KR100785997B1 - 1,3-프로판디올을 높은 역가로 생물학적으로 생산하는 방법 - Google Patents

1,3-프로판디올을 높은 역가로 생물학적으로 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단독 미생물 내에서 발효가능한 탄소 공급원으로부터 1,3-프로판디올을 생물학적으로 생산하는 개선된 방법을 제공한다. 본 발명의 한 측면에서, 글루코스를 1,3-프로판디올로 전환시키기 위한 개선된 방법은 클렙시엘라 뉴모니아 dha 레귤론 유전자인 dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3, 및 orfZ (이 유전자 모두는 야생형 클렙시엘라 뉴모니아에서 발견되는 바와 동일한 유전적 조직으로 배열됨)를 사용하여 형질전환시킨 대장균을 사용하면 달성된다. 본 발명의 다른 측면에서, 글루코스로부터 1,3-프로판디올을 생산하기 위해 G3PDH, G3P 포스파타제, 데히드라타제, 및 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 대장균을 사용하는 방법은 G3PDH, G3P 포스파타제, 데히드라타제, 데히드라타제 재활성화 인자 뿐 아니라 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (dhaT)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 대장균을 사용하는 동일 방법에 비해 개선된 방법이다. 이 방법의 극적인 개선은 대장균에 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환시키기에 충분한 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자의 존재 여부에 따라 달라진다.
1,3-프로판디올, 형질전환, 비특이적 촉매 활성

Description

1,3-프로판디올을 높은 역가로 생물학적으로 생산하는 방법 {Process for the Biological Production of 1,3-Propanediol with High Titer}
본 발명은 단독 미생물에 의해 발효가능한 탄소 공급원을 1,3-프로판디올으로 생물전환하는 방법을 포함한다.
1,3-프로판디올은 폴리에스테르 섬유 생산 및 폴리우레탄 및 고리형 화합물 제조에서 잠재적 유용성이 있는 단량체이다.
1,3-프로판디올을 생성하는 다양한 화학적 경로가 공지되어 있다. 예를 들면, 산화에틸렌이 포스핀, 물, 일산화탄소, 수소 및 산의 존재시 촉매 상에서 아크롤레인의 촉매적 용액상 수화 후 환원되어, 또는 글리세롤과 같은 화합물로부터 주기율표의 VIII족 원소를 갖는 촉매 상에서 일산화탄소 및 수소의 존재하에 반응하여 1,3-프로판디올로 전환될 수 있다. 이런 방법으로 1,3-프로판디올을 제조할 수 있지만 이 방법은 비용이 많이 들고 환경 오염물질을 함유한 폐유출물을 발생시킨다.
글리세롤을 발효시켜 1,3-프로판디올을 생산할 수 있다는 사실은 1세기 전부터 알려져 있었다. 1,3-프로판디올을 생산할 수 있는 박테리아 균주가 밝혀졌는 데, 예를 들면, 시트로박터 (Citrobacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 엔테로박터 (Enterobacter), 일리오박터 (Ilyobacter), 클렙시엘라 (Klebsiella), 락토바실러스 (Lactobacillus), 및 펠로박터 (Pelobacter) 군 등이 있다. 각각의 연구 사례에서, 글리세롤은 2 단계의 효소 촉매 반응을 거쳐 1,3-프로판디올로 전환된다. 제1단계에서, 데히드라타제는 글리세롤이 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA) 및 물로 전환되는 것을 촉매한다 (반응식 1). 제2 단계에서, 3-HPA는 NAD+-결합 옥시도리덕타제에 의해 1,3-프로판디올로 환원된다 (반응식 2). 1,3-프로판디올은 더이상 대사되지 않아서, 결과적으로 배지에 축적된다. 전체 반응에서, 보조인자인 β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)가 환원 형태로 1 환원 당량 소모되어 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+)로 산화된다.
글리세롤 →3-HPA + H20
3-HPA + NADH + H+ → 1,3-프로판디올 + NAD+
클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia), 시트로박터 프로인디이 (Citrobacter freundii), 및 클로스트리듐 파스테리아눔 (Clostridium pasteurianum)에서, 글리세롤 데히드라타제의 3개의 구조적 서브유닛을 코딩하는 유전자 (dhaB1-3 또는 dhaB, C 및 E)는 특이적 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제를 코딩하는 유전자 (dhaT)에 인접해서 위치해 있다 (도 1 참조). 이 미생물들 사이의 유전적 조직 (organization)은 다소 상이하지만, 이 유전자들은 orfX 및 orfZ (글리세롤 데히드라타제를 위한 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 유전자임), 및 orfY 및 orfW (이 유전자들의 기능은 공지되어 있지 않음)도 포함하는 군에 클러스터 되어 있다. 상기 미생물들의 특이적 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (dhaT의 생산물)는 제III형 알콜 데히드로게나제 족에 속하는 것으로 공지되어 있다; 각각에는 철-결합 모티프가 보존되어 있고, 1,3-프로판디올 및 3-HPA의 NAD+/NADH-결합 상호전환에 우선적으로 관여한다. 1,3-프로판디올 및 3-HPA의 NAD+/NADH-결합 상호전환은 데히드라타제 효소와 특별한 연관이 없는 알콜 데히드로게나제 (예를 들면, 말 간 및 제과용 효모 알콜 데히드로게나제 (E.C.1.1.1.1))에 의해 촉매될 수도 있으나, 이의 동력학적 파라미터는 덜 효과적이다. 글리세롤 데히드라타제 (E.C.4.2.1.30) 및 디올[1,2-프로판디올] 데히드라타제 (E.C.4.2.1.28)는 관련있는 효소이지만, 다른 유전자에 의해 코딩되는 다른 효소이다. 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca) 및 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)의 디올 데히드라타제 유전자는 글리세롤 데히드라타제 유전자와 유사하고, orfX 및 orfZ에 유사한 유전자를 포함하는 군에 클러스터 되어 있다 ([Daniel et al., FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999)] 및 [Toraya and Mori, J. Biol. Chem. 274, 3372 (1999)], [젠뱅크 (GenBank) AF026270]).
글리세롤로부터의 1,3-프로판디올 생산은 통상적으로 유일한 탄소 공급원으 로 글리세롤을 사용하는 혐기적 조건하에서 다른 외인성 환원 등가물 수용체가 없을 경우 일어난다. 예를 들어, 시트로박터, 클로스트리듐, 및 클렙시엘라 균주에서는 이러한 조건하에서 글리세롤에 관한 비슷한 경로가 작동되는데, 먼저, NAD+ (또는 NADP+)-결합 글리세롤 데히드로게나제에 의해 글리세롤이 디히드록시아세톤 (DHA)으로 산화된다 (반응식 3). 그 다음, DHA는 DHA 키나제에 의해 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)로 인산화되어 (반응식 4), 해당과정 등을 통한 ATP 생성의 보조 및 생합성에 사용될 수 있게 된다. 1,3-프로판디올 경로와 반대로, 이 경로는 세포에 탄소와 에너지를 제공할 수 있으며, NADH를 소비하는 것이 아니라 NADH를 생산한다.
글리세롤 + NAD+ →DHA + NADH + H+
DHA + ATP →DHAP + ADP
클렙시엘라 뉴모니아 및 시트로박터 프로인디이에서, 기능적으로 연결된 활성인 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 유전자 (dhaB), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제를 코딩하는 유전자 (dhaT), 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 (dhaD), 및 디히드록시아세톤 키나제를 코딩하는 유전자 (dhaK)들은 dha 레귤론 (regulon)으로 포괄된다. 클렙시엘라 뉴모니아 및 시트로박터 프로인디이의 dha 레귤론에는 또한 전사 활성자 단백질을 코딩하는 유전자 (dhaR)도 포함된다. 시트로박터 및 클렙시엘라의 dha 레귤론을 대장균에서 발현시켰을 때, 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환시키는 것으로 나타났다.
상기 화학적 방법은 에너지 집약적이고, 상기 생물학적 방법은 고가의 출발 물질인 글리세롤로부터의 역가가 비교적 낮게 한정되기 때문에, 상기 기재한 화학적 방법이나 생물학적 방법 모두 1,3-프로판디올을 산업적 규모로 생산하는데 적합하지 않다. 이러한 결점들은 에너지 투입량이 적게 요구되고, 탄수화물 또는 당과 같은 저가의 출발 물질이 요구되는 방법을 이용하거나, 글리세롤 프로세싱의 대사 효율을 증가시키면 극복될 수 있다. 어떤 방법을 개발하더라도, 당을 글리세롤로 전환하고, 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하는 것을 담당하는 유전적 기구의 조작력이 요구될 것이다.
글리세롤의 생물학적 제조 방법이 공지되어 있다. 글리세롤 생산자 중 압도적인 다수는 효모이지만, 일부 박테리아와 기타 진균류 및 조류 (algae)도 공지되어 있다. 박테리아 및 효모는 둘다 해당작용 중의 프럭토스-1, 6-비스포스페이트 경로 또는 EMP (Embden Meyerhof Parnas) 경로를 통해 글루코스 또는 기타 탄수화물을 전환시켜 글리세롤을 생산하지만, 어떤 조류는 엽록체 중에 용해된 이산화탄소 또는 중탄산염을 칼빈 회로 (Calvin cycle)의 3-탄소 중간체로 전환시킨다. 일련의 단계에서, 3-탄소 중간체인 포스포글리세르산은 글리세르알데히드 3-포스페이트로 전환되는데, 이는 그의 케토 이성질체인 디히드록시아세톤 포스페이트로 쉽게 상호전환될 수 있어서 궁극적으로는 글리세롤로 전환된다.
구체적으로, 박테리아 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 및 락토바실러스 리코페르시카 (Lactobacillus lycopersica)는 글리세롤을 합성하고, 내염성(耐鹽性) 조류인 두날리엘라 (Dunaliella) 종 및 아스테로모나스 그라실리스 (Asteromonas gracilis)는 외부의 높은 염 농도로부터 보호받기 위해서 글리세롤을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 유사하게, 각종 내삼투성(耐渗透性) 효모는 보호 수단으로서 글리세롤을 합성한다. 사카로마이세스 (Saccharomyces) 균주의 대부분은 알콜성 발효 동안 약간의 글리세롤을 생산하는데, 삼투성 스트레스를 받으면 글리세롤 생산량이 생리적으로 증가될 수 있다. 20세기 초반에는 아황산염 또는 알칼리 등과 같은 "조향 (steering) 시약"을 첨가한 사카로마이세스 배양물을 이용하여 글리세롤의 상업적 생산을 달성했다. 조향 작용제는 불활성 복합체를 형성함으로써 아세트알데히드의 에탄올로의 전환을 차단 또는 억제하기 때문에, 과량의 환원 등가물 (NADH)이 글리세롤 생산에 이용가능해지거나, DHAP를 환원하는 방향으로 "조향"된다. 이 방법은 아황산염 때문에 효모 증식이 부분적으로 억제되므로 제한된다. 이러한 제한은 상이한 메카니즘에 의해 과량의 NADH 등가물을 생성하는 알칼리를 사용하면 부분적으로 극복될 수 있다. 이러한 실행에서, 알칼리는 카니자로 불균등화반응 (Cannizarro disproportionation)을 개시하여 아세트알데히드 2 당량으로부터 에탄올 및 아세트산이 생성된다.
사카로마이세스 디아스타티쿠스 (Saccharomyces diastaticus)의 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 (DAR1, GPD1)를 클로닝하고 서열결정했다 [Wang et al., J. Bact. 176, 7091-7095 (1994)]. DARI 유전자를 셔틀 벡 터 내로 클로닝하고, 이를 사용하여 대장균을 형질전환시킨 후 발현시켜 활성 효소를 생산했다. 문헌 [Wang et al., 상기 문헌]에서는 DAR1이 세포내 삼투성 환경에 의해 조절된다는 것은 알아냈지만, 이 유전자가 재조합 미생물에서 어떻게 1,3-프로판디올의 생산 향상에 이용될 수 있는지에 대해서는 제안하지 못했다.
다른 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 효소가 단리되었다: 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 sn-글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제가 클로닝되어 서열결정되었으며 ([Larason et al., Mol. Microbiol. 10, 1101 (1993)], [Albertyn et al., Mol. Cell. Biol. 14, 4135 (1994)])에서는 사카로마이세스 세레비지애의 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 GPD 1의 클로닝을 교시한다. 문헌 [Wang et al., 상기 문헌]에서와 마찬가지로, 상기 문헌 ([Albertyn et al., 상기 문헌] 및 [Larason et al., 상기 문헌]) 모두 이 유전자가 삼투압감수성 (osmosensitivity)에 의해 조절된다는 것은 알아냈지만, 이 유전자가 재조합 미생물에서 어떻게 1,3-프로판디올 생산에 이용될 수 있는지에 대해서는 제안하지 못했다.
G3PDH의 경우에서와 마찬가지로, 사카로마이세스 세레비지애로부터 글리세롤-3-포스파타제가 단리되었고, 이 단백질은 GPP1 및 GPP2 유전자에 의해 코딩되는 것으로 확인되었다 [Norbeck et al., J Biol. Chem. 271, 13875 (1996)]. G3PDH를 코딩하는 유전자와 마찬가지로, GPP2는 삼투압감수성이 있는 것으로 보인다.
글리세롤 또는 디히드록시아세톤 이외의 다른 발효가능한 탄소 공급원을 단 독 미생물에 의해 1,3-프로판디올로 전환시키는 것이 바람직하지만, 이러한 시도에는 극복해야할 상당한 난점이 있다는 것이 문헌에 기록된 바 있었다. 예를 들어, 문헌 [Gottschalk et al. (EP 373 230)]은 1,3-프로판디올의 생산에 유용한 대부분의 균주들, 예를 들면, 시트로박터 프로인디이, 클로스트리듐 오토부틸리쿰 (Clostridium autobutylicum), 클로스트리듐 부틸리쿰 (Clostridium butylicum), 및 클렙시엘라 뉴모니아 등의 증식이 프럭토스 또는 글루코스 등과 같은 수소 공여자가 있으면 방해를 받는다고 교시한다. 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 및 락토바실러스 부크네리 (Lactobacillus buchneri) 균주는 글리세롤 및 프럭토스 또는 글루코스의 동시 발효 (co-fermentation)시에 1,3-프로판디올을 생산하지만 글리세롤이 유일한 탄소 공급원으로 제공되는 경우에는 증식하지 않으며, 이들의 휴지 세포는 글루코스 또는 프럭토스를 대사할 수 있지만 1,3-프로판디올을 생산하지는 않는 것으로 나타났다 [Veiga DA Cunha et al., J. Bacteriol., 174, 1013 (1992)]. 유사하게, 일리오박터 폴리트로푸스 (Ilyobacter polytropus) 균주는 글리세롤 및 아세테이트가 제공되는 경우에는 1,3-프로판디올을 생산하지만, 프럭토스 및 글루코스 등과 같이 글리세롤 이외의 탄소 기질로부터는 1,3-프로판디올을 생산하지 못하는 것으로 나타났다 [Steib et al., Arch. Microbiol. 140, 139 (1984)]. 마지막으로, 문헌 [Tong et al., Appl. Biochem. Biotech. 34, 149 (1992)]에는 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 dha 레귤론으로 형질전환시킨 재조합 대장균은 외인성 글리세롤이 없는 경우 글루코스 또는 크실로스로부터 1,3-프로판디올을 생산하지 않는다는 것이 교시되어 있다.
글리세롤로부터의 1,3-프로판디올 수율을 개선하기 위한 시도로서, 환원 등가물을 제공할 수 있는 보조 기질, 전형적으로는 발효가능한 당을 상기 과정에 포함시키는 방법이 보고되었다. 시트로박터 프로인디이 및 클렙시엘라 뉴모니아 DSM 4270의 휴지 세포에 의한 글리세롤 및 글루코스의 동시 발효를 이용한 수율 개선 방법이 보고되었으나 ([Gottschalk et al., 상기 문헌] 및 [Tran-Dinh et al., DE 3734 764]), 클렙시엘라 뉴모니아 ATCC 25955의 증식 세포에 의한 글리세롤 및 글루코스의 동시 발효로는 1,3-프로판디올이 전혀 생산되지 않는 것으로 보고되었다 [I-T. Tong, Ph.D. Thesis, University of Wisconsin-Madison (1992)]. 재조합 대장균에 의한 글리세롤 및 글루코스 또는 프럭토스의 동시 발효가 수율을 증가시킨다는 보고가 있었으나, 글리세롤이 없으면 1,3-프로판디올이 전혀 생산되지 않았다 [Tong et al., 상기 문헌]. 상기 시스템에서, 단독 미생물은 NADH 생성을 위한 공급원으로서 탄수화물을 사용하는 한편, 이를 사용하여 세포 유지 또는 증식을 위한 에너지 및 탄소를 제공한다. 이러한 사실은 당이 1,3-프로판디올을 생산하는 탄소 스트림으로 들어가지 않는다는 것을 의미한다.
그러나, 최근에는 문헌 ([미국 특허 제5,686,276호], [WO 9821339], [WO 9928480], 및 [WO 9821341 (미국 특허 제6013494호)])에 데히드라타제 효소를 발현하는 단독 미생물에 의해 글리세롤 또는 디히드록시아세톤 이외의 탄소 기질이 1,3-프로판디올로 전환된다고 기재되었다. 글리세롤 또는 글루코스로부터 1,3-프로판디올이 생산되는 생물학적 과정의 특정 결함은 발효를 통한 생산물의 역가가 낮기 때문에, 수성 발효 브로스로부터 1,3-프로판디올을 얻기 위한 에너지 집약적 인 분리 과정이 요구되었다. 페드-배치 (Fed-batch) 또는 배치 발효를 통해 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생성할 때의 최종 역가는 클로스트리듐 부티리쿰 (Clostridium butyricum)에 의한 경우가 65 g/L였고 [Saint-Amans et al., Biotechnology Letters 16, 831 (1994)], 클로스트리듐 부티리쿰 돌연변이체에 의한 경우는 71 g/L였으며 [Abbad-Andaloussi et al., Appl. Environ. Microbiol. 61, 4413 (1995)], 클렙시엘라 뉴모니아에 의한 경우는 61 g/L였고 [Homann et al., Appl. Bicrobiol. Biotechnol. 33, 121 (1990)], 시트로박터 프로인디이에 의한 경우에는 35 g/L였다 [Homann et al., 상기 문헌]. 글루코스를 발효시켜 1,3-프로판디올을 생성하는 경우의 역가가 글리세롤 발효로부터 얻어진 역가를 초과하는 경우는 아직 개시된 바 없다.
단독 미생물을 이용하여 글루코스 또는 다른 당과 같은 저가의 탄소 기질로부터 1,3-프로판디올을 높은 역가로 생성하기 위한 생물학적 생산 방법은 아직 미해결된 과제이다. 1,3-프로판디올의 생물학적 생산 방법은 기질로서의 글리세롤이 요구되는 2-단계의 순차적 반응으로, 여기서는 데히드라타제 효소 (전형적으로, 보조효소 B12-의존성 데히드라타제)가 글리세롤을 중간체인 3-히드록시프로피온알데히드로 전환시킨 다음, 이것이 NADH (또는 NADPH)-의존성 옥시도리덕타제에 의해 1,3-프로판디올로 환원된다. 보조인자가 요구되는 복잡성 때문에 1,3-프로판디올 생산을 위해 상기 반응 순차를 이용하는 산업적 방법에는 온전한 세포 촉매 (whole cell catalyst)를 사용할 필요가 있다.
발명의 요약
본 출원인들은 상기한 과제를 해결하였고, 본 발명은 단독 미생물을 사용하여 발효가능한 탄소 공급원을 1,3-프로판디올로 직접 생물전환시키되, 예전에 얻어진 역가보다 상당히 높은 역가로 전환시키는 방법을 제공한다. 모델 기질로 글루코스가 사용되고, 모델 숙주로 대장균이 사용된다. 본 발명의 한 측면에서, 유전자 군 (데히드라타제 활성, 데히드라타제 재활성화 인자, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (dhaT), 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 글리세롤-3-포스파타제를 코딩하는 유전자 포함)을 발현하는 재조합 대장균은 글루코스를 1,3-프로판디올로 전환시킬 때의 역가가 글리세롤을 1,3-프로판디올로 발효시킬 때의 역가에 근접하다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 재조합 대장균에서 기능적 dhaT 유전자를 제거하면 글루코스에서 1,3-프로판디올이 상당히 높은 역가로 생성된다. 이러한 예기치못한 역가 증가로 경제성이 개선되어, 글루코스로부터의 1,3-프로판디올 생산 방법이 개선된다.
또한, 본 발명은 일반적으로 1) 글리세롤, 2) 디히드록시아세톤, 3) 글리세롤의 산화 상태의 C3 화합물 (예를 들면, 글리세롤 3-포스페이트), 또는 4) 디히드록시아세톤의 산화 상태의 C3 화합물 (예를 들면, 디히드록시아세톤 포스페이트 또는 글리세르알데히드 3-포스페이트)로 쉽게 전환되는 임의의 탄소 기질을 포함하도 록 응용될 수 있다. dhaT- 균주에서의 1,3-프로판디올 생산에는 3-HPA를 1,3-프로판디올로 전환시키는 비특이적 촉매 활성이 필요하다. 3-HPA를 1,3-프로판디올로 전환시키는 비특이적 촉매 활성을 담당하는 효소(들) 및(또는) 유전자(들)의 확인은 넓은 범위의 탄소-함유 기질로부터의 기질을 사용하여 넓은 범위의 숙주 미생물에서 이루어질 것이다. 또한, 이렇게 3-HPA를 1,3-프로판디올로 전환시키는 비특이적 촉매 활성을 사용하면, 역가 개선 및 이로인한 경제성 개선에 의해 글리세롤 또는 디히드록시아세톤으로부터의 1,3-프로판디올 생산 방법이 개선될 것임이 예상된다.
상기 활성은 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환시키는 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 핵산 단편으로 단리되었으며, 서열 58에 기재한 것이거나, 하기로 구성된 군에서 선택되는 것이다:
(a) 서열 57의 아미노산 서열 전체 또는 그의 상당 부분을 코딩하는 단리된 핵산 단편,
(b) 서열 57의 아미노산 서열 전체 또는 그의 상당 부분을 코딩하는 단리된 핵산 단편과 실질적으로 유사한 단리된 핵산 단편,
(c) 서열 57의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상인, 아미노산 387개 이상인 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 단편,
(d) 0.1 ×SSC, 0.1％ SDS, 65℃의 혼성화 조건하에 (a)와 혼성화하고, 2 ×SSC, 0.1％ SDS로 세척한 후, 0.1 ×SSC, 0.1％ SDS로 세척한 단리된 핵산 단편, 및
(e) (a), (b), (c), 또는 (d)에 상보적인 단리된 핵산 단편.
별법으로, 비특이적 촉매 활성은 서열 57에 기재한 폴리펩티드에서 구현된다. 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 기재한 단리된 핵산 단편을 포함하는 키메라 유전자를 제작할 수 있다. 이 키메라 유전자를 사용하여 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클렙시엘라, 에어로박터 (Aerobacter), 락토바실러스, 아스페르길러스 (Aspergillus), 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 지고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 피치아 (Pichia), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 무코르 (Mucor), 토룰로프시스 (Torulopsis), 메틸로박터 (Methylobacter), 살모넬라, 바실러스, 에어로박터, 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 에쉐리히아 (Escherichia), 및 슈도모나스 (Pseudomonas)로 구성된 군에서 선택된 미생물을 형질전환시킬 수 있다. 바람직한 숙주는 대장균이다.
그러므로, 본 발명은 (a) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (b) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (c) 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (d)데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 유전자 1종 이상, (e) 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환시키기에 충분한 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자 1종 이상을 포함하고, 1,3- 프로판디올 옥시도리덕타제를 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는, 1,3-프로판디올 생산에 유용한 재조합 미생물을 제공한다. 바람직한 실시양태는 dhaT 유전자가 없는 재조합 미생물 (바람직하게는 대장균)이다. 경우에 따라, 상기 재조합 미생물은 (a) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, (b) 글리세롤 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 (c) 트리오스포스페이트 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 내인성 유전자의 돌연변이 (예를 들면, 결실 돌연변이 또는 점 돌연변이)를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 적합한 조건하에, dha 레귤론을 포함하고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는 재조합 대장균을 단당류, 올리고당류, 다당류 및 1-탄소 기질로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원 1종 이상과 접촉시키는 단계, 및
(b) 경우에 따라, 단계 (a)에서 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는, 1,3-프로판디올의 생산 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은
(a) 본 발명의 재조합 미생물을 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 1-탄소 기질로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원 1종 이상과 접촉시켜 1,3-프로판디올을 생산하는 단계, 및
(b) 경우에 따라, 단계 (a)에서 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계
를 포함하는, 재조합 미생물로부터의 1,3-프로판디올 생산 방법을 포함한다.
유사하게, 본 발명은
(a) (i) 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (ii) 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 유전자 1종 이상, (iii) 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환시키기에 충분한 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자 1종 이상을 포함하고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제를 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는 재조합 미생물을 글리세롤 및 디히드록시아세톤으로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원 1종 이상과 접촉시켜 1,3-프로판디올을 생산하는 단계, 및
(b) 경우에 따라, 단계 (a)에서 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계
를 포함하는, 재조합 미생물로부터의 1,3-프로판디올의 생산 방법을 제공하려 한다.
본 발명의 다른 측면은 탄소 기질의 동시 공급 방법을 제공한다. 1,3-프로판디올을 생산하기 위한 이러한 실시양태에서, 상기 단계들은
(a) (i) 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상, (ii) 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상, (iii) 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환시키기에 충분한 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상을 포함하고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는 재조합 대장균을 글리세롤 및 디히드록시아세톤으로 구성된 군에서 선택된 제1 탄소 공급원 및 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 1-탄소 기질로 구성된 군에서 선택된 제2 탄소 공급원과 접촉시키는 단계, 및
(b) 경우에 따라, 단계 (a)에서 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계이다. 동시 공급은 순차적이거나 동시일 수 있다. 동시 공급 실시양태에 사용되는 재조합 대장균은 (a) (i) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (ii) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, 및 (iii) dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 orfZ의 유전자 생산물을 코딩하는 유전자 서브세트 1종 이상으로 구성된 외인성 유전자 세트, 및 (b) (i) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, (ii) 글리세롤 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 (iii) 트리오스포스페이트 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 구성되고, 각각의 유전자가 상기 유전자를 불활성화시키는 돌연변이를 갖는 내인성 유전자 세트를 추가로 포함할 수 있다.
유용한 재조합 대장균 균주로는 (a) (i) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 (ii) 글리세롤 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 구성되고 각각의 유전자가 상기 유전자를 불활성화시키는 돌연변이를 갖는 내인성 유전자 2종의 세트, (b) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상, (c) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상, 및 (d) 플라스미드 pKP32를 포함하는 재조합 대장균 균주 KLP23; 및 (a) (i) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, (ii) 글리세롤 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 (iii) 트리오스포스페이트 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 구성되고, 각각의 유전자가 상기 유전자를 불활성화시키는 돌연변이를 갖는 내인성 유전자 3종의 세트를 포함하는 재조합 대장균 균주 RJ8 등이 있다.
다른 유용한 실시양태는 (a) (i) 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (ii) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (iii) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, 및 (iv) 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 유전자 1종 이상으로 구성된 외인성 유전자 세트, 및 (b) 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환하는 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자 1종 이상을 포함하고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는 재조합 대장균을 포함한다.
다른 실시양태는 (a) (i) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (ii) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, 및 (iii) dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 orfZ의 유전자 생산물을 코딩하는 유전자의 서브세트 1종 이상으로 구성된 외인성 유전자 세트, 및 (b) 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환하는 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자 1종 이상을 포함하고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는 재조합 대장균을 포함한다. 또한, 이러한 실시양태는 (a) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, (b) 글리세롤 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 (c) 트리오스포스페이트 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 구성되고, 각각의 유전자가 상기 유전자를 불활성화시키는 돌연변이를 갖는 내인성 유전자 세트를 포함하는 재조합 대장균을 사용하는 방법을 포함할 수도 있다.
또한, 이러한 실시양태는
(a) 적합한 조건하에, 위에 개시한 재조합 대장균을 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 1-탄소 기질로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원 1종 이상과 접촉시켜 1,3-프로판디올을 생산하는 단계, 및
(b) 경우에 따라, 단계 (a)에서 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는, 1,3-프로판디올의 생물학적 생산 방법을 추가로 제공한다.
또한,
(a) (i) 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상, (ii) 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상, (iii) 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환시키는 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자 1종 이상을 추가로 포함하는, 위에 개시한 실시양태의 재조합 대장균을 글리세롤 및 디히드록시아세톤으로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원 1종 이상과 접촉시키는 단계, 및
(b) 경우에 따라, 단계 (a)에서 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계
를 포함하는 1,3-프로판디올의 생물학적 생산 방법을 추가로 포함한다.
도면의 간단한 설명, 서열 기재 및 생물학적 기탁물
본 발명은 하기의 상세한 기재, 도, 및 첨부 서열 기재, 및 본 명세서의 일부를 구성하는 생물학적 기탁물로부터 더욱 완전히 이해될 수 있다.
도 1은 dha 레귤론 서브클론 pHK28-26 서열 내의 유전자 조직을 도시한다.
도 2는 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 일정 공급량의 비타민 B12를 사용하여 운전한 2가지 발효물 사이를 비교한 세포외 가용성 단백질 (g/L)의 그래프를 도시한다. 실선으로 나타낸 경우에서 사용된 균주는 KLP23/pAH48/pKP32이다. 점선으로 나타낸 경우에서 사용된 균주는 KLP23/pAH48/pDT29이다.
도 3은 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 일정 공급량의 비타민 B12를 사용하여 운전한 2가지 발효물 사이를 비교한 세포 생존력 [(살아있는 세포수/mL)/OD550]의 그래프를 도시한다. 실선으로 나타낸 경우에서 사용된 균주는 KLP23/pAH48/pKP32이다. 점선으로 나타낸 경우에서 사용된 균주는 KLP23/pAH48/pDT29이다.
도 4는 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 운전하되, 비타민 B12 또는 보조효소 B12 없이 운전한 2가지 발효물 사이를 비교한, 글루코스로부터의 글리세롤 수율의 그래프를 도시한다. 실선으로 나타낸 경우에서 사용된 균주는 KLP23/pAH48/pKP32이다. 점선으로 나타낸 경우에서 사용된 균주는 KLP23/pAH48/pDT29이다.
도 5는 글루코스의 1,3-프로판디올로의 대사 전환을 나타내는 흐름 도표이다.
도 6은 천연 겔 상에서 내인성 대장균 옥시도리덕타제 활성 (비특이적 촉매 활성)을 나타내는 하나의 밴드로부터 추출해 낸 가용성 단백질 분획을 사용한 2D-PAGE 막 블럿팅이다.
68개의 서열 기재 및 본원에 첨부된 서열목록은 37 C.F.R. §1.821-1.825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules")에 기재된 바와 같이, 특허 출원시의 뉴클레오티드 및(또는) 아미노산 서열 개시에 관한 규정에 따른 것이며, WIPO (World Intellectual Property Organization) 스탠다드 ST2.5 (Standard ST2.5) (1998) 및 EPO 및 PCT (Rules 5.2 and 49.5(a-bis), and Section 208 and Annex C of the Administration Instructions)의 서열목록에 대한 요건에 부합된다. 서열 기재는 문헌 [Nucleic Acids Res. 13, 3021-3030 (1985)] 및 문헌 [Biochemical Journal 219, 345-373 (1984)]에 기재된 IUPAC-IYUB 기준과 일치하게 정의된, 뉴클레오티드 서열에 대한 1글자 알파벳 코드 및 아미노산에 대한 3글자 코드를 함유하며, 상기 문헌은 본원에서 참고로 도입된다.
서열 1은 pIBI31 (미국 코넥티커트주 뉴 헤이븐 소재의 IBI 바이오시스템 (IBI Biosystem) 제품)로 서브클로닝시킨 pKP1 (클렙시엘라 뉴모니아의 DNA를 함유하는 코스미드) (이를 pHK28-26라 지칭함)의 12.1 kb EcoRI-SalI 단편으로부터 결 정된 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 표 1에는 유전자, 서열 1에서 확인된 해당 염기쌍, 및 관련 기능에 관해 더욱 상세히 기재했다. 실시예 1을 참조한다.
서열 57은 yqhD에 대해 결정된 뉴클레오티드 서열을 함유한다.
본 출원인들은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 하기를 생물학적으로 기탁했다.
서열 58은 yqhD에 대해 결정된 아미노산 서열을 함유한다.
기탁자가 부여한 식별 표시 국제 수탁 번호 수탁 일자
글리세롤 데히드라타제 효소를 코딩하는 클렙시엘라 게놈 일부를 함유하는, 형질전환된 대장균 DH5α ATCC 69789 1995년 4월 18일
디올 데히드라타제 효소를 코딩하는 클렙시엘라 게놈 일부를 함유하는, 형질전환된 대장균 DH5α ATCC 69790 1995년 4월 18일
대장균 MSP33.6 ATCC 98598 1997년 11월 25일
glpK 돌연변이체 대장균 RJF 1Om ATCC 98597 1997년 11월 25일

