JPH0630590B2 - 複合プラスミドベクタ− - Google Patents
複合プラスミドベクタ−Info
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- JPH0630590B2 JPH0630590B2 JP60191427A JP19142785A JPH0630590B2 JP H0630590 B2 JPH0630590 B2 JP H0630590B2 JP 60191427 A JP60191427 A JP 60191427A JP 19142785 A JP19142785 A JP 19142785A JP H0630590 B2 JPH0630590 B2 JP H0630590B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、適宜の蛋白質の遺伝子を動物細胞中に導入し
動物細胞中にてその遺伝子を発現させて、所望の蛋白質
を生産せしめるのに有用な、動物ウイルスを利用した複
合プラスミドベクターに係るものである。
動物細胞中にてその遺伝子を発現させて、所望の蛋白質
を生産せしめるのに有用な、動物ウイルスを利用した複
合プラスミドベクターに係るものである。
一般に、遺伝子操作の技術を用いて、高等生物の適宜の
蛋白質を生産する場合には、高等生物の蛋白質は、実際
には、糖鎖の結合、ジスルフイド結合、Ｃ末端のアミド
化等、種々の修飾構造を有することが多ので、遺伝子を
高等生物の細胞に導入して目的蛋白質を生産すること
が、生理活性を有する蛋白質を生産する際には、好適な
方法であると考えられる。
蛋白質を生産する場合には、高等生物の蛋白質は、実際
には、糖鎖の結合、ジスルフイド結合、Ｃ末端のアミド
化等、種々の修飾構造を有することが多ので、遺伝子を
高等生物の細胞に導入して目的蛋白質を生産すること
が、生理活性を有する蛋白質を生産する際には、好適な
方法であると考えられる。
従来、適宜の外来遺伝子を動物細胞中で発現させる場合
に、動物ウイルスをベクターとして利用することが、一
般的に行われている。すなわち、動物ウイルスのプロモ
ーターに、外来遺伝子を連結し、これを動物細胞に導入
すると、ウイルスのプロモーターによるRNAの転写が行
われ、さらに、蛋白質への翻訳が行われることが知られ
ている。
に、動物ウイルスをベクターとして利用することが、一
般的に行われている。すなわち、動物ウイルスのプロモ
ーターに、外来遺伝子を連結し、これを動物細胞に導入
すると、ウイルスのプロモーターによるRNAの転写が行
われ、さらに、蛋白質への翻訳が行われることが知られ
ている。
この場合、一般に、ベクターとしてよく利用される動物
ウイルスとしては、パポバウイルス、パピローマウイル
ス、レトロウイルス等がある。これらのうち、パポバウ
イルスの一種であるSV40や、SV40由来のpSV2、パピロー
マウイルスの一種であるウシパピローマウイルス等は、
よく研究されており、その使用例も多い。他方、レトロ
ウイルスを利用したベクターに関しては、他のウイルス
由来のベクターと比較して種々の利点、例えば、宿主
動物細胞域が広いこと、宿主感染細胞中にて染色体に
組み込まれ、比較的安定に存在すること、宿主感染細
胞が死なないこと、比較的大きな外来遺伝子を挿入し
て組み換えることができること、等の利点を有してお
り、ベクターとしての好適な条件を具備しているので、
その将来性が期待されている。
ウイルスとしては、パポバウイルス、パピローマウイル
ス、レトロウイルス等がある。これらのうち、パポバウ
イルスの一種であるSV40や、SV40由来のpSV2、パピロー
マウイルスの一種であるウシパピローマウイルス等は、
よく研究されており、その使用例も多い。他方、レトロ
ウイルスを利用したベクターに関しては、他のウイルス
由来のベクターと比較して種々の利点、例えば、宿主
動物細胞域が広いこと、宿主感染細胞中にて染色体に
組み込まれ、比較的安定に存在すること、宿主感染細
胞が死なないこと、比較的大きな外来遺伝子を挿入し
て組み換えることができること、等の利点を有してお
り、ベクターとしての好適な条件を具備しているので、
その将来性が期待されている。
ところで、レトロウイルスの一種であるマウス乳癌ウイ
ルス(MMTV)に関しては、その遺伝子の発現がホルモン調
節を受けること、すなわち、グルココルチコイドホルモ
ンの添加によって、その遺伝情報の発現が調節されるこ
とが知られており、この点に着目して、このウイルスの
プロモーター領域とホルモン調節を受けるホルモン感受
領域とを含む部分、一般に、レトロウイルスのLTR(long
terminal repeat)と称される部分を用いたベクターが
幾つか製作されている。例えば、このLTRが外来のras遺
伝子を発現させてp21を生産させるのに有用であること
が報告されており(Ce11,27,245-255(1981))、また、こ
のLTRをウシパピローマウイルスに連結して製作された
ベクターも報告されている(Mo1.Ce11.Bio1.,3,2045-205
7(1983))。その他、SV40由来のpSV2にLTRを連結して製
作されたベクターも報告されている(Nature,294,228-23
2(1981))。
ルス(MMTV)に関しては、その遺伝子の発現がホルモン調
節を受けること、すなわち、グルココルチコイドホルモ
ンの添加によって、その遺伝情報の発現が調節されるこ
とが知られており、この点に着目して、このウイルスの
プロモーター領域とホルモン調節を受けるホルモン感受
領域とを含む部分、一般に、レトロウイルスのLTR(long
terminal repeat)と称される部分を用いたベクターが
幾つか製作されている。例えば、このLTRが外来のras遺
伝子を発現させてp21を生産させるのに有用であること
が報告されており(Ce11,27,245-255(1981))、また、こ
のLTRをウシパピローマウイルスに連結して製作された
ベクターも報告されている(Mo1.Ce11.Bio1.,3,2045-205
7(1983))。その他、SV40由来のpSV2にLTRを連結して製
作されたベクターも報告されている(Nature,294,228-23
2(1981))。
しかしながら、すでに報告されている上記ベクターに関
しては、唯一のLTR領域しか保有しないものであるの
で、有効に作用するRNA転写停止部位が欠如しており、
そのため、外来遺伝子の正確かつ安定な転写作用が阻害
されるという問題点があった。
しては、唯一のLTR領域しか保有しないものであるの
で、有効に作用するRNA転写停止部位が欠如しており、
そのため、外来遺伝子の正確かつ安定な転写作用が阻害
されるという問題点があった。
そればかりか、上記ベクターに関しては、保有する唯一
のLTR領域とのその下流に挿入された外来遺伝子との間
のDNA領域においても、転写作用が行われてしまうの
で、該LTR領域中のプロモーターから外来遺伝子に至る
までの翻訳作用の対象領域が長大化しており、そのた
め、外来遺伝子の翻訳作用が不安定になるという問題点
