CN104919039A

CN104919039A - 在蓝藻中生产1,3-丙二醇

Info

Publication number: CN104919039A
Application number: CN201380064756.6A
Authority: CN
Inventors: J·W·钦; M·A·安德森; J·崔; M·施皮克
Original assignee: Algenol Biofuels Inc
Current assignee: Algenol Biofuels Inc
Priority date: 2012-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2015-09-16
Also published as: US20150211028A1; WO2014062997A1

Abstract

蓝藻宿主细胞被修饰以产生有用的化学品，例如1,3-丙二醇和甘油。

Description

在蓝藻中生产1,3-丙二醇

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年10月18日提交的美国临时专利申请序列号61/715,371的权益，其公开的内容通过提述并入本文。

涉及序列表

本申请包含序列表，其通过EFS-Web提交，于2013年10月11日生成，名称为"Propanediol_l_3_PCT_seq_list_ST25"，大小为102KB。

发明领域

本发明涉及经修饰以产生有用化学品如1,3-丙二醇的蓝藻宿主细胞。

发明背景

蓝藻/蓝细菌(cyanobacteria)(也称作“蓝绿藻”)是小的、主要为水生的原核细胞，其具有进行产氧光合作用，并从输入的光、营养物质和CO₂制造生物质和有机化合物的能力。蓝藻能够经遗传增强以产生有价值的产物，如生物燃料、药物、营养食品等。例如，已描述了用编码特定酶的基因转化蓝藻聚球藻属(Synechococcus)可产生用于生物燃料生产的乙醇(授予Woods等的美国专利号6,699,696和6,306,639)。在例如PCT/US2007/001071、PCT/EP2009/000892和PCT/EP2009/060526中描述了蓝藻集胞藻属(Synechocystis)的转化。

化合物1,3-丙二醇是一种粘稠、无色、可与水混溶的液体。1,3-丙二醇可被用作生产聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、尼龙、和PET变异体聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的构建块(building block)。1,3-丙二醇也可用于多种材料中，包括粘合剂、层压板(laminates)、服装(clothing)、地毯、塑料、涂料、模制品(moldings)、防冻剂、脂肪族聚酯和共聚酯。

1,3-丙二醇可以合成产生或者通过发酵产生。已经有多种不同的1,3-丙二醇合成制造方法被采用。例如，1,3-丙二醇可由下述合成产生：1)在膦、水、一氧化碳、氢和酸的存在下，由环氧乙烷在催化剂上产生；2)通过丙烯醛的催化溶液相水合随后进行还原；或3)在一氧化碳和氢的存在下，由碳氢化合物(如甘油)在具有来自周期表第VIII族的原子的催化剂上反应产生。

美国专利号5,786,524教导了从环氧乙烷制备1,3-丙二醇。该过程涉及(1)钴催化环氧乙烷加氢甲酰化(与合成气、H₂/CO反应)以制备中间产物3-羟基丙醛(HPA)的稀释溶液；(2)将HPA提取到水中形成更浓缩的HPA溶液；和(3)将HPA氢化为丙二醇。

美国专利申请公开号20110125118描述了从丙烯酸合成生产1,3-丙二醇的方法的一个预示实例(prophetic example)。该方法包括在无支持物的(unsupported)钌催化剂的存在下，使用搅拌反应罐在1000psi和150℃使3-羟基丙酸在液相(水和环己烷)中加氢。

在例如美国专利号5,686,276、美国专利号6,358,716和美国专利号6,136,576中描述了使用重组工程化细菌通过糖和甘油发酵而生物法产生1,3-丙二醇。

美国专利号8,216,816描述了可用于在微生物中产生1,3-丙二醇的生物工程方法的预示性实例。预示方法利用如下的生物学途径：酶sn-甘油-3-P脱氢酶darl(EC1.1.1；酿酒酵母(S.cerevisiae)来源)从二羟基丙酮-P、NADH和NADPH产生sn-甘油-3-P。酶sn-甘油-3-磷酸酶gpp2(EC 3.1.3.21；酿酒酵母来源)从sn-甘油-3-P产生甘油。酶甘油脱水酶dhaB1-3(EC 4.2.1.30；肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)来源)从甘油产生3-羟基丙醛。酶1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT(EC 1.1.1.202；肺炎克雷伯氏菌来源)将3-羟基丙醛和NADH转化成1,3-丙二醇。

目前生产1,3-丙二醇的方法需要输入有机碳源，如石化燃料(fossil fuel)或糖。本发明的一个目的是从CO₂作为输入碳源，而不是从石化燃料或从其它有机起始原料生产这些化合物的方法。

发明内容

在本发明的一个方面中，提供了用于在蓝藻中生产1,3-丙二醇的遗传增强的核酸序列，其具有至少一个能够在蓝藻中调节基因表达的启动子，和DAR1、GPP2、dhaB1-3、orfZ、orf2b和yqhD基因。所述核酸序列能够在蓝藻细胞中复制。至少一个基因可存在于质粒上，例如外源的或内源的质粒，或者它可存在于蓝藻染色体上。启动子可为例如Psrp、PnblA₇₁₂₀、PrbcL₆₈₀₃、PsmtA₇₀₀₂、和ziaR-PziaA₆₈₀₃。在一个实施方案中，启动子序列可为，例如，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。

编码DAR1的基因可与SEQ ID NO:6具有至少98％的同一性。DAR1多肽可与SEQ ID NO:7具有至少98％的同一性。编码GPP2的基因可与SEQID NO:8具有例如至少98％的同一性。GPP2多肽可与SEQ ID NO:9具有至少98％的同一性。dhaB1-3编码核酸序列可与SEQ ID NO:10具有至少98％的同一性。dhaB1-3核酸序列能够编码三个分离的多肽，DhaB1、DhaB2和DhaB3，其中DhaB1多肽可与SEQ ID NO:12具有至少98％的同一性，DhaB2多肽可与SEQ ID NO:14具有至少98％的同一性，而DhaB3多肽可与SEQ IDNO:16具有至少98％的同一性。orfZ和orf2b核酸序列可与SEQ ID NO:17具有至少98％的同一性。orfZ基因可编码与SEQ ID NO:19具有至少98％的同一性的多肽，并且其中orf2b基因可编码与SEQ ID NO:21具有至少98％的同一性的多肽。yqhD基因可与SEQ ID NO:22具有至少98％的同一性。YqhD多肽可与SEQ ID NO:23具有至少>98％的同一性。

在本发明的另一个方面中，提供了遗传增强的蓝藻细胞，其具有DARl基因、GPP2基因、dhaB1-3的核酸序列、orfZ基因、orf2b基因和yqhD基因，其中该细胞可产生1,3-丙二醇。所述蓝藻可为例如集胞藻属菌种PCC6803或聚球藻属菌种PCC 7002。

在本发明的另一个方面中，提供了一种在蓝藻细胞内产生1,3-丙二醇的方法，其通过向蓝藻细胞引入核酸序列，其具有编码DAR1酶的基因、编码GPP2酶的基因、编码DhaB1-3酶的基因、编码OrfZ酶的基因、编码Orf2b酶的基因和编码YqhD酶的基因；然后在产生1,3-丙二醇的条件下培养所述细胞。

附图简述

图1是用于从中心碳代谢物磷酸甘油酮(DHAP)生产1,3-丙二醇的生物合成途径的图。当将这个途径中的基因转移到蓝藻时，这些代谢物能够通过光合成和糖异生途径使用CO₂为输入碳源来产生。

图2是广宿主范围RSF1010来源的质粒pSL1211中的基因和相关特征的线性图，该质粒用作本文所述表达载体的基础。指示了相关的限制位点和终止子区(TT)。

图3是pSL1211来源质粒("pABb")的线性化图，其用作插入实施例4中所述丙二醇基因的框架质粒。指示了启动子、终止子(TT)、和核糖体结合位点(RBS)。

图4是含有如实施例4所述的参与1,3-丙二醇产生的基因编码区的核酸区段的线性化图。

图5是色谱迹线的重叠(overlay of chromatograph trace)，其确认1,3-丙二醇途径的起始部分的基因表达和从磷酸甘油酮成功转化为甘油。迹线显示携带质粒pAB1001的集胞藻属菌种PCC 6803能够产生中间产物甘油。还显示了集胞藻属菌种PCC 6803野生型和100μΜ甘油标准物。迹线是在Dionex系统上使用液相色谱分离甘油产生的。将保留时间为8.1分钟的峰鉴定为甘油。

图6是来自携带质粒pAB1003的聚球藻属菌种PCC 7002的5X浓缩的甲醇/磷酸盐提取物的图片。迹线是使用气相色谱分离1,3-丙二醇产生的。峰用质谱鉴定。将保留时间为5.88分钟的峰鉴定为1,3-丙二醇。该峰不存在于野生型聚球藻属菌种PCC 7002中。

发明详述

蓝藻宿主细胞被遗传增强以产生各种有价值的化学产物，例如1,3-丙二醇。在一个实施方案中，参与1,3-丙二醇生物合成途径的基因可被转移到蓝藻宿主细胞中。插入的异源基因可存在于染色体外的质粒上，或者它们可存在于蓝藻染色体上。然后，蓝藻按照一般的蓝藻方法进行培养，并在适当的时候移出丙二醇。在蓝藻中而不是通过使用化学手段生产1,3-丙二醇，允许以二氧化碳作为初始碳源而不是从原油或其它有机碳源生产该化合物。