상기 기탁물(들)은 상기 지정된 국제 기탁 기관에 30 년 이상 유지될 것이고, 이를 개시한 특허가 승인되는 즉시 공개적으로 이용가능해질 것이다. 행정 활동에 의해 수여된 특허 권리의 침해에 있어서, 상기 기탁물의 이용가능성은 본 발명을 실행하기 위한 라이센스를 구성하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "ATCC"이란, 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) 국제 기탁 기관을 일컫는다. "ATCC 번호"는 배양물을 ATCC에 기탁한 후의 수탁 번호이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 단독 미생물을 사용하여 발효가능한 탄소 공급원을 1,3-프로판디올로 직접 생물전환 시키기 위한 개선된 방법을 제공한다. 상기 방법은 역가, 수율, 및 세포 생존력 개선 뿐 아니라, 발효 동안의 세포 용해율이 감소된다는 특징이 있다.
본 발명은 부분적으로는 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (dhaT)를 포함하는 1,3-프로판디올 발효 과정이 배지 내에 세포 생존력 감소와 상관관계가 있는 3-HPA 및 다른 알데히드 및 케톤이 고농도로 존재한다는 특징이 있다는 관찰을 기초로 한다. 또한, 본 발명은 부분적으로는 모델 숙주인 대장균이 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환시킬 수 있는 내인성 비특이적 촉매 활성에 의해 3-HPA를 1,3-프로판디올로 전환시킬 수 있다는 예기치못한 발견을 기초로 한다. 또한, 본 발명은 부분적으로는 이러한 비특이적 촉매 활성을 포함하고 기능적 dhaT는 없는 대장균 발효 과정이 발효 동안의 세포 생존력을 증가시키고, 기능적 dhaT를 포함하는 발효 과정보다 1,3-프로판디올의 역가 및(또는) 수율이 높다는 예기치못한 발견을 기초로 한다.
한 측면에서, 상기 모델 기질은 글리세롤이며, 상기 숙주 미생물은 야생형 dhaT에서 돌연변이가 있어서 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성이 없고, 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환시키기에 충분한 비특이적 촉매 활성을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 모델 기질은 글루코스이며, 모델 숙주는 재조합 대장균이다. 이러한 측면에서, 대장균은 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환시키기에 충분한 내인성 비특이적 촉매 활성을 포함한다. 한 실 시양태에서, 상기 비특이적 촉매 활성은 알콜 데히드로게나제이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (b) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (c) 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (d) 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 유전자 1종 이상, 및 (e) 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환시키기에 충분한 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자 1종 이상을 포함하는 유전자 군을 발현하는 재조합 대장균을 제공한다; 상기 미생물을 이용하면 글루코스가 높은 역가로 1,3-프로판디올로 전환된다. 본 발명의 다른 측면에서, 상기 재조합 대장균에서 기능적 dhaT 유전자를 제거하면, 글루코스로부터 1,3-프로판디올로의 역가가 이전에 달성된 것보다 예기치못한 높은 역가로 제공된다.
본 발명은 단독 미생물 내에서 발효가능한 탄소 공급원으로부터 1,3-프로판디올을 생물학적으로 생산하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 본 발명의 한 측면에서, 글루코스를 1,3-프로판디올로 전환시키기 위한 개선된 방법은 클렙시엘라 뉴모니아 dha 레귤론 유전자인 dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3, 및 orfZ (이 유전자 모두는 야생형 클렙시엘라 뉴모니아에서 발견되는 바와 동일한 유전적 조직으로 배열됨)를 사용하여 형질전환시킨 숙주 대장균을 포함하는 재조합 미생물을 사용하면 달성된다. 상기 발효 방법으로 얻어지는 역가는 유사한 발효법에 대해 이전에 보고된 역가보다 상당히 높다. 이러한 개선은 실시예 6 및 실시예 7에 기재된 바와 같이, 플라스미드 pDT29의 사용 여부에 따라 달라진다.
본 발명의 다른 측면에서, 글루코스로부터 1,3-프로판디올을 생산하기 위해 G3PDH, G3P 포스파타제, 데히드라타제, 및 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 대장균을 사용하는 방법은 G3PDH, G3P 포스파타제, 데히드라타제, 데히드라타제 재활성화 인자 뿐 아니라 기능적 dhaT까지도 함유하는 재조합 대장균을 사용하는 방법에 비해 개선된 방법이다. 이 방법의 극적인 개선은 대장균에 존재하는 알콜 데히드로게나제로 예측되는 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자의 존재 여부에 따라 달라진다.
실시예 7 및 9에서 설명된 바와 같이, 상기 방법에서의 극적인 개선점은 1,3-프로판디올 역가 증가로 명백하다. 또한, 상기 방법에서의 개선점은 발효 브로스 중 세포외 가용성 단백질 농도로 결정되는 세포 용해율의 감소로도 명백하다. 본 발명의 이러한 측면은 도 2에서 설명된다. 또한, 상기 방법에서의 개선점은 발효 과정에 걸친 세포 생존력의 연장으로도 명백하다. 본 발명의 이러한 측면은 도 3에서 설명된다. 또한, 상기 방법에서의 개선점은 수율 증가로도 명백하다. 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (dhaT)를 발현하는 대장균 (예를 들면, 플라스미드 pDT29로 형질전환된 대장균 KLP23)에서, 글리세롤은 3-HPA 이외의 생산물로 대사될 수 있다. 완전 반대로, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (dhaT)를 발현하지 않는 대장균 (예를 들면, 플라스미드 pKP32로 형질전환된 대장균 KLP23)에서, 글리세롤은 3-HPA 이외의 생산물로 대사되지 않는다. 이러한 비밀스런 (cryptic) 경로가 기능적 dhaT의 존재 여부에 기인할 수 있다는 것이 도 4에서 설명된 바와 같이 글루코스로부터의 글리세롤 수율 감소로 입증되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, 하기의 용어들을 사용하여 청구의 범위 및 명세서를 이해할 수 있다.
용어 "글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제" 및 "G3PDH"이란, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)의 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 담당하는 폴리펩티드를 일컫는다. 생체내 G3PDH는 NADH-, NADPH-, 또는 FAD-의존성일 수 있다. 특별히, 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제에 특이적인 보조인자를 일컫는 경우에는 용어 "NADH-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제", "NADPH-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제" 및 "FAD-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제"가 사용될 것이다. NADH-의존성 및 NADPH-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제가 NADH 및 NADPH를 서로 교환가능하게 (interchangeably) 사용할 수 있는 경우에 통상적이듯이 (예를 들면, gpsA가 코딩하는 유전자에 의한 경우), 용어 NADH-의존성 및 NADPH-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 서로 교환가능하게 사용될 것이다. NADH-의존성 효소 (EC 1.1.1.8)는 GPD1 (젠뱅크 Z74071x2), 또는 GPD2 (젠뱅크 Z35169x1), 또는 GPD3 (젠뱅크 G984182), 또는 DAR1 (젠뱅크 Z74071x2) 등의 여러 유전자에 의해 코딩된다. NADPH-의존성 효소 (EC 1.1.1.94)는 gpsA (젠뱅크 U321643, (cds 197911-196892) G466746 및 L45246)에 의해 코딩된다. FAD-의존성 효소 (EC 1.1.99.5)는 GUT2 (젠뱅크 Z47047x23), 또는 glpD (젠뱅크 G147838), 또는 glpABC (젠뱅크 M20938)에 의해 코딩된다 (본원에서 참고로 도입되는 WO 9928480 및 그의 참고문헌 참조).
용어 "글리세롤-3-포스파타제", "sn-글리세롤-3-포스파타제", 또는 "d,l-글리세롤 포스파타제", 및 "G3P 포스파타제"란, 글리세롤-3-포스페이트 및 물의 글리세롤 및 무기 포스페이트로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 담당하는 폴리펩티드를 일컫는다. G3P 포스파타제는 GPP1 (젠뱅크 Z47047x125), 또는 GPP2 (젠뱅크 U18813x11) 등에 의해 코딩된다 (본원에서 참고로 도입되는 WO 9928480 및 그의 참고문헌 참조).
용어 "글리세롤 키나제"이란, 글리세롤 및 ATP의 글리세롤-3-포스페이트 및 ADP로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 담당하는 폴리펩티드를 일컫는다. 고에너지 포스페이트 공여자인 ATP는 생리적 치환체 (예를 들면, 포스포에놀피루브산염)로 대체될 수 있다. 글리세롤 키나제는 GUT1 (젠뱅크 U11583x19) 및 glpK (젠뱅크 L19201) 등에 의해 코딩된다 (본원에서 참고로 도입되는 WO 9928480 및 그의 참고문헌 참조).
용어 "글리세롤 데히드로게나제"이란, 글리세롤의 디히드록시아세톤으로의 전환을 촉매하는 효소 활성 (E.C.1.1.1.6) 또는 글리세롤의 글리세르알데히드로의 전환을 촉매하는 효소 활성 (E.C.1.1.1.72)을 담당하는 폴리펩티드를 일컫는다. 글리세롤의 디히드록시아세톤으로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 담당하는 폴리펩티드는 "디히드록시아세톤 리덕타제"라고 일컬어지기도 한다. 글리세롤 데히드로게나제는 NADH-의존성 (E.C.1.1.1.6), NADPH-의존성(E.C.1.1.1.72), 또는 기타 보조인자-의존성 (예를 들면, E.C.1.1.99.22)일 수 있다. NADH-의존성 글리세롤 데히드로게나제는 gldA (젠뱅크 U00006) 등에 의해 코딩된다 (본원에서 참고로 도입 되는 WO 9928480 및 그의 참고문헌 참조).
용어 "데히드라타제 효소" 또는 "데히드라타제"란, 글리세롤 분자의 생산물 3-히드록시프로피온알데히드로의 전환을 촉매하는 임의의 효소 활성을 일컫는다. 본 발명의 목적상, 상기 데히드라타제 효소는 글리세롤 데히드라타제 (E.C.4.2.1.30) 및 디올 데히드라타제 (E.C.4.2.1.28) (바람직한 기질은 각각 글리세롤 및 1,2-프로판디올)를 포함한다. 데히드라타제 효소에 대한 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아, 시트로박터 프로인디이, 클로스트리듐 파스테리아눔, 살모넬라 티피무리움, 및 클렙시엘라 옥시토카에서 확인되었다. 각각의 경우에서, 데히드라타제는 3개의 서브유닛으로 구성된다: 큰 서브유닛 또는 "α" 서브유닛, 중간 서브유닛 또는 "β" 서브유닛, 및 작은 서브유닛 또는 "γ" 서브유닛. 문헌에서 사용된 유전자 명명법이 다양하기 때문에, 용이한 확인을 위해 표 1에 비교 챠트를 제공했다. 또한, 상기 유전자들은 예를 들면, 문헌 [Daniel et al., FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999)] 및 문헌 [Toraya and Mori, J Biol. Chem. 274, 3372 (1999)] 등에도 기재되어 있다. 표 1을 참조하면, 글리세롤 데히드라타제의 큰 서브유닛 또는 "α" 서브유닛을 코딩하는 유전자로는 dhaB1, gldA 및 dhaB 등이 있고, 중간 서브유닛 또는 "β" 서브유닛을 코딩하는 유전자로는 dhaB2, gldB, 및 dhaC 등이 있으며, 작은 서브유닛 또는 "γ" 서브유닛을 코딩하는 유전자로는 dhaB3, gldC, 및 dhaE 등이 있다. 다시 표 1을 참조하면, 디올 데히드라타제의 큰 서브유닛 또는 "α" 서브유닛을 코딩하는 유전자로는 pduC 및 pddA 등이 있고, 중간 서브유닛 또는 "β" 서브유닛을 코딩하는 유전자로는 pduD 및 pddB 등이 있으 며, 작은 서브유닛 또는 "γ" 서브유닛을 코딩하는 유전자로는 pduE 및 pddC 등이 있다.
데히드라타제에 관한 유전자 명칭 및 젠뱅크 참조번호, 및 데히드라타제 관련 기능을 위한 비교용 챠트
유전자 기능
조절 알려져 있지 않음 재활성화 1,3-PD 데히드로게나제 알려져 있지 않음
유전자 염기쌍 유전자 염기쌍 유전자 염기쌍 유전자 염기쌍 유전자 염기쌍
유기체 (젠뱅크 참조번호)
클렙시엘라 뉴모니아 (서열 1) dhaR 2209-4134 orfW 4112-4642 orfX 4643-4996 dhaT 5017-6108 orfY 6202-6630
클렙시엘라 뉴모니아 (U30903) orf2c 7116-7646 orf2b 6762-7115 dhaT 5578-6741 orf2a 5125-5556
클렙시엘라 뉴모니아 (U60992) gdrB
시트로박터 프로인디이 (U09771) dhaR 3746-5671 orfW 5649-6179 orfX 6180-6533 dhaT 6550-7713 orfY 7736-8164
클로스트리듐 파스테리아눔 (AF051373)
클로스트리듐 파스테리아눔 (AF006034) orfW 210-731 orfX 1-196 dhaT 1232-2389 orfY 746-1177
살모넬라 티피무리움 (AF026270) pduH 8274-8645
클렙시엘라 옥시토카 (AF017781) ddrB 2063-2440
클렙시엘라 옥시토카 (AF051373)
유전자 기능
데히드라타제, α 데히드라타제, β 데히드라타제, γ 재활성화
유전자 염기쌍 유전자 염기쌍 유전자 염기쌍 유전자 염기쌍
유기체 (젠뱅크 참조번호)
클렙시엘라 뉴모니아 (서열 1) dhaB1 7044-8711 dhaB2 8724-9308 dhaB3 9311-9736 orfZ 9749-11572
클렙시엘라 뉴모니아 (U30903) dhaB1 3047-4714 dhaB2 2450-2890 dhaB3 2022-2447 dhaB4 186-2009
클렙시엘라 뉴모니아 (U60992) gldA 121-1788 gldB 1801-2385 gldC 2388-2813 gdrA
시트로박터 프로인디이 (U09771) dhaB 8556-10223 dhaC 10235-10819 dhaE 10822-11250 orfZ 11261-13072
클로스트리듐 파스테리아눔 (AF051373) dhaB 84-1748 dhaC 1779-2318 dhaE 2333-2773 orfZ 2790-4598
클로스트리듐 파스테리아눔 (AF006034)
살모넬라 티피무리움 (AF026270) pduC 3557-5221 pduD 5232-5906 pduE 5921-6442 pduG 6452-8284
클렙시엘라 옥시토카 (AF017781) ddrA 241-2073
클렙시엘라 옥시토카 (AF051373) pddA 121-1785 pddB 1796-2470 pddC 2485-3006