もあった。
のLTR領域とのその下流に挿入された外来遺伝子との間
のDNA領域においても、転写作用が行われてしまうの
で、該LTR領域中のプロモーターから外来遺伝子に至る
までの翻訳作用の対象領域が長大化しており、そのた
め、外来遺伝子の翻訳作用が不安定になるという問題点
もあった。
そこで、本発明者らは、レトロウイルス由来のベクター
における遺伝情報の発現の調節という利点に着目しつ
つ、上記問題点を解消して、外来遺伝子の遺伝情報の発
現による蛋白の生産を動物細胞中にて、正確かつ安定に
行うことのできる複合プラスミドベクターを開発すべ
く、鋭意努力を重ねた結果、ホルモン感受領域とMMTVプ
ロモーターとを有する第１のLTR領域の下流にRNA転写停
止部を有する第２のLTR領域を配置し、これら第１、第
２のLTR領域間にポリリンカーを配置し、第１のLTR領域
とポリリンカーの間で上流から下流に向けて5′−スプ
ライシングサイトと3′−スプライシングサイトとをそ
の順で配置して成る複合プラスミドが、とりわけ、蛋白
の生産の安定性の点で優れていることを見い出して、本
発明を完成するに至った。
における遺伝情報の発現の調節という利点に着目しつ
つ、上記問題点を解消して、外来遺伝子の遺伝情報の発
現による蛋白の生産を動物細胞中にて、正確かつ安定に
行うことのできる複合プラスミドベクターを開発すべ
く、鋭意努力を重ねた結果、ホルモン感受領域とMMTVプ
ロモーターとを有する第１のLTR領域の下流にRNA転写停
止部を有する第２のLTR領域を配置し、これら第１、第
２のLTR領域間にポリリンカーを配置し、第１のLTR領域
とポリリンカーの間で上流から下流に向けて5′−スプ
ライシングサイトと3′−スプライシングサイトとをそ
の順で配置して成る複合プラスミドが、とりわけ、蛋白
の生産の安定性の点で優れていることを見い出して、本
発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、動物細胞中において、適宜の外来
遺伝子を安定に発現させて、所望の生理活性を有する蛋
白を生産するのに有用な新規複合プラスミドベクターを
供給することを目的とするものである。
遺伝子を安定に発現させて、所望の生理活性を有する蛋
白を生産するのに有用な新規複合プラスミドベクターを
供給することを目的とするものである。
そして、この目的を達成するための本発明の構成は、第
３Ａ図に示されるように、マウス乳癌ウイルス(MMTV)由
来であって、その領域中にホルモン感受領域とMMTVプロ
モーター領域とを有する第１のLTR領域と該LTR領域の下
流に位置する5′−スプライシングサイトとを含む第１
のDNA断片と、マウス乳癌ウイルス(MMTV)由来であっ
て、その領域中にRNA転写停止領域を有する第２のLTR領
域を含む第３のDNA断片とを、大腸菌プラスミドpBR322
由来のアンピシリン耐性遺伝子領域と複製開始領域とを
含む第５のDNA断片に対して連結し、次いで、第１のDNA
断片の下流にポリリンカーを連結し、続いて、該ポリリ
ンカーの直前にプラスミドpCVSVE由来の3′−スプライ
シングサイトを有する第２のDNA断片を連結し、さら
に、pSV2gpt由来のSV40プロモーター領域とpSV2gpt由来
のEco-gpt遺伝子とを含む第４のDNA断片を選択マーカ(g
ene marker)として上記第５のDNA断片と上記第３のDNA
断片との間に挿入連結して成る複合プラスミドベクター
それ自体である。
３Ａ図に示されるように、マウス乳癌ウイルス(MMTV)由
来であって、その領域中にホルモン感受領域とMMTVプロ
モーター領域とを有する第１のLTR領域と該LTR領域の下
流に位置する5′−スプライシングサイトとを含む第１
のDNA断片と、マウス乳癌ウイルス(MMTV)由来であっ
て、その領域中にRNA転写停止領域を有する第２のLTR領
域を含む第３のDNA断片とを、大腸菌プラスミドpBR322
由来のアンピシリン耐性遺伝子領域と複製開始領域とを
含む第５のDNA断片に対して連結し、次いで、第１のDNA
断片の下流にポリリンカーを連結し、続いて、該ポリリ
ンカーの直前にプラスミドpCVSVE由来の3′−スプライ
シングサイトを有する第２のDNA断片を連結し、さら
に、pSV2gpt由来のSV40プロモーター領域とpSV2gpt由来
のEco-gpt遺伝子とを含む第４のDNA断片を選択マーカ(g
ene marker)として上記第５のDNA断片と上記第３のDNA
断片との間に挿入連結して成る複合プラスミドベクター
それ自体である。
さらに、本発明の複合プラスミドベクターについて、第
１図〜第５図に基づいてその合成過程を説明すれば、以
下のとおりである。
１図〜第５図に基づいてその合成過程を説明すれば、以
下のとおりである。
先ず、大腸菌由来のプラスミドpBR322のBam HI-Sa1I部
位の間に、マウス乳癌ウイルス(MMTV)をラムダファージ
ベクターλｇｔＷＥＳ・λＢのEcoRIサイトにクローニ
ングして作成したクローンＨ(Ce11,23,335-345(1981))
のBam HI-XhoI断片をクローニングしてpMM1（中間体
１）を製作する。このpMM1を、pvuIIで切断して得た大
きい方の断片をT4リガーゼにより連結してpMM2（中間体
２）を製作する。
位の間に、マウス乳癌ウイルス(MMTV)をラムダファージ
ベクターλｇｔＷＥＳ・λＢのEcoRIサイトにクローニ
ングして作成したクローンＨ(Ce11,23,335-345(1981))
のBam HI-XhoI断片をクローニングしてpMM1（中間体
１）を製作する。このpMM1を、pvuIIで切断して得た大
きい方の断片をT4リガーゼにより連結してpMM2（中間体
２）を製作する。
次に、前記クローンＨのLTR領域を含むBg1 II断片をpMM
2のBam HIサイトに連結してpMM3（中間体３）を製作
し、これをEcoRIとHind IIIで切断し、Klenow酵素によ
り切断点を埋めて平らにし、再び、連結して、EcoRIとH
ind IIIの両切断点が消滅したpMM4（中間体４）を製作
する。
2のBam HIサイトに連結してpMM3（中間体３）を製作
し、これをEcoRIとHind IIIで切断し、Klenow酵素によ
り切断点を埋めて平らにし、再び、連結して、EcoRIとH
ind IIIの両切断点が消滅したpMM4（中間体４）を製作
する。
pMM4をXbaIで切断し、Klenow酵素により切断点を埋めて
平らにし、その切断末端間に、πAN7(Gene,30,257-260
(1984))のHind III−EcoRI断片をKlenow酵素で処理して
得たポリリンカーを挿入してpMM5（中間体５）を製作す
る。このポリリンカーは、Hind III、XbaI、Bg1 II、Pst
I、Sa1I、BamHI、SmaI、EcoRIの各切断サイトをもつDNA断片
である（第４図）。
平らにし、その切断末端間に、πAN7(Gene,30,257-260
(1984))のHind III−EcoRI断片をKlenow酵素で処理して
