PT1204755E - Processo para a produção biológica de 1, 3-propanodiol - Google Patents

Description

ΡΕ1204755 1

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO BIOLÓGICA DE 1,3-PROPANODIOL"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção contempla o processo para a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável em 1,3-propanodiol através de um único microorganismo.

ANTECEDENTES 0 1,3-propanodiol é um monómero que apresenta uma potencial utilidade na produção de fibras de poliéster e na manufactura de poliuretanos e de compostos ciclicos. É conhecida uma variedade de vias químicas para o 1,3-propanodiol. Por exemplo o óxido de etileno pode ser convertido em 1,3-propanodiol com um catalisador na presença de fosfina água, monóxido de carbono, hidrogénio e um ácido, através da fase de hidratação da solução catalítica da acroleína seguida pela redução, ou a partir de compostos tais como o glicerol, reagido na presença de monóxido de carbono e hidrogénio com catalisadores contendo átomos do grupo VIII da tabela periódica. Apesar de ser possível produzir 1,3-propanodiol por estes métodos, estes são dispendiosos e produzem resíduos contendo poluentes ambientais. 2 ΡΕ1204755 É conhecido há mais de um século que o 1,3-propanodiol pode ser produzido através da fermentação de glicerol. Foram encontradas estirpes bacterianas capazes de produzir 1,3-propanodiol, por exemplo, nos grupos Citro-bacter, Clostridium, Enterobacter, Ilyobacter, Klebsiella, Lactobacillus, e Pelobacter. Em cada caso estudado, o glicerol é convertido em 1,3-propanodiol numa reacção sequencial de dois passos, catalisada por enzima. No primeiro passo, uma desidratase catalisa a conversão do glicerol em 3-hidroxipropionaldeído (3-HPA) e água, Equação 1. No segundo passo, o 3-HPA é reduzido a 1,3-propanodiol através de uma oxidoredutase ligada a NAD+, Equação 2. O 1,3-propanodiol não é seguidamente metabolizado e, como resultado,

Glicerol 3-HPA + H20 (Equação 1) 3-HPA + NADH + H+ 1,3-Propanodiol + NAD+ (Equação 2) acumula-se no meio. A reacção global consome um equivalente redutor na forma de um cofactor, o β-nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) reduzido, que é oxidado a nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) .

Na Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, e no Clostridium pasteurianum, os genes que codificam as três subunidades estruturais da glicerol desidratase (dhaBl-3 ou dhaB, C e E) estão localizados adjacentemente a um gene que codifica uma oxidoredutase de 1,3-propanodiol especifica 3 ΡΕ1204755 (dhaT) (ver Figura 1). Apesar da organização genética diferir um pouco entre estes microorganismos, estes genes são aglomerados num grupo que compreende também o orfX e o orfZ (genes que codificam um factor de reactivação da desidratase para a glicerol desidratase), bem como o orfY e o orfW (genes de função desconhecida). As oxidoredutases de 1,3-propanodiol especificas (dhaT's) destes microorganismos são conhecidas por pertencerem à familia das álcool desidrogenases de tipo III; cada uma exibe um motivo de ligação ao ferro conservado e têm preferência para a interconversão associada a NAD+/NADH de 1,3-propanodiol e de 3-HPA. No entanto, a interconversão associada a NAD+/NADH de 1,3-propanodiol e de 3-HPA é catalisada também por álcool desidrogenases que não se ligam especificamente às enzimas desidratases (por exemplo, álcool desidrogenases de figado de cavalo e de fermento de padeiro (E.C. l.l.l.l)), embora com menos parâmetros cinéticos eficientes. A glicerol desidratase (E.C. 4.2.1.30) e a diol[l,2-propanodiol] desidratase (E.C. 4.2.1.28) estão relacionadas mas são enzimas distintas que são codificadas por genes distintos. Os genes da diol desidratase de Klebsiella oxytoca e de Salmonella typhimurium são similares aos genes da glicerol desidratase e estão aglomerados num grupo que compreende genes análogos ao orfX e ao orfZ (Daniel et al., FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999); Toraya and Mori, J.

Bio. Chem. 274, 3372 (1999); GenBank AF026270). A produção de 1,3-propanodiol a partir de glicerol é geralmente efectuada sob condições anaeróbias 4 ΡΕ1204755 utilizando glicerol como a única fonte de carbono e na ausência de outros aceitadores exógenos de equivalentes redutores. Sob estas condições, por exemplo, em estirpes de Citrobacter, Clostridium, e Klebsiella, actua uma via paralela do glicerol que envolve primeiramente a oxidação do glicerol em di-hidroxiacetona (DHA) através de um NAD+-(ou NADP+-) associado à glicerol desidrogenase, Equação 3. A DHA, seguidamente à fosforilação em di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) por uma cinase DHA (Equação 4),

Glicerol + NAD+ -> DHA + NADH + H+ (Equação 3) DHA + ATP DHAP + ADP (Equação 4) torna-se disponível para a biosintese e para manter a via de produção de ATP por exemplo, a glicólise. Em contraste com a via do 1,3-propanodiol, esta via pode fornecer carbono e energia à célula e produzir NADH em vez de o consumir.

Na Klebsiella pneumoniae e a Citrobacter freundii, os que codificam as actividades ligadas funcionalmente ao glicerol desidratase (dhaB) , ao 1,3-propanodiol oxidoredutase (dhaT) , ao glicerol desidrogenase (dhaD), e à cinase di-hidroxiacetona (dhaK) são englobadas pelo regulão dha. O regulão dha, na Klebsiella pneumoniae e na Citrobacter freundii, englobam também um gene que codifica uma proteína activadora transcricional (dhaR) . Os regulões da Citrobacter e da Klebsiella têm sido expressos na Escherichia coli e tem sido demonstrado que convertem o glicerol no 1,3-propanodiol. 5 ΡΕ1204755

Nem os métodos químicos nem os biológicos descritos acima para a produção de 1,3-propanodiol estão bem adequados para a produção à escala industrial visto que os processos químicos são intensivamente energéticos e os processos biológicos estão limitados ao título relativamente baixo do material base dispendioso, o glicerol. Estas desvantagens podem ser ultrapassadas por um método que requer a introdução de baixa energia e de um material base barato tal como os carbohidratos ou os açucares, ou através do aumento da eficiência metabólica de processo para o glicerol. O desenvolvimento de qualquer dos métodos irá requerer a capacidade de manipular a maquinaria genética responsável pela conversão de açucares em glicerol e do glicerol em 1,3-propanodiol.

Os processos biológicos para a preparação de glicerol são conhecidos. A esmagadora maioria dos produtores de glicerol são as leveduras mas algumas bactérias, outros fungos e algas são também conhecidos. Tanto as bactérias como as leveduras produzem glicerol através da conversão da glucose ou de outros carbohidratos pela via da frutose-1,6-bifosfato pela glicólise ou pela via de Embden Meyerhof Parnas, enquanto que, algumas algas convertem o dióxido de carbono dissolvido ou o bicarbonato nos cloroplastos nos intermediários de 3-carbonos do ciclo de Calvin.

Numa série de passos, o intermediário de 3-car- 6 ΡΕ1204755 bonos, o ácido fosfoglicérico, é convertido em gliceral-deído 3-fosfato que pode ser rapidamente interconvertido no seu isómero ceto di-hidroxiacetona fosfato e finalmente em glicerol.

Especificamente, a bactéria Bacillus licheni-formis e a Lactobacillus lycopersica sintetizam o glicerol, e encontra-se produção de glicerol na alga halotolerante Dunaliella sp. e na Asteromonas gracilis para protecção contra elevadas concentrações externas de sal. Similarmente, várias leveduras osmotolerantes sintetizam o glicerol como uma medida protectora. Muitas estirpes de Saccha-romyces produzem algum glicerol durante a fermentação alcoólica, e isto pode ser aumentado fisiologicamente pela aplicação de stress osmótico. No inicio deste século foi alcançada a produção de glicerol comercializável pela utilização de culturas de Saccharomyces para as quais foram adicionados "reagentes de orientação" tais como os sulfitos ou álcalis. Através da formação de um complexo inactivo, os agentes de orientação bloqueiam ou inibem a conversão do acetaldeído em etanol; assim, os equivalentes redutores em excesso (NADH) estão disponíveis para ou "direccionados" através da DHAP para a redução para produzir glicerol. Este método está limitado pela inibição parcial do crescimento das leveduras que é devido aos sulfitos. Esta limitação pode ser parcialmente ultrapassada pela utilização de álcalis que originam equivalentes de NADH em excesso por um mecanismo diferente. Nesta prática, os álcalis iniciam uma desproporcionação Cannizarro para produzir etanol e ácido acético a partir de dois equivalentes de acetaldeído. 7 ΡΕ1204755 O gene que codifica a glicerol-3-fosfato desi-drogenase (DAR1, GPD1) tem sido clonado e sequenciado a partir da S. diastaticus (Wang et al., J. Bact. 176, 7091-7095 (1994)). O gene DAR1 foi clonado num vector Shuttle e utilizado para transformar a E. coli onde a expressão produziu uma enzima activa. Wang et al., (supra) reconhece que o DAR1 é regulado pelo ambiente celular osmótico mas não sugere como o gene pode ser utilizado para estimular a produção de 1,3-propanodiol num microorganismo recombinante.

Outras enzimas da glicerol-3-fosfato desidroge-nase foram isoladas: por exemplo, a sn-glicerol-3-fosfato desidrogenase foi clonada e sequenciada a partir da Saccharomyces cerevisiae (Larason et al., Mol. Microbiol. 10, 1101 (1993)) e Albertyn et al. (Mol. Cell. Biol. 14, 4135 (1994)) mostra a clonagem de GPD1 que codifica uma glicerol-3-fosfato desidrogenase a partir da Saccharomyces cerevisiae. Tanto Wang et al. (supra), como Albertyn et al. e Larason et al. reconhecem a osmosensibilidade da regulação deste gene mas não sugerem como o gene pode ser utilizado na produção de 1,3-propanodiol num microorganismo recombinante.

Tal como com a G3PDH, a glicerol—3-fosfatase foi isolada a partir da Saccharomyces cerevisiae e a proteína foi identificada como sendo codificada pelos genes GPP1 e GPP2 (Norbeck et al., J. Biol. Chem. 271, 13875 (1996)). Como os genes que codificam a G3PDH, parece que a GPP2 é osmosensitiva. ΡΕ1204755

Apesar de ser desejável um único microorganismo para a conversão da fonte de carbono fermentável em vez do glicerol ou da di-hidroxiacetona em 1,3-propanodiol, foi documentado que existem dificuldades significativas para superar em tal diligência. Por exemplo, Gottschalk et al. (EP 373 230) mostrou que o crescimento da maioria das estirpes úteis para a produção de 1,3-propanodiol, incluindo a Citrobacter freundii, o Clostridium autobutylicum, o Clostridium butylicum, e a Klebsiella pneumoniae é perturbado pela presença de um dador de hidrogénio tal como a frutose ou a glucose. As estirpes de Lactobacillus brevis e de Lactobacillus buchner, que produzem 1,3-propanodiol em co-fermentações do glicerol e frutose ou glucose, não crescem quando o glicerol é fornecido como a fonte de carbono exclusiva, e, apesar de ter sido mostrado que as células em repouso podem metabolizar a glucose ou a frutose, elas não produzem o 1,3-propanodiol (Veiga DA Cunha et al., J. Bacteriol. , 174, 1013 (1992)). Simi- larmente, tem sido mostrado que uma estirpe de Ilyobacter polytropus, que produz 1,3-propanodiol quando o glicerol a o acetado são fornecidos, não produzem 1,3-propanodiol a partir de substratos de carbono diferentes do glicerol, incluindo a frutose e a glucose (Steib et al., Arch. Microbiol. 140, 139 (1984)). Finalmente, Tong et al. (Appl. Biochem. Biotech. 34, 149 (1992)) mostrou que a Escherichia coli recombinante transformada com o regulão dha que codifica a glicerol desidratase não produz o 1,3-propanodiol a partir de glucose nem de xilose na falta do glicerol exógeno. 9 ΡΕ1204755

As tentativas para melhorar a produção de 1,3-propanodiol a partir de glicerol têm sido reportadas onde os co-substratos capazes de fornecer equivalentes redutores, normalmente açucares fermentáveis, são incluidos no processo. Têm sido reivindicados melhoramentos na produção para as células em repouso de Citrobacter freundii e de Klebsiella pneumoniae DMS 4270 que co-fermentam o glicerol e a glucose (Gottschalk et al., supra.; e Tran-Dinh et al., DE 3734 764); mas não para as células em crescimento de Klebsiella pneumoniae ATCC 2595 que co-fermenta o glicerol e a glucose, que não produzem o 1,3-propanodiol (I-T. Tong, Ph.D. Thesis, University of Wisconsin-Madison (1992)). Os aumentos da produção têm sido reportados para a co-fermentação do glicerol e da glucose ou da frutose através da Escherichia coli recombinante; no entanto, o 1,3-propanodiol não é produzido na ausência do glicerol (Tong et al., supra.). Nestes sistemas, microorganismos únicos utilizam os carbohidratos como uma fonte para criar NADH enquanto fornecem energia e carbono para a manutenção ou crescimento da célula. Estas descobertas sugerem que os açucares não entram na cadeia de carbono que produz o 1,3-propanodiol.

Recentemente, no entanto, tem sido descrita a conversão de substratos de carbono, em vez de glicerol ou da di-hidroxiacetona, em 1,3-propanodiol por um único microorganismo que expressa uma enzima desidratase (U. S. 5,686,276; WO 9821339; WO 9928480; e WO 9821341 (US 10 ΡΕ1204755 6013494)). Uma deficiência especifica nos processos biológicos que levam à produção de 1,3-propanodiol quer a partir de glicerol ou de glucose tem sido o baixo titulo do produto conseguido via fermentação; assim, é requerido um processo de separação de energia intensa para obter 1,3-propanodiol a partir do meio de fermentação aquoso. As fermentações semi-continuas ("fed-batch") ou descontinuas ("batch") do glicerol em 1,3-propanodiol levaram a títulos finais de 65 g/L através do Clostridium butyricum (Saint-Amans et al., Biotechnology Letters 16, 831 (1994)), 71 g/L através de mutantes do Clostridium butyricum (Abbad-Andaloussi et al., Appl. Environ. Microbiol. 61, 4413 (1995)), 61 g/L através da Klebsiella pneumoniae (Homann et al., Appl. Bicrobiol. Biotechnol. 33, 121 (1990)), e 35 g/L através da Citrobacter freundii (Homann et al., supra). Não foram ainda descobertas fermentações de glucose em 1,3-propanodiol que excedessem o título obtido a partir de fermentações do glicerol. O problema que continua sem resolução é como produzir biologicamente 1,3-propanodiol, com um título elevado e através de um único microorganismo, a partir de um substrato de carbono barato como a glucose ou outros açúcares. A produção biológica de 1,3-propanodiol requer glicerol como um substrato para uma reacção sequencial de dois passos na qual uma enzima desidratase (normalmente uma coenzima B12 - desidratase dependente) converte o glicerol num intermediário, o 3-hidroxipropionaldeído, que é depois reduzido a 1,3-propanodiol por uma oxidoredutase dependente 11 ΡΕ1204755 de NADH-(ou NADPH). A complexidade dos requerimentos do cofactor necessita da utilização de toda uma célula catalítica para um processo industrial que utiliza esta sequência de reacção para a produção de 1,3-propanodiol.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os investigadores resolveram o problema apresentado e a presente invenção proporciona a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável directamente para 1,3-propanodiol num título significativamente maior do que o obtido anteriormente e com a utilização de um único micro-organismo. A glucose é utilizada como um substrato modelo e a E. coli é utilizada como o hospedeiro modelo. A E. coli recombinante que expressa um grupo de genes (compreendendo genes que codificam uma actividade de desidratase, um factor de reactivação da desidratase, uma oxidoredutase de 1, 3-propanodiol (dhaT), glicerol-3-fosfato desidrogenase, e uma glicerol-3-fosfatase) converte a glucose em 1,3-propanodiol a um título que se aproxima do das fermentações do glicerol em 1,3-propanodiol.

Nesta invenção, a eliminação do gene funcional dhaT nesta E. coli recombinante resulta num título significativamente mais elevado de 1,3-propanodiol a partir da glucose. Este aumento inesperado no título resulta numa melhor economia, e assim, num processo melhorado para a produção de 1,3-propanodiol a partir da glucose. 12 ΡΕ1204755

Além disso, a presente invenção pode ser normalmente aplicada para incluir qualquer substrato de carbono que é rapidamente convertido em 1) glicerol, 2) di-hidroxi-acetona, 3) compostos de C3 no estado de oxidação do glicerol (por exemplo, glicerol-3-fosfato), ou 4) compostos de C3 no estado de oxidação da di-hidroxiacetona (por exemplo, di-hidroxiacetona fosfato ou gliceraldeido 3-fosfato) . A produção de 1,3-propanodiol na estirpe negativa para o dhaT requer uma actividade catalítica não específica que converta 3-HPA em 1,3-propanodiol. A identificação da(s) enzima(s) e/ou do(s) gene(s) responsável pela actividade catalítica não específica que converte 3-HPA em 1,3-propanodiol irá conduzir à produção de 1,3-propanodiol numa gama vasta de microorganismos hospedeiros com substratos de uma vasta gama de substratos contendo carbono. É também antecipado que a utilização desta actividade catalítica não específica que converte 3-HPA em 1,3-propanodiol irá conduzir a um processo melhorado para a produção de 1,3-propanodiol a partir de glicerol ou de di-hidroxiacetona, devido a um título melhorado e à melhoria económica resultante .

Esta actividade foi isolada a partir da E. coli como um fragmento de ácido nucleico que codifica uma actividade catalítica não específica para a conversão de 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol, como descrito na SEQ ID NO: 58 ou como seleccionado a partir do grupo constituído por: (a) um fragmento de ácido nucleico isolado que 13 ΡΕ1204755 codifica toda ou uma porção substancial da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57/ (b) um fragmento de ácido nucleico isolado que é substancialmente similar a um fragmento de ácido nucleico isolado que codifica toda ou uma porção substancial da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57; (c) um fragmento de ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo de pelo menos 387 aminoácidos contendo pelo menos 80% da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57; (d) um fragmento de ácido nucleico isolado que hibridiza com (a) sob condições de

hibridização de SSC 0,1X, SDS a 0,1%, 65 °C e lavado com SSC 2X, SDS a 0,1% seguido de SSC 0,1X, SDS a 0,1%; e (e) um fragmento de ácido nucleico isolado que é complementar a (a) , (b) , (c) , ou (d) .

Alternativamente a actividade catalítica não específica é incorporada no polipeptídeo como descrito na SEQ ID NO: 57.

Pode ser construído um gene quimérico contendo o fragmento de ácido nucleico isolado descrito acima operacionalmente ligado a sequências reguladoras adequadas. Este gene quimérico pode ser utilizado para transformar microorganismos seleccionados a partir do grupo constituído por Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, 14 ΡΕ1204755

Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyvero-myces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Salmonella, Bacillus, Aerobacter, Strepto-myces, Escherichia, e Pseudomonas. A E. coli é o hospedeiro preferido.

Por conseguinte, a presente invenção fornece um microorganismo recombinante, útil para a produção de 1,3-propanodiol contendo: (a) pelo menos um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase; (b) pelo menos um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol—3-fosfatase; (c) pelo menos um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da desidratase; (d) pelo menos um gene que codifica um factor da reactivação da desidratase; (e) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica suficiente para converter o 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol, em que não esteja presente nenhum gene dhaT funcional que codifique uma oxidoredutase de 1,3-propanodiol. Opcionalmente, o micro-organismo recombinante pode conter mutações (por exemplo, mutações por delecção ou mutações pontoais) nos genes endógenos seleccionados a partir do grupo constituído por: (a) um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol cinase; (b) um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol desidrogenase; e (c) um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da triosefosfato isomerase. 15 ΡΕ1204755

Noutra versão a invenção inclui um processo para a produção de 1,3-propanodiol contendo: (a) o contacto, sob condições adequadas, de uma E. coli recombinante contendo um regulão de dha e sem um gene dhaT funcional que codifica uma actividade da oxidoredutase de 1,3-propanodiol com pelo menos uma fonte de carbono, em que a fonte de carbono é seleccionada a partir do grupo constituído por monossa-carídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e substratos de carbono simples; e (b) recuperando opcionalmente o 1,3-propanodiol produzido em (a). A invenção fornece também um processo para a produção de 1,3-propanodiol a partir de um microorganismo recombinante compreendendo: (a) o contacto do microrganismo recombinante da presente invenção com pelo menos uma fonte de carbono seleccionada a partir do grupo constituído por monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e substratos de carbono simples onde o 1,3-propanodiol é produzido; e (b) recuperando opcionalmente o 1,3-propanodiol produzido em (a). A invenção pretende fornecer igualmente um processo para a produção de 1,3-propanodiol a partir de um microorganismo recombinante contendo: (a) o contacto de um microrganismo recombinante da presente invenção com pelo menos uma fonte de carbono, em que o referido microrganismo contém: (i) pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo uma actividade de desidratase; 16 ΡΕ1204755 (ii) pelo menos um gene que codifica um factor de reactivaçao da desi-dratase; (iii) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica suficiente para converter 3-hidroxipropionaldeído em 1.3- propanodiol; em que não esteja presente nenhum gene dhaT funcional que codifique uma oxidoredutase de 1.3- propanodiol; a referida fonte de carbono seleccionada a partir do grupo constituído por glicerol e di-hidroxiacetona, em que o 1,3-propanodiol é produzido e; (b) recuperando opcionalmente o 1,3-propanodiol produzido em (a).

Um outro aspecto da invenção contribui para a co-alimentação do substrato de carbono. Nesta versão para a produção de 1,3-propanodiol os passo são: o contacto de uma E. coli recombinante com uma primeira fonte de carbono e com uma segunda fonte de carbono, em que a referida E. coli recombinante contém: (i) pelo menos um gene endógeno que codifica um polipeptídeo contendo uma actividade de desi-dratase; (ii) pelo menos um gene endógeno que codifica um factor de reactivação da desidratase; (iii) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica suficiente para converter 3-hidroxipropional- 17 ΡΕ1204755 deído em 1,3-propanodiol, em que não esteja presente nenhum gene dhaT funcional que codifique uma actividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol na E. coli recombinante e em que a referida primeira fonte de carbono é seleccionada a partir do grupo constituído por glicerol e di-hidro-xiacetona, e em que a referida segunda fonte de carbono é seleccionada a partir do grupo constituído por monossaca-rídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e substratos de carbono simples, e (b) o 1,3-propanodiol produzido em (a) é opcionalmente recuperado. A co-alimentação pode ser sequencial ou simultânea. A E. coli recombinante utilizada numa versão de co-alimentação pode conter adicionalmente: (a) um conjunto de genes endógenos constituído por (i) pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase; (ii) pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol-3-fosfatase; e (iii) pelo menos um subconjunto de genes que codifica os produtos dos genes de dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaBl, dhaB2, dhaB3, e orfZ, e (b) um conjunto de genes endógenos, em que cada gene contém uma mutação que inactiva o gene, o conjunto é constituído por: (i) um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol cinase; (ii) um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol desidrogenase/ e (iii) um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da triosefosfato isomerase.

As estirpes de E. coli recombinante úteis incluem a estirpe de E. coli recombinante contendo: (a) um conjunto 18 ΡΕ1204755 de dois genes endógenos, em que cada gene inclui uma mutação que inactiva o gene, o conjunto consiste em: (i) um gene que codifica um polipeptídeo que contém uma actividade de glicerol cinase; e (ii) um gene que codifica um polipeptídeo contendo uma actividade de glicerol desidrogenase; (b) pelo menos um gene endógeno que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase; (c) pelo menos um gene endógeno que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol—3-fosfatase; e (d) um vector pKP32 contendo dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaBl, dhaB2, dhaB3 e orfZ como descrito na SEQ ID NO: 1.

Outras versões úteis incluem a E. coli recombi-nante compreendendo: (a) um conjunto de genes endógenos constituído por: (i) pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo uma actividade de desidratase; (ii) pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase; (iii) pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol—3-fosfatase; e (iv) pelo menos um gene que codifica um factor de reactivação da desidratase; e (b) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica para converter 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol; em que não esteja presente nenhum gene dhaT funcional que codifique uma actividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol na E. coli recombinante.

Outra versão é uma E. coli recombinante compre- 19 ΡΕ1204755 endendo: (a) um conjunto de genes endógenos constituído por (i) pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase; (ii) pelo menos um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol—3-fosfatase; e (iii) pelo menos um subconjunto de genes que codifica os produtos dos genes de dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaBl, dhaB2, dhaB3 e orfZ, e (b) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não especifica para converter 3-hidroxipropionaldeido em 1,3-propanodiol, em que não esteja presente nenhum gene dhaT funcional que codifique uma actividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol na E. coli recombinante. Esta versão inclui também um processo utilizando um E. coli recombinante contendo adicionalmente um conjunto de genes endógenos, em que cada gene contém uma mutação que inactiva o gene, e o conjunto é constituído por: (a) um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol cinase; (b) um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol desidrogenase; e (c) um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da triosefosfato isomerase.