글리세롤 및 디올 데히드라타제는 글리세롤 및 몇몇 다른 기질에 의해 메카니즘에 기초한 자살 불활성화의 대상이 된다 [Daniel et al., FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999)]. 용어 "데히드라타제 재활성화 인자"이란, 데히드라타제 활성의 재활성화에 담당하는 단백질들을 일컫는다. 용어 "데히드라타제 재활성화 활성", "데히드라타제 활성을 재활성화시키는" 또는 "데히드라타제 활성을 재생산하 는"이란, 기질을 촉매할 수 없는 데히드라타제를 기질을 촉매할 수 있는 데히드라타제로 전환하는 현상, 데히드라타제의 불활성화 억제 현상, 또는 생체내 데히드라타제 효소의 유용한 반감기를 연장하는 현상을 일컫는다. 데히드라타제 재활성화 인자와 관련된 2가지 단백질이 확인되었다 [WO 9821341 (미국 특허 제6013494호) 및 그의 참고문헌, [Daniel et al., 상기 문헌], [Toraya and Mori, J. Biol. Chem. 274, 3372 (1999)] 및 [Tobimatsu et al., J. Bacteriol. 181, 4110 (1999)] 참조, 상기 문헌은 본원에서 참고로 도입됨). 표 1을 참조하면, 상기 2가지 단백질 중 하나를 코딩하는 유전자는 orfZ, dhaB4, gdrA, pduG 및 ddrA 등이 있다. 또한, 표 1을 참조하면, 상기 중 나머지 하나를 코딩하는 유전자는 orfX, org2b, gdrB, pduH 및 ddrB 등이 있다.
용어 "1,3-프로판디올 옥시도리덕타제", "1,3-프로판디올 데히드로게나제" 또는 "DhaT"란, 상기 활성을 코딩하는 유전자(들)가 그의 자연 형태 (즉, 야생형)에서 데히드라타제 효소에 물리적 또는 전사적으로 관련되어 있다고 밝혀진, 3-HPA 및 1,3-프로판디올의 상호전환을 촉매할 수 있는 효소 활성을 담당하는 폴리펩티드(들)를 일컫는다; 예를 들어, 클렙시엘라 뉴모니아의 dhaT 경우, 이 유전자는 dha 레귤론 내에서 발견된다. 표 1을 참조하면, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제를 코딩하는 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아, 시트로박터 프로인디이, 및 클로스트리듐 파스테리아눔의 dhaT 등이 있다. 이러한 유전자 각각은 제III형 알콜 데히드로게나제 족에 속하는 폴리펩티드를 코딩하고, 철-결합 모티프가 보존되어 있으며, 3-HPA 및 1,3-프로판디올의 NAD+/NADH 관련 상호전환에 우선적으로 관여한다 ([Johnson and Lin, J. Bacteriol. 169, 2050 (1987)], [Daniel et al., J. Bacteriol. 177, 2151 (1995)], 및 [Leurs et al., FEMS Microbiol. Lett. 154, 337 (1997)]). 물리적 특성이 유사한 효소가 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 부크네리 [Veiga da Dunha and Foster, Appl. Environ. Microbiol. 58, 2005 (1992)]에서 단리되었다.
용어 "dha 레귤론"이란, 각종 생물학적 활성을 코딩하는 오픈리딩프레임 또는 관련 유전자 세트를 일컬으며, 상기 활성에는 데히드라타제 활성, 재활성화 활성, 및 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 본원에 기재된 바와 같이, dha 레귤론은 오픈리딩프레임 dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3, 및 orfZ를 포함한다.
용어 "비특이적 촉매 활성"이란, 3-HPA 및 1,3-프로판디올의 상호전환을 촉매하기에 충분한 효소활성을 담당하는 폴리펩티드(들)를 일컫고, 구체적으로 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제(들)은 제외한다. 전형적으로, 이 효소들은 알콜 데히드로게나제이다. 상기 효소들은 NAD+/NADH를 제외한 보조인자를 이용할 수 있는데, 이러한 보조인자로는 FAD 또는 FMN 등의 플라빈 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 비특이적 알콜 데히드로게나제(들)에 관한 유전자(들)은 예를 들면, 미생물 대장균 KLP23 내에서 내인성으로 코딩되고 기능적으로 발현된다고 밝혀졌다. .
용어 "기능" 또는 "효소 기능"이란, 특이적 화학적 반응을 수행하는데 요구 되는 에너지가 변경된 효소의 촉매 활성을 일컫는다. 이 활성은 생산물 또는 기질 생산이 적합한 조건하에 수행될 수 있는 평형상태의 반응에 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 서로 교환가능하게 사용된다.
용어 "탄소 기질" 및 "탄소 공급원"이란, 본 발명의 숙주 미생물에 의해 대사될 수 있는 탄소 공급원, 특히, 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 1-탄소 기질 또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원을 일컫는다.
용어 "숙주 세포" 또는 "숙주 미생물"이란, 외래 또는 이종 유전자를 수용할 수 있고, 이 유전자들을 발현하여 활성 유전자 생산물을 생산할 수 있는 미생물을 일컫는다.
용어 "외래 유전자", "외래 DNA", "이종 유전자" 및 "이종 DNA"란, 어떤 미생물에서는 천연인 유전적 물질이 각종 수단에 의해 숙주 미생물 내에 위치하게 된 유전적 물질을 일컫는다. 해당 유전자는 자연 발생 유전자, 돌연변이된 유전자, 또는 합성 유전자일 수 있다.
용어 "형질전환" 및 "형질감염"이란, 핵산의 도입 후에 세포에서 새로운 유전자가 수득됨을 일컫는다. 수득된 유전자는 염색체 DNA에 통합되거나 염색체외 복제 서열로서 도입될 수 있다. 용어 "형질전환체"란, 형질전환의 생산물을 일컫는다.
용어 "유전적으로 변경된"이란, 형질전환 또는 돌연변이에 의해 유전성 물질을 변화시키는 과정을 일컫는다.
용어 "재조합 미생물" 및 "형질전환된 숙주"란, 이종 또는 외래 유전자, 또는 상동성 유전자의 여분 카피로 형질전환된 임의의 미생물을 일컫는다. 본 발명의 재조합 미생물은 적합한 탄소 기질로부터 1,3-프로판디올을 생산하기 위한 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (GPD1), 글리세롤-3-포스파타제 (GPP2), 글리세롤 데히드라타제 (dhaB1, dhaB2 및 dhaB3), 데히드라타제 재활성화 인자 (orfZ 및 orfX), 및 경우에 따라 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (dhaT)를 코딩하는 외래 유전자를 발현한다. 바람직한 실시양태는 상기 유전자로 형질전환되었으나 기능적 dhaT는 없는 대장균이다. 또한, 대장균을 제외한 숙주 미생물은 상기 개시된 유전자, 및 3-HPA 및 1,3-프로판디올의 상호전환을 위한 비특이적 촉매 활성에 관한 유전자를 함유하되, 특별히 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제(들)에 관한 유전자 (dhaT)는 제외하도록 형질전환될 수 있다.
"유전자"란, 코딩 영역의 앞쪽 (5' 비코딩) 및 뒤쪽 (3' 비코딩) 조절 서열을 포함하는, 특이적 단백질을 발현하는 핵산 단편을 일컫는다. 용어 "천연" 및 "야생형"이란, 자연계에 존재하는 유전자 및 그의 고유 조절 서열을 일컫는다.
용어 "코딩하는" ("encoding" 및 "coding")이란, 유전자가 전사 및 번역 메카니즘을 통해 아미노산 서열을 생산하는 과정을 일컫는다. 특정 아미노산 서열을 코딩하는 과정은 코딩되는 아미노산에 변화를 초래하지 않는 염기 변화를 포함할 수 있거나, 아미노산 하나 이상을 변경시킬 수 있지만 그 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 특성에는 영향을 미치지 않는 염기 변화를 포함하는 것으로 이해된다. 그러므로, 본 발명은 구체적으로 예시된 서열 이상을 포괄하는 것으로 이 해된다.
용어 "단리된"이란, 자연적으로 결합된 성분 1종 이상을 제거한 단백질 또는 DNA 서열을 일컫는다.
"단리된 핵산 분자"란, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA의 폴리머를 일컬으며, 이는 경우에 따라 합성, 비자연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. DNA 폴리머 형태의 단리된 핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 절편을 하나 이상 포함할 수 있다.
"실질적으로 유사한"이란, 하나 이상의 뉴클레오티드 염기 변화가 하나 이상의 아미노산을 치환시킬 수 있으나, 그 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 특성에는 영향을 미치지 않는 핵산 분자를 일컫는다. 또한, "실질적으로 유사한"이란, 하나 이상의 뉴클레오티드 염기 변화가 안티센스 또는 동시 저해 기술 (co-suppression technology)에 의한 유전자 발현의 변경을 매개하는 핵산 분자의 능력에는 영향을 미치지 않는 핵산 분자를 일컫는다. 또한, "실질적으로 유사한"이란, 안티센스 또는 동시 저해 기술에 의한 유전자 발현의 변경, 또는 생성되는 단백질 분자의 기능적 특성 변경을 매개하는 능력과 비교할 때, 생성되는 전사체의 기능적 특성에는 실질적으로 영향을 미치지 않는, 본 발명의 핵산 분자의 변형 (하나 이상의 뉴클레오티드 염기 결실 또는 삽입 등)을 일컫는다. 본 발명은 구체적으로 예시된 서열 이상을 포괄한다.
예를 들어, 유전자를 변경해도 그 부위에 화학적으로 동등한 아미노산이 생산되고, 코딩되는 단백질의 기능적 특성에 영향을 주지 않는다는 것이 당업계에 공 지되어 있다. 본 발명의 목적상, 치환은 다음의 5개 군 중 하나 안에서의 교환으로 정의된다:
1. 작은 지방족, 비극성 잔기 또는 작은 지방족, 다소 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly),
2. 극성, 음으로 대전된 잔기 및 그의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln,
3. 극성, 양으로 대전된 잔기: His, Arg, Lys,
4. 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val (Cys), 및
5. 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp.
그러므로, 소수성 아미노산인 알라닌의 코돈은 다른 덜 소수성인 잔기 (예를 들면, 글리신) 또는 더욱 소수성인 잔기 (예를 들면, 발린, 루이신, 또는 이소루이신)를 코딩하는 코돈으로 치환될 수 있다. 유사하게, 음으로 대전된 한 잔기를 다른 음으로 대전된 잔기로 치환 (예를 들면, 아스파르트산을 글루탐산으로 치환)하는 변화, 또는 양으로 대전된 한 잔기를 다른 양으로 대전된 잔기로 치환 (예를 들면, 라이신을 아르기닌으로 치환)하는 변화 또한 기능적으로 동등한 생산물을 생산할 것이라 예측될 수 있다.
많은 경우에서, 단백질 분자의 N-말단 및 C-말단 일부를 변경시키는 뉴클레오티드 변화 또한 그 단백질의 활성을 변경시키지 않을 것이라고 예측된다.
제안된 변형 각각은 코딩된 생산물의 생물학적 활성 보유 여부를 결정하는 것과 같이, 당업계의 통상적인 기술 내이다. 또한, 당업자라면, 본 발명에 포함되는 실질적으로 유사한 서열 역시 본원에서 예시된 서열과 엄격한 조건 (0.1 ×SSC, 0.1％ SDS, 65℃에서 혼성화한 후, 2 ×SSC, 0.1％ SDS로 세척한 후 0.1 ×SSC, 0.1％ SDS로 세척)하에 혼성화하는 능력에 의해 정의된다는 점을 알 것이다. 본 발명에 바람직한 실질적으로 유사한 핵산 단편은 본원에서 보고된 핵산 단편과의 DNA 서열 동일성이 80％ 이상인 핵산 단편이다. 더욱 바람직한 핵산 단편은 본원에서 보고된 핵산 단편과의 DNA 서열 동일성이 90％ 이상인 핵산 단편이다. 가장 바람직한 것은 본원에서 보고된 핵산 단편과의 DNA 서열 동일성이 95％ 이상인 핵산 단편이다.
핵산 단편의 단일 가닥 형태가 온도 및 용액의 이온 세기가 적당한 조건하에 cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA 등의 다른 핵산 단편과 어닐링될 수 있는 경우, 그 핵산 단편은 상기 다른 핵산 단편과 "혼성화가능"하다. 혼성화 및 세척 조건은 공지되어 있으며, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)], 특히 상기 문헌의 제11장 및 표 11.1 (그 전체가 본원에서 참고로 도입됨)에 예시되어 있다. 온도 및 이온 세기의 조건이 혼성화의 "엄격도"를 결정한다. 상동성 핵산에 관한 예비 스크리닝을 위해서는 Tm이 55℃인 저엄격도 혼성화 조건, 예를 들면, 5 ×SSC, 0.1％ SDS, 0.25％ 밀크가 있고, 포름아미드는 없는 조건; 또는 30％ 포름아미드, 5 ×SSC, 0.5％ SDS가 있는 조건을 사용할 수 있다. 중간정도의 엄격도 혼성화 조건은 더욱 고온의 Tm에 해당하며, 예를 들면, 40％ 포름아미드, 5 × 또는 6 ×SSC가 있는 조건이다. 혼성화에는 2가지 핵산이 상보적 서열을 함유할 것이 요구되지만, 혼성화의 엄격도에 따 라 염기 사이의 미스매치 (mismatch)가 가능하다. 핵산 혼성화에 적당한 엄격도는 당업계에 공지된 변수인 핵산의 길이 및 상보성 정도에 따라 달라진다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록 그 서열을 갖는 핵산의 하이브리드에 대한 Tm 값도 높아진다. 핵산 혼성화의 상대적인 안정성 (고온의 Tm에 해당)은 다음 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오티드가 넘는 하이브리드에서, Tm 계산을 위한 식은 문헌 ([Sambrook et al., 상기 문헌, 9.50-9.51] 참조)에서 유도될 수 있다. 더 짧은 핵산, 즉, 올리고뉴클레오티드를 사용한 혼성화를 위해서는, 미스매치의 위치가 더욱 중요해지며, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 그의 특이성을 결정한다 ([Sambrook et al., 상기 문헌, 11.7-11.8] 참조). 한 실시양태에서, 혼성화가능한 핵산의 길이는 약 10 뉴클레오티드 이상이다. 혼성화가능한 핵산의 바람직한 최소 길이는 약 15 뉴클레오티드 이상이고, 더욱 바람직하게는 약 20 뉴클레오티드 이상이며, 가장 바람직하게는 길이가 30 뉴클레오티드 이상이다. 또한, 당업자라면, 온도 및 세척 용액의 염 농도를 프로브의 길이 등과 같은 인자에 따라 필요에 맞게 조정할 수 있다는 것을 알 것이다.
"상당 부분"이란, 당업자가 그 서열을 수동으로 평가하거나, BLAST ([Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1993)], 또한 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 참조) 등과 같은 알고리즘을 사용하는 자동화된 컴퓨터 서열 비교 및 확인법으로 그 폴리펩티드 또는 그 유전자에 관해 추정하여 알아내기에 충분한, 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오 티드 서열을 포함하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 일컫는다. 통상적으로, 어떤 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 공지된 단백질 또는 유전자에 대한 상동체로서 추정하여 확인하기 위해서는 10개 이상의 연속 아미노산 서열 또는 30개 이상의 뉴클레오티드 서열이 필요하다. 또한, 뉴클레오티드 서열에 대해, 20-30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 서열-의존적인 유전자 확인법 (예를 들면, 서던 혼성화) 및 단리법 (예를 들면, 박테리아 콜로니 또는 박테리오파지 플라크의 계내 혼성화)에 사용할 수 있다. 또한, 12-15개 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드를 PCR에서 증폭 프라이머로 사용하여 그 프라이머를 포함하는 특정 핵산 분자를 수득할 수 있다. 그러므로, 뉴클레오티드 서열의 "상당 부분"은 그 서열을 포함하는 핵산 분자의 구체적인 확인 및(또는) 단리에 충분한 서열을 포함한다. 본 명세서는 부분적 또는 완전한 아미노산 및 1종 이상의 특정 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 교시한다. 당업자는 본원에서 보고된 바와 같은 상기 서열의 이점을 이용하여 개시된 서열 전체 또는 그의 상당 부분을 당업자에게 공지된 목적을 위해 사용할 수 있게 된다. 그러므로, 본 발명은 첨부한 서열목록에 보고된 바와 같은 완전한 서열 뿐 아니라 상기 정의된 바와 같이 그 서열의 상당 부분을 포함한다.
용어 "상보적인"이란, 서로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 염기들 사이의 관계를 나타낸다. 예를 들면, DNA의 경우, 아데노신은 티민에 상보적이고, 시토신은 구아닌에 상보적이다. 그러므로, 본 발명은 또한 첨부한 서열목록에 보고된 바와 같은 완전한 서열 뿐 아니라 그의 실질적으로 유사한 핵산 서열에 상보적인, 단 리된 핵산 분자도 포함한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "동일성(％)"이란, 2종 이상의 폴리펩티드 서열들 또는 2종 이상의 폴리뉴클레오티드 서열들을 비교하여 결정되는, 상기 서열들 사이의 관계이다. 당업계에서, "동일성"은 또한 폴리펩티드 서열들 또는 폴리뉴클레오티드 서열들의 스트링 (string) 사이의 매치로 결정되는, 상기 서열들 사이의 서열 관련성 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있으며, 이 방법으로는 문헌 [Computational Molecular Biology; Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press:New York, 1988], [Biocomputing:Informatics and Genome Projects; Smith, D. W., Ed.; Academic Press:New York, 1993], [Computer Analysis of Sequence Data, Part 1; Griffin, A. M. and Griffin, H. G., Eds., Humana Press:New Jersey, 1994], [Sequence Analysis in Molecular Biology; von Heinje, G., Ed., Academic Press:New York, 1987], 및 [Sequence Analysis Primer; Gribskov, M. and Devereux, J., Eds., Stockton Press:New York, 1991]에 기재된 방법 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 동일성을 측정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열들 사이의 가장 큰 매치가 제공되도록 고안되어 있다.
동일성 및 유사성을 측정하는 방법은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램에 문서화되어 있다. 2개의 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법으로는 표준 디폴트 값을 갭 생성 패널티 = 12 및 갭 연장 패널티 = 4로 사용한 니들맨 (Needleman) 및 운쉬 (Wunsch) 알고리즘을 이용하는 GCG 프로그램 패키지에 기재된 GCG 파일업 프로그램 ([Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12:387-395 (1984)], BLASTP, BLASTN, 및 FASTA [Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988)] 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 공급처에서 공개적으로 입수가능하다 ([BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl. Library Med. (NCBI NLM) NIH, Bethesda, Md. 20894], [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)], [Altschul et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]). 동일성(％)를 측정하는 다른 바람직한 방법은 조턴-하인 (Jotun-Hein) 알고리즘 [Hein et al., Methods Enzymol. 183:626-645 (1990)]을 사용하는 DNASTAR 단백질 정렬 프로토콜 방법에 의한 것이다. 정렬을 위한 조턴-하인 방법의 디폴트 파라미터는 다음과 같다: 다중 정렬의 경우, 갭 패널티 = 11, 갭 길이 패널티 = 3; 쌍별 정렬의 경우, ktuple = 6. 설명하자면, 참조 뉴클레오티드 서열에 예를 들면, 95％ 이상의 "동일성"이 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 경우, 그 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드 마다 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하면, 그 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 동일함을 의미한다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열과의 서열 동일성이 95％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 그 참조 서열의 뉴클레오티드 중 5％ 이하를 결실시키거나 다른 뉴클레오티드로 치환시킬 수 있고, 또는 그 참조 서열 내의 전 체 뉴클레오티드 중 5％ 이하의 많은 뉴클레오티드를 그 참조 서열로 삽입시킬 수 있다. 이러한 참조 서열 돌연변이는 그 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단 위치에서 일어나거나, 두 말단 위치 사이의 어느 지점에서나 일어나서 참조 서열 내 뉴클레오티드 사이에서 개별적으로 또는 참조 서열 중의 하나 이상의 연속 군으로 산재될 수 있다. 유사하게, 참조 아미노산 서열에 예를 들면, 95％ 이상의 "동일성"이 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 경우, 그 폴리펩티드의 아미노산 서열이 참조 아미노산의 각 100개의 아미노산 마다 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 점을 제외하면, 그 폴리펩티드의 아미노산 서열은 참조 서열과 동일함을 의미한다. 즉, 참조 아미노산 서열과의 서열 동일성이 95％ 이상인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻기 위해서는, 그 참조 서열의 아미노산 잔기 중 5％ 이하를 결실시키거나 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있고, 또는 그 참조 서열 내의 전체 아미노산 잔기 중 5％ 이하의 많은 아미노산을 그 참조 서열로 삽입시킬 수 있다. 이러한 참조 서열의 변경은 그 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 일어나거나, 두 말단 위치 사이의 어느 지점에서나 일어나서 참조 서열 내 잔기 사이에서 개별적으로 또는 참조 서열 중의 하나 이상의 연속 군으로 산재될 수 있다.
용어 "상동성"이란, 주어진 숙주 세포에서 자연적으로 발생되거나 천연인 단백질 또는 폴리펩티드를 일컫는다. 본 발명은 재조합 DNA 기술을 통해 상동성 단백질을 생산하는 미생물을 포함한다.
용어 "상동성(％)"이란, 폴리펩티드들 사이의 아미노산 서열 동일성 정도를 일컫는다. 제1 아미노산 서열이 제2 아미노산 서열과 동일한 경우, 제1 및 제2 아미노산 서열은 100％ 상동성을 나타낸다. 임의의 2개 폴리펩티드 사이의 상동성은 둘 중 어느 서열의 주어진 위치에서 매치되는 아미노산들 전체 개수에 직접 비례하는데, 예를 들어, 2개의 서열 중 어느 하나에서의 아미노산 전체 개수 중 절반이 동일하다면, 이 2개의 서열은 50％ 상동성을 나타낸다고 말한다.
"코돈 동의성 (degeneracy)"이란, 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에의 영향없이, 그 뉴클레오티드 서열의 변이를 가능케하는 유전 코드의 다양성을 일컫는다. 그러므로, 본 발명은 서열 57에 기재된 아미노산 서열 전체 또는 그의 상당 부분을 코딩하는 임의의 핵산 분자에 관한 것이다. 당업자라면, 주어진 아미노산을 구체화하기 위해 뉴클레오티드 코돈을 사용할 때, 특정 숙주 세포가 나타내는 "코돈 성향 (codon-bias)"을 알 것이다. 그러므로, 숙주 세포에서의 발현이 개선되도록 유전자를 합성하는 경우, 코돈 사용의 빈도가 그 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 적합하도록 유전자를 고안하는 것이 바람직하다.
생성되는 단백질 분자의 기능적 특성에는 실질적으로 영향을 미치지 않는 침묵 (silent) 변화를 유발하는 서열 변형, 예를 들면, 서열에서의 결실, 삽입, 또는 치환 역시 고려된다. 예를 들면, 유전 코드의 동의성을 반영하거나, 주어진 부위에서 화학적으로 동등한 아미노산을 생산케하는 유전자 서열의 변경이 고려된다. 그러므로, 소수성 아미노산인 알라닌 코돈을 다른 덜 소수성 잔기 (예를 들면, 글리신)를 코딩하는 코돈, 또는 더욱 소수성인 잔기 (예를 들면, 발린, 루이신, 또는 이소루이신)를 코딩하는 코돈으로 치환시킬 수 있다. 유사하게, 음으로 대전된 한 잔기를 다른 음으로 대전된 잔기로 치환 (예를 들면, 아스파르트산을 글루탐산으로 치환)하는 변화, 또는 양으로 대전된 한 잔기를 다른 양으로 대전된 잔기로 치환 (예를 들면, 라이신을 아르기닌으로 치환)하는 변화 또한 생물학적으로 동등한 생산물을 생산할 것이라 기대된다. 단백질 분자의 N-말단 및 C-말단 일부를 변경시키는 뉴클레오티드 변화 또한 그 단백질의 활성을 변경시키지 않을 것이라고 예측된다. 사실, 몇몇 경우에서는 그 서열의 돌연변이체를 만들어 그 단백질의 생물학적 활성 변경에 대한 효과를 연구하는 것이 바람직할 수 있다. 제안된 변형 각각은 코딩된 생산물의 생물학적 활성 보유 여부를 결정하는 것과 같이, 당업계의 통상적인 기술 내이다. 또한, 당업자라면, 본 발명에 포함되는 서열 역시 본원에서 예시된 서열과 엄격한 조건 (0.1 ×SSC, 0.1％ SDS, 65℃)하에 혼성화하는 능력에 의해 정의된다는 점을 알 것이다.
용어 "발현"이란, 유전자 생산물의 서열을 코딩하는 유전자로부터 그 유전자 생산물로의 전사 및 번역을 일컫는다.
용어 "플라스미드", "벡터", 및 "카세트"란, 종종 세포의 중심 대사의 일부가 아니며, 보통 원형 이중 가닥 DNA 분자 형태로 있는 유전자를 함유하는 여분의 염색체 요소를 일컫는다. 상기 요소들은 임의의 공급원에서 유도된 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 선형 또는 원형인, 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 그 안의 많은 뉴클레오티드 서열은 선택된 유전자 생산물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 적당한 3' 비번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구조로 연결되거나 재조합된 것이다. "형 질전환 카세트"란, 외래 유전자를 함유하고, 그 외래 유전자 뿐 아니라 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소들도 포함하는 특정 벡터를 일컫는다. "발현 카세트"란, 외래 유전자를 함유하고, 그 외래 유전자 뿐 아니라 외래 숙주에서 그 유전자의 발현을 향상케하는 요소들도 포함하는 특정 벡터를 일컫는다.
재조합 유기체의 제작
탄소 기질을 1,3-프로판디올로 전환시키는 효소 경로를 코딩하는 필요 유전자를 함유하는 재조합 유기체를 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제작할 수 있다. 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (GPD1), 글리세롤-3-포스파타제 (GPP2), 글리세롤 데히드라타제 (dhaB1, dhaB2, 및 dhaB3), 데히드라타제 재활성화 인자 (orfZ 및 orfX) 및 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (dhaT)를 코딩하는 유전자를 클렙시엘라 또는 사카로마이세스 등의 천연 숙주로부터 단리하였고, 이를 사용하여 대장균 DH5α, ECL707, AA200, 또는 KLP23 등과 같은 숙주 균주를 형질전환시켰다.
유전자의 단리
박테리아 게놈으로부터 원하는 유전자를 얻는 방법은 통상적이며, 분자생물학 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 유전자 서열이 공지되어 있는 경우, 제한 엔도뉴클레아제 절단법을 사용하여 적합한 게놈 라이브러리를 제작할 수 있고, 원하는 유전자 서열에 상보적인 프로브를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 일단, 서열이 단리되면, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) [미국 특허 제4,683,202호] 등과 같이 표준 프라이머로 지시된 증폭 방법을 사용하여 그 DNA를 증폭시켜 적당한 벡터를 사용하는 형질전환에 적합한 양의 DNA를 얻을 수 있다.
별법으로, 코스미드 라이브러리를 제작하고, 여기서 게놈 DNA의 커다란 절편 (35-45 kb)을 벡터 내로 패키징해넣고, 이를 사용하여 적당한 숙주를 형질전환시킬 수 있다. 코스미드 벡터는 다량의 DNA를 수용할 수 있는 유일한 벡터이다. 통상적으로, 코스미드 벡터는 외래 DNA의 패키징 및 그 후의 환형화에 필요한 cos DNA 서열을 1개 카피 이상 함유한다. cos 서열 뿐 아니라, 상기 벡터는 ColE1 등과 같은 복제 기점, 및 암피실린 또는 네오마이신 내성 유전자 등과 같은 약물 내성 마커도 함유할 것이다. 적합한 박테리아 숙주를 형질전환시키기 위해 코스미드 벡터를 사용하는 방법은 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고로 도입된다.
전형적으로, 코스미드를 클로닝하기 위해서는 외래 DNA를 단리하고, 적당한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 코스미드 벡터의 cos 영역에 인접하도록 라이게이션시킨다. 그 다음, 선형화된 외래 DNA를 함유하는 코스미드 벡터를 박테리오파지 등의 DNA 패키징 운반체와 반응시킨다. 패키징 과정 동안, 상기 cos 부위가 절단되어 상기 외래 DNA가 상기 박테리아의 바이러스성 입자의 헤드 (head) 부분으로 패키징된다. 그 다음, 이 입자를 사용하여 대장균 등의 적합한 숙주 세포를 형질감염시킨다. 일단, 세포 내로 주입되면, 상기 외래 DNA는 cos 점착성 말단 (sticky end)의 영향하에 환형화된다. 이러한 방식으로, 외래 DNA의 커다란 절편을 재조합 숙주 세포 내로 도입하고 그 안에서 발현시킬 수 있다.
글리세롤 데히드라타제 (dhaB1 dhaB2, 및 dhaB3), 데히드라타제 재활성화 인자 (orfZ 및 orfX), 및 1,3-프로판디올 데히드로게나제 (dhaT)를 코딩하는 유전자의 단리 및 클로닝
본 발명에 따라, 코스미드 벡터 및 코스미드 형질전환 방법을 이용하여 글리세롤을 1,3-프로판디올로 프로세싱할 수 있는 유전자를 함유하는 것으로 알려진 박테리아 속(屬)의 게놈 DNA의 커다란 절편을 클로닝했다. 구체적으로, 클렙시엘라 뉴모니아의 게놈 DNA를 당업계에 공지된 방법으로 단리하고, 제한 효소 Sau3A를 써서 코스미드 벡터 Supercos 1으로 삽입하고, GigapackII 패키징 추출물을 사용하여 패키징했다. 벡터 대장균 XL1-Blue MR 세포를 제작한 후, 코스미드 DNA로 형질전환시켰다. 세포를 글리세롤의 존재하에 증식시키고, 배지를 1,3-프로판디올 형성에 대해 분석함으로써, 형질전환체를 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환시키는 능력에 대해 스크리닝했다.
1,3-프로판디올 양성 형질전환체 2개를 분석하고, 그 코스미드를 pKP1 및 pKP2라 명명했다. DNA 서열결정으로 시트로박터 프로인디이의 글리세롤 데히드라타제 유전자에 광범위한 상동성이 있음을 밝혀냈고, 이는 이 형질전환체가 글리세롤 데히드라타제 유전자를 코딩하는 DNA를 함유한다는 것을 입증했다. 다른 1,3-프로판디올 양성 형질전환체를 분석하고, 그 코스미드를 pKP4 및 pKP5라 명명했다. DNA 서열결정으로 이 코스미드가 디올 데히드라타제 유전자를 코딩하는 DNA를 함유한다는 것을 밝혀냈다.
본 발명에서는 클렙시엘라 코스미드에서 단리한 유전자를 이용했지만, 데히드라타제 유전자 및 데히드라타제 재활성화 인자 유전자의 다른 공급처로는 시트로 박터, 클로스트리듐 및 살모넬라 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다 (표 1 참조).
G3PDH 및 G3P 포스파타제를 코딩하는 유전자
본 발명은 숙주 세포에서 G3PDH 및 G3P 포스파타제 활성 발현에 적합한 유전자를 제공한다.
G3PDH를 코딩하는 유전자는 공지되어 있다. 예를 들어, GPD1를 사카로마이세스에서 단리하였고 서열 54의 아미노산 서열을 코딩하는 그의 염기 서열을 서열 53에 기재했다 [Wang et al., 상기 문헌]. 유사하게, GPD2에 의해 코딩되는 G3PDH 활성 역시 사카로마이세스에서 단리했다 [Eriksson et al., Mol. Microbiol. 17, 95 (1995)].
본 발명의 목적상, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)의 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로의 전환을 촉매할 수 있는 NADH-의존성 G3PDH 활성을 담당하는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 유전자가 적합한 것으로 고려된다. 또한, 유전자 DAR1, GPD1, GPD2, GPD3, 및 gpsA에 상응하는 NADH-의존성 G3PDH의 아미노산 서열을 코딩하는 임의의 유전자는 본 발명에서 기능성일 것이며, 이 아미노산 서열은 효소의 기능을 변경시키지 않는 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있음이 고려된다. 당업자라면, 다른 공급처에서 단리한 G3PDH를 코딩하는 유전자 역시 본 발명에 사용하기 적합하다는 것을 알 것이다. G3P 포스파타제를 코딩하는 유전자가 공지되어 있다. 예를 들면, GPP2를 사카로마이세스 세레비지애에서 단리하였고, 서열 56에 주어진 아미노산 서열을 코딩하는 그의 염기 서열을 서열 55에 기재하였다 [Norbeck et al., J. Biol. Chem. 271, 13875 (1996)].
본 발명의 목적상, 글리세롤-3-포스페이트 + H20의 글리세롤 + 무기 포스페이트로의 전환을 촉매할 수 있는, G3P 포스파타제 활성을 코딩하는 임의의 유전자가 상기 방법에 사용하기 적합한 것으로 고려된다. 또한, 유전자 GPP2 및 GPP1에 상응하는 G3P 포스파타제의 아미노산 서열을 코딩하는 임의의 유전자는 본 발명에서 기능성일 것이며, 이 아미노산 서열은 G3P 포스파타제 효소의 기능을 변경시키지 않는 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있음이 고려된다. 당업자라면, 다른 공급처에서 단리한 G3P 포스파타제를 코딩하는 유전자 역시 본 발명에 사용하기 적합하다는 것을 알 것이다.
숙주 세포
1,3-프로판디올의 재조합 생산에 적합한 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있고, 이들의 1,3-프로판디올 경로를 위한 활성 효소 발현 능력에 의해서만 제한될 것이다. 적합한 숙주 세포는 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클렙시엘라, 에어로박터, 락토바실러스, 아스페르길러스, 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스, 지고사카로마이세스, 피치아, 클루이베로마이세스, 칸디다, 한세눌라, 데바리오마이세스, 무코르, 토룰로프시스, 메틸로박터, 에쉐리히아, 살모넬라, 바실러스, 스트렙토마이세스, 및 슈도모나스 등의 박테리아이다. 본 발명에 바람직한 숙주 세포는 대장균, 에쉐리히아 블라태 (Escherichia blattae), 클렙시엘라, 시트로박터, 및 에어로박터이다.
하기의 통상적 프로토콜을 사용하면, 미생물을 높은 역가의 1,3-프로판디올 생산자로 전환할 수 있다.
1. 가능한 숙주 유기체에서, 1,3-프로판디올 1-2 M의 존재하에 3-HPA의 독성 또는 억제성 수준을 정상 상태 (steady state)의 수준이 되게 하는 내인성 dhaT-유사 활성의 존재 여부를 결정한다;
2. 상기 가능한 숙주 유기체에 상기 활성이 있는 경우, 적합한 돌연변이유발법을 수행하여 이 활성을 결실시키거나 불활성화시킨다. dhaT-유사 활성이 비기능적이 되었거나 결실되었다는 것은 1,3-프로판디올 1-2 M의 존재하에 3-HPA 축적이 없음을 검출하여 입증할 수 있다;
3. a) 글리세롤이 탄소 공급원이 아닌 경우, 글리세롤 생산에 관한 적당한 유전자, b) 글리세롤 데히드라타제 및 그와 관련된 유지 시스템에 관한 적당한 유전자, 및 c) yqhD를 발현시킨다.
특정 미생물에 있어서, 1,3-프로판디올 생산을 위한 조건하에 내인성 dhaT-유사 효소를 발현하는지 또는 억제하는지에 관해 고려할 필요가 있다. 또한, 이는 글리세롤, 글루코스의 존재, 또는 혐기성 조건을 포함할 수도 있다.
벡터 및 발현 카세트
본 발명은 G3PDH, G3P 포스파타제, 데히드라타제, 및 데히드라타제 재활성화 인자의 적합한 숙주 세포 내로의 클로닝, 형질전환 및 발현에 적합한 각종 벡터 및 형질전환체 및 발현 카세트를 제공한다. 적합한 벡터는 이용된 미생물과 상용가능한 벡터일 것이다. 적합한 벡터는 박테리아, 바이러스 (예를 들면, 박테리오파지 T7 또는 M-13에서 유래한 파지), 코스미드, 효모 또는 식물 등으로부터 유래한 것 일 수 있다. 상기 벡터를 얻고 사용하는 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있다 [Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual-volumes 1, 2, 3, Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor, NY, 1989].
전형적으로, 상기 벡터 또는 카세트는 적당한 유전자의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선택가능한 마커, 및 자율 복제 또는 염색체 통합을 가능케하는 서열을 함유한다. 적합한 벡터는 전사 개시 제어 영역을 보유하는, 유전자의 5' 영역 및 전사 종결을 제어하는, DNA 단편의 3' 영역을 포함한다. 상기 2가지 제어 영역이 모두 형질전환된 숙주 세포에 상동성인 유전자에서 유래한 경우가 가장 바람직하다. 상기 제어 영역은 생산 숙주로 선택된 특정 종에 천연인 유전자에서 유래한 것일 필요는 없다.
원하는 숙주 세포에서 G3PDH 및 G3P 포스파타제 유전자 (각각, DAR1 및 GPP2)의 발현 추진에 유용한 개시 제어 영역, 또는 프로모터는 수없이 많고 당업자에게 공지되어 있다. 사실상, 이러한 유전자를 추진할 수 있는 임의의 프로모터가 본 발명에 적합하며, 이에는 CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, 및 TPI (사카로마이세스에서의 발현에 유용함); AOX1 (피치아에서의 발현에 유용함); 및 lac, trp, APL, XPR, T7, tac, 및 trc (대장균에서의 발현에 유용함) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 종결 제어 영역은 상기 바람직한 숙주에 천연인 각종 유전자로부터 유래할 수도 있다. 경우에 따라, 종결 부위가 불필요할 수 있으나, 종결 부위가 포함된 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 효소의 효과적인 발현을 위해서, 그 효소를 코딩하는 DNA를 선택된 발현 제어 영역에 개시 코돈을 통해 작동가능하게 연결시켜, 적당한 mRNA의 형태로 발현시킨다.
본 발명에 특히 유용한 것은 pAH48와 접합시켜 사용하도록 고안된 벡터 pDT29 및 pKP32이다. pDT29 및 pKP32의 필수 요소는 클렙시엘라 뉴모니아에서 단리한 dha 레귤론에서 유래한다. pDT29는 오픈리딩프레임인 dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, 및 dhaB3를 함유하며, 이의 뉴클레오티드 서열을 서열 1에 기재했다. pKP32는 dhaT가 없다는 점만 제외하면, 동일한 공급원으로부터의 pDT29의 경우에 확인된 것과 동일한 세트의 오픈리딩프레임을 함유한다. pAH48은 DARI 및 GPP2 유전자를 숙주 세포 내로 도입시킬 때 사용되는 운반체이며, 더욱 구체적으로 사카로마이세스 세레비지애에서 단리한 DAR1 및 GPP2 유전자를 포함한다.
1,3-프로판디올 생산을 위한 적합한 숙주의 형질전환 및 유전자 발현
일단, 적합한 카세트가 제작되면, 이를 사용하여 적당한 숙주 세포를 형질전환시킨다. G3PDH, G3P 포스파타제, 데히드라타제, 및 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 카세트의 숙주 세포로의 도입은 형질전환법 (예를 들면, 칼슘을 사용하여 투과가능해진 세포를 이용하는 전기천공법), 또는 재조합 파지 바이러스를 이용한 형질감염법 [Sambrook et al., 상기 문헌] 등의 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명에서는, 하기 <통상의 방법> 및 <실시예> 란에 자세히 기재되어 있는 바와 같이, 카세트를 사용하여 대장균을 형질전환시켰다.
돌연변이체
본 발명에서는, 상기 예시한 세포 뿐 아니라, 1,3-프로판디올의 생산을 향상시키도록 특별하게 고안된, 하나 또는 다수의 돌연변이를 갖는 세포를 사용할 수 있음이 고려된다. 통상적으로 탄소 공급원료를 비생산적 경로로 우회시키거나, 상당한 이화대사물질 억제 활성을 나타내는 세포를 돌연변이시켜 이러한 표현형의 결함을 막을 수 있다. 예를 들면, 많은 야생형 세포는 배지 내의 글루코스 및 부산물로부터의 이화물질 억제를 받으며, 글루코스 억제에 내성이 있어 1,3-프로판디올을 생산할 수 있는, 이러한 야생형 유기체의 돌연변이체 균주가 본 발명에 특히 유용할 것이라 고려된다.
돌연변이체 제작 방법은 통상적이고, 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 야생형 세포를 방사선 또는 화학적 돌연변이유발제 등의 각종 작용제에 노출시킨 다음, 원하는 표현형을 스크리닝할 수 있다. 방사선을 통해 돌연변이를 일으키는 경우에는 자외선 (UV) 또는 이온화 방사선을 사용할 수 있다. 유전적 돌연변이에 적합한 단파 UV 파장은 200 nm 내지 300 nm의 범위 내이고, 바람직하게는 254 nm이다. 이러한 파장의 UV 방사선은 주로 핵산 서열 내 구아니딘 및 시토신을 아데닌 및 티미딘으로 변화시킨다. 모든 세포에는 UV로 유도된 돌연변이 대개를 복구해내는 DNA 복구 메카니즘이 있기 때문에, 카페인과 같은 작용제 및 기타의 억제제를 첨가하여 복구 과정을 방해하고 유효한 돌연변이 개수를 최대화할 수 있다. 또한, 300 nm 내지 400 nm 범위의 빛을 사용한 장파 UV에 의한 돌연변이도 가능하지만, 통상적으로, DNA와 상호작용하는 소랄렌 (psoralen) 염료 등과 같은 각종 활성제와 함께 사용하지 않는다면, 단파 UV 빛을 사용한 경우 만큼 효과적이지 않다.