得たポリリンカーを挿入してpMM5（中間体５）を製作す
る。このポリリンカーは、Hind III、XbaI、Bg1 II、Pst
I、Sa1I、BamHI、SmaI、EcoRIの各切断サイトをもつDNA断片
である（第４図）。
pMM5をApaIとKpnIで切断し、T4ポリメラーゼで切断点を
けずって平らにし、これを連結して間をつめてpMM6（中
間体６）を製作する。
けずって平らにし、これを連結して間をつめてpMM6（中
間体６）を製作する。
続いて、pMM6をNdeIで短時間処理し、NdeI切断点３箇所
のうち部分分解により１箇所のみ切れたDNA断片をアガ
ロースゲル泳動により、分離、抽出し、さらに、Hind I
IIで切断し、Klenow酵素で処理して切断点を埋め、これ
を連結して間をつめてpMM7（中間体７）を製作する。
のうち部分分解により１箇所のみ切れたDNA断片をアガ
ロースゲル泳動により、分離、抽出し、さらに、Hind I
IIで切断し、Klenow酵素で処理して切断点を埋め、これ
を連結して間をつめてpMM7（中間体７）を製作する。
残り２箇所にあるNdeIの切断点をNdeIで部分分解し、Kl
enow酵素で切断点を埋めて、その間にXhoIリンカーを連
結する。この際pBR322由来のNdeI切断点にXhoIリンカー
の連結したものを選択してpMM7X1（中間体８）を得る。
enow酵素で切断点を埋めて、その間にXhoIリンカーを連
結する。この際pBR322由来のNdeI切断点にXhoIリンカー
の連結したものを選択してpMM7X1（中間体８）を得る。
次にSV40由来のpSV2gpt(Science,209,1422-1427(1980))
より、SV40のプロモーター及びEco-gpt遺伝子（マイコ
フェノーリック酸耐性）、SV40スプライシングサイトを
含むPvu II-BamHI断片を、Klenow酵素で処理した後、こ
れに、XhoIリンカーを連結し、前記pMM7X1のXhoI切断点
にクローニングしてpMM8（中間体９）を製作する。
より、SV40のプロモーター及びEco-gpt遺伝子（マイコ
フェノーリック酸耐性）、SV40スプライシングサイトを
含むPvu II-BamHI断片を、Klenow酵素で処理した後、こ
れに、XhoIリンカーを連結し、前記pMM7X1のXhoI切断点
にクローニングしてpMM8（中間体９）を製作する。
このpMM8のポリリンカー部位のHind III-PstI部位の間
に、免疫グロブリンＶ領域由来の3′−スプライシング
サイトの塩基配列をもつプラスミドpCVSVE(Mo1.Ce11.Bi
ol.,2,1304-1319(1982))より得た3′−スプライシング
サイトを含むHind III-PstI断片をクローニングして、
本発明の複合プラスミドベクターpMM102を製作する。
に、免疫グロブリンＶ領域由来の3′−スプライシング
サイトの塩基配列をもつプラスミドpCVSVE(Mo1.Ce11.Bi
ol.,2,1304-1319(1982))より得た3′−スプライシング
サイトを含むHind III-PstI断片をクローニングして、
本発明の複合プラスミドベクターpMM102を製作する。
そして、本発明の複合プラスミドベクターpMM102は、前
記したように、大腸菌においても複製可能であり、これ
により、大腸菌χ1776を、実施例１の方法と同様の方法
にて形質転換させて得た大腸菌Ｋ−１２χ１７７６（ｐ
ＭＭ１０２）については、微工研条寄第１１５７号とし
て、既に寄託済みである。
記したように、大腸菌においても複製可能であり、これ
により、大腸菌χ1776を、実施例１の方法と同様の方法
にて形質転換させて得た大腸菌Ｋ−１２χ１７７６（ｐ
ＭＭ１０２）については、微工研条寄第１１５７号とし
て、既に寄託済みである。
本発明の複合プラスミドベクターは、マウス乳癌ウイル
ス(MMTV)の由来の、ホルモン感受領域とMMTVプロモータ
ーとを有する第１のLTR領域のほかに、その下流に、外
来遺伝子の挿入部位としてのポリリンカーを介して、マ
ウス乳癌ウイルス(MMTV)由来の、RNA転写停止部位を有
する第２のLTR領域を含んで成る構成としたことによ
り、宿主としての動物細胞内でポリリンカーに挿入され
た外来遺伝子を発現させる際に、ホルモン添加に応動し
て、MMTVプロモーター直後の部位から開始される転写作
用が、外来遺伝子に及んだ後、その下流の第２のLTR領
域中のRNA転写停止部位に至ったときに、転写作用が確
実に停止されるので、外来遺伝子に特有の目的蛋白の生
産が該動物細胞内で正確かつ安定に行われる。
ス(MMTV)の由来の、ホルモン感受領域とMMTVプロモータ
ーとを有する第１のLTR領域のほかに、その下流に、外
来遺伝子の挿入部位としてのポリリンカーを介して、マ
ウス乳癌ウイルス(MMTV)由来の、RNA転写停止部位を有
する第２のLTR領域を含んで成る構成としたことによ
り、宿主としての動物細胞内でポリリンカーに挿入され
た外来遺伝子を発現させる際に、ホルモン添加に応動し
て、MMTVプロモーター直後の部位から開始される転写作
用が、外来遺伝子に及んだ後、その下流の第２のLTR領
域中のRNA転写停止部位に至ったときに、転写作用が確
実に停止されるので、外来遺伝子に特有の目的蛋白の生
産が該動物細胞内で正確かつ安定に行われる。
さらに、本発明の複合プラスミドは、第１のDNA断片中
の5′-スプライシングサイトの下流であって、外来遺伝
子の挿入部位としてのポリリンカーの直前に3′-スプラ
イシングサイトを有する第２のDNA断片を含んで成る構
成としたことにより、宿主としての動物細胞内での外来
遺伝子の転写に際して、外来遺伝子の挿入部位であるポ
リリンカーの上流であって、5′-スプライシングサイト
から3′-スプライシングサイトに至るまでの長大なDNA
領域での転写作用をスキップさせることができるので、
スキップされたDNA領域に対する不要な蛋白の生産が外
来遺伝子の翻訳による目的蛋白の生産に支障をきたすこ
とがない。
の5′-スプライシングサイトの下流であって、外来遺伝
子の挿入部位としてのポリリンカーの直前に3′-スプラ
イシングサイトを有する第２のDNA断片を含んで成る構
成としたことにより、宿主としての動物細胞内での外来
遺伝子の転写に際して、外来遺伝子の挿入部位であるポ
リリンカーの上流であって、5′-スプライシングサイト
から3′-スプライシングサイトに至るまでの長大なDNA
領域での転写作用をスキップさせることができるので、
スキップされたDNA領域に対する不要な蛋白の生産が外
来遺伝子の翻訳による目的蛋白の生産に支障をきたすこ
とがない。
かくして、本発明によれば、すでに報告されているマウ
ス乳癌ウイルス(MMTV)由来のLTR領域を含むベクターに
係る諸問題点が解消される。さればかりか、本発明の複
合プラスミドは、pSV2gpt由来のSV40プロモーターとpSV
2gpt由来のEco-gpt遺伝子領域とを有する第４のDNA断片
を含んで成る構成としたことにより、宿主としての動物
細胞内で外来遺伝子を発現させる際に、本発明の複合プ
