCGACGCTCAG
GTTTTCGG−3’ (配列番号:60)5’−GCGAGCTCGACGCTTGCCCTGATC
GAGTTTTGC−3’ 反応を94℃で1分間、50℃で1分間及び72℃で3分間、35サイクル行
い、続いて72℃で5分間、最終的伸長を行った。得られる3.7KbのDNA
フラグメントを精製し、SacI及びKpnIで消化し、同様に消化されたpB
luescriptII KS(+)(Strategene)に16℃で16
h連結した。連結されたDNAを用いてE.コリDH5α(Gibco/BRL
)を形質転換し、X−gal(40μg/mL)及びアンピシリン(100μg
/mL)を含有するLB寒天(Difco)上で白いコロニー色を示す形質転換
細胞から期待されるプラスミド、pJSP29を単離した。プラスミドpJSP
29をAflII及びNdeIで消化し、363bpのyqhD遺伝子及び46
bpの3’−フランキングDNA配列を含む409bpのDNAフラグメントを
遊離させた。残る5,350bpのDNAフラグメントを精製し、pLoxKa
n2(Genencor International,Palo Alto,
CA)からのカナマイシン耐性遺伝子を含有する1,374bpのAflII/
NdeI DNAフラグメントに16℃で16h連結した。連結されたDNAを
用いてE.コリDH5αを形質転換し、カナマイシン(50μg/mL)を含有
するLB寒天培地上で選択された形質転換細胞から期待されるプラスミド、pJ
SP32−Blueを単離した。プラスミドpJSP32−BlueをKpnI
及びSacIで消化し、3,865bpのyqhD破壊カセットを精製し、同様
に消化されたpGP704(Miller and Mekalanos,J.
Bacteriol.170:2575−2583(1988))に16℃で1
6h連結した。連結されたDNAを用いてE.コリSY327(Miller
and Mekalanos,J.Bacteriol.170:2575−2
583(1988))を形質転換し、カナマイシン(50μg/mL)を含有す
るLB寒天培地上で選択された形質転換細胞から期待されるプラスミド、pJS
P32を単離した。プラスミドpJSP32をE.コリKLP23中に形質転換
し、形質転換細胞をカナマイシン(50μg/mL)を含有するLB寒天上で選
択した。スクリーニングされた200のカナマイシン−耐性形質転換細胞の中で
、2つが、yqhD破壊カセットによるyqhD遺伝子の置換を生ずる二重−交
差組換え結果の場合に予測されるアンピシリン−感受性表現型を示した。
ならびに以下の組のプライマー対を用いて、PCRによりyqhD遺伝子の破壊
を確証した: 1組: (配列番号:61)5’−GCGAGCTCGACGCTTGCCCTGATC
GAGTTTTGC−3’ (配列番号:62)5’−CAGCTGGCAATTCCGGTTCG−3’ 2組: (配列番号:63)5’−CCCAGCTGGCAATTCCGGTTCGCT
TGCTGT−3’ (配列番号:64)5’−GGCGACCCGACGCTCCAGACGGAA
GCTGGT−3’ 3組: (配列番号:65)5’−CCGCAAGATTCACGGATGCATCGT
GAAGGG−3’ (配列番号:66)5’−CGCCTTCTTGACGAGTTCTGAGCG
GGA−3’ 4組: (配列番号:67)5’−GGAATTCATGAACAACTTTAATCT
GCACAC−3’ (配列番号:68)5’−GTTTGAGGCGTAAAAAGCTTAGCG
GGCGGC−3’ 反応はExpand High Fidelity Polymerase(
Boehringer Manheim)又はTaqポリメラーゼを含有するP
latinum PCR Supermix (Gibco/BRL)を用いて
、94℃で1分間、50℃で1分間及び72℃で2分間、35サイクル行い、続
いて72℃で5分間最終的伸長を行った。得られるPCR産物を1.0%(w/
v)アガロース中におけるゲル電気泳動により分析した。表8にまとめる結果は
、両方の形質転換細胞におけるyqhD遺伝子の破壊を確証した。
qhDの3’末端を欠失させる。欠失は121アミノ酸に対応する363bpの
3’yqhDコード配列を除去する。停止コドンは、カナマイシン耐性カセット
中の残りのyqhDコード配列の15bp下流に存在する。
に共−形質転換し、両方のプラスミドを含有する形質転換細胞をアンピシリン(
100μg/mL)及びスペクチノマイシン(50μg/mL)を含有するLB
寒天上で選択した。代表的な形質転換細胞を、ビタミンB12の存在下もしくは不
在下での10Lの発酵においてグルコースを1,3−プロパンジオールに転換す
るその能力に関して調べた。E.コリ株KLP23/pAH48/pKP32における有意な1,3−プロパ ンジオール生産にyqhDが必要であることの立証 : 1,3−プロパンジオール生産へのyqhD破壊の影響に関して調べるために
、E.コリ株KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32を用い、本質
的に実施例7に記載した通りに1,3−プロパンジオールの生産のための発酵を
行った。
pAH48/pKP32を用いる代表的10−L発酵を表9に示す。OD550が
30Aを越えた時に(10.4h)ビタミンB12を添加するまで、生物は安定し
て細胞塊及びグリセロールを堆積させた。ビタミンB12を10.4hに8mgの
ボーラス添加として与え、その後ビタミンB12を1.32mh/hの速度で連続
的に供給した。B12の添加に続く4h以内に、グルコース消費が遅くなり、酸素
使用速度が低下し、光学濃度におけるさらなる向上はなかった。グルコースの発
酵が止まり、タンク中のグルコース濃度が蓄積した。得られた1,3−プロパン
ジオールの最高の力価は0.41g/Lであった。アンピシリン及びスペクチノ
マイシンを含有する寒天平板上で細胞の希釈系列を平板培養することにより、生
物をその生存率に関して調べた。平板を30℃のインキュベーター中で24hイ
