KR20190052927A

KR20190052927A - 포도당으로부터 1,3-프로판디올를 생산하는 신규한 크렙시엘라 뉴모니아 균주 및 이를 이용한 1,3 프로판디올의 생산방법

Info

Publication number: KR20190052927A
Application number: KR1020170148780A
Authority: KR
Inventors: 박성훈; 설은희; 수만라마; 박종명; 라트나싱
Original assignee: 지에스칼텍스 주식회사; 울산과학기술원
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2019-05-17
Also published as: KR101994772B1

Abstract

본 발명은 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 생산할 수 있는 신규한 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주 및 이를 이용하여 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 야생형 크렙시엘라 뉴모니아 J2B 균주는 포도당으로부터 글리세롤이나 1,3-프로판디올을 전혀 생산하지 못하였지만, 본 발명의 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주는 포도당으로부터 최대 0.82 mol/mol 의 수율로 1,3-프로판디올을 생산할 수 있다. 본 발명의 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주는 배지 내 고가의 비타민 B12 첨가 없이도 1,3-프로판디올을 생산할 수 있어 1,3-프로판디올을 경제적인 생산에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

포도당으로부터 1,3-프로판디올를 생산하는 신규한 크렙시엘라 뉴모니아 균주 및 이를 이용한 1,3 프로판디올의 생산방법{NEW KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAIN FOR PRODUCTION OF 1,3-PROPANEDIOL FROM GLUCOSE AND METHOD FOR PRODING 1,3-PROPANEDIOL USING THE SAME}

본 발명은 포도당으로부터 1,3-프로판디올(1,3-propanediol; 1,3-PDO)을 생산하기 위하여 개발한 유전자 변형 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 균주 및 이를 이용하여 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

글리세롤로부터 1,3-프로판디올를 생산할 수 있는 미생물로는 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 크렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca), 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 클로스트라디움 뷰티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트라디움 디올리스(C. diolis), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 시트로박터 아말로나티쿠스(C. amalonaticus)와 같은 것들이 알려져 있다. 이러한 미생물은 NAD(P)H의 산화와 NAD(P)+의 재생을 통해 글리세롤을 1,3-PDO로 전환시키며, 동시에 세포 성장을 위한 글리세롤의 동화작용을 필요로 한다(도 1 참조).

1,3-프로판디올 생산(환원성 경로)이 진행되는 동안, 글리세롤은 조효소 B12-의존성 글리세롤 탈수효소인 GDHt(DhaB, GdrAB)에 의해 3-하이드록시프로피온 알데히드(3-HPA)로 먼저 탈수되고, 이어서 1,3-PDO 산화환원효소 (DhaT) 및/또는 NADPH-의존성 비특이적 알코올 탈수소 효소(YqhD)에 의해 1,3-PDO로 환원된다. 글리세롤이 세포 성장(산화적 경로)을 위해 대사될 때, 글리세롤은 호흡경로 (FAD+-의존성 글리세롤-3-인산탈수효소 (GPD), GlpD/GlpABC) 및/또는 발효경로(NAD+-의존성 글리세롤 탈수소효소, DhaD/GldA 및 디히드록시아세톤 키나아제, DhaKLM)에 의해 디히드록시아세톤- 3-인산으로 산화되고, 이어서 피루브산으로 전환된다.

현재, 자연적으로 포도당으로부터 1,3-프로판디올를 생산할 수 있다고 알려진 미생물은 없다. 그러나 듀폰(Dupont, 미국)은 대장균을 개량하여 포도당으로부터 1,3-프로판디올의 생물학적 생산을 성공적으로 수행하였고 또 상업화하였다. 가장 중요한 유전적 변형은 (1) 해당경로로부터 글리세롤을 합성하는데 필수적인 두 가지 효소, 즉 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 유래한 NADH-의존성 GPD(글리세롤-3-인산 탈수소효소) 및 GPP(글리세롤-3-인산 포스파타아제)의 발현, (2) 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생산하는데 필요한 두 가지 효소, 즉 글리세롤 디하이드라테이즈(glycerol dehydratase; 주로 K. pneumoniae 유래의 DhaB) 와 1,3-PDO oxidoreductase(주로 K. pneumoniae 유래의 DhaT 또는 E. coli 유래의 YqhD)의 발현이라 할 수 있다. 또한 이 균주는 조효소 B12의 막 수송 개선을 비롯하여 1,3-프로판디올 생산으로 탄소 흐름 재조정, 주요 효소의 발현 조정을 통한 균형 발현, 그리고 산화환원 및 에너지 요구량을 최소화하기 위한 변형 등, 미생물 대사 전반에 광범위한 변형이 이루어졌다. 결과적으로, 높은 농도의 1,3-프로판디올 (135 g/L) 생산을 생산했다.

하지만, 듀폰에 의해 포도당으로부터 1,3-프로판디올 생산은 성공적으로 확립되었지만 자세한 기술의 세부사항은 밝혀지지 않았다. 게다가 균주 및 공정에 대한 광범위한 특허는 과학계가 포도당으로부터 1,3-프로판디올 생산을 연구하는 것에 대해 의지를 상실시켰다. 듀폰의 한국등록특허 제10-525325호 ‘단일미생물에 의한 발효가능한 탄소원의 1,3-프로판디올로의 생물전환’에서는 데히드라타제 효소(EC4.2.1-)를 발현할 수 있는 유전자를 갖는 대장균과 같은 단일 미생물을 이용하여 탄소원을 1,3-프로판디올로 생물전환시키는 방법을 개시하고 있다. 또한, 한국등록특허 제10-0785997호 '1,3-프로판디올을 높은 역가로 생물학적으로 생산하는 방법'에서는 클렙시엘라 뉴모니아 dha 레귤론 유전자를 사용하여 형질전환시킨 대장균을 사용하여 탄소 공급원으로부터 1,3-프로판디올을 생물학적으로 생산하는 개선된 방법을 개시하고 있다.

한편, 리그노셀룰로오스 바이오매스로부터 얻어진 탄소원의 사용수요 증가 및 비싼 코엔자임 B12를 첨가하지 않아도 된다는 점을 고려하면, B12를 천연으로 생산할 수 있는 균주를 이용하여 포도당으로부터 1,3-PDO를 생산하는 것은 중요한 연구라 할 수 있다.

크렙시엘라 뉴모니아는 대장균을 능가하는 몇 가지 장점을 가지고 있다. 우선, B12 및 글리세롤로부터 1,3-프로판디올를 자연적으로 생산할 수 있다. 또한, 대장균에 적용되는 대부분의 유전자 툴박스를 큰 변형 없이 적용할 수 있다. 본 발명에 사용된 크렙시엘라 뉴모니아(K. pneumoniae) J2B는 본 연구실에서 분리한 것으로 다른 K. pneumoniae 균주들에 비해 LPS 합성이 낮을 뿐 아니라 병원성의 성질이 높지 않다.

본 발명은 고가의 비타민 B12를 자체적으로 생산할 수 있는 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) J2B 균주를 이용하여 포도당으로부터 1,3-프로판디올(1,3-propanediol; 1,3-PDO)을 생산하는 능력을 갖는 Klebsiella pneumoniae J2B 변이 균주 및 상기 균주를 배양하여 1,3-프로판디올을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 다양한 유전자를 결실시키거나 새로운 유전자를 도입하고 증폭시키는 대사공학(Metabolic engineering)적 방법을 통해 얻어진 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 J2B 균주를 제공한다.

바람직하게는, a) 효모 유래 gpd1 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 gpp2 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, b) 글리세롤 분해경로가 결실된, 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 생산하기 위한 재조합 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 균주를 제공한다.