本发明的方面利用分子生物学、微生物学和细胞培养领域常用的技术和方法。关于这些类型的方法的有用实验室参考对于本领域的技术人员是容易获得的。参见，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第三版),Sambrook,J等(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press；Current Protocols inMicrobiology(2007)Coico,R等编,John Wiley and Sons,Inc.；The MolecularBiology of Cyanobacteria(1994)Donald Bryant(编),Springer Netherlands；Handbook Of Microalgal Culture Biotechnology And Applied Phycology(2003)Richmond,A.；(编),Blackwell Publishing；和"The cyanobacteria,molecularBiology,Genomics and Evolution",Antonia Herrero和Enrique Flores编,CaisterAcademic Press,Norfolk,UK,2008。

在本说明书中提到的全部出版物和专利申请通过提述并入本文，其程度如同每个的出版物和专利申请被具体而个别地指示以通过提述并入。

定义

除非另外限定，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员所公知的含义。如本文所使用的，除非另外指出，否则下列术语具有归因于它们的含义。

术语“大约”在本文中使用的意思是大约、在所述范围内、粗略地或周围。当术语“大约”和数值/数值范围联合使用时，它通过延伸所提数值的上下边界对所述数值/范围进行修饰。一般地，术语“大约”在本文中用于修饰数值高于或低于所述数值的20％的变异。

术语“蓝藻”是指一群光合自养原核微生物，其能够利用太阳能和固定二氧化碳。蓝藻也被称作蓝绿藻。

术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”意在包括适合于代谢操纵的细胞，例如能够并入异源多核苷酸序列，例如可被转化的细胞。该术语意图包括最初被转化细胞的后代。在特殊的实施方案中，所述细胞是原核细胞，例如，蓝藻细胞。术语重组宿主细胞意图包括已经被选择或工程化从而具有某些期望的性能、并且适合于用本发明的组合物和方法进一步增强的细胞。

“表达感受态(Competent to express)”是指细胞提供充分的细胞环境以表达内源和/或外源多核苷酸。

如本文所使用的，术语“遗传增强”是指野生型细胞内源基因的任何改变或者向野生型细胞添加非内源的遗传密码，例如导入异源基因。更具体地，这些改变可以通过使用重组DNA技术或突变人为制造。改变可涉及蛋白编码序列或非蛋白编码序列，例如调节序列如启动子或增强子。

“多核苷酸”和“核酸”是指如下的聚合物，其包括通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关天然存在的结构变体和其合成的非天然存在的类似物)，相关天然存在的结构变体，和其合成的非天然存在的类似物。因此，该术语包括如下的核苷酸聚合物，其中核苷酸和它们之间的连接键包括非天然存在的合成类似物。应当理解，在语境需要时，当核苷酸序列用DNA序列(即A,T,G,C)代表时，它也包括RNA序列(即A,U,G,C)，其中"U"代替"T"。

本发明的核酸可以被化学或生物活性修饰，或者可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基，这是本领域技术人员容易了解的。这些修饰包括，例如标签、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰如不带电连接键、带电连接键、烷基化剂(alkylator)、嵌入剂(intercalator)、悬垂部分(pendent moieties)、经修饰的连接键、和螯合剂。还包括合成的分子，其模拟多核苷酸通过氢键和其它化学相互作用与指定序列结合的能力。

术语“核酸”(也被称为多核苷酸)也意图包括具有编码多肽的开放阅读框的核酸分子，并且可以进一步包括非编码的调节序列和内含子。此外，该术语意图包括一个或多个基因映射到(map to)功能基因座上的基因。此外，该术语意图包括用于选定目的的特定基因。该基因可为对宿主细胞内源的或者可被重组导入到宿主细胞内。

在一个方面中，本发明还提供了与本文公开的核酸具有至少60％,70％,80％,90％,95％,97％,98％,99％,或99.5％同一性的核酸。

两条核酸序列或两条氨基酸序列的百分比同一性可以使用Thompson等(CLUSTALW,1994,Nucleic Acids Research 22:4673-4680)的算法加以确定。核苷酸序列或氨基酸序列还可以用作所谓的“查询序列”对公共核酸或蛋白序列数据库进行搜索，以例如鉴定进一步未知的同源启动子，其也能够用在本发明的实施方案中。此外，在本专利申请中公开的任何核酸序列或蛋白序列也可以用作以“查询序列”，以便在公共数据库中鉴定尚未知的序列，其能够编码例如新的酶，所述酶可用于本发明。这种搜索可以使用Karlin和Altschul的算法(1990,Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.87:2,264-2,268)，Karlin和Altschul修饰的算法(1993,Proceedings of theNational Academy of Sciences U.S.A.90:5,873-5,877)执行。这种算法并入Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(1990,Journal of Molecular Biology215:403-410)。用这些程序搜索这些数据库的合适参数为，例如，对于用NBLAST程序执行的BLAST核苷酸搜索得分为100和字长为12。BLAST蛋白质搜索用XBLAST程序执行，得分为50，和字长为3。当两个序列之间存在缺口时，利用有缺口的BLAST，如Altschul等(1997,Nucleic AcidsResearch,25:3,389-3,402)所述。

“启动子”是核酸控制序列，其指导相关多核苷酸的转录，可为异源多核苷酸或者天然多核苷酸。启动子包括转录起始位点附近的核酸序列，例如聚合酶结合位点。启动子还任选地包括远端增强子或抑制子元件，其能够位于距离转录起始位点远至数千个碱基对。在一个实施方案中，启动子的转录控制导致感兴趣基因的表达增加。在另一个实施方案中，启动子位于感兴趣基因的5'。

启动子可用于代替天然启动子，或者可以和天然启动子附加使用。启动子对于使用它的宿主细胞而言可为内源的，或它可为引入宿主细胞的异源多核苷酸序列，例如对于使用它的宿主细胞而言是异源的。启动子还可对于宿主细胞而言是内源的，但是来自不同的原始基因。在一个实施方案中，启动子是组成型启动子。在另一个实施方案中，启动子是可诱导的，意思是某些外源刺激物(例如营养物饥饿、热激、机械应力、光暴露等)能够诱导该启动子导致基因的转录。

术语“重组核酸分子”包括如下的核酸分子(例如，DNA分子)，其被改变、修饰或工程化，使得它不同于该重组核酸分子所来源的天然或自然核酸分子的核苷酸序列(例如，通过添加、缺失或取代一个或多个核苷酸)。重组核酸分子(例如，重组DNA分子)也可指来源于DNA的不同位置或来自不同生物体的核酸。

“重组”是指体外合成或者以其他方式操纵的多核苷酸(“重组多核苷酸”)，还指在细胞或其它生物系统中使用重组多核苷酸产生由这些多核苷酸编码的基因产物的方法。例如，可将克隆的多核苷酸插入合适的表达载体，如细菌质粒，并且该质粒能够用于转化合适的宿主细胞。在一个实施方案中，重组多核苷酸可位于染色体外的质粒上。在另一个实施方案中，重组核酸可位于蓝藻染色体上。包含重组多核苷酸的宿主细胞称作“重组宿主细胞”或“重组细菌”或“重组蓝藻”。然后，基因在重组宿主细胞内表达以产生例如“重组蛋白”。重组多核苷酸也可发挥非编码功能(例如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。

术语“同源重组”是指两个核酸分子基于核酸序列相似性的重组过程。该术语既包括相互重组也包括非相互重组(nonreciprocal recombination)(也称为基因转变)。此外，重组可为等价或非等价的交换事件(cross-over event)的结果。等价交换发生在两个等价的序列或染色体区之间，而非等价交换发生在非等价序列或染色体区的相同(或基本上相同)区段之间。不等交换通常导致基因重复和缺失。关于参与同源重组的酶和机制的描述参见Watson等,"Molecular Biology of the Gene,"313-327页,The Benjamin/CummingsPublishing Co.第四版.(1987)。

术语“非同源或随机整合”是指任何不涉及同源重组的DNA整合入基因组中的过程。这看起来为随机的过程，其中并入可发生在大量基因组位置中的任一个处。

术语“内源表达的”是指多核苷酸对于宿主细胞是天然的，并且在宿主细胞内天然表达。

术语“操作连接的”是指两个部分之间的功能关系，其中一个部分的活性(例如调节转录的能力)导致对另一个部分发挥作用(例如序列的转录)。因此，当多核苷酸表达控制序列(如启动子或其它转录调节序列)与第二多核苷酸序列(例如天然或异源多核苷酸)之间存在功能联系，并且该表达控制序列指导该多核苷酸的转录时，该多核苷酸“与启动子操作连接”。感兴趣核酸分子或基因的核苷酸序列以如下方式连接于调节序列，所述方式允许调节该核苷酸序列的表达(例如，增强、提高、组成型、基础、减弱、降低或抑制表达)以及由该核苷酸序列编码的基因产物的表达(例如，如本文所定义的，当重组核酸分子包含在重组载体内并且被引入到微生物中)。

如本文所使用的，术语“载体”意图指核酸分子，其能够转运与其连接的另一个核酸。一种类型的载体是“质粒”，其一般是指其中可以连接额外DNA区段的环状双链DNA分子，但是也包括线性双链分子，如那些通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的或者通过用限制酶处理环状质粒产生的。