Esta versão ainda inclui adicionalmente um processo para a bioprodução de 1,3-propanodiol compreendendo: (a) o contacto sob condições adequadas da E. coli recombinante imediatamente revelada com pelo menos uma fonte de carbono seleccionada a partir do grupo constituído por monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e substratos de carbono simples pelos quais o 1,3-propanodiol 20 ΡΕ1204755 é produzido; e (b) recuperando opcionalmente o 1,3-propano-diol produzido em (a). E inclui também um processo adicional para a bioprodução de 1,3-propanodiol consistindo em: (a) o contacto da E. coli recombinante das versões imediatamente reveladas que compreendem: (i) pelo menos um gene endógeno que codifica um polipeptideo contendo uma actividade de desidratase; (ii) pelo menos um gene endógeno que codifica um factor de reactivação da desidratase; (iii) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não especifica para a conversão de 3-hidroxipropionaldeido em 1,3-propanodiol, com pelo menos uma fonte de carbono seleccionada a partir do grupo constituído por glicerol e di-hidroxiacetona, e (b) recuperando opcionalmente o 1,3-propanodiol produzido em (a). BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS,

DESCRIÇÕES DAS SEQUÊNCIAS, E DEPÓSITOS BIOLÓGICOS A invenção pode ser melhor compreendida a partir da descrição detalhada seguinte, das Figuras, das descrições das sequências anexas, e dos depósitos biológicos que formam as partes desta aplicação. A Figura 1 apresenta a organização do gene dentro da sequência do regulão dha do subclone pHK28-26. A Figura 2 apresenta um gráfico da proteína 21 ΡΕ1204755 solúvel extracelular (g/L) comparada entre duas fermentações essencialmente como descritas no exemplo 7 utilizando um fornecimento constante de vitamina Bi2. Num dos casos, as linhas continuas, a estirpe utilizada foi a KLP23/pAH48/pKP32. N outro caso, linhas descontinuas, a estirpe utilizada foi a KLP23/pAH48/pDT29. A Figura 3 apresenta um gráfico da viabilidade das células [(células viáveis/mL)/OD550] comparada entre duas fermentações essencialmente como descritas no exemplo 7 utilizando um fornecimento constante de vitamina Bi2. Num dos casos (linhas continuas), a estirpe utilizada foi a KLP23/pAH48/pKP32. N outro caso (linhas descontinuas), a estirpe utilizada foi a KLP23/pAH48/pDT29. A Figura 4 apresenta um gráfico da produção do glicerol a partir da glucose comparada entre duas fermentações essencialmente como descritas no exemplo 7, mas na ausência da vitamina B12 ou da coenzima B12. Num dos casos (linhas contínuas), a estirpe utilizada foi a KLP23/pAH48/ pKP32. N outro caso (linhas descontínuas), a estirpe utilizada foi a KLP23/pAH48/pDT29. A Figura 5 é um diagrama de fluxo que ilustra a conversão metabólica de glucose em 1,3-propanodiol. A Figura 6 é uma membrana de blot 2D-PAGE com a fracção da proteína solúvel extraída a partir de uma banda que apresenta a actividade endógena da oxidoredutase de E. coli (actividade catalítica não específica) num gel nativo. 22 ΡΕ1204755 A descrição das 68 sequências e a listagem das sequências anexadas aqui estão de acordo com as regras que regem as descobertas de nucleótidos e/ou sequências de aminoácidos nas aplicações de patentes como descrito em 37 C.F.R. § 1,821-1,825 ("Requerimentos para Aplicações de Patentes Contendo Sequências de Nucleótidos e/ou Descobertas de Sequências de Aminoácidos - as Regras de Sequências") e estão de acordo com a Organização Mundial da Propriedade Intelectual (WIPO) Modelo ST2,5 (1998) e com os requerimentos da listagem de sequências EPO e PCT (Regra 5,2 e 49,5 (a-bis), e Secção 208 e o Anexo C das Instruções de Administração). As Descrições das Sequências contêm o código de uma letra para as sequências de nucleótidos e o código de três letras para os aminoácidos como definido em conformidade com as normas da IUPAC-IYUB descritas em Nucleic Acids Res. 13, 3021-3030 (1985) e no Biochemical Journal 219, 345-373 (1984). A SEQ ID NO: 1 contém a sequência de nucleótidos determinada a partir de um fragmento EcoRI-SalI de 12,1 kb de pKPl (cosmideo contendo DNA de Klebsiella pneumoniae), subclonado em pIBI31 (IBI Biosystem, New Haven, CT) , e denominada ρΗΚ28-2β. A Tabela 1 seguinte detalha os genes, os pares de bases correspondentes identificados dentro da SEQ ID NO: 1, e associados funcionalmente. Ver também o Exemplo 1. A SEQ ID NO: 57 contém a sequência de nucleótidos denominada por yqhD. 23 ΡΕ1204755

Os investigadores efectuaram os seguintes depósitos biológicos sob os acórdãos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes: A SEQ ID NO: 58 contém a sequência de aminoácidos denominada por YahD.

Referência de Identificação Designação Data do do Depositor Int'l do Depósito _Depositório 18 de Abril de 1995 E. coli DH5ot recombinante contendo ATCC 69789 uma porção do genoma de Klebsiella que codifica a enzima glicerol desidratase ATCC 69790 18 de Abril de 1995 E. coli DH5a recombinante contendo o cosmideo pKP4 contendo uma porção do genoma de Klebsiella que codifica uma enzima diol desidratase E. coli MSP33,6 ATCC 98598 25 de Novem bro de 1997

Mutante glpK de E. coli RJFIOm ATCC 98597 25 de Novem bro de 1997 O(s) depósito(s) será(ão) mantido(s) no depositório internacional indicado durante pelo menos 30 anos e estarão disponíveis ao público após a concessão de uma 24 ΡΕ1204755 patente descoberta. A disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção em detrimento dos direitos da patente garantidos por acção governamental .

Quando utilizado aqui, "ATCC" refere-se à Colecção de Cultura de Tipo Americana, depositório internacional localizado no 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110-2209 U.S.A. O "N.° ATCC" é o número de acesso para culturas depositadas no ATCC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece um processo melhorado para a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável directamente para 1,3-propanodiol utilizando um único microorganismo. O método é caracterizado por melhoramento do título, rendimento, e viabilidade da célula bem como um decréscimo na lise da célula durante a fermentação. A presente invenção é baseada, em parte, na observação de que os processos de fermentação do 1,3-propanodiol contendo a oxidoredutase de 1,3-propanodiol (dhaT) são caracterizados por níveis elevados de 3HPA e outros aldeídos e cetonas no meio, o qual é correlacionado com um decréscimo na viabilidade da célula. A presente invenção é também baseada, em parte, na descoberta inesperada de que o modelo hospedeiro, E. coli, é capaz de converter 3-HPA em 1,3-propanodiol através de uma acti- 25 ΡΕ1204755 vidade catalítica endógena não específica capaz de converter 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol. A presente invenção é baseada também, em parte, na descoberta inesperada de que um processo de fermentação de E. coli compreendendo esta actividade catalítica não específica e sem um dhaT funcional resulta no aumento da viabilidade da célula durante a fermentação e fornece títulos e/ou rendimentos mais elevados de 1,3-propanodiol do que um processo de fermentação contendo um dhaT funcional.

Num aspecto, o glicerol é um substrato modelo, o microorganismo hospedeiro possui uma mutação no dhaT de estirpe selvagem tal que não exista actividade da oxidoredutase de 1,3-propanodiol e compreende uma actividade catalítica não específica para converter 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol. Noutro aspecto, a glucose é um substrato modelo e a E. coli recombinante é um modelo hospedeiro. Neste aspecto, a E. coli contém uma actividade catalítica endógena não específica suficiente para converter 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol. Numa versão, a actividade catalítica não específica é uma álcool desidrogenase.

Num aspecto a presente invenção fornece uma E. coli recombinante que expressa um grupo de genes que compreende (a) pelo menos um gene que codifica um poli-peptídeo contendo a actividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase; (b) pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol—3-fosfatase; 26 ΡΕ1204755 (c) pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo uma actividade de desidratase; (d) pelo menos um gene que codifica um factor de reactivação da desidratase; (e) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não especifica suficiente para converter 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol, em que pelo menos um gene endógeno compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de pelo menos 387 aminoácidos contendo pelo menos 80% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57, em que não esteja presente nenhum gene dhaT funcional que codifique uma actividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol na E. coli recombinante. A eliminação do gene dhaT funcional nesta E. coli recombinante fornece inesperadamente um título mais elevado de 1,3-propanodiol a partir da glucose do que o anteriormente alcançado.

Noutro aspecto da presente invenção é alcançado um processo melhorado para a produção de 1,3-propanodiol a partir de glucose utilizando uma E. coli recombinante contendo genes que codificam uma G3PDH, uma fosfatase G3P, uma desidratase, e um factor de reactivação da desidratase comparado com um processo utilizando uma E. coli recombinante contendo genes que codificam uma G3PDH, uma fosfatase G3P, uma desidratase, um factor de reactivação da desidratase, e também um dhaT funcional. O processo drasticamente melhorado confia num gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica, a qual se espera ser uma álcool desidrogenase, que está presente em E. coli. 27 ΡΕ1204755 O drástico melhoramento no processo é evidente como um aumento no titulo de 1,3-propanodiol como demonstrado nos Exemplos 7 e 9. 0 melhoramento no processo é também evidente como um decréscimo na lise da célula como determinado pela concentração da proteina solúvel extracelular no meio de fermentação. Este aspecto da invenção está ilustrado na Figura 2. Adicionalmente, o melhoramento no processo é evidente como o prolongamento da viabilidade da célula sobre o curso da fermentação. Este aspecto da invenção está ilustrado na Figura 3. Além disso, o melhoramento no processo é também evidente como um aumento na produção. Na E. coli que expressa uma oxidoredutase de 1,3-propanodiol (dhaT) (por exemplo, a E. coli KLP23 transformada com o plasmideo pDT29), o glicerol pode ser metabolizado num produto diferente do 3-HPA. Em contraste directo, na E. coli que não expressa uma oxidoredutase de 1,3-propanodiol (dhaT) (por exemplo, a E. coli KLP23 transformada com o plasmideo pDT32), o glicerol não é metabolizado num produto diferente do 3-HPA. Esta via críptica atribuída à presença ou ausência de um dhaT funcional é demonstrada pela baixa produção de glicerol a partir de glucose como ilustrado na Figura 4.

Quando utilizados aqui os seguintes termos podem ser utilizados para interpretação das reivindicações e para especificações.

Os termos "glicerol-3-fosfato desidrogenase" e 28 ΡΕ1204755 "G3PDH" referem-se a um polipeptídeo responsável por uma actividade enzimática e catalisam a conversão da di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) em glicerol-3-fosfato (G3P). A G3PDH in vivo pode estar dependente de NADH; NADPH; ou de FAD. Quando se referem especificamente a um cofactor específico da glicerol-3-fosfato desidrogenase, serão utilizados os termos "glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NADH", "glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NADPH" e "glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de FAD" Como é geralmente o caso o glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NADH e dependente de NADPH é capaz de utilizar alternadamente NADH e NADPH (por exemplo através do gene codificado pelo gpsA), os termos glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NADH e dependente de NADPH irão ser utilizados alternadamente. A enzima dependente de NADH (EC 1.1.1.8) é codificada, por exemplo, por diversos genes incluindo o GPD1 (GenBank Z74071x2), ou GPD2 (GenBank Z35169xl), ou GPD3 (GenBank G984182), ou DAR1 (GenBank Z74071x2). A enzima dependente de NADPH (EC 1.1.1.94) é codificada, pelo gpsA (GenBank U321643, (cds 197911-196892) G466746 e L45246). A enzima dependente de FAD (EC 1.1.99.5) é codificada pelo GUT2 (GenBank Z47047x23), ou pelo glpD (GenBank G417838), ou pelo glpABC (GenBank M20938) (ver WO 9928480 e referências e respectivas referências).

Os termos "glicerol—3-fosfatase", "sn-glicerol—3-fosfatase", ou "d,1-glicerol fosfatase", e "G3P fosfatase" referem-se a um polipeptídeo responsável por uma actividade 29 ΡΕ1204755 enzimática que catalisa a conversão de glicerol-3-fosfato e água em glicerol e fosfato inorgânico. A G3P fosfatase é codificada, por exemplo, por GPP1 (GenBank Z47047xl25), ou por GPP2 (GenBank U18813xll) (ver WO 9928480 e referências e respectivas referências). O termo "glicerol cinase" refere-se a um polipeptideo responsável por uma actividade enzimática que catalisa a conversão do glicerol e ATP em glicerol-3-fosfato e ADP. O dador de fosfato de energia elevada ATP pode ser substituído por substitutos fisiológicos (por exemplo, fosfoenolpiruvato) . A glicerol cinase é codificada, por exemplo, por GUT1 (GenBank U11583xl9) e glpK (GenBank L19201) (ver WO 9928480 e referências e respectivas referências). O termo "glicerol desidrogenase" refere-se a um polipeptideo responsável por uma actividade enzimática que catalisa a conversão de glicerol em di-hidroxiacetona (E.C. 1.1.1.6) ou de glicerol em gliceraldeído (E.C. 1.1.1.72). Um polipeptideo responsável por uma actividade enzimática que catalisa a conversão de glicerol em di-hidroxiacetona é também referido como uma "di-hidroxiacetona redutase". A glicerol desidrogenase pode ser dependente de NADH (E.C. 1.1.1.6) , de NADPH (E.C. 1.1.1.72), ou de outros cofactores (por exemplo, E.C. 1.1.92.22). Uma glicerol desidrogenase dependente de NADH é codificada, por exemplo, por gldA (GenBank U00006) (ver WO 9928480 e referências e respectivas referências). 30 ΡΕ1204755 O termo "enzima desidratase" ou "desidratase" irá referir-se a qualquer actividade enzimática que catalise a conversão de uma molécula de glicerol no produto 3-hidroxipropionaldeído. Para o propósito da presente invenção as enzimas desidratases incluem uma glicerol desidratase (E.C. 4.2.1.30) e uma diol desidratase (E.C. 4.2.1.28) possuindo substratos preferidos de glicerol e 1,2-propanodiol, respectivamente. Os genes para as enzimas desidratases foram identificados em Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Clostridium pasteurianum, Salmonella typhimurium, e Klebsiella oxytoca. Nestes casos a desidratase é composta por três subunidades: a maior ou subunidade "a", a média ou subunidade "β", e a menor ou subunidade "γ". Devido à grande variação na nomenclatura dos genes utilizados na literatura, é fornecida uma carta comparativa na Tabela 1 para facilitar a identificação. O genes são também descritos em, por exemplo, Daniel et al. (FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999)) e Toraya e Mori (J. Biol. Chem. 274,3312 (1999)). Com referência à Tabela 1, os genes que codificam a subunidade maior ou "a" da glicerol desidratase incluem o dhaBl, gldA e dhaB; os genes que codificam a subunidade média ou "β" incluem o dhaB2, o gldB, e o dhaC; os genes que codificam a subunidade menor ou "γ" incluem o dhaB3, o gldC, e o dhaE. Também com referência à Tabela 1, os genes que codificam a subunidade maior ou "a" da diol desidratase incluem o pduC e o pddA; os genes que codificam a subunidade média ou "β" incluem o pduD e o pddB; os genes que codificam a subunidade menor ou "γ" incluem o pduE e o pddC. 31 ΡΕ1204755

Tabela 1: Quadro comparativo do nome do genes e das referências do GenBank para a desidratase e funções ligadas à desidratase FUNÇÃO DO GENE: reguladora desconhecida reactivação Gene pares de qene pares de qene pares de bases bases bases ORGANISMO (Referência no GenBank) K. pneumoniae (SEQ ID NO: 1) dhaR 2209- 4134 orfW 4112- 4641 orfX 4643- 4996 K. pneumoniae (U30903) orf2c 7116- 7646 orf2b 6762- 7115 K. pneumoniae (U60992) gdrB C. freundii (U09771) dhaR 3746- 5671 orfW 5649- 6179 orfX 6180- 6533 C. pasteurianum (AF051373) C. pasteurianum (AF006034) orfW 210-731 orfX 1-196 S. typhimurium (AF026270) pduH 8274- 8645 K. oxytoca (AF017781) ddrB 2063- 2440 K. oxytoca (AF051373) 32 ΡΕ1204755

Tabela 1 (continuação? FUNÇÃO DO GENE; 1,3-PD desidrogenase desconhecida desidratase, α Gene pares de qene pares de qene pares de bases bases bases ORGANISMO (Referência no GenBank) K. pneumoniae (SEQ ID NO: 1) dhaT 5017-6108 orfY 6202- 6630 dhaBl 7044- 8711 K. pneumoniae (U30903) dhaT 5578-6741 orf2a 5125- 5556 dhaBl 3047- 4714 K. pneumoniae (U60992) gldA 121-1788 C. freundii (U09771) dhaT 6550-7713 orfY 7736- 8164 dhaB 8856- 10223 C. pasteurianum (AF051373) dhaB 84-1748 C. pasteurianum (AF006034) dhaT 1232-2389 orfY 746-1177 S. typhimurium (AF026270) pduC 3557- 5221 K. oxytoca (AF0177 81) K. oxytoca (AF051373) pddA 121-1785 33 ΡΕ1204755

Tabela 1 (continuação? FUNÇÃO DO GENE; desidratase, β desidratase, γ reactivação Gene pares de qene pares de qene pares de bases bases bases ORGANISMO (Referência no GenBank) K. pneumoniae (SEQ ID NO: 1) dhaB2 8724-9308 dhaB3 9311-9736 orfZ 9749- 11572 K. pneumoniae (U30903) dhaB2 2450-2890 dhaB3 2022-2447 dhaB4 186-2009 K. pneumoniae (U60992) gldB 1801-2385 gldC 2388-2813 gdrA C. freundii (U09771) dhaC 10235- 10819 dhaE 10822- 11250 orfZ 11261- 13072 C. pasteurianum (AF051373) dhaC 1779-2318 dhaE 2333-2773 orfZ 2790- 4598 C. pasteurianum (AF006034) S. typhimurium (AF026270) pduD 5232-5906 pduE 5921-6442 pduG 6452- 8284 K. oxytoca (AF017781) ddrA 241-2073 K. oxytoca (AF051373) pddB 1796-2470 pddC 2485-3006

As glicerol e diol desidratases são sujeitas a inactivação do mecanismo base do suicídio através do gli- 34 ΡΕ1204755

cerol e de outros substratos (Daniel et al., FEMS

Microbiol. Rev. 22, 553 (1999)). O termo "factor de reactivação da desidratase" refere-se àquelas proteínas responsáveis pela reactivação da actividade da desidratase. Os termos "actividade de reactivação da desidratase", "reactivação da actividade da desidratase" ou "regeneração da actividade da desidratase" referem-se ao fenómeno da conversão de uma desidratase incapaz da catálise de um substrato para uma capaz da catálise de um substrato ou ao fenómeno de inibir a inactivação de uma desidratase ou ao fenómeno de prolongar a meia vida útil da enzima desidratase in vivo. Foram identificadas duas proteínas como estando envolvidas como o factor de reactivação da desidratase (ver WO 9821341 (US 6013494)) e respectivas referências; Daniel et al., supra; Toraya e Mori, J. Biol. Chem. 274, 33122 (1999); e Tobimatsu et al., J. Bacteriol. 181, 4110 (1999)). Com referência à Tabela 1, os genes que codificam uma das proteínas incluem orfZ, dhaB4, gdrA, pduG e ddrA. Também com referência à Tabela 1, os genes que codificam a segunda das duas proteínas incluem orfX, orf2b, gdrB, pduH e ddrB.

Os termos "oxidoredutase de 1,3-propanodiol", "desidrogenase de 1,3-propanodiol" ou "DhaT" referem-se ao(s) polipeptídeo(s) responsável(eis) por uma actividade enzimática que é capaz de catalisar a interconversão de 3-HPA e 1,3-propanodiol desde que o(s) gene(s) que codifica (m) tal actividade esteja(m) fisicamente ou transcri-cionalmente ligado(s) a uma enzima desidratase no seu 35 ΡΕ1204755 estado natural (isto é, tipo selvagem): por exemplo, o gene encontra-se dentro do regulão dha como é caso do dhaT de Klebsiella pneumoniae. Com referência à Tabela 1, os genes que codificam uma oxidoredutase de 1,3-propanodiol incluem o dhaT de Klebsiella pneumoniae, de Citrobacter freundii, e de Clostridium pasteurianum. Cada um destes genes codificam um polipeptideo pertencente à familia das álcool desi-drogenases de tipo III, apresentam um motivo de ligação ao ferro conservado, e têm uma preferência para a ligação NAD+/NADH na interconversão de 3-HPA e 1,3-propanodiol (Johnson and Lin, J. Bacteriol. 169, 2050 (1987); Daniel et al., J. Bacteriol. 177, 2151 (1995); e Leurs et al., FEMS Microbiol. Lett. 154, 337 (1997)). As enzimas com propriedades físicas similares foram isoladas a partir do Lactobaclllus brevis e do Lactobacillus buchneri (Veiga da Dunha and Foster, Appl. Environ. Microbiol. 58, 2005 (1992)) . O termo "regulão dha" refere-se a um conjunto de genes associados ou a janelas de leitura abertas que codificam várias actividades biológicas, incluindo mas não limitadas a uma actividade de desidratase, uma actividade de reactivação, e a uma oxidoredutase de 1,3-propanodiol. Normalmente um regulão dha contém as janelas de leitura abertas dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW, dhaBl, dhaB2, dhaB3, e orfZ como descrito aqui. O termo "actividade catalítica não específica" refere-se ao(s) polipeptideo(s) responsável(eis) por uma 36 ΡΕ1204755 actividade enzimática que é suficiente para catalisar a interconversão de 3-HPA e 1,3-propanodiol e exclui especi-ficamente a(s) oxidoredutase(s) de 1,3-propanodiol. Normalmente estas enzimas são álcool desidrogenases. Tais enzimas podem utilizar cofactores em vez de NAD+/NADH, incluindo mas não limitados a flavinas tais como FAD ou FMN. Descobriu-se que o(s) gene(s) para uma(s) álcool desidro-genase(s) não especifica (s) era(m), por exemplo, codificado (s) endogenamente e expressava (m)-se funcionalmente dentro do microorganismo E. coli KLP23.

Os termos "função" ou "função enzimática" referem-se à actividade catalítica de uma enzima para alterar a energia necessária para efectuar uma reacção química específica. Entenda-se que tal actividade pode ser aplicada a uma reacção em equilíbrio onde a produção quer do produto ou do substrato pode ser alcançada sob condições adequadas.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados alternadamente.

Os termos "substrato de carbono" e "fonte de carbono" refere-se a uma fonte de carbono capaz de ser metabolizada pelos microorganismos hospedeiros da presente invenção e particularmente fontes de carbono seleccionadas a partir do grupo constituído por monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e substratos de um carbono ou misturas daí resultantes. 37 ΡΕ1204755

Os termos "célula hospedeira" ou "microorganismo hospedeiro" referem-se a um microorganismo capaz de receber genes estranhos ou heterólogos e de expressar esses genes para produzir um produto de gene activo.

Os termos "gene estranho", "DNA estranho", "gene heterólogo" e "DNA heterólogo" referem-se ao material genético nativo de um organismo que foi colocado num microorganismo hospedeiro através de várias formas. 0 gene de interesse pode ser um gene que ocorre naturalmente, um gene mutado, ou um gene sintético.

Os termos "transformação" e "transfecção" referem-se à aquisição de novos genes numa célula após a incorporação de ácido nucleico. Os genes adquiridos podem estar integrados no DNA cromossomal ou introduzidos como sequências de replicação extracromossomais. O termo "transformante" refere-se ao produto de uma transformação. O termo "geneticamente modificado" refere-se ao processo de modificar o material hereditário por transformação ou mutação.

Os termos "microorganismo recombinante" e "hospedeiro transformado" referem-se a qualquer microorganismo que tenha sido transformado por genes heterólogos ou estranhos ou cópias extra de genes homólogos. Os micro-organismos recombinantes da presente invenção expressam genes estranhos que codificam a glicerol-3-fosfato desidro- 38 ΡΕ1204755 genase (GPD1), a glicerol—3-fosfatase (GPP2), a glicerol desidratase (dhaBl, dhaB2 e dhaB3) e factor de reactivação da desidratase (orfZ e orfX) para a produção de 1,3-propa-nodiol a partir de substratos de carbono adequados. A E. coli transformada com estes genes não possui um dhaT funcional. Um microorganismo hospedeiro, diferente da E. coli, pode também ser transformado para conter os genes revelados e o gene da actividade catalítica não específica para a in-terconversão de 3-HPA e 1,3-propanodiol, excluindo especi-ficamente a(s) oxidoredutase(s) de 1,3-propanodiol (dhaT). "Gene" refere-se a um fragmente de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo as sequências reguladoras que precedem (5' não codificantes) e que sucedem (3' não codificantes) a região codificante. O termo "nativo" e "tipo selvagem" referem-se a um gene tal como se encontra na natureza com as suas próprias sequências reguladoras.

Os termos "que codifica" e "codificante" referem-se ao processo pelo qual um gene, através dos mecanismos de transcrição e tradução, produz uma sequência de amino-ácidos. Entenda-se que o processo de codificar um sequência de aminoácidos específica inclui sequências de DNA que podem envolver mudanças de base que não causam uma mudança nos aminoácidos codificados, ou que envolvem mudanças de base que podem alterar um ou mais aminoácidos, mas que não afectam as propriedades funcionais da proteína codificada pela sequência de DNA. Entenda-se por isso que a invenção 39 ΡΕ1204755 englobe mais do que as sequências exemplarmente especificadas . 0 termo "isolada" refere-se a uma proteina ou sequência de DNA que é removida de pelo menos um componente com o qual está naturalmente associada.

