JPWO2004096860A1 - 目的蛋白質の製造方法、融合蛋白質及びその遺伝子、インテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体 - Google Patents
目的蛋白質の製造方法、融合蛋白質及びその遺伝子、インテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2004096860A1 JPWO2004096860A1 JP2004569240A JP2004569240A JPWO2004096860A1 JP WO2004096860 A1 JPWO2004096860 A1 JP WO2004096860A1 JP 2004569240 A JP2004569240 A JP 2004569240A JP 2004569240 A JP2004569240 A JP 2004569240A JP WO2004096860 A1 JPWO2004096860 A1 JP WO2004096860A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- fusion protein
- intein
- target protein
- partial sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
- C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
- C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
通常の遺伝子組換え技術によっては発現が難しい蛋白質であっても、効率的に正常型蛋白質として目的蛋白質を得ることができる技術を提供することを課題とする。分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質を調製し、該融合蛋白質から該ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって目的蛋白質を切り出す。ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の例として、インテイン及びその部分配列蛋白質が挙げられる。
Description
本発明は、目的蛋白質の製造方法、融合蛋白質及びその遺伝子、インテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体に関する。さらに詳細には、本発明は、分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質から該介在蛋白質の作用によって目的蛋白質を切り出す目的蛋白質の製造方法、該融合蛋白質及びその遺伝子、ペプチド結合切断活性を有するインテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体に関する。本発明によれば、通常の遺伝子組換え技術によっては発現が難しい蛋白質であっても、効率的に正常型蛋白質として目的蛋白質を得ることができる。
これまでにバクテリア、酵母、昆虫、動植物細胞又はトランスジェニック動植物などの多くの宿主における蛋白質発現系、さらに無細胞翻訳系など、種々の蛋白質発現系が開発されている。特に近年、種々の生物でのゲノムが次々と解読され、遺伝子から組換え蛋白質を生産し解析するニーズは益々高まっている。しかしながら、目的とする全ての蛋白質がこれらの蛋白質発現系で容易に得られるわけではない。例えば、宿主に対する毒性を有する蛋白質、不溶化しやすい蛋白質などは、依然として組換え蛋白質として得ることが困難である。具体的には、目的蛋白質が宿主に対して毒性を有する場合、宿主内においてその蛋白質の合成が抑制され、発現量が低下することがある。また、発現した目的蛋白質が正しく折り畳まれず、目的蛋白質が間違った立体構造を有する異常型蛋白質としてしか得られない場合がある。特に、異常型蛋白質は封入体と呼ばれる不溶性の凝集体を形成することが多い。そして、いったん封入体となった異常型蛋白質を折り畳み直して正常型蛋白質とすることは非常に困難であり、成功しないことが多い。
目的蛋白質が封入体を形成しないようにする方法としては、目的蛋白質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、マルトース結合蛋白質等との融合蛋白質として発現させる方法が提案されている。しかし、この方法では、封入体の形成を高効率で解消することは難しい（例えば、スミス・ディ・ビ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９８８年、第６７巻、ｐ．３１−４０）。一方、蛋白質の折り畳み反応を支援する蛋白質である分子シャペロンの作用によって、目的蛋白質を正しい立体構造を有する正常型蛋白質として発現させる試みもある。例えば、目的蛋白質を分子シャペロンと宿主内で共発現させ、その分子シャペロンの作用によって目的蛋白質を正常型蛋白質として発現させる方法もある。しかし、この方法においても正常型蛋白質として得られる目的蛋白質の量を飛躍的に増加させるには至っていない（ニシハラ（Ｎｉｓｈｉｈａｒａ）ら、アプライド・アンド・エンビロメンタル・ミクロバイオロジー．（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９８年、第６４巻、ｐ．１６９４−１６９９）。
分子シャペロンの作用を利用する別の方法として、分子シャペロンの一種であるシャペロニンのサブユニット同士を連結したシャペロニンサブユニット連結体を利用する試みもある。すなわち、目的蛋白質を１〜２０個のシャペロニンサブユニットが直列に連結されたシャペロニンサブユニット連結体との融合蛋白質を作製して利用する。この際、目的蛋白質は天然のシャペロニンと複合体を形成するのと同様に、シャペロニンの立体構造内部に格納される。その結果、目的蛋白質は正しく折り畳まれた正常型蛋白質として得られやすくなり、封入体の形成を抑制することができる。さらに、目的蛋白質が宿主に対する毒性を有する場合でも、シャペロニンの内部に格納されているので毒性を抑えることができる。さらに、宿主由来のプロテアーゼによる攻撃から目的蛋白質を守ることもできる（ＷＯ０２／０５２０２９ Ａ１参照）。すなわち、この方法によると、宿主に対する毒性を有する種々のウイルス抗原、種々の抗体、７回膜貫通型受容体（Ｇ蛋白質共役型受容体）、あるいはサイトカイン類などを発現することが可能である。