또한, 화학적 작용제를 사용한 돌연변이유발법도 돌연변이체 생성에 효과적이고, 통상적으로 사용되는 물질로는 HNO2 및 NH2OH와 같이 복제되고 있지 않은 DNA에 영향을 미치는 화학물질, 및 아크리딘 염료 등과 같이 복제되고 있는 DNA에 영향을 미쳐 프레임시프트 (frameshift) 돌연변이 유발에 뛰어난 작용제 등이 있다. 방사선 또는 화학적 작용제를 사용한 돌연변이체 제작의 구체적인 방법이 당업계에 문서화되어 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌 ([Thomas D. Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.] 또는 [Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227 (1992)])을 참조한다.
돌연변이유발시킨 다음, 원하는 표현형을 갖는 돌연변이체를 각종 방법으로 선택할 수 있다. 돌연변이화된 세포를 원하는 생산물 또는 중간체 생산력에 대해 선택하는 랜덤 스크리닝법이 가장 통상적인 방법이다. 별법으로, 돌연변이체의 선택적 단리는 내성 콜로니만이 증식할 수 있는 선택 배지 상에서 돌연변이화된 집단을 증식시켜 수행할 수 있다. 돌연변이체 선택 방법은 고도로 개발되어 산업 미생물학 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Brock, 상기 문헌], [DeMancilha et al., Food Chem. 14, 313 (1984)]을 참조한다.
또한, 원치않는 효소 활성의 제거 역시 그 효소를 코딩하는 유전자를 파괴시키면 달성될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 실시예 4 및 실시예 8에서 예시했다.
1,3-프로판디올 생산 경로의 변경
대표적인 효소 경로: 글루코스로부터의 1,3-프로판디올 생산은 하기의 일련의 단계에 의해 달성될 수 있다. 이러한 일련의 단계들은 당업자에게 공지된 수많은 경로 중 대표적인 것이고, 도 5에서 설명된다. 글루코스가 해당 경로의 효소들에 의한 일련의 단계들을 거쳐 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP) 및 3-포스포글리세르알데히드 (3-PG)로 전환된다. 그 다음, DHAP가 디히드록시아세톤 (DHA)으로 가수분해된 후에 환원되거나, DHAP가 글리세롤 3-포스페이트 (G3P)로 환원된 후에 가수분해되어 글리세롤이 형성된다. 가수분해 단계는 기질에 대해 비특이적이라고 공지된, 임의의 개수의 세포내 포스파타제에 의해 촉매되거나, 재조합에 의해 숙주 내로 도입된 포스파타제 활성에 의해 촉매될 수 있다. 환원 단계는 NAD+ (또는 NADP+)-결합 숙주 효소 또는 재조합에 의해 숙주로 도입될 수 있는 활성에 의해 촉매될 수 있다. dha 레귤론이 하기 반응식 3의 가역 반응을 촉매하는 글리세롤 데히드로게나제 (E.C.1.1.1.6)를 함유할 수 있다는 것을 주목할 수 있다.
<반응식 1>
글리세롤 →3-HPA + H20
<반응식 2>
3-HPA + NADH + H+ → 1,3-프로판디올 + NAD+
<반응식 3>
글리세롤 + NAD+ →DHA + NADH + H+
상기에서 상세히 기재한 바와 같이, 글리세롤은 중간체인 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA)을 거쳐 1,3-프로판디올로 전환된다. 글리세롤로부터 생산되는 중간체 3-HPA (반응식 1)는 숙주에 의해 코딩되는 것이거나 재조합에 의해 숙주로 도입된 것일 수 있는 데히드라타제 효소에 의해 생산된다. 상기 데히드라타제는 글리세롤 데히드라타제 (E.C.4.2.1.30), 디올 데히드라타제 (E.C.4.2.1.28) 또는 이러한 변형을 촉매할 수 있는 임의의 다른 효소일 수 있다. 글리세롤 데히드라타제는 dha 레귤론에 의해 코딩되지만, 디올 데히드라타제는 그렇지 않다. 3-HPA로부터 생산되는 1,3-프로판디올 (반응식 2)은 NAD+ (또는 NADP+)-결합 숙주 효소 또는 재조합에 의해 숙주로 도입될 수 있는 활성에 의해 생산된다. 1,3-프로판디올을 생산하는 상기 최종 반응은 1,3-프로판디올 데히드로나제 (E.C.1.1.1.202) 또는 기타 알콜 데히드로게나제에 의해 촉매될 수 있다.
탄소 채널링에 영향을 미치는 돌연변이 및 형질전환
1,3-프로판디올 생산 경로에서의 변이를 포함하는 다양한 돌연변이 미생물이 본 발명에 유용할 것이다. 예를 들어, 트리오스포스페이트 이소머라제 돌연변이 (tpi-)를 본 발명의 미생물에 도입하는 것은 탄소 채널링에 의한 수행능을 개선하기 위해 돌연변이체를 사용하는 한 예이다. 트리오스포스페이트 이소머라제는 DAHP의 3-포스포글리세르알데히드로의 전환을 담당하는 효소이고, 글루코스로부터 글리세롤 및 1,3-프로판디올로의 주 경로 탄소 흐름을 우회시킬 수 있다 (도 5). 그러므로, 상기 결실 돌연변이 (tpi-)는 원하는 경로의 전반적인 대사 효율을 당업계에 기술된 것 보다 향상시킨다. 유사하게, 1,3-프로판디올 생산 경로의 중간체에 대한 다른 경로를 차단한 돌연변이 역시 본 발명에 유용하다. 예를 들어, 글리세롤 키나제를 제거하면, G3P 포스파타제의 작용에 의해 G3P로부터 형성된 글리세롤이 ATP를 소비하며 G3P로 재전환되는 것 (도 5)이 방지된다. 또한, 글리세롤 데히드로게나제 (예를 들면, gldA)를 제거하면, NADH-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제의 작용에 의해 DHAP로부터 형성된 글리세롤이 디히드록시아세톤으로 전환되는 것 (도 5)이 방지된다. 돌연변이는 구조 유전자에 대해 지시되어 효소 활성을 손상시키거나 개선시킬 수 있고, 또는 프로모터 영역 및 리보솜 결합 부위 등의 조절 유전자에 대해 지시되어 효소 활성의 발현 수준을 조정할 수 있다.
그러므로, 1,3-프로판디올 생산 향상을 위해 형질전환 및 돌연변이를 조합하여 특정 효소 활성을 제어할 수 있음이 고려된다. 따라서, 1,3-프로판디올의 생산이 증가되도록 하는 온전한 세포 촉매의 변형을 예상하는 것은 본 발명의 범위 내이다.
본 발명은 당 기질로부터 1,3-프로판디올을 생산하기 위한 바람직한 경로를 이용하는데, 여기서는 탄소 흐름이 글루코스에서 DHAP, G3P, 글리세롤, 3-HPA, 및 최종적으로는 1,3-프로판디올로 이동한다. 본 발명의 생산 균주를 조작하여 탄소의 비생산적 화합물로의 우회를 방지하는 각종 결실 돌연변이를 함입함으로써 상기 경로의 대사 활성을 최대화시킬 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 형질전환에 의 해 글리세롤은 3-HPA로 전환되지 않고 글리세롤 데히드로게나제 또는 글리세롤 키나제를 통해 DHA 또는 G3P로 우회될 수 있다 (도 5). 그러므로, 본 발명의 생산 균주는 gldA 및 glpK 유전자 내에 결실 돌연변이를 함유한다. 유사하게, DHAP는 트리오스포스페이트 이소머라제에 의해 3-PG로 우회될 수 있어서, 본 발명의 생산 미생물은 이 유전자 내에 결실 돌연변이도 함유한다. 또한, 본 발명의 방법에는 글리세롤을 3-HPA로 전환시키는 데히드라타제 효소도 함입되는데, 이 효소는 dha 레귤론의 orfX 및 orfZ에 의해 코딩되는 재활성화 인자와 함께 기능한다 (도 5). 3-HPA의 1,3-프로판디올로의 전환은 전형적으로 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제를 통해 수행되지만, 본 발명의 방법은 최종 생산물인 1,3-프로판디올 생산에 대한 역가 및 수율이 더 높은 비특이적 촉매 활성을 이용한다 (도 5). 이 방법에서, 1,3-프로판디올에 대한 역가는 10 g/L 이상으로 달성되며, 200 g/L의 역가가 예측된다.
별법으로, 1,3-프로판디올 생산을 위한 개선된 방법은 기질로서 글리세롤 또는 디히드록시아세톤을 이용하여 그 경로가 오직 마지막 3가지 기질만을 포함하는 글리세롤 →3-HPA →1,3-프로판디올일 수 있다. 이 방법에서, 비특이적 촉매 활성 (알콜 데히드로게나제인 것으로 예측됨)을 위해 옥시도리덕타제가 다시 제거되지만, 배양물에 글리세롤을 첨가하면 결실 돌연변이가 필요없다. 이 방법에서, 1,3-프로판디올에 대한 역가는 71 g/L 이상으로 달성되며, 200 g/L의 역가가 예측된다.
유사하게, 본 발명의 범위에는 개선된 1,3-프로판디올 생산자 제작을 위해 dhaT 활성을 결실 또는 돌연변이시켜 변형된, 야생형 미생물의 돌연변이체를 제공하는 것이 포함된다. 예를 들어, 천연적으로 dha 레귤론의 모든 요소들을 함유하 는 미생물을 조작하여 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 코딩하는 dhaT 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 상기 미생물들은 내인성 촉매 활성 (알콜 데히드로게나제에 의한 것이라 예측됨)에 의해 매개되는 1,3-프로판디올 생산에 대한 수율 및 역가가 더 높을 것으로 예측될 것이다. 상기 미생물의 예로는 클렙시엘라 종, 시트로박터 종, 및 클로스트리듐 종 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
배지 및 탄소 기질
본 발명에서 발효 배지는 적합한 탄소 기질을 함유해야 한다. 적합한 기질에는 글루코스 및 프럭토스 등의 단당류, 락토스 또는 수크로스 등의 올리고당류, 전분 또는 셀룰로스 등의 다당류 또는 이들의 혼합물, 및 치즈 유장 투과물, 콘스팁 (cornsteep)액, 당 사탕무 당밀 및 맥아 (barley malt)와 같은 재생가능한 공급원료로부터의 미정제 혼합물 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 탄소 기질은 이산화탄소, 또는 메탄올 등과 같이 핵심 생화학적 중간체로의 대사적 전환이 입증된 바 있는 1-탄소 기질일 수도 있다. 메틸영양요구성 효모 [K. Yamada et al., Agric. Biol. Chem. 53(2), 541-543 (1989)] 및 박테리아 [Hunter et. al., Biochemistry 24, 4148-4155 (1985)]에서, 1-탄소 공급원 (예를 들면, 메탄올, 포름알데히드 또는 포름산염)으로부터의 글리세롤 생산이 보고되었다. 상기 미생물들은 1-탄소 화합물을 산화 상태로 메탄에서 포름산염으로 동화시켜, 글리세롤을 생산할 수 있다. 탄소 동화 경로는 리불로스 모노포스페이트, 세린 또는 크실루로스-모노포스페이트를 경유할 수 있다 [Gottschalk, Bacterial Metabolism, Second Edition, Springer-Verlag:New York (1986)]. 리불로스 모노 포스페이트 경로는 포름산염과 리불로스-5-포스페이트를 축합하여 프럭토스가 되는 6탄당을 형성하고 사실상 3탄당 생산물인 글리세르알데히드-3-포스페이트를 형성하는 과정을 포함한다. 유사하게, 세린 경로는 1-탄소 화합물을 메틸렌테트라히드로폴레이트를 통해 해당 경로로 동화시킨다.
1탄당 및 2탄당 탄소 기질 뿐 아니라, 메틸영양요구성 미생물은 또한 대사 활성을 위해 메틸아민, 글루코스아민 및 각종 아미노산 등의 수많은 다른 탄소-함유 화합물을 이용하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 메틸영양요구성 효모는 메틸아민으로부터의 탄소를 이용하여 트레할로스 또는 글리세롤을 형성하는 것으로 알려져 있다 [Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd, [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32. Editor(s); Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher:Intercept, Andover, UK]. 유사하게, 각종 칸디다 종은 알라닌 또는 올레산을 대사할 것이다 [Sulter et al., Arch. Microbiol. 153 (5), 485-489 (1990)]. 그러므로, 본 발명에 이용되는 탄소 공급원은 광범위하게 다양한 탄소 함유 기질을 포괄할 수 있으며, 오직 선택한 미생물 또는 방법에 의해서만 제한될 것임이 고려된다.
상기 언급한 탄소 기질 및 그의 혼합물 (동시 공급물) 모두가 본 발명에 적합한 것으로 고려되지만, 바람직한 탄소 기질은 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 또는 메탄올 (이 과정으로는 내인성 글리세롤이 생산됨), 및 글리세롤 또는 디히드록시아세톤 (이 과정으로는 글리세롤 또는 디히드록시아세톤이 생산될 것이라 예상됨)이다.
발효 배지에는 적당한 탄소 공급원 뿐 아니라, 당업자에게 공지된, 1,3-프로판디올 생산에 필요한 효소 경로의 촉진과 배양물의 증식에 적합한 적당한 무기물, 염, 보조인자, 완충액 및 기타 성분들이 함유되어 있어야 한다. 특히 주목되는 것은 Co(II)염 및(또는) 비타민 B12 또는 그의 전구체이다.
아데노실-코발라민 (보조효소 B12)은 데히드라타제 활성에 필수적인 보조인자이다. 보조효소 B12의 합성은 원핵 생물에서 발견되는데, 예를 들어, 에쉐리히아 블라태, 클렙시엘라 종, 시트로박터 종, 및 클로스트리듐 종 등과 같은 일부의 원핵 생물은 상기 화합물을 데 노보 (de novo)로 합성할 수 있지만, 다른 일부는 부분적인 반응을 수행할 수 있다. 예를 들어, 대장균은 코린 고리 구조를 제작할 수는 없지만, 코빈아미드의 코리노이드로의 전환을 촉매할 수 있고, 5'-데옥시아데노실기를 도입할 수 있다. 그러므로, 대장균 발효시에 비타민 B12와 같은 보조효소 B12 전구체를 제공할 필요가 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다.
대장균 발효물에 비타민 B12를 첨가하는 것은 일정 속도로 연속적 첨가하거나, 생성되는 세포 질량에 따라 단계별로 첨가할 수 있으며, 또는 한번에 첨가하거나 여러번에 걸쳐 첨가할 수 있다. 세포 질량 (OD550)에 대한 비타민 B12 공급량 (mg)의 바람직한 비율은 0.06 내지 0.60이다. 세포 질량 (OD550)에 대한 비타민 B12 공급량 (mg)의 가장 바람직한 비율은 0.12 내지 0.48이다.
본 발명의 형질전환된 대장균에 비타민 B12를 첨가하더라도, B12를 데 노보 생합성할 수 있는 다른 미생물도 적합한 생산 세포이며, 이 미생물들에는 B12를 첨가할 필요가 없음이 고려된다.
배양 조건:
전형적으로, 세포는 35℃의 적당한 배지 중에서 증식시킨다. 본 발명의 바람직한 증식 배지는 루리아 베르타니 (Luria Bertani) (LB) 브로스, 사보우라우드 덱스트로스 (Sabouraud Dextrose) (SD) 브로스 또는 효모 배지 (YM) 브로스 등과 같은 통상적으로 시판되는 제조된 배지이다. 다른 규정된 또는 합성 증식 배지도 사용할 수 있으며, 특정 미생물의 증식에 적당한 배지는 미생물학 또는 발효 과학 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 이화대사물질 억제를 직접 또는 간접 조정하는 것으로 알려진 작용제, 예를 들면, 시클릭 아데노신 2':3'-모노포스페이트를 사용하여 반응 배지에 혼입시킬 수도 있다. 유사하게, 효소 활성을 조정하는 것으로 알려진 작용제 (예를 들면, 메틸 비올로겐)를 유전적 조작에 대한 대안물로써 또는 유전적 조작과 함께 사용하여 1,3-프로판디올 생산을 향상시킬 수 있다.
발효에 적합한 pH 범위는 pH 5.0 내지 pH 9.0 사이이며, 초기 조건으로 바람직한 범위는 pH 6.0 내지 pH 8.0이다.
호기성 또는 혐기성 조건하에 반응시킬 수 있으며, 혐기성 또는 미량호기성 (microaerobic) 조건인 것이 바람직하다.
페드-배치 (Fed-Batch) 발효는 탄소 공급물, 예를 들면, 글루코스를 제한된 양 또는 과량으로 사용하여 수행될 수 있다.
배치 및 연속 발효:
본 발명의 방법은 배치식 발효 방법을 사용한다. 고전적인 배치 발효법은 발효 시작 시에 설정해 둔 배지 조성을 발효 동안 인위적으로 변경시키지 않는 밀폐 시스템이다. 그러므로, 발효 시작시에, 배지에 원하는 미생물(들)을 접종하여 발효시키고, 이 시스템에 아무것도 첨가하지 않는다. 그러나, 전형적으로, "배치" 발효는 탄소 공급원의 첨가에 대한 배치이고, 종종 pH 및 산소 농도 등과 같은 인자를 조절해야 한다. 배치 시스템에서, 시스템 내의 대사물질 및 생물량 (biomass) 조성은 발효가 정지되는 시점까지 지속적으로 변화한다. 배치 배양물 내에서, 세포 증식은 정적 잠복기 (static lag phase)에서 고증식 대수기 (log phase)로 진행되고, 결국에는 증식 속도가 감소하거나 정지한 정지기 (stationary phase)가 된다. 미처리된 경우, 정지기의 세포는 사실상 죽을 것이다. 통상적으로, 대수기의 세포가 최종 생산물 또는 중간체의 대부분을 생산한다.
표준 배치 시스템의 변형이 페드-배치 시스템 (Fed-Batch system)이다. 페드-배치 발효 방법도 또한 본 발명에 적합하며, 발효가 진행됨에 따라 기질 첨가량을 증가시킨다는 것을 제외하면 전형적인 배치 시스템의 방식을 포함한다. 이화대사물질 억제가 세포의 대사를 억제하는 경향이 있고, 배지 내 기질의 양을 제한하는 것이 바람직한 경우, 페드-배치 시스템이 유용하다. 페드-배치 시스템 내 실제 기질 농도를 측정하는 것은 어려운 일이므로, 이는 pH, 용존 산소량 및 CO2와 같은 폐기 기체의 분압 등과 같이 측정가능한 인자의 변화를 기초로 추정한다. 배치 및 페드-배치 발효는 통상적이며 당업계에 공지되어 있고, 그 예를 문헌 [Brock, 상기 문헌]에서 찾을 수 있다.
본 발명을 배치식으로 수행하더라도, 이 방법을 연속 발효 방법으로 개조할 수 있을 것으로 고려된다. 연속 발효는 규정된 발효 배지를 생물반응로에 연속적으로 첨가하는 동시에, 프로세싱을 위해 동량의 조건 배지를 제거하는 개방 시스템이다. 통상적으로, 연속 발효는 배양물을 세포가 주로 대수기 증식 상태에 있는 일정한 고밀도로 유지한다.
연속 발효는 세포 증식 또는 최종 생산물 농도에 영향을 미치는 인자 1개 또는 임의의 개수를 조정할 수 있다. 예를 들어, 한 방법에서는 탄소 공급원과 같은 영양분 또는 질소 수준을 고정된 값으로 제한하면서, 기타 모든 파라미터를 조정할 수 있다. 다른 시스템에서는, 배지 혼탁도로 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지하면서 증식에 영향을 주는 많은 인자를 연속적으로 변경시킬 수 있다. 연속 시스템은 정상 상태 증식 조건을 유지하려 하기 때문에, 배지 회수에 기인한 세포 손실은 발효 시의 세포 증식 속도와 균형을 이루어야 한다. 연속 발효 방법을 위해 영양분 및 증식 인자를 조정하는 방법 및 생산물 형성 속도를 최대화하는 기술은 산업 미생물 분야에 공지되어 있고, 각종 방법이 문헌 [Brock, 상기 문헌]에 상세히 기술되어 있다.
본 발명은 배치, 페드-배치 또는 연속 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 임의의 공지된 발현 모드가 적합하다는 것이 고려된다. 또한, 세포는 1,3-프로판 디올 생산을 위한 발효 조건하에서 온전한 세포 촉매로서 기질 상에 고정될 수 있다는 것이 고려된다.
1,3-프로판디올의 확인 및 정제:
발효 배지로부터 1,3-프로판디올을 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 반응 혼합물을 유기 용매를 사용한 추출, 증류, 및 컬럼 크로마토그래피시켜, 세포 배지로부터 프로판디올을 얻을 수 있다 [미국 특허 제5,356,812호]. 이 방법에 특히 양호한 유기 용매는 시클로헥산이다 [미국 특허 제5,008,473호].
배지를 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분석하여 1,3-프로판디올을 직접 확인할 수 있다. 본 발명에 바람직한 방법은 0.01 N 황산을 이동상으로 사용하는 분석용 이온 교환 컬럼상에서 이소크래틱형 (isocratic fashion)으로 발효 배지를 분석하는 것이다.
실시예
통상의 방법
인산화, 라이게이션 및 형질전환 방법은 당업계에 공지되어 있다. 하기 실시예에 사용하기 적합한 기술은 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에서 찾을 수 있다.
박테리아 배양물의 유지 및 증식에 적합한 재료 및 방법은 당업계에 공지되어 있다. 하기 실시예에 사용하기 적합한 기술은 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1994)] 또는 [Thomas D. Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA]에서 찾을 수 있다. 별도의 언급이 없는 한, 박테리아 세포의 증식 및 유지에 사용된 모든 시약 및 재료는 알드리치 케미칼 (Aldrich Chemicals) (미국 위스콘신주 밀워키 소재), DIFCO 연구소 (DIFCO Laboratories) (미국 미시건주 디트로이트 소재), GIBCO/BRL (미국 메릴랜드주 가이테르스베르크 소재), 또는 시그마 케미칼 컴퍼니 (Sigma Chemical Company) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에서 구입했다.
약자의 의미는 다음과 같다: "시간 (h)"는 시간 (hour(s))을 의미하고, "분"은 분 (min)을 의미하며, "초"는 초 (sec)를 의미하고, "일"은 일 (日)을 의미하며, "mL"은 밀리리터 (㎖)를 의미하고, "L"는 리터 (ℓ)를 의미하며, 50 amp는 암피실린 50 ㎍/mL이고 LB-50 amp는 50 ㎍/mL의 암피실린을 함유하는 루리아 베르타니 브로스이다.
표에서의 하기 약어들은 다음을 의미하는 것으로 사용되었다: "Con."은 전환율이고, "Sel."은 탄소를 기준으로 한 선택성을, 그리고 "nd"는 검출되지 않았음을 의미한다.
하기 실시예에서 사용한 균주 및 벡터를 하기 챠트에 나열했다:
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효소 분석
데히드라타제 효소 분석:
기질로서 글리세롤 또는 1,2-프로판디올을 사용하여 무세포 (cell-free) 추출물 중의 데히드라타제 활성을 측정했다. 전형적으로, 무세포 추출물은 프렌치 프레스 (french press)를 사용하여 세포를 파괴한 후, 세포내 부스러기를 원심분리시켜 제조했다. 알데히드와 메틸벤조-2-티아졸론 히드라존의 반응을 기초로하는 이 분석법은 문헌 [Forage and Foster, Biochim. Biophys. Acta 569, 249 (1979)]에 기재되어 있다.
문헌 [Honda et al., J. Bacteriol. 143, 1458 (1980)]에는 데히드라타제의 재활성화율을 측정하는 분석법이 개시되어 있다. 기질로서 글리세롤 또는 1,2-프로판디올을 사용하고 ATP 존재 및 부재하에, 톨루엔화된 온전한 세포에서의 데히드라타제 활성을 측정했다. ATP를 첨가했을 때와 첨가하지 않았을 때의 생산물 형성 비율로써 재활성화율을 측정했다. 생산물 형성 (기질로서 글리세롤 또는 1,2-프로판디올이 사용되는 경우, 각각 3-HPA 또는 프로피온알데히드)은 HPLC를 사용하여 직접 측정하거나, 메틸벤조-2-티아졸론 히드라존 시약을 사용하여 간접 측정했다. 별법으로, NADH-결합 알콜 데히드로게나제를 사용하여 알데히드가 그의 상응하는 알콜로 전환하는 것을 커플링하고, NADH가 사라지는 것을 모니터링하여 생산물 형성을 측정했다.
1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 분석:
문헌 [Johnson and Lin, J. Bacteriol. 169, 2050 (1987)]에 기재되어 있는 바와 같이, 기질로서 1,3-프로판디올 및 NAD+를 사용하여, 용액 또는 슬랩 겔 중의 무세포 추출물에 대한 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (때때로 1,3-프로판디올 데히드로게나제로도 일컬어짐)의 활성을 측정했다. 별법으로, 3-HPA 및 NADH의 1,3-프로판디올 및 NAD+로의 전환을 NADH가 사라지는 것으로써 측정했다. 슬랩 겔 분석법은 크기 분리법에 의해 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (dhaT)의 활성을 비특이적 알콜 데히드로게나제 활성과 분리한다는 강력한 이점이 있다. 시트로박터 프로인디이, 클렙시엘라 뉴모니아, 및 클로스트리듐 파스테리아눔으로부터의 1,3-프로 판디올 옥시도리덕타제 (dhaT)의 천연 분자량은 통상적으로 330,000 내지 440,000 Da의 범위 내이다. 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 부크네리는 공지된 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 (dhaT)와 유사한 특징을 갖는 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제-관련 데히드라타제를 함유한다.
글리세롤 3-포스페이트 데히드로게나제 활성 분석:
문헌 [Bell et al., J. Biol. Chem. 250, 7153 (1975)]에 공개된 방법을 하기와 같이 변형시킨 방법을 사용했다. 이 방법은 0.2 mM NADH, 2.0 mM 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP), 및 0.1 M 트리스/HCl (pH 7.5) 완충액 및 5 mM DTT 중의 효소를 함유하는 큐빗 내 무세포 추출물 샘플 (총 부피 1.0 mL)을 30℃에서 인큐베이션하는 것을 포함했다. 먼저, 효소 및 NADH 반응의 백그라운드 (background) 속도를 340 nm에서 3분 이상 동안 측정했다. 그 다음, 제2 기질인 DHAP를 첨가하고, 시간에 따른 흡광도 변화를 3분 이상 동안 계속 모니터링했다. G3PDH 활성은 전체 속도에서 백그라운드 속도를 뺀 값으로 정의했다.
글리세롤-3-포스파타제 활성 분석:
추출물을 비스-트리스 또는 MES 및 마그네슘 완충액 (pH 6.5) 중의 유기 포스페이트 기질과 함께 인큐베이션시켜 효소 활성 분석을 수행했다. 사용된 기질은 1-α-글리세롤 포스페이트, 또는 d,1-α-글리세롤 포스페이트였다. 본 분석법에 사용된 시약의 최종 농도는 다음과 같았다: 완충액 (20 mM 비스-트리스 또는 50 mM MES), MgCl2 (10 mM), 및 기질 (20 mM). 샘플 내 총 단백질량이 적고, 산 급냉으로 인한 가시적인 침전물이 없는 경우, 이 샘플은 편리하게 큐빗 내에서 분석했다. 이 방법은 20 mM 기질 (50 ㎕, 200 mM), 50 mM MES, 10 mM MgCl2 (pH 6.5) 완충액을 함유하는 큐빗 내 효소 샘플을 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 최종 포스파타제 분석 부피는 0.5 mL이었다. 반응 혼합물에 효소-함유 샘플을 첨가했다; 큐빗 내 내용물을 혼합한 다음, 큐빗을 온도 = 37℃의 순환식 수조에 5 내지 120분 (이 시간은 효소 샘플 내 포스파타제 활성 (2 내지 0.02 U/mL 범위)에 따라 달라짐) 동안 넣어두었다. 산 몰리브데이트 시약 (0.4 mL)을 첨가하여 급냉시킴으로써 효소 반응을 중단했다. 피스케 서바로우 (Fiske SubbaRow) 시약 (0.1 mL) 및 증류수 (1.5 mL)를 첨가한 후에, 상기 용액을 혼합하고 전개시켰다. 10분 후에, 완전한 색 전개가 나타났고, Cary 219 UV/비스 분광광도계를 사용하여 660 nm에서 샘플의 흡광도를 측정했다. 스톡 무기 포스페이트 용액 (0.65 mM)을 사용하여 최종 무기 포스페이트 농도가 0.026 내지 0.130 μmol/mL 범위가 되도록 만든 6개의 표준물로 제작한 표준 곡선과 방출된 무기 포스페이트의 양을 비교했다.
글리세롤 키나제 활성 분석:
25℃에서, 효소, 전형적으로는 무세포 조 추출물 적당량을 40 mM ATP, 20 mM MgSO4, 21 mM 균질한 13C-표지 글리세롤 (99％, 캠브리지 동위원소 연구소 (Cambridge Isotope Laboratories) 제품), 및 0.1 M 트리스-HCl (pH 9)를 함유하는 반응 혼합물에 75분 동안 첨가했다. 글리세롤의 글리세롤 3-포스페이트로의 전환 을 13C-NMR (125 MHz)로 검출했다: 글리세롤 (63.11 ppm, δ, J= 41 Hz 및 72.66 ppm, t, J= 41 Hz); 글리세롤 3-포스페이트 (62.93 ppm, δ, J= 41 Hz; 65.31 ppm, br d, J= 43 Hz; 및 72.66 ppm, dt, J= 6, 41 Hz).
NADH-결합 글리세롤 데히드로게나제 분석:
비변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 단백질을 분리한 후에, 대장균 균주로부터의 무세포 추출물 내 NADH-결합 글리세롤 데히드로게나제 활성 (gldA)을 측정했다. 매개체로서 페나진 메토술페이트 (PMS)를 사용하여 글리세롤 + NAD+의 디히드록시아세톤 + NADH로의 전환을 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT)의 진한 색상의 포르마잔으로의 전환과 커플링시킨다 [Tang et al., J. Bacteriol. 140, 182 (1997)].
천연 겔 (8-16％ TG, 1.5 mm, 15개 레인이 있는 겔, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 노벡스 (Novex) 제품)을 사용한 표준 방법으로 전기영동을 2벌 (duplicate) 수행했다. 50 mM 트리스 또는 탄산 칼륨 완충액 (pH 9)을 사용하여, 상기 겔을 10분씩 3회 세척하여 잔류 글리세롤을 제거했다. 글리세롤 (최종 농도: 대략 0.16 M)이 있는 조건 및 없는 조건하에, 상기 2벌 겔을 50 mM 트리스 또는 탄산 칼륨 (pH 9), 60 mg 황산 암모늄, 75 mg NAD+, 1.5 mg MTT, 및 0.5 mg PMS를 함유하는 분석 용액 15 mL 중에서 전개시켰다.
또한, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후에, 정제된 클렙시엘라 뉴모니아 글리세롤 데히드로게나제 (dhaD)에 대해 유도된 폴리클로날 항체와 반응시켜 대장균 균주 (gldA) 내 NADH-결합 글리세롤 데히드로게나제 활성의 존재 여부를 결정했다.
1,3-프로판디올의 단리 및 확인:
글리세롤의 1,3-프로판디올로의 전환을 HPLC로 모니터링했다. 크로마토그래피 분야의 당업자에게 공지된 표준 기술 및 재료를 사용하여 분석했다. 한 적합한 방법으로 UV (210 nm) 및 RI 검출을 이용하는 워터스 맥시마 (Waters Maxima) 820 HPLC 시스템을 이용했다. 쇼덱스 (Shodex) SH-1011P 예비컬럼 (6 mm ×50 mm)이 장착된 쇼덱스 SH-1011 컬럼 (8 mm ×300 mm, 미국 매사추세츠주 밀포드 소재의 워터스 (Waters) 제품)의 온도를 50℃로 조절하고, 여기에 샘플을 주입하였으며, 이동상으로는 0.01 N H2SO4를 사용했고, 유동 속도는 0.5 mL/분이었다. 정량 분석을 원하는 경우, 외부 표준으로서 공지된 양의 트리메틸아세트산을 사용하여 샘플을 제조했다. 전형적으로, 글루코스 (RI 검출), 글리세롤, 1,3-프로판디올 (RI 검출), 및 트리메틸아세트산 (UV 및 RI 검출)의 체류 시간은 각각 15.27분, 20.67분, 26.08분, 및 35.03분이었다.
1,3-프로판디올의 생산을 GC/MS를 사용하여 입증했다. GC/MS 분야의 당업자에게 이용가능한 표준 기술 및 재료를 사용하여 분석했다. 한 가지 적합한 방법은 휴렛 팩커드 (Hewlett Packard) 5971 시리즈 질량 선택 검출기 (EI) 및 HP-INNOWax 컬럼 (길이 30 m, 내부 직경 0.25 mm, 막 두께 0.25 마이크론)과 커플링된 휴렛 팩커드 5890 시리즈 II 기체 크로마토그래피를 사용하는 것이다. 생성된 1,3-프로판디올의 체류 시간 및 질량 스펙트럼을 인증된 1,3-프로판디올의 값 (m/e: 57, 58) 과 비교했다.
GC/MS에 대한 대안적인 방법은 샘플의 유도체화를 포함했다. 샘플 (예를 들면, 배양물 상층액) 1.0 mL에 진한 과염소산 (70％ v/v) 30 ㎕를 첨가했다. 혼합한 뒤에, 상기 샘플을 냉동시켜 동결건조했다. 상기 동결건조된 물질에 비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 : 피리딘 (300 ㎕)의 1 : 1 혼합물을 첨가하고, 격렬하게 혼합하고 65℃에서 1시간 동안 방치했다. 샘플을 원심분리하여 불용성 물질을 제거하여 샘플을 맑게 했다. 2개의 상으로 분배된 액체가 생성되었는데, 이 중에서 상층물을 사용해서 분석했다. 이 샘플을 DB-5 컬럼 (48 m, 내부 직경 0.25 mm 내부, 막 두께 0.25 ㎛; J ＆ W 사이언티픽 (Scientific) 제품) 상에서 크로마토그래피하였으며, 배양 상층물로부터 얻어진 1,3-프로판디올 유도체의 체류 시간 및 질량 스펙트럼을 인증된 표준물에서 얻어진 값과 비교했다. TMS-유도된 1,3-프로판디올의 질량 스펙트럼은 205, 177, 130 및 115 AMU의 특징적인 이온들을 함유했다.
세포 용해:
발효 브로스 내 세포외 가용성 단백질 농도를 측정하여 세포 용해를 평가했다. 발효 샘플을 데스크탑 원심분리기 중에서 원심분리하여 (전형적으로, 에펜도르프 (Eppendorf) 제품인 모델 5415C 마이크로 원심분리기 중에서 12,000 rpm으로 3 내지 5분 동안 수행), 세포를 분리했다. 시판 시약 (바이오-래드 (Bio-Rad) 단백질 분석, 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재의 바이오-래드 제품)을 사용한 브래드포드 (Bradford) 방법을 이용하여, 생성된 상층액의 단백질 농도를 분석했다.
생존력:
발효조로부터 수득한 세포를 적당히 희석하여 비선택적 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하여 세포 생존력을 결정했다. OD550 (AU)에 의한, 발효 브로스 1 mL 당 살아있는 세포의 비율을 사용하여 발효 실험물 사이의 세포 생존력을 비교했다.
실시예 1
1,3-프로판디올의 발현을 위한 코스미드 DNA를 사용한 대장균 숙주 세포의 클로닝 및 형질전환
배지:
1,3-프로판디올 생산능에 대한 박테리아 형질전환체의 스크리닝에 합성 S12 배지를 사용했다. S12 배지는 다음을 함유한다: 10 mM 황산암모늄, 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액 (pH 7.0), 2 mM MgCl2, 0.7 mM CaCl2, 50 μM MnCl2, 1 μM FeCl3, 1 μM ZnCl, 1.7 μM CuCO4, 2.5 μM CoCl2, 2.4 μM Na2MoO4, 및 2 μM 티아민 히드로클로라이드.
증식 및 발효에 사용된 배지 A는 다음으로 구성된다: 10 mM 황산 암모늄; 50 mM MOPS/KOH 완충액 (pH 7.5), 5 mM 칼륨 포스페이트 완충액 (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 0.7 mM CaCl2, 50 μM MnCl2, 1 μM FeCl3, 1 μM ZnCl, 1.72 μM CuSO 4, 2.53 μM CoCl2, 2.4 μM Na2MoO4, 2 μM 티아민 히드로클로라이드, 0.01％ 효모 추출물, 0.01％ 카스아미노산, 0.8 ㎍/mL 비타민 B12, 및 50 ㎍/mL 암피실린. 필요에 따라, 배지 A에는 0.2％ 글리세롤 또는 0.2％ 글리세롤 및 0.2％ D-글루코스를 보충할 수 있다.
세포:
문헌에서 클렙시엘라 에어로게네스 (Klebsiella aerogenes) 또는 에어로박터 에어로게네스 (Aerobacter aerogenes)로도 알려진 클렙시엘라 뉴모니아 ECL2106 [Ruch et al, J.Bacteriol. 124, 348 (1975)]를 E.C.C.Lin (미국 매사추세츠주 소재의 하바드 메디칼 스쿨 (Harvard Medical School)에서 입수했으며, 이를 실험실 배양물로 유지했다.
클렙시엘라 뉴모니아 ATCC25955를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 구입했다.
대장균 DH5α를 Gibco/BRL에서 구입하고, 이를 클렙시엘라 뉴모니아 ATCC 25955에서 단리한, 글리세롤 또는 디올 데히드라타제 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 코스미드 DNA로 형질전환시켰다. 글리세롤 데히드라타제를 함유하는 코스미드를 pKP1 및 pKP2로 지칭하고, 디올 데히드라타제 효소를 함유하는 코스미드는 pKP4로 지칭했다. 형질전환된 DH5α 세포는 DH5α-pKP1, DH5α-pKP2, 및 DH5α-pKP4로 지칭했다.
대장균 ECL707 [Sprenger et al., J. Gen. Microbiol. 135,1255 (1989)]을 E.C.C.Lin (미국 매사추세츠주 소재의 하바드 메디칼 스쿨 (Harvard Medical School)에서 입수하여, 클렙시엘라 뉴모니아로부터의 코스미드 DNA를 사용하여 이를 유사하게 형질전환시켰다. 글리세롤 데히드라타제 유전자를 함유하는 상기 형질전환체는 ECL707-pKP1 및 ECL707-pKP2로 지칭하였고, 디올 데히드라타제 유전자를 함유하는 상기 형질전환체는 ECL707-pKP4로 지칭했다.
tpi 유전자에서 돌연변이를 함유하는 대장균 AA200 [Anderson et al., J. Gen. Microbiol. 62, 329 (1970)]을 예일 대학 (미국 코넥티커트주 뉴 헤이븐 소재)에 위치한 이.콜라이 제네틱 스톡 센타 (E.coli Genetic Stock Center)로부터 구입하여, 클렙시엘라 코스미드 DNA를 사용하여 형질전환시켜 글리세롤 데히드라타제 유전자를 함유하는 재조합 미생물 AA200-pKP1 및 AA200-pKP2, 및 디올 데히드라타제 유전자를 함유하는 재조합 미생물 AA200-pKP4를 생성했다,
DH5α:
클렙시엘라 뉴모니아 DNA로 형질감염시킨 대장균 XL1-Blue MR 콜로니를 대략 1,000개 함유하는 6개의 형질전환 플레이트를 5 mL LB 배지로 세척하고 원심분리했다. 박테리아를 펠렛화하고, 5 mL LB 배지 + 글리세롤 중에 재현탁했다. 0.2％ 글리세롤 + 비타민 B12 400 ng/mL + 0.001％ 효모 추출물 + 50 amp이 있는 S12 합성 배지를 함유하는 15 mL 튜브에 분취액 (50 ㎕)을 접종했다. 상기 튜브를 상기 배지로 끝까지 채우고, 파라필름으로 싸서 30℃에서 인큐베이션시켰다. 48시간 후에, 약간의 현탁성이 관찰되었다. 상기 기재한 바와 같이, 분취액을 78시간 및 132시간에 생산물에 대해 분석했을 때, 이 분취액들은 1,3-프로판디올에 대해 양성 이었고, 132시간의 경우에 1,3-프로판디올 양이 증가되었다.
시험 결과, 1,3-프로판디올 생산에 대해 양성으로 나타난 박테리아를 연속 희석하여 LB-50 amp 플레이트 상에 플레이팅하여 단일 콜로니를 단리했다. 48개의 단일 콜로니를 단리하여 1,3-프로판디올 생산 여부를 다시 검토했다. 6개의 독립적인 클론으로부터 코스미드 DNA를 단리하고, 이를 사용하여 대장균 균주 DH5α를 형질전환시켰다. 이 형질전환체를 1,3-프로판디올 생산에 대해 다시 평가했다. 2개의 형질전환체를 추가로 특성화하여 DH5α-pKP1 및 DH5α-pKP2로 지칭했다.
pKP1의 12.1 kb EcoRI-SalI 단편을 pIBI31 (미국 코넥티커트주 뉴 헤이븐 소재의 IBI 바이오시스템 (IBI Biosystem) 제품)에 서브클로닝하고, 서열결정하여 pHK28-26 (서열 1)로 지칭했다. 서열결정으로 오픈리딩프레임 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 dha 오페론의 관련 오픈리딩프레임 및 조절에 필요한 유전자의 유전자좌를 밝혔다.
서열 1과 관련하여, 디히드록시아세톤 키나제를 코딩하는 dhaK1의 오픈리딩프레임 단편이 염기 1-399 (상보체)에서 발견되었고; 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 오픈리딩프레임 dhaD가 염기 1010-2107에서 발견되었고; 레프레서를 코딩하는 오픈리딩프레임 dhaR이 염기 2209-4134에서 발견되었고; 미지 기능의 단백질을 코딩하는 오픈리딩프레임 orfW가 염기 4112-4642 (상보체)에서 발견되었고; 데히드라타제 재활성화 단백질을 코딩하는 오픈리딩프레임 orfX가 염기 4643-4996 (상보체)에서 발견되었고; 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제를 코딩하는 오픈리딩프레임 dhaT가 염기 5017-6180 (상보체)에서 발견되었고; 미지 기능의 단백질을 코딩하 는 오픈리딩프레임 orfY가 염기 6202-6630 (상보체)에서 발견되었고; α 서브유닛 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 오픈리딩프레임 dhaB1은 염기 7044-8711에서 발견되었고; β 서브유닛 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 오픈리딩프레임 dhaB2는 염기 8724-9308에서 발견되었고; γ 서브유닛 글리세롤 데히드라타제 오픈리딩프레임 dhaB3이 염기 9311-9736에서 발견되었고; 데히드라타제 재활성화 단백질을 코딩하는 오픈리딩프레임 dhaBX가 염기 9749-11572에서 발견되었고; 글리세롤 흡수 촉진제 단백질을 코딩하는 glpF 오픈리딩프레임 단편이 염기 11626-12145에서 발견되었다.
클렙시엘라 뉴모니아로부터 패키징된 코스미드 DNA로 형질감염시킨 대장균 XL1-Blue MR의 단일 콜로니를 200 ㎕의 S15 배지 (황산암모늄, 10 mM; 칼륨 포스페이트 완충액, pH 7.0, 1 mM; MOPS/KOH 완충액, pH 7.0, 50 mM; MgCl2, 2 mM; CaCl2, 0.7 mM; MnCl2, 50 nM; FeCl3, 1 μM; ZnCl, 1 M; CuSO4, 1.72 μM; CoCl 2, 2.53 μM; Na2MoO4, 2.42 μM; 및 티아민 히드로클로라이드, 2 μM) + 0.2％ 글리세롤 + 400 ng/mL 비타민 B12 + 0.001％ 효모 추출물 + 50 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 마이크로타이터 웰에 또한 접종했다. 마이크로타이터 웰 외에, LB-50 amp을 함유하는 마스터 플레이트에 접종했다. 96시간 후에, 100 ㎕를 취해 0.2 마이크론 나이론 막 필터를 함유하는 라이닌 마이크로퓨지 (Rainin microfuge)에서 원심분리했다. 박테리아를 남기고 여액을 HPLC 분석했다. 1,3-프로판디올 생산이 입증된 양성 클론을 스크리닝한 후 대략 240개의 콜로니가 확인되었다. 3개의 양성 클론이 확인 되었으며, 이들 중 2개 클론이 LB-50 amp에서 증식하였으며, 1개의 클론은 증식하지 못했다. LB-50 amp 상에서 배양된 2개의 양성 클론중 1개로부터 단리되고, 1,3-프로판디올의 생산이 입증된 단일 콜로니를 pKP4로 지칭했다. 코스미드 DNA를 pKP4를 함유하는 대장균 균주로부터 단리하고 대장균 균주 DH5α를 형질전환시켰다. DH5α-pKP4로 지칭된 독립적인 형질전환체를 1,3-프로판디올 생산에 대해 확인했다.
ECL707:
대장균 균주 ECL707을 pKP1, pKP2, pKP4에 상응하는 코스미드 클렙시엘라 뉴모니아 DNA 및 슈퍼코스 벡터 단독으로 형질전환시키고, 이를 ECL707-pKP1, ECL707-pKP2, ECL707-pKP4 및 ECL707-sc로 각각 지칭했다. ECL707은 ATP-의존성 글리세롤 키나제, NAD+-결합된 글리세롤 데히드로게나제 및 포스포에놀피루베이트 의존성 포스포트랜스퍼라제계의 디히드록시아세톤에 대한 효소 II를 각각 코딩하는 glpK, gld, 및 ptsD에 결함이 있다.
LB-50amp 플레이트에서 단리된, 각 코스미드로 형질전환된 20개의 단독 콜로니 및 슈퍼코스 벡터만으로 형질전환된 5개의 콜로니 (음성 대조군)를 마스터 LB-50 amp 플레이트로 옮겼다. 이들을 데히드라타제 활성을 갖는지를 알아보기 위해 글리세롤을 1,3-프로판디올으로 전환시킬 수 있는 능력에 대해서 시험했다. 형질전환체를 멸균 이쑤시개로 0.2％ 글리세롤 또는 0.2％ 글리세롤 + 0.2％ D-글루코스이 보강된 배지 A 200 ㎕가 들어있는 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 30℃ 에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 마이크로타이터 플레이트 웰의 내용물을 0.45 마이크론 나일론 필터를 통해 여과하고 HPLC로 크로마토그래피를 실시했다. 이 시험의 결과를 표 2에 나타냈다.
형질전환된 ECL707에 의한 글리세롤에서 1,3-프로판디올로의 전환율
형질전환체 글리세롤* 글리세롤 + 글루코스*
ECL707-pKP1 19/20 19/20
ECL707-pKP2 18/20 20/20
ECL707-pKP4 0/20 20/20
ECL707-sc 0/5 0/5
*양성 단리체의 개수/시험한 단리체의 개수