ラスミドベクターにより形質転換された宿主を選別する
ためのgene markerとしてEco-gpt遺伝子が作用して、形
質転換された宿主がマイコフェノーリック酸耐性を帯び
るので、形質転換された宿主の選別が容易である。そし
て、その際、SV40プロモーターはホルモン調節を受けな
いので、Eco-gpt遺伝子のgene markerとしての作用がMM
TVプロモーターでのホルモン調節と干渉することはな
い。
ス乳癌ウイルス(MMTV)由来のLTR領域を含むベクターに
係る諸問題点が解消される。さればかりか、本発明の複
合プラスミドは、pSV2gpt由来のSV40プロモーターとpSV
2gpt由来のEco-gpt遺伝子領域とを有する第４のDNA断片
を含んで成る構成としたことにより、宿主としての動物
細胞内で外来遺伝子を発現させる際に、本発明の複合プ
ラスミドベクターにより形質転換された宿主を選別する
ためのgene markerとしてEco-gpt遺伝子が作用して、形
質転換された宿主がマイコフェノーリック酸耐性を帯び
るので、形質転換された宿主の選別が容易である。そし
て、その際、SV40プロモーターはホルモン調節を受けな
いので、Eco-gpt遺伝子のgene markerとしての作用がMM
TVプロモーターでのホルモン調節と干渉することはな
い。
さらに、本発明のプラスミドベクターは、大腸菌プラス
ミドpBR322由来のアンピシリン耐性領域と複製開始部位
とを有する第５のDNA断片を含んで成る構成としたこと
により、宿主としての動物細胞の、本発明の複合プラス
ミドによる形質転換処理に先がけて、そのポリリンカー
に外来遺伝子の挿入された本発明の複合プラスミドを大
腸菌を宿主として増幅する際に、該アンピシリン耐性遺
伝子が大腸菌内でのgene markerとして作用して、形質
転換された宿主がアンピシリン耐性を帯びるので、ここ
での、形質転換された宿主の選別も容易である。
ミドpBR322由来のアンピシリン耐性領域と複製開始部位
とを有する第５のDNA断片を含んで成る構成としたこと
により、宿主としての動物細胞の、本発明の複合プラス
ミドによる形質転換処理に先がけて、そのポリリンカー
に外来遺伝子の挿入された本発明の複合プラスミドを大
腸菌を宿主として増幅する際に、該アンピシリン耐性遺
伝子が大腸菌内でのgene markerとして作用して、形質
転換された宿主がアンピシリン耐性を帯びるので、ここ
での、形質転換された宿主の選別も容易である。
その上、本発明の複合プラスミドは、第１のLTR領域の
下流に、ウイルスを粒子状にパッキングする作用を奏す
る領域を有する第１のDNA断片と、その下流に配置さ
れ、第２のLTR領域を有する第３のDNA断片との間に配置
されたポリリンカーに外来遺伝子を挿入する構成とした
ことにより、第１のLTR領域から第２のLTR領域に至る間
のDNA領域での、外来遺伝子を含む複製物をウイルス粒
子として回収可能である。さすれば、回収されたウイル
ス粒子自体を宿主としての動物細胞に感染(transfect)
させることで、多量の宿主内での外来遺伝子の発現によ
る目的蛋白の生産が可能となる。
下流に、ウイルスを粒子状にパッキングする作用を奏す
る領域を有する第１のDNA断片と、その下流に配置さ
れ、第２のLTR領域を有する第３のDNA断片との間に配置
されたポリリンカーに外来遺伝子を挿入する構成とした
ことにより、第１のLTR領域から第２のLTR領域に至る間
のDNA領域での、外来遺伝子を含む複製物をウイルス粒
子として回収可能である。さすれば、回収されたウイル
ス粒子自体を宿主としての動物細胞に感染(transfect)
させることで、多量の宿主内での外来遺伝子の発現によ
る目的蛋白の生産が可能となる。
続いて、本発明の複合プラスミドの実益につき言及すれ
ば以下のとおりである。
ば以下のとおりである。
すなわち、レトロウイルス由来の本複合プラスミドベク
ターは、宿主細胞の染色体に組み込まれて安定に存在
し、しかも、LTR領域にあるMMTVのプロモーターが強力
であるので、大量の遺伝子産物を生産するのに好適であ
る。MMTVのプロモーターは、グルココルチコイドホルモ
ン感受性であり、このホルモンの添加によりプロモータ
ーの活性が上昇することから、これにより外来遺伝子の
形質発現を調節することができ、例えば、グルココルチ
コイドホルモンでプロモーターの活性をオンオフ制御す
ることで、外来遺伝子由来の蛋白が宿主の生態系内でど
のように作用するのかを有効に検証するのに利用可能で
あり、さらには、外来遺伝子が、宿主細胞にとって有害
なものである場合に、その遺伝子の発現を抑制させた状
態で、これを細胞内に導入するのにも利用可能である。
ターは、宿主細胞の染色体に組み込まれて安定に存在
し、しかも、LTR領域にあるMMTVのプロモーターが強力
であるので、大量の遺伝子産物を生産するのに好適であ
る。MMTVのプロモーターは、グルココルチコイドホルモ
ン感受性であり、このホルモンの添加によりプロモータ
ーの活性が上昇することから、これにより外来遺伝子の
形質発現を調節することができ、例えば、グルココルチ
コイドホルモンでプロモーターの活性をオンオフ制御す
ることで、外来遺伝子由来の蛋白が宿主の生態系内でど
のように作用するのかを有効に検証するのに利用可能で
あり、さらには、外来遺伝子が、宿主細胞にとって有害
なものである場合に、その遺伝子の発現を抑制させた状
態で、これを細胞内に導入するのにも利用可能である。
本発明の複合プラスミドは、Sa1I、SnaI、EcoRI、XbaIの切
断サイトが各１ヶ所ポリリンカーサイトに存在し、ま
た、Bam HI、AccIの切断サイトが各２ヶ所存在する（そ
のうち各１ヶ所はポリリンカーサイトに存在する）の
で、Sa1I、BamHI、Bg1 II、Bc1I、SmaI、EcoRI、XbaI、XhoI、A
ccI、TaqI,Sau3A断片等を容易にクローニングすることが
できる。
断サイトが各１ヶ所ポリリンカーサイトに存在し、ま
た、Bam HI、AccIの切断サイトが各２ヶ所存在する（そ
のうち各１ヶ所はポリリンカーサイトに存在する）の
で、Sa1I、BamHI、Bg1 II、Bc1I、SmaI、EcoRI、XbaI、XhoI、A
ccI、TaqI,Sau3A断片等を容易にクローニングすることが
できる。
本複合プラスミドベクターは、大腸菌中にて複製可能で
あり、pMM102を保有する大腸菌は、アンピシリンによっ
て選択できる。
あり、pMM102を保有する大腸菌は、アンピシリンによっ
て選択できる。
本複合プラスミドベクターの合成過程を第１図〜第２図
に、また、その制限酵素切断地図を第３に示す。
に、また、その制限酵素切断地図を第３に示す。
以下に、本発明の複合プラスミドベクターの実施例を示
して、本発明を詳細に説明する。
して、本発明を詳細に説明する。
＜複合プラスミドベクターpMM102の合成＞ （１）pMM1の合成 ２μ１のｐＢＲ３２２ＤＮＡ（０．５μｇ／μ１）に、
２μ１の10倍濃度緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