この方法では、従来のＧＳＴ、チオレドキシン、マルトース結合蛋白質などの融合蛋白質で用いられている方法と同様に、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す必要がある。具体的には、融合蛋白質に限定分解型プロテアーゼを作用させて、目的蛋白質を切り出す。すなわち、目的蛋白質とシャペロニンサブユニット連結体の間に限定分解型プロテアーゼの認識配列をあらかじめ含めておき、当該プロテアーゼを作用させて目的蛋白質を切り出す。なお、限定分解型プロテアーゼとして、トロンビン、ＦＸａ（活性型血液第Ｘ因子）、エンテロカイネース、プレシジョンプロテアーゼなどが用いられている。
しかしながら、この方法では、目的蛋白質の性質によっては、目的蛋白質自体がプロテアーゼで分解されてしまうことがある。例えば、目的蛋白質がＣ型肝炎ウイルス抗原の場合は、その疎水性が高いため、限定分解型プロテアーゼの認識配列の厳密性が崩れ、認識配列以外の部分が切断されてＣ型肝炎ウイルス抗原自体が分解されてしまう。その他の疎水性が高い領域、膜貫通領域などをもつ蛋白質においても同様の問題がある。
また、プロテアーゼの切断効率は目的蛋白質の種類によって異なる。したがって、この方法では、目的蛋白質の種類によってはプロテアーゼが効かず、目的蛋白質を切り出すことができない場合がある。この切断効率の違いは、限定分解型プロテアーゼが切断部位に接近し認識配列を切断する際の、限定分解型プロテアーゼの入り込みやすさ、接近しやすさの違いに起因するものと考えられる。さらに、この方法では、切り出した目的蛋白質を精製する際に、添加した限定分解型プロテアーゼを除去する必要がある。したがって、目的蛋白質の精製が煩雑となるという問題点も有している。
目的蛋白質が封入体を形成しないようにする方法としては、目的蛋白質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、マルトース結合蛋白質等との融合蛋白質として発現させる方法が提案されている。しかし、この方法では、封入体の形成を高効率で解消することは難しい（例えば、スミス・ディ・ビ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９８８年、第６７巻、ｐ．３１−４０）。一方、蛋白質の折り畳み反応を支援する蛋白質である分子シャペロンの作用によって、目的蛋白質を正しい立体構造を有する正常型蛋白質として発現させる試みもある。例えば、目的蛋白質を分子シャペロンと宿主内で共発現させ、その分子シャペロンの作用によって目的蛋白質を正常型蛋白質として発現させる方法もある。しかし、この方法においても正常型蛋白質として得られる目的蛋白質の量を飛躍的に増加させるには至っていない（ニシハラ（Ｎｉｓｈｉｈａｒａ）ら、アプライド・アンド・エンビロメンタル・ミクロバイオロジー．（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９８年、第６４巻、ｐ．１６９４−１６９９）。
分子シャペロンの作用を利用する別の方法として、分子シャペロンの一種であるシャペロニンのサブユニット同士を連結したシャペロニンサブユニット連結体を利用する試みもある。すなわち、目的蛋白質を１〜２０個のシャペロニンサブユニットが直列に連結されたシャペロニンサブユニット連結体との融合蛋白質を作製して利用する。この際、目的蛋白質は天然のシャペロニンと複合体を形成するのと同様に、シャペロニンの立体構造内部に格納される。その結果、目的蛋白質は正しく折り畳まれた正常型蛋白質として得られやすくなり、封入体の形成を抑制することができる。さらに、目的蛋白質が宿主に対する毒性を有する場合でも、シャペロニンの内部に格納されているので毒性を抑えることができる。さらに、宿主由来のプロテアーゼによる攻撃から目的蛋白質を守ることもできる（ＷＯ０２／０５２０２９ Ａ１参照）。すなわち、この方法によると、宿主に対する毒性を有する種々のウイルス抗原、種々の抗体、７回膜貫通型受容体（Ｇ蛋白質共役型受容体）、あるいはサイトカイン類などを発現することが可能である。
この方法では、従来のＧＳＴ、チオレドキシン、マルトース結合蛋白質などの融合蛋白質で用いられている方法と同様に、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す必要がある。具体的には、融合蛋白質に限定分解型プロテアーゼを作用させて、目的蛋白質を切り出す。すなわち、目的蛋白質とシャペロニンサブユニット連結体の間に限定分解型プロテアーゼの認識配列をあらかじめ含めておき、当該プロテアーゼを作用させて目的蛋白質を切り出す。なお、限定分解型プロテアーゼとして、トロンビン、ＦＸａ（活性型血液第Ｘ因子）、エンテロカイネース、プレシジョンプロテアーゼなどが用いられている。
しかしながら、この方法では、目的蛋白質の性質によっては、目的蛋白質自体がプロテアーゼで分解されてしまうことがある。例えば、目的蛋白質がＣ型肝炎ウイルス抗原の場合は、その疎水性が高いため、限定分解型プロテアーゼの認識配列の厳密性が崩れ、認識配列以外の部分が切断されてＣ型肝炎ウイルス抗原自体が分解されてしまう。その他の疎水性が高い領域、膜貫通領域などをもつ蛋白質においても同様の問題がある。
また、プロテアーゼの切断効率は目的蛋白質の種類によって異なる。したがって、この方法では、目的蛋白質の種類によってはプロテアーゼが効かず、目的蛋白質を切り出すことができない場合がある。この切断効率の違いは、限定分解型プロテアーゼが切断部位に接近し認識配列を切断する際の、限定分解型プロテアーゼの入り込みやすさ、接近しやすさの違いに起因するものと考えられる。さらに、この方法では、切り出した目的蛋白質を精製する際に、添加した限定分解型プロテアーゼを除去する必要がある。したがって、目的蛋白質の精製が煩雑となるという問題点も有している。