또한 바람직하게는, 상기 균주는 LPS 생산이 낮고 배양 후 발효액과 잘 분리되는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 균주는 글리세롤을 생산하는 효모 유래 GPD 및 GPP 효소를 발현하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 gpd1 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 gpp2 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또한, 상기 글리세롤 분해 경로의 결실은 글리세롤을 글리세롤-3-포스페이트로 전환시키는 글리세롤-3-포스페이트 키나아제(GlpK)를 암호화하는 glpK 유전자, 및 글리세롤을 디하이드록시아세톤으로 전환시키는 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나아제(DhaD)를 암호화하는 dhaD 유전자를 개별적으로 또는 동시에 결실시킨 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 dhaB 유전자, gdrA 유전자, gdrB 유전자 및 dhaT 유전자는 크렙시엘라 뉴모니아 J2B 균주(KCCM11213P)에서 유래된 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 dhaB1 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 dhaB2 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 dhaB3 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 gdrA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 gdrB 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 dhaT 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주를 배양하여 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 포도당으로부터 1,3-프로판디올(1,3-propanediol; 1,3-PDO)를 생산하는 능력을 갖는 유전자 변형 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) J2B 균주에 관한 것으로서, 1,3-프로판디올 생산이나 부산물 생산과 관련된 경로의 유전자를 제거하거나 새로 도입하고 증폭하는 등 대사공학 기술을 이용하여 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 생산할 수 있는 유전자 재조합 (Klebsiella pneumoniae) J2B 균주를 제공한다. 야생형 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) J2B 균주는 포도당으로부터 글리세롤이나 1,3-프로판디올을 전혀 생산하지 못하는데 반해, 본 발명에서 유전자 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 J2B 균주는 포도당으로부터 최대 0.82 mol/mol 의 수율로 1,3-프로판디올을 생산할 수 있다. 본 발명의 유전자 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 J2B 균주는 배지 내 고가의 비타민 B12 첨가 없이도 1,3-프로판디올을 생산할 수 있어, 1,3-프로판디올의 경제적인 생산에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 크렙시엘라 뉴모니아의 포도당 대사경로 및 포도당으로부터 글리세롤 및 1,3-PDO 생산을 위한 반응경로를 보여준다:
도 2 (A)는 GPD1, GPP2 효소의 발현 및 발현 균주를 이용한 발효 프로파일을 보여준다. 특히 크렙시엘라 뉴모니아 J2B에서 GPD1, GPP2 효소의 발현을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 보여준다: lane 1, marker; lane 2, J2B 균주의 세포 파쇄액; lane 3, GPD1/GPP2가 발현된 J2B-1의 세포 파쇄액.
도 2 (B)는 GPD1, GPP2 효소의 발현 및 발현 균주를 이용한 발효 프로파일을 보여준다. 특히 GPD/GPP 과발현 균주 (J2B-1)의 세포 성장 및 생산 프로파일을 보여준다. 세포 성장 (○), 포도당(▼), 글리세롤 (△), 1,3-PDO (□), 2,3-BDO (■), 아세트산 (●), pH (×).
도 2 (C)는 GPD1, GPP2 효소의 발현 및 발현 균주를 이용한 발효 프로파일을 보여준다. 특히 글리세롤 산화 경로의 결실에 따른 J2B-1, J2B1-1, J2B2-1, J2B3-1 및 J2B4-1 균주의 글리세롤과 1,3-PDO 생산 수율 변화를 보여준다.
도 2 (D)는 GPD1, GPP2 효소의 발현 및 발현 균주를 이용한 발효 프로파일을 보여준다. 특히 J2B3-1 균주의 폭기 조건에 따른 글리세롤 및 1,3-PDO 생산 수율 변화를 보여준다.
도 3 (A)은 호기 조건에서 J2B3-1 균주의 세포성장, 글리세롤 및 1,3-PDO 생산과 그 밖의 대사산물 생산 프로파일을 보여준다. 세포 성장(○), 포도당(▼), 글리세롤(△), 1,3-PDO(□), 2,3-BDO(■), 아세트산(●), pH (×).
도 3 (B)는 미호기 타입 I 조건에서 J2B3-1 균주의 세포성장, 글리세롤 및 1,3-PDO 생산과 그 밖의 대사산물 생산 프로파일을 보여준다. 이때 배양 부피는 50 ml이다. 세포 성장(○), 포도당(▼), 글리세롤(△), 1,3-PDO(□), 2,3-BDO(■), 아세트산(●), pH (×).
도 3 (C)는 미호기 타입 II 조건에서 J2B3-1 균주의 세포성장, 글리세롤 및 1,3-PDO 생산과 그 밖의 대사산물 생산 프로파일을 보여준다. 이때 배양 부피는 100 ml이다. 세포 성장(○), 포도당(▼), 글리세롤(△), 1,3-PDO(□), 2,3-BDO(■), 아세트산(●), pH (×).
도 3 (D)는 혐기 조건에서 J2B3-1 균주의 세포성장, 글리세롤 및 1,3-PDO 생산과 그 밖의 대사산물 생산 프로파일을 보여준다. 세포 성장(○), 포도당(▼), 글리세롤(△), 1,3-PDO(□), 2,3-BDO(■), 아세트산(●), pH (×).
도 4(A)는 IPTG 농도 변화에 따른 글리세롤과 1,3-PDO 생산 수율 변화 및 GPD 활성 변화를 보여준다.
도 4(B)는 서로 다른 동종 효소의 사용에 따른 수율 변화를 나타낸다. J2B3-1 (gpd1, gpp2 발현), J2B3-2 (gpd1, gpp1 발현), J2B3-3 (gpd2, gpp1 발현).
도 5 (A)는 1,3-PDO 생산에 관여하는 주요 효소들의 전사 수준 및 효소 활성을 탄소원의 종류에 따라 조사한 결과로, RT-PCR를 이용한 주요 효소의 전사 수준 변화를 보여준다.
도 5 (B)는 1,3-PDO 생산에 관여하는 주요 효소들의 전사 수준 및 효소 활성을 탄소원의 종류에 따라 조사한 결과로, 배양에 사용된 탄소원의 종류에 따른 DhaB, DhaT 활성 변화를 보여준다.
도 6 (A)는 DhaB 및 DhaT의 과발현이 글리세롤 및 1,3-PDO 생산 수율(에 미치는 영향을 보여준다. K. pneumoniae J2B3-1(GPD/GPP만 발현), J2B3-4(GPD/GPP와 DhaB 추가발현), J2B3-5(GPD/GPP와 DhaB, DhaT 추가발현), J2B3-6(GPD/GPP와 DhaT 추가발현).
도 6 (B)는 DhaB 및 DhaT의 과발현이 대사산물 생산(B)에 미치는 영향을 보여준다. K. pneumoniae J2B3-1(GPD/GPP만 발현), J2B3-4(GPD/GPP와 DhaB 추가발현), J2B3-5(GPD/GPP와 DhaB, DhaT 추가발현), J2B3-6(GPD/GPP와 DhaT 추가발현).
도 7은 GPD, GPP의 구성적 발현을 최적화하기 위해 개발된 다양한 프로모터와 이들 프로모터의 세기를 GFP로 측정한 결과를 보여준다.
도 8 (A)는 DhaB의 추가발현 균주(J2B3-8)의 DhaB 및 DhaT 발현 및 발현 세기에 따른 글리세롤 및 1,3-PDO 생산 수율을 보여준다.
도 8 (B)는 DhaT의 추가발현 균주(J2B3-9)의 DhaB 및 DhaT 발현 및 발현 세기에 따른 글리세롤 및 1,3-PDO 생산 수율을 보여준다.
도 8 (C)는 DhaB, DhaT의 동시 추가발현 균주(J2B3-10)의 DhaB 및 DhaT 발현 및 발현 세기에 따른 글리세롤 및 1,3-PDO 생산 수율을 보여준다.
도 9 (a)는 pQE80L 벡터에 카나마이신 저항 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터 pQE80LK의 모식도이다.
도 9 (b)는 pQE80LK에 GPD1 및 GPP2 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터 pD1P2 의 모식도이다.
도 9 (c)는 pQE80LK에 GPD1, GPP2 및 DahT 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터 pD1P2T의 모식도이다.
도 9 (d)는 pQE80LK에 DahT 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터 pT의 모식도이다.
도 9 (e)는 pDK7(p15A)에 dhaB 및 gdrAB 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터 pBG의 모식도이다.
도 9 (f)는 pCDF에 GPD1 및 GPP2 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터 pSP10D1P2의 모식도이다.

본 발명은 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 생산하기 위한 재조합 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 균주를 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 ‘크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)’는 폐렴간균으로 그람음성이며 운동성이 없고 유당 발효를 하는 조건적 혐기성 균주이다.

본 발명에서 야생균주로 사용된 ‘크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) J2B’는 본 연구실에서 분리한 것으로서, 다른 K. pneumoniae 균주들에 비해 LPS 합성이 낮을 뿐 아니라 병원성의 성질이 높지 않다. 상기 균주는 본 발명자들의 선행특허인 한국 공개특허 제10-2013-0095395에 개시된 방법으로 분리될 수 있고, 그람음성의 통성 혐기균으로서, 한국미생물보존센터(국외)에 2011.10.14자로 기탁(기탁번호:KCCM11213P)되어 있다.

본 발명에서 사용된 용어 ‘결실’은 유전자가 염색체상 또는 플라스미드 상에서 삭제되어 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 생산할 수 없게된 상태를 의미한다.

본 발명에 유전자를 숙주세포의 염색체 상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자 조작방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에서 사용한 약어는 하기와 같다.

GLC, 포도당(glucose);

G6P, 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate);

DHAP, 디하이드록시아세톤 포스페이트(dihydroxyacetone phosphate);

G3P, 글리세롤-3-포스페이트(glycerol-3-phosphate); GLY, 글리세롤(glycerol);

DHA, 디하이드록시아세톤(dihydroxyacetone);

3-HPA, 3-하이드록시프로피온알데히드(3-hydroxypropionaldehyde); 1,3-PDO,

1,3-프로판디올(1,3-propanediol);

B12, 코엔자임B12(coenzyme B12);

GPD1, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase);

GPP2, 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제(glycerol-3-phosphate phosphatase);

GlpD/GlpABC, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase);

GlpK, 글리세롤 키나제(glycerol kinase);

DhaD/GldA, 글리세롤 디하이드로게나제(glycerol dehydrogenase);

DhaK/DhaKLM, 디하이드록시아세톤 키나제(dihydroxyacetone kinase);

GlpF1/GlpF2, 글리세롤 트랜스포터(glycerol transporter);

DhaB, 글리세롤 디하이드레이트(glycerol dehydratase);

DhaT, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase);

YqhD, 알코올 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase).

도 1은 크렙시엘라 뉴모니아의 포도당 대사경로 및 포도당으로부터 글리세롤 및 1,3-PDO 생산을 위한 반응경로를 보여준다.

글리세롤에서 1,3-프로판디올 생산에 필수적인 코엔자임 B12의 외부 공급 없이 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 생산하기 위해 크렙시엘라 뉴모니아 균주를 호스트로 사용하였다. 본 발명에 사용된 호스트 크렙시엘라 뉴모니아 J2B(KCCM11213P)는 본 연구실에서 분리, 동정된 것으로 병원성의 성질 또한 상대적으로 낮다.

우선, 포도당으로부터 글리세롤을 생산하기 위해 포도당 해당과정의 중간물질인 DHAP(dihydroxyacetone phosphate) 또는 GA3P(glyceraldehyde- 3-phosphate)로부터 글리세롤 생산에 필요한 2가지 종류의 효소인 GPD(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 및 GPP(glycerol-3-phosphate phosphatase)를 효모로부터 클로닝하여 호스트 균주에서 발현시켜 본 발명의 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주를 제조하였다. 크렙시엘라 뉴모니아가 가지고 있는 GPD는 역반응이 우세하여 글리세롤의 산화에는 사용될 수 있지만 글리세롤 생산 반응에는 부적합하다. 본 발명에서는 GDP 및 GPP를 발현하는 재조합 크렙시엘라 뉴모니아를 제조하고, 포도당으로부터 글리세롤 생산 여부를 확인하였다.

글리세롤 생산으로 인해 GPD 및 GPP의 성공적인 이종 발현을 확인한 후, 생산된 글리세롤이 본래 호스트 균주가 가진 글리세롤 산화경로를 통해 동화되는 것을 막기 위해 산화경로의 다양한 유전자가 결실된 결실 균주를 제작하였다. 산화경로는 G3P(glycerol-3-phosphate)를 중간체로 하는 호흡경로, DHA(dihydroyacetone)을 중간체로 하는 발효경로로 나눌 수 있다. 이들 경로의 유전자 결실이 글리세롤 및 1,3-프로판디올 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 결실은 개별적으로 또는 동시에 이루어졌다. 두 경로(호흡/발효) 모두에서 결실이 이루어졌을 때 글리세롤 생산 증가 효과가 분명하게 드러났다.

글리세롤 생산 증가와 달리 1,3-프로판디올의 생산은 높지 않았다. 낮은 1,3-프로판디올 생산을 해결하기 위해 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생산하는 주요 효소들에 대한 과발현을 시도하였다. 과발현은 본래 크렙시엘라 뉴모니아가 가진 유전자를 이용하였다. 또한 기질로 사용되는 포도당이 이들 유전자의 발현에 미치는 영향을 조사함으로써 탄소대사저해의 심각성을 인지하였다. 이들 주요 효소들의 과발현은 산화경로의 결실과 더불어 1,3-프로판디올의 생산 향상에 크게 기여하였다. 하지만 수율 향상은 어느 정도 수준에서 더 이상 증가하지 못했다.

포도당으로부터 글리세롤 및 1,3-프로판디올을 생산하기 위해서는 NADH가 필요하다. 따라서, 세포 내 NADH/NAD+ 비는 이들 생산물 생산에 중요한 영향을 미칠 수 있다. 글리세롤이나 1,3-프로판디올 생산에 유리하도록 NADH/NAD+ 비를 높게 유지하려면, NADH 재생 또는 공급을 향상시키거나 NADH 소모를 감소시켜야 한다. NADH 공급을 향상시키기 위해 글리세롤 산화경로 중 글리세롤 탈수소효소(DhaD)의 반응을 다시 재개하거나, 5-인산경로(Pentose Phosphate 경로; PP 경로)와 해당과정의 활성화를 위한 유전자 조작 균주가 개발되었다. DhaD 반응은 글리세롤 동화(분해) 반응의 첫 단계 반응이므로 글리세롤을 분해하는 단점이 있지만 NAD+의 환원반응을 수반하기 때문에 NADH 공급을 증가시킬 수 있으며, PP 경로는 Zwf, Gnd 효소 반응이 NADPH를 생산함으로써 포도당을 피루브 산으로 전환하는 과정에서 해당과정인 Embden Meyerhoff Parnas 경로 (EMP 경로)보다 많은 환원력을 공급해 준다. 한편, NADH 소모를 감소시키기 위한 또 다른 노력으로, NADH를 필요로 하는 숙신산, 젖산, 에탄올 생산경로의 유전자 결실이 이루어졌다.