１）ｐＨ７．６）、７０ｍＭ−ＭｇＣ１２、７０ｍＭ−
β−メルカプトエタノール、500mM-NaC1)を加えた後、
水を加えて全量を18μ1にし、これに１μ１のＢａｍＨ
Ｉ（１０ｕｎｉｔ／μ１）、１μ１のＳａ１ Ｉ（８ｕ
ｎｉｔ／μ１）を加え、37゜Cにて１時間反応させた。65
゜Cにて５分間加熱して反応を止めた後、1%アガロースゲ
ルにて電気泳動を行ない、4.1Kbpの長さのバンドを切り
出した。次いで、このゲルを透析チューブに入れ、電気
泳動を行なって、DNAを解析チューブ中のTris-酢酸緩衝
液(0.04M-Tris-酢酸(pH7.5)、0.001M-EDTA)に流し出し
た。この液を取り出し、等量のフェノールを加えて振と
うした後、15,000rpm、５分間遠心処理してDNAを含む水
層を採取し、再び、等量のフェノールを加え、前記操作
を繰返して、DNAを含む水層を採取した。次に、等量の
クロロホルムを加えて、同じ操作を繰返して得たDNAを
含む水層に、これの10分の１量の3M-酢酸ナトリウム液
(pH7.0)を加え、３倍量のエタノールを加え、-70゜Cにて
10分間冷却した。０゜Cにて、15,000rpm、10分間遠心し
て沈澱させ、エタノールを蒸発させた後、１０μ１の水
に溶解した。
２μ１の10倍濃度緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
１）ｐＨ７．６）、７０ｍＭ−ＭｇＣ１２、７０ｍＭ−
β−メルカプトエタノール、500mM-NaC1)を加えた後、
水を加えて全量を18μ1にし、これに１μ１のＢａｍＨ
Ｉ（１０ｕｎｉｔ／μ１）、１μ１のＳａ１ Ｉ（８ｕ
ｎｉｔ／μ１）を加え、37゜Cにて１時間反応させた。65
゜Cにて５分間加熱して反応を止めた後、1%アガロースゲ
ルにて電気泳動を行ない、4.1Kbpの長さのバンドを切り
出した。次いで、このゲルを透析チューブに入れ、電気
泳動を行なって、DNAを解析チューブ中のTris-酢酸緩衝
液(0.04M-Tris-酢酸(pH7.5)、0.001M-EDTA)に流し出し
た。この液を取り出し、等量のフェノールを加えて振と
うした後、15,000rpm、５分間遠心処理してDNAを含む水
層を採取し、再び、等量のフェノールを加え、前記操作
を繰返して、DNAを含む水層を採取した。次に、等量の
クロロホルムを加えて、同じ操作を繰返して得たDNAを
含む水層に、これの10分の１量の3M-酢酸ナトリウム液
(pH7.0)を加え、３倍量のエタノールを加え、-70゜Cにて
10分間冷却した。０゜Cにて、15,000rpm、10分間遠心し
て沈澱させ、エタノールを蒸発させた後、１０μ１の水
に溶解した。
２０μ１のクローンH(Ce11,23,335-345(1981))（１μｇ
／μ１）を前記と同様にして、BamHIとＸｈｏＩ（６ｕ
ｎｉｔ／μ１）尾で切断し、１％アガロースゲルにて電
気泳動し、3.6Kbpのバンドを切り出し、前記方法にてDN
Aを抽出した。これを１０μ１の水に溶解し、前記のpBR
322のBamHI、Sa1I切断０．１μ１、２μ１の10倍緩衝液
(660mM-Tris-HC1(pH7.5)、66mM-MgC12、100mM-DTT、1mM-AT
P)を加え、水で全量を１８μ１にした。２μ１のT4リガ
ーゼ（１．４ｕｎｉｔ／μ１）を加え、４゜Cにて１晩反
応させた。これを、５倍に希釈し、その１μ１を２０μ
１のコンピテント状態の大腸菌HB101に加え、０゜Cにて3
0分間放置した。42゜Cにて２分間加温した後、８０μ１
のL-ブロスを加え、37゜Cにて30分間培養し、これを４０
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む寒天培地のプレート上
で、37゜Cにて一晩培養した。得られたコロニーを解析
し、pBR322のBamHI-Sa1I断片に、クローンＨのBamHI-Xh
oI断片が連結したものを選択して、pMM1を得た。
／μ１）を前記と同様にして、BamHIとＸｈｏＩ（６ｕ
ｎｉｔ／μ１）尾で切断し、１％アガロースゲルにて電
気泳動し、3.6Kbpのバンドを切り出し、前記方法にてDN
Aを抽出した。これを１０μ１の水に溶解し、前記のpBR
322のBamHI、Sa1I切断０．１μ１、２μ１の10倍緩衝液
(660mM-Tris-HC1(pH7.5)、66mM-MgC12、100mM-DTT、1mM-AT
P)を加え、水で全量を１８μ１にした。２μ１のT4リガ
ーゼ（１．４ｕｎｉｔ／μ１）を加え、４゜Cにて１晩反
応させた。これを、５倍に希釈し、その１μ１を２０μ
１のコンピテント状態の大腸菌HB101に加え、０゜Cにて3
0分間放置した。42゜Cにて２分間加温した後、８０μ１
のL-ブロスを加え、37゜Cにて30分間培養し、これを４０
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む寒天培地のプレート上
で、37゜Cにて一晩培養した。得られたコロニーを解析
し、pBR322のBamHI-Sa1I断片に、クローンＨのBamHI-Xh
oI断片が連結したものを選択して、pMM1を得た。
（２）pMM2の合成 pMM1 DNAを、前記と同様の方法にて、PvuIIにより切断
した。4.5Kbpのバンドをアガロースゲルより切り出し、
DNAを抽出した。次いで、前記（１）と同様に、T4リガ
ーゼにより連結し、さらに、大腸菌HB101を形質転換さ
せて、pMM2を得た。
した。4.5Kbpのバンドをアガロースゲルより切り出し、
DNAを抽出した。次いで、前記（１）と同様に、T4リガ
ーゼにより連結し、さらに、大腸菌HB101を形質転換さ
せて、pMM2を得た。
（３）pMM3の合成 前記クローンＨを、Ba1IIで切断し、アガローズゲルか
ら4.5kbppMM1の断片を抽出した。これを、pMM2のBamHI
切断片と、前記（１）と同様に処理して、pMM3を得た。
ら4.5kbppMM1の断片を抽出した。これを、pMM2のBamHI
切断片と、前記（１）と同様に処理して、pMM3を得た。
（４）pMM4の合成 前記pMM3をHindIIIとEcoRIで切断し、エタノールにて沈
澱させた後、２１μ１の水に溶解させた。２．５μ１の
緩衝液（０．５Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７．２）、
０．１Ｍ−ＭｇＣ１２、１ｍＭ ＤＴＴ、５００μｇ／
ｍ１ ＢＳＡ）と、１μ１のデオキシヌクレチオド混合
液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各２ｍ
Ｍ）を加え、０．５μ１のKlenow酵素（２．６ｕｎｉｔ
／μ１）を加えて、室温にて、30分間放置した。65゜Cに
て、５分間加温した後、２μ１のT4リガーゼを加え、連
結して、HindIIIとEcoRIの切断点の無くなったpMM4を得
た。
澱させた後、２１μ１の水に溶解させた。２．５μ１の
緩衝液（０．５Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７．２）、