Uma "molécula de aminoácido isolada" é um polímero de RNA ou de DNA que é de cadeia simples ou dupla, contendo opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Uma molécula de ácido nucleico isolada na forma de um polímero de DNA pode ser composta por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genómico ou DNA sintético. "Substancialmente similar" refere-se a moléculas de ácido nucleico em que as alterações numa ou em mais bases nucleotídicas resultam na substituição de um ou mais aminoácidos, mas não afectam as propriedades funcionais da proteína codificada pela sequência de DNA. "Substancialmente similar" refere-se também a moléculas de ácido nucleico em que as alterações numa ou em mais bases nucleotídicas não afectam a capacidade da molécula de ácido nucleico de mediar a alteração da expressão do gene por tecnologia anti-sentido ou por co-supressão. "Substancialmente similar" refere-se também a modificações das moléculas de ácido nucleico da presente invenção (tais como delecção ou inserção de uma ou mais bases nucleotídicas) que não afectam substancialmente as propriedades funcionais 40 ΡΕ1204755 do transcrito resultante relativamente à capacidade de mediar a alteração da expressão do gene por tecnologia anti-sentido ou por co-supressão ou a alteração das propriedades funcionais da molécula da proteína resultante. A invenção engloba mais do que as sequência exemplarmente especificadas.

Por exemplo, é do conhecimento na técnica que são comuns alterações num gene que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente num dado sítio, mas que não afectam as propriedades funcionais da proteína codificada. Com o propósito da presente invenção as substituições são definidas como trocas dentro de um dos seguintes cinco grupos: 1. Alifático pequeno, resíduos não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Tre (Pro, Gli) ; 2. Polar, resíduos carregados negativamente e suas amidas: Asp, Ans, Glu, Gin; 3. Polar, resíduos carregados positivamente: His, Arg, Lis; 4. Alifático grande, resíduos não polares: Met, Leu, Ile, Vai (Cis); e 5. Resíduos aromáticos grandes: Fen, Tir, Trp.

Assim, um codão para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um codão que codifica outro resíduo menos hidrofóbico (tal como a 41 ΡΕ1204755 glicina) ou um resíduo mais hidrofóbico (tal como a valina, a leucina, ou a isoleucina). Igualmente, pode também esperar-se que alterações que resultam na substituição de um resíduo carregado negativamente por outro (tal como o ácido aspártico pelo ácido glutâmico) ou um resíduo carregado positivamente por outro (tal como a lisina pela arginina) produzam um produto funcionalmente equivalente,

Em muitos casos, pode também não ser esperado que trocas nucleotídicas que resultam na alteração das porções N-terminal e C-terminal da molécula da proteína alterem a actividade da proteína.

Cada uma das modificações propostas está bem dentro da rotina dos peritos na técnica, como a sua determinação da retenção da actividade biológica dos produtos codificados. Além disso, o perito na técnica reconhece que as sequências substancialmente similares englobadas por esta invenção são também definidas pela sua capacidade de hibridizar, sob condições estringentes (SSC 0,1X, SDS a 0,1%, 65 °C e lavado com SSC 2X, SDS a 0,1% seguido de SSC 0,1X, SDS a 0,1%), com as sequências aqui exemplificadas. Os fragmentos de ácido nucleico substancialmente similares preferenciais da presente invenção são aqueles fragmentos de ácido nucleico cujas sequências de DNA são pelo menos 80% idênticas ás sequências de DNA dos fragmentos de ácido nucleico aqui apresentados. Os fragmentos de ácido nucleico mais preferenciais são pelo menos 90% idênticos à sequência de 42 ΡΕ1204755 DNA dos fragmentos de ácido nucleico aqui apresentados. Ainda mais preferenciais são os fragmentos de ácido nucleico que são pelo menos 95% idênticos à sequência de DNA dos fragmentos de ácido nucleico aqui apresentados.

Um fragmento de ácido nucleico é "hibridizável" com outro fragmento de ácido nucleico, tal como um cDNA, um DNA genómico, ou um RNA, quando uma forma de cadeia simples do fragmento de ácido nucleico pode emparelhar com o outro fragmento de ácido nucleico sob as condições apropriadas de temperatura e de força iónica da solução. A hibridização e as condições de lavagem são bem conhecidas e estão exemplificadas no Sambrook, J. Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente no Capitulo 11 e na Tabela 11,1 lá incluídos (aqui incorporados na totalidade para referência). As condições de temperatura e da força iónica determinam a "estringência" da hibridização. Para o rastreio preliminar de ácidos nucleicos homólogos, podem ser utilizadas condições de hibridização de baixa estringência, correspondendo a uma Tm de 55 °C, por exemplo, SSC 5X, SDS a 0,1%, leite a 0, 25 %, e sem formamida, ou formamida a 30%, SSC 5X, SDS a 0,5%. As condições de hibridização de estringência moderada correspondem a uma Tm mais elevada, por exemplo, formamida a 40%, com SSC 5X ou 6X. A hibridização requer que os dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, apesar de dependerem da estringência da hibridização, os 43 ΡΕ1204755 desemparelhamentos entre as bases são possíveis. A estringência apropriada para hibridizar ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou de homologia entre duas sequências de nucleótidos, maior o valor de Tm para os híbridos de ácidos nucleicos que possuem essas sequências. A relativa estabilidade (correspondendo a uma Tm elevada) da hibridização do ácido nucleico decresce pela seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos maiores do que 100 nucleótidos de comprimento, derivaram equações para calcular a Tm (ver Sambrook et al., supra, 9,50-9,51). Para a hibridização com ácidos nucleicos mais curtos, isto é, de oligonucleótidos, a posição dos desemparelhamentos torna-se mais importante, e o comprimento do oligonucleótido determina a sua especificidade (ver Sambrook et al., supra, 11,7-11,8).

Numa versão o comprimento para um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 10 nucleótidos. Preferencialmente um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 15 nucleótidos; mais preferencialmente de cerca de 20 nucleótidos; e ainda mais preferencialmente o comprimento é de cerca de 30 nucleótidos. Além disso, o perito irá reconhecer que a temperatura e a concentração de sal na solução de lavagem podem ser ajustadas se necessário de acordo com os factores tais como o comprimento da sonda. 44 ΡΕ1204755

Uma "porção substancial" refere-se a um aminoácido ou a uma sequência de nucleótidos que compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo ou a sequência de nucleótidos de um gene suficientes para proporcionar a identificação putativa desse polipeptídeo ou gene, quer por avaliação manual da sequência por um perito na técnica, ou por comparação e identificação automática de sequências computadorizada utilizando algoritmos tais como o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1993); ver também www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Em geral, uma sequência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou trinta ou mais nucleótidos é necessária por forma a identificar putativamente um polipeptídeo ou sequência de ácido nucleico que sejam homólogas a uma proteína ou a um gene conhecidos. Além disso, no que diz respeito ás sequências de nucleótidos, podem ser utilizadas sondas oligonucleótidas específicas de gene contendo 20-30 nucleótidos contíguos em métodos dependentes de sequências para identificação (por exemplo, hibridização por Southern) e isolamento (por exemplo, hibridização in situ de colónias bacterianas ou de placas bacteriofágicas) de genes. Adicionalmente, pequenos oligonucleótidos de 12-15 bases podem ser utilizados como os iniciadores de amplificação em PCR por forma a obter um molécula de ácido nucleico particular compreendendo os iniciadores. Deste modo, uma "porção substancial" de uma sequência de nucleótidos compreende a sequência suficiente para proporcionar a identificação específica e/ou o isolamento de uma molécula de ácido nucleico que compreenda a sequência. Esta especi- 45 ΡΕ1204755 ficação mostra os aminoácidos e as sequências de nucleó-tidos parciais ou completos que codificam uma ou mais proteínas específicas. 0 perito, possuindo o benefício das sequências aqui reportadas, pode agora utilizar todas ou uma porção substancial das sequências reveladas para o propósito conhecido por aqueles peritos na técnica. Assim, a presente invenção contém a totalidade das sequências como descrito na Listagem de Sequências anexa, bem como porções substanciais dessas sequências como definido acima. O termo "complementar" descreve a relação entre bases nucleotídicas que são capazes de hibridizar umas com as outras. Por exemplo, no que diz respeito ao DNA, a ade-nosina é complementar a timina e a citosina é complementar à guanina. Assim, a presente invenção inclui também moléculas de ácido nucleico isoladas que são complementares à totalidade das sequências como é descrito na Listagem de Sequências anexa bem como ás sequências de ácido nucleico substancialmente similares. O termo "percentagem de identidade", como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de poli-nucleótidos, como determinado por comparação de sequências. Na técnica, "identificar" significa também o grau de relação das sequências entre as sequências de polipeptídeos ou de polinucleótidos, como pode ser o caso, como determinado pelo emparelhamento entre a estrutura de tais sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser imedia- 46 ΡΕ1204755 tamente calculadas por métodos conhecidos, incluindo mas não limitados a estes descritos em Computational Molecular Biology; Lesk, A. M., Ed.; Oxford University Press: New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects; Smith, D. W., Ed. Academic Press: New York, 1993; Computer Analysis of Seguence Data, Part I; Griffin, A. M. and Griffin, H. G., Eds.; Humana Press: New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology; von Heinje, G., Ed.; Academic Press: New York, 1997; and Sequence Analysis Primer; Gribskov, M. and Devereux, J. Eds.; Stockton Press: New York, 1991. Os métodos preferidos para determinar a identidade são efectuados de modo a obter o maior emparelhamento entre as sequências testadas.

Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computadores disponíveis ao público. Os métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade e a similaridade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados a, ao programa GCG Pileup que se encontra no pacote de programas GCG, utilizando o algoritmo Needleman e Wunsch com os seus valores Standard implícitos de penalidade para a inserção de um gap = 12 e penalidade para a extensão de um gap = 4 (Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984)), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444-2448 (1988)). 0 programa BLASTX está disponível ao público a partir do NCBI e de outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al., Natl.

Cent. Biotechnol. Inf., Natl. Library Med. (NCBI NLM) NIH, 47 ΡΕ1204755

Bethesda, Md. 20894/ Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein data base search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). Outro método preferido para determinar a percentagem e identidade, é pelo método do protocolo do alinhamento de proteínas DNASTAR utilizando o algoritmo Jotun-Hein (Hein et al. , Methods Enzymol. 183: 626-645 (1990)). Os parâmetros implícitos para o método de Jotun-Hein para os alinhamentos são: para alinhamentos múltiplos, a penalidade de um gap = 11, a penalidade para o comprimento de um gap = 3; para os alinhamentos entre pares de sequências ktuple = 6. Como uma ilustração, por um polinucleótido contendo uma sequência de nucleótidos contendo pelo menos, por exemplo, 95% de "identidade" com uma sequência de nucleótidos de referência é entendido que a sequência de nucleótidos do polinucleótido é idêntica à sequência de referência excepto que a sequência do polinucleótido pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência de nucleótidos de referência. Por outras palavras, para obter um polinucleótido contendo uma sequência de nucleótidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleótidos de referência, até 5% dos nucleótidos na sequência de referência podem ser delectados ou substituídos por outros nucleótidos, ou um número de nucleótidos até 5% do total de nucleótidos na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições 5' ou 3' terminais da sequência de nucleótidos de referência ou em qualquer local entre essas posições terminais, intercaladas quer indivi- 48 ΡΕ1204755 dualmente entre nucleótidos na sequência de referência ou num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Analogamente, por um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos contendo pelo menos, por exemplo, 95% de "identidade" com uma sequência de aminoácidos de referência é entendido que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é idêntica à sequência de referência excepto que a sequência do polipeptídeo pode incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos do aminoácido de referência. Por outras palavras, para obter um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de referência, até 5% dos resíduos de aminoácidos na sequência de referência podem ser delectados ou substituídos por outros aminoácidos, ou um número de aminoácidos até 5% do total de resíduos de aminoácidos na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais amino- ou carboxilo da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer local entre essas posições terminais, intercaladas quer individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. O termo "homólogo" refere-se a uma proteína ou a um polipeptídeo nativo ou que ocorre na natureza numa dada célula hospedeira. A invenção inclui microorganismos que produzem proteínas homologas via tecnologia do DNA recombinante. 49 ΡΕ1204755 O termo "percentagem de homologia" refere-se à extensão da sequência de aminoácidos idêntica entre os polipeptídeos. Quando uma primeira sequência de aminoácidos é idêntica a uma segunda sequência de aminoácidos, então a primeira e segunda sequências de aminoácidos exibem 100% de homologia. A homologia entre quaisquer dois polipeptídeos é uma função directa do número total de aminoácidos emparelhados numa dada posição em qualquer sequência, por exemplo, se metade do número total de aminoácidos em qualquer uma das duas sequências for o mesmo então diz-se que as duas sequências exibem 50% de homologia. "Degenerescência dos codões" refere-se à divergência no código genético que permite a variação da sequência de nucleótidos sem consequência na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. Assim, A presente invenção utiliza preferencialmente qualquer molécula de ácido nucleico que codifique toda ou uma porção substancial da sequência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 57. O perito está bem ciente do "codão-tendência" exibido por uma célula hospedeira específica em utilização de codões de nucleótidos para especificar um dado aminoácido. Então, quando se sintetiza um gene para melhorar a expressão numa célula hospedeira, é desejável projectar o gene tal que a sua frequência de utilização de codão se aproxime da frequência da utilização de codão preferido da célula hospedeira. São também contempladas as modificações na 50 ΡΕ1204755 sequência, tais como delecções, inserções, ou substituições na sequência que produzam alterações silenciosas que não afectem substancialmente as propriedades funcionais da molécula da proteína resultante. Por exemplo, são contempladas as alterações na sequência do gene que reflectem a degenerescência do código genético, ou que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente num dado sitio. Assim, um codão para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico pode ser substituído por um codão que codifica outro resíduo menos hidrofóbico, tal como a glicina, ou um resíduo mais hidrofóbico, tal como a valina, a leucina, ou a isoleucina. Similarmente, alterações que resultam na substituição de um resíduo carregado negativamente por outro, tal como o ácido aspártico pelo ácido glutâmico ou um resíduo carregado positivamente por outro, tal como a lisina pela arginina, podem também esperar-se que produzam um produto biologicamente equivalente. As alterações de nucleótidos que resultam na alteração das porções N-terminal e C-terminal da molécula da proteína podem também não ser esperadas que alterem a actividade da proteína. Nalguns casos, pode de facto ser desejável produzir mutantes da sequência por forma a estudar o efeito da alteração na actividade biológica da proteína. Cada uma das modificações propostas está bem dentro da rotina dos peritos na técnica, bem como a sua determinação de retenção da actividade biológica nos produtos codificados. Além disso, o perito reconhece que essas sequências englobadas por esta invenção são também definidas pela sua capacidade de hibridizar, sob 51 ΡΕ1204755 condições estringentes (SSC 0,1X, SDS a 0,1%, 65° C) , com as sequências aqui exemplificadas. O termo "expressão" refere-se à transcrição e tradução do produto do gene a partir da codificação de um gene para a sequência do produto do gene. O termo "plasmideo", "vector", e "cassete" referem-se a um elemento extra cromossomal que transporta muitas vezes genes que não fazem parte do metabolismo central da célula, e normalmente sob a forma de moléculas de DNA circular em cadeia dupla. Tais elementos podem ser sequências de replicação autónomas, sequências de integração no genoma, fagos ou sequências de nucleótidos, lineares ou circulares, de DNA ou RNA de cadeia simples ou dupla, derivados de qualquer fonte, nos quais um número de sequências de nucleótidos foi adicionada ou recombinada numa única construção a qual é capaz da introdução numa célula de um fragmento promotor e de uma sequência de DNA para um produto de gene seleccionado em conjunto com uma sequência 3' não traduzida apropriada. "Cassete de transformação" refere-se a um vector especifico contendo um gene estranho e possuindo elementos em adição ao gene estranho que facilitam a transformação de uma célula hospedeira particular. "Cassete de expressão" refere-se a um vector especifico que contém um gene estranho e possui elementos em adição ao gene estranho que permitam a expressão aumentada desse gene num hospedeiro estranho. 52 ΡΕ1204755

Construção de Organismos Recombinantes

Os organismos recombinantes que contêm os genes necessários que irão codificar a via enzimática para a conversão de um substrato de carbono em 1,3-propanodiol podem ser construídos utilizando técnicas bem conhecidas na área. Os genes que codificam a glicerol-3-fosfato desidro-genase (GPD1), a glicerol—3-fosfatase (GPP2), a glicerol desidratase (dhaBl, dhaB2, e dhaB3), o factor de reacti-vação da desidratase (orfZ e orfX) e a oxidoredutase de 1,3-propanodiol (dhaT) foram isolados a partir de um hospedeiro nativo tal como a Klebsiella ou a Saccharomyces e utilizados para transformar estirpes hospedeiras tais como a E. coli DH5a, ECL707, AA200, ou KLP23.

Isolamento de Genes

Os métodos para a obtenção dos genes desejados a partir de um genoma bacteriano são comuns e bem conhecidos na área da biologia molecular. Por exemplo, se a sequência do gene é conhecida, podem ser criadas bibliotecas genómicas adequadas por digestão com endonucleases de restrição e podem ser rastreadas com sondas complementares para a sequência de genes desejada. Assim que a sequência é isolada, o DNA pode ser amplificado utilizando métodos de amplificação directa com iniciadores Standard tais como a reacção de polimerização em cadeia (PCR) (U.S. 4,683,202) para obter quantidades de DNA adequadas para a transformação utilizando vectores apropriados. 53 ΡΕ1204755

Alternativamente, podem ser criadas bibliotecas cosmídicas onde grandes segmentos de DNA genómico (35-45 kb) podem ser depositados em vectores e utilizados para transformar hospedeiros apropriados. Os vectores cosmidicos são únicos na capacidade de acomodar grandes quantidades de DNA. Normalmente os vectores cosmidicos possuem pelo menos uma cópia da sequência de DNA cos que é necessária para a integração e subsequente circularização do DNA estranho. Adicionalmente para a sequência cos estes vectores irão conter também uma origem de replicação tal como a ColEl e marcas de resistência a antibióticos tais como um gene resistente à ampicilina ou à neomicina. Os métodos de utilização de vectores cosmidicos para a transformação de hospedeiros bacterianos adequados estão bem descritos no Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Normalmente para clones cosmidicos, o DNA estranho é isolado e ligado, utilizando as endonucleases de restrição apropriadas, adjacentemente à região cos do vector cosmidico. Os vectores cosmidicos contendo o DNA estranho linearizado são então postos a reagir com um veiculo de armazenamento de DNA tal como o bacteriófago. Durante o processo de integração os sitios cos são clivados e o DNA estranho é integrado na porção inicial da partícula bacteriana virai . Estas partículas são então utilizadas para transfectar células hospedeiras adequadas tal como a E. coli. Uma vez injectado na célula, o DNA estranho 54 ΡΕ1204755 circulariza sob a influência das extremidades de união cos. Desta forma grandes segmentos de DNA estranho podem ser introduzidos e expressos em células hospedeiras recombi-nantes.

Isolamento e Clonagem dos Genes gue Codificam a Glicerol Desidratase (dhaBl, dhaB2, e dhaB3), os Factores de Reacti-vação da Desidratase (orfz e orfX) , e a 1,3-propanodiol desidrogenase (dhaT)

Os vectores cosmidicos e os métodos de transformação do cosmideo foram utilizados dentro do contexto da presente invenção para clonar grandes segmentos de DNA genómico a partir géneros bacterianos conhecidos por possuírem genes capazes de processar o glicerol em 1,3-propanodiol. Especificamente, o DNA genómico de K. pneumoniae foi isolado por métodos bem conhecidos na técnica e digerido com a enzima de restrição Sau3A para a inserção num vector cosmidico Supercos 1 e integrado utilizando extractos de integração Gigapackll. A seguir à construção do vector as células de E. coli XLl-Blue MR foram transformadas com o DNA cosmidico. Os transformantes foram rastreados quanto à capacidade de converterem o glicerol em 1,3-propanodiol fazendo crescer as células na presença de glicerol e analisando o meio quanto à formação de 1,3-propanodiol.

Dois dos transformantes positivos de 1,3-propanodiol foram analisados e os cosmideos foram denominados 55 ΡΕ1204755 pKPl e pKP2. A sequenciação do DNA revelou elevada homologia com o gene da glicerol desidratase de C. freundii, demonstrando que estes transformantes contêm DNA que codifica o gene da glicerol desidratase. Outros transformantes positivos de 1,3-propanodiol foram analisados e os cosmideos foram denominados pKP4 e pKP5. A sequenciação do DNA revelou que estes cosmideos transportam DNA que codifica um gene da diol desidratase.

Apesar da presente invenção utilizar genes isolados de dentro de um cosmideo de Klebsiella, fontes alternativas de genes da desidratase e genes do factor de reactivação da desidratase incluem, mas não estão limitados a, Citrobacter, Clostridia e Salmonella (ver Tabela 1).

Genes que Codificam a G3PDH e a G3P Fosfatase A presente invenção utiliza genes adequados para a expressão da actividade das G3PDH e G3P fosfatase numa célula hospedeira.

Os genes que codificam a G3PDH são conhecidos. Por exemplo, o GPD1 foi isolado a partir da Saccharomyces e possui a sequência base fornecida pela SEQ ID NO: 53, que codifica a sequência de aminoácidos fornecida pela SEQ ID NO: 54 (Wang et al., supra) . Igualmente, a actividade da G3PDH foi também isolada a partir da Saccharomyces codificada pelo GPD2 (Eriksson et al. , Mol. Microbial. 17, 95 (1995)) . 56 ΡΕ1204755

Para o propósito da presente invenção é contemplado que qualquer gene que codifique um polipeptideo responsável pela actividade da G3PDH dependente de NADH seja adequado tal que essa actividade seja capaz de catalisar a conversão da di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) em glicerol-3-fosfato (G3P). Além disso, é contemplado que qualquer gene que codifica a sequência de aminoácidos da G3PDH dependente de NADH corresponda aos genes DAR1, GPD1, GPD2, GPD3, e gpsA irá ser funcional na presente invenção tal que essa sequência de aminoácidos possa englobar substituições de aminoácidos, delecções ou adições que não alteram a função da enzima. O perito irá apreciar que os genes que codificam a G3PDH isolados a partir de outras fontes irão também ser adequados para a utilização na presente invenção. Os genes que codificam a G3P fosfatase são conhecidos. Por exemplo, o GPP2 foi isolado a partir da Saccharomyces cerevisiae e tem a sequência base fornecida pela SEQ ID NO: 55, que codifica a sequência de aminoácidos fornecida na SEQ ID NO: 56 (Norbeck et al., J. Biol. Chem. 271, 13875 (1996) ) .

Para o propósito da presente invenção, qualquer gene que codifique uma actividade da G3P fosfatase é adequado para a utilização no método em que essa actividade seja capaz de catalisar a conversão do glicerol-3-fosfato mais H20 em glicerol mais fosfato inorgânico. Adicionalmente, qualquer gene que codifique a sequência de aminoácidos da G3P fosfatase correspondendo aos genes GPP2 e 57 ΡΕ1204755 GPP1 irá ser funcional na presente invenção incluindo qualquer sequência de aminoácidos que englobe substituições, delecções ou adições de aminoácidos que não alterem a função da enzima G3P fosfatase. 0 perito irá apreciar que os genes que codificam a G3P fosfatase isolados a partir de outras fontes irão também ser adequados para a utilização na presente invenção. Células Hospedeiras

As células hospedeiras adequadas para a produção recombinante de 1,3-propanodiol podem ser quer proca-rióticas quer eucarióticas e serão apenas limitadas pela capacidade da célula hospedeira expressar as enzimas acti-vas para a via de 1,3-propanodiol. As células hospedeiras adequadas serão bactérias tais como Citrobacter, Entero-bacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygo-saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Esche-richia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces, e Pseudomonas. As preferencias na presente invenção são E. coli, E. blattae, Klebsiella, Citrobacter, e Aerobacter.

Os microorganismos podem ser convertidos num produtor de 1,3-propanodiol de titulo elevado utilizando o seguinte protocolo geral. 1. Determinar a presença num potencial organismo 58 ΡΕ1204755 hospedeiro de uma actividade endógena da dhaT que permita o estado de concentração estacionária de um nivel tóxico ou inibitório de 3-HPA na presença de 1,3-propanodiol a 1-2 M. 2. Se tal actividade existe no organismo hospedeiro potencial, efectua-se a mutagénese adequada para delectar ou inactivar esta actividade. A confirmação de uma actividade dhaT não funcional ou delectada pode ser detectada pela falta de acumulação de 3-HPA na presença de 1,3-propanodiol a 1-2 M. 3. Expressar genes apropriados para a) a produção de glicerol, se o glicerol não for a fonte de glicerol, b) a glicerol desidratase e o sistema de manutenção associado, e c) o yqhD.

As considerações que deverão tomadas dizem respeito a certos microorganismos que concernem a expressão ou a repressão de enzimas endógenas dhaT sob as condições para a produção de 1,3-propanodiol. Isto poderá incluir também a presença de glicerol, glucose ou anaerobiose.

Vectores e Cassetes de Expressão A presente invenção fornece uma variedade de vectores e de cassetes de transformação e de expressão adequadas para a clonagem, transformação e expressão de 59 ΡΕ1204755 G3PDH, G3P fosfatase, desidratase, e factor de reactivação da desidratase numa célula hospedeira adequada. Os vectores adequados irão ser aqueles que são compatíveis com o microorqanismo utilizado. Os vectores adequados podem derivar, por exemplo, de uma bactéria, de um virus (tal como o bacteriófago T7 ou um fago derivado de M-13), de um cosmideo, de uma levedura, ou de uma planta. Os protocolos para obter e utilizar tais vectores são conhecidos na técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual - volumes 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor NY, 1989)).