本発明の目的は、分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質及びその遺伝子、該融合蛋白質から該介在蛋白質の作用によって目的蛋白質を切り出す目的蛋白質の製造方法、ペプチド結合切断活性を有するインテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究の結果、インテインに代表されるペプチド結合切断活性を有する蛋白質と、分子シャペロンとを組み合わせることにより、通常の遺伝子組換え技術によっては発現が難しい蛋白質であっても、効率的に正常型蛋白質として製造することができることを見出した。さらに、本製造方法に有用な、分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質を単離した。さらに、ペプチド結合切断活性を有するインテインの部分配列蛋白質を単離した。さらに、それらをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクター及び該発現ベクターを含有する形質転換体を単離し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブユニットをペプチド結合で連結させ、且つ、他方の末端には目的蛋白質をペプチド結合で連結させたことを特徴とする融合蛋白質。
（２） 分子シャペロンが、複数のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンであることを特徴とする（１）に記載の融合蛋白質。
（３） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、単独のシャペロニンサブユニット、又はシャペロニンサブユニット連結体に連結されており、前記シャペロニンサブユニット連結体は、２〜１０個のシャペロニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結したものであることを特徴とする（２）に記載の融合蛋白質。
（４） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、単独のシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体のＮ末端、単独のシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体のＣ末端、シャペロニンサブユニット連結体のシャペロニンサブユニット同士の連結部、から選択される１又は２以上の部位に連結されていることを特徴とする（３）に記載の融合蛋白質。
（５） シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との数の比が１：１〜１０：１であることを特徴とする（３）又は（４）に記載の融合蛋白質。
（６） 分子シャペロンがペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであることを特徴とする（１）に記載の融合蛋白質。
（７） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼのＮ末端及び／又はＣ末端に連結されていることを特徴とする（６）に記載の融合蛋白質。
（８） 分子シャペロンが、バクテリア、古細菌又は真核生物に由来することを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の融合蛋白質。
（９） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がインテイン又はインテインの部分配列蛋白質であることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載の融合蛋白質。
（１０） インテインが、Ｎ末端を切断するがＣ末端を切断しないものであることを特徴とする（９）に記載の融合蛋白質。
（１１） インテインが、Ｃ末端を切断するがＮ末端を切断しないものであること特徴とする（９）に記載の融合蛋白質。
（１２） インテインの部分配列蛋白質が、インテインのＣ末端から２０〜１２０個のアミノ酸残基からなることを特徴とする（９）に記載の融合蛋白質。
（１３） インテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．由来のものであることを特徴とする（９）〜（１２）のいずれかに記載の融合蛋白質。
（１４） インテインが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．から選択される由来のものであることを特徴とする（９）〜（１２）のいずれかに記載の融合蛋白質。
（１５） インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする（１２）に記載の融合蛋白質。
（１６） インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする（１２）に記載の融合蛋白質。
（１７） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がプロテアーゼであることを特徴とする（１）〜（１６）のいずれかに記載の融合蛋白質。
（１８） 上記（１）〜（１７）のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする単離された遺伝子。
（１９） 上記（１）〜（１７）のいずれかに記載の融合蛋白質から、目的蛋白質を、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって切り出すことを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