０．１Ｍ−ＭｇＣ１２、１ｍＭ ＤＴＴ、５００μｇ／
ｍ１ ＢＳＡ）と、１μ１のデオキシヌクレチオド混合
液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各２ｍ
Ｍ）を加え、０．５μ１のKlenow酵素（２．６ｕｎｉｔ
／μ１）を加えて、室温にて、30分間放置した。65゜Cに
て、５分間加温した後、２μ１のT4リガーゼを加え、連
結して、HindIIIとEcoRIの切断点の無くなったpMM4を得
た。
（５）pMM5の合成 前記pMM4をXbaIで切断し、Klenow酵素で処理した断片
を、πAN7由来のHindIII-EcoRI断片をKlenow酵素で処理
したポリリンカーサイト（多重制限酵素切断部位）に連
結し、前記（１）と同様に処理して、pMM5を得た。
を、πAN7由来のHindIII-EcoRI断片をKlenow酵素で処理
したポリリンカーサイト（多重制限酵素切断部位）に連
結し、前記（１）と同様に処理して、pMM5を得た。
（６）pMM6の合成 前記pMM5をApaIとKpnIで切断し、DNA断片を、エタノー
ル沈澱で回収して、１６μ１の水に溶解した。２μ１の
緩衝液(0.33M-Tris-酢酸(pH7.9)、0.66M-酢酸ナトリウ
ム、0.10M-酢酸マグネシウム、5.0mM-DDT,1mg/m1 BS
A)、１μ１のデオキシヌクレオチド混合液（各2mM）、
１μ１のT4DNAポリメラーゼを加え、37゜Cにて、５分間
保温した。1μ1の0.5M-EDTAを加えて反応を止め、フェ
ノール抽出した後、エタノール沈澱により、DNAを回収
した。これを前記(1)と同様に処理して、pMM6を得た。
ル沈澱で回収して、１６μ１の水に溶解した。２μ１の
緩衝液(0.33M-Tris-酢酸(pH7.9)、0.66M-酢酸ナトリウ
ム、0.10M-酢酸マグネシウム、5.0mM-DDT,1mg/m1 BS
A)、１μ１のデオキシヌクレオチド混合液（各2mM）、
１μ１のT4DNAポリメラーゼを加え、37゜Cにて、５分間
保温した。1μ1の0.5M-EDTAを加えて反応を止め、フェ
ノール抽出した後、エタノール沈澱により、DNAを回収
した。これを前記(1)と同様に処理して、pMM6を得た。
（７）pMM7の合成 前記pMM6をNdeIで切断し、フェノール抽出した後、アガ
ロースゲルにて電気泳動し、7.5Kbpのバンドを切出し、
フェノール抽出、エタノール沈澱により、DNAを回収し
た。これをHindIIIで切断し、Klenow酵素で処理し、さ
らに前記（１）と同様に処理して、pMM7を得た。
ロースゲルにて電気泳動し、7.5Kbpのバンドを切出し、
フェノール抽出、エタノール沈澱により、DNAを回収し
た。これをHindIIIで切断し、Klenow酵素で処理し、さ
らに前記（１）と同様に処理して、pMM7を得た。
（８）pMM7X1の合成 前記pMM7を、NdeIで切断し、6.5KbpのDNAを得た。これ
に、１μ１のXhoIリンカー（０．０２ ＯＤ ｕｎｉｔ
／μ１、宝酒造（株）製）を加えて、全量２０μ１の反
応液中にて連結させ、前記（１）と同様に処理して、ポ
リリンカーから離れた方のNdeIサイトにXhoIリンカーが
連結したpMM7X1を得た。
に、１μ１のXhoIリンカー（０．０２ ＯＤ ｕｎｉｔ
／μ１、宝酒造（株）製）を加えて、全量２０μ１の反
応液中にて連結させ、前記（１）と同様に処理して、ポ
リリンカーから離れた方のNdeIサイトにXhoIリンカーが
連結したpMM7X1を得た。
（９）pMM8の合成 １０μｇのpSV2gpt(Science,209,1422-1427(1980))をpv
uIIとBamHIで切断し、2.2Kbpの断片とアガロースゲルに
て抽出した。Klenow酵素で処理し、XhoIリンカーと連結
させた後、XhoIで切断した。アガロースゲルにて、2.2K
bpの断片を抽出し、これを前記pMM7X1のXhoI切断片と連
結して、pMM8を得た。
uIIとBamHIで切断し、2.2Kbpの断片とアガロースゲルに
て抽出した。Klenow酵素で処理し、XhoIリンカーと連結
させた後、XhoIで切断した。アガロースゲルにて、2.2K
bpの断片を抽出し、これを前記pMM7X1のXhoI切断片と連
結して、pMM8を得た。
(10)pMM102の合成 １０μｇのpCVSVE(Mo1.Ce11.Bio1.,2,1304-1319(1982))
をPstIとHindIIIにより切断し、アクリルアミドゲルに
より、約90bpの断片を抽出した。前記pMM8をPstIで切断
し、アガロースゲルにより8.7Kbpの断片を抽出した。さ
らに、HindIIIで切断し、前記の90bpの断片と連結してp
MM102を得た。
をPstIとHindIIIにより切断し、アクリルアミドゲルに
より、約90bpの断片を抽出した。前記pMM8をPstIで切断
し、アガロースゲルにより8.7Kbpの断片を抽出した。さ
らに、HindIIIで切断し、前記の90bpの断片と連結してp
MM102を得た。
＜実施例１＞ この実施例は、pMM102の、動物細胞への導入とそこでの
実現に関するものである。
実現に関するものである。
１００μｇのpMM102を滅菌蒸留水に溶解し、2.5M-CaC12
を0.5m1加えた。HNP溶液(50mM-HEPES、280mM-NaC1、1.5mM
-Na2HPO4、pH7.1)をチューブに2.5m1とり、空気を送り込
んで泡だたせながら、上記DNA-CaC12溶液を一滴ずつ加
え、室温にて30分間放置して沈澱させた。
を0.5m1加えた。HNP溶液(50mM-HEPES、280mM-NaC1、1.5mM
-Na2HPO4、pH7.1)をチューブに2.5m1とり、空気を送り込
んで泡だたせながら、上記DNA-CaC12溶液を一滴ずつ加
え、室温にて30分間放置して沈澱させた。
一方、6cm直径のシャーレ当り３×１０５個（１０４／m
2）となるように、ダルベッコ変法イーグル培地(In Vit
ro,9,468-469(1974))に10%牛胎児血清を添加した培地に
て、ミンク肺細胞(ATCC CCL64)を培養し、これに、前記
沈澱を各シャーレにつき0.5m1滴下し、16時間培養し
た。0.6m1のDMSOを最終濃度が10%になるように加え、30
分間放置後、新培地と交換して培養を続けた。得られた
細胞を選択培地（前記培地に１５μｇ／ｍ１ヒポキサン
チン、１０μｇ／ｍ１チミジン、５μｇ／ｍ１グリシ
ン、２μｇ／ｍ１アミノプテリン、２５μｇ／ｍ１マイ
コフェノーリック酸、２５０μｇ／ｍ１キサンチンを加
えたもの）にて約２週間培養して、マイコフェノーリッ
ク酸耐性のコロニーを得た。これは、pMM102が細胞に取
り込まれ、Eco-gpt遺伝子が発現している結果であるこ
とを示す。
2）となるように、ダルベッコ変法イーグル培地(In Vit
ro,9,468-469(1974))に10%牛胎児血清を添加した培地に
て、ミンク肺細胞(ATCC CCL64)を培養し、これに、前記
沈澱を各シャーレにつき0.5m1滴下し、16時間培養し
