TWI515293B - 用於生產甘油及甘油衍生產物且具有增強乙醯輔酶ａ合成酶活性之重組大腸桿菌 - Google Patents

Description

用於生產甘油與甘油衍生產物且具有增強乙醯輔酶A合成酶活性之重組大腸桿菌

本發明涉及微生物學與分子生物學領域。更特定的是，所提供者為具有增強乙醯輔酶A(acetyl-CoA)合成酶活性與生產甘油與甘油衍生產物之能力的重組大腸桿菌(Escherichia coli,E. coli)，以及利用此類重組細菌的方法。

多元醇1,3-丙二醇(PDO)為一種可用於生產各式聚合物之單體，包括聚酯、聚胺甲酸酯、聚醚與環狀化合物。這些聚合物最終用於纖維、膜、塗層、複合材料、溶劑、抗凍劑、共聚酯與其他加值應用。雖然1,3-丙二醇可藉由化學合成生產，但經由發酵作用的生物生產較化學合成有數種優勢，包括提供一永續且更加環境友善的製程。使用重組工程細菌並利用廉價碳源(諸如葡萄糖或其他糖類)來進行發酵作用，以生產1,3-丙二醇係為習知者(請參見如美國專利第5,686,276號、美國專利第6,358,716號、美國專利第6,136,576號與美國專利第7,524,660號)。然而，生產1,3-丙二醇之發酵性途徑會產生殘餘物質(如乙酸)，其會對產自此單體之聚合物品質產生不利影響。因此，需要藉由各式分離方法將此殘餘物質由該1,3-丙二醇產物中移除，包括離子交換與蒸餾。乙酸的存在特別難處理，因為需要高離子交換能力以將其濃度降低至可接受的程度。

所以，需要將在1,3-丙二醇與其他甘油衍生產物生產(藉由發酵)期間所產生之乙酸量降低，以增加得到具有可接受純度水準之產物所需的分離程序容量。此外，已知乙酸為會抑制細菌生長之副產物(Lin et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 71:870-874,2006)，所以減少乙酸產生可能會提高1,3-丙二醇的產率。

在一實施例中，本發明提供一種重組大腸桿菌，其包含一可操作地連結至一核苷酸序列之啟動子(promoter)，該核苷酸序列編碼(encoding)一具有乙醯CoA合成酶活性的多肽；其中該啟動子與核苷酸序列各獨立為原生(native)或非原生(non-native)；進一步的是其中該重組大腸桿菌相較於其親體大腸桿菌(parent E. coli)(該重組大腸桿菌係衍生自該親體大腸桿菌)具有增強乙醯CoA合成酶活性，並且該重組大腸桿菌生產甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥丙酸；其限制條件是若該啟動子與核苷酸序列皆為原生，則該重組大腸桿菌包含至少兩個該啟動子與核苷酸序列之拷貝(copy)。

在另一實施例中，本發明提供一種用於製造甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥丙酸之方法，其包含：

a)　在一合適生長培養基中培養一如本文所述之重組大腸桿菌；以及

b)　選擇性地，回收所生產的甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥丙酸。

簡單序列說明

以下序列符合37 C.F.R. 1.821 1.825(“Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”)並且與世界智慧財產權組織(WIPO)標準ST.25(2009)以及EPO與PCT之序列表要求(Rules 5.2 and 49.5(a bis),and Section 208 and Annex C of the Administrative Instructions)一致。用於核苷酸與胺基酸序列資料之符號與格式符合37 C.F.R. §1.822所設立之規定。

SEQ ID NO:33為噬菌體T5啟動子(phage T5 promoter)之核苷酸序列。

SEQ ID NO:34為Pcat啟動子之核苷酸序列。

SEQ ID NO:35為質體(plasmid) pSYCO101之核苷酸序列。

SEQ ID NO:36為質體pSYCO103之核苷酸序列。

SEQ ID NO:37為質體pSYCO106之核苷酸序列。

SEQ ID NO:38為質體pSYCO109之核苷酸序列。

SEQ ID NO:39為質體pSYCO400/AGRO之核苷酸序列。

SEQ ID NOs:40-51、56、57、59、60、66-71、73與74為用於本文實例之引子(primer)的核苷酸序列。

SEQ ID NO:52為質體pDCQ702之核苷酸序列，如本文實例1所述。

SEQ ID NO:53為質體pDCQ703之核苷酸序列，如本文實例1所述。

SEQ ID NO:54為loxP-Kan^R-loxP-PT5卡匣(cassette)之核苷酸序列，如本文實例1所述。

SEQ ID NO:55為loxP-Kan^R-loxP-Pcat卡匣之核苷酸序列，如本文實例1所述。

SEQ ID NO:58為大腸桿菌轉運蛋白(E. coli fucP)基因之譯碼序列(coding sequence)。

SEQ ID NO:61為質體pMTP1.5fucP之核苷酸序列，如本文實例2所述。

SEQ ID NO:62為用於建構質體pMTP1.5fucPpmeI之合成連接手序列(synthetic linker sequence)之核苷酸序列，如本文實例2所述。

SEQ ID NO:63為質體pMTP1.6fucP之核苷酸序列，如本文實例2所述。

SEQ ID NO:64為質體pDCQ804之核苷酸序列，如本文實例2所述。

SEQ ID NO:65為質體pDCQ805之核苷酸序列，如本文實例2所述。

SEQ ID NOs:72嶼75為探針(probe)之核苷酸序列，如本文實例7所述。

SEQ ID NO:76為質體pDCQ806之核苷酸序列，如本文實例8-10所述。

SEQ ID NO:77為質體pDCQ807之核苷酸序列，如本文實例8-10所述。

本文所提出之各參考文獻揭露係以引用方式全文併入本文中。

如本文與隨附之申請專利範圍中所用者，單數形「一」與「該」包括複數之指稱，除非在上下文中另有明確指示。因此舉例而言，當提及「一細胞」時係包括一或多個細胞以及熟習該項技術者所習知之其等效物等等。

在本揭露之上下文中係使用多種用語與縮寫。提供下列定義。

「開放閱讀框架(Open reading frame)」係縮寫為「ORF」。

「聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction)」係縮寫為「PCR」。

美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)係縮寫為「ATCC」。

用語「乙醯CoA合成酶活性」係指一造成一酶活性之多肽，其係催化乙酸+輔酶A+ATP轉化為乙醯CoA+二磷酸+AMP。典型之乙醯CoA合成酶為EC 6.2.1.1。乙醯CoA合成酶係藉由基因acs而編碼。

如本文中所用之用語「增強乙醯CoA合成酶活性」意指本文所揭示之重組大腸桿菌在與其親體大腸桿菌之表現水準比較時，具有較高之acs基因表現水準，亦即本文中所稱之「過度表現(overexpression)」，該基因係編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽，而該重組大腸桿菌係衍生自其親體大腸桿菌。acs表現水準可使用即時PCR測定以決定在大腸桿菌中之acs轉錄水準，如本文實例4中所詳述者。

用語「甘油衍生物」與「甘油衍生產物」在本文中係可互換使用並且係指一合成自甘油或以一包括甘油之途徑合成的化合物。此類產物之實例包括3-羥丙酸、甲基乙二醛(methylglyoxal)、1,2-丙二醇與1,3-丙二醇。

用語「微生物產物」係指一以微生物方式生產之產物，即微生物代謝一物質後之產物。該產物可由該微生物天然產製，或該微生物可經基因工程以生產該產物。

用語「磷酸烯醇丙酮酸-糖磷轉移酶系統(phosphoenolpyruvate-sugar phosphotransferase)」、「PTS系統」與「PTS」在本文中係可互換使用並指磷酸烯醇丙酮酸依賴型之糖吸收系統。

用語「磷載體(phosphocarrier)蛋白質HPr」與「PtsH」係指由大腸桿菌中之ptsH所編碼的磷載體蛋白質。用語「磷酸烯醇丙酮酸-蛋白質磷轉移酶(phosphoenolpyruvate-protein phosphotransferase)」與「PtSI」係指由大腸桿菌中之ptsI所編碼的磷轉移酶(EC 2.7.3.9)。用語「葡萄糖特異性之IIA成分」與「Crr」係指由EC 2.7.1.69標示之酶，其係由大腸桿菌中之crr所編碼。PtsH、PtsI與Crr包含該PTS系統。

術語「PTS陰性」係指一在其原生態下不含有PTS系統之微生物，或是已透過去活化PTS基因而將PTS系統去活化之微生物。

用語「甘油-3-磷酸去氫酶」與「G3PDH」係指一造成酶活性之多肽，其催化二羥丙酮磷酸(DHAP)轉化為甘油3-磷酸(G3P)。體內G3PDH可為NAD依賴型或NADP依賴型。當特別提及一輔因子特異性甘油-3-磷酸去氫酶時，會使用用語「NAD依賴型甘油-3-磷酸去氫酶」與「NADP依賴型甘油-3-磷酸去氫酶」。因為在一般情況下，NAD依賴型與NADP依賴型甘油-3-磷酸去氫酶能夠可交換地使用NAD與NADP(例如藉由以gpsA編碼之酶)，所以可互換地使用用語NAD依賴型與NADP依賴型甘油-3-磷酸去氫酶。該NAD依賴型酶(EC 1.1.1.8)例如係藉由數個基因而編碼，包括GPD1(在本文中亦稱為DAR1，譯碼序列設立於SEQ ID NO:1；編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:2)或GPD2(譯碼序列設立於SEQ ID NO:3；編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:4)或GPD3。該NADP依賴型酶(EC 1.1.1.94)例如係藉由gpsA而編碼。

用語「甘油3-磷酸酶(glycerol 3-phosphatase)」、「sn-甘油3-磷酸酶」、「D,L-甘油磷酸酶」與「G3P磷酸酶」係指一具有酶活性之多肽，其能夠催化甘油3-磷酸與水轉化為甘油與無機磷酸。G3P磷酸酶例如係藉由GPP1(譯碼序列設立於SEQ ID NO:5；編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:6)或GPP2(譯碼之序列設立於SEQ ID NO:7；編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:8)而編碼。

用語「甘油脫水酶(glycerol dehydratase)」或「脫水酶」係指一具有酶活性之多肽，其能夠催化甘油分子轉化為3-羥丙醛(3-HPA)產物。

針對本發明之目的，該脫水酶包括一甘油脫水酶(EC 4.2.1.30)與一二醇脫水酶(EC 4.2.1.28)，其偏好之受質分別為甘油與1,2-丙二醇。尤其已在克留氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、佛氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)、巴斯德氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium pasteurianum)、鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)、克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)與洛德乳桿菌(Lactobacillus reuteri)中辨識出脫水酶之基因。在各個案例中，脫水酶係由三種次單元(subunit)所構成：大型或「α」次單元，中型或「β」次單元，以及小型或「γ」次單元。這些基因亦描述於例如Daniel et al.(FEMS Microbiol. Rev. 22,553(1999)) and Toraya and Mori(J. Biol. Chem. 274,3372(1999))。編碼甘油脫水酶之大型或「α」(alpha)次單元的基因包括dhaB1(譯碼序列設立於SEQ ID NO:9，編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:10)、gldA與dhaB；編碼中型或「β」(beta)次單元的基因包括dhaB2(譯碼序列設立於SEQ ID NO:11，編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:12)、gldB與dhaC；編碼小型或「γ」(gamma)次單元的基因包括dhaB3(譯碼序列設立於SEQ ID NO:13，編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:14)、gldC與dhaE。其他編碼二醇脫水酶之大型或「α」次單元的基因包括pduC與pddA；其他編碼中型或「β」次單元的基因包括pduD與pddB；並且其他編碼小型或「γ」次單元的基因包括pduE與pddC。

甘油與二醇脫水酶常遭受甘油以及其他受質之以機制為基礎的自殺型去活化作用(mechanism-based suicide inactivation)(Daniel et al.,FEMS Microbiol. Rev. 22,553(1999))。用語「脫水酶再活化因子」係指那些造成脫水酶活性再活化的蛋白質。用語「脫水酶再活化活性」、「再活化脫水酶活性」與「再生脫水酶活性」係可互換使用並指將無法催化反應之脫水酶轉化為能夠催化反應者的現象，或是抑制脫水酶去活化作用的現象，或是延長脫水酶之有用酶體內半生期的現象。已辨識出兩種與脫水酶再活化因子有關的蛋白質(請參見例如美國專利第6,013,494號與其中之參考文獻；Daniel et al.,supra;Toraya and Mori,J. Biol. Chem. 274,3372(1999)；與Tobimatsu et al.,J. Bacteriol. 181,4110(1999))。編碼此兩種蛋白質之一者的基因包括例如orfZ、dhaB4、gdrA、pduG與ddrA。編碼此兩種蛋白質之第二者的基因包括例如orfX、orf2b、gdrB、pduH與ddrB。