某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有能够在宿主细胞中发挥功能的复制起点的载体)。其它载体可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，借此与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与其操作连接的基因的表达。这类载体在本文中被称作“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。

在一个实施方案中，使用最初来自大肠杆菌的RSF1010载体(Mermet-Bouvier等,1993,Current Microbiology 27:323-327)作为基础质粒，用于在蓝藻宿主细胞中表达丙二醇基因。这个载体似乎相对稳定，并且能够在细胞中以大约15-20个拷贝数/细胞存在。

也可以使用其它的质粒，如来自宿主细胞菌株或另一蓝藻细胞的内源载体的质粒。“内源载体”或“内源质粒”指来自宿主细胞生物体的染色体外环状核酸分子。

术语“基因”是指编码多肽的核苷酸组装物，包括cDNA和基因组DNA核酸。“基因”也指表达特定蛋白或多肽的核酸片段，包括编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。

术语“内源基因”是指生物体基因组中处于其天然位置处的自然基因。“外来”基因或“异源”基因是指正常不在宿主生物体中发现而是通过基因转移而导入到宿主生物体内的基因。外来基因可包括插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序导入基因组的基因。

术语“核酸片段”可理解为意指相对于参考核酸在长度上减少的核苷酸序列，并且在共有部分上包括与参考核酸基本上相同的核苷酸序列。在合适的情况下，根据本发明的这种核酸片段可包含于更大的多核苷酸内，作为一个组成部分。这种片段包括下述，或者可选地由下述构成：根据本发明的多核苷酸的长度从至少大约6到大约2200或更多的连续核苷酸的寡核苷酸。

术语“开放阅读框”(缩写为“ORF”)是指一段核酸序列，DNA、cDNA或RNA，其包括翻译开始信号或起始密码子，如ATG或AUG，和终止密码子，并且能够被潜在翻译成多肽序列。

术语“上游”是指位于参考核苷酸序列5'的核苷酸序列。特别地，上游核苷酸序列一般涉及位于编码序列或转录起始点5'侧的序列。例如，大多数启动子位于转录起始位点的上游。

术语“下游”是指位于参考核苷酸序列3'的核苷酸序列。特别地，下游核苷酸序列一般涉及位于转录起始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。

术语“同源性”是指两条多核苷酸或两个多肽部分之间的百分比同一性。序列一部分与另一部分之间的一致性可通过本领域已知的技术加以确定。例如，同源性可通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序通过直接比较两条多肽分子之间的序列信息加以确定。可选地，同源性可通过如下确定：在同源区之间形成稳定二聚体的条件下使多核苷酸杂交，随后用单链特异性核酸酶消化，和对消化后片段进行大小确定。

如本文所使用的，“基本上相似”是指如下的核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变导致一个或多个氨基酸取代，但是不会影响由该DNA序列编码的蛋白质的功能性质。

术语“基本上相似”还指本发明核酸片段的修饰，如一个或多个核苷酸碱基的缺失或插入，其不会显著影响所得转录物的功能性质。

术语“限制性内切酶”和“限制酶”是指可结合并切割双链DNA内特定核苷酸序列的酶。

术语“引物”是指在合适的条件下与靶核酸序列杂交从而产生能够用作DNA合成起始点的双链核酸区的寡核苷酸。这些引物可以用在聚合酶链式反应中。

术语“聚合酶链式反应”也称作“PCR”，是指一种用于酶促扩增特定核酸序列的体外方法。PCR涉及重复系列的温度循环，每个循环包括三个阶段：模板核酸变性以分离靶分子的链，单链PCR寡核苷酸引物退火到模板核酸上，和退火引物通过DNA聚合酶延伸。PCR提供了一种检测靶分子存在的手段，并且在定量和半定量条件下确定核酸起始池内靶分子的相对量。

如本文所使用的术语“表达”是指来自核酸或多核苷酸的mRNA的转录和稳定积累。表达还可指将mRNA翻译成蛋白质或多肽。

“表达盒”或“表达构建体”是指一系列多核苷酸元件，其允许基因在宿主细胞内转录。通常，表达盒包括启动子和一个或多个被转录的异源或天然多核苷酸序列。表达盒或构建体还可包括，例如，转录终止信号、多腺苷酸化信号和增强子元件。

术语“密码子”是指编码单个氨基酸的核苷酸三联体。

术语“密码子-反密码子识别”是指mRNA分子上的密码子与tRNA分子上的相应反密码之间的相互作用。

术语“密码子偏好”是指如下的事实，即在特定生物体的基因中不是所有密码子都被以相等的频率使用。

术语“密码子优化”是指异源基因序列中存在的至少一些密码子的修饰，从宿主生物体一般不使用的三联体密码子修改成特定宿主生物体中更常用的三联体密码子。这可能会导致感兴趣基因的表达水平升高。

通过考虑如下的性质，例如待表达重组基因的生物体中的密码子使用频率，对表达构建体进行设计。密码子使用频率能使用已知的方法确定(参见例如Nakamura等.Nucl.Acids Res.28:292,2000)。密码子使用频率表，包括用于蓝藻的表，也可以在本领域中获得(例如，在Kazusa DNA研究所植物基因研究部的密码子使用数据库中(www.kazusa.or.jp/codon))。

本文所使用的术语“转化”意思是将异源遗传材料插入到宿主细胞中。通常，遗传材料是质粒载体上的DNA，但是也可以采用其他工具。用于细菌和蓝藻的一般转化方法和可选择标记是本领域已知的(Wirth,Mol Gen Genet.216:175-177(1989)；Koksharova,Appl Microbiol Biotechnol 58:123-137(2002)；Sambrook等，见前文)。

术语“可选择标记”是指一种鉴定因子，通常是抗生素或化学品抗性基因，其能够根据标记基因的效应进行选择，即抗生素抗性、除草剂抗性、比色标记、酶、荧光标记等，其中该效应用于跟踪感兴趣核酸的继承和/或鉴定继承了感兴趣核酸的细胞或生物体。本领域已知并使用的可选择标记基因的实例包括：提供对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、壮观霉素、卡那霉素、潮霉素等抗性的基因。

“多肽”是由共价连接的氨基酸残基构成的聚合化合物。“蛋白质”是在活细胞中执行结构或功能作用的多肽。

本发明还提供了参与1,3-丙二醇形成的酶的氨基酸序列，其与本文公开的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％的同一性。

本专利申请全文引用的EC编号是酶学委员会编号。这是根据所述酶催化的化学反应对酶的数字分类方案。

“异源基因”是指非自然存在于细胞内的基因。类似地，术语“异源核酸”是指非正常存在于细胞内的核酸序列。

“异源蛋白”是指非自然产生于细胞内的蛋白质。

“分离的多肽”或“分离的蛋白”是基本上不含通常与其在自然状态下相关的化合物(例如，其它蛋白质或多肽、核酸、碳水化合物、脂质)的多肽或蛋白质。

术语多肽的“多肽片段”是指氨基酸序列短于参考多肽的多肽。根据本发明的这些多肽片段的长度可为至少大约2-大约750或更多个氨基酸。

多肽或蛋白质的“变体”是来自多肽或蛋白质的任何类似物、片段、衍生物或突变体，其保留该多肽或蛋白质的至少一种生物学性质。多肽或蛋白质的不同变体可以自然存在。这些变体可以是等位基因变体，其特征是编码蛋白质的结构基因的核苷酸序列差异，或者可以涉及差异性剪切或翻译后修饰。技术人员能够产生具有单个或多个氨基酸取代、缺失、添加或置换(replacement)的变体。

制备用于遗传修饰蓝藻的重组载体

蓝藻可以被修饰添加本文所示的感兴趣酶途径，以便产生1,3-丙二醇。编码本文所述基因的DNA序列可以通过聚合酶链式反应使用特异的引物进行扩增。扩增的PCR产物可以用合适的限制酶消化，然后能够被克隆到自我复制的质粒或整合质粒中。

在一个实施方案中，感兴趣的核酸可以使用扩增技术从核酸样品扩增。可使用PCR从mRNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库直接扩增基因序列。PCR和其它体外扩增方法也可用于，例如，克隆编码待表达蛋白的核酸序列，制造用作检测样品中期望mRNA的存在的探针的核酸，和用于核酸测序。

为了在上述技术中使用分离的序列，可制备适合于转化蓝藻的重组DNA载体。转化技术是众所周知的，并且在技术和科学文献中有描述。例如，编码一个或多个本文所述基因的DNA序列可与指导从被转化蓝藻的基因转录该序列的转录和其它调节序列组合。

在一个实施方案中，用于选择阳性克隆的抗生素抗性盒可存在于质粒上，以帮助选择被转化的细胞。例如，赋予对氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素或其他抗生素的抗性的基因可插入载体中，处于合适启动子的控制之下。其它抗生素抗性基因可以根据期望加以使用。在一些实施方案中，载体含有超过一个抗生素抗性基因。编码抗生素抗性的外来基因的存在可通过，例如，将推定的被转化的细胞置于合适量的相应抗生素中，并挑取存活的细胞来进行选择。