Normalmente, o vector ou a cassete contêm sequências que dirigem a transcrição e a tradução do gene apropriado, um marcador seleccionável, e sequências que permitem a replicação autónoma ou a integração cromossomal. Os vectores adequados compreendem uma região 5' do gene, que alberga os controlos da iniciação transcripcional, e uma região 3' do fragmento de DNA que controla a terminação transcripcional. É mais preferencial quando as regiões controlo derivam de genes homólogos da célula hospedeira transformada. Tais regiões controlo não precisam de derivar dos genes nativos das espécies especificas escolhidas como um hospedeiro de produção.

As regiões de controlo de iniciação, ou promotores, que são úteis para direccionar a expressão dos genes da G3PDH e da G3P fosfatase (DAR1 e GPP2, respectivamente) na célula hospedeira desejada são 60 ΡΕ1204755 numerosos e familiares aos peritos na técnica. Na prática qualquer promotor capaz de dirigir esses genes é adequado para a presente invenção incluindo mas não limitado a CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, e TPI (úteis para expressão em Saccharomyces); AOX1 (útil para expressão em Pichia); e lac, trp, XPL, λΡκ, T7, tac, e trc (úteis para expressão em E. coli).

As regiões de controlo de terminação podem derivar também de vários genes nativos dos hospedeiros preferenciais. Opcionalmente, um sitio de terminação pode ser desnecessário; no entanto, é preferível que lá esteja incluído.

Para a expressão efectiva destas enzimas, o DNA que codifica as enzimas está operacionalmente ligado através de codões de iniciação a regiões de controlo da expressão seleccionadas tal que a expressão resulte na formação do RNA mensageiro apropriado.

Particularmente útil na presente invenção é o vector pKP32 o qual é planeado para ser utilizado em conjunção com o pAH48. Os elementos essenciais do pKP32 derivam do regulão dha isolado a partir da Klebsiella pneumoniae. O pKP32 contém as janelas de leitura aberta de dhaR, orfY, orfx, orfW, dhaBl, dhaB2, e dhaB3, as sequências de nucleótidos que estão contidas na SEQ ID NO: 1. O pAH48 é o veículo utilizado para a introdução dos 61 ΡΕ1204755 genes DAR1 e GPP2 na célula hospedeira e mais especificamente contém os genes DAR1 e GPP2 isolados a partir de Saccharomyces cerevisiae.

Transformação de Hospedeiros Adequados e Expressão de Genes para a Produção de 1,3-propanodiol

Assim que as cassetes adequadas sejam construídas são utilizadas para transformar células hospedeiras apropriadas. A introdução da cassete que contém os genes que codificam a G3PDH, a G3P fosfatase, a desidratase, e o factor de reactivação da desidratase na célula hospedeira pode ser efectuada por procedimentos conhecidos tal como por transformação (por exemplo, utilizando células permea-bilizadas com cálcio, electroporação), ou por transfecção utilizando um vírus fago recombinante (Sambrook et al., supra).

Na presente invenção as cassetes são utilizadas para transformar a E. coli tal como é descrito detalhadamente nos MÉTODOS GERAIS e EXEMPLOS.

Mutantes

Adicionalmente ás células exemplificadas, é contemplado que o presente método será capaz de fazer uso de células que contêm mutações simples ou múltiplas especificamente planeadas para aumentar a produção de 1,3-propanodiol. As células que normalmente desviam uma fonte 62 ΡΕ1204755 de carbono para vias não produtivas, ou que exibem repressão catabólica significativa podem ser mutadas para evitar estas deficiências fenotípicas. Por exemplo, muitas células de estirpe selvagem são sujeitas a repressão catabólica pela glucose e pelos produtos no meio e é contemplado que as estirpes mutantes destes organismos de estirpe selvagem, capazes da produção de 1,3-propanodiol que é resistente à repressão pela glucose, serão particularmente úteis na presente invenção.

Os métodos para criar mutantes são comuns e bem conhecidos na técnica. Por exemplo, células de estirpe selvagem podem ser expostas a uma variedade de agentes tais como radiação ou mutagénese química e depois rastreadas para o fenótipo desejado. Quando se criam mutações através de radiação pode ser utilizada quer radiação ultravioleta (UV) ou radiação de ionização. Os comprimentos de onda adequados de UV de onda curta para mutações genéticas irão estar dentro do espectro de 200 nm a 300 nm com preferência para 254 nm. A radiação UV neste comprimento de onda causa principalmente alterações na sequência do ácido nucleico de guanidina e citosina para adenina e timidina. Assim que as células apresentem os mecanismos de reparação do DNA que podem reparar a maioria das mutações induzidas por UV, os agentes tais como a cafeína e outros inibidores podem ser adicionados para interromper o processo de reparação e maximizar o número de mutações efectivas. As mutações de UV de onda longa utilizando luz no espectro de 300 nm a 400 nm são também possíveis mas normalmente não são tão eficazes 63 ΡΕ1204755 quanto a luz de UV de onda curta a não ser que seja utilizada em conjunto com vários activadores tal como o corante psoraleno que interaqe com o DNA. A mutagénese com agentes químicos é também eficaz para produzir mutantes e as substâncias normalmente utilizadas incluem químicos que afectam o DNA não replicativo tal como ο HNO2 e a NH2OH, bem como agentes que afectam o DNA replicativo tais como os corantes de acri-dina, conhecidos por causar mutações por desvio da janela de leitura ("frameshift") . Os métodos específicos para a criação de mutantes utilizando radiação ou agentes químicos estão bem documentados na técnica. Ver por exemplo Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland MA., ou Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227 (1992).

Após a mutagénese ter ocorrido, os mutantes contendo o fenótipo desejado podem ser seleccionados por uma variedade de métodos. O rastreio aleatório é mais comum onde as células mutagenizadas são seleccionadas pela sua capacidade de produzir o produto ou o intermediário desejado. Alternativamente, o isolamento selectivo de mutantes pode ser efectuado por crescimento de uma população mutagenizada num meio selectivo onde apenas as colónias resistentes se podem desenvolver. Os métodos de selecção de mutantes estão bastante desenvolvidos e são bem conhecidos na área da microbiologia industrial. Ver por 64 ΡΕ1204755 exemplo Brock, supra; DeMancilha et al., Food Chem. 14, 313 (1984) . A eliminação de uma actividade enzimática não desejada pode também ser efectuada por disrupção do gene que codifica a enzima. Estes métodos são conhecidos por aqueles peritos na técnica e são exemplificados no Exemplo 4 e no Exemplo 8.

Alterações na Via de Produção de 1,3-propanodiol

Via Enzimática Representativa. A produção de 1,3-propanodiol a partir de glucose pode ser alcançada pela seguinte série de passos. Esta série é representativa de um número de vias conhecidas pelos peritos na técnica e é ilustrada na Figura 5. A glucose é convertida numa série de passos por enzimas da via glicolitica em di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) e em 3-fosfogliceraldeido (3-PG). O glicerol é então formado quer pela hidrólise de DHAP para di-hidroxiacetona (DHA) seguida por redução, ou por redução de DHAP para glicerol-3-fosfato (G3P) seguida por hidrólise. Este passo de hidrólise pode ser catalisado por qualquer número de fosfatases celulares, que são conhecidas por serem não especificas no que diz respeito aos seus substratos, ou a actividade pode ser introduzida no hospedeiro por recombinação. 0 passo de redução pode ser catalisado por uma enzima hospedeira ligada a NAD+ (ou NADP+) ou a actividade pode ser introduzida no hospedeiro por recombinação. É de notar que o regulão dha contém uma 65 ΡΕ1204755 glicerol desidrogenase (E.C. 1.1.1.6) que catalisa a reac- çao reversível da Equação 3.

Glicerol -> 3-HPA + H20 (Equação 1) 3-HPA + NADH + H+ 1,3-Propanodiol + NAD+ (Equação 2)

Glicerol + NAD+ -> DHA + NADH + H+ (Equação 3) 0 glicerol é convertido em 1,3-propanodiol via o intermediário 3-hidroxipropionaldeído (3-HPA) como está descrito em detalhe acima. O intermediário 3-HPA é produzido a partir de glicerol, Equação 1, por uma enzima desidratase que pode ser codificada pelo hospedeiro ou pode ser introduzida no hospedeiro por recombinação. Esta desidratase pode ser a glicerol desidratase (E.C. 4.2.1.30), a diol desidratase (E.C. 4.2.1.28) ou qualquer outra enzima capaz de catalisar esta transformação. A glicerol desidratase, mas não a diol desidratase, é codificada pelo regulão dha. O 1,3-propanodiol é produzido a partir do 3-HPA, Equação 2, por uma enzima hospedeira ligada a NAD+ (ou NADP+) ou a actividade pode ser introduzida no hospedeiro por recombinação. Esta reacção final da produção de 1,3-propanodiol pode ser catalisada pela desidrogenase de 1,3-propanodiol (E. C. 1.1.1.202) ou por outras álcool desidrogenases.

Mutações e transformações que afectam a canalização do carbono. Uma variedade de microorganismos mutan-tes compreendendo variações na via de produção de 1,3-propanodiol serão úteis na presente invenção. Por exemplo a 66 ΡΕ1204755 introdução de uma mutação triosefosfato isomerase (tpi-) no microorganismo da presente invenção é um exemplo da utilização de uma mutação para melhorar a performance por canalização do carbono. A triosefosfato isomerase é a enzima responsável pela conversão de DAHP em 3-fosfo-gliceraldeido, e por isso permite a dispersão do fluxo de carbono da via principal da glucose para a glicerol e 1,3-propanodiol (Figura 5). Assim, a mutação por delecção (tpi-) aumenta a eficiência metabólica geral da via desejada sob a descrita na técnica. Similarmente, as mutações que bloqueiam as vias alternativas para os intermediários da via de produção de 1,3-propanodiol podem também ser úteis para a presente invenção. Por exemplo, a eliminação da glicerol cinase previne que o glicerol formado a partir da G3P pela acção da G3P fosfatase, seja reconvertido em G3P à custa do ATP (Figura 5) . Também, a eliminação da glicerol desidrogenase (por exemplo, gldA) permite que o glicerol, formado a partir de DHAP pela acção da glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NADH, seja convertido em di-hidroxiacetona (Figura 5). As mutações podem ser direccionadas a um gene estrutural para prejudicar ou melhorar a actividade de uma actividade enzimática ou podem ser dirigidas a um gene regulador, incluindo as regiões promotoras e os sitios de ligação do ribossoma, para modular o nivel de expressão de uma actividade enzimática. É assim contemplado que as transformações e mutações possam ser combinadas para controlar actividades enzimáticas particulares para ao aumento da produção de 67 ΡΕ1204755 1,3-propanodiol. Assim, está dentro do âmbito da presente invenção antecipar modificações de toda uma célula catalítica que conduzam a um aumento da produção de 1,3-propanodiol. A presente invenção utiliza uma via preferida para a produção de 1,3-propanodiol a partir de um substrato de açúcar onde o fluxo de carbono se move da glucose para a DHAP, para o G3P, para o glicerol, para o 3-HPA e finalmente para o 1,3-propanodiol. A presente produção de estirpes tem sido manipulada para maximizar a eficiência metabólica da via incorporando várias mutações por delecção que evitam a dispersão de carbono para compostos não produtivos. 0 glicerol pode ser dispersado a partir da conversão em 3HPA por transformação quer para DHA ou para G3P via glicerol desidrogenase ou glicerol cinase como discutido acima (Figura 5) . Desta forma, a presente produção de estirpes contém mutações por delecção nos genes gldA e glpK. Similarmente o DHAP pode ser dispersado da 3-PG através da triosefosfato isomerase, assim a presente produção de microorganismos contém também uma mutação por delecção neste gene. O presente método incorpora adicionalmente um enzima desidratase para a conversão de glicerol em 3HPA, que funciona em conjunto com o factor de reactivação, codificado por orfX e orfZ do regulão dha (Figura 5) . Apesar da conversão do 3HPA em 1,3-propanodiol ser normalmente conseguida via a oxidoredutase de 1,3-propanodiol, o presente método utiliza uma actividade catalítica não específica que produz títulos e rendimentos mais elevados 68 ΡΕ1204755 do produto final, 1,3-propanodiol (Figura 5). Em tal processo, são conseguidos títulos de 1,3-propanodiol de pelo menos 10 g/L, quando se esperam títulos de 200 g/L.

Alternativamente, um processo melhorado para a produção de 1,3-propanodiol pode utilizar glicerol ou di-hidroxiacetona como um substrato onde a via contém apenas os últimos três substratos, glicerol 3HPA -> 1,3-propanodiol. Em tal processo, a oxidoredutase é novamente eliminada em favor da actividade catalítica não específica (que se espera ser uma álcool desidrogenase), no entanto a necessidade de mutações por delecção é anulada pelas considerações energéticas da adição do glicerol à cultura. Em tal processo são conseguidos títulos de 1,3-propanodiol de pelo menos 71 g/L onde se esperam títulos de 200 g/L.

Os mutantes dos microorganismos de estirpe selvagem foram modificados pela delecção ou mutação da actividade da dhaT para criar produtores de 1,3-propanodiol melhorados. Por exemplo, os microorganismos, que contém naturalmente todos os elementos do regulão dha podem ser manipulados para inactivar o gene dhaT que codifica a actividade da oxidoredutase de 1,3-propanodiol. Espera-se que estes microorganismos produzam rendimentos e títulos elevados de 1,3-propanodiol mediados pela presença de uma actividade catalítica endógena que se espera ser uma álcool desidrogenase. Exemplos de tais microorganismos incluem mas não estão limitados a Klebsiella sp., Citrobacter sp., e Clostridium sp. 69 ΡΕ1204755

Meio e Substratos de Carbono 0 meio de fermentação na presente invenção deve conter substratos de carbono adequados. Os substratos adequados podem incluir mas não estão limitados a monos-sacarídeos tais como a glucose e a frutose, oligossaca-rideos tais como a lactose ou a sacarose, polissacarideos tais como o amido ou a celulose ou misturas dai resultantes e misturas não purificadas de matérias-primas renováveis tais como , soro de queijo coado, água de maceração do milho, melaço do açúcar de beterraba, malte de cevada. Adicionalmente o substrato de carbono pode ser também substratos de um carbono tal como o dióxido de carbono ou o metanol para os quais a conversão metabólica em intermediários bioquímicos chave tem sido demonstrada. A produção de glicerol a partir de fontes de carbono simples (por exemplo, metanol, formaldeido ou formato) foi descrita em leveduras metilotróficas (K. Yamada et al., Agric. Biol. Chem. 53 (2) , 541-543 (1989) ) e em bactérias (Hunter et al., Biochemistry 24, 4148-4155 (1985)). Estes micro- organismos podem assimilar compostos de carbono simples, variando no estado de oxidação de metano para formato, e produzem glicerol. A via da assimilação de carbono pode ser através da ribulose monofosfato, através da serina, ou através xilulose monofosfato (Gottschalk, Bacterial Metabolism, Second Edition, Springer-Verlag: New York (1986)). A via da ribulose monofosfato envolve a condensação do formato com a ribulose-5-fosfato para formar um açúcar de 6 carbonos que se torna na frutose e eventualmente o produto de três carbonos no gliceraldeido 3-fosfa- 70 ΡΕ1204755 to. Da mesma forma, a via da serina assimila o composto de um carbono na via glicolitica via a metilenotetra-hidro-folato.

Em adição aos substratos de um e de dois carbonos, os microorganismos metilotróficos são também conhecidos por utilizarem um número de outros compostos que contêm carbono tais como a metilamina, a glucosamina e uma variedade de aminoácidos para actividade metabólica. Por exemplo, as leveduras metilotróficas são conhecidas por utilizarem o carbono da metilamina para formar a trealose ou o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd., [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32. Editor(s): Murrell, J.

Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK) . Similarmente, várias espécies de Candida, irão metabolizar a alanina ou o ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153(5), 485-489 (1990)). Consequentemente, é contemplado que a fonte de carbono utilizada na presente invenção pode englobar uma grande variedade de substratos que contêm carbono e será apenas limitada pela escolha do microorganismo ou do processo.

Apesar de estar contemplado que todos os substratos de carbono e misturas dai resultantes (co-fornecido) mencionados acima são adequados na presente invenção, os substratos de carbono preferidos são a glucose, a frutose, a sacarose, ou o metanol onde o processo se destina à produção de um glicerol endógeno, e o glicerol e a di-hidroxiacetona onde o processo antecipa um fornecimento de glicerol ou de di-hidroxiacetona. 71 ΡΕ1204755

Adicionalmente para uma fonte de carbono apropriada o meio de fermentação deve conter minerais, sais, cofactores, tampões e outros componentes adequados, conhecidos pelos peritos na técnica, adequados para o crescimento de culturas e promoção da via enzimática necessária para a produção de 1,3-propanodiol. É fornecida particular atenção aos sais de Co(II) e/ou à vitamina B12 ou a percursores dai resultantes. A adenosilcobalamina (coenzima B12) é um cofactor essencial para a actividade da desidratase. A síntese da coenzima B12 é encontrada em procariotas, alguns dos quais são capazes de sintetizar os compostos de novo, por exemplo, a Escherichia blattae, espécies de Klebsiella, espécies de Citrobacter, e espécies de Clostridium, enquanto que outros podem efectuar reacções parciais. A E. coli, por exemplo, não consegue fabricar a estrutura do anel corrina, mas é capaz de catalisar a conversão da cobinamida em corrinoide e pode introduzir um grupo 5'-deoxiadenosil. Assim, é conhecido na técnica que um percursor da coenzima B12, tal como a vitamina Bi2, precisa de ser fornecida nas fermentações da E. coli.

As adições de vitamina B12 nas fermentações de E. coli podem ser efectuadas continuamente, a uma taxa constante ou gradualmente para coincidir com a produção de massa celular, ou pode ser adicionada em adições em bolus simples ou múltiplas, As taxas preferenciais da vitamina B12 (mg) fornecidas à massa celular (OD550) são de 0,06 a 72 ΡΕ1204755 0,60. As taxas mais preferenciais da vitamina Bi2 (mg) fornecidas à massa celular (OD550) são de 0,12 a 0,48.

Apesar da vitamina Bi2 ser adicionada à E. coli transformada da presente invenção é contemplado que outros microorganismos, capazes da biossintese de novo da B12 sejam também adequados para a produção de células, e a adição de B12 a estes microorganismos será desnecessária.

Condições de Cultura:

Normalmente as células são crescidas a 35 °C em meio apropriado. O meio de crescimento preferido na presente invenção é o meio comum preparado comercialmente tal como o Luria Bertani (LB) broth, Sabouraud Dextrose (SD) broth, ou Yeast médium (YM) broth. Outros meios de crescimento definidos ou sintéticos podem também ser utilizados e o meio apropriado para o crescimento do microorganismo particular será conhecido por alguém entendido na área da microbiologia ou ciência da fermentação. A utilização de agentes conhecidos por modularem a repressão catabólica directa ou indirectamente, por exemplo, adenosina 2': 3'-monofosfato cíclica, podem também ser incorporados no meio de reacção. Similarmente, o utilização de agentes conhecidos por modularem as actividades enzimáticas (por exemplo, metilviologénio) que levam ao aumento da produção de 1,3-propanodiol podem ser utilizadas em conjunto com ou como alternativa ás manipulações genéticas.

As gamas de pH adequadas para a fermentação são 73 ΡΕ1204755 entro ο pH 5,0 a pH 9,0, onde o pH 6,0 a pH 8,0 são preferidos como condição inicial.

As reacções podem ser efectuadas sob condições aeróbias ou anaeróbias, onde as condições anaeróbias ou microaeróbias são preferidas. As fermentações semi-contí-nuas ("fed-batch") podem ser efectuadas com fornecimento de carbono, por exemplo, glucose, limitante ou em excesso.

Fermentações Descontinuas ("Batch") e Contínuas O presente processo emprega um método descontínuo de fermentação. A fermentação descontínua clássica é um sistema fechado onde a composição do meio é estabelecida no início da fermentação e não está sujeita a alterações artificiais durante a fermentação. Assim, no início da fermentação o meio é inoculado com o microorganismo ou microorganismos desejados e permite-se que a fermentação ocorra sem adicionar nada ao sistema. Normalmente, no entanto a fermentação "descontínua" é descontínua no que diz respeito à adição de fontes de carbono e as diligências são muitas vezes efectuadas nos factores de controlo tais como o pH e a concentração de oxigénio. Nos sistemas descontínuos ("batch") as composições dos metabolitos e da biomassa do sistema alteram-se constantemente até ao final da fermentação. Dentro das culturas descontínuas ("batch") as células moderam desde a fase estática lag até à fase de elevado crescimento log e finalmente até uma fase estacionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou detida. Se não forem tratadas, as células na fase 74 ΡΕ1204755 estacionária irão eventualmente morrer. As células na fase log são geralmente responsáveis pela capacidade de produção do produto final ou intermediário. A variação nos sistemas descontínuos ("batch") Standard é o sistema semi-continuo ("fed-batch") . Os processos de fermentação semi-continuos ("fed-batch") são também adequados na presente invenção e compreendem um sistema descontinuo ("batch") típico com excepção de que o substrato é adicionado em incrementos com o progresso da fermentação. Os sistemas semi-continuos ("fed-batch") são úteis quando a repressão catabólica está apta a inibir o metabolismo das células e quando é desejável existirem quantidades limitadas do substrato no meio. A medida da concentração actual de substrato em sistemas semi-continuos ("fed-batch") é difícil e é por isso estimado com base nas alterações dos factores medíveis tais como o pH, o oxigénio dissolvido, e a pressão parcial de gases gerados tal como o CO2. As fermentações descontínuas ("batch") e semi-contínuas ("fed-batch") são comuns e bem conhecidas na técnica e exemplos podem ser encontrados em Brock, supra.

Apesar da presente invenção ser efectuada em modo descontínuo ("batch") é contemplado que o método pode ser adaptado aos métodos da fermentação contínua. A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreactor e uma quantidade igual de meio condicionado é removido simultaneamente para processamento. A fermentação contínua mantém geralmente as culturas numa densidade elevada 75 ΡΕ1204755 constante onde as células estão inicialmente numa fase de crescimento log. A fermentação continua permite a modulação de um factor ou de qualquer número de factores que afectam o crescimento da célula ou terminem a concentração do produto. Pr exemplo, um método irá manter um nutriente limitante tal como a fonte de carbono ou o nivel de azoto a uma taxa fixa e permite que todos os outros parâmetros se moderem. Noutros sistemas um número de factores que afectam o crescimento podem ser alterados continuamente enquanto que a concentração celular, medida pela turvação do meio, é mantida constante. Os sistemas continuos procuram manter-se nas condições de estádio estacionário do crescimento e assim a perda celular devido ao meio ser retirado deve ser compensada contra a taxa de crescimento celular na fermentação. Os métodos para modular os nutrientes e os factores de crescimento nos processo de fermentação contínua bem como as técnicas para maximizar a taxa de formação de produto são bem conhecidas na área da microbiologia industrial e uma variedade de métodos está descrita em Brock, supra. É contemplado que a presente invenção pode ser praticada utilizando processos descontínuos ("batch"), semi-continuos ("fed-batch") e contínuos e que qualquer modo conhecido de fermentação poderá ser adequado. Adicionalmente, é contemplado que as células podem ser imobilizadas num substrato como toda uma célula catalítica e sujeitas ás condições de fermentação para produção de 1,3-propanodiol. 76 ΡΕ1204755

Identificação e purificação de 1,3-propanodiol:

Os métodos para a purificação de 1,3-propanodiol a partir do meios de fermentação são conhecidos na técnica. Por exemplo, os propanodióis podem ser obtidos a partir de meios celulares sujeitando a mistura de reacção a extracção com um solvente orgânico, a destilação, e a cromatografia em coluna (U.S. 5,356,812). Um solvente orgânico particularmente bom para este processo é o ciclohexano (U.S. 5,008,473). O 1,3-propanodiol pode ser identificado directa-mente submetendo o meio a análise por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). É preferível na presente invenção um método onde o meio de fermentação é analisado numa coluna analítica de troca iónica utilizando uma fase móvel de ácido sulfúrico a 0,01 N num modo isocrático.

EXEMPLOS

MÉTODOS GERAIS

Os procedimentos para fosforilações, ligações e transformação são bem conhecidos na técnica. As técnicas adequadas para a utilização nos seguintes exemplos podem ser encontradas em Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor

Laboratory Press (1989). 77 ΡΕ1204755

Os materiais e métodos adequados para a manutenção e crescimento de culturas bacterianas são bem conhecidos na técnica. As técnicas adequadas para a utilização nos sequintes exemplos podem ser encontradas em Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg e G. Briggs Phillips, eds) , American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1994) ou Thomas D. Brock in Biotechnoloqy: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. Todos os reagentes e materiais utilizados para o crescimento e manutenção de células bacterianas foi obtido de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) , ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) salvo indicação em contrário. 0 significado das abreviaturas é o que o seguinte: "h" significa hora(s), "min" significa minuto(s), "sec" significa segundo(s), "d" significa dia(s), "mL" significa mililitros, "L" significa litros, 50 amp significa 50 pg/mL de ampicilina, e LB-50 amp significa Luria Bertani broth contendo 50 pg/mL de ampicilina.