ンキュベーションした。E.コリKLP23(yqhD-)/pAH48/pK
P32の発酵からの平板上に生存コロニーはなかった、表11。
グルコース供給溶液の完全な添加の故に10−Lタンクが満たされるまで、細胞
塊及びグリセロールを生じ続けた(表10)。この発酵の最後における細胞懸濁
液の希釈系列による寒天平板生存率決定は、光学濃度値により見積もられる合計
細胞数と一致する生存細胞カウントを示した(表11)。
験の間で比較される細胞外可溶性タンパク質(g/L)のグラフ。
験の間で比較される細胞生存率[(生存細胞/mL)/OD550]のグラフ。
おける2つの発酵実験の間で比較されるグルコースからのグリセロールの収率の
グラフ。
性)を示すバンドから抽出される可溶性タンパク質画分を用いた2D−PAGE
膜ブロット。
Claims (29)
- 【請求項1】 3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの1,3−プロパンジ
オールへの転換のための非−特異的触媒活性をコードし、且つ: (a)配列番号:57のアミノ酸配列のすべて又は実質的部分をコードする単
離された核酸フラグメント; (e)配列番号:57のアミノ酸配列のすべて又は実質的部分をコードする単
離された核酸フラグメントに実質的に類似している単離された核酸フラグメント
; (f)配列番号:57のアミノ酸配列の少なくとも80%を有する少なくとも
387個のアミノ酸のポリペプチドをコードする単離された核酸フラグメント; (d)0.1XSSC、0.1%SDS、65℃のハイブリダイジェーション
条件下で(a)とハイブリダイジェーションし、2XSSC、0.1%SDS及
び続いて0.1XSSC、0.1%SDSを用いて洗浄された単離された核酸フ
ラグメント;ならびに (e)(a)、(b)、(c)又は(d)に相補的である単離された核酸フラグ
メント より成る群から選ばれる単離された核酸フラグメント。 - 【請求項2】 配列番号:58に示される単離された核酸フラグメント。
- 【請求項3】 請求項1の単離された核酸フラグメントによりコードされる
ポリペプチド。 - 【請求項4】 配列番号:57に示される請求項3のポリペプチド。
- 【請求項5】 適した調節配列に操作可能に結合した請求項1の単離された
核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子。 - 【請求項6】 請求項5のキメラ遺伝子を用いて形質転換された、シトロバ
クテル(Cytrobacter)、エンテロバクテル(Enterobact
er)、クロスツリジウム(Clostridium)、クレブシエラ(Kle
bsiella)、アエロバクテル(Aerobacter)、ラクトバシルス
(Lactobacillus)、アスペルギルス(Aspergillus)
、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Sc
hizosaccharomyces)、チゴサッカロミセス(Zygosac
charomyces)、ピチア(Pichia)、クルイベロミセス(Klu
yveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(Hans
enula)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ムコル(Muc
or)、トルロプシス(Torulopsis)、メチロバクテル(Methy
lobacter)、サルモネラ(Salmonella)、バシルス(Bac
illus)、アエロバクテル(Aerobacter)、ストレプトミセス(
Streptomyces)及びシュードモナス(Pseudomonas)よ
り成る群から選ばれる微生物。 - 【請求項7】 (a)デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードす
る少なくとも1つの遺伝子; (b)デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも1つの遺伝子; 及び (c)3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオールに転
換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも1つの外因性遺伝子 を含む1,3−プロパンジオールの生産に有用な組換え微生物であって、1,3
−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする機能性dhaT遺伝
子が組換え微生物中に存在せず、微生物がシトロバクテル、エンテロバクテル、
クロスツリジウム、クレブシエラ、アエロバクテル、ラクトバシルス、アスペル
ギルス、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、チゴサッカロミセス、ピチア、
クルイベロミセス、カンジダ、ハンセヌラ、デバリオミセス、ムコル、トルロプ
シス、メチロバクテル、サルモネラ、バシルス、アエロバクテル、ストレプトミ
セス及びシュードモナスより成る群から選ばれる組換え微生物。 - 【請求項8】 さらに: (a)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする少なくとも1つの遺伝子;及び (b)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコード
する少なくとも1つの遺伝子 を含む請求項7の組換え微生物。 - 【請求項9】 デヒドラターゼ再活性化因子がdhaレギュロンから単離さ
れるorfX及びorfZによりコードされる請求項7又は8の組換え微生物。 - 【請求項10】 orfX及びorfZが独立にクレブシエラ種、シトロバ
クテル種又はクロスツリジウム種から単離される請求項9の組換え微生物。 - 【請求項11】 さらに、それぞれが遺伝子を不活性化する突然変異を有す