在一个实施方案中，感兴趣的基因被插入在蓝藻染色体中。当细胞是多倍体时，基因插入物可以存在于染色体的全部拷贝中，或者存在于染色体的一些拷贝中。

在另一个实施方案中，插入的基因存在于染色体外质粒上。染色体外质粒可以高量或低量地存在于遗传增强的蓝藻中。

染色体外质粒可以来自外部来源，例如基于RSF101的质粒载体，或者它可以来源于来自蓝藻细胞或另一个蓝藻物种的内源质粒。

许多蓝藻物种具有能够用于携带生产基因的内源性载体。例如，蓝藻聚球藻属PCC7002含有6个内源质粒，其在蓝藻细胞中具有不同数目的拷贝(Xu等:"Expression of genes in cyanobacteria:Adaption of EndogenousPlasmids as platforms for High-Level gene Expression in Synechococcus PCC7002",Photosynthesis Research Protocols,Methods in Molecular Biology,684,273-293页(2011))。内源质粒pAQ1在每个细胞中具有50个拷贝数(高拷贝)，质粒pAQ3具有27个拷贝，质粒pAQ4具有15个拷贝，而质粒pAQ5在每个细胞中有10个拷贝(低拷贝)。在一个实施方案中，这些内源质粒可以用作本文所述1,3-丙二醇基因的整合平台。丙二醇途径基因可以通过同源重组，或通过其它合适的手段整合到蓝藻内源质粒中。还有可能根据内源载体的骨架并与自我复制的大肠杆菌载体的部分组合而创建“穿梭载体”，以方便遗传操纵。这样的载体可以在例如大肠杆菌中很容易地被操纵，然后将这些载体转移到蓝藻宿主菌株中，用于生产1,3-丙二醇或甘油。

在一个实施方案中，插入的基因存在于染色体外质粒上，其中该质粒在每个细胞中具有多个拷贝。质粒在每个宿主蓝藻细胞中可以具有大约1、3、5、8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或更多个拷贝。在一个实施方案中，质粒被完全分隔(segregated)。

在另一个实施方案中，插入的基因存在于被一个启动子驱动的盒上。在另一个实施方案中，插入的基因存在于分离的质粒上或在不同的盒上。

在另一个实施方案中，通过将核苷酸序列修饰成与蓝藻细胞的蛋白翻译系统相适应而对插入的基因进行修饰以实现最佳表达。用这种方式修饰核酸序列能够导致增加的基因表达。

插入的基因可以被一个启动子调节，或者它们可以被各自的启动子调节。启动子可以是组成型或可诱导的。启动子序列能够来自，例如，宿主细胞、另一个生物体，或者能够是合成来源的。

任何期望的启动子均可用于调节基因的表达用于1,3-丙二醇的生产。示例性启动子类型包括，但不仅限于，例如组成型启动子、诱导型启动子(例如通过营养物饥饿、热激、机械应力、环境胁迫、金属浓度、光暴露等)、内源启动子、异源启动子，等等。

在一个实施方案中，插入的用于1,3-丙二醇生产的基因置于选自下组的启动子的转录控制之下：rbcL、ntcA、nblA、isiA、petJ、petE、sigB、IrtA、htpG、hspA、clpBl、hliB、ggpS、psbA2、psaA、nirA、crhC和srp。启动子hspA、clpBl和hliB可被如下诱导：热激(将宿主细胞培养物的生长温度从30℃提高到40℃)、冷激(将细胞培养物的生长温度从30℃降低到20℃)、氧化胁迫(例如向培养物中添加氧化物，如过氧化氢)、或渗透压胁迫(例如通过增加盐度)。启动子sigB可通过静止生长(stationary growth)、热激和渗透胁迫诱导。启动子ntcA和nblA可通过降低生长培养基中氮的浓度被诱导，而启动子psaA和psbA2可通过低光或高光条件来诱导。启动子htpG可被渗透胁迫和热激诱导。启动子crhC可被冷激诱导。可使用铜浓度增加以诱导启动子petE，而启动子petJ可通过降低铜浓度被诱导。启动子srp可通过添加IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷)被诱导。这些启动子的其它细节可在例如PCT/EP2009/060526中发现，其内容通过提述以其整体并入本文。

在一个实施方案中，诱导型启动子选自下组：PntcA、PnblA、PisiA、PpetJ、PpetE、PggpS、PpsbA2、PpsaA、PsigB、PlrtA、PhtpG、PnirA、PhspA、PclpB1、PhliB、PcrhC、PziaA、PsmtA、PcorT、PnrsB、PaztA、PbmtA、Pbxa1、PzntA、PczrB、PnmtA和Psrp。

在某些其它的优选实施方案中，可经常使用这些启动子的截短或部分截短版本，其仅包括转录起始点天然启动子上游的一小部分，如从-35到转录起始点的区域。而且，可向启动子序列，例如TATA盒、操作子序列和/或核糖体结合位点(RBS)中引入核苷酸改变，以便修整(tailor)或优化启动子强度和/或其诱导条件，如诱导剂化合物的浓度。

在一个实施方案中，用于调节1,3-丙二醇途径基因的启动子是Psrp启动子(SEQ ID NO:1)。在另一个实施方案中，启动子是PnblA₇₁₂₀(来自念珠藻属菌种(Nostoc sp.)PCC 7120的藻胆体降解蛋白启动子(SEQ ID NO:2))。在一个实施方案中，启动子是PrbcL₆₈₀₃(来自集胞藻属菌种PCC 6803的组成性核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基启动子(SEQ ID NO:3))。另一个可使用的启动子是PsmtA₇₀₀₂(来自聚球藻属菌种PCC7002的原核生物金属硫蛋白相关蛋白的启动子(SEQ ID NO:4))。也可使用阻遏子/启动子系统ziaR-PziaA₆₈₀₃(来自集胞藻属菌种PCC 6803的锌可诱导启动子(SEQ ID NO:5))。

在蓝藻中生产1,3-丙二醇

蓝藻可被修饰生产1,3-丙二醇。用于在蓝藻中生产1,3-丙二醇的生物合成途径如图1所示。底物磷酸二羟丙酮(也称为磷酸甘油酮，并缩写为DHAP)已经存在于蓝藻细胞中。添加编码参与此途径的酶的基因能够导致产生1,3-丙二醇。

在一个实施方案中，从CO₂到1,3-丙二醇的生物化学途径涉及多个步骤。底物是：

CO₂→→→磷酸二羟丙酮→磷酸甘油→甘油→3-羟基丙醛→1,3-丙二醇

为了创建以CO₂为碳源的1,3-丙二醇生物合成途径，可将下列基因插入到蓝藻细胞中：

DAR1-GPP2-dhaBl-3-(οrfZ和orf2b)-yqhD

用于产生1,3-丙二醇的质粒的构建证明如实施例4所示。表4显示了被构建的多个质粒的列表。实施例5显示了1,3-丙二醇构建体成功转化蓝藻的实例。实施例6显示了成功转化的确证。实施例8显示了用于确定所生产的1,3-丙二醇水平的合适方法。

正如在背景部分中提到的，美国专利号8,216,816描述了用于在微生物中生产1,3-丙二醇的另一种生物工程方法的预示实例(prophetic example)。专利8,216,816中描述的预示方法描述了编码如下酶的基因：darl、gpp2、dhaBl-3和dhaT。然而，没有教导存在再激活酶(reactivase)(例如orfZ和orf2b)，它们是成功生产产品必需的。另外，专利8,216,816描述了dhaT基因的使用，其具有相对低的酶活性(Nakamura等,2003,Curr.Opin.Biotech.14:454-459)。

相反，本文所述的方法在多个方面有不同。在一个实施方案中，存在编码再激活酶orfZ和orf2b的基因，其已经被发现是成功生产产品必需的。此外，在一个实施方案中，没有使用专利8,216,816中提到的dhaT酶，而是使用yqhD酶催化3-羟基丙醛转变为1,3-丙二醇。yqhD酶具有比dhaT更高的活性(Nakamura等,2003,前文)。

包含DARl(甘油1-3磷酸脱氢酶)和GPP2(甘油-3-磷酸酶)的生物合成途径能够将磷酸甘油酮(DHAP)转变成甘油。然后通过编码辅酶B₁₂依赖的甘油脱水酶(dhaBl-3)、辅酶B₁₂再激活酶(orfZ和orf2b)和醇脱氢酶(yqhD)(其也被称作“1,3-丙二醇氧化还原酶”)的基因实现1,3-丙二醇生产。

术语“甘油-3-磷酸脱氢酶”和“DAR1”是指参与酵母中甘油磷脂代谢并响应细胞渗透胁迫的酶。该酶促进从磷酸甘油酮生产甘油磷酸。“DAR1基因”是指编码促进从磷酸甘油酮生产甘油磷酸的酶的基因。在本发明的一个实施方案中，DAR1基因来自酿酒酵母，核酸登录号#NM 001180081，蛋白登录号#NP 010262.1。在另一个实施方案中，本发明提供重组光合微生物，其包括至少一种异源DNA序列，其编码的至少一种多肽可催化底物向产物转化，导致从磷酸甘油酮合成甘油磷酸。在一个实施方案中，DAR1酶是酶分类EC#1.1.1.8的成员。在一个实施方案中，DAR1核苷酸序列是SEQ ID NO:6并且DAR1氨基酸序列是SEQ ID NO:7。