用語「1,3-丙二醇氧化還原酶(1,3-propanediol oxidoreductase)」、「1,3-丙二醇去氫酶(1,3-propanediol dehydrogenase)」與「DhaT」在本文中係可互換使用，並指具有一種酶活性(能夠催化3-HPA與1,3-丙二醇之相互轉化)之多肽，其限制條件是編碼此活性之基因係發現在其天然(即野生型)環境中為實體性或轉錄性地連結至一脫水酶；例如該基因係發現於一dha調節子(regulon)中，如同來自克留氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)之dhaT的情形。編碼1,3-丙二醇氧化還原酶之基因包括但不限於來自自克留氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、佛氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)與巴斯德氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium pasteurianum)之dhaT。各個這些基因編碼一屬於第III型醇去氫酶族之多肽，其展現一保留之鐵結合基序(conserved iron-binding motif)，並且偏向於NAD⁺/NADH連結之3-HPA與1,3-丙二醇相互轉化(Johnson and Lin,J. Bacteriol. 169,2050(1987)；Daniel et al.,J. Bacteriol. 177,2151(1995)；以及Leurs et al.,FEMS Microbiol. Lett. 154,337(1997))。具有類似物理性質之酶已經自短毛乳酸桿菌(Lactobacillus brevis)與布氏乳酸菌(Lactobacillus buchneri)分離出來(Veiga da Dunha and Foster,Appl. Environ. Microbiol. 58,2005(1992))。

用語「dha調節子(regulon)」係指一組編碼具有各式生物活性之多肽的相關多核苷酸或開放閱讀框架，該生物活性包括但不限於脫水酶活性、再活化活性與1,3-丙二醇氧化還原酶。典型的是，dha調節子包含開放閱讀框架dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3與orfZ，如美國專利第7,371,558號中所述。

用語「醛去氫酶(aldehyde dehydrogenase)」與「Ald」係指催化醛轉化為羧酸之多肽。醛去氫酶可使用一氧化還原輔因子如NAD、NADP、FAD或PQQ。典型之醛去氫酶係EC 1.2.1.3(NAD依賴型)；EC 1.2.1.4(NADP依賴型)；EC 1.2.99.3(PQQ依賴型)；或EC 1.2.99.7(FAD依賴型)。NADP依賴型醛去氫酶之一個例子為AldB(SEQ ID NO:16)，其由大腸桿菌基因aldB(譯碼序列設立於SEQ ID NO:15)所編碼。NAD依賴型醛去氫酶之實例包括AldA(SEQ ID NO:18)，其由大腸桿菌基因aldA(譯碼序列設立於SEQ ID NO:17)所編碼；以及AldH(SEQ ID NO:20)，其由大腸桿菌基因aldH(譯碼序列設立於SEQ ID NO:19)所編碼。

用語「葡萄醣激酶(glucokinase)」與「Glk」於本文中係可互換使用並且指一催化D-葡萄糖+ ATP轉化為葡萄糖6-磷酸+ ADP的蛋白質。典型的葡萄醣激酶為EC 2.7.1.2。葡萄醣激酶係由大腸桿菌中glk所編碼。

用語「磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)」與「Ppc」在本文中係可互換使用並指一催化磷酸烯醇丙酮酸+ H₂O+ CO₂轉化為磷酸+草乙酸之蛋白質。典型的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶為EC 4.1.1.31。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶係由大腸桿菌中之ppc所編碼。

用語「甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)」與「GapA」在本文中係可互換使用並指一具有能夠催化甘油醛3-磷酸+磷酸+ NAD⁺轉化為3-磷-D-甘油醯基-磷酸(3-phospho-D-glyceroyl-phosphate)+NADH+H⁺之酶活性的蛋白質。典型的甘油醛-3-磷酸去氫酶為EC 1.2.1.12。甘油醛-3-磷酸去氫酶係由大腸桿菌中之gapA所編碼。

用語「有氧呼吸控制蛋白質(aerobic respiration control protein)」與「ArcA」在本文中係可互換使用並指一全面性調控蛋白質(global regulatory protein)。該有氧呼吸控制蛋白質係由大腸桿菌中之arcA所編碼。

用語「甲基乙二醛合成酶(methylglyoxal synthase)」與「MgsA」在本文中係可互換使用並指一具有能夠催化二羥丙酮磷酸轉化為甲基乙二醛+磷酸之酶活性的蛋白質。典型的甲基乙二醛合成酶為EC 4.2.3.3。甲基乙二醛合成酶係由大腸桿菌中之mgsA所編碼。

用語「磷葡萄糖酸脫水酶(phosphogluconate dehydratase)」與「Edd」在本文中係可互換使用並指一具有能夠催化6-磷-葡萄糖酸轉化為2-酮-3-脫氧-6-磷-葡萄糖酸+H₂O之酶活性的蛋白質。典型的磷葡萄糖酸脫水酶為EC 4.2.1.12。磷葡萄糖酸脫水酶係由大腸桿菌中之edd所編碼。

用語「YciK」係指一由轉譯性地偶合至btuR之yciK所編碼的推定酶(putative enzyme)，該基因編碼大腸桿菌中之Cob(I)alamin腺苷轉移酶(adenosyltransferase)。

用語「cob(I)alamin腺苷轉移酶」係指一能夠將一脫氧腺苷部分(deoxyadenosyl moiety)由ATP轉移至經還原之類咕啉(corrinoid)的酶。典型的cob(I)alamin腺苷轉移酶為EC 2.5.1.17。Cob(I)alamin腺苷轉移酶係由下列基因所編碼：大腸桿菌中之「btuR」、鼠傷寒沙氏桿菌中之「cobA」以及脫氮假單孢桿菌(Pseudomonas denitrificans)中之「cobO」。

用語「半乳糖-質子同向轉運子(galactose-proton symporter)」與「GalP」在本文中係可互換使用並指一具有能夠將一糖與蛋白質由周質(periplasm)轉運至細胞質之酶活性的蛋白質。D-葡萄糖為GalP所偏好的受質。半乳糖-質子同向轉運子係由大腸桿菌中之galP(譯碼序列設立於SEQ ID NO:21，編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:22)所編碼。

用語「非特異性催化活性」係指具有能夠催化3-HPA與1,3-丙二醇相互轉化之酶活性的多肽，並且特定排除1,3-丙二醇氧化還原酶。典型的是，這些酶為醇去氫酶。此類酶可利用NAD⁺/NADH以外之輔因子(cofactor)，包括但不限於黃素(flavin)如FAD或FMN。一針對非特異性醇去氫酶(yqhD)之基因，係發現其例如內生性地編碼並功能性地表現在大腸桿菌K-12菌株內。

用語「1.6長GI啟動子」、「1.20短/長GI啟動子」與「1.5長GI啟動子」係指含有一來自變鉛青鏈黴菌(Streptomyces lividans)葡萄糖異構酶(isomerase)基因之啟動子的多核苷酸或斷片，如美國專利第7,132,527號所述。這些啟動子斷片包括一突變，相較於野生型變鉛青鏈黴菌之葡萄糖異構酶基因啟動子，此突變降低其活性。

用語「功能」與「酶功能」在本文中係可互換使用並指酶之催化活性，此活性會改變特定化學反應發生時之速率而其本身不會被該反應所消耗。已理解到此活性可應用於平衡時之反應，其中產物或受質的生產可在合適條件下達成。

用語「多肽」與「蛋白質」在本文中係可互換使用。

用語「碳受質」與「碳源」在本文中係可互換使用並指一能夠被本文所揭示之重組大腸桿菌代謝的碳源。此碳源可包含單醣如葡萄糖與果糖、寡醣如乳糖或蔗糖與多醣。

用語「宿主細胞」與「宿主細菌」在本文中係可互換使用並指一能夠接受外來或異源性基因並且能夠表現這些基因以生產活性基因產物之細菌。

如本文中所用者，「核酸」意指一多核苷酸並包括去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基之單股或雙股聚合物。核酸亦可包括斷片與經修飾之核苷酸。因此，用語「多核苷酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」或「核酸斷片」在本文中係可互換使用並指為單股或雙股之RNA或DNA聚合物，其選擇性地含有合成、非天然或經改變之核苷酸鹼基。核苷酸(通常發現其為5’-單磷酸形式)係以其單字母符號表示如下：「A」表示腺苷酸(adenylate)或去氧腺苷酸(分別用於RNA或DNA)，「C」表示胞苷酸(cytidylate)或去氧胞苷酸，「G」表示鳥苷酸(guanylate)或去氧鳥苷酸，「U」表示尿苷酸(uridylate)，「T」表示去氧胸苷酸(deoxythymidylate)，「R」表示嘌呤(A或G)，「Y」表示嘧啶(C或T)，「K」表示G或T，「H」表示A或C或T，「I」表示肌苷(inosine)，並且「N」表示任何核苷酸。

多核苷酸可為一單股或雙股之RNA或DNA聚合物，其選擇性地含有合成、非天然或經改變之核苷酸鹼基。DNA之聚合物形式的多核苷酸可由一或多個cDNA、基因體DNA(genomic DNA)、合成DNA或其混合物之片段所構成。

「基因」係指表現一特定蛋白質之核酸斷片(nucleic acid fragment)，並且其可單獨指譯碼區(coding region)或者可包括該譯碼序列之(5'非譯碼序列(non-coding sequence))前的調控序列以及(3'非譯碼序列)後之調控序列。「原生基因(Native gene)」係指一本身之調控序列如天然環境中所發現者的基因。「雜體基因(Chimeric gene)」係指任何非為一原生基因之基因，其包含不會在天然環境中所發現之調控與譯碼序列。因此，雜體基因可包含衍生自不同來源的調控序列與譯碼序列，或者衍生自相同來源但以不同於天然環境中所發現之方式排列的調控序列與譯碼序列。「內生基因」係指一原生基因，其係在一生物基因體的天然位置。「外來」基因係指一藉由基因轉移而導入至宿主生物的基因。外來基因可包含插入於一非原生生物之基因、導入至該原生宿主內之一新位置的基因或者雜體基因。

用語「原生核苷酸序列」係指一正常會發現於宿主微生物中之核苷酸序列。

用語「非原生核苷酸序列」係指一正常不會發現於宿主微生物中之核苷酸序列。

用語「原生啟動子」係指一連結至一基因之啟動子，其連接方式係相同於其正常會發現於宿主微生物中者。

用語「非原生啟動子」係指一連結至一基因之啟動子，其正常不會連結至該基因。

用語「原生多肽」係指一正常會發現於宿主微生物中之多肽。

用語「非原生多肽」係指一正常不會發現於宿主微生物中之多肽。

用語「編碼」與「譯碼」在本文中係可互換使用並指一基因係藉由該程序透過轉錄與轉譯機制而產生一胺基酸序列。

用語「譯碼序列」係指一譯碼一特定胺基酸序列的核苷酸序列。

「合適調控序列」係指位於一譯碼序列之(5'非譯碼序列)上游(upstream)、內或(3'非譯碼序列)下游的核苷酸序列，並且其影響相關譯碼序列之轉錄、RNA加工或安定性或者轉譯。調控序列可包括啟動子、加強子(enhancer)、靜止子(silencer)、5’未轉譯前導序列(5’untranslated leader sequence)(例如介於轉錄起始點(transcription start site)與轉譯起始密碼子(translation initiation codon)間)、內含子(intron)、多腺苷酸化辨識序列(polyadenylation recognition sequences)、RNA處理點(processing site)、效應子結合點(effector binding site)與幹環(stem-loop)結構。

用語「表現卡匣(expression cassette)」係指一DNA斷片，其包含一選定基因之譯碼序列以及該譯碼序列之(5'非譯碼序列)前的調控序列與(3'非譯碼序列)後之調控序列，其為表現該選定基因之產物所需者。因此，一表現卡匣典型為由下列所構成：1)一啟動子序列；2)一譯碼序列(即ORF)以及3)一3'未轉譯區(例如一終止子(terminator))，該3'未轉譯區在真核生物中通常含有一多腺苷酸化點。該表現卡匣通常包括於一載體(vector)內，以利於選殖(cloning)與轉形(transformation)。只要針對各個宿主使用正確之調控序列，即可以不同之表現卡匣使不同生物(包括細菌、酵母與真菌)轉形。

「轉形」係指使一核酸分子轉移至一宿主生物中，導致基因上穩定的遺傳。該核酸分子例如可為一自主複製之質體，或者其可結合至該宿主生物之基因體。以該核酸斷片轉形之宿主生物係稱為「重組」或「轉形」生物或「轉形株(transformant)」。「穩定轉形」係指使一核酸斷片轉移至一宿主生物之基因體，包括細胞核基因體(nuclear genome)與胞器基因體(organellar genome)，導致基因上穩定之遺傳。相對而言，「暫時轉形(transient transformation)」係指使一核酸斷片轉移至一宿主生物之細胞核或含DNA胞器，導致不具結合性(integration)或穩定遺傳性之基因表現。