이러한 변이 균주들은 1,3-프로판디올 생산증가에 어느 정도 기여하였지만, 생산된 글리세롤을 1,3-프로판디올로 모두 전환하지는 못했다. 1,3-프로판디올로 전환되지 못한 글리세롤은 배양 배지로 유출되었다. 글리세롤이 세포 내에서 밖으로 유출되지 않고 세포 내 머물면서 1,3-프로판디올 생산에 충분히 사용될 수 있도록 글리세롤 수송 막 단백질의 결실이 이루어졌다. 결실 균주는 글리세롤 유출 감소 및 1,3-프로판디올 생산증가에 영향을 주었지만 글리세롤 유출을 완전히 막지는 못하였다. 이는 글리세롤 수송에 관련된 다양한 수송체, 혹은 기작들이 존재함을 암시한다.

한편, 탄소대사저해(CCR, carbon catabolite repression)로 인한 주요 효소들(DhaB, DhaT)의 발현저해 및 독성 있는 아세트산 축적과 같은 오버플로우(overflow) 대사를 완화하기 위해 포도당의 PTS 시스템을 비활성화 하였다. PTS 시스템의 비활성화는 ptsG 유전자를 결실함으로써 얻어졌다. ptsG 유전자를 결실시킨 경우 DhaB, DhaT 효소의 과발현 없이 1,3-프로판디올 생산이 성공적으로 이루어졌다. 또한 아세트산의 축적이 유의하게 감소하였다.

DhaB, DhaT의 과발현 없이도 1,3-프로판디올을 잘 생산할 수 있고, 아세트산의 축적이 낮은 ptsG 결실 균주를 이용하여 생산 수율을 더욱 향상시키고 부산물의 생산을 최소화하기 위해 앞서 기술되었던 방법들이 복합적으로 적용되었다. 글리세롤 수송체의 결실, NADH 소모하는 다양한 발효경로들의 결실, 아세트산 생산 유전자 pta-ackA의 결실이 그것들이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 실험 재료

제한 효소를 비롯한 유전자 변형에 사용되는 효소들은 New England Bio-Labs (Beverly, MA, USA)에서 구매하였다. DNA 중합 효소는 SolGent co., Ltd (Seoul, Korea)에서, 플라스미드 DNA의 분리 및 젤 DNA 추출 키트는 Cosmogentech Co. Ltd. (Seoul, Korea)에서 각각 구매하였다. 게놈 DNA 분리 키트 및 RNAlater 용액은 Promega (Madison, WI, USA)와 ThermoFisher Scientific (Seoul, Korea)에서 각각 구매하였다. RNA 분리 키트 및 pQE80L 플라스미드는 Qiagen (Mannheim, Germany)에서 구입하였다. Seamless 클로닝 키트와 SuperScript III first-strand synthesis system은 Invitrogen (Seoul, Korea)에서 구입하였다. pCDFDuet-1은 Novagen (Merck Millipore Corporation, Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. 프라이머는 Macrogen Co. Ltd. (Seoul, Korea)을 통해 합성하였다. 트립톤과 효모 추출물은 Difco (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구입하였고 글리세롤, 포도당을 비롯한 표기되지 않은 화학 물질들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다.

2. 플라스미드 및 균주 제작

표 1은 본 발명에 사용된 균주 및 플라스미드를 보여준다.

본 발명에서 사용된 호스트 균주는 크렙시엘라 뉴모니아(K.pneumoniae) J2B (KCCM11213P) 균주로서, 본 발명자들의 선행특허인 한국 공개특허 제10-2013-0095395에 개시된 방법으로 분리될 수 있고, 상기 균주는 그람음성의 통성 혐기균으로서, 한국미생물보존센터(국외)에 2011.10.14자로 기탁(기탁번호:KCCM11213P)되어 있다. 그러나 본 발명의 호스트 균주는 반드시 크렙시엘라 뉴모니아 J2B일 필요는 없으며, 일반적인 크렙시엘라 뉴모니아를 사용하면 된다.

pQE80LK 플라스미드는 pQE80L(중간 카피수, ~30 카피) 벡터에 카나마이신 저항 유전자를 삽입함으로써 새롭게 제작되었다. 코돈-최적화 후 GenScript에서 합성된 GPD을 발현하는 gdp1 유전자(서열번호 1) 및 GPP를 발현하는 gpp2 유전자(서열번호 2)는 발현벡터 pQE80LK에 클로닝되었고, 그 결과 얻어진 발현벡터는 pD1P2로 명명되었다. gfp, gpd1 및 gpp2의 구성적 발현을 위해 이들 유전자의 5 'UTR 서열은 "N11-13AAGGAGN6-8" 및 각 코딩 서열의 35개 뉴클레오타이드를 제약 조건으로, 목표 발현 수준을 6백만으로 설정하여 UTR 디자이너 (Seo S. W., Yang J.-S., Kim I., Yang J., Min B. E., Kim S. & Jung G. Y. (2013) Predictive design of mRNA translation initiation region to control prokaryotic translation efficiency. Metab. Eng. 15, 67-74)를 이용해 디자인되었다. 발현 카세트는 gfp의 구성적 발현을 통해 합성 프로모터의 강도를 조사할 수 있도록 고안되었다. 우선, upstream의 insulator와 다른 합성 프로모터를 포함한 합성 카세트들은 합성된 후 pCDF 벡터(중간 카피수, ~40카피)에 클로닝 되었다. 그리고 디자인된 5'UTR과 함께 gfp는 제작된 플라스미드에 클로닝 되었다. gpd1gpp2의 구성적 발현은 pD1P2에서 증폭된 5’UTR-gpd1-5’UTR-gpp2에 의해 gfp를 대체함으로써 제작되었다. DhaT 발현을 위해서는 K. pneumoniae J2B의 dhaT를 pQE80LK 벡터에 클로닝 함으로써 pT, pD1P2T 두 개의 플라스미드가 제작되었다. 도 9는 본 발명에서 제작된 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.

글리세롤 산화경로의 결실균주 개발은 pKOV 플라스미드를 이용하는 방법을 사용하였다(Link A.J., Phillips D. & Church G. M. (1997) Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. J. Bacteriol. 179, 6228-6237). 간단히 설명하면, 결실 유전자의 upstream과 downstream 영역을 각각 약 500bp씩 포함하는 2개의 DNA fragment를 PCR로 합성한 후, 이들을 overlap PCR로 연결하고 pKOV 벡터에 클로닝 하였다. 결실 유전자의 upstream과 downstream을 포함한 pKOV 벡터는 형질전환을 통해 균주에 도입되었다. 형질전환된 균주는 항생제 마커를 이용해 스크리닝되었고, 30 ℃, overnight 배양과 42 ℃ 배양을 순차적으로 진행함으로써 상동재조합을 통한 유전자를 결실을 시도하였다. 최종 결실 균주는 PCR을 통한 결실 부위의 서열 및 사이즈 확인을 통해 스크리닝되었다. 그리고 도입된 플라스미드는 자당(sucrose)이 포함된 배지에 배양함으로써 큐어링(curing)되었다.

본 발명에서 결실되는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:

- 서열번호 9: GlpK upstream의 뉴클레오타이드 서열

- 서열번호 10: GlpK downstream의 뉴클레오타이드 서열

- 서열번호 11: GlpD upstream의 뉴클레오타이드 서열

- 서열번호 12: GlpD downstream의 뉴클레오타이드 서열

- 서열번호 13: DhaD upstream의 뉴클레오타이드 서열

- 서열번호 14: DhaD downstream의 뉴클레오타이드 서열

- 서열번호 15: GlpA upstream의 뉴클레오타이드 서열

- 서열번호 16: GlpA downstream의 뉴클레오타이드 서열

본 발명에서 이용한 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열은 표 2에 나타내었다. 또한, 본 발명에서 이용된 유전자 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 서열(과발현 유전자의 프라이머 서열)을 각각 표 3 및 표 4에 나타내었다.

3. 배양 배지 및 조건

Luria-Bertani(LB) 아가플레이트의 단일 콜로니를 효모 추출물 (5g/L), NaCl (10g/L) 및 트립톤 (10g/L)이 포함된 LB 배지에 접종한 후 8시간 동안 배양하였다. 세포를 다시 신선한 M9 배지로 옮겨 12시간 배양함으로써 예비-접종물을 준비하였다. 예비-접종물로부터 세포를 다시 동일한 조건의 M9 배지에 접종하여 배양함으로써 생산 연구를 개시하였다. 본 연구에서 사용된 M9 배지(pH 7.0)는 효모 추출물 (1.0g/L), NH₄SO₄(1.0g/L) 및 MgSO₄·7H₂O (0.25 g/L)을 포함하고 10g/L의 포도당을 탄소원으로 포함하였다. 모든 실험은 세포농도는 0.05 OD600에서 시작하였다.

호기성, 미호기성, 혐기성과 같이 다양한 폭기 조건 하에서 30 ℃ 교반 - 플라스크 배양을 수행 하였다. 호기성 및 미호기성 배양은 산소 투과성 코르크가 사용된 250 mL플라스크를 사용하였다. 혐기성 배양은 고무마개와 알루미늄 캡으로 닫힌 165 mL 혈청병을 사용하였고, 배양 전 기체상은 아르곤 가스로 치환되었다. 명시되지 않는 한 호기성 조건에서의 작업 배양량은 20mL였고, 미호기성 및 혐기성 조건에서는 50 mL로 고정되었다. 교반 속도는 호기성 조건의 경우 250 rpm이었고 미호기성 및 혐기성 조건의 경우 모두 100 rpm이었다. DhaB 및 DhaT의 과발현 동안 배양 배지에 보효소 B12 10 μM을 보충하였다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 배양액은 발현효소의 유도를 위해 0.1 mM IPTG가 사용되었다.

4. 단백질 발현 조사

단백질 발현 측정을 위한 균주배양은 LB 배지를 이용해 30 ℃/200rpm에서 이루어졌고, 0.5mM IPTG로 0.5 OD600에서 발현 유도하였다. 유도 후 10시간의 추가 배양이 이루어졌고, 배양액은 10,000 X g, 4 ℃에서 10 분간 원심 분리하여 수확하였다. 세포 펠렛을 20 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.0)으로 2 회 세척하고 동일한 완충액에 재현탁시켰다. 현탁액은 프렌치프레스 셀 (FA-078A, Thermo Electron Co., Waltham, MA)을 사용하여 파쇄 되었고, 파쇄된 세포 현탁액은 10,000 X g, 4 ℃에서 20 분간 원심분리 후 상등액을 이용해 SDS-PAGE 분석에 사용 되었다.

5. 효소 활성 측정

GPD 활성은 활성을 측정하기 위해 적절한 양의 세포 파쇄물을 1 mM 디트리에리트리톨(dithioerythritol)과 1 mM MgCl₂를 함유한 20 mM 이미다졸-HCl 완충액 (pH 7.0)에 섞어 25 ℃에서 2 분간 예비 배양 하였다. 이어서, 0.6 mM 디하이드록시 아세톤 및 0.1 mM NADH를 첨가하여 반응을 개시하였다. 소모된 NADH의 양은 6.22 × 103M-1cm-1의 몰 흡광 계수 (Δε340)를 사용하여 결정하였다.