术语“甘油-3-磷酸”和“GPP2”(也称作"YER062C"和"HOR2")是指在酵母中生物合成甘油必需的酶。在酵母中，该酶被发现参与对各种细胞胁迫的响应，例如渗透压胁迫和氧化胁迫(Pahlman等,J Biol Chem.276:3555-3563；2001)。该酶能够催化从甘油磷酸形成甘油。“GPP2基因”是指编码促进从甘油磷酸产生甘油的酶的基因。在一个实施方案中，GPP2由核酸登录号#NM001178953.1编码，并且蛋白登录号为#NP 010984.1，来自酿酒酵母。在另一个实施方案中，本发明提供重组光合微生物，其包括至少一种异源DNA序列，其编码的至少一种多肽催化从底物向产物的转化，导致从甘油磷酸合成甘油。在一个实施方案中，GPP2酶是酶分类EC#3.1.3.21的成员。在一个实施方案中，GPP2核苷酸序列是SEQ ID NO:8，而GPP2氨基酸序列是SEQ ID NO:9。

术语“辅酶B₁₂依赖的甘油脱水酶”是指一组3个基因，统称为"dhaB1-3"，其编码参与甘油脂代谢的酶复合体，该酶复合体能够催化从甘油形成3-羟基丙醛。该酶复合体包括三种多肽。在一个实施方案中，使用包含全部3个dhaB(dhaB1,dhaB2,dhaB3)核苷酸序列的操纵子(SEQ ID NO:10)。在一个实施方案中，dhaB1具有核酸序列SEQ ID NO:11和氨基酸序列SEQ ID NO:12；dhaB2具有核酸序列SEQ ID NO:13和氨基酸序列SEQ ID NO:14；和dhaB3具有核酸序列SEQ ID NO:15和氨基酸序列SEQ ID NO:16。

总之，由dhaB1-3编码的三种多肽形成的酶可促进从甘油产生3-羟基丙醛。在一个实施方案中，该基因序列是核酸登录号#CP000647.1:3846008..3848700，蛋白登录号#ABR78884.1、ABR78883.1和ABR78882.1，来自肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(K.pneumoniae subspecies pneumonia)(Shroeter)Trevisan(ATCC#700721，本文称作肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)。在另一个实施方案中，本发明提供重组光合微生物，其包括至少一种异源DNA序列，其编码的至少一种多肽催化底物向产物的转化，导致从甘油合成羟基丙醛。在一个实施方案中，dhaB1-3酶是酶分类EC#4.2.1.30的成员。

术语“orfZ”和“orf2b”是指甘油脱水酶再激活酶。在一个实施方案中，这些基因来自肺炎克雷伯氏菌。在一个实施方案中，使用编码orfZ和orf2b两者的人工创建的操纵子(SEQ ID NO:17)。在一个实施方案中，orfZ的基因序列(SEQ ID NO:18)是核酸登录号#CP000647.1:3844172.3845995，蛋白登录号是#ABR78881.1(“甘油脱水酶激活子”；SEQ ID NO:19)。这种酶具有分子伴侣样活性，并具有从甘油脱水酶除去被破坏的辅酶B₁₂(其已变成无活性)的表观功能。在一个实施方案中，orf2b的基因序列("甘油脱水酶再激活因子小亚基"；SEQ ID NO:20)是JF260927.1:6577..6930，蛋白序列登录号是#AEL12184.1(SEQ ID NO:21)。

术语“yqhD”是指编码醇脱氢酶的基因，该酶发挥1,3-丙二醇氧化还原酶的功能。该酶能够催化从3-羟基丙醛形成1,3-丙二醇。在一个实施方案中，该基因来自大肠杆菌。在另一个实施方案中，该基因是核酸登录号#NC_010473.1:3251122..3252285，蛋白登录号是#YP 001731875.1。在另一个实施方案中，本发明提供重组光合微生物，其包括至少一种异源DNA序列，其编码的至少一种多肽催化底物向产物的转化，导致从3-羟基丙醛合成1,3-丙二醇。在一个实施方案中，YqhD酶是酶分类EC#1.1.1.202的成员。在一个实施方案中，yqhD核苷酸序列是SEQ ID NO:22，yqhD氨基酸序列是SEQID NO:23。

在蓝藻中生产甘油

用于产生1,3-丙二醇的生物合成途径的一部分参与甘油的产生，如下所示。前体磷酸甘油酮通常在蓝藻细胞中容易获得。通过向蓝藻细胞添加两个基因DAR1和GPP2，就能够产生甘油，如实施例7和12所示。

向蓝藻供给甘油以产生1,3-丙二醇

某些蓝藻物种含有甘油转运蛋白，因此能够从培养基获取甘油。甘油目前一般可作为生物柴油生产的废物而获得。因此，在一个实施方案中，具有内源甘油转运蛋白并进一步具有至少一些如本文所述的1,3-丙二醇途径基因(dhaB1-3、orf2B/orfZ和yqhD)的蓝藻物种能够摄取外源添加的甘油以产生1,3-丙二醇产物。甘油供给可以是单次剂量，或者能够被间歇添加，或者能够被恒定添加。在一个实施方案中，甘油在培养物的光/暗循环中的黑暗期添加，以促进甘油摄取。

蓝藻细胞的转化

蓝藻可以通过几种合适的方法转化。能够用本文所述核酸进行转化的示例性蓝藻包括，但不仅限于，集胞藻属、聚球藻属、Acaryochloris、鱼腥藻属(Anabaena)、嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)、Chamaesiphon、色球藻属(Chroococcus)、蓝藻属、Cyanobium、Dactylococcopsis、Gloeobacter，粘球藻属(Gloeocapsa)、Gloeothece、微孢藻属(Microcystis)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、Prochloron、Chroococcidiopsis、Cyanocystis、Dermocarpella、Myxosarcina、Pleurocapsa、Stanieria、Xenococcus、节旋藻属(Arthrospira)、Borzia、Crinalium、Geitlerinema、Halospirulina、Leptolyngbya、Limnothrix、鞘丝藻属(Lyngbya)、Microcoleus、Cyanodictyon、Aphanocapsa、颤藻属(Oscillatoria)、Planktothrix、Prochlorothrix、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、螺旋藻属(Spirulina)、Starria、Symploca、束毛藻属(Trichodesmium)、Tychonema、Anabaenopsis、束丝藻属(Aphanizomenon)、Calothrix、Cyanospira、Cylindrospermopsis、Cylindrospermum、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属、Chlorogloeopsis、Fischerella、Geitleria、Nostochopsis、Iyengariella、Stigonema、胶须藻属(Rivularia)、伪枝藻属(Scytonema)、Tolypothrix、蓝丝藻属(Cyanothece)、席藻属(Phormidium)、Adrianema等等。

适合于转化蓝藻的示例性方法包括，作为非限制性实例，天然DNA摄取(Chung等.(1998)FEMS Microbiol.Lett.164:353-361；Frigaard等.(2004)Methods Mol.Biol.274:325-40；Zang等.(2007)J.Microbiol.45:241-245)，接合、转导、玻璃微球转化(Kindle等.(1989)J.Cell Biol.109:2589-601；Feng等.(2009)Mol.Biol.Rep.36:1433-9；美国专利号5,661,017)，碳化硅晶须转化(Dunahay等.(1997)Methods Mol.Biol.(1997)62:503-9)，生物射弹(Dawson等.(1997)Curr.Microbiol.35:356-62；Hallmann等.(1997)Proc.Natl.Acad.USA 94:7469-7474；Jakobiak等.(2004)Protist 155:381-93；Tan等.(2005)J.Microbiol.43:361-365；Steinbrenner等.(2006)Appl Environ.Microbiol.72:7477-7484；Kroth(2007)Methods Mol.Biol.390:257-267；美国专利号5,661,017)，电穿孔(Kjaerulff等.(1994)Photosynth.Res.41:277-283；Iwai等.(2004)Plant CellPhysiol.45:171-5；Ravindran等.(2006)J.Microbiol.Methods 66:174-6；Sun等.(2006)Gene 377:140-149；Wang等.(2007)Appl.Microbiol.Biotechnol.76:651-657；Chaurasia等.(2008)J.Microbiol.Methods 73:133-141；Ludwig等.(2008)Appl.Microbiol.Biotechnol.78:729-35)，激光介导的转化，或者在任何聚(酰胺)树状物(Pasupathy等.(2008)Biotechnol.J.3:1078-82)、聚乙二醇(Ohnuma等.(2008)Plant Cell Physiol.49:117-120)、阳离子脂质(Muradawa等.(2008)J.Biosci.Bioeng.105:77-80)、右旋糖酐(dextran)、磷酸钙、或氯化钙(Mendez-Alvarez等.(1994)J.Bacteriol.176:7395-7397)的存在下或用其预处理之后与DNA进行温育，任选地在用细胞壁降解酶处理后与DNA温育(Perrone等.(1998)Mol.Biol.Cell 9:3351-3365)；和生物射弹方法(参见，例如Ramesh等.(2004)Methods Mol.Biol.274:355-307；Doestch等.(2001)Curr.Genet.39:49-60；其内容通过提述以其整体并入本文)。

培养蓝藻细胞

在一个实施方案中，1,3-丙二醇在蓝藻培养物中合成，通过制备具有本文讨论的基因构建体的宿主蓝藻细胞并培养这些细胞。

培养基的选择取决于蓝藻物种。在本发明的一个实施方案中，可使用如下的BG-11培养基生长蓝藻(表1和表2，下文)。当生长盐水物种时，可向培养基中添加Instant Ocean(35g/L)和维生素B₁₂(1μg/ml)。