「密碼子簡併性(Codon degeneracy)」係指遺傳密碼中的性質，其允許該核苷酸序列之變異而不致於影響一經編碼多肽之胺基酸序列。熟習該項技藝人士熟知，一特定宿主細胞在使用核苷酸密碼子來指定一給定之胺基酸時，會展現出「密碼子使用偏性(codon-bias)」。因此，當合成一用於改善宿主細胞中之表現的基因時，理想為設計該基因以使其密碼子使用頻率達到該宿主細胞的較佳密碼子使用頻率。

用語「功能性等效之次斷片(subfragment)」與「功能性等效次斷片」在本文中係可互換使用。這些用語係指一分離核酸斷片之一部分或次序列(subsequence)，在其中無論該斷片或次斷片是否編碼一活性酶，改變基因表現或產生某種表型之能力仍維持。雜體基因可設計為用於以連結一核酸斷片或其次斷片來進行壓制(無論其是否編碼一活性酶)，其連結係相對於一啟動子序列為正義(sense)或反義(antisense)方向。

用語「保留區(conserved domain)」或「基序(motif)」意指一組保留在特定位置(沿演化相關蛋白質之一比對序列(aligned sequence))之胺基酸。雖然在其他位置之胺基酸可在同源蛋白質(homologous protein)間變化，但在特定位置高度保留之胺基酸係指在蛋白質之結構、穩定性或活性中為必要的胺基酸。

用語「實質上相似」與「實質上對應」在本文中係可互換使用。這些用語係指核酸斷片，其中一或多個核苷酸鹼基改變不會影響該核酸斷片媒介基因表現或產生某種表型之能力。這些用語亦指對於本發明核酸斷片之修飾，例如刪除或插入一或多個核苷酸，而不會實質上改變所得核酸斷片之功能性(相對於初始未經修飾之斷片)。因此瞭解到，如熟習該項技術者所會理解者，本發明涵括特定之例示性序列以外者。再者，熟悉該項技藝人士會認知到，本發明所涵括之實質上相似核酸序列亦由其與本文中所示例之序列雜合(在中度嚴格條件下，例如0.5X SSC(標準檸檬酸鈉)、0.1% SDS(十二烷硫酸鈉)、60℃)的能力而定義，或者為本文所揭示之核苷酸序列的任何部分並且其係功能性等效於本文所揭示之所有核酸序列。可調整嚴格性條件(Stringency condition)以篩選中度相似之斷片(諸如來自遠親生物之同源序列)，或高度相似斷片(例如由近親生物複製功能性酶的基因)。後雜合洗滌(Post-hybridization wash)會決定嚴格性條件。

用語「選擇性雜合」包括在嚴格雜合條件下，對於雜合一核酸序列成為特定核酸標的序列的指稱，並且雜合程度係大於其雜合成為非標的核酸序列而且為實質排除非標的核酸至一可檢測出之程度(例如至少超過背景2倍)。選擇性雜合(Selectively hybridizing)序列為兩種核苷酸序列，其中該核苷酸序列之一者的補體對於另一核苷酸序列典型具有約至少80%的序列一致性(sequence identity)，或90%的序列一致性，以及高達並且包含100%的序列一致性(即完全互補)。

用語「嚴格條件(stringent condition)」或「嚴格雜合條件」包括對於一探針(probe)會選擇性雜合成為其標的序列之條件的指稱。探針典型為單股核酸序列，其互補於擬檢測之核酸序列。探針對於擬檢測之核酸序列係為「可雜合(hybridizable)」。一般而言，探針長度係小於約1000核苷酸，長度可選擇性地小於500核苷酸。

雜合方法已有清楚定義。典型的是，該探針與樣品係在允許核酸雜合的條件下混合。此涉及使該探針與樣品於無機或有機鹽存在下在適當的濃度與溫度條件下接觸。可選擇的是，可加入促溶劑(chaotropic agent)。核酸雜合可適用於各式不同之檢定形式。其中一種最適合者為三明治(sandwich)檢定形式。三明治型檢定的主要成分為一固體支持物。該固體支持物已吸附或共價偶合一固定化核酸探針，其係未經標誌並互補於該序列之一部分。

嚴格條件係取決於序列並在不同環境下會有所不同。藉由控制該雜合及/或洗滌條件的嚴格性，可將100%互補於該探針(同源探測)之標的序列辨識出來。或者，可調整嚴格性條件以容許某些序列中的不匹配(mismatching)，所以會檢測到較低程度的相似性(異源探測)。

典型的是，嚴格條件會是其中鹽濃度低於約1.5 M Na離子者，典型為在pH 7.0至8.3下係約0.01至1.0 M Na離子濃度(或其他鹽類)，對於短探針(例如10至50核苷酸)溫度為至少約30℃，而對於長探針(例如大於50核苷酸)則為至少約60℃。嚴格條件亦可在去穩定劑(destabilizing agent)如甲醯胺加入下而達成。例示性的低度嚴格性條件包括在37℃下以30至35%甲醯胺、1 M NaCl、1% SDS(十二烷硫酸鈉)的緩衝溶液雜合，以及在50至55℃下以1X至2X SSC(20X SSC=3.0 M NaCl/0.3 M檸檬酸三鈉鹽)洗滌。例示性的中度嚴格性條件包括在37℃下於40至45%甲醯胺、1 M NaCl、1% SDS中雜合，並且在55至60℃下以0.5X至1X SSC洗滌。例示性的高度嚴格性條件包括在37℃下於50%甲醯胺、1 M NaCl、1% SDS中雜合，並且在60至65℃下以0.1X SSC洗滌。

特異性典型為後雜合洗滌之功能，關鍵因子為離子強度以及最終洗滌溶液的溫度。針對DNA-DNA雜合體(hybrid)，其熱熔點(T_m)可由以下之方程式近似而得：Meinkoth et al.,Anal. Biochem. 138:267-284(1984): T_m=81.5℃+16.6(log M) +0.41(%GC) -0.61(% form) -500/L；其中M為單價陽離子之莫耳濃度，%GC為鳥苷(guanosine)與胞嘧啶(cytosine)核苷酸在DNA中之百分比，% form為甲醯胺在雜合溶液中之百分比，並且L為雜合體之鹼基對長度。該T_m為在此溫度下(於預定之離子強度與pH下)50%的互補標的序列會雜合至一完全匹配探針。對於每1%的不匹配，T_m會降低約1℃；因此，可調整T_m、雜合及/或洗滌條件以雜合至具有所欲一致性的序列。例如，若尋求具有90%一致性的序列，則可將T_m降低10℃。一般而言，在預定之離子強度與pH下，針對特定序列及其補體，嚴格條件係選擇為較T_m低5℃。然而，嚴謹的嚴格條件可在較T_m低1、2、3或4℃下利用雜合及/或洗滌；中度的嚴格條件可在較T_m低6、7、8、9或10℃下利用雜合及/或洗滌；低度嚴格性條件可在較T_m低11、12、13、14、15或20℃下利用雜合及/或洗滌。利用此方程式、雜合與洗滌組成以及所欲之T_m，具有通常知識者會理解雜合嚴格性及/或洗滌劑溶液的變化係以內含的方式而描述。若所欲之不匹配程度會導致T_m低於45℃(水溶液)或32℃(甲醯胺溶液)，較佳為提高SSC濃度而能夠使用較高的溫度。關於核酸雜合的廣泛指南係發現於Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,New York(1993)；以及Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Ausubel et al.,Eds.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1995)。可施加雜合及/或洗滌條件達至少10、30、60、90、120或240分鐘。

在核酸或多肽序列上下文中的「序列一致性」或「一致性」係指在一指定之比較窗(comparison window)中以最大對應性(correspondence)比對時，兩個序列中之核酸鹼基或胺基酸殘基係為相同。

因此，「序列一致性百分比」係指藉由比較在一比較窗中之兩個最佳比對序列所測定之值，其中在該比較窗中之多核苷酸或多肽序列部分可包含加入或刪除(即間隙)而使兩個序列最佳比對，此係相較於參考序列(其未包含加入或刪除)。該百分比係藉由下列方式而計算得到：測定相同核酸鹼基或胺基酸殘基出現在兩個序列中的位置數目以產生匹配位置數目，將匹配位置數目除以比較窗中之位置總數，並將結果乘以100而產生序列一致性的百分比。有用之序列一致性百分比實例包括但不限於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或任何50%至100%間之整數百分比。這些一致性可使用任何本文中所述之程式測定。

序列比對(alignment)與一致性百分比或相似性計算可使用各式設計以檢測同源序列的比較方法來測定，包括但不限於LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的MegAlign^TM程式。在閱讀此申請案之上下文時會理解到，在使用序列分析軟體進行分析時，分析結果係基於所參照程式的「預設值(default value)」，除非另有指明。如本文中所用者，「預設值」意指首次初始化時，任何原先載入於軟體內之數值或參數組。

該「Clustal V比對法」對應於標示為Clustal V的比對方法(如Higgins and Sharp,CABIOS. 5:151-153(1989);Higgins,D.G. et al.,Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992)所述)並發現於LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的MegAlign^TM程式中。針對多重比對，預設值對應於GAP PENALTY=10以及GAP LENGTH PENALTY=10。用於成對比對(pairwise alignment)與使用Clustal V法計算蛋白質序列之一致性百分比的預設參數為KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5與DIAGONALS SAVED=5。針對核酸，這些參數為KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4與DIAGONALS SAVED=4。在使用Clustal V程式比對序列後，藉由檢視相同程式中之「序列距離」表即可能獲得「一致性百分比」。

該「Clustal W比對法」對應於標示為Clustal W的比對法(如Higgins and Sharp,supra;Higgins,D.G. et al.,supra所述)並發現於LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的MegAlign^TM v6.1程式中。用於多重比對之預設參數對應於GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.2、Delay Divergen Seqs(%)=30、DNA Transition Weight=0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet Series、DNA Weight Matrix=IUB。在使用Clustal W程式比對序列後，藉由檢視相同程式中之「序列距離」表即可能獲得「一致性百分比」。

「BLASTN比對法」為一種由國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)所提供之演算法，其使用預設參數比較核苷酸序列。

熟習該項技術者充分理解到，許多序列一致性程度皆可用於辨識來自其他物種的多肽，其中此類多肽具有相同或相似的功能或活性。有用之一致性百分比實例包括但不限於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或任何由50%至100%的整數百分比。實際上，任何由50%至100%之整數胺基酸一致性可用於描述本發明，諸如51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。再者，此分離核苷酸斷片的全長或部分補體亦引人注意。

因此，本發明涵括本文所揭示之特定例示性核苷酸序列以外者。例如，亦預想到為反映遺傳密碼簡併性而對基因序列所作的改變。再者，在該項技術中充分理解到，導致在給定部位產生化學等效胺基酸所作的基因改變但不會影響編碼之蛋白質的功能特性係為普遍者。針對本文討論之取代係定義為下列五個群組中其中一群組內的交換：

1.　小型脂族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；

2.　極性、負電荷殘基與其醯胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.　極性、正電荷殘基：His、Arg、Lys；

4.　大型脂族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及

5.　大型芳族殘基：Phe、Tyr、Trp。

因此，該胺基酸丙胺酸之密碼子(一疏水性胺基酸)可由一編碼另一較低疏水性殘基(如甘胺酸)或一較高疏水性殘基(如纈胺酸、白胺酸或異白胺酸)的密碼子取代。同樣地，亦可預料到導致一負電荷殘基取代另一者(諸如天冬胺酸取代麩胺酸)或一正電荷殘基取代另一者(諸如離胺酸取代精胺酸)的變化，以產生一功能等效之產物。在許多情況下，亦不會預期導致蛋白質分子之N端與C端部分改變的核苷酸變化會改變該蛋白質活性。

所提出的各種修改皆落入於該項技術之常規技藝中，正如編碼產物之生物活性保持的測定。再者，熟悉技藝人士會認知到，本發明所涵括之實質上相似序列亦由其在嚴格條件下雜合的能力所定義，如以上所定義者。

較佳之本發明實質上相似核酸斷片為具有下列性質之核酸斷片，即其核苷酸序列至少70%一致於本文中所記述之核酸斷片的核苷酸序列。更佳之核酸斷片為至少90%一致於本文中所記述之核酸斷片的核苷酸序列。最佳之核酸斷片為至少95%一致於本文中所記述之核酸斷片的核苷酸序列。

一胺基酸或核苷酸序列之「實質部分」為包含一多肽或一基因核苷酸序列之足夠胺基酸序列(足以用推定方式辨識出該多肽或基因)的部分，此推定辨識係由熟習該項技術者以人工方式評估該序列，或者藉由電腦自動化進行序列比較與辨識，其係使用如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool;Altschul,S. F.,et al.,J. Mol. Biol.,215:403-410(1993))之演算法。一般而言，一具有十個或以上鄰接胺基酸或三十個或以上核苷酸的序列係為必要，以推定辨識一多肽或核酸序列係同源於一已知蛋白質或基因。再者，關於核苷酸序列，包含20-30個鄰接核苷酸之基因特異性寡核苷酸探針可用於基因辨識之序列依賴型方法(例如南方雜合(Southern hybridization))與分離(例如菌落或噬菌體溶菌斑的原位雜合)。此外，具有12-15個鹼基的短寡核苷酸可用於作為在PCR中之放大引子(amplification primer)，以獲得一包含該引子之特定核酸斷片。因此，一核苷酸序列之「實質部分」包含該序列之足夠部分，以特定辨識及/或分離包含該序列之核酸斷片。本說明書教示完整之胺基酸以及編碼特定蛋白質之核苷酸序列。熟悉該項技藝人士(知悉如本文中所記述之序列效益)現可將所揭示序列之全部或一實質部分用於熟習該項技術者習知之目的。