Dentro das tabelas são utilizadas as seguintes abreviaturas. "Con." significa conversão, "Sei." Significa selectividade baseada no carbono, e "nd" significa não detectado. 78 ΡΕ1204755

As estirpes e os vectores utilizados e construídos nos seguintes exemplos estão listados na quadro abaixo:

ESTIRPE/PLASMÍDEO

DELECÇAO

ORF/GENE KLP23

gldA glpK RJ8m gldA glpK Tpi pAH4 8 GPP2 DAR1 pDT2 9

dhaR orfY dhaT orfX orfW dhaBl dhaB2 dhaB3 orfZ pKP32

dhaR orfY orfX orfW dhaBl dhaB2 dhaB3 orfZ ΡΕ1204755 79

ENSAIOS DE ENZIMAS

Ensaios para as enzimas desidratases: A actividade desidratase em extractos livres de células foi determinada utilizando como substrato quer o glicerol quer o 1,2-propanodiol. Normalmente, os extractos livres de células são preparados por disrupção celular utilizando uma prensa francesa ("french press") seguido por centrifugação dos detritos celulares. 0 ensaio, baseado na reacção de aldeidos com o metilbenzo-2-tiazolona hidrazona, foi descrito por Forage e Foster (Biochim. Biophys. Acta 569, 249 (1979) ) .

Honda et al. (J. Bacteriol. 143, 1458 (1980)) descreve um ensaio que mede a reactivação das desidratases. A actividade da desidratase foi determina em células totalmente toluenizadas, com e sem ATP, utilizando como substrato quer o glicerol quer o 1,3-propanodiol. A reactivação foi determinada pela taxa de formação de produto com ou sem a adição de ATP. A formação de produto (3-HPA ou propionaldeido quando o glicerol ou o 1,2-propanodiol é utilizado como substrato, respectivamente) foi medida directamente, utilizando HPLC, ou indirecta-mente, utilizando o reagente metilbenzo-2-tiazolona hidrazona. Alternativamente, a formação de produto foi determinada por acopulação da conversão do aldeído com o seu álcool respectivo utilizando uma álcool desidrogenase ligada ao NADH e monitorizando o desaparecimento do NADH. 80 ΡΕ1204755

Ensaios para a oxidoredutase de 1,3-propanodiol: A actividade da oxidoredutase de 1,3-propanodiol, referida por vezes como desidrogenase de 1,3-propanodiol, foi determinada em extractos livres de células em solução ou em géis de acrilamida ("slab") utilizando 1,3-propanodiol e NAD+ como substratos foi descrita (Johnson and Lin, J. Bacteriol. 169, 2050 (1987)). Alternativamente a conversão de 3-HPA e de NADH em 1,3-propanodiol e NAD+ foi determinada pelo desaparecimento de NADH. O ensaio do gel acrilamida ("slab") apresenta a potencial vantagem de separar a actividade da oxidoredutase de 1,3-propanodiol (dhaT) das álcool desidrogenases não específicas devido à separação por tamanhos. Os pesos moleculares nativos das oxidoredutases de 1,3-propanodiol (dhaT) de Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, e de Clostridium pasteu-rianum são invulgarmente grandes, na ordem dos 330,000 a 440,000 daltons. O Lactobaclllus brevis e o Lactobacillus buchneri contêm desidratases associadas ás oxidoredutases de 1,3-propanodiol com propriedades similares ás das oxidoredutases de 1,3-propanodiol (dhaT) conhecidas.

Ensaios para a actividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase :

Foi utilizado um procedimento modificado em baixo a partir de um método publicado por Bell et al. (J. Biol. Chem. 250, 7153 (1975)). Este método envolve a incubação de 81 ΡΕ1204755 uma amostra de extracto livre de células numa cuvete que contém NADH a 0,2 mM, di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) a 2,0 mM, e enzima em tampão Tris/HCl a 0,1 M, pH 7,5 com DTT a 5 mM, num volume total de 1,0 mL a 30 °C. A taxa de base da reacção da enzima e do NADH foi determinada primeiramente a 340 nm durante pelo menos 3 min. O segundo substrato, DHAP, foi subsequentemente adicionado e a alteração da absorvância com o tempo foi seguidamente monitorizada durante pelo menos 3 min. A actividade da G3PDH foi definida pela subtracção da taxa de base à taxa total.

Ensaio para a actividade da glicerol—3-fosfatase: O ensaio para a actividade da enzima foi efectuado pela incubação do extracto com um substrato fosfato orgânico num tampão bis-Tris ou MES e magnésio, pH 6,5. O substrato utilizado foi quer o 1-a-glicerol fosfato, ou o d, 1-a-glicerol fosfato. As concentrações finais dos reagentes no ensaio são: tampão (20 mM, bis-Tris ou MES a 50 mM) ; MgCl2 (10 mM) ; e substrato (20 mM) . Se a proteína total na amostra foi baixa e não ocorreu precipitação visível com uma têmpera ácida, a amostra foi convenientemente ensaiada na cuvete. Este método envolveu a incubação de uma amostra de enzima numa cuvete que continha substrato a 20 mM (50 pL, 200 mM) , tampão MES a 50 mM, MgCl2 a 50 mM, pH 6,5. O volume final do ensaio da fosfatase foi de 0,5 mL. A amostra contendo a enzima foi adicionada à mistura de reacção; o conteúdo da cuvete foi misturado e a cuvete foi então colocada sob um banho de 82 ΡΕ1204755 água corrente a T = 37 °C durante 5 a 120 min, a diferença de tempo depende da variação de 2 a 0,02 U/mL da actividade da fosfatase na amostra da enzima. A reacção enzimática foi extinguida pela adição do reagente do ácido molibdato (0,4 mL) . Após serem adicionados o reagente Fiske SubbaRow (0,1 mL) e a água destilada (1,5 mL) , a solução foi misturada para permitir o seu desenvolvimento. Após 10 min, para permitir o desenvolvimento total da cor, a absorvância das amostras foi lida a 60 nm utilizando um espectrofotómetro Cary 219 UV/vis. A quantidade de fosfato inorgânico libertado foi comparada com uma curva Standard que foi preparada utilizando uma solução stock de fosfato inorgânico (0,65 mM) e preparando 6 amostras Standard com uma concentração final de fosfato inorgânico variando entre 0,026 e 0,130 pmol/mL.

Ensaio para a actividade da glicerol cinase:

Uma quantidade apropriada de enzima, normalmente um extracto em bruto livre de células foi adicionada a uma mistura de reacção contendo ATP a 40 mM, MgSCt a 20 mM, glicerol a 21 mM marcado uniformemente com 13C (99%,

Cambridge Isotope Laboratories), e Tris-HCl a 0,1 M, pH 9 durante 75 min a 25 °C. A conversão de glicerol em glicerol-3-fosfato foi detectada por NMR de 13C (125 MHz) : glicerol (63,11 ppm, δ, J = 41 Hz e 72, 66 ppm, t, J = 41 Hz); glicerol-3-f osf ato (62, 93 ppm, δ, J = 41 Hz; 65,31 ppm, br d, J = 43 Hz; e 72,66 ppm, dt, J = 6,41 Hz). 83 ΡΕ1204755

Ensaio da glicerol desidrogenase ligada a NADH: A actividade da glicerol desidrogenase ligada a NADH (gldA) em extractos livres de células de estirpes de E. coli foi determinada após a separação da proteína por electroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante. A conversão de glicerol mais NAD+ em di-hidroxiacetona mais NADH foi acoplada com a conversão de brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio (MTT) num formazano intensamente colorido, utilizando metossulfato de fenazina (PMS) como mediador (Tang et al., J. Bacteriol. 140, 182 (1997)). A electroforese foi efectuada em duplicado por procedimentos Standard utilizando géis nativos (8-16% TG, 1,5 mm, géis de 15 poços da Novex, San Diego, CA). O gi icerol residual foi removidos dos géis por lavagem 3x com tampão Tris ou carbonato de potássio a 50 mM, pH 9 durante 10 min. Foram desenvolvidos géis duplicados, com e sem glicerol (aproximadamente 0,16 M de concentração final), em 15 mL de solução de ensaio contendo Tris ou carbonato de potássio a 50 mM, pH 9, 60 mg de sulfato de amónio, 75 mg de NAD+, 1,5 mg de MTT, e 0,5 mg de PMS. A presença ou a ausência da actividade da glicerol desidrogenase ligada a NADH em estirpes de E. coli (gldA) foi também determinada, seguidamente à electroforese em gel de poliacrilamida, por reacção com anticorpos policlonais criados para purificar a glicerol desidrogenase (dhaD) de K. pneumoniae. 84 ΡΕ1204755

Isolamento e identificação de 1,3-propanodiol: A conversão de glicerol em 1,3-propanodiol foi monitorizada por HPLC. As análises foram efectuadas utilizando técnicas Standard e materiais disponíveis para os peritos na técnica da cromatografia. Um método adequado utiliza um sistema de HPLC Waters Maxima 820 que utiliza detecção UV (210 nm) e RI. As amostras foram injectadas numa coluna Shodex SH-1011 (8 mm x 300 mm, adquirida na Waters, Milford, MA) equipada com uma pré-coluna Shodex SH-1011P (6 mm x 50 mm), temperatura controlada a 50 °C, utilizando o H2SO4 a 0,1 N como fase móvel a um fluxo de 0,5 mL/min. Quando a análise quantitativa foi desejada, as amostras foram preparadas com uma quantidade conhecida de ácido trimetilacético como amostra Standard externa. Normalmente, o tempo de retenção da glucose (detecção RI) , do glicerol, do 1,3-propanodiol (detecção RI), e do ácido trimetilacético (detecção UV e RI) foi de 15, 27 min, 20,67 min, 26,08 min, e 35,03 min, respectivamente. A produção de 1,3-propanodiol foi confirmada por GC/MS. As análises foram efectuadas utilizando técnicas Standard e materiais disponíveis para os peritos na técnica de GC/MS. Um método adequado utiliza um cromatógrafo de gás da Hewlett Packard 5890 Series II acoplado a um detector selectivo de massa da Hewlett Packard 5971 Series (EI) e uma coluna HP-INNOWax (30 m de comprimento, 0,25 mm i.d., 0,25 mícron de espessura de filme). O tempo de retenção e o 85 ΡΕ1204755 espectro de massa do 1,3-propanodiol produzido foi comparado ao do 1,3-propanodiol autêntico (m/e: 57, 58).

Um método alternativo para a GC/MS envolveu a derivatização da amostra. A 1,0 mL de amostra (por exemplo, cultura sobrenadante) foi adicionada 30 yL de ácido perclórico concentrado (70% v/v). Após a mistura, a amostra foi congelada e liofilizada. Uma mistura de 1:1 de bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida: piridina (300 μΐ) foi adicionada ao material liofilizado, mexida vigorosamente e colocada a 65 °C durante uma h. O material insolúvel foi retirado da amostra por centrifugação. O liquido resultante encontrava-se dividido em duas fases, das quais a superior foi utilizada para análise. A amostra foi cromatografada numa coluna DB-5 (48 m, 0,25 I.D., 0,25 ym de espessura de filme; da J&W Scientific) e o tempo de retenção e o espectro de massa do 1,3-propanodiol derivado obtido da cultura sobrenadante foi comparado com o obtido a partir de amostras Standard autênticas. O espectro de massa de 1,3-propanodiol derivado de TMS contém os iões caracteristicos de 205, 177, 130 e 115 AMU.

Lise Celular: A lise celular foi estimada medindo a concentração da proteína solúvel extracelular no meio de fermentação. As amostras fermentadas foram centrifugadas numa centrífuga de bancada (normalmente, 3-5 min a 12,000 rpm numa micro centrífuga Eppendorf Modelo 5415C) por forma 86 ΡΕ1204755 a separar as células. O sobrenadante resultante foi analisado relativamente à concentração de proteínas pelo método Bradford utilizando um reagente comercialmente disponível (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad, Hercules, CA) .

Viabilidade: A viabilidade das células foi determinada por plaqueamento, em diluições apropriadas, de células obtidas da fermentação em placas de LB com agar não selectivas. A viabilidade das células entre as experiências de fermentação é comparada utilizando a taxa de células viáveis por mL de meio de fermentação dividido pela OD550 (AU). EXEMPLO 1

CLONAGEM E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE E. COLI COM DNA COSMÍDICO PARA A EXPRESSÃO DE 1,3-PROPANODIOL

Meio :

Foi utilizado meio sintético S12 no rastreio de transformantes bacterianos pela sua capacidade de produzirem 1,3-propanodiol. O meio S12 contém: sulfato de amónio a 10 mM, tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,0, MgCl2 a 2 mM, CaCl2 a 0,7 mM, MnCl2 a 50 μΜ, FeCl3 a 1 μΜ, ZnCl a 1 μΜ, CuS04 a 1,7 μΜ, CoCl2 a 2,5 μΜ, Na2Mo04 a 2,4 μΜ, e hidrocloreto de tiamina a 2 μΜ. 87 ΡΕ1204755 O meio A utilizado para crescimento e fermentação consiste em: sulfato de amónio a 10 mM; tampão MOPS/KOH a 50 mM, pH 7,5; tampão fosfato de potássio a 5 mM, pH 7,5; MgCl2 a 2 mM; CaCl2 a 0,7 mM; MnCl2 a 50 μΜ; FeCl3 a 1 μΜ;

ZnCl a 1 μΜ; CuS04 a 1,72 μΜ; CoCl2 a 2,53 μΜ; Na2Mo04 a 2,42 μΜ; hidrocloreto de tiamina a 2 μΜ, ; extracto de levedura a 0,01%; casamino ácidos a 0,01%; vitamina Bi2 a 0,8 pg/mL; e amp a 50 pg/mL. O meio A foi suplementado quer com glicerol a 0,2% quer com glicerol a 0,2% mais D-glucose a 0,2% como requerido. Células: A Klebsiella pneumoniae ECL2106 (Ruch et al., J. Bacteriol. 124, 348 (1975)), também conhecida na literatura como K. aerogenes ou Aerobacter aerogenes, foi obtida a partir de E. C. C. Lin (Harvard Medicai School, Cambridge, MA) e foi mantida como uma cultura de laboratório. A Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 foi adquirida na Colecção de Cultura de Tipo Americana (Manassas, VA). A E. coli DH5a foi adquirida na Gibco/BRL e foi transformada com o DNA cosmídico isolado a partir da Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 contendo um gene que codifica quer para uma enzima glicerol desidratase quer para uma enzima diol desidratase. Os cosmídeos que contêm a glicerol desidratase foram identificados como pKPl e pKP2 e o cosmideo que contém a enzima diol desidratase foi 88 ΡΕ1204755 identificado como pKP4. As células DH5a transformadas foram identificadas como DH5a-pKPl, DH5a-pKP2, e DH5a-pKP4. A E. coli ECL707 (Sprenger et al., J. Gen.

Microbiol. 135, 1255 (1989)) foi obtido a partir de E. C. C. Lin (Harvard Medicai School, Cambridge, MA) e foi similarmente transformada com o DNA cosmidico da Klebsiella pneumoniae. Estes transformantes foram identificados como ECL707-pKPl e ECL707-pKP2, por conterem o gene da glicerol desidratase e ECL707-pKP4 por conter o gene da diol desidratase. A E. coli AA2 0 0 gue contém uma mutação no gene tpi (Andersen et al., J. Gen. Microbiol. 62, 32 9 (1970)) foi adquirida na E. coli Genetic Stock Center, Yale

University (New Haven, CT) e foi transformada com o DNA cosmidico de Klebsiella para produzir os microorganismos recombinantes AA200-pKPl e AA200-pKP2, que contém o gene da glicerol desidratase, e AA200-pKP4, que contém o gene da diol desidratase. DH5a:

Seis placas de transformação contendo aproxima-damente 1,000 colónias de E. coli XLl-Blue MR transfectadas com o DNA da K. pneumoniae foram lavadas com 5 mL de meio LB e centrifugadas. As bactérias formaram pellet que foi 89 ΡΕ1204755 ressuspenso em 5 mL de meio LB + glicerol. Uma alíquota (50 μΐ) foi inoculada num tubo de 15 ml contendo meios sintético S12 com glicerol a 0,2% + vitamina B12 a 400 ng por mL + extracto de levedura a 0,00% + 50 amp. O tubo foi cheio com meio até perfazer o volume tapado com parafilme e incubado a 30 °C. Uma ligeira turvação foi observada após 48 h. As aliquotas, analisadas para a distribuição do produto como descrito acima às 78h e 132 h, foram positivas para o 1,3-propanodiol, os últimos tempos continham um aumento da quantidade de 1,3-propanodiol.

As bactérias, testadas positivamente para a produção de 1,3-propanodiol, foram diluídas seriadamente e plaqueadas em placas de LB-50 amp por forma a isolar colónias únicas. Quarenta e oito colónias únicas foram isoladas e testadas novamente relativamente à produção de 1,3-propanodiol. O DNA cosmídico foi isolado a partir de 6 clones independentes e transformado na estirpe DH5a de E. coli. O transformantes foram testados novamente relativamente à produção de 1,3-propanodiol. Dois transformantes foram seguidamente caracterizados e designados como DH5a-pKPl e DH5a-pKP2.

Um fragmento EcoRI-SalI de 12,1 kb do pKPl, subclonado em pIBI31 (IBI Biosystem, New Haven, CT) , foi sequenciado e denominado pHK28-26 (SEQ ID NO: 1). A sequenciação revelou os locais ("loci") das j anelas de leitura abertas relevantes do operão dha que codifica a 90 ΡΕ1204755 glicerol desidratase e os genes necessários para a regulação. Em referência à SEQ ID NO: 1, um fragmento da janela de leitura aberta de dhaKl que codifica a di-hidroxiacetona cinase foi encontrado nas bases 1-399 (complementar); a janela de leitura aberta de dhaD que codifica a glicerol desidrogenase foi encontrada nas bases 1010-2107; a janela de leitura aberta de dhaR que codifica o repressor foi encontrada nas bases 2209-4134; a janela de leitura aberta de orfW, que codifica uma proteina de função desconhecida foi encontrada nas bases 4112-4642 (complementar); a janela de leitura aberta de orfX que codifica uma proteina de reactivação da desidratase foi encontrada nas bases 4643-4996 (complementar); a janela de leitura aberta de dhaT que codifica a oxidoredutase de 1,3-propanodiol foi encontrada nas bases 5017-6180 (complementar); a janela de leitura aberta de orfY, que codifica uma proteina de função desconhecida foi encontrada nas bases 6202-6630 (complementar); a janela de leitura aberta de dhaBl que codifica a subunidade alfa da glicerol desidratase foi encontrada nas bases 7044-8711; a janela de leitura aberta de dhaB2 que codifica a subunidade beta da glicerol desidratase foi encontrada nas bases 8724-9308; a janela de leitura aberta de dhaB3 que codifica a subunidade gama da glicerol desidratase foi encontrada nas bases 9311-9736; a janela de leitura aberta de dhaBX, que codifica uma proteina da reactivação da desidratase foi encontrada nas bases 9749-11572; e um fragmento da janela de leitura aberta de glpF que codifica uma proteina que facilita o a absorção do glicerol foi encontrado nas bases 11626-12145. 91 ΡΕ1204755

As colónias isoladas de E. coli XLl-Blue MR transfectadas com o DNA cosmidico empacotado de K. pneumoniae foram inoculadas em poços de microtitulo contendo 200 μΐ de meio S15 (sulfato de amónio, 10 mM; tampão fosfato de potássio, pH 7,5, 1 mM; tampão MOPS/KOH, pH 7,0, 50 mM; MgCl2, 2 mM; CaCl2, 0,7 mM; MnCl2, 5 0 μΜ;

FeCl3, 1 μΜ; ZnCl, 1 μΜ; CuS04, 1,72 pM; C0CI2, 2,53 μΜ; Na2MoC>4, 2,42 μΜ; e hidrocloreto de tiamina, 2 pM) + glicerol a 0,2% + vitamina B12 a 400 ng/mL + extracto de levedura a 0,001% + ampicilina a 50 pg/mL. Adicionalmente aos poços de microtitulo, uma placa base contendo LB-50 amp foi também inoculada. Após 96 h, foram retirados 100 pL e centrifugados num tubo de microcentrifuga Rainin contendo um filtro de membrana de nylon de 0,2 micron. As bactérias ficaram retidas e o filtrado foi processado por análise de HPLC. Os clones positivos que demonstraram produção de 1,3-propanodiol foram identificados após o rastreio de aproximadamente 240 colónias. Foram identificados três clones positivos, dois dos quais tinham crescido em LB-50 amp e o outro não. Uma colónia única, isolada a partir de um dos dois clones positivos crescidos em LB-50 amp e verificada relativamente à produção de 1,3-propanodiol, foi designada como pKP4. O DNA cosmidico foi isolado a partir de estripes de E. coli contendo o pKP4 e a estirpe DH5a de E. coli foi transformada. Um transformante independente, designado como DH5a-pKP4, foi verificado relativamente à produção de 1,3-propanodiol. 92 ΡΕ1204755 ECL707 : A estirpe de E. coli ECL707 foi transformada com o DNA cosmidico de K. pneumoniae correspondendo a um dos pKPl, pKP2, pKP4 ou apenas ao vector Supercos e denominadas ECL7 0 7-pKPl, ECL707-pKP2, ECL707-pKP4, e ECL7 07-sc, respectivamente. A ECL7 07 é defectiva em glpK, gld, e em ptsD que codificam a glicerol cinase dependente de ATP, a glicerol desidrogenase ligada a NAD+, e a enzima II para a di-hidroxiacetona do sistema fosfotransferase dependente do fosfoenolpiruvato, respectivamente.

Vinte colónias únicas de cada transformação cosmidica e cinco da transformação apenas com o vector Supercos (controlo negativo), isoladas das placas LB-50 amp, foram transferidas para uma placa base LB-50 amp. Estes isolados foram testados também relativamente à sua capacidade de converter o glicerol em 1,3-propanodiol por forma a determinar se continham a actividade da desidratase. Os transformantes foram transferidos com um palito estéril para placas de microtítulo contendo 200 pL de Meio A suplementado quer com glicerol a 0,2% quer com glicerol a 0,2% mais D-glucose a 0,2%. Após a incubação durante 48 h a 30 °C, os conteúdos dos poços das placas de microtítulo foram filtrados através de um filtro de nylon de 0,45 mícron e cromatografados por HPLC. Os resultados destes testes são fornecidos na Tabela 2. ΡΕ1204755 93 TABELA 2

Conversão de glicerol em 1,3-propanodiol pela ECL707 __transformada_ glicerol mais transformante glicerol* glucose* ECL7 07-pKPl 19/20 19/20 ECL707-pKP2 18/20 20/20 ECL707-pKP4 0/20 20/20 ECL707-sc 0/5 0/5 *(Número de isolados positivos/número de isolados testados) AA200: A estirpe de E. coli AA200 foi transformada com o DNA cosmidico de K. pneumoniae correspondendo a um dos pKPl, pKP2, pKP4 ou apenas ao vector Supercos e denominadas ΑΑ2 0 0-ρΚΡ1, AA2 0 0-pKP2, AA200-pKP4, e AA200-sc, respecti-vamente. A estirpe AA200 é defectiva na triosefosfato isomerase (tpi~) .

Vinte colónias únicas de cada transformação cosmidica e cinco da transformação com o vector vazio foram isoladas e testadas relativamente à sua capacidade de converter o glicerol em 1,3-propanodiol como descrito para a estirpe de E. coli ECL707. Os resultados destes testes são fornecidos na Tabela 3. ΡΕ1204755 94 TABELA 3

Conversão de glicerol em 1,3-propanodiol pela AA200 _transformada_ glicerol mais transformante glicerol* glucose AA200-pKPl 17/20 17/20 AA200-pKP2 17/20 17/20 AA200-pKP4 2/20 16/20 AA2 0 0-s c 0/5 0/5 *(Número de isolados positivos/número de isolados testados) EXEMPLO 2

MANIPULAÇÃO DE MUTANTES DA GLICEROL CINASE DE E. COLI FM5 PARA PRODUÇÃO DE GLICEROL A PARTIR DE GLUCOSE

Construção de um plasmídeo de integração para a substituição do gene da glicerol cinase em E. coli FM5:

O DNA genómico de E. coli FM5 (ATCC 53911) foi preparado utilizando o Kit da Puregene de Isolamento de DNA (Gentra Systems, Minneapolis, MN) . Um fragmento de DNA de 1,0 kb contendo genes parciais de glpF e da glicerol cinase (glpK) foi amplificado por PCR (Mullis and Faloona, Methods Enzymol. 155, 335 (1987)) a partir de DNA genómico de FM5 utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 2 e da SEQ ID NO: 3. Um fragmento de DNA de 1,1 kb contendo genes parciais de glpK e de glpX foi amplificado por PCR a partir de DNA 95 ΡΕ1204755 genómico de FM5 utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 4 e da SEQ ID NO: 5. Foi incorporado um sítio Muni no iniciador da SEQ ID NO: 4. A extremidade 5' do iniciador da SEQ ID NO: 4 foi o complementar reverso do iniciador da SEQ ID NO: 3 para permitir a sobreposição subsequente da extensão do PCR. O processamento ("splicing") do gene pela técnica de sobreposição da extensão (Horton et al., BioTechniques 8, 528 (1990)) foi utilizado para criar um fragmento de 2,1 kb por PCR utilizando os dois fragmentos de PCR acima como moldes e os iniciadores da SEQ ID NO: 2 e da SEQ ID NO: 5. Este fragmento representa uma delecção de 0,8 kb da região central do gene de glpK de 1,5 kb. A pesar de tudo, este fragmento contém regiões flanqueadoras de 1,0 kb e de 1,1 kb de cada lado do sitio de clonagem Muni (dentro do glpK parcial) para permitir a substituição do gene cromossomal por recombinação homóloga. O fragmento de PCR de 2,1 kb acima foi cegado ("blunt-ended") (utilizando a nuclease mung bean) e clonado no vector pCR-Blunt utilizando o Kit de Clonagem Zero Blunt PCR (Invitrogen, San Diego, CA) para formar o plasmídeo pRNIOO de 5,6 kb contendo os genes de resistência à canamicina e à zeocina. O fragmento HincII de 1,2 kb de pLoxCatl (resultados não publicados), contendo um gene de resistência ao cloranfenicol flanqueado pelos sítios loxP do bacteriófago Pl (Snaith et al., Gene 166, 173 (1995)), foi utilizado para interromper o fragmento glpK no plasmídeo pRNIOO ligando-o ao plasmídeo pRNIOO digerido com Muni (e cegado) para conceber o plasmídeo pRN101-l de 6, 9 96 ΡΕ1204755 kb. Um fragmento de 37 6 pb contendo a origem R6K foi amplificado por PCR a partir do vector pGP704 (Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988)) utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 6 e da SEQ ID NO: 7, cegados, e ligados ao fragmento Aspll8-AatII de 5,3 kb (que foi cegado) a partir do pRN101-l para formar o plasmídeo pRN102-l de 5,7 kb contendo os genes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol. A substituição da região da origem ColEl no pRN101-l pela origem R6K para formar o pRN102-l envolveu também a delecção da maior parte do gene de resistência à zeocina. O hospedeiro para a replicação de pRN102-l foi a E. coli SY327 (Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988)) que contém o gene pir necessário para a função da origem R6K.