AA200:
대장균 균주 AA200을 pKP1, pKP2, pKP4에 상응하는 코스미드 클렙시엘라 뉴모니아 DNA 및 슈퍼코스 벡터 단독으로 형질전환시키고, 이들을 각각 AA200-pKP1, AA200-pKP2, AA200-pKP4 및 AA200-sc로 각각 지칭했다. 균주 AA200은 트리오즈포스페이트 이소머라제에 결함이 있다 (trp-).
각 코스미드로 형질전환된 20개의 단일 콜로니 및 빈 벡터로 형질전환된 5개의 콜로니를 단리하고 대장균 균주 ECL707에 대해 상기한 바와 같이 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환시킬 수 있는 능력에 관해 시험했다. 시험 결과를 표 3에 나타내었다.
형질전환된 AA200에 의한, 글리세롤에서 1,3-프로판디올로의 전환율
형질전환체 글리세롤* 글리세롤 + 글루코스*
AA200-pKP1 17/20 17/20
AA200-pKP2 17/20 17/20
AA200-pKP4 2/20 16/20
AA200-sc 0/5 0/5
*양성 단리체의 개수/시험한 단리체의 개수

실시예 2
글루코스로부터 글리세롤을 생산하기 위한 대장균 FM5의 글리세롤 키나제 돌연변이체 조작
대장균 FM5의 글리세롤 키나제 유전자 대체를 위한 통합 플라스미드 제작:
대장균 FM5 (ATCC 53911) 게놈 DNA를 퓨어진 (Puregene) DNA 단리 키트 (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재의 젠트라 시스템스 (Gentra Systems) 제품)를 사용하여 제조했다. glpF 일부분 및 글리세롤 키나제 (glpK) 유전자를 함유하는 1.0 kb DNA 단편을 프라이머 서열 2 및 서열 3을 사용하여 FM5 게놈 DNA로부터 PCR [Mullis and Faloona, Methods Enzymol. 155, 335 (1987)]에 의해 증폭했다. glpK 일부분 및 glpX 유전자를 함유하는 1.1 kb DNA 단편을 프라이머 서열 4 및 서열 5를 사용하여 FM5 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭했다. MunI 부위를 프라이머 서열 4에 포함시켰다. 프라이머 서열 4의 5' 말단은 프라이머 서열 3에 반대 방향으로 상보적이어서 연속 오버랩 신장 PCR (subsequent overlap extension PCR)을 수행할 수 있었다. 오버랩 신장 기술 [Horton et al., BioTechniques 8, 528-535 (1990)]에 의한 유전자 스플라이싱을 사용하여, 주형으로 상기 두개의 PCR 단편 및 프라이머 서열 2 및 서열 5을 사용한 PCR에 의해 2.1 kb 단편을 얻었다. 상기 단 편은 1.5 kb glpK 유전자의 중앙 영역으로부터 0.8 kb의 결실을 나타냈다. 전체적으로, 상기 단편은 MunI 클로닝 부위 (glpt 일부분내)의 한쪽에 1.0 kb 및 1.1 kb의 플랭킹 영역을 가지고 있어 상동성 재조합에 의해 염색체 유전자를 대체할 수 있었다.
상기 2.1 kb PCR 단편을 블런트 말단으로 만들고 (멍 빈 (mung bean) 뉴클레아제 사용) 제로 블런트 (Zero Blunt) PCR 클로닝 키트 (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로젠 (Invitrogen) 제품)를 사용하여 pCR-Blunt 벡터에 클로닝하여, 카나마이신 및 제오신 내성 유전자를 함유하는 5.6 kb 플라스미드 pRN100을 얻었다. 박테리오파지 P1 loxP 부위에 플랭킹한 클로르암페니콜-내성 유전자 [Snaith et al., Gene 166, 173 (1995)]를 함유하는 pLoxCat1 (미공개 결과)의 1.2 kb HincII 단편을 사용하여 MunI-절단된 (블런트 말단의) 플라스미드 pRN100에 라이게이션시켜 플라스미드 pRN100내의 glpK 단편 사이에 삽입하여 6.9 kb 플라스미드 pRN101-1를 얻었다. R6K 기점을 함유하는 376 bp 단편을 프라이머 서열 6 및 서열 7을 사용한 PCR [Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988)]에 의해 벡터 pGP704로부터 증폭하고, 블런트 말단으로 만들고, pRN101-1의 5.3 kb Asp7l8-AatII 단편 (블런트 말단 처리됨)에 라이게이션시켜 카나마이신 및 클로르암페니콜 내성 유전자를 함유하는 5.7 kb 플라스미드 pRN102-1을 얻었다. pRN101-1 내 ColE1 기점 영역을 R6K 기점으로 치환시켜 pRN102-1을 얻었으며 이때 제오신 내성 유전자의 대부분이 결실되었다. pRN102-1 복제를 위한 숙주는 R6K 기점의 작용에 필수적인 pir 유전자를 함유하는 대장균 SY327 [Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988)]였다.
클로르암페니콜 내성 유전자내 삽입체를 사용한 글리세롤 키나제 돌연변이체 RJF1Om의 조작:
대장균 FM5를 비복제성 통합 플라스미드 pRN 102-1로 전기형질전환시키고, 클로르암페니콜 (12.5 g/mL) 내성 및 카나마이신 (30 ㎍/mL) 감수성인 형질전환체중에서 1 mM 글리세롤 함유 M9 최소 배지 상에서 글루코스를 이용하지 못하는 형질전환체를 스크리닝했다. 완전한 glpK 유전자로 서던 분석 [Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)]에 의해 프로빙하는 경우 상기 돌연변이체, RJF10m 게놈 DNA의 EcoRI 절단체는 클로르암페니콜 내성 유전자 내의 추가의 EcoRI 부위의 존재로 인해 예측된 2개의 7.9 kb 및 2.0 kb 밴드가 관찰되었기 때문에 이중 교차 (double-crossover) 통합체 (glpK 유전자 치환체)임을 나타냈다. 야생형 대조군은 예측된 단일 9.4 kb 밴드를 생성했다. 돌연변이체 RJF10m의 13C NMR 분석은 13C-표지된 글리세롤 및 ATP를 글리세롤-3-포스페이트로 전환시킬 수 있다는 것을 입증했다. 상기 glpK 돌연변이체를 서열 8 및 서열 9, 서열 10 및 서열 11, 및 서열 8 및 서열 11의 프라이머 조합을 사용한 게놈 PCR에 의해 추가로 분석하여 예측된 2.3 kb, 2.4 kb, 및 4.0 kb PCR 단편을 각각 생성했다. 야생형 대조군은 프라이머 서열 8 및 서열 11을 사용하여 예측된 3.5 kb 밴드를 생성했다. glpK 돌연변이체 RJF10m을 플라스미드 pAH48로 전기형질전환시켜 글루코스로부터 글리세롤을 생산했다. glpK 돌연변이체 대장균 RJF10m은 1997년 11월 24일 부다페스트 조약하에 ATCC에 기탁했다.
제거된 클로르암페니콜 내성 유전자내 삽입체를 사용한 글리세롤 키나제 돌연변이체 RJF10 조작:
YENB 배지 (0.75％ 효모 추출물, 0.8％ 영양 브로스) 상에서 37℃에서 밤새 배양한 후 수 현탁액 중의 대장균 RJFlOm을 IPTG 유도성 lacUV5 프로모터, 온도-감수성 pSC101 레플리콘 및 암피실린 내성 유전자의 조절하의 박테리오파지 P1 Cre 리콤비나제를 함유하는 플라스미드 pJW168 (미공개 결과)로 전기형질전환시켰다. SOC 배지중에 30℃에서 더 배양하면서, 형질전환체를 카르베니실린 (50 ㎍/mL) 및 IPTG (1 mM)이 보충된 LB 아가 배지상에서 30℃ (pJW168 복제에 대한 허용 온도)에서 선별했다. 모아진 콜로니를 카르베니실린 및 IPTG가 보충된 새로운 LB 아가 배지상에서 30℃에서 2회 연속 옮겨 밤새 배양하여 염색체 클로르암페니콜 내성 유전자를 Cre 리콤비나제 [Hoess and Abremski, J. Mol. Biol. 181, 351-362 (1985)]에 의해 매개되는 loxP 부위에서의 재조합에 의해 염색체 클로르암페니콜 내성 유전자를 절단 제거하였다. 생성된 콜로니를 카르베니실린 및 IPTG이 보충된 LB 아가 배지 및 클로르암페니콜 (12.5 ㎍/mL)이 보충된 LB 아가 배지상에서 레플리카 (replica) 플레이팅하여 카르베니실린 내성 및 마커 유전자 제거를 나타내는 클로르암페니콜 감수성인 콜로니를 확인했다. 상기 한 콜로니를 30℃에서 밤새 배양하고, 이를 사용하여 LB 배지 10 mL에 접종했다. OD (600 nm)에서 0.6 AU까지 30℃에서 배양하고 배양물을 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. 여러 희석율로 예열된 LB 아가 배지에 플레이팅하고 플레이트를 42℃ (pJW168 복제의 비허용 온도)에서 밤새 인큐베이션했다. 생성된 콜로니를 LB 아가 배지 및 카르베니실린 (75 ㎍/mL)이 보충된 LB 아가 배지에서 레플리카 플레이팅하여 플라스미드 pJW168의 손실을 나타내는 카르베니실린 감수성 콜로니를 확인했다. 상기 한 glpK 돌연변이체, RJF 10를 프라이머 서열 8 및 서열 11을 사용한 게놈 PCR에 의해 추가로 분석하여 마커 유전자가 절단 제거되었음을 나타내는 예측된 3.0 kb 밴드를 생성했다. 돌연변이체 RJF10가 글리세롤을 이용할 수 없음은 1 mM 글리세롤을 함유하는 M9 최소 배지에서 증식하지 못하는 것으로 입증되었다. glpK 돌연변이체 RJF10을 플라스미드 pAH48로 전기형질전환시켜 글루코스로부터 글리세롤을 생산했다.
실시예 3
gldA 유전자가 녹아웃된 대장균 균주의 제작
말단 SphI 및 XbaI 부위를 각각 포함하고 있는 프라이머 서열 12 및 서열 13을 사용한 PCR에 의해 대장균의 gldA 유전자를 단리하고 [K. B. Mullis and F. A. Faloona, Meth. Enzymol. 155, 335-350 (1987)], pUC18 내 SphI 및 XbaI 부위 사이에 클로닝 [T. Maniatis (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, NY]하여 pKP8을 제작했다. pKP8를 gldA 유전자 내 유일한 SalI 및 NcoI 부위에서 절단하고, 말단들을 클레나우 (Klenow)로 처리하고 다시 라이게이션시켜 gldA의 중간에 109 bp을 결실시키고 유일한 SalI 부위를 재생하여 pKP9를 생성했다. 말단 SalI 부위를 포함하고 있는 프라이머 서열 14 및 서열 15를 사용한 PCR에 의해, 카나마이신 내성 부여 유전자 (kan)를 함유하고, 번역 개시 코돈 상류 DNA 약 400 bp 및 번역 정지 코돈 하류 DNA 약 100 bp를 포함하는 1.4 kb DNA 단편을 pET-28a(+) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 노바젠 (Novagen) 제품)로부터 단리하고, pKP9의 유일한 SalI 부위에 서브클로닝하여 pKP13을 생성했다. 말단 SphI 및 XbaI 부위를 각각 포함하고 있는 프라이머 서열 16 및 서열 17을 사용한 PCR에 의해 gldA 번역 개시 코돈 하류 204 bp에서 출발하여 gldA 번역 정지 코돈 상류 178 bp에서 종결하고, kan 삽입체를 함유하는 2.1 kb DNA 단편을 pKP13으로부터 단리하고, pMAK705 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 제넨코 인터내셔날 (Genencor International) 제품) 내 SphI 및 XbaI 부위 사이에 서브클로닝하여 pMP33을 생성했다. 대장균 FM5를 pMP33로 형질전환시키고, pMAK705 복제에 대한 허용 온도인 30℃에서, 20 ㎍/mL 카나마이신 상에서 선별했다. 30℃에서, 콜로니 1개가 20 ㎍/mL 카나마이신으로 보충된 액체 배지 중에서 밤새 증식했다. 대략 32,000개의 세포를 20 ㎍/mL kan 상에 플레이팅하고, pMAK705 복제에 대한 제한 온도인 44℃에서 16시간 동안 인큐베이션했다. 44℃에서 증식한 형질전환체는 대략 0.0001의 빈도로 염색체 내로 통합된 플라스미드를 함유했다. PCR 및 서던 블럿팅 [E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)] 분석법을 사용하여 형질전환체 내 염색체 통합된 특성을 결정했다. 웨스턴 블럿팅 분석법 [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 4350 (1979)]을 사용하여 형질전환체 내에서 gldA의 생산물인 글리세롤 데히드로게나제 단백질이 생성되었는지 여부를 결정했다. 활성 분석법을 사용하여 형질전환체 내에 글리세롤 데히드로게나제 활성이 남아있는지 여부를 결정했다. 매개체로서 페나진 메토술페 이트를 사용하여 글리세롤 및 NAD+의 디히드록시아세톤 및 NADH로의 전환을 테트라졸륨 염료, MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드]의 진한 색상의 포르마잔으로의 전환과 커플링시켜, 천연 겔 상의 글리세롤 데히드로게나제 밴드 내 활성을 측정했다. 글리세롤 데히드로게나제는 또한 30 mM 황산 암모늄 및 100 mM 트리스 (pH 9)가 필요하다 [Tang et al., J. Bacteriol. 140, 182 (1997)]. 분석한 8개의 형질전환체 중 6개가 gldA 녹아웃 (knockout)인 것으로 결정되었다. 부다페스트 조약하에 대장균 MSP33.6를 1997년 11월 24일에 ATCC에 기탁했다.
실시예 4
glpK 및 gld4 유전자가 녹아웃된 대장균 균주의 제작
gldA 유전자를 함유하고 번역 개시 코돈의 상류 DNA 228 bp 및 번역 정지 코돈 하류 DNA 220 bp를 포함하는 1.6 kb DNA 단편을 말단 SphI 및 XbaI 부위를 각각 포함하고 있는 프라이머 서열 18 및 서열 19를 사용한 PCR에 의해 단리하고 pUC18의 SphI 및 XbaI 부위 사이에 클로닝하여 pQN2를 생성했다. pQN2를 gldA 유전자 내 유일한 SalI 및 NcoI 부위를 절단하고, 말단을 클레나우 처리하고 다시 라이게이션시켜 gldA 중간에 109 bp를 결실시키고 유일한 SalI 부위를 재생시켜 pQN4를 생성했다. 카나마이신 내성 부여 유전자 (kan)를 함유하고 loxP 부위에 플랭킹된 1.2 kb 단편을 StuI/XhoI 단편으로서 pLoxKan2 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재 의 제넨코 인터내셔날 제품)로부터 단리하고, 말단을 클레나우 처리하고 클레나우 처리된 pQN4의 SalI 부위에 서브클로닝하여 pQN8을 생성했다. R6K 복제 기점을 함유하는 0.4 kb DNA 단편을 말단 SphI 및 XbaI 부위를 각각 포함하고 있는 프라이머 서열 20 및 서열 21를 사용한 PCR [Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988)]에 의해 pGP704로부터 단리하고, gldA::kan 카세트를 함유하는 pQN8의 2.8 kb SphI/XbaI DNA 단편에 라이게이션시켜 pKP22를 생성했다. 클로르암페니콜 내성 부여 유전자 (cam)를 함유하고 loxP 부위에 플랭킹된 1.0 kb DNA 단편을 XbaI 단편으로서 pLoxCat2 (제넨코르 인터내셔날, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터 단리하여, pKP22의 XbaI 부위에 서브클로닝하여 pKP23를 생성했다. glpK-인 대장균 균주 RJF10 (실시예 2 참조)를 pKP23으로 형질전환시키고, 표현형 kanRcamS을 갖는 형질전환체를 단리하고 서던 블럿 분석에 의해 입증된 이중 교차 통합을 나타냈다. 글리세롤 데히드로게나제 겔 활성 분석 (실시예 3에 기재됨)은 활성인 글리세롤 데히드로게나제가 상기 형질전환체에 존재하지 않음을 입증했다. kan 마커는 실시예 2에 기재된 Cre-생산 플라스미드 pJW168를 이용하여 염색체로부터 제거하여 균주 KLP23를 생성했다. 표현형 kanS를 갖는 여러 단리체는 글리세롤 데히드로게나제 활성이 없음이 입증되었으며 서던 블럿 분석으로 kan 마커가 손실되었음을 확인했다.
실시예 5
글리세롤 3-포스페이트 데히드로게나제 (DAR1) 및(또는) 글리세롤 3-포스파타제 (GPP2) 발현을 위한 플라스미드 제작 및 균주 제작
글리세롤 3-포스파타제 (gpp2)를 위한 발현 카세트 제작:
사카로마이세스 세레비지에 염색체 V 람다 클론 6592 (진뱅크 수탁 번호 #U18813x11)를 ATCC로부터 입수했다. 글리세롤-3-포스파타제 (GPP2) 유전자를 표적 DNA로서 5' 말단에 BamHI-RBS-XbaI 부위 및 3' 말단에 SmaI 부위를 포함하고 있는 합성 프라이머 (서열 22 및 서열 23)를 사용하여 람다 클론으로부터 클로닝했다. 생성물을 pCR-Script (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 스트라타진 (Stratagene) 제품)의 Srfl 부위에 서브클로닝하여 GPP2를 함유하는 플라스미드 pAH15를 생성했다. 플라스미드 pAH15는 pCR-Script SK+ 내의 lac 프로모터로부터의 발현에 불활성인 방향으로 GPP2 유전자를 함유한다. GPP2를 함유하는 pAH15의 BamHI-SmaI 단편을 pBlueScriptIISK+에 삽입하여 플라스미드 pAH19를 생성했다. pAH19는 lac 프로모터로부터의 발현에 적합한 방향으로 GPP2 유전자를 함유한다. GPP2 유전자를 함유하는 pAH19의 XbaI-PstI 단편을 pPHOX2에 삽입하여 플라스미드 pAH21를 생성했다. pAH21/DH5α는 발현 플라스미드이다.
글리세롤 3-포스페이트 데히드로게나제 (DAR1)을 위한 발현 카세트 제작:
DAR1을 합성 프라이머 (서열 24 및 서열 25)를 사용하여 게놈 사카로마이세스 세레비지에 DNA로부터 PCR 클로닝에 의해 단리했다. DAR1의 5' 말단의 NcoI 부위에 성공적으로 PCR 클로닝하였으며, 여기서 NcoI 내의 ATG는 DAR1 개시 메티오닌이다. DAR1의 3' 말단에 BamHI 부위를 번역 종결자 뒤에 도입한다. PCR 단편을 NcoI + BamHI로 절단하고, 발현 플라스미드 pTrc99A (미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재의 파르마시아 (Pharmacia) 제품) 내의 동일 부위 내에 클로닝하여 pDAR1을 생성했다.
DAR1의 5' 말단에 더 우수한 리보솜 결합 부위를 생성하기 위하여, 합성 프라이머 (서열 26 및 서열 27)을 어닐링하여 얻은 SpeI-RBS-NcoI 링커를 pDAR1A의 NcoI 부위 내에 삽입하여 pAH40을 생성했다. 플라스미드 pAH40은 pTrc99A (미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재의 파르마시아 제품)의 trc 프로모터로부터의 발현에 적합한 방향으로 신규 RBS 및 DAR1 유전자를 함유한다. pDAR1A의 NcoI-BamHI 단편 및 합성 프라이머 (서열 28 및 서열 29)를 어닐링하여 얻은 제2의 SpeI-RBS-NcoI 링커를 pBC-SK+ (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 스트라타진 제품)의 SpeI-BamHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pAH42를 생성했다. 플라스미드 pAH42는 클로르암페니콜 내성 유전자를 포함한다.
dar1 및 gpp2의 발현 카세트 제작:
DAR1 및 GPP2의 발현 카세트를 표준 분자생물학 방법을 사용하여 상기 기재된 각각 DAR1 및 GPP2 서브클론으로부터 조립했다. 리보솜 결합 부위 (RBS) 및 GPP2 유전자를 함유하는 pAH19의 BamHI-PstI 단편을 pAH40에 삽입하여 pAH43을 생성했다. RBS 및 GPP2 유전자를 함유하는 pAH19의 BamHI-PstI 단편을 pAH42에 삽입하여 pAH45를 생성했다.
GPP2의 5' 말단의 리보솜 결합 부위를 다음과 같이 변형시켰다. 합성 프라이머 GATCCAGGAAACAGA (서열 30)과 CTAGTCTGTTTCCTG (서열 31)를 GPP2를 함유하는 pAH19의 XbaI-PstI 단편에 어닐링시켜 얻은 BamHI-RBS-SpeI 링커를 pAH40의 BamHI- PstI 부위에 삽입하여 pAH48을 생성했다. 플라스미드 pAH48은 DAR1 유전자, 변형된 RBS, 및 GPP2 유전자를 pTrc99A (미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재의 파르마시아 제품)의 trc 프로모터 발현에 적합한 방향으로 함유한다.
대장균의 형질전환
본원에 기재된 모든 플라스미드를 표준 분자생물학 기술을 사용하여 대장균 DH5α로 형질전환시켰다. 형질전환체를 DNA RFLP 패턴으로 확인했다.
실시예 6
대장균을 클렙시엘라 뉴모니에 dha 레굴론의 유전자로 형질전환시키는데 사용하기 위한 발현 플라스미드 제작
발현 벡터 pTacIQ 제작
대장균 발현 벡터인 pTacIQ는 pBR322 [Sutcliffe et al., Cold Spring Harb, Symp. Quant. Biol. 43, 77-90 (1979)]의 엔도뉴클레아제 부위 EcoRI에 lacIq 유전자 [Farabaugh, Nature 274 (5673), 765-769 (1978)] 및 tac 프로모터 [Amann et al., Gene 25, 167-178 (1983)]를 삽입하여 제조했다. 다중 클로닝 부위 및 종결 서열 (서열 32)로 EcoRI에서 SphI까지의 pBR322 서열을 대체했다.
글리세롤 데히드라타제 유전자 (dhaB1, 2, 3, X)의 서브클로닝
5' 말단에 EcoRI 부위 및 3' 말단에 XbaI 부위를 포함하고 있는 프라이머 (서열 33 및 서열 34)를 사용한 PCR에 의해 dhaB3 유전자의 오픈리딩프레임을 pHK28-26으로부터 증폭시켰다. 생성물을 pLitmus29 (미국 매사추세츠주 버벌리 소 재의 뉴 잉글랜드 바이오랩, 인크. (New England Biolab, Inc.) 제품)에 서브클로닝하여 dhaB3을 함유한 pDHAB3를 생성했다.
pHK28-26으로부터 얻은 dhaB 오페론의 dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaBX의 전체 코딩 영역을 함유하는 영역을 제한 효소 KpnI 및 EcoRI을 사용하여 pBluescriptIIKS+ (미국 캘리포니아주 라졸라 소재의 스트라타진 제품)로 클로닝하여 플라스미드 pM7을 생성했다.
플라스미드 pM7을 ApaI 및 XbaI로 절단하여 dhaBX를 제거하고 5.9 kb 단편을 정제하고 플라스미드 pDHAB3의 325 bp ApaI-XbaI 단편과 라이게이션시켜 dhaB1, dhaB2 및 dhaB3을 함유하는 pM11을 생성했다.
5' 말단에 HindIII 부위 및 컨센서스 리보솜 결합 부위, 및 3' 말단의 XbaI 부위를 포함하고 있는 프라이머 (서열 35 및 서열 36)를 사용한 PCR에 의해 dhaB1 유전자의 오픈리딩프레임을 pHK28-26으로부터 증폭시켰다. 생성물을 pLitmus28 (뉴 잉글랜드 바이오랩, 인크. 제품)에 서브클로닝하여 dhaB1을 함유하는 플라스미드 pDT1을 생성했다.
dhaB1 유전자 일부분, dhaB2 유전자 및 dhaB3 유전자를 함유하는 pM11의 NotI-XbaI 단편을 pDT1에 삽입하여 dhaB 발현 플라스미드, pDT2를 생성했다. pDT2의 dhaB(1,2,3) 유전자를 함유하는 HindIII-XbaI 단편을 pTacIQ에 삽입하여 pDT3를 생성했다.
1,3-프로판디올 데히드로게나제 유전자 (dhaT)의 서브클로닝
1,3-프로판디올 데히드로게나제 (dhaT) 유전자를 함유하는 pHK28-26의 KpnI- SacI 단편을 pBluescriptII KS+에 서브클로닝하여 플라스미드 pAH1을 생성했다. 5' 말단에 XbaI 부위 및 3' 말단에 BamHI 부위를 포함하고 있는 합성 프라이머 (서열 37 및 서열 38)를 사용한 PCR에 의해 주형 DNA로서 pAH1로부터 dhaT 유전자를 증폭시켰다. 생성물을 pCR-Script (스트라타진 제품)의 SrfI 부위에 서브클로닝하여 dhaT를 함유하는 플라스미드 pAH4 및 pAH5를 생성했다. 플라스미드 pAH4는 pCR-Script의 lac 프로모터로부터 발현에 적합한 방향으로 dhaT 유전자를 함유하며, pAH5는 dhaT 유전자를 반대 방향으로 포함한다. pAH4의 dhaT 유전자를 함유하는 XbaI-BamHI 단편을 pTacIQ에 삽입하여 플라스미드 pAH8을 생성했다. RBS 및 dhaT 유전자를 함유하는 pAH8의 HindIII-BamHI 단편을 pBluescriptIIKS+에 삽입하여 pAH11을 생성했다.
dhaT 및 dhaB(1,2,3)의 발현 카세트 제작
dhaT 및 dhaB(1,2,3)의 발현 카세트는 상기한 개별 dhaB(1,2,3) 및 dhaT 서브클론으로부터 표준 분자생물학 방법을 이용하여 조립했다. dhaB(1,2,3)을 함유하는 pDT3의 SpeI-SacI 단편을 pAH11의 SpeI-SacI 부위에 삽입하여 pAH24를 생성했다.
SalI-XbaI 링커 (서열 39 및 서열 40)를 제한 효소 SalI-XbaI로 절단된 pAH5에 삽입하여 pDT16을 제작했다. 링커는 XbaI 부위가 제거되었다. 이어서, pDT16의 1 kb SaII-MluI 단편을 pAH24에 삽입하여 이미 존재하고 있는 SalI-MluI 단편을 대체하여 pDT18을 생성했다. pDT18의 SalI-NotI 단편 및 pM7의 NotI-XbaI 단편을 pCL1920 (서열 41)에 삽입하여 pDT21을 제작했다. 스트렙토마이세스의 글루코스 이소머라제 프로모터 서열 (서열 42)을 PCR에 의해 클로닝하고 pLitmus28의 EcoRI-HinDIII 부위에 삽입하여 pDT5를 제작했다. pDT5의 EcoRI-PvuII 단편을 pCL1920의 EcoRI-PvuI 부위에 삽입하여 pCL1925를 제작했다. pDT21의 HinDIII-MluII 단편 및 pDT21의 MluI-XbaI 단편을 pCL1925의 HinDIII-XbaI 부위에 클로닝하여 pDT24를 제작했다.
dhaT 및 dhaB(1,2,3,X)의 발현 카세트 제작:
pDT18의 SalI-NotI 단편 및 pM7의 NotI-XbaI 단편을 pCL1920 (서열 41)에 삽입하여 pDT21을 제작했다. 스트렙토마이세스의 글루코스 이소머라제 프로모터 서열 (서열 42)를 PCR에 의해 클로닝하고 pLitmus28의 EcoRI-HinDIII 부위에 삽입하여 pDT5를 제작했다. pDT5의 EcoRI-PvuII 단편을 pCL1920의 EcoRI-PvuI 부위에 삽입하여 pCL1925를 제작했다. pDT21의 HinDIII-MluII 단편 및 pDT21의 MluI-XbaI 단편을 pCL1925의 HinDIII-XbaI 부위에 클로닝하여 pDT24를 제작했다.
dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW 및 dhaB(1,2,3,X)의 발현 카세트 제작:
pHK28-26의 SacI-EcoRI 단편을 pCL1925의 SacI-EcoRI 부위에 삽입하여 pDT29를 제작했다.
dhaR, orfY, orfX, orfW 및 dhaB(1,2,3,X)의 발현 카세트 제작:
처음 5개 및 마지막 5 코돈 (및 정지 코돈)을 제외한 유전자 dhaT 전체를 PCR 매개 오버랩 신장법으로 공지된 기술에 의해 결실시켜 플라스미드 pDT29의 유도체를 제작했다. 주형으로 pDT29를 사용하고 하기 프라이머를 사용하여 2가지 주요 PCR 생산물을 얻었다.
서열 43 = 5'GAC GCA ACA GTA TTC CGT CGC3' ;
서열 44 = 5'ATG AGC TAT CGT ATG TTC CGC CAG GCA TTC TGA GTG TTA ACG3' ;
서열 45 = 5'GCC TGG CGG AAC ATA CGA TAG CTC ATA ATA
TAC3';
서열 46 = 5'CGG GGC GCT GGG CCA GTA CTG3'.
서열 45를 서열 46과 짝지어 5' dhaB1 (유일한 ScaI 부위까지), orfY의 전체 및 dhaT의 처음 5개 코돈을 포함하는 핵산에 걸친 931 bp 생성물을 얻었다. 서열 43을 서열 44와 짝지어 dhaT의 마지막 5개의 코돈 (및 정지 코돈), orfX의 전체, orfW의 전체 및 5'dhaR (유일한 SapI 부위까지)를 포함하는 핵산에 걸친 1348 bp의 생산물을 얻었다. 서열 44의 5' 말단의 15개 염기는 서열 45의 15개 염기 부분과 반대 방향으로 상보적인 테일을 구성한다. 유사하게, 서열 45의 5' 말단의 11개 염기는 서열 44의 11개 염기 부분과 반대 방향으로 상보적인 테일을 구성한다. 따라서, 2개의 주요 PCR 생성물을 어닐링시키고 (26 bp의 테일 오버랩에 의해) PCR에 의해 신장시켜 서로 연결하여 2253 bp의 제3의 핵산 생성물을 얻었다. 상기 제3 PCR 생성물을 SapI 및 ScaI로 절단하고, SapI 및 ScaI으로 역시 절단된 pDT29에 라이게이션시켜, dhaT내에 프레임 내 큰 결실을 제외하고는 pDT29와 동일한 플라스미드 pKT32를 생성했다.
실시예 7
대장균 균주 KLP23/pAH48/pDT29를 이용한 글루코스의 1,3-프로판디올로의 전환 및 KLP23/pAH48/pKP32을 이용한 개선된 방법
예비 배양:
KLP23/pAH48/pDT29 및 KLP23/pAH48/pKP32를 예비 배양하여 200 mg/L 카르베니실린 (또는 암피실린) 및 50 mg/L 스펙티노마이신을 함유한 2YT 배지 (10 g/L 효모 추출물, 16 g/L 트립톤, 및 10 g/L NaCl) 중에 발효조를 접종했다. KLP23/pAH48/pKP32는 dhaT가 결실된 것을 제외하고는 KLP23/pAH48/pDT29와 동일하다.
2 L 엘른마이어 플라스크 내 배지 500 mL 내에 냉동된 스톡 (동결 방지제로서 10％ DMSO)으로 배양을 개시하고, 35℃ 진탕기 250 rpm에서 배양하여 OD550에서 대략 1.0 AU가 도달하면 발효조에 접종했다.
발효조 배지:
하기 성분을 발효조 용기와 함께 멸균시켰다: 45 g KH2PO4, 12 g 시트르산, 12 g MgS04·7H20, 30 g 효모 추출물, 2.0 g 시트르산 암모늄 제2철, 제포제로서 5 mL Mazu DF204, 1.2 g CaCl2·2H2O, 및 7.3 mL 황산. 20 내지 28％ NH40H로 pH를 6.8로 상승시키고 하기 성분을 첨가했다: 1.2 g 카르베니실린 또는 암피실린, 0.30 g 스펙티노마이신, 60 mL 미량 원소 용액 및 글루코스 (60 내지 67 중량％ 공급물로부터). 접종 후, 부피는 6.0 L였고, 글루코스 농도는 10 g/L였다. 미량 원소 용액은 다음 성분을 함유했다 (g/L): 시트르산. H20 (4.0), MnSO4 H2O (3.0), NaCl (1.0), FeSO4·7H2O (0.10), CoCl2·6H20 (0.10), ZnS04 ·7H20 (0.10), CuS04·5H20 (0.010), H3BO3 (0.010) 및 Na2MoO4·2H20 (0.010).
발효 배양:
15 L 교반 탱크 발효조를 상기한 배지로 준비했다. 온도는 35℃로 조절했으며 수성 암모니아 (20 내지 28 중량％)를 사용하여 pH를 6.8로 조절했다. 공기 유량의 초기값 (최소값을 6 내지 12 표준 리터/분 사이로 설정) 및 교반기 속도 (최소값을 350 내지 690 rpm로 설정)을 설정하여 OUR 값이 대략 140 mmol/L/시간에 이르면 용존 산소 (DO) 제어를 개시했다. 역압을 0.5 bar로 조절했다. DO 제어는 10％로 설정했다. 약간의 오차를 제외하고는 글루코스를 60％ 또는 67％ (wt) 공급물로 0 g/L 내지 10 g/L 사이를 유지시켰다. 비타민 B12 또는 보조효소 B12를 하기와 같이 첨가했다.
KLP23/pAH48/pDT29를 이용한 발효:
대장균 균주 KLP23/pAH48/pDT29를 이용한 글루코스의 1,3-프로판디올 (1,3-PD)로의 전환에 대한 대표적인 발효 개요는 표 4에 나타냈다. 접종 3시간 후에 시작하여 비타민 B12 (0.075 g/L, 500 mL)를 16 mL/시간의 속도로 공급했다. 1,3-프로판디올의 수율은 24 중량％ (1,3-프로판디올(g)/소비된 글루코스(g))였고, 1,3-프로판디올에 대한 역가는 68 g/L로 얻어졌다.
대장균 균주 KLP23/pAH48/pDT29를 이용한 글루코스의 1,3-프로판디올 (1,3-PD)로의 전환에 대한 대표적인 발효 개요
시간 (h) OD550 (AU) DO(％) 글루코스 (g/L) 글리세롤 (g/L) 1,3-PD (g/L)
0 0 150 12.9 0.0 0
6 17 80 8.3 3.1 1
12 42 53 2.8 12.5 9
18 98 9 5.7 12.6 32
24 136 11 32.8 12.0 51
30 148 10 12.3 13.3 62
32 152 11 12.5 14.3 65
38 159 11 1.5 17.2 68