用語「互補」描述在以反平行方向(anti-parallel orientation)比對時，兩個能夠達成Watson-Crick鹼基配對(base-pairing)的核苷酸鹼基序列之間的關係。例如涉及DNA時，腺苷能夠與胸嘧啶鹼基配對而胞嘧啶能夠與鳥嘌呤鹼基配對。因此，本發明可利用分離之核酸分子(互補於如隨附序列列表與說明書中所記述的完整序列)以及那些實質上相似之核酸序列。

用語「分離」係指一多肽或核苷酸序列，其係由其天然關聯之至少一個成分移出。

「啟動子」係指一DNA序列，其能夠控制一譯碼序列或功能性RNA的表現。該啟動子序列係由近側(proximal)與較遠側之上游元件(upstream element)所組成，後者元件常稱為加強子。因此，一「加強子」為一可刺激啟動子活性之DNA序列，並且可為該啟動子之內在元件(innate element)或一經插入以強化啟動子水準或組織特異性之異源元件(heterologous element)。啟動子可完全衍生自一原生基因，或者由衍生自天然發現之不同啟動子的不同元件所構成，或者甚至包含合成DNA片段。熟習該項技術者會理解到，不同啟動子可能主導在不同組織或細胞類型中的基因表現，或者在不同發育階段中的基因表現，或者反應不同環境條件下的基因表現。進一步認知到，因為在大部分情況下無法完全定義調控序列的確切邊界，某些變異的DNA斷片可能具有相同啟動子活性。造成一基因在大部分細胞類型中與大部分時間下表現的啟動子通常稱為「持續性啟動子(constitutive promoter)」。

「3’非譯碼序列」、「轉錄終止子」與「終止序列」在本文中係可互換使用並且係指位於一譯碼序列下游之DNA序列，包括多腺苷酸化辨識序列與其他編碼調控信號(能夠影響mRNA加工或基因表現)之序列。該多腺苷酸化信號通常藉由下列特性而特徵化，即影響多腺苷酸束(polyadenylic acid tract)加入至mRNA前體的3’端。

用語「可操作地連結」係指核酸序列結合於一單獨之核酸斷片上，所以該者之功能係受另一者所影響。例如，當一啟動子能夠影響一譯碼序列之表現時，其係可操作地連結於該譯碼序列(即該譯碼序列係在該啟動子的轉錄控制下)。譯碼序列可以一正義或反義方向可操作地連結至調控序列。在另一例子中，本發明之互補RNA區可直接或間接在5’可操作地連結至該標的mRNA，或者在3’連結至標的mRNA，或者連結至標的mRNA內，或者一第一互補區為5’而其補體為在3’連結至該標的mRNA。

本文中所用之標準重組DNA與分子選殖技術為該項技術中所熟知者，並且更完整地描述於Sambrook,J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,T.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor,NY(1989)中。轉形方法為熟悉該項技術者所熟知，並且描述於後。

「PCR」或「聚合酶連鎖反應」為一種用於合成大量特異性DNA片段的技術，並且由一系列的重複循環所組成(Perkin Elmer Cetus Instruments,Norwalk,CT)。典型的是，該雙股DNA係經熱變性，其兩個互補於標的片段之3’邊界的引子在低溫下黏合(annealed)而後在中溫下伸展。這三個連續步驟的一個組合稱為一「循環」。

一「質體」或「載體」為一常攜帶有基因(非為細胞之中樞代謝部分)的染色體外元件(extra chromosomal element)，並且通常為圓形雙股DNA斷片的形式。此類元件可為一單股或雙股DNA或RNA之自體複製序列、基因體結合序列、噬菌體或核苷酸序列，其可為線性或圓形並衍生自任何來源，其中將數個核苷酸序列結合或重組於一獨特結構中，該結構能夠將一表現卡匣導入至一細胞中。

用語「基因改變(genetically altered)」係指藉由基因工程、轉形及/或突變而改變遺傳物質(hereditary material)的程序。

用語「重組」係指以人工方式組合兩個彼此分開之序列片段，其係藉由例如化學合成或藉由以基因工程技術操縱分離之核酸片段。「重組」亦包括對於一細胞或載體之指稱，其係已藉由導入一異源核酸而修飾或一衍生自一如此修飾之細胞的細胞，但是並未涵括藉由天然發生之事件(例如自發性突變、天然轉形(transformation)、天然轉導(transduction)、天然轉位(transposition)諸如未經人為刻意介入而發生者之細胞或載體的改變。

用語「重組建構體(construct)」、「表現建構體」、「雜體建構體」、「建構體」以及「重組DNA建構體」在本文中係可互換使用。一重組建構體包含核酸斷片的人工組合，例如未在天然環境中一起發現的調控與譯碼序列。例如，一重組建構體可包含衍生自不同來源的調控序列與譯碼序列，或者衍生自相同來源但以不同於發現在天然環境中者的方式排列的調控序列與譯碼序列。此一建構體本身即可使用或者可與一載體結合使用。若使用一載體，則載體之選擇係取決於用以轉形宿主細胞的方法，如同熟習該項技術者所熟知者。例如，可使用一質體載體。熟悉該項技藝人士熟知必須出現在載體上之基因元件，以成功轉形、選擇並增殖包含任何本發明之分離核酸斷片的宿主細胞。熟悉該項技藝人士亦會認知到，不同之獨立轉形事件可導致不同之表現水準與形態(Jones et al.,EMBO J. 4:2411-2418(1985);De Almeida et al.,Mol. Gen. Genetics 218:78-86(1989))，並因而可能需要篩選多重事件以獲得顯示所欲之表現水準與形態的線條。此類篩選尤其可藉由DNA的南方分析法、mRNA表現的北方分析法、蛋白質表現的免疫吸漬(immunoblotting)分析法或者表型分析法而達成。

用語「表現」如本文中所用者，係指一功能性終產物(例如一mRNA或一蛋白質[可為前體(precursor)或成熟(mature)者])的產生。

用語「導入(introduced)」意指提供一核酸(例如表現建構體)或蛋白質進入一細胞。導入包括對將一核酸結合至一真核或原核細胞的指稱，其中該核酸可結合至該細胞之基因體，並且包括對將一核酸或蛋白質暫時提供至該細胞的指稱。導入包括對穩定或暫時轉形方法以及有性雜交(sexually crossing)的指稱。因此，在將一核酸斷片(例如一重組建構體/表現建構體)插入至一細胞的上下文中，「導入」意指「轉染(transfection)」或「轉形」或「轉導」並且包括對將一核酸斷片結合至一原核或真核細胞中的指稱，其中該核酸斷片可結合至該細胞之基因體(例如染色體、質體、色素體(plastid)或粒線體DNA)、轉化為一自主複製子(autonomous replicon)或暫時表現(例如經轉染之mRNA)。

用語「同源」係指具有共同之演化起源以及相似之催化功能的蛋白質或多肽。本發明可包括經由重組技術生產同源蛋白質之細菌。

本文所揭露者為重組大腸桿菌，其具有生產甘油與甘油衍生產物之能力並且亦具有增強乙醯CoA合成酶活性。該增強乙醯CoA合成酶活性係由於一acs基因的過度表現，該基因係編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽。因為具有增強乙醯CoA合成酶活性，本文所揭示之重組大腸桿菌在發酵過程中會產生較少的乙酸。在發酵液中有較低的乙酸濃度會簡化所欲產物的分離與純化，即甘油與甘油衍生產物如3-羥丙酸、甲基乙二醛、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇。

本文所揭示之重組大腸桿菌包含一可操作地連結至一核苷酸序列的啟動子，該核苷酸序列係編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽。該啟動子與核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)各獨立為原生或非原生。特別的是，該啟動子可為非原生而該核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)可為原生；該啟動子可為原生而該核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)可為非原生；該啟動子與該核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)皆可為非原生；以及啟動子與該核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)皆可為原生，若該重組大腸桿菌包含至少兩個該啟動子與該核苷酸序列的拷貝。

該acs基因在大腸桿菌K菌株中通常表現出非常低的水準(Phue et al.,J. Biotechnol. 109:21-30,2004)。在大腸桿菌中增強該乙醯Co合成酶活性以降低發酵過程中之乙酸累積的一個方法為，藉由以一非原生啟動子取代該原生啟動子以過度表現該原生acs基因。因此，在本文所揭示之重組大腸桿菌的一個實施例包含一非原生啟動子與一原生核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)。

在一實施例中，該原生核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)為來自大腸桿菌acs基因之譯碼序列，如設立於SEQ ID NO:27中者，其編碼該具有設立於SEQ ID NO:28中之胺基酸序列的多肽。在一實施例中，基於Clustal V比對方法與設立於SEQ ID NO:28中之胺基酸序列比較時，該具有乙醯CoA合成酶活性之多肽具有至少95%的胺基酸一致性。

合適的非原生啟動子在該項技術中係為熟知並且包括但不限於CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、與lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T5、T7、tac、Pcat、和trc、amy、apr以及npr啟動子。在一實施例中，該非原生啟動子為一強噬菌體T5啟動子(Deuschle et al.,EMBO 5:2987-2994,1986)。在一實施例中，該噬菌體T5啟動子具有一如設立於SEQ ID NO:33中者之核苷酸序列。此含有一T5啟動子、lacO部位與核糖體結合部位之序列可合成自該pQE30載體，該載體可得自Qiagen(Valencia,CA)。在另一實施例中，基於BLASTN比對方法與設立於SEQ ID NO:33中之核苷酸序列比較時，該T5啟動子具有一具有至少95%的序列一致性之核苷酸序列。

在另一實施例中，該非原生啟動子為一Pcat啟動子，發現其驅使氯黴素(chloramphenicol)乙醯轉移酶(編碼質體R6/5上之基因)的表現(Stuber et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,78:167-171,1981)。在一實施例中，該Pcat啟動子具有一如設立於SEQ ID NO:34中者之核苷酸序列。在另一實施例中，基於BLASTN比對方法與設立於SEQ ID NO:34中之核苷酸序列比較時，該Pcat啟動子具有一具有至少95%的序列一致性之核苷酸序列。

在另一實施例中，本文所揭示之重組大腸桿菌包含一非原生啟動子與一非原生核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)。可使用任何以上所列示之非原生啟動子。在一實施例中，該非原生啟動子為一T5啟動子，如上所述。在另一實施例中，該啟動子為一Pcat啟動子，如上所述。

來自不同來源的acs基因會提供合適的非原生核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)以用於如本文中所述之用途。acs基因的實例包括但不限於來自下列的acs基因：鼠疫耶氏桿菌(Yersinia pestis)、鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)、螢光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)以及啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。

在一實施例中，該核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)為來自啤酒酵母菌acs1基因之譯碼序列，如設立於SEQ ID NO:29中者，其編碼該具有設立於SEQ ID NO:30中之胺基酸序列的多肽。在一實施例中，基於Clustal V比對方法與設立於SEQ ID NO:30中之胺基酸序列比較時，該具有乙醯CoA合成酶活性之多肽具有至少95%的胺基酸一致性。

在另一實施例中，該核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)為來自啤酒酵母菌acs2基因之譯碼序列，如設立於SEQ ID NO:31中者，其編碼該具有設立於SEQ ID NO:32中之胺基酸序列的多肽。在一實施例中，基於Clustal V比對方法與設立於SEQ ID NO:32中之胺基酸序列比較時，該具有乙醯CoA合成酶活性之多肽具有至少95%的胺基酸一致性。

在另一實施例中，本文所揭示之重組大腸桿菌包含一原生啟動子與一非原生核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)。以上所討論之任何非原生核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)可與該原生啟動子一同使用。

在另一實施例中，本文所揭示之重組大腸桿菌包含至少兩個該原生啟動子與該原生核苷酸序列(編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)的拷貝。至少兩個拷貝係為必要以使該重組大腸桿菌具有增強乙醯基CoA合成酶活性(相較於其親體大腸桿菌菌株，其含有一個該原生acs基因的拷貝)。

該acs基因(編碼具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)的譯碼序列可用以自相同或其他微生物物種分離出編碼同源多肽的核苷酸序列。例如，該基因之同源物(homolog)可使用序列分析軟體(如BLASTN)搜尋公開之核酸序列資料庫而加以辨識。此外，使用序列依賴型協定(sequence-dependent protocol)來分離同源基因在該項技術中係為熟知。序列依賴型協定的實例包括但不限於核酸雜合方法與DNA及RNA放大方法，如藉由核酸放大技術的各式使用所示範者(例如聚合酶連鎖反應(PCR)，Mullis et al.，美國專利第4,683,202號；連接酶(ligase)連鎖反應(LCR)，Tabor,S. et al.,Proc. Acad. Sci. USA 82,1074,1985)；或單股置換放大(strand displacementam plification,SDA)，Walker,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,89: 392,(1992))。例如，上述核苷酸序列(編碼具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)可用以作為辨識同源體之雜合探針。