た。0.6m1のDMSOを最終濃度が10%になるように加え、30
分間放置後、新培地と交換して培養を続けた。得られた
細胞を選択培地（前記培地に１５μｇ／ｍ１ヒポキサン
チン、１０μｇ／ｍ１チミジン、５μｇ／ｍ１グリシ
ン、２μｇ／ｍ１アミノプテリン、２５μｇ／ｍ１マイ
コフェノーリック酸、２５０μｇ／ｍ１キサンチンを加
えたもの）にて約２週間培養して、マイコフェノーリッ
ク酸耐性のコロニーを得た。これは、pMM102が細胞に取
り込まれ、Eco-gpt遺伝子が発現している結果であるこ
とを示す。
＜実施例２＞ この実施例はMMTVのプロモータ作用の、グルココルチコ
イドホルモンへの依存性に関するものである。
イドホルモンへの依存性に関するものである。
実施例１で得たマイコフェノーリック酸耐性株15株をそ
れぞれ個別に培養し、各々の株を２つの群に分け、一方
に１０−６Ｍのデキサメタゾンを加えた。20時間後に、
細胞からグアニジウム-CsC1によって全RNAを抽出した。
pMM102をBg1IIで切断して得たMMTVプロモーターの下流
のDNA断片を３２Ｐアイソトープでラベルし、これを用
いてハイブリダイゼーション法により、前記Bg1II断片
と相補性をもつRNA量を分析したところ、デキサメタゾ
ン添加によって、RNAの転写量が、約10倍以上増加した
株が２株得られた。これは、MMTVのプロモーターによる
RNAの転写が、前記ホルモン依存性であることを示す。
れぞれ個別に培養し、各々の株を２つの群に分け、一方
に１０−６Ｍのデキサメタゾンを加えた。20時間後に、
細胞からグアニジウム-CsC1によって全RNAを抽出した。
pMM102をBg1IIで切断して得たMMTVプロモーターの下流
のDNA断片を３２Ｐアイソトープでラベルし、これを用
いてハイブリダイゼーション法により、前記Bg1II断片
と相補性をもつRNA量を分析したところ、デキサメタゾ
ン添加によって、RNAの転写量が、約10倍以上増加した
株が２株得られた。これは、MMTVのプロモーターによる
RNAの転写が、前記ホルモン依存性であることを示す。
＜実施例３＞ この実施例は、CAT遺伝子の動物細胞中で発現に関する
ものである。
ものである。
プラスミドpBR325(Gene,14、289(1981))をTaqIで切断し
てクロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT遺伝子）を含
む断片を得た。これをKlenow酵素で処理した後、Sa1Iリ
ンカーを連結し、pMM102のポリリンカーのSa1Iサイトに
クローニングした。CAT遺伝子がプロモーターに対し正
方向に挿入したものを選択し、これを実施例１と同様の
方法にて、ミンク肺細胞へ導入した。48時間後に細胞を
集め、0.25M Tris緩衝液に溶解後、１分間超音波処理し
て細胞を破壊し、15,000rpm、５分間遠心し、上清を集
めた。これに１４Ｃでラベルしたクロラムフェニコー
ル、アセチルCoAを加え37゜Cにて60分間保温した後、酢
酸エチルにより抽出し、有機層を乾燥させ、これを１０
μ１の酢酸エチルに溶かし、シリカゲルの薄層クロマト
にスポットし、95：5(V/V)のクロロフォルム−メタノー
ルにより展開した。展開終了後、乾燥させて、Ｘ線フィ
ルムを密着させてオートラジオグラフィー法にて解析し
た結果、CAT遺伝子を導入した細胞の抽出液において、
クロラムフェニコールがアセチル化されていた。これ
は、前記細胞中にてCAT遺伝子が発現されていることを
示す。
てクロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT遺伝子）を含
む断片を得た。これをKlenow酵素で処理した後、Sa1Iリ
ンカーを連結し、pMM102のポリリンカーのSa1Iサイトに
クローニングした。CAT遺伝子がプロモーターに対し正
方向に挿入したものを選択し、これを実施例１と同様の
方法にて、ミンク肺細胞へ導入した。48時間後に細胞を
集め、0.25M Tris緩衝液に溶解後、１分間超音波処理し
て細胞を破壊し、15,000rpm、５分間遠心し、上清を集
めた。これに１４Ｃでラベルしたクロラムフェニコー
ル、アセチルCoAを加え37゜Cにて60分間保温した後、酢
酸エチルにより抽出し、有機層を乾燥させ、これを１０
μ１の酢酸エチルに溶かし、シリカゲルの薄層クロマト
にスポットし、95：5(V/V)のクロロフォルム−メタノー
ルにより展開した。展開終了後、乾燥させて、Ｘ線フィ
ルムを密着させてオートラジオグラフィー法にて解析し
た結果、CAT遺伝子を導入した細胞の抽出液において、
クロラムフェニコールがアセチル化されていた。これ
は、前記細胞中にてCAT遺伝子が発現されていることを
示す。
第１図は、本発明の複合プラスミドベクターpMM102の中
間体pMM1〜pMM5の合成過程を示す。 第２図は、同中間体pMM6〜pMM8及び本発明の複合プラス
ミドベクターpMM102の合成過程を示す。 第３図は、pMM102の制限酵素切断地図を示す。 第３Ａ図は、pMM102の制限酵素切断地図を模式的に示
す。 第４図は、πAN7由来のポリリンカーの塩基配列を示
す。 第５図は、XhoIリンカーの塩基配列を示す。なお、第１
図中、クローンＨの記号は、以下の制限酵素の略号を示
す。また、（ ）は、消滅した制限酵素サイトを示す。 Ba：BamHI、Ｐ：PstI Bg：Bg1II、Ｓ：SstI Ｅ：EcoRI、Xh：XhoI Ｈ：HindIII、Xb：XbaI Ｋ：KpnI
間体pMM1〜pMM5の合成過程を示す。 第２図は、同中間体pMM6〜pMM8及び本発明の複合プラス
ミドベクターpMM102の合成過程を示す。 第３図は、pMM102の制限酵素切断地図を示す。 第３Ａ図は、pMM102の制限酵素切断地図を模式的に示
す。 第４図は、πAN7由来のポリリンカーの塩基配列を示
す。 第５図は、XhoIリンカーの塩基配列を示す。なお、第１
図中、クローンＨの記号は、以下の制限酵素の略号を示
す。また、（ ）は、消滅した制限酵素サイトを示す。 Ba：BamHI、Ｐ：PstI Bg：Bg1II、Ｓ：SstI Ｅ：EcoRI、Xh：XhoI Ｈ：HindIII、Xb：XbaI Ｋ：KpnI
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】(A)ホルモン感受領域と該感受領域の下流
に配置されたMMTVプロモーターとが含まれているマウス
乳癌ウイルス(MMTV)由来の第１のLTR領域を含む第１のD
NA断片、 (B)第１のDNA断片の下流に配置され、プラスミドpCVSVE
由来の3′−スプライシングサイトを含む第２のDNA断
片、 (C)第２のDNA断片の下流に配置されたπAN7由来のポリ
リンカー、 (D)ポリリンカーの下流に配置され、RNA転写停止部位が
含まれているマウス乳癌ウイルス(MMTV)由来の第２のLT
R領域を含む第３のDNA断片、 (E)第３のDNA断片の下流に配置され、pSV2gpt由来のSV4
0プロモーターとpSV2gpt由来のEco-gpt遺伝子とが含ま