Manipulação do mutante da glicerol cinase RJFIOm com o gene da resistência ao cloranfenicol interrompido: A E. coli FM5 foi electrotransformada com o plasmideo de integração não replicativo pRN102-l e os transformantes que eram resistentes ao cloranfenicol (12,5 yg/mL) e sensiveis à canamicina (30 yg/mL) foram seguidamente rastreados relativamente à não utilização de glicerol em meio mínimo M9 contendo glicerol a 1 mM. Uma digestão com EcoRI do DNA genómico de um mutante, RJFIOm, quando testada com o gene intacto de glpK via análise por Southern (Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)) indicou que era um integrante de duplo cruzamento (substituição do gene glpK) desde que fossem observadas as 97 ΡΕ1204755 duas bandas esperadas de 7,9 kb e 2,0 kb, devido à presença de um sítio £7coRI adicional dentro do gene de resistência ao cloranfenicol. O controlo da estirpe selvagem produziu a única banda de 9,4 kb esperada. Uma análise de NMR de 13C do mutante RJFIOm confirmou que este era incapaz de converter o glicerol marcado com o 13C e o ATP em glicerol-3-fosfato. Este mutante de glpK foi seguidamente analisado através de PCR genómico utilizando combinações de iniciadores da SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, da SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11, e da SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 11 as quais originam os fragmentos de PCR esperados de 2,3 kb, 2,4 kb, e 4,0 kb respectivamente. O controlo da estirpe selvagem origina a banda de 3,5 kb esperada com os iniciadores da SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 11. O mutante RJFIOm de glpK foi electrotransformado com o plasmídeo pAH48 para permitir a produção de glicerol a partir da glucose. O mutante de E. coli RJFIOm de glpK foi depositado no ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste de 24 de Novembro de 1997.

Manipulação do mutante da glicerol cinase RJF10 com o gene da resistência ao cloranfenicol interrompido removido:

Após o crescimento durante a noite em meio YENB (extracto de levedura a 0,75%, caldo de nutrientes a 0,8%) a 37 °C, a E. coli RJFIOm numa suspensão de água foi electrotransformada com o plasmídeo pJW168 (resultados não publicados), que contém o gene da recombinase Cre do bacteriófago PI sob o controlo do promotor IacUV5 induzível 98 ΡΕ1204755 por IPTG, um replicão pSClOl sensível à temperatura, e um gene de resistência à ampicilina. Após crescimento em meio SOC a 30 °C, os transformantes foram seleccionados a 30 °C (temperatura permissiva para a replicação de pJW168) em meio LB com agar suplementado com carbenicilina (50 yg/mL) e IPTG (1 mM) . Foram efectuadas duas transferências em série durante a noite de colónias agrupadas em meio LB com agar fresco suplementado com carbenicilina e IPTG a 30 °C por forma a permitir a excisão do gene cromossomal de resistência ao cloranfenicol via recombinação nos sítios loxP mediada pela recombinase Cre (Hoess and Abremski, J. Mol. Biol. 181, 531-362 (1985)). As colónias resultantes foram repicadas para placas com meio LB com agar suplementado com carbenicilina e IPTG e para LB com agar suplementado com cloranfenicol (12,5 yg/mL) para identificar as colónias que eram resistentes a carbenicilina e sensíveis ao cloranfenicol indicando a remoção do gene marcador. Foi utilizada uma cultura crescida durante a noite a 30 °C de uma destas colónias para inocular 10 ml de meio LB. Após crescerem a 30 °C até uma OD (600 nm) de 0,6 AU a cultura foi incubada a 37 °C durante a noite. Foram plaqueadas diversas diluições em meio LB com agar pré-aquecido e as placas foram incubadas durante a noite a 42 °C (temperatura não permissiva para a replicação de pJW168). As colónias resultantes foram repicadas para placas com meio LB com agar e para meio LB com agar suplementado com carbenicilina (75 yg/mL) para identificar as colónias que eram resistentes à carbenicilina indicando a perda do plasmídeo pJW168. Um destes mutantes de glpK, o 99 ΡΕ1204755 RJF10, foi posteriormente analisado através de PCR genómico utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 11 e originando a banda de 3,0 kb esperada que confirma a excisão do gene marcador. A não utilização e glicerol pelo mutante RJF10 foi confirmada pela ausência de crescimento no meio minimo M9 contendo 1 mM de glicerol. O mutante RJF10 de glpK foi electrotransformado com o plasmideo pAH48 para permitir a produção de glicerol a partir da glucose. EXEMPLO 3

CONSTRUÇÃO DE ESTIRPES DE E. COLI COM O GENE KNOCKOUT gldA O gene gldA foi isolado a partir da E. coli por PCR (K. B. Mullis and F. A. Faloona, Meth. Enzymol. 155, 335-350 (1987)) utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 12 e da SEQ ID NO: 13, que incorporam os sítios terminais Sphl e Xbal, respectivamente, e clonado (T. Maniatis (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, NY) entre os sítios Sphl e Xbal em pUC18, para criar pKP8. O pKP8 foi cortado nos sítios Sall e Ncol únicos dentro do gene gldA, as extremidades foram preenchidas com Klenow e religadas, resultando numa delecção de 109 pb no meio de gldA e na regeneração de um sitio Sall único, para originar pKP9. Um fragmento de DNA de 1,4 kb contendo o gene que confere resistência à canamicina (kan) , e incluindo cerca de 400 pb de DNA a montante do codão de iniciação traducional e cerca de 100 pb de DNA a jusante do codão de terminação traducional, foi 100 ΡΕ1204755 isolado a partir de pET-28a(+) (Novagen, Madison, Wis) por PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, que incorporam os sitios Sall terminais, e subclonado no sítio Sall único de pKP9, para formar pKP13. Um fragmento de DNA de 2,1 kb que começa 204 pb a jusante do codão de iniciação traducional de gldA e acaba 178 pb a montante do codão de terminação traducional de gldA, e contendo a inserção kan, foi isolado por PCR a partir de pKP13 utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17, que incorporam os sitios Sphl e Xbal terminais, respectivamente, foi subclonado entre os sitios Sphl e Xbal em pMAK705 (Genencor International, Paio Alto, CA), para originar pMP33. A E. coli FM5 foi transformada com pMP33 e seleccionada em kan a 20 yg/mL a 30 °C, que é a temperatura permissiva para a replicação de pMAK705. Uma colónia foi crescida durante a noite a 30 °C em meio líquido suplementado com kan a 20 yg/mL. Foram plaqueadas aproximadamente 32,000 células em kan a 20 yg/mL e incubadas durante 16 h a 44 °C, que é a temperatura restritiva para a replicação de pMAK705. Os transformantes que cresceram a 44 °C possuem o plasmídeo integrado no cromossoma, ocorrendo a uma frequência de aproximadamente 0, 0001. As análises por PCR e de Southern blot (E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)) foram utilizadas para determinar a natureza dos eventos de integração cromossomal nos transformantes. A análise por Western blot (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Scl. 76, 4350 (1979)) foi utilizada para determinar se a proteína glicerol desidrogenase, o produto de gldA, é produzida nos 101 ΡΕ1204755 transformantes. Foi utilizado um ensaio de actividade para determinar se a actividade da glicerol desidrogenase permanece nos transformantes. A actividade em bandas de glicerol desidrogenase em géis nativos foi determinada por acopulação da conversão de glicerol mais NAD+ em di- hidroxiacetona mais NADH com a conversão de um corante tetrazólio, MTT [brometo de 3- (4,5-dimetil-tiazol -2-il)- 2,5-difenil-tetrazólio] num formazano intensamente colorido, com metossulfato de fenazina como mediador. A glicerol desidrogenase requer também a presença de sulfato de amónio a 30 mM e de Tris a 100 mM, pH 9 (Tang et al., J. Bacteriol. 140, 182 (1997)). De 8 transformantes anali sados, seis foram designados para se tornarem knockout de gldA. A E. coli MSP33.6 foi depositada no ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste de 24 de Novembro de 1997. EXEMPLO 4

CONSTRUÇÃO DE UMA ESTIRPE DE E. COLI COM OS GENES KNOCKOUT DE qlpK E gldA

Um fragmento de DNA de 1,6 kb contendo o gene gldA e incluindo 22 8 pb de DNA a montante do codão de iniciação traducional e 220 pb de DNA a jusante do codão de terminação traducional foi isolado a partir de E. coli por PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, que incorporam os sitios Sphl e Xbal terminais, respectivamente, e clonados entre os sitios Sphl e Xbal de pUC18, para originar pQN2. O pQN2 foi cortado nos sitios 102 ΡΕ1204755

Sall e Ncol únicos dentro do gene gldA, as extremidades foram preenchidas com Klenow e religadas, resultando numa delecção de 10 9 pb no meio de gldA e na regeneração de um sitio Sall único, para originar pQN4. Um fragmento de DNA de 1,4 kb contendo o gene que confere resistência à canamicina (kan), e flanqueado por sitios loxP foi isolado a partir de pLoxKan2 (Genencor International, Paio Alto, CA) como um fragmento Stul/Xhol, as extremidades foram preenchidas com Klenow, e subclonado em pQN4 no sítio Sall após o preenchimento com Klenow, para criar pQN8. Um fragmento de DNA de 0,4 kb contendo a origem de replicação R6K foi isolado a partir de pGP704 (Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988)) por PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 20 e da SEQ ID NO: 21, que incorporam os sitios Sphl e Xbal terminais, respecti-vamente, e ligado ao fragmento de DNA de 2,8 kb Sphl/Xbal contendo a cassete gldA::kan de pQN8, para origina pKP22. um fragmento de DNA de 1,0 kb contendo o gene que confere resistência ao cloranfenicol (cam) e flanqueado pelos sitios loxP foi isolado a partir de pLoxCat2 (Genencor International, Paio Alto, CA) como um fragmento Xbal, e subclonado em pKP22 no sitio Xbal, para originar pKP23. A estirpe de E. coli RJF10 (ver Exemplo 2), que é glpK-, foi transformada com pKP23 e os transformantes com o fenótipo kanRcamS foram isolados, indicando a integração do duplo cruzamento, o que foi confirmado por análise por Southern blot. Os ensaios de actividade em gel da glicerol desidrogenase (como descrito no Exemplo 3) demonstraram que a glicerol desidrogenase activa não estava presente nestes 103 ΡΕ1204755 transformantes. O marcador kan foi removido do cromossoma utilizando o plasmideo produtor de Cre pJW168, como descrito no Exemplo 2, para produzir a estirpe KLP23. Diversos isolados com o fenótipo kanS não demonstraram a actividade da glicerol desidrogenase, e a análise por Southern blot confirmou a perda do marcador kan. EXEMPLO 5 CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEO E CONSTRUÇÃO DE ESTIRPE PARA A EXPRESSÃO DA GLICEROL-3-FOSFATO DESIDROGENASE (DAR1) E/OU DA GLICEROL-3-FOSFATASE (GPP2)

Construção de cassetes de expressão para a glicerol-3-fosfatase (gpp2): O clone lamda 6592 do cromossoma V de Saccha-romyces cerevisiae (GenBank, acesso #U18813xll) foi obtido a partir do ATCC. O gene (GPP2) da fosfatase do glicerol-3-fosfato foi clonado por clonagem a partir do clone lamda como DNA alvo utilizando iniciadores sintéticos (SEQ ID NO: 22 com SEQ ID NO: 23) incorporando um sitio BamHI-RBS-Xbal na extremidade 5' e um sitio Smal na extremidade 3'. O produto foi subclonado em pCR-Script (Stratagene, Madison, WI) no sitio Srfl para formar o plasmideo pAH15 contendo o GPP2. O plasmideo pAH15 contém o gene GPP2 na orientação inactiva para expressão a partir do promotor lac em pCR-Script SK+. O fragmento BamHI-Smal de pAHl5 contendo o gene GPP2 foi inserido em pBlueScriptII SK+ para formar o pias- 104 ΡΕ1204755 mídeo pAHl9. O pAH19 contém o gene GPP2 na orientação cor-recta para expressão a partir do promotor lac. O fragmento Xbal-PstI de pAH19 contendo o gene GPP2 foi inserido no pPHOX2 para formar o plasmídeo pAH21. O pAH21/DH5ct é o plasmideo de expressão.

Construção de cassetes de expressão para a glicerol-3-fosfato desidrogenase (PARI): O DARl foi isolado a partir da clonagem por PCR de DNA genómico de S. cerevisiae utilizando iniciadores sintéticos (SEQ ID NO: 24 com SEQ ID NO: 25) . A clonagem por PCR bem sucedida coloca um sitio Ncol na extremidade 5' de DARl onde o ATG dentro de Ncol é a metionina iniciadora de DARl. Na extremidade 3' de DARl é introduzido um sitio BamHI a seguir ao terminador da tradução. Os fragmentos de PCR foram digeridos com Ncol + BamHI e clonados nos mesmos sitios dentro do plasmideo de expressão pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, NJ) para originar pDARlA.

De forma a criar um sitio de ligação ao ribossoma melhor na extremidade 5' de DARl, foi inserido um linker ("ligador") Spel-RBS-Ncol obtido por emparelhamento de iniciadores sintéticos (SEQ ID NO: 26 com SEQ ID NO: 27) no sitio Ncol de pDARlA para formar pAH40. O plasmideo pAH40 contém o novo RBS e o gene DARl na orientação correcta para a expressão a partir do promotor trc de pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, NJ) . O fragmento NcoI-BamHI de pDARlA e um segundo conjunto do linker ("ligador") Spel-RBS-Ncol obtido 105 ΡΕ1204755 por emparelhamento de iniciadores sintéticos (SEQ ID NO: 28 com SEQ ID NO: 29) foram inseridos no sitio Spel-BamHI de pBC-SK+ (Stratagene, Madison, WI) para formar o plasmideo pAH42. O plasmideo pAH42 contém um gene de resistência ao cloranfenicol.

Construção de cassetes de expressão para darl e gpp2:

As cassetes de expressão para DAR1 e GPP2 foram adicionadas a partir dos subclones individuais de DARl e GPP2 descritos acima utilizando métodos de biologia molecular Standard. O fragmento BamHI-PstI de pAH19 contendo o sitio de ligação ribossomal (RBS) e o gene GPP2 foram inseridos em pAH40 para originar pAH43. O fragmento BamHI-PstI de pAH19 contendo o RBS e o gene GPP2 foram inseridos em pAH42 para originar pAH45. O sitio de ligação ribossomal na extremidade 5' de GPP2 foi modificado da seguinte forma. Foi inserido um linker ("ligador") BamHI-RBS-Spel, obtido por emparelhamento dos iniciadores sintéticos GATCCAGGAAACAGA (SEQ ID NO: 30) e CTAGTCTGTTTCCTG (SEQ ID NO: 31) ao fragmento Xbal-PstI de pAH19 contendo o gene GPP2, no sitio BamHI-PstI de pAH40 para criar pAH48. O plasmideo pAH48 contém o gene de DARI, o RBS modificado, e o gene GPP2 na orientação correcta para expressão a partir do promotor trc de pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, NJ). 106 ΡΕ1204755

Transformação de E. coli:

Os plasmídeos descritos aqui foram transformados em E. coli DH5a, FM5 e em KLP23 utilizando técnicas de biologia molecular Standard. Os transformantes foram verificados pelo seu padrão de DNA RFLP. EXEMPLO 6

CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO PARA UTILIZAÇÃO NA TRANSFORMAÇÃO DE ESCHERICHIA COLI COM GENES DO REGULÃO dha DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE

Construção do vector de expressão pTacIQ: O vector de expressão pTacIQ de E. coli foi preparado pela inserção do gene laclq (Farabaugh, Nature 274 (5673), 765-769 (1978)) e do promotor tac (Amann et al., Gene 25, 167-178 (1983)) no sitio de restrição da endonuclease EcoRI do pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43, 77-90 (1979)). Um sitio de clonagem múltipla e a sequência terminadora (SEQ ID NO: 32) substituem a sequência de EcoRI até Sphl do pBR322.

Subclonagem dos genes da glicerol desidratase (dhaBl, 2, 3, X) : A janela de leitura aberta para o gene dhaB3 foi amplificada a partir de pHK28-26 por PCR utilizando inicia- 107 ΡΕ1204755 dores (SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34) incorporando um sítio EcoRI na extremidade 5' e um sítio Xbal na extremidade 3'. O produto foi subclonado em pLitmus29 (New England Biolab, Inc. Beverly, MA) para originar o plasmídeo pDHAB3 contendo o dhaB3. A região contendo toda a região codificante de dhaBl, dhaB2, dhaB3 e dhaBX do operão dhaB de pHK28-26 foi clonado no pBluescriptIIKS+ (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando as enzimas de restrição Kpnl e EcoRI para criar o plasmídeo pM7. O gene dhaBX foi removido pela digestão do plasmídeo pM7 com Apal e Xbal, purificando o fragmento de 5,9 kb e ligando-o com o fragmento Apal-Xbal de 325 pb do plasmídeo pDHAB3 para formar pMll, contendo dhaBl, dhaB2 e dhaB3. A janela de leitura aberta para o gene dhaBl foi amplificada a partir de pHK28-26 por PCR utilizando iniciadores (SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36) que incorporam um sítio HindIII e um sítio de ligação ao ribossoma consensus na extremidade 5' e um sítio Xbal na extremidade 3'. O produto foi subclonado em pLitmus28 (New England Biolab, Inc. Beverly, MA) para originar o plasmídeo pDTl contendo o dhaBl.

Um fragmento NotI-Xbal de pMll contendo parte do gene dhaBl, do gene dhaB2, do gene dhaB3 foi inserido em 108 ΡΕ1204755 pDTl para formar o plasmídeo de expressão de dhaB, pDT2. O fragmento HindIII-Xbal contendo os genes dhaB (1, 2, 3) de pDT2 foi inserido em pTacIQ para formar pDT3.

Subclonagem do gene da desidrogenase de 1,3-propanodiol (dhaT) : 0 fragmento Kpnl-SacI de pHK28-26, contendo o gene da desidrogenase de 1,3-propanodiol (dhaT), foi subclonado em pBluescriptII KS+ criando o plasmídeo pAHl. O gene dhaT foi amplificado por PCR a partir de pAHl como DNA molde e de iniciadores sintéticos (SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38) que incorporam um sítio Xbal na extremidade 5' e um sítio BamHI na extremidade 3'. O produto foi subclonado em pCR-Script (Stratagene) no sítio Srfl para criar os plasmídeos pAH4 e pAH5 contendo dhaT. O plasmídeo pAH4 contém o gene dhaT na orientação correcta para a expressão a partir do promotor lac em pCR-Script e o pAH5 contém o gene dhaT na orientação oposta. O fragmentos Xbal-BamHI de pAH4 que contém o gene dhaT foi inserido em pTacIQ para criar o plasmídeo pAH8. O fragmento HindII-BamHI de pAH8 que contém o RBS e o gene de dhaT foi inserido em pBluescriptIIKS+ para criar pAHll.

Construção de uma cassete de expressão para dhaT e dhaB (1, 2, 3) :

Uma cassete de expressão para dhaT e dhaB (1, 2, 3) foi adicionada a partir dos subclones individuais de dhaB (1, 2, 3) e de dhaT descritos anteriormente utilizando 109 ΡΕ1204755 métodos de biologia molecular Standard. Um fragmento Spel-SacI contendo os genes de dhaB (1, 2, 3) do pDT3 foi inserido em pAHll nos sitios Spel-SacI para originar pAH24. Foi inserido um linker ("ligador") Sall-Xbal (SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40) em pAH5 que foi digerido com as enzimas de restrição Sall-Xbal para criar pDT16. O linker ("ligador") destrói o sítio Xbal. O fragmento SalI-MluI de 1 kb de pDTlô foi então inserido em pAH24 substituindo o fragmento

SalI-MluI existente para criar pDT18. 0 pDT21 foi construído inserindo o fragmento Sall-Notl de pDT18 e o fragmento NotI-Xbal de pM7 em pLC1920 (SEQ ID NO: 41). A sequência do promotor da glucose isomerase de Streptomyces (SEQ ID NO: 42) foi clonada por PCR e inserida nos sitios EcoRI-HinDIII de pLitmus28 para construir pDT5. O pLC1925 foi construído inserindo o fragmento EcoRI-PvuII de pDT5 no sítio EcoRI-PvuI de pLC1920. O pDT24 foi construído clonando o fragmentos HinDIII-MluII de pDT21 e o fragmento Mlul-Xbal de pDT21 nos sítios HinDIII-Xbal de pLC1925.

Construção de uma cassete de expressão para dhaT e dhaB (1, 2, 3, X) : O pDT21 foi construído por inserção do fragmento Sall-Notl de pDT18 e do fragmentos NotI-Xbal de pM7 em pLC1920 (SEQ ID NO: 41). A sequência do promotor da glucose isomerase de Streptomyces (SEQ ID NO: 42) foi clonada por PCR e inserida nos sítios EcoRI-HinDIII de pLitmus28 para construir o pDT5. O pLCl925 foi construído inserindo o fragmento EcoRI-PvuII de pDT5 no sítio EcoRI-PvuI de pLCl920. O pDT24 foi construído clonando o fragmentos 110 ΡΕ1204755

HinDIII-MluII de pDT21 e o fragmento Mlul-Xbal de pDT21 nos sítios HinDIII-Xbal de pLC1925.

Construção de uma cassete de expressão para dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfw e dhaB (1, 2, 3, X) : O pDT29 foi construindo pela inserção do fragmento SacI-EcoRI de pHK28-26 nos sítios SacI-EcoRI de pLCl925.

Construção de uma cassete de expressão para dhaR, orfY, orfX, orfW e dhaB (1, 2, 3, X) :

Foi construído um derivado do plasmídeo pDT29 no qual todos excepto os primeiros 5 e os últimos 5 codões (mais o codão de terminação) do gene dhaT foram delectados por uma técnica conhecida como PCR - mediada pela sobreposição da extensão. Utilizando o pDT29 como molde, 2 produtos de PCR primários foram criados utilizando os seguintes iniciadores: SEQ ID NO: 43 = 5'GAC GCA ACA GTA TTC CGT CGC3'; SEQ ID NO: 44 = 5 ' ATG AGC TAT CGT ATG TTC CGC CAG GCA TTC TGA GTG TTA AGC3'; SEQ ID NO: 45 = 5' GCC TGG CGG AAC ATA CGA TAG CTC ATA ATA TAC3'; SEQ ID NO: 46 = 5'CGG GGC GCT GGG CCA GTA CTG3'/ A SEQ ID NO: 45 foi agrupada com a SEQ ID NO: 46 para originar um produto de 931 pb e que engloba o ácido nucleico que inclui 5' dhaBl (para o único sítio Seal), 111 ΡΕ1204755 todo o orfY, e os primeiros cinco codões de dhaT. A SEQ ID NO: 43 foi agrupada com a SEQ ID NO: 44 para criar um produto de 1348 pb e que engloba o ácido nucleico que inclui os últimos cinco codões (mais o codão de terminação) de dhaT, todo o orfX, todo o orfW, e o 5' dhaR (para o único sitio Seal). As 15 bases na extremidade 5' da SEQ ID NO: 44 constituem uma extremidade que é a complementar inversa de uma porção de 15 bases da SEQ ID NO: 45. Similarmente, as 11 bases na extremidade 5' da SEQ ID NO: 45 constituem uma extremidade que é a complementar inversa de uma porção de 11 bases da SEQ ID NO: 44. Assim, os dois produtos de PCR primários foram agrupados após o emparelhamento (via a sobreposição da extremidade de 26 pb) e extensão por PCR, para criar um terceiro produto de ácido nucleico de 2253 pb. Este terceiro produto de PCR foi digerido com SapI e Seal e ligado ao pDT2 9 que foi também digerido com SapI e Seal, para formar o plasmideo pKP32, que é idêntico ao pDT29, excepto no comprimento, na delecção em fase dentro de dhaT. EXEMPLO 7 CONVERSÃO DE GLUCOSE EM 1,3-PROPANODIOL UTILIZANDO A ESTIRPE DE E. COLI KLP23/pAH48/pDT29 E O PROCESSO MELHORADO UTILIZANDO KLP23/ pAH48/pKP32

Pré-Cultura: A KLP23/pAH48/pDT29 e a KLP23/pAH48/pKP32 foram colocadas em pré-culturas para inocular um fermentador com 112 ΡΕ1204755 meio 2YT (extracto de levedura a 10 g/L, triptona a 16 g/L, e NaCl a 10 g/L) contendo carbenicilina (ou ampicilina) a 200 mg/L e espectinomicina a 50 mg/L. A KLP23/pAH48/pKP32 é idêntica à KLP23/pAH48/pDT29 excepto que o dhaT está delectado.