該項技術中具有通常知識者會理解到，編碼這些分離自其他來源之多肽的基因亦可用於本文所揭示之重組大腸桿菌中。此外，可使編碼該多肽之核苷酸序列中產生變異，並且不會因為密碼子簡併性而影響該編碼之多肽的胺基酸序列，而且會產生一實質上相似之蛋白質的胺基酸取代、刪除或加入可包括於該編碼之蛋白質中。

該核苷酸序列(編碼具有乙醯CoA合成酶活性之多肽)可使用PCR(請參見美國專利第4,683,202號)與設計為結合所欲之序列的引子加以分離(若此序列為已知者)。其他之基因分離方法對於熟習該項技術者係為熟知，例如藉由使用簡併引子(degenerate primer)或異源探針雜合。該核苷酸序列亦可以化學方式合成或購自如DNA2.0 Inc.(Menlo Park,CA)之供應商。

一編碼一多肽(具有乙醯CoA合成酶活性)之acs基因的過度表現可使用熟習該項技術者所習知之許多方法的其中一個來引發。例如，上述編碼該多肽之原生或非原生核苷酸序列可在至少一個多重拷貝(multicopy)質體上導入至該大腸桿菌，或藉由將一或多個該核苷酸序列的拷貝結合至該宿主基因體中。該導入之譯碼區(在質體上或在基因體中)可由至少一個高度活性之啟動子來表現，如上所述。一結合之譯碼區可導入作為一雜體基因(具有自身之啟動子)之一部分，或者其可結合鄰接至一高度活性之啟動子，該啟動子對於該基因體係為內生性或者在一高度表現之操作子(operon)中。

在一實施例中，本文所揭示之重組大腸桿菌能夠生產甘油。在酵母與某些細菌、其他真菌與藻類中使用碳水化合物或糖製備甘油的生物程序係為習知。透過醣解(glycolysis)中的果糖-1,6-雙磷酸途徑，細菌與酵母兩者皆藉由轉化葡萄糖或其他碳水化合物生產甘油。在本文所揭示之甘油生產方法中，宿主大腸桿菌可用於天然生產甘油。此外，大腸桿菌可經工程改造以生產甘油與甘油衍生物。自不同受質生產甘油的能力可透過甘油-3-磷酸去氫酶(G3PDH)及/或甘油-3-磷酸酶的酶活性表現而提供，如美國專利第7,005,291號所述。編碼這些用於在宿主細菌中表現酶活性之蛋白質的基因係描述於美國專利第7,005,291號。編碼具有甘油-3-磷酸去氫酶活性之多肽的基因之合適實例包括但不限於來自啤酒酵母菌的GPD1(譯碼序列設立於SEQ ID NO:1，編碼之蛋白質序列設立SEQ ID NO:2)以及來自啤酒酵母菌的GPD2(譯碼序列設立於SEQ ID NO:3，編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:4)。編碼具有甘油-3-磷酸酶活性之多肽的基因之合適實例包括但不限於來自啤酒酵母菌的GPP1(譯碼序列設立於SEQ ID NO:5，編碼之蛋白質序列設立SEQ ID NO:6)以及來自啤酒酵母菌的GPP2(譯碼序列設立於SEQ ID NO:7，編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:8)。

甘油的生產增加可透過降低標的內生性基因的表現而達到。編碼甘油激酶與甘油去氫酶活性之內生性基因的向下調控(Down-regulation)會進一步提高甘油生產，如描述於美國專利第7,005,291號中者。碳至甘油溝流效應(channeling)之增加可藉由降低編碼甘油醛3-磷酸去氫酶之內生性基因的表現而達成，如描述於美國專利第7,371,558號中者。向下調控可藉由使用任何該項技術中習知的方法而達成，例如上述用於向下調控PTS系統之基因的方法。

甘油提供一用於有用產物之微生物生產的受質。此類產物(即甘油衍生物)的實例包括但不限於3-羥丙酸、甲基乙二醛、1,2-丙二醇與1,3-丙二醇。

在另一實施例中，本文所揭示之重組大腸桿菌能夠生產1,3-丙二醇。該甘油衍生1,3-丙二醇為一單體，其在生產聚酯纖維與製造聚胺甲酸酯與環狀化合物中具有潛在實用性。1,3-丙二醇可藉由單一微生物生物轉化一碳受質(非為甘油或二羥丙酮)而生產，如描述於美國專利第5,686,276號中者。在此生物轉化中，甘油係產自該碳受質，如上所述。甘油係藉由脫水酶轉化為中間物3-羥丙醛，該脫水酶可以該宿主細菌編碼，或可藉由重組導入至該宿主中。該脫水酶可為甘油脫水酶(EC 4.2.1.30)、二醇脫水酶(EC 4.2.1.28)或任何其他能夠催化此轉化之酶。編碼甘油脫水酶之「α」(alpha)，「β」(beta)以及「γ」(gamma)次單元的基因之合適實例分別包括但不限於來自克留氏肺炎桿菌的dhaB1(譯碼序列設立於SEQ ID NO:9)、dhaB2(譯碼序列設立於SEQ ID NO:11)以及dhaB3(譯碼序列設立於SEQ ID NO:13)。3-羥丙醛可藉由1,3-丙二醇去氫酶(EC 1.1.1.202)或其他醇去氫酶催化而進一步轉化為1,3-丙二醇。編碼1,3-丙二醇去氫酶之基因的合適實例為來自克留氏肺炎桿菌的dhaT(譯碼序列設立於SEQ ID NO:23，編碼之蛋白質序列設立於SEQ ID NO:24)。

大腸桿菌可以重組方式工程改造以提供更具效率之甘油與甘油衍生1,3-丙二醇生產。例如，美國專利第7,005,291號揭露經轉形之微生物與一用於生產甘油與1,3-丙二醇的方法，其具有衍生自下列的優點，即表現甘油-3-磷酸去氫酶與甘油-3-磷酸磷酸酶其中一者或兩者之外生性活性，同時阻礙甘油激酶與甘油去氫酶其中一者或兩者之外生性活性。

美國專利第6,013,494號描述一種用於使用單一微生物生產1,3-丙二醇的方法，該微生物包含外生性甘油-3-磷酸去氫酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、脫水酶與1,3-丙二醇氧化還原酶(例如dhaT)。美國專利第6,136,576號描述一種用於生產1,3-丙二醇的方法，該方法包含一重組微生物，其進一步包含一脫水酶與蛋白質X(後來經辨識為一脫水酶再活化因子胜肽)。

美國專利第6,514,733號描述一種方法之改良，其中滴定量(titer)(每升之克產物)之顯著增加係由於轉化3-羥丙醛為1,3-丙二醇之非特異性催化活性(與由dhaT編碼之1,3-丙二醇氧化還原酶有別)所致。此外，美國專利第7,132,527號揭露可用於生產1,3-丙二醇的載體與質體。

1,3-丙二醇的生產增加可藉由進一步修飾宿主細菌而達成，包括向下調控某些標的基因的表現以及向上調控其他標的基因的表現，如描述於美國專利第7,371,558號中者。關於在PTS陰性宿主(minus host)中利用葡萄糖作為碳源，可能要增加葡萄糖激酶活性的表現。

其他增加或向上調控表現會提高1,3-丙二醇生產的基因包括編碼下列之基因：

‧　磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其典型特徵為EC 4.1.1.31

‧　cob(I)alamin腺苷轉移酶，其典型特徵為EC 2.5.1.17

‧　足以催化3-HPA與1,3-丙二醇之相互轉化的非特異性催化活性，並且特別排除1,3-丙二醇氧化還原酶，典型的是這些酶為醇去氫酶

降低或向下調控表現會提高1,3-丙二醇生產的基因包括編碼下列之基因：

‧　有氧呼吸控制蛋白質

‧　甲基乙二醛合成酶

‧　乙酸激酶

‧　磷轉乙醯酶

‧　醛去氫酶A

‧　醛去氫酶B

‧　磷酸三碳糖異構酶(triosephosphate isomerase)

‧　磷葡萄糖酸脫水酶

在另一實施例中，本文所揭示之重組大腸桿菌能夠生產3-羥丙酸。3-羥丙酸對於特用合成具有利用性，並且可藉由化學工業之習知技術轉化為商業上重要的中間物，例如藉由脫水而得到丙烯酸、藉由氧化而得到丙二酸、藉由與醇類進行酯化反應而得到酯類，以及藉由還原而得到1,3-丙二醇。3-羥丙酸可藉由生物方式以單一微生物自一可發酵之碳源生產而得，如描述於共同申請與持有之美國專利申請案第12/815461號中者。在一種代表性之生物合成途徑中，一碳受質係轉化為3-羥丙醛，如上述用於生產1,3-丙二醇中者。該3-羥丙醛係藉由醛去氫酶而轉化為3-羥丙酸。醛去氫酶的合適實例包括但不限於AldB(SEQ ID NO:16)，其由大腸桿菌基因aldB(譯碼序列設立於SEQ ID NO:15)所編碼；AldA(SEQ ID NO:18)，其由大腸桿菌基因aldA(譯碼序列設立於SEQ ID NO:17)所編碼；以及AldH(SEQ ID NO:20)，其由大腸桿菌基因aldH(譯碼序列設立於SEQ ID NO:19)所編碼。

許多上述用於改良1,3-丙二醇之生產(以一重組大腸桿菌)的修飾亦可用於改良3-羥丙酸之生產。例如，除去甘油激酶會防止甘油(藉由G3P磷酸酶之作用形成自G3P)再轉化為G3P(消耗ATP)。再者，除去甘油去氫酶(例如，gldA)會防止甘油(藉由NAD依賴型甘油-3-磷酸去氫酶作用而形成自DHAP)轉化為二羥丙酮。可將突變指向一結構基因而減低或增進酶活性，或者可指向一調控基因(包括啟動子區與核糖體結合部位)而調節酶活性之表現水準。

向上調控或向下調控可藉由各式熟習該項技術者習知的技術而達成。已充分理解到，一基因的向上調控或向下調控係指改變出現在一細胞中之活性水準(相對於一控制之活性水準)，該活性係衍生自由該基因所編碼之蛋白質，該控制之活性水準例如來自由對應(未經修改)野生型基因所編碼之蛋白質的活性。

涉及酶途徑之特定基因可經向上調控而增加其編碼之功能的活性。例如，選用基因之額外拷貝可在多重拷貝質體(如pBR322)上導入至該宿主細胞。此類基因亦可與適當之調控序列(會導致其編碼之功能活性增加)整合至該染色體。該標的基因可經修飾而在非原生啟動子或經改變原生啟動子之控制下。內生性啟動子可藉由突變、刪除及/或取代而在體內進行改變。

或者，其可用以降低或除去某些基因的表現(相對於給定之活性水準)。向下調控(阻礙)基因的方法對於熟習該項技術者係為習知。

向下調控可藉由刪除、插入或改變譯碼區及/或調控(啟動子)區而發生。特定之向下調控可藉由隨機突變接著藉由篩選或選擇而獲得，或者在該基因序列已知處，藉由以熟習該項技術者習知之分子生物方法直接介入(direct intervention)而獲得。一引發向下調控之特別有效但非唯一的方法為改變啟動子強度。

再者，向下調控基因表現可用以防止所關注蛋白質之表現，或者導致非功能性蛋白質之表現。此可藉由例如下列方式而達成：1)刪除譯碼區及/或調控(啟動子)區，2)將外生性核酸序列插入至譯碼區與/調控(啟動子)區，以及3)改變譯碼區及/或調控(啟動子)區(例如藉由進行DNA鹼基對的變化)。特定之阻礙可藉由隨機突變接著藉由篩選或選擇而獲得，或者在該基因序列已知處，藉由以熟習該項技術者習知之分子生物方法直接介入(direct intervention)而獲得。一特別有用之方法為刪除顯著量的譯碼區及/或調控(啟動子)區。

改變重組蛋白質表現之方法對於熟習該項技術者係為習知，並且部分討論於Baneyx,Curr Opin. Biotechnol.(1999) 10:411；Ross,et al.,J. Bacteriol.(1998) 180:5375；deHaseth,et al.,J. Bacteriol.(1998) 180:3019；Smolke and Keasling,Biotechnol. Bioeng.(2002) 80:762;Swartz,Curr. Opin. Biotech.(2001) 12:195；以及Ma,et al.,J. Bacteriol.(2002) 184:5733。

上述重組大腸桿菌(在基因表現中含有必要變化以過度表現acs與生產包括甘油與甘油衍生物之微生物產物)可使用該項技術中熟知的技術來建構，其中某些係示例於本文之實例中。