세포파쇄물의 DhaB 활성은 커플링된 효소 방법 (Yakusheva, M., Malahov, A., Poznanskaya, A. & Yakovlev, V., (1974) Determination ofglycerol dehydratase activity by the coupled enzymic method. Anal. Biochem. 60, 293-301)을 약간 수정하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 3 mM MgCl2 및 40 mM 1,2-프로판디올을 포함하는 20 mM 인산칼륨 완충액 (pH 8.0)을 혐기조건에서 준비하고 DhaB를 포함하는 적당량의 세포파쇄액 및 12 U/ml의 커플링 효소(효모의 알콜탈수소 효소)를 완충액에 혼합하여 37 ℃ 수조에서 3 분간 배양하였다. 효소 반응은 15 μM 코엔자임 B12, 0.2 mM NADH 및 1.5 mM ATP를 첨가함으로써 개시되었다. 소모된 NADH의 양은 Δε340 = 6.22 × 103M-1cm-1을 사용하여 결정되었다. DhaT 활성은 문헌(Lama, S., Ro, S. M., Seol, E. & Park, S., (2015) Characterization of 1,3-propanediol oxidoreductase (DhaT) from Klebsiella pneumoniae J2B. Biotechnol. Bioproc. E. 20, 971-979)에 기재된 방법을 사용하여 340 nm에서의 NAD+ 환원정도를 측정하여 결정하였다.

6. 정량 PCR

탄소원에 따른 유전자 발현을 조사하기 위해, 미호기 조건 하에서 각기 다른 10g/L의 탄소원(포도당, 글리세롤, 포도당+글리세롤, 과당+글리세롤)이 포함된 M9 배지에서 세포를 배양하였다. 배양 6 시간 후, 세포를 수확한 후 원심분리를 통해 펠렛을 수집하였다. 펠렛은 즉시 500㎕의 RNAlater 용액에 재현탁 되었고 RNA isolation kit를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA(1 μg)은 SuperScript III first-strand synthesis system을 이용해 cDNA합성에 사용되었다. 실시간 PCR은 StepOne 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, USA)에서 SYBR green 방법을 통해 20 μL 반응 부피에서 수행되었다. 모든 프라이머의 PCR 효능은 실험적으로 결정되었다. mRNA 수준의 정량 분석은 ΔΔCT 방법을 통해 계산되었다 (Yim S.H., Kim T.M., Hu H.J., Kim J.H., Kim B.J., Lee J.Y., Han B.G., Shin S.H.,Jung S.H. & Chung Y.J. (2010) Copy number variations in East-Asian population and their evolutionary and functional implications. Hum. Mol. Genet. 19:1001-1008).

7. 전세포 형광 분석

전세포의 형광 (whole cell fluorescence, WCF) 분석은 100 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 현탁된 세포를 이용하여 측정되었다. 형광 강도는 PerkinElmer/Wallac Victor 2 Multi 라벨 계수기 (Ayyadurai, N., Neelamegam, R., Nagasundarapandian, S., Edwardraja, S., Park, H.S., Lee, S.J., Yoo, T.H., Yoon, H., Lee, S.-G., (2009) Importance of expression system in the production of unnatural recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Bioproc. E. 14, 257-265)를 사용하여 485 nm에서의 여기와 515 nm에서 방출을 수집함으로써 측정되었다. 빈 pCDF를 갖는 세포로부터 나온 형광을 기준(blank) 값으로 사용하였고 각각의 측정값에서 기준 값을 빼줌으로써 보정하였다.

8. 분석방법

미생물의 농도는 분광 광도계 (Lambda 20, PerkinElmer, Norwalk, CT, USA)를 사용하여 10mm 길이의 큐벳에서 측정하였다. 단백질 농도는 소혈청 알부민을 표준 용액으로 사용하여 마이크로 타이터플레이트 판독기(1420, Wallac Victor 2; Perkin Elmer)에서 Bradford 방법을 사용하여 측정 하였다. 글리세롤, 포도당, 1,3-PDO 및 기타 대사산물의 농도는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, Agilent 1200 infinity series, USA)로 측정하였다. 표본들은 분석 전 10,000 x g의 속도로 10분 동안 원심분리 하였고, 얻어진 상등액은 Tuffryn 멤브레인 (Acrodisc, Pall Life Sciences)을 사용하여 여과하였다. HPLC 분석은 300mm x 7.8mm Aminex HPX-87H 컬럼 (Bio-Rad, USA)을 사용하여 65 ℃, 2.5 mM H2SO4 이동상으로 이루어졌다.

이하에서 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다.

<실시예 1> 글리세롤 생합성 경로가 발현된 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) J2B 균주의 제작 및 효과

야생균주인 K. 뉴모니아 J2B(KCCM11213P)가 NADPH-dependent GPD(gpsA)와 putative sugar phosphatases(cdhA, pgpA, ydiA)를 암호화하는 유전자를 보유하고 있지만, 포도당으로부터 글리세롤을 생산하지는 못했다(한국 공개특허 제10-2013-0095395 참조). K. 뉴모니아 J2B 균주는 이러한 유전자의 발현이나 활성이 DHAP를 글리세롤로 전환하기에 충분하지 못하거나 적절하지 않은 것 같다. 이를 해결하기 위해, 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae)에서 글리세롤 생산을 촉매하는 두 효소의 유전자 gpd1(서열번호 1), gpp2(서열번호 2)를 코돈-최적화를 통해 합성한 후, pQE80LK(~30 카피수) 플라스미드에 클로닝하였고(pD1P2), 다시 J2B 균주에 발현시켜 재조합 균주 J2B-1를 제조하였다. SDS-PAGE 실험을 통해 두 효소(GPD1:42 kDa, GPP2: 29kDa)의 발현을 확인할 수 있었다(도 2(A)). 또한 야생균주 J2B와는 달리, 재조합 균주 J2B-1은 호기조건에서 배양 12시간 후 포도당으로부터 24mM (0.56 mol/mol)의 글리세롤을 생산하였다(도 2(B)). 이러한 결과는 S. cerevisiae의 GPD1과 GPP2가 J2B-1에서 성공적으로 발현되고 기능하였음을 의미한다. 하지만, 1,3-프로판디올 생산 수율(0.12 mol/mol, 24시간)은 높지 않았다.

<실시예 2> 글리세롤 분해 경로 결실 효과

비록 J2B-1 균주가 포도당으로부터 글리세롤 및 1,3-프로판디올을 생산하였지만 그 생산성은 만족스럽지 못했다. 특히, 1,3-프로판디올의 수율은 이론적 수율 1.42 mol/mol glucose에 비해 상당히 낮았다(Cameron D.C., Altaras N.E., Hoffman M.L. & Shaw AJ, (1998) Metabolic engineering of propanediol pathways. Biotechnol. Prog., 14, 116-125). 이는 포도당으로부터 생산된 글리세롤이 1,3-프로판디올로 전환되기 전에, 글리세롤의 산화경로를 통해 다시 동화되기 때문일 수 있다(도 1 참조). 또한 포도당의 탄소흐름이 폭기 조건에 의해 크게 영향을 받을 수 있기 때문에, 글리세롤의 생산수율 향상을 위해 글리세롤 산화경로를 차단하고 폭기 조건의 영향을 조사하였다.

글리세롤 산화경로의 부분적 또는 완전한 결실은 글리세롤을 이용한 세포성장을 크게 저해하였다. 하지만, 포도당을 탄소원으로 한 세포성장은 야생균주와 다르지 않았다. 산화경로의 결실은 글리세롤 생산을 증가시켰고 증가 정도는 산화경로의 결실 유전자 수가 증가할수록 높았다. 특히, G3P로 통하는 호흡(respiratory) 경로 및 DHA를 통하는 발효(fermentative) 경로가 모두 제거되었을 때(J2B3-1(△glpK△glpD△glpA△dhaD), J2B4-1(△ glpK △ glpD △ glpA △ dhaD △ gldA)), 글리세롤 생산수율의 크게 증가하여 0.91 mol/mol glucose에 이르렀다(도 2(C)). 호흡 및 발효경로가 제거된 균주는 상기 ‘2. 플라스미드 및 균주 제작’에서 기재된 방법으로 제조하였다. 상기 2가지 균주의 글리세롤 생산수율은 J2B-1에 비해 40% 이상 높은 결과를 보였다. 이러한 결과는 이전 균주에서는 글리세롤이 생산된 후 다시 동화됨으로써 글리세롤 생산 수율을 낮추는 원인이 되었음을 보여준다.

하지만 산화경로의 결실에도 불구하고 1,3-프로판디올의 수율 증가는 관찰되지 않았다. 1,3-프로판디올 생산에 관련된 환원 경로의 낮은 유전자 발현, NADH의 비효율적인 재생 또는 조효소 B12의 불충분한 합성과 같은 여러 요인이 원인이 될 수 있다. 아세트산은 모든 경우에서 주요 부산물로 생산되었고 약 0.70 mol/mol glucose에 이르렀다.

한편, 글리세롤을 이용해 1,3-프로판디올을 생산할 때 폭기 조건이 그 결과에 중요한 영향을 미치며, 혐기, 미호기 조건이 완전한 호기조건보다 1,3-프로판디올 생산에 더 유리한 것으로 알려져 있다. 이는 완전한 호기조건에서 글리세롤 대사의 환원 경로 반응을 촉매하는 유전자(Dha 오페론)의 발현이 저해되기 때문이다. 또한, 산소가 제한된 조건에서 K. pneumoniae는 더 높은 NADH/NAD+ 비를 유지함으로써 DhaT 활성 및 조효소 B12 생산에 유리한 조건을 제공한다. 폭기는 세포성장, 탄소대사, 발효산물 생성에도 영향을 미친다. 산소가 제한된 조건에서 세포성장은 감소하고 에탄올, 젖산, 포름산과 같은 발효 산물로의 탄소전환은 증가 한다(Celinska and Grajek, 2009).

이에, 글리세롤 및 1,3-프로판디올 생산에 유리한 폭기 조건을 찾기 위해 J2B3-1 균주를 이용하여 그 영향을 조사하였고, 그 결과 도 2(D)에 나타내었다. J2B3-1 균주는 J2B3 균주(△ glpK △ glpD △ glpA △ dhaD)에 상기한 pD1P2를 발현시켜 제조되었다.

폭기 조건은 플라스크 내 배양액의 양을 달리하면서 조절되었다. 미호기 조건은 배양 부피를 50ml (type I), 100ml (type II)로 조절하였다. 비록 미호기 type I은 완전한 호기조건과 유사한 글리세롤 대사결과를 보여주었지만, 조효소 B12의 합성 및 글리세롤 환원경로가 높은 활성을 유지한다고 보고된 바 있다.

도 3은 다양한 폭기 조건에서 J2B3-1 균주의 세포성장, 글리세롤 및 1,3-POD 생산 및 그 밖의 대사산물 생산 프로파일을 보여준다: (A) 호기조건, (B) 미호기 type I (배양 부피, 50ml), (C) 미호기 type II (배양 부피, 100ml), (D) 혐기 조건. 세포 성장(○), 포도당(▼), 글리세롤(△), 1,3-PDO(□), 2,3-BDO(■), 아세트산(●), pH (× ).