表1：示例培养基组成

化合物	量(每升)	终浓度
			NaNO₃	1.5g	17.6mM
K₂HPO₄	0.04g	0.23mM
			MgSO₄·7H₂O	0.75g	3.04mM
CaCl₂·2H₂O	0.036g	0.24mM
			柠檬酸	0.006g	0.031mM
柠檬酸铁铵	0.006g	--
			EDTA(二钠盐)	0.001g	0.0030mM
NaCO₃	0.02g	0.19mM
			痕量金属混合物A5	1.0ml	--

表2：痕量金属混合物

痕量金属混合物A5		最终培养基中的浓度
			H₃BO₃	2.86g	46.26μM
MnCl₂·4H₂O	1.81g	9.15μM
			ZnSO₄·7H₂O	0.222g	0.772μM
NaMoO₄·2H₂O	0.39g	1.61μM
			CuSO₄·5H₂O	0.079g	0.32μM
Co(NO₃)₂·6H₂O	49.4mg	0.170μM
			蒸馏水	1.0L	--

在一个实施方案中，细胞自营养生长，唯一的碳源是CO₂。在另一个实施方案中，细胞混合营养生长(mixotrophically)，例如添加碳源如甘油。

培养物在室内或室外生长。培养物可以是无菌或非无菌的。在另一个实施方案中，培养物在无菌环境下在室内生长，具有连续的光照。在另一个实施方案中，培养物在开放池类型的光生物反应器中室外生长。

在一个实施方案中，蓝藻在一个封闭的生物反应器中生长，量为至少大约100升、500升、1000升、2000升、5000升或更多。在一个实施方案中，蓝藻细胞培养物在用透明塑料材料制成的一次性柔韧的管状光生物反应器中生长。

光周期可以根据期望设定，例如：连续光照，或者16小时开和8小时关，或者14小时开和10小时关，或者12小时开和12小时关。

从蓝藻培养物分离和纯化1,3-丙二醇

可以使用各种方法用于从蓝藻培养基中除去1,3-丙二醇。关于数种当前使用的用于分离和纯化1,3-丙二醇的方法的评述参见，例如，Xiu等,Appl.Microbiol.Biotechnol.78:917-926；2008。

在一个实施方案中，丙二醇在培养物生长期间从培养基中周期性分离。例如，将培养基与细胞分离，随后是过滤步骤。然后，可以从过滤物中除去丙二醇。如果需要，培养基可以再次循环回到培养物，或者可以添加新的培养基。在另一个实施方案中，丙二醇在批次运行结束时从培养物中除去。

授予Adkesson等的美国专利号7,919,658介绍了一种用于从经过遗传修饰的大肠杆菌的发酵培养液中分离1,3-丙二醇的方法。该方法涉及从培养培养液中过滤出颗粒，将培养液运行通过离子交换柱，然后蒸馏所得液体以产生基本上纯的1,3-丙二醇。

在授予Fisher等的国际专利申请No.WO/2000/024918中描述了另一种从产生它的培养物中分离聚醇产物的方法。这一申请描述了预处理步骤，其能够用于从含有聚醇的溶液中分离细胞而不会杀死细胞培养物。其它步骤包括浮选或絮凝以除去蛋白质类材料，随后是离子交换色谱，活性炭处理，蒸发浓缩，沉淀和结晶。

在授予George等的美国专利号5,194,159中描述了用于操作流体(operative fluid)如防冻剂溶液、传热流体、除冰剂、润滑剂、液压流体、淬火剂、溶剂和吸收剂回收1,3-丙二醇的工艺。该方法涉及在反渗透下使流体与半透膜接触。

授予Woyciesjes等的美国专利号5,510,036公开了用于纯化和除去含聚醇溶液中污染物(例如重金属油和有机污染物)的工艺，其中该处理包括降低pH和添加沉淀剂、絮凝剂或凝结剂，随后可以是过滤和离子交换色谱步骤。

通过如下的非限制性实施例进一步描述本发明。然而，本领域的技术人员会意识到，考虑到本公开，可在本发明的精神和范围内进行修饰和改进。

实施例

实施例1

一般方法

除非另外指出，限制性核酸内切酶购自New England Biolabs(NewEngland Biolabs(NEB),Ipswich,MA)。使用Eppendorf Mastercycler热循环仪(Eppendorf,Hauppauge,NY)进行PCR，使用Phire II热启动聚合酶或Taq DNA聚合酶(NEB)用于诊断性扩增，并使用Phusion聚合酶或Crimson LongAmpTaq DNA聚合酶(NEB)用于高保真扩增。PCR温度概貌按照聚合酶制造商的推荐加以设定。使用XL10-Gold超感受态细胞(Agilent Technologies,SantaClara,CA)并遵循制造商的规程在大肠杆菌中进行克隆。TOPO克隆试剂盒(Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒)购自Invitrogen(Invitrogen,Carlsbad,CA)，并根据制造商的规程使用。

BG-11储液购自Sigma Aldrich(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。海洋BG-11(MBG-11)通过将35g Instant Ocean(United Pet Group,Inc,Cincinnati,OH)溶于1L水中并补充BG-11储液来制备。根据需要，向MBG-11中补充维生素B₁₂(Sigma Aldrich)以获得1μg/L的终浓度。固体培养基(琼脂平板)的制备与液体培养基相似，只是添加了1％(w/v)Phyto琼脂(ResearchProducts International Corp,Mt.Prospect,IL)。抗生素壮观霉素(100mg/ml)和卡那霉素(50mg/ml)的储液购自Teknova(Teknova,Hollister,CA)。抗生素庆大霉素(10mg/ml)的储液购自MP Biomedicals(MP Biomedicals,Solon,OH)。

实施例2

SLIC方法(不依赖序列和连接的克隆)

将引物设计成具有5'序列，其与靶载体在期望限制位点重叠，或者如果一次插入超过1个产物则其与下一个PCR产物重叠。重叠序列通常为30个碱基对(bp)长度。PCR产物从基因组DNA(肺炎克雷伯氏菌或酿酒酵母)或者从整个细胞(大肠杆菌)扩增，并进行凝胶纯化。靶载体用合适的限制性酶消化，并进行凝胶纯化。为了产生30-bp粘末端，将消化的靶载体(200ng-1μg)和每个PCR产物(20ng-1μg)在NEB缓冲液2+BSA(没有dNTP)中用购自NEB的0.5U的T4DNA聚合酶处理，并在室温下温育15分钟/10bp重叠(30bp重叠为45分钟)。通过添加1/10体积的10mM dCTP(或其它单一dNTP)终止反应。在PCR管中将等摩尔量(1:1或1:1:1等)的T4处理的载体和插入物合并成8μl体积。向管中添加10X T4连接酶缓冲液1μl。使用热循环仪，将反应加热到65℃10分钟，然后缓慢斜面下降到37℃(10％斜面速度)。向管中添加RecA蛋白(购自NEB)，20ng溶于1ml 10X RecA缓冲液中，其在37℃温育30分钟。使用5μl反应用于大肠杆菌转化。

实施例3

制备用于表达载体的RSF1010来源质粒骨架

本文所述的广宿主范围质粒是基于RSF1010来源的质粒pSL1211，其如图2所示。IPTG可诱导的srp启动子和卡那霉素抗性基因被连接在pSL1211中，生成质粒pABb，用作异源表达丙二醇基因的骨架质粒(图3)。

实施例4

构建用于在蓝藻中生产1,3-丙二醇的质粒

利用图1所示的步骤构建用于在蓝藻中生产1,3-丙二醇的生物合成途径。将重组的1,3-丙二醇生产基因设计成具有在单个操纵子中被单一启动子驱动的多顺反子表达，基因的排列顺序与它们在途径中的相同。

将每个基因设计成具有自己的RBS(核糖体结合位点)。将基因插入到RSF1010来源的质粒骨架中。RSF1010的复制起点用作大肠杆菌和蓝藻菌株两者的复制起点。用于质粒构建的引物如下表3中所示。

表3：用于构建1,3-丙二醇生产质粒的引物

基因DAR1(SEQ ID NO:6)和GPP2(SEQ ID NO:8)使用引物DAR1F1、DAR1R1、GPP2F1和GPP2R1按照标准PCR反应从野生型酿酒酵母扩增。重叠PCR用于将DAR1和GPP2组合为单个PCR产物。按照制造商的使用说明，将此连接入TOPO平末端克隆载体中，得到pAB1002。使用标准SLIC反应，将DAR1和GPP2PCR产物克隆到用EcoRI和SbfI消化的质粒pABb中，得到pAB1001(SEQ ID NO:39)。

使用引物dha F2和dha R1在标准PCR反应中从野生型肺炎克雷伯氏菌基因组DNA中扩增核酸序列dhaB1-3(SEQ ID NO:10)和orfZ(SEQ ID NO:17)作为单个PCR产物。使用引物yqhD F1和yqhD R1在标准PCR反应中从野生型大肠杆菌中扩增yqhD基因。在标准SLIC反应中，将含有dhaB1-3-orfZ-yqhD基因的PCR产物克隆入用限制酶EcoRI和SbfI消化的载体pABb中，得到质粒pAB1003(SEQ ID NO:40)。使用引物dha F1和yqhD R1以从pAB1003扩增dhaBl-3-orfZ-yqhD。根据制造商的使用说明，将此连接入TOPO平末端克隆载体中，得到pAB1005。