建構本文所揭示重組大腸桿菌可使用各式載體與轉形及表現卡匣(適用於選殖、轉形與表現acs基因與生產甘油與甘油衍生產物所必須之基因的譯碼區)而達成，如上所述。合適之載體為相容於所使用之細菌者。合適之載體可衍生自例如一細菌、一病毒(如細菌噬菌體T7或一M-13衍生之噬菌體)、一黏接質體(cosmid)、一酵母或一植物。用於獲得與使用此類載體的協定對於熟習該項技術者係為習知(Sambrook et al.,supra)。

可用於驅使本發明之譯碼區在所欲宿主細菌中表現的起始控制區或啟動子係為數眾多並且對於熟習該項技術者係為熟悉。實際上任何能夠驅使表現的啟動子皆適用於本文之用途。例如，任何以上列示之啟動子皆可使用。

終止控制區亦可衍生自原生於較佳宿主的各式基因。選擇性地，一終止部位可能為非必要；然而，若將其包括可能夠為最佳。

關於具有乙醯CoA合成酶活性之多肽的有效表現，編碼該多肽之核苷酸序列係透過起始密碼子可操作地連結至所選用之表現控制區，而使表現會導致適當傳訊RNA(messenger RNA)的形成。

在本發明中特別有用者為載體pSYCO101、pSYCO103、pSYCO106與pSYCO109，其描述於美國專利第7,371,558號中，以及pSYCO400/AGRO，其描述於美國專利第7,524,660號中。這些載體的基本元件係衍生自dha調節子，其係分離自克留氏肺炎桿菌與啤酒酵母菌。各載體含有開放閱讀框架dhaB1,dhaB2,dhaB3、dhaX(譯碼序列設立於SEQ ID NO:25)、orfX、DAR1與GPP2，其排列於三個分開之操作子中。核苷酸序列pSYCO101、pSYCO103、pSYCO106、pSYCO109與pSYCO400/AGRO係分別設立於SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38與SEQ ID NO:39。載體間的差異係說明於下表中[前綴字「p-」係指一啟動子；在各「()」中所包含之開放閱讀框架代表一操作子之組成]：

pSYCO101(SEQ ID NO:35)：相較於其他2途徑操作子在相反方向之p-trc(Dar1_GPP2)、p-1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)與p-1.6 long GI(orfY_orfX_orfW)。

pSYCO103(SEQ ID NO:36)：相較於其他2途徑操作子在相同方向之p-trc(Dar1_GPP2)、p-1.5 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)與p-1.5 long GI(orfY_orfX_orfW)。

pSYCO106(SEQ ID NO:37)：相較於其他2途徑操作子在相同方向之p-trc(Dar1_GPP2)、p-1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)與p-1.6 long GI(orfY_orfX_orfW)。

pSYCO109(SEQ ID NO:38)：相較於其他2途徑操作子在相同方向之p-trc(Dar1_GPP2)、p-1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)與p-1.6 long GI(orfY_orfX)。

pSYCO400/AGRO(SEQ ID NO:39)：相較於其他2途徑操作子在相同方向之p-trc(Dar1_GPP2)、p-1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)與p-1.6 long GI(orfY _orfX)。

相較於途徑操作子在相反方向之p-1.20短/長GI(scrK)。

一旦合適之表現卡匣建構完成，將它們用於轉形適當之宿主細菌。將含有譯碼區之卡匣導入至該宿主細菌可藉由習知程序如轉形(例如使用鈣可通透化(calcium-permeabilized)細胞或電穿孔法(electroporation))或藉由使用一重組噬菌體病毒(Sambrook et al.,supra)轉染而達成。可將表現卡匣保持在一宿主細胞中之穩定質體上。此外，可將表現卡匣透過同源或隨機重組整合至該宿主細菌之基因體，此係使用載體與熟習該項技術者熟知的方法。部位特異性之重組系統亦可用於表現卡匣之基因體整合。

除了所示例之細胞外，亦可使用具有單一或多重突變之細胞，該突變係特別設計以提高微生物產物(包括甘油及/或其衍生物)之生產。正常為將一碳原料轉向至非生產性途徑或展現顯著之分解代謝物壓制(catabolite repression)的細胞可經突變以避免這些表型缺陷。

創造突變體的方法係為普遍並且在該項技術中係為熟知。某些方法之歸納係呈現於美國專利第7,371,558號。使用輻射或化學藥劑創造突變體之特定方法在該項技術中係經文件證明。請參見如Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition(1989) Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA.，或者Deshpande,Mukund V.,Appl. Biochem. Biotechnol. 36,227(1992)。

在突變作用發生後，具有所欲表型之突變體可藉由各式方法加以選擇。在選擇具有生產所欲產物或中間物之能力的突變細胞(mutagenized cell)時，隨機篩選係最普遍者。或者，突變體之選擇性分離(selective isolation)可藉由在選擇性培養基上生長一突變族群而實施，在該選擇性培養基上僅有抗性菌落得以生長。突變體選擇方法係經高度發展並且在微生物工業技術中係為熟知。請參見如Brock,Supra;DeMancilha et al.,Food Chem. 14,313(1984)。

本發明中之發酵培養基包含一合適之碳受質。合適之碳受質包括但不限於單醣如葡萄糖與果糖、寡醣如乳糖或蔗糖以及多醣。在一實施例中，該碳受質為葡萄糖。

除了碳受質外，一合適之發酵培養基含有如合適礦物質、鹽類、輔因子、緩衝劑與其他熟習該項技術者習知之成分，其適於菌種培養與酶途徑促進且對於生產甘油與其衍生物如1,3-丙二醇為必須者。在1,3-丙二醇之生產中，尤其值得注意的是Co(II)鹽及/或維他命B12或其前驅物。

腺苷-鈷胺素(Adenosyl-cobalamin，輔酶B₁₂)對於脫水酶活性係重要之輔因子。輔酶B₁₂之合成係發現於原核生物中，其中有些能夠重新(denovo)合成該化合物，例如蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)、克留氏菌屬(Klebsiella)菌種、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)菌種與芽胞梭菌屬(Clostridium)菌種，而其他則可以進行部分反應。例如大腸桿菌無法製造咕啉(corrin)環結構，但卻能夠催化鈷啉醇醯胺(cobinamide)轉化為類咕啉(corrinoid)並且可以導入該5'-脫氧腺苷基團。因此，在該項技術中已知，在大腸桿菌發酵過程中需要提供輔酶B₁₂前體如維他命B₁₂。維他命B₁₂可以固定速率連續加入至大腸桿菌發酵過程中，或是分段加入以配合細胞團的繁殖，或者可以單一或多團添加方式加入。

典型的是，細菌細胞係在25至40℃下於適當培養基中生長。用於本文中之合適生長培養基實例為一般商業製備培養基如Luria Bertani(LB)培養液、Sabouraud Dextrose(SD)培養液或Yeast medium(YM)培養液。亦可使用其他已知成分(defined)或合成之生長培養基，並且用於生長特定細菌之適當培養基係熟習微生物或發酵科學技術者所習知。已知能直接或間接調節分解代謝物壓制之藥劑(例如環狀腺苷2':3'-單磷酸)的使用亦可結合至反應介質中。同樣地，已知能調節酶活性(例如增加1,3-丙二醇生產)之藥劑(例如甲基紫原(methyl viologen))可用於與以1,3-丙二醇生產菌株進行之基因操作一同使用，或者作為上述基因調控之替代方案。

適用於發酵的pH範圍係介於pH 5.0至pH 9.0，其中以pH 6.0至pH 8.0作為初始條件係為典型者。

反應可在有氧(aerobic)、缺氧(anoxic)或無氧(anaerobic)條件下進行，取決於該重組細菌的需求。饋料批次式(Fed-batch)發酵可以碳原料如碳受質而進行，無論是受限或過剩。

批次式發酵為常用方法。標準的批次式發酵為一封閉系統，其中培養基組成係在發酵開始時設定並且在發酵過程中未經過人為改變。因此，在發酵開始時，將培養基以所欲之細菌接種，並且即使在系統中未加入任何物質發酵仍可發生。典型的是，然而「批次式」發酵的批次係與碳源的添加有關，並且嚐試控制諸如pH與氧濃度等因素。在批次式系統，該系統之代謝物與生質組成係穩定變化，直到發酵停止的時候。在批次式培養中，細胞由靜止遲滯期(static lag phase)穩定變化至一高成長對數期(high growth log phase)，最後變為生長速率降低或停止的穩定期(stationary phase)。若未經處理，穩定期之細胞最終會死亡。終產物或中間物之主要生產通常由對數期之細胞所造成。

標準批次式系統的一種變化為饋料批次式系統。饋料批次式發酵程序亦適用於本文中並且包含一典型之批次式系統，除了其受質隨著發酵進行而以增量方式加入。在分解代謝物壓制傾向於抑制細胞代謝並且其理想為在培養基中具有限量之受質時，饋料批次式系統係為有用的。在饋料批次式系統中要量測實際受質濃度並不容易，因而受質濃度係在可量測因子之變化的基礎上加以估計，可量測因子諸如pH、溶氧與廢氣(如CO₂)分壓。批次式與饋料批次式發酵係為常見並且在該項技術領域中係為熟知，並且其例子可發現於Brock,supra。

連續式發酵為一開放系統，其中一已知成分之發酵培養基係連續加入至一生物反應器並且將等量之使用後培養基(conditioned medium)同步移除以進行處理。連續式發酵通常將培養物維持在固定之高密度，細胞在其中主要為對數期生長。

連續式發酵使一個或任何數目之因子(影響細胞生長或終產物濃度)得以受到調節。例如，有一種方法係將一限制營養如碳源或氮水準維持在固定速率並使所有其他參數穩定。在其他系統中，數個影響生長之因子可連續變化，同時細胞濃度(藉由培養基濁度量測而得)係保持恆定。連續式系統力求維持穩定態之生長條件，因此培養基排出所造成的細胞損失必須與發酵中的細胞生長率平衡。調節用於連續式發酵程序之營養與生長因子的方法以及最大化產物形成速率的技術在該工業微生物技術中係為熟知，並且各式方法係由Brock,supra詳細說明。

可預想到，本發明可使用批次式、饋料批次式或連續式程序實施並且任何習知的發酵模式皆為合適。此外可預想到，細胞可固定於一基質上作為整體細胞催化劑(whole cell catalyst)並經過發酵條件以生產甘油與甘油衍生物，如1,3-丙二醇。

在一實施例中，所提供者為一種使用上述重組大腸桿菌製造甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥丙酸的方法。該方法包含下列步驟，即如上所述在一合適生長培養基中培養一重組大腸桿菌，以及選擇性地回收所生產之甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥丙酸。可使用該項技術中習知的方法回收該產物。例如，可藉由離心、過濾、傾瀉或類似者自該發酵培養基中移出固體。接著，可使用諸如蒸餾、液液萃取或膜基分離(membrane-based separation)之方法自該發酵培養基中分離該產物，該發酵培養基如上所述已經處理而將固體移除。例如，可自該發酵液中純化1,3-丙二醇，其純化係可使用由Adkesson等人所揭示之方法(美國專利公開申請案第2005/0069997號)。

實例

於後述實例中將進一步定義本發明。應理解的是，這些實例雖然指出本發明之較佳實施例，但仍僅以說明性的方式給出。由上述說明及該等實例，本領域具有通常知識者可確定本發明之主要特徵，且在不超出本發明之精神與範圍的前提下可對本發明作各種改變及修飾，以使其適於各種用途及條件。

一般方法

實例中所述之標準重組DNA與分子選殖技術在該項技術中係為熟知並且描述於Sambrook,J.,Fritsch,E. F. and Maniatis,T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor,(1989)(Maniatis)與T. J. Silhavy,M. L. Bennan,and L. W. Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)以及Ausubel,F. M. et al.,Current Protocols in Molecular Biology,pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience(1987)。

適用於細菌培養物之維持與生長的材料與方法在該項技術中係為熟知。適用於下列實例之技術可發現於Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt,R. G. E. Murray,Ralph N. Costilow,Eugene W. Nester,Willis A. Wood,Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips,eds),American Society for Microbiology,Washington,DC.(1994))或者Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(1989)。所有描述用於維持與生長細菌細胞之試劑、限制酶(restriction enzyme)與材料可得自Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、BD Diagnostic Systems(Sparks,MD)、Life Technologies(Rockville,MD)、New England Biolabs(Beverly,MA)或Sigma Chemical Company(St. Louis,MO)。

縮寫之代表意義如下：「sec」代表秒鐘，「min」代表分鐘，「h」代表小時，「nm」代表奈米，「μL」代表微升，「mL」代表毫升，「L」代表升，「mM」代表毫莫耳濃度，「M」代表莫耳濃度，「g」代表克，「μg」代表微克，「ng」代表奈克，「bp」代表鹼基對，「kbp」代表千鹼基對，「rpm」代表每分鐘轉數，「ATCC」代表美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA)，「OD」代表光學密度，「OD550」代表在550 nm量測之光學密度，「g」代表萬有引力常數，「HPLC」代表高效液相層析法。