As culturas foram iniciadas a partir de stocks congelados (DMSO a 10% como crioprotector) em 500 mL de meio num Erlenmeyer de 2 L, cultivadas a 35 °C num agitador a 250 rpm até a uma OD55o de aproximadamente 1,0 AU ser atingida e utilizada para inocular o fermentador.

Meio de fermentação:

Os seguintes componentes foram esterilizados juntamente no recipiente de fermentação: 45 g de ΚΗ2Ρ04, 12 g de ácido cítrico, 12 g de MgS04.7H20, 30 g de extracto de levedura, 2,0 g de citrato de amónio ferroso, 5 mL de Mazu DF204 como antiespuma, 1,2 g de CaCl2.2H20, e 7,3 ml de ácido sulfúrico. O pH foi aumentado até 6,8 com NH4OH ente 20-28% e foram adicionados os seguintes componentes: 1,2 carbenicilina ou ampicilina, 0,30 g de espectinomicina, 60 mL de uma solução de elementos traço e de glucose (a partir de uma alimentação de 60-67% peso). Após a inoculação, o volume era de 6,0 L e a concentração da glucose foi de 10 g/L. A solução de elementos traço continha (g/L): ácido cítrico.Η20 (4,0),

MnS04.H20 (3,0), NaCl (1,0), FeS04.7H20 (0,10), CoC12.6H20 (0,10), ZnS04.7H20 (0,10), CuS04.5H20 (0,010), H3BO3 (0,010), e Na2Mo04.2H20 (0,010) . 113 ΡΕ1204755

Crescimento da fermentação:

Um fermentador de 15 L com agitação foi preparado com o meio descrito acima. A temperatura foi controlada nos 35 °C e foi utilizada amónia aquosa (20-28 % peso) para controlar o pH a 6,8. Os valores iniciais para a taxa de fluxo de ar (determinado para valores mínimos Standard de entre 6 e 12 litros por min) e da velocidade de agitação (fixada para valores mínimos de entre 350 e 690 rpm) foram determinado para que o controlo do oxigénio dissolvido (OD) fosse iniciado quando os valores da TCO atingissem aproximadamente 140 mmol/L/h. A pressão de retorno foi controlada a 0,5 bar. O controlo do OD foi fixado a 10%. Excepto para valores menores, a glucose foi mantida entre 0 g/L e 10 g/L com uma alimentação de 60% ou 67% (p/p) . Foi adicionada a vitamina Bi2 ou a coenzima B12 como descrito em baixo.

Fermentação com KLP23/pAH48/pDT29:

Um resumo da fermentação representativa da conversão da glucose em 1,3-propanodiol (1,3-PD) utilizando a estirpe de E. coli KLP23/pAH48/pDT29 é fornecido na Tabela 4. A vitamina B12 (0,075 g/L, 500 mL) foi alimentada, 3 h após o início da inoculação, a uma taxa de 16 mL/h. O rendimento do 1,3-propanodiol foi de 24% (p/p) (g de 1,3-propanodiol/g de glucose consumida) e foi obtido um título de 1,3-propanodiol de 68 g/L. ΡΕ1204755 114 TABELA 4

Resumo da fermentação representativa da conversão da glucose em 1,3-propanodiol (1,3-PD) utilizando a estirpe de _E. coli KLP23/pAH4 8/pDT2 9_

Tempo (h) OD550 (AU) OD (%) Glucose (g/L) Glicerol (g/L) 1,3-PD (g/L) 0 0 150 12, 9 0,0 0 6 17 80 8,3 3,1 1 12 42 53 2,8 12,5 9 18 98 9 5,7 12, 6 32 24 136 11 32,8 12,0 51 30 148 10 12,3 13, 3 62 32 152 11 12,5 14,3 65 38 159 11 1,5 17,2 68 Foram obtidos resultados similares com uma ali- mentação idêntica de vitamina B12 até duas vezes a concen- tração ou as adições de bolus de vitamina B12 ao longo do curso tempo da fermentação. O maior titulo obtido foi de 77 g/L.

Fermentação melhorada com KLP23/pAH48/pKP32:

Um resumo da fermentação representativa da conversão da glucose em 1,3-propanodiol (1,3-PD) utilizando a estirpe de E. coli KLP23/pAH48/pKP32 é fornecido na Tabela 5. A vitamina B12 (0,150 g/L, 500 mL) foi alimentada, 3 h após o inicio da inoculação, a uma taxa de 16 mL/h. Após 36 h, aproximadamente 2 L de meio de 115 ΡΕ1204755 fermentação foi purgado por forma a permitir a adição continuada da alimentação da glucose. O rendimento do 1,3-propanodiol foi de 26% (p/p) (g de 1,3-propanodiol/g de glucose consumida) e foi obtido um titulo de 1,3-propanodiol de 112 g/L. TABELA 5

Resumo da fermentação representativa da conversão melhorada da glucose em 1,3-propanodiol (1,3-PD) utilizando a estirpe _de E. coli KLP2 3/pAH4 8/pKP32_

Tempo (h) OD550 (AU) OD (%) Glucose (g/L) Glicerol (g/L) 1,3-PD (g/L) 0 0 148 12,8 0,0 0 6 22 84 6,9 3,3 0 12 34 90 9,7 10,4 7 18 66 43 9,3 5,9 24 24 161 9 0,2 2,5 46 30 200 10 0,2 6, 0 67 36 212 10 1,2 9,7 88 42 202 2 0,1 15, 5 98 48 197 12 1,2 23, 8 112 Foram obtidos resultados similares com uma ali- mentação idêntica de vitamina B12 até metade da concen- tração ou das adições de bolus de vitamina B12 ao longo do curso tempo da fermentação. O maior titulo obtido foi de 114 g/L. ΡΕ1204755 116 EXEMPLO 8

MANIPULAÇAO DO MUTANTE DA TRIOSEFOSFATO ISOMERASE DE E. COLI KLP23 PARA A PRODUÇÃO AUMENTADA DO 1,3-PROPANODIOL A PARTIR DE GLUCOSE

Construção do plasmideo para a substituição do gene da triosefosfato isomerase em E. coli KLP23: O DNA genómico de E. coli KLP23 foi preparado utilizando o Kit da Puregene de Isolamento de DNA (Gentra Systems, Minneapolis, MN). Um fragmento de DNA de 1,0 kb contendo cdh e extremidade 3' dos genes da triosefosfato isomerase (tpiA) foi amplificado por PCR (Mullis and Faloona, Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987)) a partir de DNA genómico de KLP23 utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 47 e da SEQ ID NO: 48. Um fragmento de DNA de 1,0 kb contendo a extremidade 5' dos genes tpiA, yiiQ, e a extremidade 5' do gene yiiR foi amplificado por PCR a partir de DNA genómico de KLP23 utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 49 e da SEQ ID NO: 50. Foi incorporado um sitio Seal no iniciador da SEQ ID NO: 49. A extremidade 5' do iniciador da SEQ ID NO: 49 foi o complementar reverso do iniciador da SEQ ID NO: 48 para permitir a sobreposição subsequente da extensão do PCR. O processamento ("splicing") do gene pela técnica de sobreposição da extensão (Horton et al., BioTechniques 8, 528-535 (1990)) foi utilizado para criar um fragmento de 2,0 kb por PCR utilizando os dois fragmentos de PCR acima como moldes e os iniciadores da SEQ ID NO: 47 e da SEQ ID NO: 50. Este 117 ΡΕ1204755 fragmento representa uma delecção de 73% do gene estrutural tpiA de 768 pb. A pesar de tudo, este fragmento contém regiões flanqueadoras de 1,0 kb de cada lado do sítio de clonagem Seal (dentro do tpiA parcial) para permitir a substituição do gene cromossomal por recombinação homóloga. O fragmento de PCR acima de 2,0 kb cegado ("blunt-ended") foi clonado no vector pCR-Blunt utilizando o Kit de Clonagem Zero Blunt PCR (Invitrogen, San Diego, CA) para formar o plasmídeo pRN106-2 de 5,5 kb contendo os genes de resistência à canamicina e à zeocina. O fragmento HincII de 1,2 kb de pLoxCatl (resultados não publicados), contendo um gene de resistência ao cloranfenicol flanqueado pelos sítios loxP do bacteriófago PI (Snaith et al., Gene 166, 173-174 (1995)), foi utilizado para interromper o fragmento tpiA no plasmídeo pRN106-2 ligando-o ao plasmídeo pRN106-2 digerido com Seal para conceber o plasmídeo pRN107-l de 6,8 kb.

Manipulação do mutante da triosefosfato isomerase RJ8m por transformação com DNA linear:

Utilizando o pRN107-l como molde e os iniciadores da SEQ ID NO: 47 e da SEQ ID NO: 50, o fragmento de 3,2 kb contendo as regiões flanqueadoras de tpiA e a cassete de loxP-CmR-loxP foi amplificado por PCR e extraído em gel. A E. coli KLP23 foi electrotransformada com até cerca de 1 yg deste fragmento de DNA linear de 3,2 kb e os transformantes que eram resistentes ao cloranfenicol (12,5 yg/mL) e sensíveis à canamicina (30 yg/mL) foram seguidamente 118 ΡΕ1204755 rastreados em meio minimo M9 para utilização escassa de glucose em glucose a 1 mM, para utilização normal de gluconato em gluconato a 1 mM, e para assegurar a não utilização de glicerol pelo fenótipo do hospedeiro KLP23 em glicerol a 1 mM. Uma digestão EcoRI do DNA genómico de um mutante, RJ8m, quando testada com o gene intacto de tpiA via análise por Southern (Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)) indicou que era um integrante de duplo cruzamento (substituição do gene tpiA) desde que fossem observadas as duas bandas esperadas de 6,6 kb e 3,0 kb, devido à presença de um sitio EcoRI adicional dentro do gene de resistência ao cloranfenicol. Como esperado, o hospedeiro KLP23 e os controlos da estirpe selvagem de FM5 produziram bandas únicas de 8,9 kb e 9,4 kb respectivamente. Este mutante de tpiA foi seguidamente analisado através de PCR genómico utilizando os iniciadores da SEQ ID NO: 51 e da SEQ ID NO: 52, que originam o fragmento de PCR esperado de 4,6 kb enquanto que para o mesmo par de iniciadores o hospedeiro KLP23 e as estirpes FM5 de estirpe selvagem produzem ambos o fragmento de PCR esperado de 3,9 kb. Quando os extractos livres de células do mutante de tpiA RJ8m e do hospedeiro KLP23 foram testados relativamente à actividade de tpiA utilizando gliceraldeido 3-fosfato como substrato, não foi observada nenhuma actividade com RJ8m. O mutante de tpiA RJ8m foi electrotransformado com o plasmideo pAH48 para permitir a produção de glicerol a partir da glucose e também com ambos os plasmideos pAH48 e pDT29 ou pKP32 para permitir a produção de 1,3-propanodiol a partir da glucose. O marcador de resistência ao cloranfenicol foi eliminado de RJ8m para originar RJ8. ΡΕ1204755 119 EXEMPLO 9 CONVERSÃO DE GLUCOSE EM 1,3-PROPANODIOL UTILIZANDO A ESTIRPE DE E. COLI RJ8/pAH4 8/pDT2 9 E O PROCESSO MELHORADO UTILIZANDO RJ8/ pAH48/pKP32

Pré-Cultura: A RJ8/pAH4 8/pDT2 9 e a RJ8/pAH4 8/pKP32 foram colocadas em pré-culturas para inocular um fermentador como descrito no Exemplo 7. A RJ8/pAH48/pKP32 é idêntica à RJ8/pAH48/pDT29 excepto que o dhaT está delectado.

Meio de fermentação: O meio de fermentação está descrito no Exemplo 7. Crescimento da fermentação: O crescimento da fermentação está descrito no Exemplo 7 excepto que os valores iniciais para a taxa de fluxo de ar (determinado para valores minimos Standard de entre 6 e 7 litros por min) e da velocidade de agitação (fixada para valores minimos de entre 300 e 690 rpm) foram determinado para que o controlo do oxigénio dissolvido (OD) fosse iniciado quando os valores da TCO atingissem entre 60 e os 100 mmol/L/h. Foi adicionada a vitamina B12 ou a coenzima B12 como descrito em baixo. 120 ΡΕ1204755

Fermentação com RJ8/pAH48/pDT29:

Um resumo da fermentação representativa da conversão da glucose em 1,3-propanodiol (1,3-PD) utilizando a estirpe de E. coli RJ8/pAH48/pDT29 é fornecido na Tabela 6. A vitamina Bi2 foi fornecida como adições de bolus de 2, 16 e 16 mg ás 2, 8, e26h, respectivamente. O rendimento do 1,3-propanodiol foi de 35% (p/p) (g de 1,3-propanodiol/g de glucose consumida) e foi obtido um titulo de 1,3-propanodiol de 50,1 g/L. TABELA 6

Resumo da fermentação representativa da conversão da glucose em i 1,3-propanodiol (1,3-PD) utilizando a estirpe de E. coli RJ8/pAH48/pDT29 Tempo (h) OD550 (AU) OD (%) Glucose (g/L) Glicerol (g/L) 1,3-PD (g/L) 0 0 140 10, 6 0,1 0,0 6 5 107 11,1 0,5 0,4 10 16 90 8,5 1,7 1,3 14 25 86 1,8 2,4 5,9 19 38 53 3, 5 5,9 15, 4 25 53 38 0,1 9,2 26, 7 31 54 10 4,5 7,4 39, 0 37 37 23 17,2 6, 0 45, 0 43 21 13 9,9 7,7 50,1 121 ΡΕ1204755

Fermentação melhorada com RJ8/pAH48/pKP32:

Um resumo da fermentação representativa da conversão da glucose em 1,3-propanodiol (1,3-PD) utilizando a estirpe de E. coli RJ8/pAH48/pKP32 é fornecido na Tabela 7. A vitamina B12 foi fornecida como adições de bolus de 48 e 16 mg ás aproximadamente 26 e 44h, respectivamente. O rendimento do 1,3-propanodiol foi de 34% (p/p) (g de 1,3- propanodiol/g de glucose consumida) e foi obtido um titulo de 1,3-propanodiol de 129 g/L. TABELA 7

Resumo da fermentação representativa da conversão melhorada da glucose em 1,3-propanodiol (1,3-PD) utilizando a estirpe de E. coli RJ8/pAH48/pKP32 Tempo (h) OD550 (AU) OD (%) Glucose (g/L) Glicerol (g/L) 1,3-PD (g/L) 0 0 150 12, 6 0,1 0 6 12 113 6, 0 2, 6 0 12 24 99 0,0 10, 6 0 18 51 76 2,4 28, 9 0 24 78 82 2,4 44,2 5 30 114 70 3, 8 26, 9 33 36 111 72 0,0 20,0 57 42 139 65 0,1 21, 9 69 48 157 36 0,1 22,4 79 55 158 25 0,2 21,4 94 64 169 14 0,1 15, 8 113 72 169 12 0,1 13,4 119 74 162 14 0,1 14,8 129 ΡΕ1204755 122 EXEMPLO 10

IDENTIFICAÇÃO DA ACTIVIDADE CATALÍTICA NÃO ESPECÍFICA DE E. COLI (yqhD) NO PROCESSO MELHORADO DE 1,3-PROPANQDIQL

Demonstração da actividade catalítica não específica em 1,3-propanodiol produzido em fermentações com a catálise melhorada:

Um ensaio de célula total para a actividade da desidrogenase de 1,3-propanodiol foi utilizado para demonstrar que a actividade catalitica não especifica em E. coli está presente sob condições fermentativas após a adição de vitamina B12 e a produção de 3-hidroxi-propionaldeído (3-HPA), mas não antes. Uma estirpe de E. coli recombinante contendo os plasmideos para a produção de glicerol e para a produção de 1,3-propanodiol, pAH48 e pKP32, respectivamente, cresceu em fermentadores de 10 L, essencialmente como descrito no Exemplo 7, mas na ausência de vitamina Bi2. Um bolus de vitamina Bi2 (48 mg) foi adicionado quando os tanques alcançaram uma OD55o de aproximadamente 100. Foram retiradas aliquotas de células dos tanques imediatamente antes e 2 h após a adição da vitamina Bi2. As células foram recolhidas por centrifugação e ressuspensas no seu volume original em tampão PBS contendo cloranfenicol a 150 pg/mL para inibir a sintese de novas proteinas. Um volume apropriado das células tratadas com cloranfenicol foi adicionado a frascos escuros de 250 123 ΡΕ1204755 mL contendo uma mistura de reacção (tampão PBS contendo glucose a 10 g/L, glicerol a 10 g/L, coenzima B12 a 1 mg/L, e cloranfenicol a 150 pg/mL) tal que o volume final fosse de 50 mL a uma OD55o de aproximadamente 10. Os frascos, protegidos da luz foram agitados a 250 rpm a 35 °C. Foram retiradas aliquotas para análise por HPLC a o longo do tempo. Foi observada produção de 3-HPA dependente do tempo em frascos contendo células recolhidas do fermentador quer pré ou pós a adição da vitamina B12. Em contraste directo, foram observados niveis significativos de 1,3-propanodiol apenas naqueles frascos que continham células recolhidas do fermentados pós a adição da vitamina B12.

Detecção da actividade catalítica não específica em extractos livres de células:

Foi utilizado um ensaio de actividade em gel nativo com coloração para demonstrar a actividade catalítica não específica em extractos livres de células. As células foram recolhidas, pré e pós a adição de vitamina B12, a partir das fermentações de 10 L representativas empregando estirpes de E. coli recombinantes contendo os plasmídeos para a produção de glicerol e para a produção de 1,3-propanodiol, pAH48 e pKP32, respectivamente; e foram preparados extractos livres de células por disrupção celular utilizando uma prensa francesa ("french press"). Os extractos livres de células, uma preparação pura de desidrogenase de 1,3-propanodiol (dhaT) de Klebsiella pneumoniae, e padrões de pesos moleculares foram aplicados 124 ΡΕ1204755 nos e postos a correr nos géis nativos de gradiente de poliacrilamida. Os géis foram seguidamente expostos a ambos os substratos 1,3-propanodiol e NAD+ ou etanol e NAD+. Como esperado nos géis onde o 1,3-propanodiol era o substrato, foi observada uma actividade corada para DhaT que migrava no gel nativo a aproximadamente 340 Kdal. Esta actividade foi observada apenas nos poços em que foi aplicada a desidrogenase de 1,3-propanodiol (dhaT) de Klebsiella pneumoniae pura. Em contraste, onde o 1,3-propanodiol era o substrato e onde foram aplicados os extractos livres de células pós vitamina B12, foi observada uma actividade catalítica não específica a aproximadamente 90 Kdal. Quando o etanol foi utilizado como um substrato, nem a banda de DhaT nem a banda da actividade catalítica não específica eram visíveis, mas foi encontrada uma banda separada pré e pós adição de vitamina Bi2 a aproximadamente 120 Kdal. Esta nova banda representa muito provavelmente uma álcool desidrogenase com especificidade relativamente ao etanol como substrato como é encontrada normalmente em todos os organismos.

Este ensaio de gel nativo, onde as proteínas são separadas por peso molecular antes do ensaio do passo enzimático, oferece maior sensibilidade e precisão na medição da redução de 1,3-propanodiol naqueles construtores com baixa actividade e onde a actividade é provavelmente distinta das álcool desidrogenases com especificidade relativamente ao etanol como substrato que foi bem caracterizada para a E. coli e encontrada em todos os 125 ΡΕ1204755 organismos. O ensaio da desidrogenase assenta no principio de que a desidrogenase catalisa a transferência de electrões a partir do 1,3-propanodiol (ou outros álcoois) para o NAD+. 0 PMS (metossulfato de fenazina) junta-se então à transferência de electrões entre NADH e um corante de brometo de tetrazólio (MTT, brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio) que forma um precipitado no gel. Após algumas horas de absorção nos substratos durante a noite, os géis foram lavados para remover os reagentes e o corante solúvel. Nas bandas no gel onde existe uma actividade de desidrogenase, forma-se um corante azul insolúvel. Têm sido descritos vários aspectos do ensaio por Johnson e Lin (J. Bacteriol. 169: 2050 (1987)).

Purificação e identificação da actividade catalítica não específica em E. coli:

Foi efectuada uma purificação parcial em larga escala da actividade catalítica não específica em células recolhidas no fim de um processo de produção normal de 1,3-propanodiol como descrito no processo melhorado utilizando a KLP23/pAH48/pKP32 do Exemplo 7. O pellet celular (16 g) foi lavado e ressuspenso três vezes em 20 mL de tampão Hepes a 50 mM, pH 7,5. As células na suspensão foram lisadas por sonicação. O extracto livre de células foi obtido por centrifugação (15 min, 20,000 x g, 10 °C) e o sobrenadante foi seguidamente clarificado por adição de 250 mg de sulfato de protamina com agitação em gelo. O sobrenadante obtido por centrifugação (20 min, 20,000 x g, 126 ΡΕ1204755 10 °C) foi fraccionado pela passagem através de uma coluna de escala preparativa Superdex 200 (6 x 60) equilibrada com tampão Hepes. Foram colectadas fracções de 10 mL cada e uma alíquota de cada uma foi concentrada vinte e cinco vezes utilizando membranas Centricon® ) com limite de 10, 000 PM antes do ensaio de actividade de gel nativo com coloração. A actividade catalítica não específica foi identificada em fracções com 107· -112, e o pico de actividade em fracções com 108-109. Uma alíquota maior (7 mL cada) das fracções com 108-109 foram concentradas cinquenta vezes e carregadas em todos os poços de um gel nativo de 12 poços. O gel foi cortado ao meio e uma parte foi corada relativamente à actividade da desidrogenase onde apareceu uma banda azul escura que representa a actividade catalítica não específica. O gel não corado foi alinhado do topo à base com o gel corado e foi cortada uma banda no gel não corado que corresponde à banda da actividade catalítica não específica. A tira de gel foi pulverizada e a proteína solúvel foi extraída por imersão as partículas pulverizadas em 0,5 mL de tampão de amostra 2D, aquecendo a 95 °C durante 5 min, e centrifugação para remover as partículas de gel. O sobrenadante foi depositado numa tira de isoelectrofocagem (IEF) para electroforese em gel de poliacrilamida de 2 dimensões (2D-PAGE) utilizando as condições descritas para o 2D-PAGE de extractos de E. coli na base de dados 2D Suíça (http://www.expasy.ch/ch2d/; Tonella et al. Electrophoresis 19: 1960-1971 (1998)). O gel foi transferido para uma membrana PVDF por electroblotting. A membrana foi corada para proteínas utilizando o corante 127 ΡΕ1204755

de gel azul Colloidal. O blot corado utilizado para obter a identidade da actividade catalitica não especifica é apresentado na Figura 6. Os pontos foram identificados utilizando técnicas Standard para sequenciação de peptídeos amino terminais. Apenas um único ponto (Ponto A) codifica para uma actividade de oxidoredutase. Dezanove ciclos do Ponto A (Figura 6) apresentaram uma identidade de 100% pela ferramenta de pesquisa FASTA com os amino-terminais de yqhD, uma janela de leitura aberta de E. coli com actividade de oxidoredutase putativa. A sequência de amino-ácidos completa para a proteína codificada por yqhD é fornecida na SEQ ID NO: 57; a sequência de DNA correspondente é fornecida na SEQ ID NO: 58. o gene yqhD possui 405 de identidade com o gene adhB em Clostridium, uma provável butanol desidrogenase 2 dependente de NADH.

Disrupção de gene de yqhD em E. coli KLP23:

Os ensaios bioquímicos e a sequenciação de aminoácidos amino-terminais sugerem que a actividade catalítica não específica pode ser codificada pelo gene yqhD de E. coli. Este gene de funções desconhecidas codifica uma oxidoredutase hipotética e contém dois padrões de álcool desidrogenase também encontrados na desidrogenase de 1,3-propanodiol codificada pelo gene dhaT de Citrobacter freundii e de Klebsiella pneumoniae.