（２０） 上記（１）〜（１７）のいずれかに記載の融合蛋白質を調製する工程と、前工程で調製した融合蛋白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質のペプチド結合切断活性を惹起する工程と、前工程でペプチド結合切断活性を惹起したペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用により、融合蛋白質の一部を切断し、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる工程とを含むことを特徴とする（１９）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２１） 前記融合蛋白質を２０〜３７℃の温度に曝すことにより前記ペプチド結合切断活性を惹起することを特徴とする（２０）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２２） 前記融合蛋白質をｐＨ６〜８の水素イオン濃度に曝すことにより前記ペプチド結合切断活性を惹起することを特徴とする（２０）又は（２１）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２３） チオールを添加することにより前記ペプチド結合切断活性を惹起することを特徴とする（２０）〜（２２）のいずれかに目的蛋白質の製造方法。
（２４） 前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製する工程と、前工程で得られた発現ベクターを宿主に導入して該融合蛋白質を発現する工程と、前工程で得られた融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す工程とを含むことを特徴とする（１９）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２５） 同一宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドに、前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んで２種類の発現ベクターを作製する工程と、前工程で得られた２種類の発現ベクターを同一宿主に導入し、該融合蛋白質を発現させる工程と、前工程で得られた融合蛋白質から、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用で目的蛋白質を切り出す工程とを含むことを特徴とする（１９）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２６） 同一宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドの、一方に前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込み、他方に分子シャペロンのみをコードする遺伝子を組み込んで、２種類の発現ベクターを作製する工程と、前工程で得られた２種類の発現ベクターを同一宿主に導入し、該融合蛋白質と該分子シャペロンを発現させる工程と、前工程で得られた融合蛋白質から、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用で目的蛋白質を切り出す工程を含むことを特徴とする（１９）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２７） 宿主は、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする（２４）〜（２６）のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
（２８） 宿主内で融合蛋白質を発現させ、前記宿主はバクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする（１９）〜（２６）のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
（２９） 無細胞翻訳系で行うことを特徴とする（１９）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（３０） 分子シャペロンがシャペロニンであり、５〜１０個のシャペロニンサブユニットがリング状に集合してシャペロニンリングを形成しており、前記目的蛋白質は、該シャペロニンリングの内部に収納されていることを特徴とする（１９）〜（２９）のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
（３１） インテインのＣ末端から２０〜１２０個のアミノ酸残基からなることを特徴とするインテインの部分配列蛋白質。
（３２） インテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．由来のものであることを特徴とする（３１）に記載のインテインの部分配列蛋白質。
（３３） インテインが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．から選択される由来のものであることを特徴とする（３１）に記載のインテインの部分配列蛋白質。
（３４） インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする（３１）に記載のインテインの部分配列蛋白質。
（３５） インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする（３１）に記載のインテインの部分配列蛋白質。
（３６） 上記（３１）〜（３５）のいずれかに記載のインテインの部分配列蛋白質をコードする単離された遺伝子。
（３７） 上記（１８）又は（３６）に記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
（３８） 上記（３７）に記載の発現ベクターを含有する形質転換体。
（３９） インテインの部分配列蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブユニットをペプチド結合で連結させ、且つ、他方の末端には目的蛋白質第１前駆体をペプチド結合で連結させた第１の融合蛋白質を作製する工程１と、該インテインの残余の部分配列蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブユニットをペプチド結合で連結させ、且つ、他方の末端には目的蛋白質第２前駆体をペプチド結合で連結させた第２の融合蛋白質を作製する工程２と、インテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質の切断機能により、工程１で得られた第１の融合蛋白質から目的蛋白質第１前駆体を切り出し、さらに工程２で得られた第２の融合蛋白質から目的蛋白質第２前駆体を切り出す工程３と、インテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質のアセンブリー機能により、工程３で得られた目的蛋白質第１前駆体と目的蛋白質第２前駆体をアセンブルする工程４とを含むことを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