用SbfI和SpeI消化质粒pAB1002，将5.5-kb片段进行凝胶纯化，并处理作为载体。质粒pAB1005用NsiI和SpeI消化，将5.9-kb片段进行凝胶纯化并处理作为插入物。将经过消化的片段连接在一起，得到pAB1014。使用引物orf2b Fasc和orf2b Rase将orf2b基因从野生型肺炎克雷伯氏菌基因组DNA中扩增作为单一PCR产物。产物进行凝胶纯化，并使用来自Invitrogen的GENEART Seamless克隆和组装试剂盒重组入已经用AscI消化的pAB1014中，得到pAB1035。

使用引物DAR1Fn和GPP2R1从pAB1014扩增DAR1-GPP2；使用引物dha F1和yqhD Rr从pAB1014扩增dhaBl-3-orfZ-yqhD；使用GENEARTSeamless克隆和组装试剂盒将PCR产物重组入用EcoRI和XhoI消化的pAB412中，得到pAB1034。pAB1034用AsiSI和BsrGI消化。使用引物dhaB3_R和yqhD_L2从pAB1035PCR扩增具有orfZ和yqhD的部分的orf2b。将PCR产物重组入pAB1034AsiSI/BsrGI中，得到pAB1040(SEQ ID NO:41)。使用引物DAR1Fr和yqhD Rr从pAB1040PCR扩增DAR1-GPP2-dhaB1-3-orfZ-orf2b-yqhD，并重组入用EcoRI和XhoI消化的pAB415中，得到pAB1050。

pAB1040和pAB1050的序列通过用限制酶AflII消化并通过测序进行确认。质粒pAB1070含有上述被锌诱导型启动子ziaR-PziaA₆₈₀₃控制的1,3-丙二醇途径基因。

使用不同启动子和不同质粒的构建体的几个组合如下面表4所示制备。

表4：1,3-丙二醇质粒

实施例5

具有1,3-丙二醇构建体的蓝藻菌株聚球藻属菌种PCC 7002和集胞藻属菌种PCC 6803的转化

为了确认1,3-丙二醇基因在被转化到蓝藻中时具有功能，用携带1,3-丙二醇途径各种区段的质粒转化蓝藻菌株聚球藻属菌种PCC 7002和集胞藻属菌种PCC 6803。

转化程序通过接合如下进行：接合日前1周，蓝藻细胞(例如PCC 7002和PCC 6803)用新鲜培养物接种，新鲜培养物是老(1周)培养物的～1:10稀释物。含有感兴趣质粒和辅助质粒pRL443的大肠杆菌培养物在计划接合的前夜在补充有合适抗生素的～3ml LB中启动。接合前4小时，30ml新鲜LB培养基(含有合适的抗生素)用～0.5ml过夜培养物接种。将大肠杆菌和蓝藻培养物转移到50ml锥形管中，并在室温在2500x g离心10分钟以沉淀细胞。倾析上清，将细胞沉淀重悬于1ml LB(对于大肠杆菌培养物)或(M)BG-11(对于蓝藻)中。然后，将细胞转移到微离心管中，并在室温以2500x g离心10分钟。重复倾析、重悬和离心步骤，适当地将每个沉淀重悬于300μl LB或(M)BG-11中。稀释细胞重悬浮物并对细胞计数。将大约3.6x 10⁸细胞每种蓝藻、具有质粒pRL443的大肠杆菌和具有感兴趣质粒的大肠杆菌(目的是大约1:1:1细胞比)置于一个微离心管中。然后，将细胞混合物在室温以2,500xg离心5分钟。倾析上清，将沉淀重悬于950μl(M)BG-11和50μl LB中。将无菌硝酸纤维素膜滤膜(Whatman)转移到(M)BG-11(维生素B₁₂)+5％LB琼脂平板。在每个滤膜上均匀铺混合物的200μl等分试样。然后，将琼脂平板置于低光下2天。然后，将滤膜转移到含有合适选择性抗生素的新鲜的(M)BG-11(+维生素B₁₂)琼脂平板上。MBG-11+维生素B₁₂平板具有如下的抗生素终浓度：壮观霉素100μg/ml；卡那霉素40μg/ml。BG-11平板具有如下的抗生素终浓度：壮观霉素15μg/ml；卡那霉素10μg/ml。8-12天后，监测滤膜上单菌落的出现。一旦观察到单菌落，便将菌落划线到新鲜的选择平板(第1传平板)上。重复这个过程(第2传平板)。一旦在第2传平板上观察到菌落，便拾取菌片(patch)并划线到LB平板上，以检查潜在的大肠杆菌污染。使用清洁的菌片进行菌落PCR以检测感兴趣的质粒。

实施例6

菌落PCR以确认1,3-丙二醇途径基因的转化和存在

为了确认被转化蓝藻细胞中存在1,3-丙二醇基因，将菌落的划线重悬于TE缓冲液中，用玻璃珠破坏细胞。将上清用作DNA模板用于1,3-丙二醇途径基因的片段进行PCR扩增。PCR分析的结果确认在宿主细胞中存在1,3-丙二醇基因。

然后，使用来自确认的划线物的细胞接种3ml补充有合适抗生素的液体BG-11或MBG-11vB₁₂培养物(MBG-11+维生素B₁₂培养基具有如下的抗生素终浓度：壮观霉素100μg/ml；卡那霉素40μg/ml；BG-11培养基具有如下的抗生素终浓度：壮观霉素15μg/ml；卡那霉素10μg/ml)，并在10-20μmol光子m^-2s^-1的光强度下在37℃温育。

实施例7

在蓝藻中确认1,3-丙二醇途径初始部分的功能：从磷酸甘油酮产生甘油

如下制备多个具有相应于1,3-丙二醇途径初始部分的基因的质粒构建体，如表5所示。用质粒pAB1001(SEQ ID NO:39)按照实施例5所述的方法转化集胞藻属菌株PCC 6803。该质粒含有1,3-丙二醇生物合成途径的DAR1和GPP2部分，以便确认该生物合成途径的第一部分(从磷酸甘油酮到甘油)在蓝藻中具有功能。

将转化的细胞在30℃以12hr/12hr光暗循环培养于250ml通风瓶(ventedflask)中的100ml BG-11中。在一个月的时间周期内周期性获取1毫升样品。将每个样品通过如下加工：在12,000rpm将1ml培养物离心2分钟并使上清通过0.2μm微离心柱滤器(SpinX)。过滤的上清在Dionex设备上进行分析。使用具有脉冲电流检测的离子色谱测量甘油。在装备有一次性铂电极的DionexICS-3000IC系统上，使用加热到30℃的IonPac ICE-AS1柱(2mm x 250mm)。使用100mM甲磺酸以0.2mL/分钟的流速等度洗脱30分钟运行方法。

结果确认，在转化的蓝藻中确实产生了甘油(图5)。甘油峰的身份(identity)通过与纯的甘油标准品的比较加以确认，如图所示。在30天后，甘油以高达大约3g/L的积累水平、以～100mg/L/天的平均速度，分泌到周围介质中。

表5：具有甘油生产基因的质粒构建体

质粒名称	启动子	基因盒	大肠杆菌复制起点	蓝藻复制起点
					pAB1001	Psrp	DAR1-GPP2	RSF1010	RSF1010
pAB1002	Plac	DAR1-GPP2	pBR	N/A
					pAB1028	PrbcL₆₈₀₃	DAR1-GPP2	RSF1010	RSF1010
pAB1029	PnblA₇₁₂₀	DAR1-GPP2	RSF1010	RSF1010

实施例8

在蓝藻中确认从甘油产生1,3-丙二醇

为了确认1,3-丙二醇途径的第二部分在蓝藻中具有功能，用质粒pAB1003(SEQ ID NO:40)转化聚球藻属菌种PCC 7002，该质粒含有编码从甘油到1,3-丙二醇的生物合成途径中酶的最后两步(dhaB1-3-orfZ-yqhD)。将细胞培养在25ml MBG-11中，在37℃在12hr/12hr光/暗周期下以120rpm震荡温育。细胞被单独一次供给1-2％甘油。5-7天后，当细胞呈指数生长时，对培养物进行采样以确认1,3-丙二醇的产生。

使用甲醇/磷酸提取以分离从培养物产生的1,3-丙二醇。5ml蓝藻培养物用磷酸氢二钾(～6g)饱和。该混合物中添加甲醇至甲醇终浓度为30％，然后剧烈震荡3次，中间间隔5分钟。将提取物在室温温育过夜以达到相分离。收集上面的甲醇层，避免收集界面，并在台式离心式蒸发器中蒸发至～100μl(15X浓度)。在分析之前，使该提取物通过0.2μm滤器。

使用液体注射将甲醇提取物加载到GC/MS上。使用具有火焰离子化检测的气相色谱测量1,3-丙二醇。在装备有7683B液体注射器的Agilent 7890AGC系统上使用Stabilwax柱(长30m，直径0.53mm，滤膜1μm)。在分流/不分流进样器上安装Cyclo-uniliner并加热到225℃。使用脉冲不分流程序以10psi 0.1分钟注入2微升。使用氦气作为载气50cm/sec，通过运行线性热程序80℃-200℃(24℃/min)及在200℃保持5分钟来进行分离。使用这种方法，1,3-丙二醇的保留时间为5.88分钟。