도 3을 보면, 서로 다른 폭기 조건에서 J2B3-1 균주는 매우 다른 결과 프로파일을 보여주었다. 세포 성장과 포도당 소모 속도는 폭기가 제한될수록 느려졌다. 게다가 가장 높은 글리세롤 생산수율을 나타낸 호기조건(0.91 mol/mol glucose)에 비해 미호기 조건(type II)과 혐기조건에서 각각 40%, 63% 감소하여 0.55, 0.34 mol/mol glucose로 측정되었다(도 2(D)). 그러나, 1,3-프로판디올의 수율은 0.1 mol/mol glucose 이하 범위에서 거의 변화가 없었다. 완전 호기조건에서 1,3-프로판디올로의 글리세롤 전환은 Dha 오페론의 발현과 조효소 B12의 이용가능성에 의해 제한될 수 있다. 그러나 글리세롤 생산의 경우, 높은 폭기조건(완전호기 또는 미호기 type I)이 더 좋은 결과를 보여주었다.

<실시예 3> GPD, GPP의 발현 수준 및 동종효소의 영향

글리세롤 산화경로의 결실로 인해 글리세롤 생산은 상당히 개선되었다. 하지만 추가적인 생산수율의 향상이 가능한지 조사하기 위해 GPD, GPP효소의 발현 수준 및 동종효소(isozymes) 영향을 조사하였다. 이는 GPD/GPP 효소의 활성이 증가하면 GA3P(또는 DHAP) node에서 탄소흐름이 글리세롤 생산으로 확대될 수 있을 것으로 기대되기 때문이다. 이들 효소의 발현 수준이 미치는 영향은 유도인자(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)의 농도(0~0.5 mM)를 달리하면서 조사하였다. 이들 영향은 미호기 조건(type I)에서 이루어졌다. 글리세롤 수율은 IPTG 농도가 0.1mM까지 증가할수록 향상되었고, 더 높은 농도에서 추가적인 증가가 없었다(도 4(A)). 세포 파쇄액을 이용한 효소 활성 측정 결과, GPD1의 활성이 IPTG 농도 0.1 mM까지 꾸준히 증가하였고 그 이상의 증가는 크지 않았다. 이러한 결과로 볼 때, 테스트에 사용된 균주에서 GPD 활성이 3.14 U/mg protein(0.1 mM IPTG 사용) 이상이 되면 글리세롤 생산에 충분한 활성이 제공됨을 알 수 있다. 그러나 1,3-PDO 생산은 글리세롤 생산에 영향을 받지 않았으며, 이것은 글리세롤의 생성효율이 1,3-PDO 생산을 제한하는 요소가 아님을 의미한다.

한편, S. cerevisiae에 존재하는 GPD, GPP 각각의 동종 효소에 대한 영향이 조사되었다. 이들 동종효소는 상이한 배양 조건하에서 발현되거나 기능을 하는 것으로 알려져 있다; gpd1, gpp2의 경우 삼투압에 의해 유도되는 반면, gpd2, gpp1은 상시 발현된다. 테스트에 사용된 모든 동종 효소들이 코돈 최적화를 통해 합성되었고, 이들 4개의 유전자는 서로 다른 조합(gpd1-gpp2, gpd1-gpp1, and gpd2-gpp1)으로 J2B3균주에 각각 클로닝 되었다. J2B3-1 (gpd1-gpp2 과발현)가 가장 높은 글리세롤 생산을 보여주었고, J2B3-3(gpd2-gpp1 과발현)가 가장 낮은 결과를 보여주었다 (도 4B). GPD1은 GPD2에 비해 우수한 효소특성을 가지고 있다고 보고된 바 있는데, Km값이 DHAP에 대해 0.31-0.54 mM이며 NADH에 대해 0.018-0.023 mM이다. 이는 GPD2의 0.86 mM (DHAP), 0.018 mM (NADH)보다 우수하다 (Ansell R1, Granath K, Hohmann S, Thevelein JM, Adler L., (1997) The two isoenzymes for yeast NAD+-dependent glycerol 3-phosphate dehydrogenase encoded by GPD1 and GPD2 have distinct roles in osmoadaptation and redox regulation. EMBO J. 16(9), 2179-2187). 세포 파쇄액으로 GPD 활성을 간단히 확인한 결과, J2B3-1(GPD1-GPP2)은 3.14 U/mg protein, J2B3-3(GPD2-GPP1)는 0.29 U/mg protein로 GPD1이 GPD2보다 87% 높았다. 게다가 J2B3-1의 gpp2가 gpp1으로 치환된 균주 J2B3-2(GPD1-GPP1)의 경우 글리세롤 수율이 50 % 감소했다. 이로써 J2B3-1의 높은 글리세롤 생산이 GPD1, GPP2 모두의 활성에 기인함을 알 수 있다.

<실시예 4> 글리세롤의 1,3-PDO로의 전환 향상을 위한 DhaB 및 DhaT의 과발현

높은 글리세롤 생산에도 불구하고 1,3-PDO의 생산수율은 매우 낮았다. 이는 Dha 오페론에 의해 암호화되는 DhaB, DhaT와 같은 1,3-PDO 생산 경로(글리세롤 환원경로)에 관여한 주요 효소의 낮은 발현이 원인이 될 수 있다. 이를 확인하기 위해, 글리세롤 산화 경로 중 NADH 생산에 기여하지 않는 호흡경로만 제거된 J2B2-1 균주(△glpK△glpD△glpA)를 이용해, 탄소원이 달라질 경우, 1,3-PDO 생산에 직접 관여된 Dha 오페론 유전자(dhaB1, dhaT, dhaD, dhaR, gdrB)의 전사 및 DhaB, DhaT 효소의 활성이 어떻게 영향을 받는지 조사하였다(도 5A). Dha 오페론 유전자의 전사는 글리세롤 배양에 비해 포도당에서 배양될 때 현저하게 감소하였다. 그러나 글리세롤이 포도당 또는 과당배지에 추가될 때 전사수준이 약간 향상되는 것이 확인되었다. 하지만 글리세롤 단독으로 사용될 때의 수준에는 미치지 못했다. Glp 오페론에 포함되어 글리세롤 수송 역할을 하는 glpF 유전자의 발현 또한 포도당 또는 과당이 존재할 경우 감소하였다. 이러한 결과는 Dha, Glp 오페론이 탄소대사저해(CCR, carbon catabolite repression)의 영향 아래 있음을 보여준다.

반면, 다양한 알데히드에 기질특이성을 가진 NADPH-의존성 산화환원효소인 yqhD의 전사는 탄소원의 종류에 상관없이 발현율이 낮았다. DhaB, DhaT 효소활성 또한 글리세롤 단독 배양에 비해 포도당이 포함될 경우 뚜렷하게 감소하였다. 감소 정도는 포도당 단독 배지에서 각각 80% (DhaB), 95% (DhaT)였고, 포도당/글리세롤 배지에서 각각 64% (DhaB), 91% (DhaT)였다(도. 5B). 이러한 결과는 탄소대사저해로 인한 주요 효소의 발현저하가 1,3-PDO 합성에 영향을 끼친다는 보고들과 일치하는 결과이다.

본 발명에서는 탄소대사저해(CCR)의 영향을 극복하고 동시에 1,3-PDO 생산을 향상시키기 위해, Dha 오페론의 6개 유전자(dhaB1, dhaB2, dhaB3, gdrA, gdrB, dhaT)의 과발현이 이루어졌다. 상기 과발현은 dhaB1, dhaB2, dhaB3, gdrA, gdrB 유전자를 포함하는 pBG와 dhaT 유전자를 포함하는 pT를 제조하고, 이를 균주에서 발현시켜 이루어질 수 있다. 상기 dhaB1 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 dhaB2 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 dhaB3 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 gdrA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 gdrB 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 dhaT 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

그 결과, J2B3-4(gpd1, gpp2, dhaB1, dhaB2, dhaB3, gdrA, gdrB 과발현), J2B3-5(gpd1, gpp2, dhaT, dhaB1, dhaB2, dhaB3, gdrA, gdrB 과발현), J2B3-6(gpd1, gpp2, dhaT 과발현) 균주들이 확보되었다. DhaB와 DhaT의 과발현은 1,3-PDO 생산을 현저하게 향상시켰는데, DhaB 단독 발현(J2B3-4)의 경우, 66%(0.18 mol/mol glucose), DhaB, DhaT 동시 과발현(J2B3-5)의 경우 80%까지 1,3-PDO 생산이 증가하였다. 그러나 DhaB 과발현 없이 DhaT만 발현된 경우는 그 증가가 미미하였다. 이러한 증가에도 불구하고, J2B3-5균주에서 1,3-PDO 보다 3배나 많은 글리세롤이 1,3-PDO로 전환되지 못하고 남아 있었다(도 6). 또한, 독성의 3-HPA 축적이 DhaB, DhaT 동시 과발현 균주에 비해 DhaB만 과발현될 때 증가하는 것이 확인되었다. 3-HPA는 세포성장에 유독하기 때문에 결과적으로 1,3-PDO 생산을 저해할 수 있다. 때문에 DhaB 및 DhaT의 균형 잡힌 활성을 유지하여 그 축적을 막아야 한다. 그러나 현재 개발된 균주의 경우 두 효소 모두 IPTG-유도성 프로모터(tac, T5)를 사용하고 있기 때문에, 두 효소의 활성을 조절하기에 어려움이 있다. 그리고 DhaB, DhaT의 과발현에도 불구하고, 부산물 생산은 변하지 않았고, 모든 경우에 상당량의 아세트산이 생산되었다.

<실시예 5> DhaB, GdrA, GdrB, DhaT의 발현 세기의 영향

앞서 DhaB, DhaT의 발현 향상 및 균형 조절은 1,3-PDO 생산 증가를 위해 필요함을 확인하였다. 하지만 모든 과발현 대상 유전자들이 IPTG-유도성 프로모터를 이용하고 있기 때문에 쉽지 않다. 이에 구성적(constitutive) 프로모터를 이용해 gpd1, gpp2를 과발현하고 dhaB123, gdrAB, dhaT를 IPTG-유도성 프로모터(tac, T5)를 이용해 클로닝 함으로써 그 발현 세기를 변화시켰다. gpd1, gpp2의 발현정도는 GPD 활성이 충분하다고 판단된(실시예 3의 결과) 3.14 U/mg protein를 목적으로 하였다(도 4(A)).

gpd1, gpp2의 적당한 구성적 발현을 위해 Mutalik 그룹에서 보고한 합성 프로모터 정보를 활용하여 다양한 발현 세기를 가진 pCDFDuel-1 플라스미드들이 개발되었다(도 7). 이 중 SP10 프로모터로 gpd1, gpp2를 발현한 J2B3-7 균주가 J2B3-1(0.1 mM IPTG로 발현)과 유사한 글리세롤 생산을 보여주었다. 세포 파쇄액으로 측정한 J2B3-7 균주의 GPD 활성은 2.9 U/mg protein로 J2B3-1의 값과 매우 유사하였다.

DhaB, DhaT의 발현 조절의 영향을 조사하기 위해 pBG(dhaB123, gdrA, gdrB 과발현), pT(dhaT 과발현) 플라스미드가 각각 개발되었고 개별적으로 또는 동시에 J2B3-7 균주에 도입됨으로써, J2B3-8(dhaB1, dhaB2, dhaB3, gdrA, gdrB만 발현), J2B3-9(dhaT만 발현), J2B3-10(dhaB1, dhaB2, dhaB3, gdrA, gdrB, dhaT 동시발현) 균주가 확보되었다.