（４０） 分子シャペロンの一方の末端にインテインの部分配列蛋白質、他方の末端に該インテインの残余の部分配列蛋白質がペプチド結合を介して連結され、さらに該インテインの部分配列蛋白質に目的蛋白質第１前駆体がペプチド結合を介して連結され、且つ該インテインの残余の部分配列蛋白質に目的蛋白質第２前駆体がペプチド結合を介して連結された融合蛋白質から、インテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質の切断機能により、目的蛋白質第１前駆体及び目的蛋白質第２前駆体を切り出し、さらにインテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質のアセンブリー機能により、目的蛋白質第１前駆体と目的蛋白質第２前駆体をアセンブルすることを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
（４１） 前記融合蛋白質を宿主内で発現させることを特徴とする（３９）又は（４０）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（４２） 前記宿主が、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする（４１）に記載の融合蛋白質の製造方法。
（４３） 無細胞翻訳系で行うことを特徴とする（３９）又は（４０）に記載の目的蛋白質の製造方法。
本発明の目的蛋白質の製造方法によれば、通常の遺伝子組換え技術によっては発現が難しい目的蛋白質であっても、効率的に正常型蛋白質として目的蛋白質を得ることができる。さらに、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す際においても、より簡便且つ安全に目的蛋白質を切り出すことができる。
本発明の融合蛋白質によれば、通常の遺伝子組換え技術によっては発現が難しい目的蛋白質であっても、融合蛋白質の一部として発現することができる。さらに、融合蛋白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって、目的蛋白質が簡便且つ安全に切り出される。
本発明のインテインの部分配列蛋白質によれば、天然のインテインに比べて分子量が小さいので、分子シャペロンと目的蛋白質との融合蛋白質の分子量を小さくすることができる。したがって、遺伝子組み換え技術により該融合蛋白質をより容易に発現させることができる。
本発明のインテインの部分配列蛋白質の遺伝子によれば、遺伝子組み換え技術によりインテインの部分配列蛋白質を発現することができる。
本発明のベクターによれば、目的蛋白質の遺伝子を導入するだけで、分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子を作製することができ、容易に該融合蛋白質の遺伝子を宿主に導入することができる。また、本発明のベクターによれば、インテインの部分配列蛋白質の遺伝子を容易に宿主に導入することができる。
本発明の形質転換体によれば、分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質を製造することができる。また、本発明の形質転換体によれば、インテインの部分配列蛋白質を製造することができる。
本発明者らは、鋭意研究の結果、インテインに代表されるペプチド結合切断活性を有する蛋白質と、分子シャペロンとを組み合わせることにより、通常の遺伝子組換え技術によっては発現が難しい蛋白質であっても、効率的に正常型蛋白質として製造することができることを見出した。さらに、本製造方法に有用な、分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質を単離した。さらに、ペプチド結合切断活性を有するインテインの部分配列蛋白質を単離した。さらに、それらをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクター及び該発現ベクターを含有する形質転換体を単離し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブユニットをペプチド結合で連結させ、且つ、他方の末端には目的蛋白質をペプチド結合で連結させたことを特徴とする融合蛋白質。
（２） 分子シャペロンが、複数のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンであることを特徴とする（１）に記載の融合蛋白質。
（３） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、単独のシャペロニンサブユニット、又はシャペロニンサブユニット連結体に連結されており、前記シャペロニンサブユニット連結体は、２〜１０個のシャペロニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結したものであることを特徴とする（２）に記載の融合蛋白質。
（４） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、単独のシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体のＮ末端、単独のシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体のＣ末端、シャペロニンサブユニット連結体のシャペロニンサブユニット同士の連結部、から選択される１又は２以上の部位に連結されていることを特徴とする（３）に記載の融合蛋白質。
（５） シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との数の比が１：１〜１０：１であることを特徴とする（３）又は（４）に記載の融合蛋白質。