Para disruptar este gene, o yqhD e 830 pb da 128 ΡΕ1204755 sequência de DNA flanqueadora a 5' e 906 pb da sequência de DNA flanqueadora a 3' foram amplificados a partir de DNA genómico de E. coli KLP23 (Exemplo 4) num PCR utilizando a Taq polimerase e os seguintes iniciadores: (SEQ ID NO: 59) 5'-GCGGTACCGTTGCTCGACGCTCAGGTTTTCGG-3' (SEQ ID NO: 60) 5'-GCGAGCTCGACGCTTGCCCTGATCGAGTTTTGC-3' A reacção decorreu a 94 °C durante 1 min, 50 °C durante 1 min, e 72 °C durante 3 min por 35 ciclos seguido por uma extensão final a 72 °C durante 5 min. O fragmento de DNA de 3,7 kb resultante foi purificado, digerido com Saci e Kpnl e ligado a pBluescriptII KS(+) (Stratagene) similarmente digerido durante 16 h a 16 °C. O DNA ligado foi utilizado para transformar E. coli DH5a (Gibco/BRL) e o plasmídeo esperado, pJSP29, foi isolado a partir de um transformante apresentando uma colónia de cor branca em LB com agar (Difco) contendo X-gal (40 pg/mL) e ampicilina (100 pg/mL). O plasmídeo pJSP29 foi digerido com AflII e Ndel para libertar um fragmento de DNA de 409 pb compreendendo 3 63 pb do gene yqhD e 4 6 pb da sequência de DNA flanqueadora a 3'. O restante fragmento de DNA de 5,350 pb foi purificado e ligado ao fragmento de DNA Aflll/Ndel de 1,374 pb contendo o gene de resistência à canamicina de pLoxKan2 (Genencor International, Paio Alto, CA) durante 16 ha 16 °C. O DNA ligado foi utilizado para transformar E. coli DH5a e o plasmídeo esperado, pJSP32-Blue, foi isolado a partir de um transformante seleccionado em meio LB com agar contendo canamicina (50 pg/mL). O plasmídeo pJSP32- 129 ΡΕ1204755

Blue foi digerido com Kpnl e Saci e a cassete de disrupção de yqhD de 3, 865 pb foram purificados e ligados ao pGP704 similarmente digerido (Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170: 2575-2583 (1988)) durante 16 h a 16 °C. O DNA ligado foi utilizado para transformar E. coli SY327 (Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170: 2575-2583 (1988)) e o plasmideo esperado, pJSP32, foi isolado a partir de um transformante seleccionado em meio LB com agar contendo canamicina (50 yg/mL). O plasmideo pJSP32 foi transformado em E. coli KLP23 e os transformantes foram seleccionado em LB com agar contendo canamicina (50 yg/mL). Dos 200 transformantes resistentes à canamicina rastreados, dois demonstraram o fenótipo sensível à ampicilina esperado para um evento de recombinação de duplo cruzamento resultando na substituição do gene yqhD pela cassete de disrupção de yqhD. A disrupção do gene yqhD foi confirmada por PCR utilizando o DNA genómico como molde isolado a partir destes dois transformantes e os seguintes conjuntos de pares de iniciadores:

Conjunto #1: (SEQ ID NO: 61) 5'-GCGAGCTCGACGCTTGCCCTGATCGAGTTTTGC-3' (SEQ ID NO: 62) 5'-CAGCTGGCAATTCCGGTTCG-3'

Conjunto #2: (SEQ ID NO: 63) 5'-CCCAGCTGGCAATTCCGGTTCGCTTGCTGT-3' (SEQ ID NO: 64) 5'-GGCGACCCGACGCTCCAGACGGAAGCTGGT-3' 130 ΡΕ1204755

Conjunto #3: (SEQ ID NO: 65) 5'-CCGCAAGATTCACGGATGCATCGTGAAGGG-3' (SEQ ID NO: 66) 5'-CGCCTTCTTGACGAGTTCTGAGCGGGA-3'

Conjunto #4: (SEQ ID NO: 67) 5'-GGAATTCATGAACAACTTTAATCTGCACAC-3' (SEQ ID NO: 68) 5'-GTTTGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGCGGC-3'

As reacções decorreram utilizando quer Expand High Fidelity Polymerase (Boehringer Manheim) quer Platinum PCR Supermix contendo a Taq polymerase (Gibco/BRL) a 94 °C durante 1 min, a 50 °C durante 1 min, e a 72 °C durante 2 min por 35 ciclos seguido por uma extensão final a 72 °C durante 5 min. Os produtos de PCR resultantes foram analisados por electroforese em gel de agarose a 1,0% (p/v) . Os resultados sumarizados na Tabela 8 confirmam a disrupção do gene yqhD em ambos os transformantes. TABELA 8

Conjunto de Iniciadores Tamanho Esperado (pb) Tamanho Observado (pb) disrupção de yqhD yqhD de estirpe selvagem 1 1,200 sem produto -1,200 2 1,266 sem produto -1,266 3 2,594 sem produto -2,594 4 sem produto 1,189 -900 131 ΡΕ1204755 A disrupção de yqhD delecta a extremidade 3' de yqhD, incluindo 46 pb a 3' da sequência de DNA intergénica flanqueadora. A delecção remove 363 pb a 3' da sequência codificante de yqhD correspondendo a 121 aminoácidos. Está presente um codão de terminação 15 pb a jusante da restante sequência codificante de yqhD na cassete de resistência à canamicina.

Os plasmideos pAH48 e pKP32 foram co-transfor-mados em E. coli KLP23 (yqhD~) e os transformantes que contêm ambos os plasmideos foram seleccionados em LB com agar contendo ampicilina (100 yg/mL) e espectinomicina (50 yg/mL). Um transformante representativo foi testado relativamente à sua capacidade de converter a glucose em 1,3-propanodiol em fermentações de 10 L quer na presença quer na ausência de vitamina B12.

Demonstração de que yqhD é necessário para a produção significativa de 1,3-propanodiol na estirpe de E. coli KLP23/pAH48/pKP32:

As fermentações para a produção de 1,3-propa-nodiol foram efectuadas, essencialmente como descrito no Exemplo 7, com a estirpe de E. coli KLP23 (yqhD~) / pAH48/pKP32 por forma a testar o efeito da disrupção de yqhD na produção de 1,3-propanodiol.

Uma fermentação representativa de 10 L utilizando o knockout da actividade catalítica não específica, a 132 ΡΕ1204755 estirpe de E. coli KLP23 (yqhD~) /pAH48/pKP32, é apresentada na Tabela 9. O organismo acumulou estavelmente massa celular e glicerol até à adição de vitamina B12, quando a OD550 excedeu 30 A (10,4 h) . Foi adicionada vitamina B12 como uma adição de bolus de 8 mg ás 10,4 h e depois disso a vitamina B12 foi alimentada continuamente a uma taxa de 1,32 mg/h. Nas 4 h que se seguiram à adição de vitamina B12, o consumo de glucose diminui, a taxa de utilização de oxigénio caiu e não existiu aumento adicional na densidade óptica. A fermentação de glucose cessou e a concentração de glucose no tanque acumulou. O titulo mais elevado de 1,3-propanodiol obtido foi de 0,41 g/L. O organismo foi testado relativamente à sua viabilidade plaqueando uma diluição seriada das células em placas de agar contendo ampicilina e espectinomicina. As placas foram incubadas durante 24 h numa incubadora a 30 °C. Não existiam colónias viáveis na placa da fermentação de E. coli KLP23 (yqhD~) /pAH48/pKP32, Tabela 11.

Em contraste, a suspensão celular de um tanque de controlo ao qual não foi adicionada vitamina B12 continuou a acumular massa celular e glicerol até o tanque de 10 L estar cheio devido à adição completa da solução de alimentação de glucose (Tabela 10). Uma determinação de viabilidade em placa com agar por diluição seriada da suspensão celular no fim desta fermentação mostrou uma contagem de células viáveis que era consistente com o número total de células estimado pelo valor da densidade óptica (Tabela 11) . ΡΕ1204755 133 TABELA 9

Resumo da fermentação representativa da incapacidade da conversão da glucose em 1,3-propanodiol (1,3-PD) utilizando a estirpe de E. coli KLP23 (yqhD~) /pAH48/pKP32. tempo (h) OD55o (AU) OD (%) glucose (g/L) glicerol (g/L) 1,3-PD (g/L) 0 0,4 150 11,3 0,05 0 2,3 3, 0 134 10,7 0,13 0 4,3 10,8 85, 0 8,2 1,41 0 8,3 23, 1 81,8 0, 9 10,0 0 16, 3 37,2 149 13, 1 21,4 0,41 18,3 47, 6 149 18, 9 21, 6 0,39 20,3 39, 6 149 24,4 22,3 0,42 23, 8 33, 6 149 25,4 22,0 0,41 TABELA 10

Resumo da fermentação representativa da conversão da glucose em glicerol utilizando a estirpe de E. coli KLP23 (yqhD )/pAH48/pKP32. tempo (h) OD550 (AU) OD (%) glucose (g/L) glicerol (g/L) 0 0,2 148 9,5 0,06 2,2 2,8 128 8,9 0,13 4,2 10,4 58,5 7,0 1,4 8,2 21, 6 57, 6 2,7 11,2 16,2 76, 8 10,7 0 40,5 20,2 117 10,2 0 52, 9 23, 7 154 8,5 0 63, 9 36,2 239 10,1 0,1 122 ΡΕ1204755 134 TABELA 11

Resumo representativo das contagens das placas de viabilidade a partir do fim das fermentações da glucose utilizando a estirpe de E. coli KLP23 (yqhD~) /pAH48/pKP32 na ausência e presença de vitamina B12. vitamina Bl2 tempo (h) final OD550 (AU) contagens viáveis (cfu/mL) não 36, 2 239 2,1E11 sim 23, 8 33, 6 0 sim 23, 8 41,2 0 ΡΕ1204755 135

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> E. I. du Pont de Nemours and Company

Biológica de 1,3-Propanodiol <120> Processo Melhorado para a Produção com Título Elevado

<130> BC1020 PCT <140> <141> <150> 60/149,534 <151> 1999-08-08 <160> 68 <170> Microsoft Office 97

<210> 1 <211> 12145 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 1 gtegaccscs acggfeggfcga aaa&ttcagg atgtcgccg® aa fc ttfc«tc gcgcat.tca a ae&ggcgccg gagag essfcgc gscgccgõcg Qsgagcíitgg cagegggteo a tfcc&igt&ca tcteeaacaa aggttegatg ccgcctotct qtggagegtg cctggcgat a çgggit fctesfctacga getfaggafca tgcrfegââáat tcaggatago cggcga&gçg gsgaâââgg c ggisj-aaaeísc ggatcgcaat cctgacagag cct gtg131 o atat cagaac gtgategcac tgetccggta «gc ca ggg et c afcca tgt c t t&ttcaatct ccagecsaafc tgccaaasac ctggeggaga. gggagagaas g«ggtgaatg tsseg çjcgaa i:çc.« gccat g «tgecgcggs gtggtcgggã tfcisetacoag aagotgccgg ecaogsgetg tcggtgatgí gaaaaacccg gasszqqzqq gctggtcfce© ggcatgggeg tgegegcgsc aecagcatgg eetgtgctat gatacçetge ggtagfcgacc gâagc.gc3gg c11 tgaaagc satggoc tgg agagi.g<iâ&t cacctgtstc gçfcgç«$M$ sgçççgatgg õ etg «©ggtg acgct egege ggtggcge&a getsectgcg cccggagsgc g fescatgçcg gcgttsat r. c gcggt ggeta ggeagtcget gccggagggg acfccsggafca ccgggs&gg© aâgcttâtge sgiagog&aae otttsatfço tâtagfctttt asat.tttgtc eotggccgat eeacetfcgce feoagctgsgg ggttaatsag gctggcggag tgatgattct gaçattgçtt gcgageèggc ggt-gggaaas ggaggatfcgt: actagggttt aaaaaggcga cgetaegtte acatgegcsíc afcefcfcesggg gcttcttsgt gcctgcsgag egga&atc-ôO: teggcgçtgg tggtggfcgat •àcacsgaagc tgstggaeae afcgcgcfcete ©cggaggae» tggcggaggg açcsgcatcat ccgctgccca aeggtgãgas acgagattga agstgggcgt ©ggaagggga ©tefccctcac aaccgctçgc ttçtctafegg ggtctctfccc t O! ^ v» δ <3 <3 § gçtççcatgc gafcaatcaçrc cggcgtcggc staçjesgcag agccaccggê sfcgçgôtm etttfcfccatt gcggtSfitcg ggçtgagcgg octgattfetg gsgstt-fcttt «afc&ttttgc aagggosttã tttgfctccãa sagafctttfct aggeeefcgct ttstttgsgg teetgatgct eaiçgcfcgac eoacgatatt ecgtccgatg tssaassete cccgaccat© g-ggogagttt ggcgattatc cacctggtts gtcscÍ&ceg&g cgaaããggcc cgaggegsaãc

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<210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Desconhecido <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <220> <223> iniciador <400> 2 gctttctgtg ctgcggcttt ag 22

<210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <220> <223> iniciador <400> 3 tggtcgagga tccacttcac ttt 23 139 ΡΕ1204755 <210> <211> <212> <213> 4 51 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 4 aaagtgaagt ggatcctgca ccaattggat ggtggcgcag tagcaaacaa t 51 <210> <211> <212> <213> 5 23 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 5 ggatcaccgc cgcagaaact acg 23 <210> <211> <212> <213> 6 25 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 6 ctgtcagccg ttaagtcttc ctgtg 25 <210> <211> <212> <213> 7 23 DNA Sequência Artificial <22 0> <221> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <221> iniciador <400> 7 cagttcaacc tgttgatagt acg 23 <210> <211> <212> <213> 8 20 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador 140 ΡΕ1204755 <22 0> <223> iniciador <400> 8 atgagtcaaa catcaacctt 20 <210> <211> <212> <213> 9 20 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 9 atggagaaaa aaatcactgg 20 <210> <211> <212> <213> 10 20 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 10 ttacgccccg ccctgccact 20 <210> <211> <212> <213> 11 20 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 11 tcagaggatg tgcacctgca 20 <210> <211> <212> <213> 12 26 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 12 cgagcatgcc gcatttggca ctactc 26 141 ΡΕ1204755 <210> <211> <212> <213> 13 29 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 13 gcgtctagag taggttattc ccactcttg 29 <210> <211> <212> <213> 14 26 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iniciador <400> 19 ctaacgattg ttctctagag aaaatgtcc 29 <210> <211> <212> <213> 20 30 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 20 cacgcatgca gttcaacctg ttgatagtac 30 <210> <211> <212> <213> 21 28 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 21 gcgtctagat ccttttaaat taaaaatg 28 <210> 22 <211> 51 143 ΡΕ1204755 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 22 gcgcggatcc aggagtctag aattatggga ttgactacta aacctctatc t 51 <210> <211> <212> <213> 23 36 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 23 gatacgcccg ggttaccatt tcaacagatc gtcctt 36 <210> <211> <212> <213> 24 34 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 24 ttgataatat aaccatggct gctgctgctg 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Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 30 gatccaggaa acaga 15 <210> <211> <212> <213> 31 15 DNA Sequência Artificial 145 ΡΕ1204755 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 31 ctagtctgtt tcctg 15 <210> <211> <212> <213> 32 94 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de terminação <22 0> <223> sequência de terminação <400> 32 agcttaggag tctagaatat tgagctcgaa ttcccgggca tgcggtaccg gatccagaaa 60 aaagcccgca cctgacagtg cgggcttttt tttt 94 <210> <211> <212> <213> 33 37 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 33 ggaattcaga tctcagcaat gagcgagaaa accatgc 37 <210> <211> <212> <213> 34 27 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 34 gctctagatt agcttccttt acgcagc 27 <210> <211> <212> <213> 35 33 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador 146 ΡΕ1204755 <400> 35 ggccaagctt aaggaggtta attaaatgaa aag 33 <210> <211> <212> <213> 36 26 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 36 gctctagatt attcaatggt gtcggg 26 <210> <211> <212> <213> 37 42 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 37 gcgccgtcta gaattatgag ctatcgtatg tttgattatc tg 42 <210> <211> <212> <213> 38 36 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <22 0> <223> iniciador <400> 38 tctgatacgg gatcctcaga atgcctggcg gaaaat 36 <210> <211> <212> <213> 39 18 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: linker ("ligador") <22 0> <223> linker ("ligador") <400> 39 tcgacgaatt caggagga 18 <210> <211> <212> <213> 40 18 DNA Sequência Artificial 147 ΡΕ1204755 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: linker ("ligador") <22 0> <223> linker ("ligador") <400> 40 ctagtcctcc tgaattcg <210> 41

<211> 4549 <212> DNA <213>Sequência Artificial <22 0> pCL1920 <223> Descrição da Sequência Artificial: <22 0> <223> plasmideo <400> 41 agct-cgisaa afcfcgfcatrtg» taccgeatca sgggQstctt

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Lisboa, 21 de Setembro de 2006

Claims (26)

1. ΡΕ1204755 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um microorganismo recombinante útil para a produção de 1,3-propanodiol, compreendendo: (a) pelo menos um gene que codifique um polipeptideo contendo uma actividade de desidratase; (b) pelo menos um gene que codifique um factor de reactivação da desidratase; e (c) pelo menos um gene endógeno que codifique uma actividade catalítica não específica para converter 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol, em que se diz que pelo menos um gene endógeno compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptideo de pelo menos 387 aminoácidos contendo pelo menos 80% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:: 57; em que nenhum gene funcional dhaT que codifica uma actividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol está presente no microorganismo recombinante e o microorganismo é selec-cionado a partir do grupo constituído por Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactoba-cillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hanse-nula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Sal-monella, Bacillus, Aerobacter, Streptomyces e Pseudomonas.
2. 2. O microorganismo recombinante da Reivindicação 1, em que o referido pelo menos um gene endógeno codifica um polipeptideo contendo a sequência da SEQ ID NO: 57. 2 ΡΕ1204755
3. 3. O microorganismo recombinante da Reivindicação 1 ou da Reivindicação 2 contendo adicionalmente: (a) pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol-3-fosfato desi-drogenase; e (b) pelo menos um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol—3-fosfatase.
4. 4. 0 microorganismo recombinante de qualquer das Reivindicações 1, 2 ou 3, em que o factor da reactivação da desidratase é codificado por orfX e orfZ, isolados a partir de um regulão dha.
5. 5. O microorganismo recombinante da Reivindicação 4, em que orfX e orfZ são isolados independentemente a partir de Klebsiella sp., Citrobacter sp.r ou de Clos-tridium sp.
6. 6. O microorganismo recombinante da Reivindicação 3, compreendendo adicionalmente um conjunto de genes endógenos, contendo cada um uma mutação que inactiva o gene, sendo o conjunto constituído por: (a) um primeiro gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol cinase; (b) um segundo gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol desidrogenase; e (c) um terceiro gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da triosefosfato isomerase. 3 ΡΕ1204755
7. 7. O microorganismo recombinante das Reivindicações 3 ou 6, em que o microorganismo recombinante converte uma fonte de carbono seleccionada a partir do grupo constituído por monossacarideos, oligossacarideos, polissa-carideos, e substratos de um carbono em 1,3-propanodiol.
8. 8. 0 microorganismo recombinante da Reivindicação 1 ou da Reivindicação 2, em que o microorganismo recombinante converte uma fonte de carbono seleccionada a partir do grupo constituído por glicerol e di-hidroxi-acetona em 1,3-propanodiol.
9. 9. 0 microorganismo recombinante das Reivindicações 3 ou 6, em que o gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase é seleccionado a partir do grupo constituído por GPD1, GPD2, GPD3, DARI, gpsA, GUT2, glpD, e glpABC.
10. 10. O microorganismo recombinante das Reivindicações 3 ou 6, em que o gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol—3-fosfatase é seleccionado a partir do grupo constituído por GPPI e GPP2.
11. 11. O microorganismo recombinante de qualquer das Reivindicações 1, 2, 3 ou 6, em que o gene que codifica um polipeptídeo contendo uma actividade de desidratase é seleccionado a partir do grupo constituído por uma glicerol desidratase e uma diol desidratase. 4 ΡΕ1204755
12. 12. O microorganismo recombinante de qualquer das Reivindicações 1, 2, 3 ou 6, em que o gene que codifica um polipeptideo contendo uma actividade de desidratase é isolado a partir de Klebsiella sp., Citrobacter sp., ou de Clostridium sp.
13. 13. Uma E. coli recombinante compreendendo: (a) um conjunto de genes exógenos constituído por: (i) pelo menos um gene que codifica um polipeptí-deo contendo uma actividade de desidratase; (ii) pelo menos um gene que codifica um polipeptí-deo contendo a actividade da glicerol-3-fos-fato desidrogenase; (iii) pelo menos um gene que codifica um polipeptí-deo contendo a actividade da glicerol—3-fos-fatase; e (iv) pelo menos um gene que codifica um factor de reactivação da desidratase; e (b) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica para converter 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol, em que se diz que pelo menos um gene endógeno compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptideo de pelo menos 387 aminoácidos contendo pelo menos 80% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:: 57; em que nenhum gene funcional dhaT que codifica uma actividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol está presente na E. coli recombinante. 5 ΡΕ1204755
14. 14. A E. coli recombinante da Reivindicação 13, em que o referido pelo menos um gene endógeno codifica um polipeptídeo contendo a sequência da SEQ ID NO: 57.
15. 15. Uma E. coli recombinante compreendendo: (a) um conjunto de genes exógenos constituído por (i) pelo menos um gene que codifica um poli peptídeo contendo a actividade da glicerol-3- fosfato desidrogenase; (ii) pelo menos um gene que codifica um poli peptídeo contendo a actividade da glicerol—3-fosfatase; e (iii) pelo menos um subconjunto de genes que codifica os produtos de gene de dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaBl, dhaB2, dhaB3 e orfZ, e (b) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica para converter 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol, em que se diz que pelo menos um gene endógeno compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de pelo menos 387 aminoácidos contendo pelo menos 80% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:: 57; em que nenhum gene funcional dhaT que codifica uma actividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol está presente na E. coli recombinante.
16. 16. A E. coli recombinante da Reivindicação 15, 6 ΡΕ1204755 em que o referido pelo menos um gene endógeno codifica um polipeptideo contendo a sequência da SEQ ID NO: 57.
17. 17. A E. coli recombinante da Reivindicação 16 compreendendo adicionalmente um conjunto de genes endógenos, contendo cada gene uma mutação que inactiva o gene, sendo o conjunto constituído por: (a) um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol cinase; (b) um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da glicerol desidrogenase; e (c) um gene que codifica um polipeptideo contendo a actividade da triosefosfato isomerase.
18. 18. Um processo para a bioprodução de 1,3-propa-nodiol compreendendo: (a) o contacto sob condições adequadas da E. coli re combinante quer da Reivindicação 16 quer da Reivindicação 17 com pelo menos uma fonte de carbono seleccionada a partir do grupo constituído por monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e substratos de um carbono pelos quais o 1,3-propanodiol é produzido; e (b) a recuperação opcional do 1,3-propanodiol produzido em (a).
19. 19. Um processo para a bioprodução de 1,3-propa-nodiol compreendendo: (a) o contacto da E. coli recombinante das Reivin- 7 ΡΕ1204755 dicações 16 ou 17 ou da E. coli recombinante das Reivindicações 16 ou 17 compreendendo adicionalmente : (i) pelo menos um gene endógeno que codifica um polipeptideo contendo uma actividade de desi-dratase; (ii) pelo menos um gene endógeno que codifica um factor de reactivação da desidratase; (iii) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica para converter 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-pro-panodiol, em que se diz que pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptideo de pelo menos 387 aminoácidos contendo pelo menos 80% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:: 57; com pelo menos uma fonte de carbono seleccionada a partir do grupo constituído por glicerol e di-hidroxiacetona, e (b) a recuperação opcional do 1,3-propanodiol produzido em (a) .
20. 20. O processo da Reivindicação 19, em que o referido pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica codifica um polipeptideo contendo a sequência da SEQ ID NO: 57. ΡΕ1204755
21. 21. Um processo para a produção de 1,3-propa-nodiol compreendendo: (a) o contacto de uma E. coli recombinante com uma primeira fonte de carbono e com uma segunda fonte de carbono, a E. coli recombinante compreende: (i) pelo menos um gene endógeno que codifica um polipeptideo contendo uma actividade de desidratase; (ii) pelo menos um gene endógeno que codifica um factor de reactivação da desidratase; (iii) pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica suficiente para converter 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol, em que se diz que pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptí-deo de pelo menos 387 aminoácidos contendo pelo menos 80% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:: 57; em que nenhum gene funcional dhaT que codifica uma actividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol está presente na E. coli recombinante e em que a primeira fonte de carbono é seleccionada a partir do grupo constituído por glicerol e di-hidroxiacetona, e a segunda fonte de carbono é seleccionada a partir do grupo constituído por monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e substratos de um carbono; e 9 ΡΕ1204755 (b) a recuperação opcional do 1,3-propanodiol produzido em (a).
22. 22. 0 processo da Reivindicação 21, em que o referido pelo menos um gene endógeno que codifica uma actividade catalítica não específica codifica um poli-peptídeo contendo a sequência da SEQ ID NO: 57.
23. 23. 0 processo da Reivindicação 22, em que a E. coli recombinante compreende adicionalmente: (a) um conjunto de genes exógenos constituído por (i) pelo menos um gene que codifica um poli- peptídeo contendo a actividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase; (ii) pelo menos um gene que codifica um poli- peptídeo contendo a actividade da glicerol—3-fosfatase; e (iii) pelo menos um subconjunto de genes que codifica os produtos de gene de dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaBl, dhaB2, dhaB3 e orfZ, e (b) um conjunto de genes endógenos, contendo cada gene uma mutação que inactiva o gene, sendo o conjunto constituído por: (i) um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol cinase; (ii) um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol desidrogenase; e (iii) um gene que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da triosefosfato isomerase. 10 ΡΕ1204755
24. 24. O vector ρΚΡ32 compreendendo dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaBl, dhaB2, dhaB3 e orfZ como descrito na SEQ ID NO: 1.
25. 25. Uma estirpe de E. coli recombinante compreendendo : (a) um conjunto de dois genes endógenos, contendo cada gene uma mutação que inactiva o gene, sendo o conjunto constituído por (i) um gene que codifica um polipeptídeo contendo uma actividade de glicerol cinase; e (ii) um gene que codifica um polipeptídeo contendo uma actividade de glicerol desidrogenase; (b) pelo menos um gene exógeno que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase; (c) pelo menos um gene exógeno que codifica um polipeptídeo contendo a actividade da glicerol—3- fosfatase; e (d) um vector pKP32, como definido na Reivindicação 24, em que nenhum gene funcional dhaT que codifica uma actividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol está presente na E. coli recombinante.
26. 26. Um processo para a produção de 1,3-propa-nodiol compreendendo: (a) o contacto, sob condições adequadas, de uma E. coli recombinante compreendendo um regulão dha e sem um 11 ΡΕ1204755 gene dhaT funcional que codifica uma actividade de oxidoredutase de 1,3-propanodiol com pelo menos uma fonte de carbono, em que a fonte de carbono é seleccionada a partir do grupo constituído por monossacarideos, oligossacarideos, polissacarídeos, e substratos de um carbono; e (b) a recuperação opcional do 1,3-propanodiol produzido em (a). Lisboa, 21 de Setembro de 2006