IPTG 농도 변화에 따른 이들 재조합 균주의 배양 결과, IPTG 농도가 증가할수록 1,3-PDO 생산이 점점 증가하였다(도 8). 앞의 결과(도 4)와 유사하게 DhaT 단독 발현 효과는 미비하였다. 이것은 글리세롤의 1,3-PDO 전환은 DhaB 활성에 크게 의존함을 보여준다(도 6B). 그러나 DhaT가 DhaB와 함께 발현될 때, DhaT의 추가 발현은 1,3-PDO 생산을 더욱 증가시키면서 시너지효과를 일으켰다(도 8(C), 균주 J2B3-10).

한편, DhaB 단독 발현 균주(J2B3-8)는 세포 성장과 글리세롤 생산이 IPTG 농도에 반비례하게 감소하였다(도 8(A)). 이것은 IPTG 농도 증가로 인해 더 많은 3-HPA가 축적되기 때문일 것이다. 가장 높은 1,3-PDO 생산은 0.27mol/mol glucose로 0.1~0.2 mM의 IPTG가 처리된 J2B3-10균주에서 얻어졌다(KCTC 13304BP). 이것은 J2B3-5에 얻어진 1,3-PDO 생산에 비해 27% 증가한 결과이다. 이러한 1,3-PDO 생산 증가는 아마도 DhaT 발현이 증가한 결과로 판단된다. 그러나 여전 많은 양(0.52 mol/mol glucose)의 글리세롤이 1,3-PDO로 전환되지 못했다. 게다가 전체 (글리세롤과 1,3-PDO) 생산 수율은 다소 감소했다. 이것은 3개의 플라스미드, 항생제, 여러 유전자의 높은 발현 때문일 것으로 생각된다. 여전히 0.6 mol/mol glucose 가량의 아세트산이 주요 부산물로 생산되었다.

이러한 결과들은 야생균주 J2B에서 포도당이 탄소원으로 사용될 때 CCR로 인해 이들 효소의 발현이 높지 않았음을 나타낸다. 그것은 글리세롤의 효율적인 1,3-PDO로의 전환을 위해서는 이들 두 효소의 과발현이 필요함을 의미한다. 그러나 글리세롤은 1,3-PDO로 완전히 전환되지 못했다. 이것은 환원력 공급의 부족과 같은 다른 제한적 요소가 존재함을 의미한다. 아마도 TCA 사이클의 활성이 낮거나 NADH 생산에 전혀 기여하지 않는 피루베이트-포메이트 리아제(pyruvat formate lyase)의 활성이 높은 탓도 있을 것으로 본다. 대사산물의 탄소 및 환원도 분포 분석결과도 NADH 공급 부족을 뒷받침 한다(표 5).

J2B3-5 균주에서의 탄소 분포 및 산화환원 균형

^ag/L.

^bAn average molecular weight of 23.86, which corresponds to an average cell with a molecular formula of CH1.74O0.44N0.22. The average ash content of 3.6% was deduced from the actual cell dry mass (Stephanopoulos GN, Aristidou AA, Nielsen J (1998) Metabolic engineering: principles and methodologies. Academic Press, San Diego, California).

^c(Total carbon in biomass and metabolites)/(Total carbon in glucose) X 100

상기 실시예에서 제조된 재조합 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 균주를 이용하여 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 생합성할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<서열목록의 설명>

서열번호 1은 gpd1 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 2는 gpp2 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 3은 dhaB1 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 4는 dhaB2 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 5는 dhaB3 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 6은 gdrA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 7은 gdrB 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 8은 dhaT 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드

서열번호 9는 GlpK upstream의 뉴클레오타이드 서열

서열번호 10은 GlpK downstream의 뉴클레오타이드 서열

서열번호 11은 GlpD upstream의 뉴클레오타이드 서열

서열번호 12는 GlpD downstream의 뉴클레오타이드 서열

서열번호 13은 DhaD upstream의 뉴클레오타이드 서열

서열번호 14는 DhaD downstream의 뉴클레오타이드 서열

서열번호 15는 GlpA upstream의 뉴클레오타이드 서열

서열번호 16은 GlpA downstream의 뉴클레오타이드 서열

서열번호 17은 gfp 유전자의 forward 프라이머 서열이다.

서열번호 18은 gfp 유전자의 reverse 프라이머 서열이다.

서열번호 19는 gpd1유전자의 forward 프라이머 서열이다.

서열번호 20은 gpd1 유전자의 reverse 프라이머 서열이다.

성열번호 21은 gpp2 유전자의 forward 프라이머 서열이다.

서열번호 22는 gpp2 유전자의 reverse 프라이머 서열이다.

서열번호 23은 dhaB-gdrA 유전자의 forward 프라이머 서열이다.

서열번호 24는 dhaB-gdrA 유전자의 reverse 프라이머 서열이다.

서열번호 25는 gdrB 유전자의 forward 프라이머 서열이다.

서열번호 26은 gdrB 유전자의 reverse 프라이머 서열이다.

서열번호 27은 dhaT 유전자의 forward 프라이머 서열이다.

서열번호 28은 dhaT 유전자의 reverse 프라이머 서열이다.