비타민 B12를 2배 농도 또는 발효 과정에 걸쳐 농축괴로 첨가하여 동일하게 공급한 경우 유사한 결과를 얻었다. 얻어진 최고 역가는 77 g/L였다.
KLP23/pAH48/pKP32를 이용한 개선된 발효:
대장균 균주 KLP23/pAH48/pKP32를 이용한 글루코스의 1,3-프로판디올 (1,3-PD)로의 전환의 대표적인 발효 개요를 표 5에 나타냈다. 접종 3시간 후에 시작하여 비타민 B12 (0.150 g/L, 500 mL)를 16 mL/시간의 속도로 공급했다. 36시간 후에, 대략 2 L의 발효 브로스를 퍼지하여 글루코스를 연속적으로 공급했다. 1,3-프로판디올의 수율은 26 중량％ (1,3-프로판디올(g)/소비된 글루코스(g))였고, 1,3-프로판디올에 대한 역가는 112 g/L로 얻어졌다.
대장균 균주 KLP23/pAH48/pKP32를 이용한 글루코스의 1,3-프로판디올 (1,3-PD)로의 전환에 대한 대표적인 발효 개요
시간 (h) OD550 (AU) DO(％) 글루코스 (g/L) 글리세롤 (g/L) 1,3-PD (g/L)
0 0 148 12.8 0.0 0
6 22 84 6.9 3.3 0
12 34 90 9.7 10.4 7
18 66 43 9.3 5.9 24
24 161 9 0.2 2.5 46
30 200 10 0.2 6.0 67
36 212 10 1.2 9.7 88
42 202 2 0.1 15.5 98
48 197 12 1.2 23.8 112