れている第４のDNA断片、 (F)第４のDNA断片の下流に配置され、pBR322由来のアン
ピシリン耐性遺伝子とpBR322由来の複製開始部位とが含
まれている第５のDNA断片とから成る複合プラスミドベ
クター。 - 【請求項２】第１のDNA断片が、マウス乳癌ウイルス(MM
TV)をラムダファージベクターλｇｔＷＥＳ・λＢのEco
RIサイトにクローニングして作成したクローンＨのBamH
I-XhoI断片由来のDNA断片である特許請求の範囲第１項
記載の複合プラスミドベクター。 - 【請求項３】第２のDNA断片が、クローンＨのBg1II断片
由来のDNA断片である特許請求の範囲第１項記載の複合
プラスミドベクター。 - 【請求項４】3′−スプライシングサイトを含む第２のD
NA断片が、pCVSVEのPstI-HindIII断片由来のDNA断片で
ある特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミドベクタ
ー。 - 【請求項５】Eco-gpt遺伝子を含む第４のDNA断片が、pS
V2gptのPvu II-BamHI断片由来のDNA断片である特許請求
の範囲第１項記載の複合プラスミドベクター。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60191427A JPH0630590B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | 複合プラスミドベクタ− |
| CA000516964A CA1287002C (en) | 1985-08-30 | 1986-08-27 | Chimeric plasmid vector |
| AT86306714T ATE74623T1 (de) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Chimaerer plasmidvektor. |
| EP86306714A EP0219214B1 (en) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Chimeric plasmid vector |
| DE8686306714T DE3684753D1 (de) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Chimaerer plasmidvektor. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60191427A JPH0630590B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | 複合プラスミドベクタ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6251991A JPS6251991A (ja) | 1987-03-06 |
| JPH0630590B2 true JPH0630590B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=16274431
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60191427A Expired - Lifetime JPH0630590B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | 複合プラスミドベクタ− |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0219214B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0630590B2 (ja) |
| AT (1) | ATE74623T1 (ja) |
| CA (1) | CA1287002C (ja) |
| DE (1) | DE3684753D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1309044C (en) * | 1987-11-09 | 1992-10-20 | Toshiya Takano | Method of producing foreign gene products |
| JPH04500004A (ja) * | 1988-07-29 | 1992-01-09 | ザイモジェネティクス，インコーポレイティド | 真核細胞におけるポリシストロン性メッセージの高率翻訳 |
| US5665873A (en) * | 1995-02-09 | 1997-09-09 | Dana Farber Cancer Institute | Glucocorticoid response elements |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0115936A1 (en) * | 1983-01-24 | 1984-08-15 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Chimeric plasmids |
| GB8424757D0 (en) * | 1984-10-01 | 1984-11-07 | Pasteur Institut | Retroviral vector |
-
1985
- 1985-08-30 JP JP60191427A patent/JPH0630590B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
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- 1986-08-29 EP EP86306714A patent/EP0219214B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 AT AT86306714T patent/ATE74623T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 DE DE8686306714T patent/DE3684753D1/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0219214B1 (en) | 1992-04-08 |
| ATE74623T1 (de) | 1992-04-15 |
| EP0219214A1 (en) | 1987-04-22 |
| DE3684753D1 (de) | 1992-05-14 |
| CA1287002C (en) | 1991-07-30 |
| JPS6251991A (ja) | 1987-03-06 |
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