한국생명공학연구원

KCTC13304

20170628

<110> GS CALTEX UNIST <120> New Klebsiella Pneumoniae Strain For Production of 1,3-propanediol From Glucose And Method for Produce 1,3-propanediol Using The Same <130> DNP170237 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1176 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 atgtcggctg ctgctgatcg cctgaatctg acctcgggcc atctgaatgc tggtcgcaaa 60 cgctcctctt cgtcggtgtc gctgaaagcg gccgaaaaac cgtttaaagt taccgtcatt 120 ggcagcggta actggggcac cacgatcgcg aaagtggttg ccgaaaattg caaaggctat 180 ccggaagtgt ttgcgccgat tgtgcagatg tgggttttcg aagaggaaat caacggcgag 240 aaactgaccg aaattatcaa cacgcgccat cagaatgtca aatacctgcc gggcattacc 300 ctgccggata acctggtggc caatccggat ctgatcgaca gcgttaaaga tgtggatatc 360 atcgttttca acattccgca ccagttcctg ccgcgcatct gctcccagct gaaaggccat 420 gtggatagtc acgtgcgtgc gatttcttgt ctgaaaggtt ttgaagtcgg tgccaaaggc 480 gtgcagctgc tgagcagcta tattaccgag gaactgggta tccagtgtgg cgcgctgagt 540 ggtgcgaaca ttgccaccga agtggcacag gaacattggt ctgagaccac ggtcgcttat 600 cacatcccga aagatttccg cggcgaaggc aaagatgttg accataaagt cctgaaagca 660 ctgtttcatc gtccgtactt ccacgtgtca gttatcgaag acgtggccgg catttcgatc 720 tgcggtgcgc tgaaaaatgt cgtggccctg ggctgtggtt ttgttgaagg cctgggttgg 780 ggcaacaatg cgtcagcagc tattcagcgc gtcggtctgg gcgaaattat ccgtttcggc 840 cagatgtttt tcccggaaag ccgtgaggaa acctattacc aggagtccgc aggtgtggct 900 gatctgatca ccacgtgcgc cggcggtcgc aacgtcaaag tggcacgtct gatggctacc 960 tcaggcaaag acgcatggga gtgtgaaaaa gagctgctga atggccagtc ggctcagggt 1020 ctgattacct gcaaagaagt gcacgagtgg ctggaaacgt gtggctctgt tgaagatttt 1080 ccgctgttcg aggccgtgta tcagatcgtt tacaacaact acccgatgaa aaacctgccg 1140 gacatgattg aagaactgga cctgcacgag gactaa 1176 <210> 2 <211> 753 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 atgggcctga cgaccaaacc gctgagcctg aaagtcaacg ctgcactgtt cgacgtggac 60 ggtacgatta tcattagcca gccggcaatt gcggcctttt ggcgcgattt cggtaaagac 120 aaaccgtatt ttgatgccga acatgtgatt caagttagcc acggctggcg taccttcgat 180 gcaatcgcta aatttgcacc ggacttcgct aacgaagagt atgtgaataa actggaagcg 240 gagattccgg ttaaatacgg cgagaaaagc atcgaagtgc cgggcgccgt gaaactgtgc 300 aacgcgctga atgccctgcc gaaagaaaaa tgggcggtcg ccacctctgg tacgcgcgat 360 atggcacaga aatggtttga gcatctgggc attcgccgtc cgaaatattt catcacggcc 420 aacgacgtga aacagggtaa accgcacccg gaaccgtatc tgaaaggccg taacggcctg 480 ggttacccga ttaatgaaca ggacccgagc aaatccaaag tggttgtctt tgaggacgca 540 ccggctggca ttgcagctgg taaagcggcg ggttgcaaaa ttatcggtat cgcgaccacg 600 tttgatctgg acttcctgaa agaaaaaggc tgtgatatca tcgttaaaaa ccatgaaagc 660 atccgcgtcg gcggttacaa tgcggagacc gacgaggtgg agtttatttt tgacgattat 720 ctgtatgcga aagacgatct gctgaaatgg tga 753 <210> 3 <211> 1669 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 3 catgaaaaga tcaaaacgat ttgcagtact ggcccagcgc cccgtcaatc aggacgggct 60 gattggcgag tggcctgaag aggggctgat cgccatggac agcccctttg acccggtctc 120 ttcagtaaaa gtggacaacg gtctgatcgt cgagctggac ggcaaacgcc gggaccagtt 180 tgacatgatc gaccgattta tcgccgatta cgcgatcaac gttgagcgca cagagcaggc 240 aatgcgcctg gaggcggtgg aaatagcccg catgctggtg gatattcacg tcagtcggga 300 ggagatcatt gccatcacta ccgccatcac gccggccaaa gcggtcgagg tgatggcgca 360 gatgaacgtg gtggagatga tgatggcgct gcagaagatg cgtgcccgcc ggaccccctc 420 caaccagtgc cacgtcacca atctcaaaga taatccggtg cagattgctg ctgacgccgc 480 cgaggccggg atccgcggct tctcagaaca ggagaccacg gtcggtatcg cgcgctatgc 540 gccgtttaac gccctggcgc tgttggtcgg ttcgcagtgc ggccgccccg gcgttttgac 600 gcagtgctcg gtggaagagg ccaccgagct ggagctgggc atgcgtggct taaccagcta 660 cgccgagacg gtgtcggtct acggcaccga agcggtattt accgacggcg atgatactcc 720 gtggtcaaag gcgttcctcg cctcggccta cgcctcccgc gggttgaaaa tgcgctacac 780 ctccggcacc ggatccgaag cgctgatggg ctattcggag agcaagtcga tgctctacct 840 cgaatcgcgc tgcatcttca ttaccaaagg cgccggggtt caggggctgc aaaacggcgc 900 ggtgagctgt atcggcatga ccggcgctgt gccgtcgggc attcgggcgg tgctggcgga 960 aaacctgatc gcctctatgc tcgacctcga agtggcgtcc gccaacgacc agactttctc 1020 ccactcggat attcgccgca ccgcgcgcac cctgatgcag atgctgccgg gcaccgactt 1080 tattttctcc ggctacagcg cggtgccgaa ctacgacaac atgttcgccg gctcgaactt 1140 cgatgcggaa gattttgatg attacaacat cctgcagcgt gacctgatgg ttgacggcgg 1200 cctgcgtccg gtgaccgagg cggaaaccat tgccattcgc cagaaagcgg cgcgggcgat 1260 ccaggcggtt ttccgcgagc tggggctgcc gccaatcgcc gacgaggagg tggaggccgc 1320 cacctacgcg cacggtagca acgagatgcc gccgcgtaac gtggtggagg atctgagtgc 1380 ggtggaagag atgatgaagc gcaacatcac cggcctcgat attgtcggcg cgctgagccg 1440 cagcggcttt gaggatatcg ccagcaatat tctcaatatg ctgcgccagc gggtcaccgg 1500 cgattacctg cagacctcgg ccattctcga tcggcagttc gaggtggtga gtgcggtcaa 1560 cgacatcaat gactatcagg ggccgggcac cggctatcgc atctctgccg aacgctgggc 1620 ggagatcaaa aatattccgg gcgtggttca gcccgacacc attgaataa 1669 <210> 4 <211> 441 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 4 atgccccatg gcgcgatcct caaagagctg attgccgggg tggaagaaga ggggcttcac 60 gcccgggtgg tgcgcattct gcgcacgtcc gacgtctcct ttatggcctg ggatgcggcc 120 aacctgagcg gctcggggat cggcatcggt atccagtcga aggggaccac ggtcatccat 180 cagcgcgatc tgctgccgct cagcaacctg gagctgttct cccaggcgcc gctgctgacg 240 ctggaaacct accggcagat tggcaaaaac gccgcgcgct atgcgcgcaa agagtcacct 300 tcgccggtgc cggtggtgaa cgatcagatg gtgcggccga aatttatggc caaagccgcg 360 ctatttcata tcaaagagac caaacatgtg gtgcaggacg ccgagcccct caccctgcac 420 gtcgacttag taagggagtg a 441 <210> 5 <211> 426 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 5 atgagcgaga aaaccatgcg cgtgcaggat tatccgttag ccacccgctg cccggagcat 60 atcctgacgc ctaccggcaa accattgacc gatattaccc tcgagaaggt gctctctggc 120 gaggtgggcc cgcaggatgt gcggatctcc tgccagaccc ttgagtacca ggcgcagatt 180 gccgagcaga tgcagcgcca tgcggtggcg cgcaatttcc gccgcgcggc ggagcttatc 240 gccattcctg acgagcgcat tctggctatc tataacgcgc tgcgcccgtt ccgctcctcg 300 caggcggagc tgctggcgat cgccgacgag ctggagcaca cctggcatgc gacagtgaat 360 gccgcctttg tccgggagtc ggcggaagtg tatcagcagc ggcataagct gcgtaaagga 420 agctaa 426 <210> 6 <211> 1824 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 6 atgccgttaa tagccgggat tgatatcggc aacgccacca ccgaggtggc gctggcgtcc 60 gacgacccgc aggcgagggc gtttgttgcc agcgggatcg tcgcgacgac gggcatgaaa 120 gggacgcggg acaatatcgc cgggaccctc gccgcgctgg agcaggccct ggcgaaaaca 180 ccgtggtcga tgagcgatgt ctctcgcatc tatcttaacg aagccgcgcc ggtgattggc 240 gatgtggcga tggagaccat caccgagacc attatcaccg aatcgaccat gatcggtcat 300 aacccgcaga cgccgggcgg ggtgggcgtt ggcgtgggga cgactatcgc cctcgggcgg 360 ctggcgacgc tgccggcggc gcagtatgcc gaggggtgga tcgtactgat tgacgacgcc 420 gtcgatttcc ttgacgccgt gtggtggctc aatgaggcgc tcgaccgggg gatcaacgtg 480 gtggcggcga tcctcaaaaa ggacgacggc gtgctggtga acaaccgcct gcgtaaaacc 540 ctgccggtgg tagatgaagt gacgctgctg gagcaggtcc ccgagggggt aatggcggcg 600 gtggaagtgg ccgcgccggg ccaggtggtg cggatcctgt cgaatcccta cgggatcgcc 660 accttcttcg ggctaagccc ggaagagacc caggccatcg tccccatcgc ccgcgccctg 720 attggcaacc gttcagcggt ggtgctcaag accccgcagg gggatgtgca gtcgcgggtg 780 atcccggcgg gcaacctcta cattagcggc gaaaagcgcc gcggagaggc cgatgtcgcc 840 gagggcgcgg aagccatcat gcaggcgatg agcgcctgcg ctccggtacg cgacatccgc 900 ggcgaaccgg gcactcacgc cggcggcatg cttgagcggg tgcgcaaggt aatggcgtcc 960 ctgaccgacc atgagatgag cgcgatatac atccaggatc tgctggcggt ggatacgttt 1020 attccgcgca aggtgcaggg cgggatggcc ggcgagtgcg ccatggaaaa tgccgtcggg 1080 atggcggcga tggtgaaagc ggatcgtctg caaatgcagg ttatcgcccg cgaactgagc 1140 gcccgactgc agaccgaggt ggtggtgggc ggcgtggagg ccaacatggc catcgccggg 1200 gcgttaacca ctcccggctg tgcggcgccg ctggcgatcc tcgacctcgg cgccggctcg 1260 acggatgcgg cgatcgtcaa cgcggagggg cagataacgg cggtccatct cgccggggcg 1320 gggaatatgg tcagcctgtt gattaaaacc gagctgggcc tcgaggatct ttcgctggcg 1380 gaagcgataa aaaaataccc gctggccaaa gtggaaagcc tgttcagtat tcgtcacgag 1440 aatggcgcgg tggagttctt tcgggaagcc ctcagcccgg cggtgttcgc caaagtggtg 1500 tacatcaagg agggcgaact ggtgccgatc gataacgcca gcccgctgga aaaaattcgt 1560 ctcgtgcgcc ggcaggcgaa agagaaagtg tttgtcacca actgcctgcg cgcgctgcgc 1620 caggtctcac ccggcggttc cattcgcgat atcgcctttg tggtgctggt gggcggctca 1680 tcgctggact ttgagatccc gcagcttatc acggaagcct tgtcgcacta tggcgtggtc 1740 gccgggcagg gcaatattcg gggaacagaa gggccgcgca atgcggtcgc caccgggctg 1800 ctactggccg gtcaggcgaa ttaa 1824 <210> 7 <211> 360 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 7 atgtcgcttt caccgccagg cgtacgcctg ttttacgatc cgcgcgggca ccatgccggc 60 gccatcaatg agctgtgctg ggggctggag gagcaggggg tcccctgcca gaccataacc 120 tatgacggag gcggtgacgc cgctgcgctg ggcgccctgg cggccagaag ctcgcccctg 180 cgggtgggta tcgggctcag cgcgtccggc gagatagccc tcactcatgc ccagctgccg 240 gcggacgcgc cgctggctac cggacacgtc accgatagcg acgatcaact gcgtacgctc 300 ggcgccaacg ccgggcagct ggttaaagtc ctgccgttaa gtgagagaaa ctgatctaga 360 360 <210> 8 <211> 1164 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 8 atgagctatc gtatgtttga ttatctggtg ccaaacgtta acttttttgg ccccaacgcc 60 atttctgtag tcggcgaacg ctgccagctg ctggggggga aaaaagccct gctggtcacc 120 gacaaaggcc tgcgggcaat taaagatggc gcggtggaca aaaccctgca ttatctgcgg 180 gaggccggga tcgaggtggc gatctttgac ggcgtcgagc cgaacccgaa agacaccaac 240 gtgcgcgacg gcctcgccgt gtttcgccgc gaacagtgcg acatcatcgt caccgtgggc 300 ggcggcagcc cgcacgattg cggcaaaggc atcggcatcg ccgccaccca tgagggcgat 360 ctgtaccagt atgccggaat cgagaccctg accaacccgc tgccgcctat cgtcgcggtc 420 aataccaccg ccggcaccgc cagcgaggtc acccgccact gcgtcctgac caacaccgaa 480 accaaagtga agtttgtgat cgtcagctgg cgcaacctgc cgtcggtctc tatcaacgat 540 ccactgctga tgatcggtaa accggccgcc ctgaccgcgg cgaccgggat ggatgccctg 600 acccacgccg tagaggccta tatctccaaa gacgctaacc cggtgacgga cgccgccgcc 660 atgcaggcga tccgcctcat cgcccgcaac ctgcgccagg ccgtggccct cggcagcaat 720 ctgcaggcgc gggaaaacat ggcctatgcc tctctgctgg ccgggatggc tttcaataac 780 gccaacctcg gctacgtgca cgccatggcg caccagctgg gcggcctgta cgacatgccg 840 cacggcgtgg ccaacgctgt cctgctgccg catgtggcgc gctacaacct gatcgccaac 900 ccggagaaat tcgccgatat cgctgaactg atgggcgaaa atatcaccgg actgtccact 960 ctcgacgcgg cggaaaaagc catcgccgct atcacgcgtc tgtcgatgga tatcggtatt 1020 ccgcagcatc tgcgcgatct gggggtaaaa gaggccgact tcccctacat ggcggagatg 1080 gctctgaaag acggcaatgc gttctcgaac ccgcgtaaag gcaacgagca ggagattgcc 1140 gcgattttcc gccaggcatt ctga 1164 <210> 9 <211> 999 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 9 catttgaagt tcgatatttc tcgtttttgc tcgttaacga taaattaaca ctatgcctac 60 atggcaatat ggtcgtctgt gaccacccta catacaataa tcatcaccac gcttcaggat 120 tcgattatga gccaaacatc aaccttaaaa ggccagtgca tcgcagagtt cctcggtacc 180 gggttgttga tctttttcgg cgttgggtgc gtggctgcgc tcaaggtcgc gggagccagc 240 ttcggacaat gggaaatcag catcatctgg ggtctgggcg tcgccatggc gatctacctg 300 accgccgggg tctccggtgc gcaccttaac ccagcggtga ctatcgcgct gtggctgttc 360 gcctgcttcg aaggccgcaa agtggttcct tttattattt cgcaattcgc tggcgccttt 420 tgcgctgcgg cattagttta cgggctttac tacaatcttt tcctcgatta tgaaaccacc 480 caccatatga ttcgcggcag cgtggaaagc ctcgatctgg ccggcatttt ctccacttac 540 ccgaacccgc acatcaattt tgtgcaggcc ttcgcggtag agatggtgat taccgctatc 600 ctgatgggcg tcatcctggc gctgaccgac gatggcaacg gcataccgcg cggcccgctg 660 gcccctctgc tgattggcct gctgattgcg gtgattggcg cctccatggg accgctgacc 720 ggcttcgcca tgaacccggc gcgtgacatc ggcccgaaag ccttcgcctg gctggcgggg 780 tggggtgacg tcgccttcac cggcggcaaa gatattcctt atttcctggt gccgctgtgc 840 gcaccggtgg tcggcgcggc gctgggcgca ttcagctatc gtaagctgat tggccgtcac 900 ctgccttgcg acacctgcgt ggaggaagag caacagagcc cctcctcttc caccgctcaa 960 cataaagctt cgctgtaatc tgactacggg acaccgact 999 <210> 10 <211> 999 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 10 attgtgaagt tattcccggc ttgcggcgta aacgcctgag ccgggctaca aaaccccaaa 60 cagcacgatc ttgtagcccg gacaggtgcg cagcaccgct tccgggtttt ttatcaacca 120 aacatcggca gcagcaggta cagcttaatc accagcgcgt tgacgatatc gataaagaac 180 gcccccacca tcggcactac caggaaggcc atatgcgatg gcccgaaacg gtcggtaatc 240 gcctgcatat tggcgatcgc cgtcggcgtt gcccccaggc caaacccgca atgcccggct 300 gccagcaccg cggcatcgta gtttttgccc atcatccgat aggtgacgaa caccgcatac 360 agcgccatcg ccagcgcctg caccgccagg ataataatca tcggcagcgc cagcgaggcc 420 aactcccaca gcttgaggct catcagcgcc atggcgagga acagcgacag gctgacgttg 480 cccaacaccg ataccgcgcg atcgaacacc cgatacaacc ccgccagcgc caggctgttg 540 ctgaggatca cgccgataaa cagcacgcag acgaaggtcg gcagctcgaa gacgctcccc 600 gccagcagtt gcgcaaccac cttgcccagc gtcagacaga tggcgatcag ggcgatactt 660 tcgatcagca ccagcgaggt gatcacccgc cccacgtccg gcttttcaaa ggcggttggc 720 gccacctgat cgtccggtgt cccgtccggt gaggaagagt gcttcaccag ataacgcgcc 780 accgggccgc cgatcaggcc gcccagcacc aggccgaaag tcgcgcaggc catcgccacc 840 tcggtggcgt tggcaaaacc gtagcgctca acgaacagct tactccacgc cgccccggtg 900 ccgtggccgc cggataaggt aatcgacccg gccagcagac ccattagcgg atccagcccc 960 agcagcgtcg ccatgccgat accgagggcg ttctgcagc 999 <210> 11 <211> 599 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 11 tcattaacat gcagcgaatc gcttattcca cacaaagggg gatagtatac ctgccagtcg 60 ttaaaacgtc ccgcgcgcca cttccgccgg gaaatggcga tgccaggcgt cgaacccgcc 120 gtcaacgcta tagaccttat caaacccctg ctgcagcaga tactgcgcgg cgcccttgct 180 gctgttgccg tgatagcaca tcaccatcac cgccgtgtca aagtcgttgt cacgcataaa 240 cgcgcccagc gtatcgttgg tcagatgaaa cgcgcccggc gtatgaccca tcgcatagct 300 ttgcggatcg cggatatcga ccagtaccgc cgtctgctga tgcagtttct ggtgcgcttc 360 ttcaacattg atgcattcaa actgttccat gattctcttc tctttctcgt catgacgggc 420 gatggccggc ccaattttac cctgtagtgt accgtcaggc ggtaaagaaa cgccaatatg 480 ttacacccat cacttcaaaa tgtttttttg atgttaccaa aagcgcgttt gtttgctata 540 gtgagcgata tcgagcattt atgagcttaa acgaaagtgt gagagggtaa gaacgtgga 599 <210> 12 <211> 569 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 12 ggaaagtctg aactgtcgtt agcgtcctga catcgcgtgg cgccaggaga gaaatacccg 60 ggctatggct tgcgcttggc ccggatacct gttcacaaat taaacgagac tttttttcca 120 gtcggcaatg tgacatttat actgagttct ccccccaatg ccgcaatgta gcgttttagg 180 gtcgaaagcc gagggtcgtt atcagtctgt tccattttag cgatcgttgg ctgctttacc 240 cccatagccg cagccatctc tgtttgcgac atttgcaact cttctcgaag caagtttaaa 300 gcgacagact ggcgtctctc tgccgctttc gctgcaatac gctgctggct ttcaggactc 360 tgtttcgcca tgagttcttt tagcgtggcc attatcgctc cttagtcagg tgttggctga 420 attctctgtc agccagagta atcatctctt tgtaaaaacg tttctcattc atgccatcct 480 tatcgcccgc acataaaacg atagctttcc gcagaggatc aaaagcaaaa aaggcgcgga 540 tggggagccc atgatgctga acctggagt 569 <210> 13 <211> 512 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 13 atatgatgat tctggctgag cggacgaaaa aaagaatgcc tcgacgatcg ggtttcatta 60 cgaaacattg cttcctgatt ttgtttcttt atggaacgtt tttgctgagg atatggtgaa 120 aatgcgagct ggcgcgcttt ttttcttctg ccataagcgg cggtcaggat agccggcgaa 180 gcgggtggga aaaaattttt tgctgatttt ctgccgactg cgggagaaaa ggcggtcaaa 240 cacggaggat tgtaagggca ttatgcggca aaggagcgga tcgggatcgc aatcctgaca 300 gagattaggg ttttttgttc caatatggaa cgtaaaaaat taacctgtgt ttcatatcag 360 aacaaaaagg cgaaagattt ttttgttccc tgccggccct acagtgatcg cactgctccg 420 gtacgctccg ttcaggccgc gcttcactgg ccggcgcgga taacgccagg gctcatcatg 480 tttacatgcg cacttatttg agggtgaaag ga 512 <210> 14 <211> 537 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 14 ttcgcggtgg ctaaaccgct ggcccaggtc agcggttttt ctttctcccc tccggcagtc 60 gctgccggag gggttctcta tggtacaacg cggaaaagga tatgactgtt cagactcagg 120 ataccgggaa ggcggtctct tccgtcatcg cccagtcatg gcaccgctgc agcaagttta 180 tgcagcgcga aacctggcaa acgccgcacc aggcccaggg cctgaccttc gactccatct 240 gtcggcgtaa aaccgcgctg ctcaccatcg gccaggcggc gctggaagac gcctgggagt 300 ttatggacgg ccgcccctgc gcgctgttta ttcttgatga gtccgcctgc atcctgagcc 360 gttgcggcga gccgcaaacc ctggcccagc tggctgccct gggatttcgc gacggcagct 420 actgcgcgga gagcattatc ggcacctgcg cgctgtcgct ggccgcgatg cagggccagc 480 cgatcaacac cgccggcgat cggcatttta agcaggcgct acagccatgg agttttt 537 <210> 15 <211> 572 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 15 gcaggaaaat gcgcggattc gagcggtcag agaccgatcc catgatgaat ttcgaaaatc 60 cataggcgat ggagataccg gaaagggcga agccgaggtc gccacgagag aacccctgct 120 cgataagata aggcatcgcc agggcaaagt tcttacgaac caaatagtag gcggcataac 180 caaaaaagat gccaataaaa atctgccagc gtaatcggcg atatagcggg tcaatctccg 240 ctgctggcaa acgcgcttta tgcgcggcgg gtttaaaaat acttaacata tcagcctccg 300 tggcccttgc tgttttctac tgacgtcacg acaaaatccc agattaatca ccaacttcaa 360 atatggtcgc gatggtaggc aatacgtaga gttgatactg tgaaacatcg cacaatttgt 420 tacagaaata tgacaaaacg ttccaatgtg agcacgaaat cacataacac gctcaaataa 480 cgcgcgaata tgctcgaaat caaacaataa ccttactaat tgtggctaaa tggcgttaaa 540 cgaaagcaga ggagctgaag atgacgggac gt 572 <210> 16 <211> 545 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 16 gatgaagttt gattgcgcga ttatcggcgg cgggctcgcc ggcctgctgt gcgggctggc 60 cctgaatcag cacggcctgc gcagcgtcat catcagccgc gggcagagcg cgctgcattt 120 ttcctccgcg tcgttagacc tgctctcggc gctgcccaac ggcgataacg tcactgacgt 180 cgcacaaggt gtgcagcaac tcgctgaaca gcttcctgaa cacccttatt cccgtctcgg 240 cgccgaggcg gtgctcgaat acgcgacaca gaccgaagcc ctgctggccg cctgcggcgc 300 ggtgatgcag ggcgatgcgc gccggccgca ccggcgggta acgccgctgg ggacgttgcg 360 cccggcatgg ctgtcgcccc ttgaggtgcc tgtcgcgccc ctgccgtcgc agggcgcctg 420 tctggtgggg atcagcggct ttgctgattt tcagccgcat ctcgccgccg ccgcgctcgg 480 tcaacacgga gttaccgccg cggcggtgga aatcgagtta ccgctgctgg atgtactgcg 540 tgaca 545 <210> 17 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> f primer sequence for gfp gene <400> 17 gtgtggaagc ttcttggctg aaaataggag gtaaattatg cagagcaaag gcgaagaact 60 g 61 <210> 18 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> r primer sequence for gfp gene <400> 18 ccggccgata tcttattaat ggtgatggtg atggtgttta tac 43 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> f primer sequence for gpd1 gene <400> 19 gagctcggta ccatgtcggc tgctgctgat cg 32 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> r primer sequence for gpd1 gene <400> 20 ggtatatctc cttggatcct tagtcctcgt gcaggtccag 40 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> f primer sequence for gpp2 gene <400> 21 ggatccaagg agatatacca tgggcctgac gaccaaacc 39 <210> 22 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> r primer sequence for gpp2 gene <400> 22 taattaagct tgcatgcctg cagtcaccat ttcagcagat cgtc 44 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> f primer sequence for dhaB to gdrA genes <400> 23 gagctcggta ccatgaaaag atcaaaacga tttg 34 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> r primer sequence for dhaB to gdrA genes <400> 24 acagccaagc ttctactggc cggtcaggcg aattaaac 38 <210> 25 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> f primer sequence for gdrB gene <400> 25 acagccaagc ttaaaggaag ctaagcggag gtcagcatgt cgctttcacc gccaggcgta 60 c 61 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> r primer sequence for gdrB gene <400> 26 acagccaagc ttcagtttct ctcacttaac ggcagga 37 <210> 27 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> f primer sequence for dhaT gene <400> 27 atggtgactg caggcatgca agcttaggag aaattaacta tgagctatcg tatgtttg 58 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> r primer sequence for dhaT gene <400> 28 aggagtccaa gctcagctaa ttaagctttc agaatgcctg gcggaaaatc 50