비타민 B12를 1/2배 농도 또는 발효 과정에 걸쳐 농축괴로 첨가하여 동일하게 공급한 경우 유사한 결과를 얻었다. 얻어진 최고 역가는 114 g/L였다.
실시예 8
글루코스로부터 1.3-프로판디올의 수율을 향상시키기 위한 대장균 KLP23의 트리오스포스페이트 이소머라제 돌연변이체의 조작
대장균 KLP23에서 트리오스포스페이트 이소머라제 유전자 대체를 위한 플라스미드 제작:
대장균 KLP23 게놈 DNA를 퓨어진 DNA 단리 키트 (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재의 젠트라 시스템스 제품)을 사용하여 제조했다. 트리오스포스페이트 이소머라제 (tpiA) 유전자의 3' 말단을 함유하는 1.0 kb 단편을 프라이머 서열 47 및 서열 48을 사용하여 KLP23 게놈 DNA으로부터 PCR [Mullis and Faloona, Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987)]에 의해 증폭했다. tpiA의 5' 말단, yiiQ, 및 yiiR 유전자의 5' 말단을 함유하는 1.0 kb DNA 단편을 프라이머 서열 49 및 서열 50을 사용하여 KLP23 게놈 DNA으로부터 PCR에 의해 증폭했다. ScaI 부위를 프라이머 서열 49에 포함시켰다. 프라이머 서열 49의 5' 말단은 프라이머 서열 48에 반대 방향으로 상보적이어서 연속 오버랩 신장 PCR을 수행할 수 있었다. 오버랩 신장 기술 [Horton et al., BioTechniques 8, 528-535 (1990)]에 의한 유전자 스플라이싱을 사용하여 주형으로 상기 두개의 PCR 단편 및 프라이머 서열 47 및 서열 50을 사용한 PRR에 의해 2.0kb 단편을 생성했다. 상기 단편은 768 bp tpiA 구조 유전자의 73％ 결실을 나타냈다. 전체적으로, 상기 단편은 ScaI 클로닝 부위 (tpiA 일부분내)의 한쪽에 1.0 kb의 플랭킹 영역을 가지고 있어 상동성 재조합에 의해 염색체 유전자를 대체할 수 있었다.
상기 블런트 말단 2.0 kb PCR 단편을 제로 블런트 (Zero Blunt) PCR 클로닝 키트 (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로젠 제품)를 사용하여 pCR-Blunt 벡터에 클로닝하여, 카나마이신 및 제오신 내성 유전자를 함유하는 5.5 kb 플라스미드 pRN106-2를 생성했다. 박테리오파지 P1 loxP 부위에 플랭킹한 클로르암페니콜-내성 유전자 [Snaith et al., Gene 166, 173-174 (1995)]를 함유하는 pLoxCat1 (미공개 결과)의 1.2 kb HincII 단편을 사용하여 ScaI-절단된 플라스미드 pRN106-2에 라이게이션시켜 플라스미드 pRN106-2내의 tpiA 단편 내에 삽입하여 6.8 kb 플라스미드 pRN107-1를 생성했다.
선형 DNA 형질전환에 의한 트리오스포스페이트 이소머라제 돌연변이체 RJ8m의 조작:
pRN107-1 및 프라이머 서열 47 및 서열 50을 주형으로 사용하여, tpiA 플랭 킹 영역 및 loxP-CmR-loxP 카세트를 함유하는 3.2 kb 단편을 PCR 증폭시키고 겔에서 추출했다. 대장균 KLP23을 1 ㎍ 이하의 상기 3.2 kb 선형 DNA 단편으로 전기형질전환시키고, 클로르암페니콜 내성 (12.5 g/mL) 및 카나마이신 감수성 (30 ㎍/mL)인 형질전환체중에서 1 mM 글루코스 상에서 글루코스 이용하지 못하는 형질전환체, 1 mM 글루코네이트 상에서 정상의 글루코네이트를 이용할 수 있는 형질전환체를 M9 최소 매질에서 스크리닝하고, 1 mM 글리세롤 상에서 숙주 KLP23가 글리세롤을 이용하지 못하는 표현형을 가짐을 확인했다. 완전한 tpiA 유전자로 서던 분석 [Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)]에 의해 프로빙하는 경우 상기 한 돌연변이체, RJ8m 게놈 DNA의 EcoRI 절단체는 클로르암페니콜 내성 유전자 내의 추가의 EcoRI 부위의 존재로 인해 예측된 2개의 6.6 kb 및 3.0 kb 밴드가 관찰되었기 때문에 이중 교차 포함체 (tpiA 유전자 치환체)임을 나타냈다. 예측한 바와 같이, 숙주 KLP23 및 야생형 FM5 대조군은 각각 8.9 kb 및 9.4 kb의 단일 밴드를 각각 생성했다. 상기 tpiA 돌연변이체를 프라이머 서열 51 및 서열 52를 사용한 게놈 PCR에 의해 추가로 분석하여 예측된 4.6 kb PCR 단편을 생성한 반면, 동일한 프라이머 쌍에 대해 숙주 KLP23 및 야생형 FM5 균주는 모두 예측된 3.9 kb PCR 단편을 생성했다. 돌연변이체 RJ8m 및 숙주 KLP23으로부터 무세포 추출물을 기질로서 글리세르알데히드 3-포스페이트를 사용하여 tpiA 활성을 시험하였을 때 RJ8m에서는 활성이 관찰되지 않았다. tpiA 돌연변이체 RJ8m을 플라스미드 pAH48로 전기형질전환시켜 글루코스로부터 글리세롤을 생산하였으며, 플라스미드 pAH48 및 pDT29 모두 또는 pKP32로 전기형질전환시켜 글루코스로부터 1,3-프로판디올을 생산했다. 클로르 암페니콜 내성 마커를 RJ8m으로부터 제거하여 RJ8를 얻었다.
실시예 9
대장균 균주 RJ8/pAH48/pDT29를 사용한 글루코스의 1,3-프로판디올로의 전환 및 RJ8/pAH48/pKP32를 사용한 개선된 방법
예비 배양:
발효조에 접종하기 위해 실시예 7에 기재된 바와 같이 RJ8/pAH48/pDT29 및 RJ8/pAH48/pKP32를 예비 배양하였다. RJ8/pAH48/pKP32는 dhaT가 결실되었다는 점을 제외하면 RJ8/pAH48/pDT29와 동일했다.
발효조 배지:
발효조 배지는 실시예 7에 기재하였다.
발효 배양:
공기 유동 속도의 초기값 (최소값을 5 내지 6 표준 리터/분 사이로 설정) 및 교반기 속도 (최소값을 300 내지 690 rpm으로 설정)을 설정하여 OUR 값이 대략 60 내지 100 mmol/L/시간에 이르면 용존 산소 (DO) 제어를 개시하는 것을 제외하고는 실시예 7에 기재된 바와 같이 발효조를 배양했다. 비타민 B12 또는 보조효소 B12를 하기와 같이 첨가했다.
RJ8/pAH48/pDT29를 사용한 발효:
대장균 균주 RJ8/pAH48/pDT29를 사용한 글루코스의 1,3-프로판디올 (1,3-PD) 로의 전환에 대한 대표적인 발효 개요는 표 6에 나타냈다. 비타민 B12를 2, 8 및 26시간에 각각 2, 16 및 16 mg의 농축괴로 첨가하였다. 1,3-프로판디올의 수율은 35 중량％ (1,3-프로판디올(g)/소비된 글루코스(g))였고, 1,3-프로판디올에 대한 역가는 50.1 g/L로 얻어졌다.
대장균 균주 RJ8/pAH48/pDT29를 사용한 글루코스의 1,3-프로판디올 (1,3-PD)로의 전환에 대한 대표적인 발효 개요
시간(h) OD550(AU) DO(％) 글루코스 (g/L) 글리세롤 (g/L) 1,3-PD(g/L)
0 0 140 10.6 0.1 0.0
6 5 107 11.1 0.5 0.4
10 16 90 8.5 1.7 1.3
14 25 86 1.8 2.4 5.9
19 38 53 3.5 5.9 15.4
25 53 38 0.1 9.2 26.7
31 54 10 4.5 7.4 39.0
37 37 23 17.2 6.0 45.0
43 21 13 9.9 7.7 50.1

RJ8/pAH48/pKP32를 사용한 개선된 발효:
대장균 균주 RJ8/pAH48/pKP32를 사용한 글루코스의 1,3-프로판디올 (1,3-PD)로의 전환에 대한 대표적인 발효 개요를 표 7에 나타냈다. 비타민 B12를 대략 26 및 44시간에 각각 48 및 16 mg의 농축괴로 첨가하였다. 1,3-프로판디올의 수율은 34 중량％ (1,3-프로판디올(g)/소비된 글루코스(g))였고, 1,3-프로판디올에 대한 역가는 129 g/L로 얻어졌다.
대장균 균주 RJ8/pAH48/pKP32를 사용한 글루코스의 1,3-프로판디올 (1,3-PD)로의 개선된 전환에 대한 대표적인 발효 개요
시간 (h) OD550(AU) DO(％) 글루코스 (g/L) 글리세롤 (g/L) 1,3-PD (g/L)
0 0 150 12.6 0.1 0
6 12 113 6.0 2.6 0
12 24 99 0.0 10.6 0
18 51 76 2.4 28.9 0
24 78 82 2.4 44.2 5
30 114 70 3.8 26.9 33
36 111 72 0.0 20.0 57
42 139 65 0.1 21.9 69
48 157 36 0.1 22.4 79
55 158 25 0.2 21.4 94
64 169 14 0.1 15.8 113
72 169 12 0.1 13.4 119
74 162 14 0.1 14.8 129

실시예 10
개선된 1,3-프로판디올 방법에서의 대장균 비특이적 촉매 활성 (yqhD)의 확인
개선된 촉매를 사용한 1,3-프로판디올-생산 발효 중의 비특이적 촉매 활성의 입증:
1,3-프로판디올 데히드로게나제 활성에 대한 온전한 세포 분석법을 이용하여, 대장균 내 비특이적 촉매 활성은 비타민 B12를 첨가하고 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)가 생산된 이후의 발효 조건하에 존재하며, 그 이전에는 존재하지 않는다는 것을 입증했다. 비타민 B12가 없다는 점을 제외하면 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이, 글리세롤을 생산하는 플라스미드 (pAH48) 및 1,3-프로판디올을 생산하는 플라스미드 (pKP32)를 함유하는 재조합 대장균 균주를 10 L 발효조에서 배양했다. 탱크의 OD550이 대략 100에 이르렀을 때 비타민 B12 농축괴 (48 mg)를 첨 가했다. 비타민 B12 첨가 직전 및 첨가한지 2시간 후에, 탱크로부터 세포 분취액을 취하였다. 원심분리하여 세포를 회수하고, 새로운 단백질 합성을 억제하는 클로르암페니콜을 150 ㎍/mL 함유하는 PBS 완충액 중에 원래의 부피로 재현탁시켰다. 클로르암페니콜 처리된 세포의 적당한 부피를 반응 혼합물 (10 g/L 글루코스, 10 g/L 글리세롤, 1 mg/L 보조효소 B12, 및 150 ㎍/mL 클로르암페니콜을 함유하는 PBS 완충액)이 들어있는 250 mL 배플 (baffled) 플라스크에 첨가하여 OD550값이 10이고, 최종 부피가 대략 50 mL가 되도록 했다. 빛을 차단시킨 플라스크를 35℃에서 250 rpm으로 진탕했다. HPLC 분석용 분취액을 시간마다 취하였다. 비타민 B12를 첨가하기 전 또는 첨가한 후에 발표조로부터 회수한 세포가 들어있는 플라스크에서 시간에 따른 3-HPA 생산을 관찰하였다. 완전 반대로, 비타민 B12를 첨가한 이후에 발효조로부터 회수한 세포가 들어있는 플라스크 중에서만 상당량의 1,3-프로판디올이 관찰되었다.
무세포 추출물에서의 비특이적 촉매 활성의 검출:
천연 겔 활성 염색 분석법을 이용하여 무세포 추출물 중에서의 비특이적 촉매 활성을 입증하였다. 글리세롤을 생산하는 플라스미드 (pAH48) 및 1,3-프로판디올을 생산하는 플라스미드 (pKP32)를 함유하는 재조합 대장균 균주를 배양한 대표적인 10 L 발효조로부터 비타민을 첨가하기 이전 및 첨가한 이후의 세포를 회수하고, 프렌치 프레스로 세포를 파괴하여 무세포 추출물을 제조했다. 무세포 추출물, 순수한 클렙시엘라 뉴모니아 1,3-프로판디올 데히드로게나제 (dhaT) 제제, 및 분자량 표준을 천연 구배 폴리아크릴아미드 겔 상에 적용하여 전기영동했다. 그 다음, 상기 겔을 기질인 1,3-프로판디올 및 NAD+, 또는 에탄올 및 NAD+에 노출시켰다. 예측했던 바와 같이, 상기 기질이 1,3-프로판디올인 경우의 겔에서는, 천연 겔 상에서 대략 340 KDa으로 이동한 DhaT에 대한 활성 염색물이 관찰되었다. 이러한 활성은 순수한 클렙시엘라 뉴모니아 1,3-프로판디올 데히드로게나제를 적용한 레인에서만 관찰되었다. 반대로, 기질이 1,3-프로판디올이고, 이후에 비타민 B12를 첨가한 무세포 추출물을 적용한 경우에는 대략 90 KDa에서 비특이적 촉매 활성이 관찰되었다. 기질로서 에탄올을 사용한 경우에는 DhaT 밴드와 비특이적 촉매 활성 밴드 모두 나타나지 않았으나, 비타민 B12를 첨가하기 이전 및 첨가한 이후에는 대략 120 KDa에서 별개의 밴드가 나타났다. 전형적으로 모든 유기체에서 발견되듯이, 이러한 새로운 밴드는 기질로서 에탄올에 대해 특이성이 있는 알콜 데히드로게나제일 것이다.
단백질에 관한 효소적 분석 단계를 수행하기 전에 단백질들을 분자량에 따라 분리하는 상기 천연 겔 분석법은 대장균에 대해 잘 특성화되어 있고 모든 유기체에서 발견되는, 기질로서 에탄올에 대해 특이성이 있는 알콜 데히드로게나제와 다를 수 있는 활성이 낮은 상기 구조물에서 1,3-프로판디올의 환원을 측정하는 데 있어서 민감성과 정확성을 더 높인다. 데히드로게나제 분석법은 데히드로게나제가 1,3-프로판디올 (또는 기타의 알콜)로부터 NAD+로의 전자 전달을 촉매한다는 원리로 작동한다. 그 다음, PMS (페나진 메토술페이트)가 NADH와 테트라졸륨 브로마이드 염료 (MTT, 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 사이의 전자 전달을 커플링하여 겔에서 침전물을 형성한다. 상기 겔을 기질 중에 몇 시간 동안 적신 후, 또는 밤새 적신 후에 세척하여 시약 및 가용성 염료를 제거했다. 겔 상에서 활성 데히드로게나제가 존재하는 밴드에 불용성 푸른색 착색물이 형성되었다. 분석의 각종 측면은 문헌 [Johnson and Lin, J. Bacteriol. 169:2050 (1987)]에 기재되어 있다.
대장균에서 비특이적 촉매 활성의 정제 및 확인:
실시예 7의 <KLP23/pAH48/pKP32를 사용한 개선된 방법>에 기재한 바와 같이, 전형적인 1,3-프로판디올 생산 운전을 종료한 후에 수거한 세포 상에서, 비특이적 촉매 활성을 대량으로 부분 정제했다. 세포 펠렛 (16 g)을 50 mM Hepes 완충액 (pH 7.5) 20 mL 중에서 세척 및 재현탁했다 (3회). 현탁액 중의 세포를 초음파 처리하여 용해했다. 원심분리 (15분, 20,000 ×g, 10℃)하여 무세포 추출물을 수득하고, 상층액을 얼음 상에서 교반하면서 황산 프로타민 250 mg을 첨가하여 이를 더욱 맑게 했다. 원심분리 (20분, 20,000 ×g, 10℃)로 수득한 상층액을 Hepes 완충액으로 평형화한 슈퍼덱스 (Superdex) (등록상표) 200 제조용 등급 컬럼 (6 ×60 cm)에 통과시켜 분획화했다. 분획물을 각각 10 mL씩 모으고, 각각의 분취액을 10,000 MW 컷오프 센트리콘 (Centricon) (등록상표) 막을 사용하여 25배 농축한 다 음, 천연 겔 활성 염색법으로 분석했다. 분획 107-112에서 비특이적 촉매 활성을 확인하였고, 분획 108-109에서 최고의 활성을 확인했다. 분획 108 및 109의 더 많은 분취액 (각각 7 mL씩)을 50배 농축하여 12-레인의 천연 겔의 모든 레인에 로딩했다. 겔을 반으로 잘라 절반을 데히드로게나제 활성에 대해 염색했는데 비특이적 촉매 활성을 나타내는 짙은 푸른색 밴드가 나타났다. 염색하지 않은 겔을 염색한 겔과 포개 위아래로 배열했고, 비특이적 촉매 활성 밴드에 상응하는 미염색 겔 상의 밴드를 잘랐다. 겔 스트립을 분쇄하고, 분쇄된 입자를 2D-로딩 완충액 0.5 mL 중에 담가 두었다가 95℃로 5분 동안 가열하고, 원심분리로 겔 입자를 제거하여 가용성 단백질을 추출했다. 문헌 [Swiss 2D database (http://www.expasy.ch/ch2d/; Tonella et al. Electrophoresis 19:1960-1971 (1998)]에서 대장균 추출물의 2-차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (2D-PAGE)에 대해 기재한 것과 같은 조건을 사용하여 상층액을 2D-PAGE용 등전점전기이동 (isoelectricfocusing) (IEF) 스트립에 로딩했다. 전기블럿팅을 사용하여 겔을 PVDF 막으로 전달했다. 상기 막을 콜로이달 블루 (Colloidal blue) 겔 염색하여 단백질에 대해 염색했다. 비특이적 촉매 활성을 확인하기 위해 사용한 염색된 블럿을 도 6에 나타냈다. 아미노 말단 펩티드 서열결정을 위한 표준 기술을 이용하여 스팟 (spot)을 확인했다. 옥시도리덕타제 활성을 코딩하는 유일한 단독 스팟 (스팟 A)을 확인했다. 스팟 A (도 6)를 19회 사이클링하여 FASTA 검색 도구로에 의해 옥시도리덕타제 활성을 가질것이라 추정되는 대장균 오픈리딩프레임, yqhD의 아미노-말단과 100％ 동일한 매치를 얻어냈다. yqhD에 의해 코딩되는 단백질에 대한 완전한 아미노산 서열을 서열 57에 나타 냈다; 상응하는 DNA 서열은 서열 58에 나타냈다. yqhD 유전자는 클로스트리듐의 가능한 NADH-의존성 부탄올 데히드로게나제 2 유전자인 adhB와의 서열 동일성이 40％이다.
대장균 KLP23에서 유전자 yqhD의 파괴:
생화학적 분석 및 아미노-말단 서열결정으로 비특이적 촉매 활성이 대장균 ydhD 유전자에 의해 코딩된다는 것이 제안되었다. 기능이 알려져 있지 않은 상기 유전자는 옥시도리덕타제를 코딩할 것이라 추측되며, dhaT 유전자에 의해 코딩되는 시트로박터 프로인디이 및 클렙시엘라 뉴모니아 1,3-프로판디올 데히드로게나제에서도 발견되는 2개의 알콜 데히드로게나제 시그너쳐 (signature)를 함유한다.
이 유전자를 파괴하기 위해서, Taq 중합효소 및 하기의 프라이머를 사용한 PCR에서 대장균 KLP23 (실시예 4) 게놈 DNA로부터의 ydhD 및 830 bp의 5'-플랭킹 DNA 서열 및 906 bp의 3'-플랭킹 DNA 서열을 증폭시켰다:
(서열 59) 5'-GCGGTACCGTTGCTCGACGCTCAGGTTTTCGG-3'
(서열 60) 5'-GCGAGCTCGACGCTTGCCCTGATCGAGTTTTGC-3'
상기 반응을 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 및 72℃에서 3분의 35 사이클을 운전한 후, 마지막 신장은 72℃에서 5분 동안 수행했다. 생성되는 3.7 Kb DNA 단편을 정제하고, SacI 및 KpnI으로 절단하고, 유사하게 절단한 pBluescriptII KS(+) (스트라타진 제품)과 16시간 동안 16℃에서 라이게이션시켰다. 라이게이션된 DNA를 사용하여 대장균 DH5α (Gibco/BRL 제품)를 형질전환하고, 예측되는 플라스미드인 pJSP29를 X-gal (40 ㎍/mL) 및 암피실린 (100 ㎍/mL)을 함유하는 LB 아가 (DIFCO 제품) 상에서 백색 콜로니로 입증된 형질전환체로부터 단리했다. 플라스미드 pJSP29를 AflII 및 NdeI으로 절단하여 363 bp yqhD 유전자 및 46 bp 3'-플랭킹 DNA 서열을 포함하는 409 bp DNA 단편을 유리시켰다. 남아있는 5,350 bp DNA 단편을 정제하고 pLoxKan2 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 제넨코 인터내셔날 제품)로부터의 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 1,374 bp AflII/NdeI DNA 단편과 16시간 동안 16℃에서 라이게이션시켰다. 라이게이션된 DNA를 사용하여 대장균 DH5α를 형질전환하고, 예측되는 플라스미드인 pJSP32-Blue를 카나마이신 (50 ㎍/mL)을 함유하는 LB 아가 배지 상에서 선별된 형질전환체로부터 단리했다. 플라스미드 pJSP32-Blue를 KpnI 및 SacI으로 절단하여 3,865 bp yqhD 파괴 카세트를 정제하고, 유사하게 절단한 pGP704 [Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170:2575-2583 (1988)]과 16시간 동안 16℃에서 라이게이션시켰다. 라이게이션된 DNA를 사용하여 대장균 SY327 [Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170:2575-2583 (1988)]를 형질전환하고, 예측되는 플라스미드인 pJSP32를 카나마이신 (50 ㎍/mL)을 함유하는 LB 아가 배지 상에서 선별된 형질전환체로부터 단리했다. 플라스미드 pJSP32를 사용하여 대장균 KLP23를 형질전환시키고, 카나마이신 (50 pLg/mL)을 함유하는 LB 아가 상에서 형질전환체를 선별했다. 카나마이신-내성 형질전환체 200개를 스크리닝하여, 그 중 2개가 yqhD 유전자가 yqhD 파괴 카세트로 대체되어 생성되는 이중 교차 재조합 사건에 대해 예측되는 암피실린 감수성 표현형임이 입증되었다.
yqhD 유전자 파괴는 상기 2개의 형질전환체로부터 단리한 게놈 DNA를 주형으 로 사용하고, 다음의 프라이머 쌍 세트들을 사용한 PCR로 입증되었다:
세트 #1:
(서열 61) 5'-GCGAGCTCGACGCTTGCCCTGATCGAGTTTTGC-3'
(서열 62) 5'-CAGCTGGCAATTCCGGTTCG-3'
세트 #2:
(서열 63) 5'-CCCAGCTGGCAATTCCGGTTCGCTTGCTGT-3'
(서열 64) 5'-GGCGACCCGACGCTCCAGACGGAAGCTGGT-3'
세트 #3:
(서열 65) 5'-CCGCAAGATTCACGGATGCATCGTGAAGGG-3'
(서열 66) 5'-CGCCTTCTTGACGAGTTCTGAGCGGGA-3'
세트 #4:
(서열 67) 5'-GGAATTCATGAACAACTTTAATCTGCACAC-3'
(서열 68) 5'-GTTTGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGCGGC-3'
상기 반응을 익스팬드 하이 피델러티 폴리머라제 (Expand High Fidelity Polymerase) (베링거 만하임 (Boehringer Manheim) 제품) 또는 Taq 중합효소 (Gibco/BRL 제품)을 함유하는 플라티넘 PCR 슈퍼믹스 (Platinum PCR Supermix)를 사용하여 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 및 72℃에서 2분으로 35 사이클을 운전한 후, 마지막 신장은 72℃에서 5분 동안 수행했다. 생성되는 PCR 생산물을 1.0％ (w/v) 아가로스 중에서의 겔 전기영동으로 분석했다. 상기 결과를 표 8에 요약했으며, 이로써 상기 2개의 형질전환체 모두에서 yqhD 유전자가 파괴되었음이 입증되 었다.
프라이머 세트 예측되는 크기 (bp) 관찰된 크기 (bp)
yqhD 파괴 yqhD 야생형
1 1,200 생산물 없음 약 1,200
2 1,266 생산물 없음 약 1,266
3 2,594 생산물 없음 약 2,594
4 생산물 없음 1,189 약 900

yqhD 파괴로 yqhD의 46 bp 3'-플랭킹 유전자간 DNA 서열을 포함하는 3' 말단이 결실되었다. 상기 결실로 121개 아미노산에 상응하는 363 bp 3' yqhD 코딩 서열이 제거되었다. 정지 코돈은 카나마이신 내성 카세트 내 남아있는 yqhD 코딩 서열의 15 bp 하류에 존재했다.
플라스미드 pAH48 및 pKP32를 사용하여 대장균 KLP23 (yqhD-)를 동시형질전환시키고, 2개 플라스미드 모두를 함유하는 형질전환체를 암피실린 (100 ㎍/mL) 및 스펙티노마이신 (50 ㎍/mL)을 함유하는 LB 아가 상에서 선별했다. 대표적인 형질전환체를 비타민 B12의 존재 또는 부재하의 10 L 발효조 내에서 글루코스를 1,3-프로판디올로 전환하는 능력에 대해 시험했다.
대장균 균주 KLP23/pAH48/pKP32에서 상당량의 1.3-프로판디올 생산에 있어서, yahD의 필요성의 입증:
yqhD 파괴가 1,3-프로판디올 생산에 미치는 영향에 관해 시험하기 위해 대장균 균주 KLP23 (yqhD-)/pAH48/pKP32를 사용하여 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 1,3-프로판디올 생산을 위한 발효를 수행했다.
비특이적 촉매 활성을 녹아웃시킨 대장균 균주 KLP23 (yqhD-/pAH48/pKP32)를 사용한 대표적인 10 L 발효 결과를 표 9에 나타냈다. 유기체의 세포량 및 글리세롤 축정량은 OD550이 30 A를 넘어 (10.4시간) 비타민 B12를 첨가할 때까지 꾸준히 증가했다. 비타민 B12는 10.4시간 째에 8 mg의 농축괴로 첨가한 후에 1.32 mg/시간의 속도로 연속 공급했다. B12를 첨가한 지 4시간 후에, 글루코스 소모 속도가 감소했고, 산소 이용률이 떨어졌으며, 더이상의 광학 밀도 증가는 없었다. 글루코스 발효가 중단되었고, 탱크 내 글루코스 농도는 축적되었다. 얻어진 1,3-프로판디올의 최고 역가는 0.41 g/L였다. 상기 세포의 연속 희석물들을 암피실린 및 스펙티노마이신을 함유하는 아가 플레이트 상에 플레이팅하여 유기체의 생존력을 시험했다. 이 플레이트들을 30℃의 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 상기 플레이트 상에서 대장균 KLP23 (yqhD-)/pAH48/pKP32의 발효물로부터의 살아있는 콜로니는 없었다 (표 11).
반대로, 비타민 B12를 첨가하지 않은 대조구 탱크로부터의 세포 현탁액에서는 글루코스 공급 용액을 모두 첨가하여 10 L 탱크가 꽉 찰 때까지 세포량 및 글리세롤 축정량은 계속 증가했다 (표 10). 상기 발효의 종료시에 세포 현탁액의 연속 희석물들에 의한 아가 플레이트 상에서의 생존력 결정 시험은 살아있는 세포의 개수가 광학 밀도 값으로 추정되는 총 세포 개수와 일치한다는 것을 나타냈다 (표 11).
대장균 균주 KLP23 (yqhD-)/pAH48/pKP32를 사용한 글루코스의 1,3-프로판디올 (1,3-PD)로의 전환 실패에 대한 대표적인 발효 개요
시간 (h) OD550 (AU) DO(％) 글루코스 (g/L) 글리세롤 (g/L) 1,3-PD (g/L)
0 0.4 150 11.3 0.1 0
2.3 3.0 134 10.7 0.13 0
4.3 10.8 85.0 8.2 1.41 0
8.3 23.1 81.8 0.9 10.0 0
16.3 37.2 149 13.1 21.4 0.41
18.3 47.6 149 18.9 21.6 0.39
20.3 39.6 149 24.4 22.3 0.42
23.8 33.6 149 25.4 22.0 0.41

대장균 균주 KLP23 (yqhD-)/pAH48/pKP32를 사용한 글루코스의 글리세롤로의 전환에 대한 대표적인 발효 개요
시간 (h) OD550 (AU) DO(％) 글루코스 (g/L) 글리세롤 (g/L)
0 0.2 148 9.5 0.06
2.2 2.8 128 8.9 0.13
4.2 10.4 58.5 7.0 1.4
8.2 21.6 57.6 2.7 11.2
16.2 76.8 10.7 0 40.5
20.2 117 10.2 0 52.9
23.7 154 8.5 0 63.9
36.2 239 10.1 0.1 122

비타민 B12의 부재 및 존재하에 대장균 균주 KLP23 (yqhD-)/pAH48/pKP32를 사용한 글루코스 발효 종료시 플레이트 상에서의 생존력에 대한 대표적인 발효 개요
비타민 B12 종료시의 시간 (h) OD550 (AU) 살아있는 개수 (cfu/mL)
부재 36.2 239 2.1E11
존재 23.8 33.6 0
존재 23.8 41.2 0