结果证实，当给予甘油输入供给时，在转化的蓝藻中产生了1,3-丙二醇：用质粒pAB1003转化并供给甘油(1-2％)的蓝藻菌株聚球藻属PCC 7002在接种1周后产生了大约10μΜ或者大约1mg/L 1,3-丙二醇(图6)。结果证实，在转化的蓝藻中产生了1,3-丙二醇。

实施例9

用含有完整1,3-丙二醇途径的构建体转化蓝藻菌株聚球藻属菌种PCC 7002和集胞藻属菌种PCC 6803

为了确认从磷酸甘油酮到1,3-丙二醇的完整生物合成途径能够成功转化到蓝藻中以产生1,3-丙二醇产物，用携带整个1,3-丙二醇途径(DAR1+GPP2+dhaB1-3+orf2B/orfZ+yqhD)的质粒转化蓝藻菌株聚球藻属PCC 7002、集胞藻属PCC 6803和鱼腥藻属。

在聚球藻属菌株PCC 7002中，将负责甘油代谢的基因(例如甘油激酶和/或甘油脱氢酶)缺失以使甘油仅会走向1,3-丙二醇生产。将前两个基因DAR1和GPP2插入到一个高拷贝质粒中以允许甘油生产基因的更高表达，从而增加甘油生产。基因dhaB1-3-orfZ-orf2b-yqhD保留在基于RSF1010的质粒上，因为这足以从甘油产生1,3-丙二醇，如实施例8所证明的。在集胞藻属PCC 6803中，该设计与建议用于PCC 700的不同，因为在PCC 6803中不存在甘油代谢途径。DAR1-GPP2基因盒仍然在低强度启动子的控制下。基因dhaB1-3-orfZ-orf2b-yqhD基因盒在更强启动子的控制之下，以限制甘油积累和分泌。这些分离的基因盒保持在一个质粒上，或者可以设置在分离的质粒上。

对转化的蓝藻细胞进行测试以确认转化是否成功。然后，将细胞在含有BG-11培养基的培养瓶中生长2周，16/8光/暗循环。从培养基提取1,3-丙二醇，并按照实施例8所述的方法进行定量。结果证实，在转化的蓝藻中产生了1,3-丙二醇。因此，使用这种方法，能够在蓝藻培养物中生产1,3-丙二醇。

实施例10

耐受性测试以确定用于1,3-丙二醇生产的合适蓝藻宿主菌株

通过向指数期培养物中一次添加不同量的1,3-丙二醇(范围是0.05％-5％)，并比较这些培养物的生长与没有添加的野生型培养物的生长，来检查蓝藻菌株集胞藻属菌种PCC 6803和聚球藻属菌种PCC 7002对培养基中积累的1,3-丙二醇的存在的耐受性。通过光密度(OD₇₅₀)监测生长1周。与对照(没有添加1,3-丙二醇)相比，集胞藻属菌种PCC 6803的生长在高达1％1,3-丙二醇的存在下没有影响。在2％和3％，存在抑制效果，导致培养物发黄褪色(yellowing discoloration)，生长减慢并凝聚(clumping)。在5％1,3-丙二醇下，集胞藻属菌种PCC 6803不能存活，在3天后褪色(bleached)。添加高达1％1,3-丙二醇对聚球藻属菌种PCC 7002的生长没有影响。然而，添加2％是致死的，导致培养物完全褪色。

实施例11

遗传增强的蓝藻在200升光生物反应器中放大生产并收集1,3-丙二醇产物

将经修饰而含有1,3-丙二醇基因盒的集胞藻属PCC 6803或聚球藻属PCC 7002的10L细胞培养物接种于最终体积为200L的室内、温度受控的光生物反应器中，16小时开/8小时关光周期，并生长2个月。在2个月的生长周期结束时，使用过滤和絮凝从培养材料中分离耗尽的培养基(spentculture medium)。保留细胞材料用于其它目的。将培养基微过滤，并大体遵循美国专利号7,919,658所述的方法用离子交换树脂逐批地进行处理。所得1,3-丙二醇进一步用本领域已知的方法进行纯化。

每2周，将50％培养基与剩余细胞分离并从培养物中除去，向光生物反应器中添加新鲜的替换培养基。将耗尽的培养基过滤、pH处理、絮凝、再次过滤，然后用蒸馏程序对所得液体进行处理，以得到基本上纯的1,3-丙二醇。

实施例12

在蓝藻中放大生产甘油

如果期望，从CO₂到1,3-丙二醇的生物合成途径的第一部分，如实施例7所述，还可用于在蓝藻中生产甘油。这涉及将该途径的DAR1和GPP2基因部分插入到合适的蓝藻菌株中。在典型的实施例中，按照实施例5所述的方法将含有DAR1和GPP2基因的质粒pAB1001(SEQ ID NO:39)转化入集胞藻属PCC 6803中。确认成功的转化，并将细胞放大至大的室外培养中。从培养基收集甘油。甘油峰的鉴定通过与纯甘油标准品相匹配的保留时间加以确认。使用这种方法，可以在蓝藻中产生甘油。

尽管已经参考其某些实施方案相当详细地描述了本发明，但是其他的实施方案仍是可能的。因此，所附权利要求的精神和范围不应限于本文所含的实施方案的描述。

序列表

Claims

1.一种遗传增强的蓝藻/蓝细菌(cyanobacterial)细胞，包含：

a)至少一个能够调节蓝藻中基因表达的启动子；和

b)DARl基因、GPP2基因、dhaB1-3基因、orfZ基因、orf2b基因和yqhD基因，其中所述基因被至少一个启动子转录控制；

其中所述细胞产生1,3-丙二醇。

2.权利要求1的蓝藻细胞，其中至少一个所述基因存在于选自下组的位置中：外源来源的染色体外质粒、内源质粒来源的染色体外质粒和蓝藻染色体。

3.权利要求1或2的蓝藻细胞，其中所述至少一个启动子选自下组：Psrp、PnblA₇₁₂₀、PrbcL₆₈₀₃、PsmtA₇₀₀₂和ziaR-PziaA₆₈₀₃。

4.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中DARl基因与SEQ ID NO:6具有至少98％的同一性。

5.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中DARl基因编码与SEQ ID NO:7具有至少98％的同一性的多肽。

6.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中GPP2基因与SEQ ID NO:8具有至少98％的同一性。

7.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中GPP2基因编码与SEQ ID NO:9具有至少98％的同一性的多肽。

8.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中dhaB1-3基因与SEQ ID NO:10具有至少98％的同一性。

9.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中dhaB1-3基因编码三个分离的多肽，DhaB1、DhaB2和DhaB3，其中

DhaB1多肽与SEQ ID NO:12具有至少98％的同一性，

DhaB2多肽与SEQ ID NO:14具有至少98％的同一性，和

DhaB3多肽与SEQ ID NO:16具有至少98％的同一性。

10.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中orfZ和orf2b核酸序列与SEQID NO:17具有至少98％的同一性。

11.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中orfZ基因编码与SEQ ID NO:19具有至少98％的同一性的多肽，并且其中orf2b基因编码与SEQ ID NO:21具有至少98％的同一性的多肽。

12.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中yqhD基因与SEQ ID NO:22具有至少98％的同一性。

13.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中yqhD基因编码与SEQ ID NO:23具有至少98％的同一性的多肽。

14.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中所述DARl、GPP2、dhaB1-3、orfZ、orf2b和yqhD基因中的至少一个存在于该细胞的分离遗传区。

15.权利要求14的蓝藻细胞，其中细胞中的所述分离遗传区是不同的质粒载体或不同的染色体。

16.上述任一权利要求的蓝藻细胞，其中所述蓝藻细胞选自下组：集胞藻属菌种(Synechocystis sp.)PCC 6803和聚球藻属菌种(Synechococcus sp.)PCC7002。

17.一种在蓝藻细胞内产生1,3-丙二醇的方法，包括：

a)向蓝藻细胞引入核酸序列，所述核酸序列包含编码DAR1酶的基因、编码GPP2酶的基因、编码DhaB1-3酶的基因、编码OrfZ酶的基因、编码Orf2b酶的基因和编码YqhD酶的基因；和

b)在可产生1,3-丙二醇的条件下培养所述蓝藻细胞。

18.一种遗传增强的集胞藻属宿主细胞，其包含至少一个与DARl基因和GPP2基因操作连接的启动子。

19.权利要求18的遗传增强的集胞藻属宿主细胞，其中所述DARl基因与SEQ ID NO:6具有至少98％的同一性，并且所述GPP2基因与SEQ ID NO:8具有至少98％的同一性。

20.一种遗传增强的聚球藻属宿主细胞，其包含至少一个与编码DhaBl-3、OrfZ、Orf2b和YqhD的基因操作连接的启动子。

21.一种制造1,3-丙二醇的方法，其包括在含有1-2％甘油的培养基中生长宿主聚球藻属细胞，所述细胞包含至少一个与dhaBl-3、orfZ和yqhD基因操作连接的启动子，其中产生1,3-丙二醇。