Claims

a) 효모 유래 gpd1 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 효모 유래 gpp2 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, b) 글리세롤 분해경로가 결실된, 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 생산하기 위한 재조합 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 글리세롤을 생산하는 효모 유래 GPD 및 GPP 효소를 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주.
제1항에 있어서, 상기 gpd1 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 gpp2 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주.
제1항에 있어서, 상기 글리세롤 분해 경로의 결실은 글리세롤을 글리세롤-3-포스페이트로 전환시키는 글리세롤-3-포스페이트 키나아제(GlpK)를 암호화하는 glpK 유전자, 및 글리세롤을 디하이드록시아세톤으로 전환시키는 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나아제(DhaD)를 암호화하는 dhaD 유전자를 개별적으로 또는 동시에 결실시킨 것을 특징으로 하는, 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주.
제4항에 있어서, 상기 글리세롤 분해 경로의 결실은 추가로 G-3-P 디하이드로게나아제를 암호화하는 glpA 유전자 및 glpD 유전자를 단독 또는 동시에 결실시킨 것을 특징으로 하는, 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, dhaB1 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, dhaB2 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, dhaB3 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, gdrA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, gdrB 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 dhaT 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 추가로 포함하는, 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주.
제6항에 있어서, 상기 dhaB1 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 dhaB2 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 dhaB3 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 gdrA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 gdrB 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 dhaT 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 크렙시엘라 뉴모니아 균주.
다음의 단계를 포함하는 1,3-프로판디올 생합성 방법:
(a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 크렙시엘라 뉴모니아 균주를 배양하여 1,3-프로판디올을 생합성하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 생합성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계.
다음의 단계를 포함하는 1,3-프로판디올 생합성 방법:
(a) 제6항의 크렙시엘라 뉴모니아 균주를 배양하여 1,3-프로판디올을 생합성하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 생합성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계.