（６） 分子シャペロンがペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであることを特徴とする（１）に記載の融合蛋白質。
（７） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼのＮ末端及び／又はＣ末端に連結されていることを特徴とする（６）に記載の融合蛋白質。
（８） 分子シャペロンが、バクテリア、古細菌又は真核生物に由来することを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の融合蛋白質。
（９） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がインテイン又はインテインの部分配列蛋白質であることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載の融合蛋白質。
（１０） インテインが、Ｎ末端を切断するがＣ末端を切断しないものであることを特徴とする（９）に記載の融合蛋白質。
（１１） インテインが、Ｃ末端を切断するがＮ末端を切断しないものであること特徴とする（９）に記載の融合蛋白質。
（１２） インテインの部分配列蛋白質が、インテインのＣ末端から２０〜１２０個のアミノ酸残基からなることを特徴とする（９）に記載の融合蛋白質。
（１３） インテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．由来のものであることを特徴とする（９）〜（１２）のいずれかに記載の融合蛋白質。
（１４） インテインが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．から選択される由来のものであることを特徴とする（９）〜（１２）のいずれかに記載の融合蛋白質。
（１５） インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする（１２）に記載の融合蛋白質。
（１６） インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする（１２）に記載の融合蛋白質。
（１７） ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がプロテアーゼであることを特徴とする（１）〜（１６）のいずれかに記載の融合蛋白質。
（１８） 上記（１）〜（１７）のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする単離された遺伝子。
（１９） 上記（１）〜（１７）のいずれかに記載の融合蛋白質から、目的蛋白質を、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって切り出すことを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
（２０） 上記（１）〜（１７）のいずれかに記載の融合蛋白質を調製する工程と、前工程で調製した融合蛋白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質のペプチド結合切断活性を惹起する工程と、前工程でペプチド結合切断活性を惹起したペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用により、融合蛋白質の一部を切断し、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる工程とを含むことを特徴とする（１９）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２１） 前記融合蛋白質を２０〜３７℃の温度に曝すことにより前記ペプチド結合切断活性を惹起することを特徴とする（２０）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２２） 前記融合蛋白質をｐＨ６〜８の水素イオン濃度に曝すことにより前記ペプチド結合切断活性を惹起することを特徴とする（２０）又は（２１）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２３） チオールを添加することにより前記ペプチド結合切断活性を惹起することを特徴とする（２０）〜（２２）のいずれかに目的蛋白質の製造方法。
（２４） 前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製する工程と、前工程で得られた発現ベクターを宿主に導入して該融合蛋白質を発現する工程と、前工程で得られた融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す工程とを含むことを特徴とする（１９）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２５） 同一宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドに、前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んで２種類の発現ベクターを作製する工程と、前工程で得られた２種類の発現ベクターを同一宿主に導入し、該融合蛋白質を発現させる工程と、前工程で得られた融合蛋白質から、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用で目的蛋白質を切り出す工程とを含むことを特徴とする（１９）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２６） 同一宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドの、一方に前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込み、他方に分子シャペロンのみをコードする遺伝子を組み込んで、２種類の発現ベクターを作製する工程と、前工程で得られた２種類の発現ベクターを同一宿主に導入し、該融合蛋白質と該分子シャペロンを発現させる工程と、前工程で得られた融合蛋白質から、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用で目的蛋白質を切り出す工程を含むことを特徴とする（１９）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（２７） 宿主は、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする（２４）〜（２６）のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