る1組の内因性遺伝子を含み、該組が: (a)グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第1の遺
伝子; (b)グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
第2の遺伝子;及び (c)トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
第3の遺伝子 から成る請求項8の組換え微生物。 - 【請求項12】 組換え微生物が単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び1−炭素
(single−carbon)基質より成る群から選ばれる炭素源を1,3−
プロパンジオールに転換する請求項8又は11の組換え微生物。 - 【請求項13】 組換え微生物がグリセロール及びジヒドロキシアセトンよ
り成る群から選ばれる炭素源を1,3−プロパンジオールに転換する請求項7の
組換え微生物。 - 【請求項14】 グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子がGPD1、GPD2、GPD3、DAR1、
gpsA、GUT2、glpD及びglpABCより成る群から選ばれる請求項
8又は11の組換え微生物。 - 【請求項15】 グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子がGPP1及びGPP2より成る群から選ばれる請求項
8又は11の組換え微生物。 - 【請求項16】 デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子がグリセロールデヒドラターゼ及びジオールデヒドラターゼより成る群から
選ばれる請求項7、8又は11の組換え微生物。 - 【請求項17】 デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子がクレブシエラ種、シトロバクテル種又はクロスツリジウム種から単離され
る請求項7、8及び11の組換え微生物。 - 【請求項18】 (a)(i)デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドを
コードする少なくとも1つの遺伝子; (ii)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードする少なくとも1つの遺伝子; (iii)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプチド
をコードする少なくとも1つの遺伝子;及び (iv)デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも1つの遺伝
子 より成る1組の外因性遺伝子;ならびに (b)3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオールに転
換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも1つの内因性遺伝子 を含む組換えE.コリ(E.coli)であって、組換えE.コリ中には1,3
−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする機能性dhaT遺伝
子が存在しない組換えE.コリ。 - 【請求項19】 (a)(i)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ
活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子; (ii)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドを
コードする少なくとも1つの遺伝子;及び (iii)dhaR、orfY、orfX、orfW、dhaB1、dh
aB2、dhaB3及びorfZの遺伝子産物をコードする少なくとも1つの遺
伝子のサブセット より成る1組の外因性遺伝子、ならびに (b)3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオールに転
換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも1つの内因性遺伝子 を含む組換えE.コリであって、組換えE.コリ中には1,3−プロパンジオー
ルオキシドレダクターゼ活性をコードする機能性dhaT遺伝子が存在しない組
換えE.コリ。 - 【請求項20】 さらに、各遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有す
る1組の内因性遺伝子を含み、該組が: (a)グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子; (b)グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子;及び (c)トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子 から成る請求項19の組換えE.コリ。 - 【請求項21】 (a)適した条件下で請求項19又は請求項20の組換え
E.コリを単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び1−炭素基質より成る群から選ばれ
る少なくとも1つの炭素源と接触させ、それにより1,3−プロパンジオールを
生産し; (b)(a)で生産される1,3−プロパンジオールを場合により回収する ことを含む1,3−プロパンジオールの生物的生産のための方法。 - 【請求項22】 (a)請求項19又は20の組換えE.コリあるいはさら
に: (i)デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも
1つの外因性遺伝子; (ii)デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも1つの外因
性遺伝子; (iii)3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオ
ールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも1つの内因性遺伝子
を含む請求項19又は20の組換えE.コリを、グリセロール及びジヒドロキシ
アセトンより成る群から選ばれる少なくとも1つの炭素源と接触させ、 (b)(a)で生産される1,3−プロパンジオールを場合により回収する ことを含む1,3−プロパンジオールの生物的生産のための方法。 - 【請求項23】 (a)組換えE.コリを第1の炭素源及び第2の炭素源と
接触させ、組換えE.コリは: (i)デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも
1つの外因性遺伝子; (ii)デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも1つの外因
性遺伝子; (iii)3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオ
ールに転換するのに十分な非−特異的触媒活性をコードする少なくとも1つの内
因性遺伝子 を含み、ここで組換えE.コリ中に1,3−プロパンジオールオキシドレダクタ
ーゼ活性をコードする機能性dhaT遺伝子は存在せず、且つここで第1の炭素
源はグリセロール及びジヒドロキシアセトンより成る群から選ばれ、第2の炭素
源は単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び1−炭素基質より成る群から選ばれ; (b)(a)で生産される1,3−プロパンジオールを場合により回収する ことを含む1,3−プロパンジオールの生産法。 - 【請求項24】 組換えE.コリがさらに (a)(i)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードする少なくとも1つの遺伝子; (ii)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドを
コードする少なくとも1つの遺伝子;及び (iii)dhaR、orfY、orfX、orfW、dhaB1、dh
aB2、dhaB3及びorfZの遺伝子産物をコードする少なくとも1つの遺
伝子のサブセット より成る1組の外因性遺伝子、ならびに (b)各遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有し: (i)グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝
子; (ii)グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子;及び (III)トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子 より成る1組の内因性遺伝子 を含む請求項23の方法。 - 【請求項25】 配列番号:1に示す1組の遺伝子dhaR、orfY、d
haT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3及びorf
Zを含むベクターpDT29。 - 【請求項26】 配列番号:1に示すdhaR、orfY、orfX、or
fW、dhaB1、dhaB2、dhaB3及びorfZを含むベクターpKP
32。 - 【請求項27】 (a)各遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有し: (i)グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝
子;及び (ii)グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子 より成る2つの内因性遺伝子の1組; (b)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする少なくとも1つの外因性遺伝子; (c)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコード
する少なくとも1つの外因性遺伝子;ならびに (d)プラスミドpKP32 を含む組換えE.コリ株KLP23。 - 【請求項28】 (a)各遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有し: (i)グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝
子; (ii)グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子;及び (iii)トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子 より成る3つの内因性遺伝子の組 を含む組換えE.コリ株RJ8。 - 【請求項29】 (a)適した条件下に、dhaレギュロンを含み、且つ1
,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする機能性dhaT
遺伝子が欠けている組換えE.コリを少なくとも1つの炭素源と接触させ、ここ
で炭素源は単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び1−炭素基質より成る群から選ばれ
; (b)(a)で生産される1,3−プロパンジオールを場合により回収する ことを含む1,3−プロパンジオールの生産法。
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