Figure 112002004638962-pct00006



Figure 112002004638962-pct00007

Figure 112002004638962-pct00008


Figure 112002004638962-pct00009
<110>E.I. du Pont de Nemours and Company <120>Improved Process for the Biological Production of 1,3-Propanediol with High Titer <130>BC1020 PCT <140> <141> <150>60/149,534 <151>1999-08-08 <160>68 <170>Microsoft Office 97 <210>1 <211>12145 <212>DNA <213>Klebsiella pneumoniae <400>1 gtcgaccacc acggtggtga ctttaatgcc gctctcatgc agcagctcgg tggcggtctc 60 aaaattcagg atgtcgccgg tatagttttt gataatcagc aagacgcctt cgccgccgtc 120 aatttgcatc gcgcattcaa acattttgtc cggcgtcggc gaggtgaata tttcccccgg 180 acaggcgccg gagagcatgc cctggccgat atagccgcag tgcatcggtt catgtccgct 240 gccgccgccg gagagcaggg ccaccttgcc agccaccggc gcgtcggtgc gggtcacata 300 cagcgggtcc tgatgcaggg tcagctgcgg atgggcttta gccagcccct gtaattgttc 360 attcagtaca tcttcaacac ggttaatcag ctttttcatt attcagtgct ccgttggaga 420 aggttcgatg ccgcctctct gctggcggag gcggtcatcg cgtaggggta tcgtctgacg 480 gtggagcgtg cctggcgata tgatgattct ggctgagcgg acgaaaaaaa gaatgccccg 540 acgatcgggt ttcattacga aacattgctt cctgattttg tttctttatg gaacgttttt 600 gctgaggata tggtgaaaat gcgagctggc gcgctttttt tcttctgcca taagcggcgg 660 tcaggatagc cggcgaagcg ggtgggaaaa aattttttgc tgattttctg ccgactgcgg 720 gagaaaaggc ggtcaaacac ggaggattgt aagggcatta tgcggcaaag gagcggatcg 780 ggatcgcaat cctgacagag actagggttt tttgttccaa tatggaacgt aaaaaattaa 840 cctgtgtttc atatcagaac aaaaaggcga aagatttttt tgttccctgc cggccctaca 900 gtgatcgcac tgctccggta cgctccgttc aggccgcgct tcactggccg gcgcggataa 960 cgccagggct catcatgtct acatgcgcac ttatttgagg gtgaaaggaa tgctaaaagt 1020 tattcaatct ccagccaaat atcttcaggg tcctgatgct gctgttctgt tcggtcaata 1080 tgccaaaaac ctggcggaga gcttcttcgt catcgctgac gatttcgtaa tgaagctggc 1140 gggagagaaa gtggtgaatg gcctgcagag ccacgatatt cgctgccatg cggaacggtt 1200 taacggcgaa tgcagccatg cggaaatcaa ccgtctgatg gcgattttgc aaaaacaggg 1260 ctgccgcggc gtggtcggga tcggcggtgg taaaaccctc gataccgcga aggcgatcgg 1320 ttactaccag aagctgccgg tggtggtgat cccgaccatc gcctcgaccg atgcgccaac 1380 cagcgcgctg tcggtgatct acaccgaagc gggcgagttt gaagagtatc tgatctatcc 1440 gaaaaacccg gatatggtgg 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cgaaaaggaa gctattattc acgccgcccg ggtgaccagc 4020 gggcgggtgc aggagatgtc gcagctgctc aatatcggcc gcaccaccct gtggcgcaaa 4080 atgaagcagt acgatattga cgccagccag ttcaagcgca agcatcaggc ctagtctctt 4140 cgattcgcgc catggagaac agggcatccg acaggcgatt gctgtagcgt ttgagcgcgt 4200 cgcgcagcgg atgcgcgcgg tccatggccg tcagcaggcg ttcgagccga cgggactggg 4260 tgcgcgccac gtgcagctgg gcagaggcga gattcctccc cgggatcacg aactgtttta 4320 acgggccgct ctcggccata ttgcggtcga taagccgctc cagggcggtg atctcctctt 4380 cgccgatcgt ctggctcagg cgggtcaggc cccgcgcatc gctggccagt tcagccccca 4440 gcacgaacag cgtctgctga atatggtgca ggctttcccg cagcccggcg tcgcgggtcg 4500 tggcgtagca gacgcccagc tgggatatca gttcatcgac ggtgccgtag gcctcgacgc 4560 gaatatggtc tttctcgatg cggctgccgc cgtacagggc ggtggtgcct ttatccccgg 4620 tgcgggtata gatacgatac attcagtttc tctcacttaa cggcaggact ttaaccagct 4680 gcccggcgtt ggcgccgagc gtacgcagtt gatcgtcgct atcggtgacg tgtccggtag 4740 ccagcggcgc gtccgccggc agctgggcat gagtgagggc tatctcgccg gacgcgctga 4800 gcccgatacc cacccgcagg ggcgagcttc tggccgccag ggcgcccagc gcagcggcgt 4860 caccgcctcc gtcataggtt atggtctggc aggggacccc ctgctcctcc agcccccagc 4920 acagctcatt gatggcgccg gcatggtgcc cgcgcggatc gtaaaacagg cgtacgcctg 4980 gcggtgaaag cgacatgacg gtcccctcgt taacactcag aatgcctggc ggaaaatcgc 5040 ggcaatctcc tgctcgttgc ctttacgcgg gttcgagaac gcattgccgt cttttagagc 5100 catctccgcc atgtagggga agtcggcctc ttttaccccc agatcgcgca gatgctgcgg 5160 aataccgata tccatcgaca gacgcgtgat agcggcgatg gctttttccg ccgcgtcgag 5220 agtggacagt ccggtgatat tttcgcccat cagttcagcg atatcggcga atttctccgg 5280 gttggcgatc aggttgtagc gcgccacatg cggcagcagg acagcgttgg ccacgccgtg 5340 cggcatgtcg tacaggccgc ccagctggtg cgccatggcg tgcacgtagc cgaggttggc 5400 gttattgaaa gccatcccgg ccagcagaga agcataggcc atgttttccc gcgcctgcag 5460 attgctgccg agggccacgg cctggcgcag gttgcgggcg atgaggcgga tcgcctgcat 5520 ggcggcggcg tccgtcaccg ggttagcgtc tttggagata taggcctcta cggcgtgggt 5580 cagggcatcc atcccggtcg ccgcggtcag ggcggccggt ttaccgatca tcagcagtgg 5640 atcgttgata gagaccgacg gcagtttgcg ccagctgacg atcacaaact tcactttggt 5700 ttcggtgttg gtcaggacgc agtggcgggt gacctcgctg gcggtgccgg cggtggtatt 5760 gaccgcgacg ataggcggca gcgggttggt cagggtctcg attccggcat actggtacag 5820 atcgccctca tgggtggcgg cgatgccgat gcctttgccg caatcgtgcg ggctgccgcc 5880 gcccacggtg acgatgatgt cgcactgttc gcggcgaaac acggcgaggc cgtcgcgcac 5940 gttggtgtct ttcgggttcg gctcgacgcc gtcaaagatc gccacctcga tcccggcctc 6000 ccgcagataa tgcagggttt tgtccaccgc gccatcttta attgcccgca ggcctttgtc 6060 ggtgaccagc agggcttttt tcccccccag cagctggcag cgttcgccga ctacggaaat 6120 ggcgttgggg ccaaaaaagt taacgtttgg caccagataa tcaaacatac gatagctcat 6180 aatatacctt ctcgcttcag gttataatgc ggaaaaacaa tccagggcgc actgggctaa 6240 taattgatcc tgctcgaccg taccgccgct aacgccgacg gcgccaatta cctgctcatt 6300 aaaaataact ggcaggccgc cgccaaaaat aataattcgc tgttggttgg ttagctgcag 6360 accgtacaga gattgtcctg gctggaccgc tgacgtaatt tcatgggtac cttgcttcag 6420 gctgcaggcg ctccaggctt tattcaggga aatatcgcag ctggagacga aggcctcgtc 6480 catccgctgg ataagcagcg tgttgcctcc gcggtcaact acggaaaaca ccaccgccac 6540 gttgatctca gtggcttttt tttccaccgc cgccgccatt tgctgggcgg cggccagggt 6600 gattgtctga acttgttggc tcttgttcat cattctctcc cgcaccagga taacgctggc 6660 gcgaatagtc agtagggggc gatagtaaaa aactattacc attcggttgg cttgctttat 6720 ttttgtcagc gttattttgt cgcccgccat gatttagtca atagggttaa aatagcgtcg 6780 gaaaaacgta attaagggcg ttttttatta attgatttat atcattgcgg gcgatcacat 6840 tttttatttt tgccgccgga gtaaagtttc atagtgaaac tgtcggtaga tttcgtgtgc 6900 caaattgaaa cgaaattaaa tttatttttt tcaccactgg ctcatttaaa gttccgctat 6960 tgccggtaat ggccgggcgg caacgacgct ggcccggcgt attcgctacc gtctgcggat 7020 ttcacctttt gagccgatga acaatgaaaa gatcaaaacg atttgcagta ctggcccagc 7080 gccccgtcaa tcaggacggg ctgattggcg agtggcctga agaggggctg atcgccatgg 7140 acagcccctt tgacccggtc tcttcagtaa aagtggacaa cggtctgatc gtcgaactgg 7200 acggcaaacg ccgggaccag tttgacatga tcgaccgatt tatcgccgat tacgcgatca 7260 acgttgagcg cacagagcag gcaatgcgcc tggaggcggt ggaaatagcc cgtatgctgg 7320 tggatattca cgtcagccgg 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<220> <223>primer <400>3 tggtcgagga tccacttcac ttt 23 <210>4 <211>51 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>4 aaagtgaagt ggatcctcga ccaattggat ggtggcgcag tagcaaacaa t 51 <210>5 <211>23 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>5 ggatcaccgc cgcagaaact acg 23 <210>6 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>6 ctgtcagccg ttaagtgttc ctgtg 25 <210>7 <211>23 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>7 cagttcaacc tgttgatagt acg 23 <210>8 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>8 atgagtcaaa catcaacctt 20 <210>9 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>9 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<211>23 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>16 gcagcatgct ggactggtag tag 23 <210>17 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>17 cagtctagag ttattggcaa acctacc 27 <210>18 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>18 gatgcatgcc cagggcggag acggc 25 <210>19 <211>29 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>19 ctaacgattg ttctctagag aaaatgtcc 29 <210>20 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>20 cacgcatgca gttcaacctg ttgatagtac 30 <210>21 <211>28 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>21 gcgtctagat ccttttaaat taaaaatg 28 <210>22 <211>51 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>22 gcgcggatcc aggagtctag aattatggga ttgactacta aacctctatc t 51 <210>23 <211>36 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>23 gatacgcccg ggttaccatt tcaacagatc gtcctt 36 <210>24 <211>34 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>24 ttgataatat aaccatggct gctgctgctg atag 34 <210>25 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>25 gtatgatatg ttatcttgga tccaataaat ctaatcttc 39 <210>26 <211>24 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>26 catgactagt aaggaggaca attc 24 <210>27 <211>24 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>27 catggaattg tcctccttac 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<223>primer <400>33 ggaattcaga tctcagcaat gagcgagaaa accatgc 37 <210>34 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>34 gctctagatt agcttccttt acgcagc 27 <210>35 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>35 ggccaagctt aaggaggtta attaaatgaa aag 33 <210>36 <211>26 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>36 gctctagatt attcaatggt gtcggg 26 <210>37 <211>42 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>37 gcgccgtcta gaattatgag ctatcgtatg tttgattatc tg 42 <210>38 <211>36 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>38 tctgatacgg gatcctcaga atgcctggcg gaaaat 36 <210>39 <211>18 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: linker <220> <223>linker <400>39 tcgacgaatt caggagga 18 <210>40 <211>18 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: linker <220> <223>linker <400>40 ctagtcctcc tgaattcg 18 <210>41 <211>4549 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: pCL1920 <220> <223>plasmid <400>41 agctcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag 60 attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 120 taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 180 cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 240 tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag 300 ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac ctgcaggcat gcaagcttgg cgtaatcatg 360 gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 420 cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 480 gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 540 cggccaacgc 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gcactactca accccacgat tgaaaaccct acaaggaaag 1440 aacggacggt atcgttcact tataaccaat acgctcagat gatgaacatc agtagggaaa 1500 atgcttatgg tgtattagct aaagcaacca gagagctgat gacgagaact gtggaaatca 1560 ggaatccttt ggttaaaggc tttgagattt tccagtggac aaactatgcc aagttctcaa 1620 gcgaaaaatt agaattagtt tttagtgaag agatattgcc ttatcttttc cagttaaaaa 1680 aattcataaa atataatctg gaacatgtta agtcttttga aaacaaatac tctatgagga 1740 tttatgagtg gttattaaaa gaactaacac aaaagaaaac tcacaaggca aatatagaga 1800 ttagccttga tgaatttaag ttcatgttaa tgcttgaaaa taactaccat gagtttaaaa 1860 ggcttaacca atgggttttg aaaccaataa gtaaagattt aaacacttac agcaatatga 1920 aattggtggt tgataagcga ggccgcccga ctgatacgtt gattttccaa gttgaactag 1980 atagacaaat ggatctcgta accgaacttg agaacaacca gataaaaatg aatggtgaca 2040 aaataccaac aaccattaca tcagattcct acctacataa cggactaaga aaaacactac 2100 acgatgcttt aactgcaaaa attcagctca ccagttttga ggcaaaattt ttgagtgaca 2160 tgcaaagtaa gtatgatctc aatggttcgt tctcatggct cacgcaaaaa caacgaacca 2220 cactagagaa catactggct aaatacggaa ggatctgagg ttcttatggc tcttgtatct 2280 atcagtgaag catcaagact aacaaacaaa agtagaacaa ctgttcaccg ttacatatca 2340 aagggaaaac tgtccatatg cacagatgaa aacggtgtaa aaaagataga tacatcagag 2400 cttttacgag tttttggtgc attcaaagct gttcaccatg aacagatcga caatgtaaca 2460 gatgaacagc atgtaacacc taatagaaca ggtgaaacca gtaaaacaaa gcaactagaa 2520 catgaaattg aacacctgag acaacttgtt acagctcaac agtcacacat agacagcctg 2580 aaacaggcga tgctgcttat cgaatcaaag ctgccgacaa cacgggagcc agtgacgcct 2640 cccgtgggga aaaaatcatg gcaattctgg aagaaatagc gctttcagcc ggcaaaccgg 2700 ctgaagccgg atctgcgatt ctgataacaa actagcaaca ccagaacagc ccgtttgcgg 2760 gcagcaaaac ccgtgggaat taattcccct gctcgcgcag gctgggtgcc aagctctcgg 2820 gtaacatcaa ggcccgatcc ttggagccct tgccctcccg cacgatgatc gtgccgtgat 2880 cgaaatccag atccttgacc cgcagttgca aaccctcact gatccgcatg cccgttccat 2940 acagaagctg ggcgaacaaa cgatgctcgc cttccagaaa accgaggatg cgaaccactt 3000 catccggggt cagcaccacc ggcaagcgcc gcgacggccg aggtcttccg atctcctgaa 3060 gccagggcag atccgtgcac 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gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg 3960 aggaactctt tgatccggtt cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa 4020 cgctatggaa ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt 4080 cccgcatttg gtacagcgca gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact 4140 gggcaatgga gcgcctgccg gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct agacaggctt 4200 atcttggaca agaagaagat cgcttggcct cgcgcgcaga tcagttggaa gaatttgtcc 4260 actacgtgaa aggcgagatc accaaggtag tcggcaaata atgtctaaca attcgttcaa 4320 gccgacgccg cttcgcggcg cggcttaact caagcgttag atgcactaag cacataattg 4380 ctcacagcca aactatcagg tcaagtctgc ttttattatt tttaagcgtg cataataagc 4440 cctacacaaa ttgggagata tatcatgaaa ggctggcttt ttcttgttat cgcaatagtt 4500 ggcgaagtaa tcgcaacatc cgcattaaaa tctagcgagg gctttacta 4549 <210>42 <211>199 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: glucose isomerase promoter <220> <223>promoter <400>42 gaattcacta gtcgatctgt gctgtttgcc acggtatgca gcaccagcgc gagattatgg 60 gctcgcacgc tcgactgtcg gacgggggca ctggaacgag aagtcaggcg agccgtcacg 120 cccttgacaa tgccacatcc tgagcaaata attcaaccac taaacaaatc aaccgcgttt 180 cccggaggta accaagctt 199 <210>43 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>43 gacgcaacag tattccgtcg c 21 <210>44 <211>42 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>44 atgagctatc gtatgttccg ccaggcattc tgagtgttaa cg 42 <210>45 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>45 gcctggcgga acatacgata gctcataata tac 33 <210>46 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <400>46 cggggcgctg ggccagtact g 21 <210>47 <211>28 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence: primer <220> <223>primer <220> <223>primer <400>47 tcaaacccgg tggtttctcg cgaccggg 28 <210>48 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gggtgagatc atcagattcg gtcaaatgtt tttcccagaa 960 tctagagaag aaacatacta ccaagagtct gctggtgttg ctgatttgat caccacctgc 1020 gctggtggta gaaacgtcaa ggttgctagg ctaatggcta cttctggtaa ggacgcctgg 1080 gaatgtgaaa aggagttgtt gaatggccaa tccgctcaag gtttaattac ctgcaaagaa 1140 gttcacgaat ggttggaaac atgtggctct gtcgaagact tcccattatt tgaagccgta 1200 taccaaatcg tttacaacaa ctacccaatg aagaacctgc cggacatgat tgaagaatta 1260 gatctacatg aagattagat ttattggaga aagataacat atcatacttc ccccactttt 1320 ttcgaggctc ttctatatca tattcataaa ttagcattat gtcatttctc ataactactt 1380 <210>54 <211>391 <212>PRT <213>Saccharomyces cerevisiae <400>54 Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn 1 5 10 15 Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu 20 25 30 Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr 35 40 45 Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe 50 55 60 Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu 85 90 95 Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile 100 105 110 Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln 115 120 125 Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His 130 135 140 Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly 145 150 155 160 Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys 165 170 175 Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His 180 185 190 Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly 195 200 205 Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg 210 215 220 Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile 225 230 235 240 Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu 245 250 255 Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly 260 265 270 Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg 275 280 285 Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr 290 295 300 Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr 305 310 315 320 Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln 325 330 335 Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu 340 345 350 Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln 355 360 365 Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu 370 375 380 Glu Leu Asp Leu His Glu Asp 385 390 <210>55 <211>753 <212>DNA <213>Saccharomyces cerevisiae <400>55 atgggattga ctactaaacc tctatctttg aaagttaacg ccgctttgtt cgacgtcgac 60 ggtaccatta tcatctctca accagccatt gctgcattct ggagggattt cggtaaggac 120 aaaccttatt tcgatgctga acacgttatc caagtctcgc atggttggag aacgtttgat 180 gccattgcta agttcgctcc agactttgcc aatgaagagt atgttaacaa attagaagct 240 gaaattccgg tcaagtacgg tgaaaaatcc attgaagtcc caggtgcagt taagctgtgc 300 aacgctttga acgctctacc aaaagagaaa tgggctgtgg caacttccgg tacccgtgat 360 atggcacaaa aatggttcga gcatctggga atcaggagac 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Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Gln Lys Trp Phe Glu His 115 120 125 Leu Gly Ile Arg Arg Pro Lys Tyr Phe Ile Thr Ala Asn Asp Val Lys 130 135 140 Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys Gly Arg Asn Gly Leu 145 150 155 160 Gly Tyr Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Lys Val Val Val 165 170 175 Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys 180 185 190 Lys Ile Ile Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu Lys Glu 195 200 205 Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu Ser Ile Arg Val Gly 210 215 220 Gly Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Phe Ile Phe Asp Asp Tyr 225 230 235 240 Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp 245 250 <210> 57 <211> 387 <212> PRT <213> E. coli <400> 57 Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val 20 25 30 Leu Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Ser Val Lys Lys Thr Gly Val Leu Asp 35 40 45 Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly 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270 Leu Thr Ala Met His Gly Leu Asp His Ala Gln Thr Leu Ala Ile Val 275 280 285 Leu Pro Ala Leu Trp Asn Glu Lys Arg Asp Thr Lys Arg Ala Lys Leu 290 295 300 Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Val Trp Asn Ile Thr Glu Gly Ser Asp Asp 305 310 315 320 Glu Arg Ile Asp Ala Ala Ile Ala Ala Thr Arg Asn Phe Phe Glu Gln 325 330 335 Leu Gly Val Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Gly Leu Asp Gly Ser Ser 340 345 350 Ile Pro Ala Leu Leu Lys Lys Leu Glu Glu His Gly Met Thr Gln Leu 355 360 365 Gly Glu Asn His Asp Ile Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Ile Tyr Glu 370 375 380 Ala Ala Arg 385 <210> 58 <211> 1164 <212> DNA <213> E. coli <400> 58 atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60 ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 120 gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180 gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240 gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 300 accaaattta tcgccgcagc ggctaactat 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Claims (29)

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  7. (a) 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상;
    (b) 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 유전자 1종 이상; 및
    (c) (1) 서열 57의 아미노산 서열 또는 그의 보존적 서열 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 단편, 또는 상기 핵산 단편에 상보적인 단리된 핵산 단편, 및
    (2) 서열 58의 단리된 핵산 단편
    으로 구성된 군에서 선택되는, 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환하는 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상
    을 포함하고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제를 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는, 시트로박터 (Citrobacter), 엔테로박터 (Enterobacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 클렙시엘라 (Klebsiella), 에어로박터 (Aerobacter), 락토바실러스 (Lactobacillus), 아스페르길러스 (Aspergillus), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 지고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 피치아 (Pichia), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 무코르 (Mucor), 토룰로프시스 (Torulopsis), 메틸로박터 (Methylobacter), 살모넬라 (Salmonella), 바실러스 (Bacillus), 에어로박터 (Aerobacter), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 및 슈도모나스 (Pseudomonas)로 구성된 군에서 선택된, 1,3-프로판디올 생산에 유용한 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서,
    (a) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, 및
    (b) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상
    을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 데히드라타제 재활성화 인자가 dha 레귤론에서 단리한 orfX 및 orfZ에 의해 코딩되는 것인 재조합 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 orfX 및 orfZ가 클렙시엘라 종, 시트로박터 종, 또는 클로스트리듐 종에서 독립적으로 단리된 것인 재조합 미생물.
  11. 제8항에 있어서,
    (a) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 유전자,
    (b) 글리세롤 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 유전자, 및
    (c) 트리오스포스페이트 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 제3 유전자
    로 구성되고, 각각의 유전자가 상기 유전자를 불활성화시키는 돌연변이를 갖는 내인성 유전자 세트를 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  12. 제8항 또는 제11항에 있어서, 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 1-탄소 기질로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원을 1,3-프로판디올로 전환하는 재조합 미생물.
  13. 제7항에 있어서, 글리세롤 및 디히드록시아세톤으로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원을 1,3-프로판디올로 전환하는 재조합 미생물.
  14. 제8항 또는 제11항에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 GPD1, GPD2, GPD3, DAR1, gpsA, GUT2, glpD, 및 glpABC로 구성된 군에서 선택된 것인 재조합 미생물.
  15. 제8항 또는 제11항에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 GPP1 및 GPP2로 구성된 군에서 선택된 것인 재조합 미생물.
  16. 제7항, 제8항 또는 제11항에 있어서, 상기 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 유전자 및 디올 데히드라타제를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 것인 재조합 미생물.
  17. 제7항, 제8항 또는 제11항에 있어서, 상기 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 클렙시엘라 종, 시트로박터 종, 또는 클로스트리듐 종에서 단리된 것인 재조합 미생물.
  18. (a) (i) 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (ii) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (iii) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, 및 (iv) 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 유전자 1종 이상
    으로 구성된 외인성 유전자 세트; 및
    (b) (1) 서열 57의 아미노산 서열 또는 그의 보존적 서열 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 단편, 또는 상기 핵산 단편에 상보적인 단리된 핵산 단편, 및
    (2) 서열 58의 단리된 핵산 단편
    으로 구성된 군에서 선택되는, 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환하는 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자 1종 이상
    을 포함하고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는 재조합 대장균.
  19. (a) (i) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (ii) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, 및 (iii) dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 orfZ의 유전자 생산물을 코딩하는 유전자 서브세트 1종 이상
    으로 구성된 외인성 유전자 세트; 및
    (b) (1) 서열 57의 아미노산 서열 또는 그의 보존적 서열 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 단편, 또는 상기 핵산 단편에 상보적인 단리된 핵산 단편, 및
    (2) 서열 58의 단리된 핵산 단편
    으로 구성된 군에서 선택되는, 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환하는 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자 1종 이상
    을 포함하고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는 재조합 대장균.
  20. 제19항에 있어서,
    (a) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자,
    (b) 글리세롤 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및
    (c) 트리오스포스페이트 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자
    로 구성되고, 각각의 유전자가 상기 유전자를 불활성화시키는 돌연변이를 갖 는 내인성 유전자 세트를 추가로 포함하는 재조합 대장균.
  21. (a) 적합한 조건하에, 제19항 또는 제20항의 재조합 대장균을 단당류, 올리고당류, 다당류 및 1-탄소 기질로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원 1종 이상과 접촉시켜 1,3-프로판디올을 생산하는 단계, 및
    (b) 경우에 따라, 단계 (a)에서 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계
    를 포함하는, 1,3-프로판디올의 생물학적 생산 방법.
  22. (a) 제19항 또는 제20항의 재조합 대장균을, 또는
    (i) 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상,
    (ii) 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상, 및
    (iii) (1) 서열 57의 아미노산 서열 또는 그의 보존적 서열 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 단편, 또는 상기 핵산 단편에 상보적인 단리된 핵산 단편, 및
    (2) 서열 58의 단리된 핵산 단편
    으로 구성된 군에서 선택되는, 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환하는 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자 1종 이상
    을 추가로 포함하는 제19항 또는 제20항의 재조합 대장균을, 글리세롤 및 디히드록시아세톤으로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원 1종 이상과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 경우에 따라, 단계 (a)에서 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계
    를 포함하는, 1,3-프로판디올의 생물학적 생산 방법.
  23. (a) (i) 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상,
    (ii) 데히드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상, 및
    (iii) (1) 서열 57의 아미노산 서열 또는 그의 보존적 서열 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 단편, 또는 상기 핵산 단편에 상보적인 단리된 핵산 단편, 및
    (2) 서열 58의 단리된 핵산 단편
    으로 구성된 군에서 선택되는, 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환하는 비특이적 촉매 활성을 코딩하는 내인성 유전자 1종 이상
    을 포함하고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는 재조합 대장균을, 글리세롤 및 디히드록시아세톤으로 구성된 군에서 선택된 제1 탄소 공급원, 및 단당류, 올리고당류, 다당류 및 1-탄소 기질로 구성된 군에서 선택된 제2 탄소 공급원과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 경우에 따라, 단계 (a)에서 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계
    를 포함하는, 1,3-프로판디올의 생산 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 재조합 대장균이
    (a) (i) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, (ii) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 1종 이상, 및 (iii) dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 orfZ의 유전자 생산물을 코딩하는 유전자 서브세트 1종 이상으로 구성된 외인성 유전자 세트, 및
    (b) (i) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, (ii) 글리세롤 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 (iii) 트리오스포스페이트 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 구성되고, 각각의 유전자가 상기 유전자를 불활성화시키는 돌연변이를 갖는 내인성 유전자 세트
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  25. 서열 1에 기재된 dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 orfZ의 유전자 세트를 포함하는 벡터 pDT29.
  26. 서열 1에 기재된 dhaR, orfY, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 orfZ의 유전자 세트를 포함하는 벡터 pKP32.
  27. (a) (i) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 (ii) 글리세롤 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 구성되고, 각각의 유전자가 상기 유전자를 불활성화시키는 돌연변이를 갖는 내인성 유전자 2종의 세트,
    (b) 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상,
    (c) 글리세롤-3-포스파타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자 1종 이상, 및
    (d) 제26항에서 정의된 플라스미드 pKP32
    를 포함하는 재조합 대장균 균주.
  28. (i) 글리세롤 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, (ii) 글리세롤 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 (iii) 트리오스포스페이트 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 구성되고, 각각의 유전자가 상기 유전자를 불활성화시키는 돌연변이를 갖는 내인성 유전자 3종의 세트를 포함하는 재조합 대장균 균주.
  29. (a) 적합한 조건하에, dha 레귤론을 포함하고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 코딩하는 기능적 dhaT 유전자는 없는 재조합 대장균을 단당류, 올리고당류, 다당류 및 1-탄소 기질로 구성된 군에서 선택된 탄소 공급원 1종 이상과 접촉시키는 단계, 및
    (b) 경우에 따라, 단계 (a)에서 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계
    를 포함하는, 1,3-프로판디올의 생산 방법.
KR1020027002027A 1999-08-18 2000-08-18 1,3-프로판디올을 높은 역가로 생물학적으로 생산하는 방법 KR100785997B1 (ko)

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