實例1

重組大腸桿菌菌株，在其中原生acs啟動子係以較強之持續性啟動子(Constitutive Promoter)取代

此實例描述藉由以較強之持續性啟動子取代原生acs啟動子，以提高大腸桿菌中之acs基因表現。

該持續性噬菌體T5(PT5)啟動子(SEQ ID NO:33)(Yuan,L. Z.,et al,2006,Metab. Eng. 8,79-90)與該Pcat啟動子(SEQ ID NO:34)(位於來自pBHR1(MoBiTec GmbH,Goettingen,Germany)之氯黴素抗性基因(chloramphenicol resistance gene)上游)係藉由DNA 2.0(Menlo Park,CA)而合成。該157 bp PT5啟動子與該253 bp Pcat啟動子係選殖至pMODlinker-Kan之FseI與PstI部位。該pMODlinker-Kan質體係由pMODlinker-Spec建構，其係如Viitanen等人所述(美國專利公開申請案第2009/0246876號，實例6)。將一DNA斷片(含有一Kan^r基因與其啟動子，其授予卡那黴素(kanamycin,Kan^r)抗性)插入於pMOD-連接子-Spec質體之NotI與PacI部位間，取代授予大觀黴素(spectinomycin,Spec^r)抗性之DNA斷片。該Kan^r基因與其啟動子之來源為質體pZB188/kan-XylA，其係如Viitanen等人所述(美國專利第7,741,119號，實例4)。所得之質體pDCQ702(SEQ ID NO:52)與pDCQ703(SEQ ID NO:53)分別含有PT5或Pcat啟動子，其在Kan^R基因(側翼為loxP部位)的下游。質體pDCQ702或pDCQ703係用作為模板以藉由PCR放大該1255 bp loxP-Kan^R-loxP-PT5卡匣(SEQ ID NO:54)或該1351 bp loxP-Kan^R-loxP-Pcat卡匣(SEQ ID NO:55)。針對與pDCQ702(作為模板)之反應，其引子為acsPup-loxKan5'與acsPdown-T5R(請參見表1)。針對與pDCQ703(作為模板)之反應，其引子為acsPup-loxKan5'引子與acsPdown-catR(請參見表1)。

PCR係使用下列循環條件實施：95℃歷時5 min，35個歷時30 sec之95℃循環，58℃歷時30 sec，72℃歷時2 min以及72℃歷時10 min。高傳真(High fidelity) PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶(Stratagene;La Jolla,CA)係用於PCR反應。該PCR產物係使用QIAquick PCR純化套組(Qiagen;Valencia,CA)純化。該經純化loxP-Kan^R-loxP-PT5卡匣或loxP-Kan^R-loxP-Pcat卡匣係結合於大腸桿菌K12菌株之acs位點上游，其結合係藉由Lambda Red重組(Datsenko,K. A.,and Wanner,B. L. 2000,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,6640-6645)。此大腸桿菌菌株為MG1655(ATCC No. 47076)之衍生物，該MG1655包含對內生性araBAD操作子與染色體中之poxB基因的阻礙。對於araBAD操作子與poxB基因的阻礙係與此處所述之acs啟動子取代無關。簡而言之，經純化之PCR產物係轉形為MG1655衍生之宿主菌株，其含有編碼lambda Red重組酶(recombinase)之pRedET1質體(Gene Bridges,Germany)。在含有25 μg/mL卡那黴素之Luria-Bertani(LB)盤上挑選其成分。PCR係用以確認該卡匣結合至該acs基因上游。Kan^R標記(側翼為loxP部位)係藉由Cre重組酶而移除，該重組酶係由溫度敏感之pCre-tet質體導入(Gene Bridges,Germany)。所得菌株係標示為QC1549(Pcat啟動子)與QC1550(PT5啟動子)。

實例2

在pMTP1.6fucP質體上之過度表現大腸桿菌acs基因的選殖

將可操作地連結至該PT5或Pcat啟動子之acs基因選殖至該pMTP1.6fucP質體(一fucP過度表現載體)中，其位在該fucP基因之下游。

建構該pMTP1.6fucP質體

將來自大腸桿菌菌株ATCC No. 13281之大型原生質體pMT100(描述於美國專利公開申請案第2008/0194032號)的複製起點(origin of replication)藉由PCR使用引子MTori1(設立於SEQ ID NO:56)與MTori2(設立於SEQ ID NO:57)放大。一HindIII限制酶辨識部位(restriction enzyme recognition site)係出現在其中一個PCR引子中。將所得PCR產物以限制酶DraI與HindIII分解並接合至pK194之SspI/HindIII斷片，如Jobling與Holmes所述(Nucleic Acids Res. 18:5315,1990)，其含有一多重選殖部位與一卡那黴素抗性基因。所得質體係命名為pMTori。為製作質體pMTP1.5與pMTP1.6，將來自pMTori1之EcoRI/HindIII斷片以來自各別pMP38質體之EcoRI/HindIII斷片取代，如美國專利第7,132,527號所述。標號「1.5」以及「1.6」係指該葡萄糖異構酶啟動子之變體，如美國專利第7,132,527號所述。將大腸桿菌fucP基因之譯碼序列(設立於SEQ ID NO:58)藉由PCR使用引子對(設立於SEQ ID NOs:59與60)由來自大腸桿菌菌株MG1655之基因體DNA(可以ATCC No: 47076得自美國菌種保存中心)放大。將所得鈍性斷片(blunt fragment)與經HindIII分解及鈍化之pMTP1.5接合以產生pMTP1.5fucP(SEQ ID NO:61)。該質體序列係經確認。

將一pmeI限制部位加入至pMTP1.5fucP，此係藉由將一合成連接子序列(設立於SEQ ID NO:62)與經ScaI及NotI分解之pMTP1.5fucP質體接合(ligation)。該合成連接子序列具有一在該反股(reverse strand)之5’端伸出的ccgg。所得質體係標示為pMTP1.5fucPpmeI。

該質體pMTP1.6fucP(SEQ ID NO: 63)係藉由以BstEII分解pMTP1.5fucPpmeI與pMTP1.6而產生。而後將來自pMTP1.5fucPpmeI分解體之較大斷片與來自pMTP1.6分解體之較小斷片接合。所得質體序列係經確認。

過度表現之大腸桿菌acs基因的選殖

將QC1549與QC1550之基因體DNA(描述於實例1)用作為分隔PCR反應之模板。將引子Pcat up與acs down(請參見表1)用以放大來自QC1549之Pcat-acs。將引子T5 up與acs down用以放大來自QC1550之PT5-acs。其PCR條件係類似於在實例1中所述者。將PCR產物純化，並以NotI與PmeI分解。亦將載體質體pMTP1.6fucP以NotI與PmeI分解，並且與Pcat-acs或PT5-acs斷片接合。所得質體係分別標示為pDCQ804(SEQ ID NO:64)與pDCQ805(SEQ ID NO:65)。質體序列係以定序法確認。

實例3-6

藉由過度表現acs之菌株生產1,3-丙二醇

大腸桿菌菌株TTab/pSYCO400Agro為一能夠生產1,3-丙二醇(PDO)與甘油之菌株。將TTab/pSYCO400Agro以acs過度表現質體pDCQ804與pDCQ805或pMTP1.6fucP轉形。

大腸桿菌菌株TTab pSYCO400/AGRO(PTS陰性菌株)

菌株TTab係藉由自菌株TT aldA中刪除aldB基因而產生，如美國專利第7,371,558號所述(實例17)。簡而言之，要刪除aldB，係先以pKD3質體之FRT-CmR-FRT卡匣取代大腸桿菌菌株MG1655中之1.5 kbp的aldB譯碼區(Datsenko and Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645,2000)。使用pKD3作為模板以引子對SEQ ID NO:66與SEQ ID NO:67放大一取代卡匣。引子SEQ ID NO:66含有80 bp的同源體於aldB的5’端，以及20 bp的同源體於pKD3。引子SEQ ID NO:67含有80 bp的同源體於aldB的3’端，以及20 bp的同源體於pKD3。將PCR產物以凝膠純化並電穿孔至MG1655/pKD46勝任細胞(competent cell)(美國專利第7,371,558號)。在LB盤上以12.5 mg/L的氯黴素挑選重組菌株。該aldB基因之刪除係藉由PCR使用引子對SEQ ID NO:68與SEQ ID NO:69而確認。該野生型菌株產出一1.5 kbp PCR產物，而該重組菌株產出一特徵性的1.1 kbp PCR產物。製備一P1溶解產物(lysate)並用以將突變移往該TT aldA菌株以形成該TT aldAΔaldB::Cm菌株。一具氯黴素抗性之純株係藉由基因體PCR以引子對SEQ ID NO:68與SEQ ID NO:69檢查以確認該突變出現。該氯黴素抗性標記係使用該FLP重組酶而移除(Datsenko and Wanner,supra)以創造TTab。菌株TTab而後以pSYCO400/AGRO(設立於SEQ ID NO:39)轉形(如美國專利第7,524,660號(實例4)所述)，以產生菌株TTab pSYCO400/AGRO。

如引用之參考文獻所述，菌株TTab為大腸桿菌菌株FM5(ATCC No. 53911)之衍生物，其含有下列修飾：刪除glpK,gldA,ptsHI,crr,edd,arcA,mgsA,qor,ackA,pta,aldA與aldB基因；向上調控galP,glk,btuR,ppc，與yqhD基因；以及向下調控gapA基因。

質體pSYCO400/AGRO含有編碼一甘油生產途徑(DAR1與GPP2)之基因與編碼一甘油脫水酶及相關再活化因子(dhaB123,dhaX,orfX,orfY)之基因，以及一編碼一果糖激酶(scrK)之基因。

以acs過度表現質體轉形大腸桿菌菌株TTab pSYCO400/AGRO

TTab/pSYCO400Agro係以該acs過度表現質體pDCQ804與pDCQ805(或pMTP1.6fucP(實例2))轉形，並且藉由在含25 μg/mL卡那黴素之LB瓊脂培養基上生長而挑選轉形體。將成功之轉形體分別標示為PDO3043、PDO3044與PDO3042。揀選出各菌株之多個轉形體並且使用Bioscreen C生長室(growth chamber)[Bioscreen,Helsinki,Finland]初步檢驗其生長表型。

來自該轉形盤之各菌株的菌落先在150 μL的LA培養基(1%胰化蛋白，0.5%酵母萃取物，0.05%氯化鈉)生長，該培養基含有100 μg/mL大觀黴素與25 μg/mL卡那黴素並在一Costar 96孔U形底盤(Corning Inc.,Corning,NY)中。在37℃下接種該盤並伴隨振動。將新鮮之過夜培養物以1:100稀釋至在Bioscreen蜂巢盤(honeycomb plate)之MOPS-TM3培養基中，該培養基含有10 g/L葡萄糖。MOPS-TM3為一基本培養基，其含有50 mM MOPS緩衝劑pH6.8、6.0 mM磷酸鉀緩衝劑pH 6.8、2.04 g/L檸檬酸二水合物、2 g/L硫酸鎂七水合物、0.033 g/L檸檬酸鐵銨、0.5 g/L酵母萃取物、3 g/L硫酸銨、0.002 g/LCaCl₂‧2H₂O、0.03 g MnSO₄‧H₂O、0.51 g/L NaCl、1 mg/L FeSO₄‧7H₂O、1 mg/L CoCl₂‧6H₂O、1 mg/L ZnSO₄‧7H₂O、0.1 mg/L CuSO₄‧5H₂O、0.1 mg/L H₃BO₄、0.1 mg/L NaMoO₄‧2H₂O與足夠之NH₄OH以提供一最終pH為6.8。將維他命B₁₂與大觀黴素加入至該培養基達濃度分別為0.1 mg/L與100 μg/mL。將該蜂巢盤依照製造商指示置入該Bioscreen C儀器中。在33℃下接種該盤並伴隨持續振動並且每15分鐘記錄OD。生長曲線數據指出，大部分分離物以類似於控制菌株(PDO3042)之速率生長。

選出六個來自各菌株之獨立純株與該TTab/pSYCO400Agro親體以用於搖瓶分析(shake flask analysis)。將新鮮之過夜培養物接種至搖瓶中之12.5 mL MOPS-TM3培養基中達初始OD為0.01，該培養基含有10 g/L葡萄糖加上100 ng/mL維他命B12與100 μg/mL大觀黴素。在33℃下生長細胞並在250 rpm下振動24小時。將培養物離心並將上層液加入至0.22 μm Spin-X離心管濾器(Corning Inc.,Corning,NY)中並在10,000 g下離心1 min。藉由HPLC使用具有折射率檢測之Waters Alliance 2690 HPLC系統分析該濾液。將樣品注射至Shodex SH-1011管柱(8 mm×300 mm，購自Waters,Milford,MA)中，該管柱配備有Shodex SH-G保護管柱(6 mm×50 mm)，溫度控制在50℃，使用0.01 N H₂SO₄作為動相並且流率為0.5 mL/min。典型的是，PDO與甘油的滯留時間分別為25.4 min與20.1 min。乙酸的滯留時間為22.4 min。

HPLC的分析結果係歸納於表2。表中的各值代表六個菌落的平均，除了TTab/pSYCO400Agro(實例3，對照用)以外，其中僅有一個培養物生長。標準偏差係以括號指示。結果顯示，含不具acs之質體的菌株PDO3042(實例4，比較例)所累積的乙酸量類似於其親體TTab/pSYCO400Agro(實例3，比較例)。具有acs過度表現之菌株PDO3043(實例5)與PDO3044(實例6)分別展現約20%與40%的乙酸降低，此係相較於控制菌株PDO3042(實例4，比較例)。再者，PDO與甘油生產在這些acs過度表現菌株中並未受到負面影響。藉由較強PT5啟動子來表現acs之菌株PDO3044(實例6)顯示更多的乙酸降低，此與較高表現水準之結果一致(請參見實例7)。

實例7

藉由即時PCR分析acs轉錄水準

此實例顯示PDO3043與PDO3044中之acs基因表現提高。

將菌株TTab/pSYCO400Agro、PDO3042、PDO3043與PDO3044之新鮮過夜培養物在搖瓶中接種至MOPS-TM3培養基達初始OD為0.05，該培養基含有10 g/L葡萄糖加上100 ng/mL維他命B12與適當之抗生素。在33℃下生長細胞並在250 rpm下振動4-5小時，直到其OD達到約0.5。將2x體積的RNAprotect Bacteria Reagent(Qiagen,Valencia,CA)直接加入至培養物中。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)製備總RNA樣品。在Applied Biosystems 7900 Sequence Detection System儀器上使用兩步驟法(Applied Biosystems,Foster City,CA)進行即時反轉錄酶(RT)-PCR。在步驟1中，cDNA係使用隨機六聚物合成自所提供之RNA樣品。先將樣品以DNase(Qiagen)在室溫下處理15 min，接著在75℃下去活化5 min以消除任何殘餘之基因體DNA。而後使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)依照製造商建議之程序反轉錄RNA。在步驟2中，使PCR反應(20 μL)在AB1 7900上運行並使用下列試劑：10 μL的ABI Universal PCR Master Mix且不含UNG(uracil N-glycosylase;PN 4326614)、各0.2 μL的前置(forward)與反置(reverse)引子(100 μM)、0.05 μL 探針(100 μM)、2 μL RNA與7.55 μL的無RNase水。該PCR引子與雙標誌探針係設計為使用Primer Express v2.0軟體，其來自Applied Biosystems並購自Sigma-Genosys。啟動子與探針序列係顯示於表3。

使用下列即時PCR熱循環條件：10 min在95℃下接著40個95℃的15 sec循環與60℃歷時1 min。樣品係在濃度1 ng cDNA/反應下運行。將各樣品之(-)反轉錄RNA控制以各引子組運行，以確認無基因體DNA存在。所有反應皆運行三重複。使用ΔΔCt方法計算樣品之相對定量(請參見Applied Biosystems User Bulletin #2“Relative Quantitation of Gene Expression”,December 11,1997,updated October 2001)。針對各引子組與探針組進行線性回歸分析並且其效率係落於95-100%。將16S rRNA基因用以正規化標的基因之定量，以差異化加入至各反應之總RNA量。結果係歸納於表4。其相對定量(RQ)值為樣品中acs表現相對於其親體菌株TTab/pSYCO400Agro增加的倍數。如表4中之數據所示，含pMTP1.6fucP載體控制之PDO3042具有如同控制菌株PDO392之acs表現。含由Pcat啟動子所表現之acs的PDO3043顯示約63倍的acs表現增加。含由PT5啟動子所表現之acs的PDO3044顯示約149倍的acs表現增加。

實例8-10

酵母acs基因在一PDO生產菌株中之過度表現

使來自啤酒酵母菌之酵母acs1(SEQ ID NO:29)與acs2(SEQ ID NO:31)基因表現於大腸桿菌菌株TTab/pSYCO400Agro。

將由Pcat啟動子所表現之酵母acs1或acs2基因選殖至pMTP1.6fucP中，分別導致pDCQ806(SEQ ID NO:76)與pDCQ807(SEQ ID NO:77)。如下所述藉由重疊(overlapping) PCR而組裝Pcat-acs1或Pcat-acs2斷片。使用第一輪PCR以放大個別元件。使用Pcat up引子與Pcat down acs1或Pcat down acs2引子自QC1549模板(實例1)放大Pcat啟動子。使用acs1 up與acs1 down引子或acs2 up與acs2 down引子自酵母基因體DNA放大acs1或acs2基因。使用第二輪PCR以組裝Pcat與acs1或acs2基因。針對Pcat-acs1，將來自第一輪之Pcat(acs1)與acs1 PCR產物加入作為模板並具有Pcat up引子與acs1 down引子。針對Pcat-2，將來自第一輪之Pcat(acs2)與acs2 PCR產物加入作為模板並具有Pcat up引子與acs2 down引子。將來自第二輪之PCR產物純化，並以NotI與PmeI分解。將經限制之斷片與經NotI與PmeI分解之pMTP1.6fucP接合。所得pDCQ806與pDCQ807係藉由定序法確認。使TTab/pSYCO400Agro分別以pDCQ806與pDCQ807轉形而分別產出菌株PDO3045與PDO3046。

酵母acs1或acs2的表現效果係使用HPLC分析而測定，如實例3-6所述。其HPLC結果係歸納於表5。表中各值代表六個培養物之平均。標準偏差係以括號指示。酵母acs1基因(菌株PDO3045，實例9)或acs2基因(菌株PDO3046，實例10)表現(藉由在pMTP1.6fucP上之Pcat啟動子)在搖瓶分析中顯示，相對於不具acs基因之菌株(菌株PDO03042，實例8，比較例)，其造成約20%的乙酸降低。PDO與甘油生產在這些acs表現菌株中並未受到負面影響。

<110>　杜邦股份有限公司

<120>　用於生產甘油與甘油衍生產物且具有增強乙醯輔酶A合成酶活性之重組大腸桿菌

<130>

<160>　77

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　1176

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　1

<210>　2

<211>　391

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　2

<210>　3

<211>　1323

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<210>　4

<211>　440

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　4

<210>　5

<211>　816

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　5

<210>　6

<211>　271

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　6

<210>　7

<211>　753

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　7

<210>　8

<211>　250

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　8

<210>　9

<211>　1668

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

<220>

<221>　CDS

<222>　(1)..(1668)

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<212>　PRT

<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　10

<210>　11

<211>　585

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

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<221>　CDS

<222>　(1)..(585)

<400>　11

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<211>　194

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<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　12

<210>　13

<211>　426

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

<220>

<221>　CDS

<222>　(1)..(426)

<400>　13

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<212>　PRT

<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　14

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<211>　1539

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

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<211>　512

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<213>　Escherichia coli

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<211>　1440

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

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<211>　479

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<213>　Escherichia coli

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<210>　19

<211>　1488

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

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<222>　(1)..(1488)

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<211>　495

<212>　PRT

<213>　Escherichia coli

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<211>　1395

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

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<212>　PRT

<213>　Escherichia coli

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<211>　1164

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

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<212>　PRT

<213>　Klebsiella pneumoniae

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<211>　1824

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

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<221>　CDS

<222>　(1)..(1824)

<400>　25

<210>　26

<211>　607

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<213>　Klebsiella pneumoniae

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<211>　1959

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

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<213>　Escherichia coli

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<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

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<211>　713

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　30

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<211>　2052

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　31

<210>　32

<211>　683

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　32

<210>　33

<211>　157

<212>　DNA

<213>　Bacteriophage T5

<400>　33

<210>　34

<211>　253

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

<400>　34

<210>　35

<211>　13669

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　35

<210>　36

<211>　13543

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　36

<210>　37

<211>　13543

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　37

<210>　38

<211>　13402

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plamid

<400>　38

<210>　39

<211>　14443

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　39

<210>　40

<211>　60

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　40

<210>　41

<211>　60

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　41

<210>　42

<211>　60

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　42

<210>　43

<211>　45

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　43

<210>　44

<211>　48

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　44

<210>　45

<211>　44

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　45

<210>　46

<211>　40

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　46

<210>　47

<211>　40

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　47

<210>　48

<211>　40

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　48

<210>　49

<211>　45

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　49

<210>　50

<211>　40

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　50

<210>　51

<211>　36

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　51

<210>　52

<211>　3772

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　52

<210>　53

<211>　3868

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　53

<210>　54

<211>　1255

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　54

<210>　55

<211>　1351

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　55

<210>　56

<211>　23

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　56

<210>　57

<211>　30

<212>　DNA

<213>　Artificial Seqeunce

<220>

<223>　Primer

<400>　57

<210>　58

<211>　1317

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

<400>　58

<210>　59

<211>　25

<212>　DNA

<213>　Artificial Seqience

<220>

<223>　Primer

<400>　59

<210>　60

<211>　30

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　60

<210>　61

<211>　5770

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　61

<210>　62

<211>　109

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Synthetic Linker

<400>　62

<210>　63

<211>　5695

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　63

<210>　64

<211>　7886

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　64

<210>　65

<211>　7790

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　65

<210>　66

<211>　100

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　66

<210>　67

<211>　100

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　67

<210>　68

<211>　22

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　68

<210>　69

<211>　21

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　69

<210>　70

<211>　17

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　70

<210>　71

<211>　20

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　71

<210>　72

<211>　23

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　TaqMan fluorescently labled probe

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(1)..(1)

<223>　Labled with 6FAM(TM) fluorescein reagent

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(23)..(23)

<223>　Labled with TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)

<400>　72

<210>　73

<211>　20

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　73

<210>　74

<211>　23

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　74

<210>　75

<211>　24

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　TaqMan fluorescently labled probe

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(1)..(1)

<223>　Labeled with 6FAM(TM) fluorescein reagent

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(24)..(24)

<223>　Labeled with TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)

<400>　75

<210>　76

<211>　8069

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　76

<210>　77

<211>　7979

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　77

Claims (13)

1. 一種重組大腸桿菌，其包含一可操作地連結至一核苷酸序列之啟動子，該核苷酸序列編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽；其中該啟動子與核苷酸序列各獨立為原生或非原生；其中該啟動子為一噬菌體T5啟動子或一Pcat啟動子；進一步的是其中該重組大腸桿菌相較於衍生該重組大腸桿菌的親體大腸桿菌具有增強之乙醯CoA合成酶活性，並且該重組大腸桿菌生產甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥丙酸；其限制條件是若該啟動子與核苷酸序列皆為原生，則該重組大腸桿菌包含至少兩個該啟動子與核苷酸序列之拷貝。
2. 如請求項1所述之重組大腸桿菌，其包含一非原生啟動子與一原生核苷酸序列。
3. 如請求項2所述之重組大腸桿菌，其中該原生核苷酸序列編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽。
4. 如請求項2所述之重組大腸桿菌，其中基於BLASTN比對方法與一設立於SEQ ID NO：33中之核苷酸序列比較時，該噬菌體T5啟動子具有一具有至少95%的序列一致性之核苷酸序列。
5. 如請求項2所述之重組大腸桿菌，其中基於BLASTN比對方法與一設立於SEQ ID NO：34中之核苷酸序列比較 時，該Pcat啟動子具有一具有至少95%的序列一致性之核苷酸序列。
6. 如請求項3所述之重組大腸桿菌，其中基於Clustal V比對方法與一設立於SEQ ID NO：28中之胺基酸序列比較時，該具有乙醯CoA合成酶活性之多肽具有至少95%的胺基酸一致性。
7. 如請求項1所述之重組大腸桿菌，其包含一非原生啟動子與一非原生核苷酸序列。
8. 如請求項7所述之重組大腸桿菌，其中該非原生核苷酸序列編碼一具有乙醯CoA合成酶活性之多肽。
9. 如請求項8所述之重組大腸桿菌，其中基於Clustal V比對方法與一設立於SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32中之胺基酸序列比較時，該具有乙醯CoA合成酶活性之多肽具有至少95%的胺基酸一致性。
10. 如請求項7所述之重組大腸桿菌，其中基於BLASTN比對方法與一設立於SEQ ID NO：33中之核苷酸序列比較時，該噬菌體T5啟動子具有一具有至少95%的序列一致性之核苷酸序列。
11. 如請求項7所述之重組大腸桿菌，其中基於BLASTN比對方法與一設立於SEQ ID NO：34中之核苷酸序列比較 時，該Pcat啟動子具有一具有至少95%的序列一致性之核苷酸序列。
12. 如請求項1所述之重組大腸桿菌，其中該具有乙醯CoA合成酶活性之多肽係分類為EC 6.2.1.1。
13. 一種用於製造甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥丙酸之方法，其包含：a)在一合適生長培養基中培養如請求項1-12所述之重組大腸桿菌；以及b)選擇性地，回收所生產的甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥丙酸。