（２８） 宿主内で融合蛋白質を発現させ、前記宿主はバクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする（１９）〜（２６）のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
（２９） 無細胞翻訳系で行うことを特徴とする（１９）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（３０） 分子シャペロンがシャペロニンであり、５〜１０個のシャペロニンサブユニットがリング状に集合してシャペロニンリングを形成しており、前記目的蛋白質は、該シャペロニンリングの内部に収納されていることを特徴とする（１９）〜（２９）のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
（３１） インテインのＣ末端から２０〜１２０個のアミノ酸残基からなることを特徴とするインテインの部分配列蛋白質。
（３２） インテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．由来のものであることを特徴とする（３１）に記載のインテインの部分配列蛋白質。
（３３） インテインが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．から選択される由来のものであることを特徴とする（３１）に記載のインテインの部分配列蛋白質。
（３４） インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする（３１）に記載のインテインの部分配列蛋白質。
（３５） インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする（３１）に記載のインテインの部分配列蛋白質。
（３６） 上記（３１）〜（３５）のいずれかに記載のインテインの部分配列蛋白質をコードする単離された遺伝子。
（３７） 上記（１８）又は（３６）に記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
（３８） 上記（３７）に記載の発現ベクターを含有する形質転換体。
（３９） インテインの部分配列蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブユニットをペプチド結合で連結させ、且つ、他方の末端には目的蛋白質第１前駆体をペプチド結合で連結させた第１の融合蛋白質を作製する工程１と、該インテインの残余の部分配列蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブユニットをペプチド結合で連結させ、且つ、他方の末端には目的蛋白質第２前駆体をペプチド結合で連結させた第２の融合蛋白質を作製する工程２と、インテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質の切断機能により、工程１で得られた第１の融合蛋白質から目的蛋白質第１前駆体を切り出し、さらに工程２で得られた第２の融合蛋白質から目的蛋白質第２前駆体を切り出す工程３と、インテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質のアセンブリー機能により、工程３で得られた目的蛋白質第１前駆体と目的蛋白質第２前駆体をアセンブルする工程４とを含むことを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
（４０） 分子シャペロンの一方の末端にインテインの部分配列蛋白質、他方の末端に該インテインの残余の部分配列蛋白質がペプチド結合を介して連結され、さらに該インテインの部分配列蛋白質に目的蛋白質第１前駆体がペプチド結合を介して連結され、且つ該インテインの残余の部分配列蛋白質に目的蛋白質第２前駆体がペプチド結合を介して連結された融合蛋白質から、インテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質の切断機能により、目的蛋白質第１前駆体及び目的蛋白質第２前駆体を切り出し、さらにインテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質のアセンブリー機能により、目的蛋白質第１前駆体と目的蛋白質第２前駆体をアセンブルすることを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
（４１） 前記融合蛋白質を宿主内で発現させることを特徴とする（３９）又は（４０）に記載の目的蛋白質の製造方法。
（４２） 前記宿主が、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする（４１）に記載の融合蛋白質の製造方法。
（４３） 無細胞翻訳系で行うことを特徴とする（３９）又は（４０）に記載の目的蛋白質の製造方法。
本発明の目的蛋白質の製造方法によれば、通常の遺伝子組換え技術によっては発現が難しい目的蛋白質であっても、効率的に正常型蛋白質として目的蛋白質を得ることができる。さらに、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す際においても、より簡便且つ安全に目的蛋白質を切り出すことができる。
本発明の融合蛋白質によれば、通常の遺伝子組換え技術によっては発現が難しい目的蛋白質であっても、融合蛋白質の一部として発現することができる。さらに、融合蛋白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって、目的蛋白質が簡便且つ安全に切り出される。
本発明のインテインの部分配列蛋白質によれば、天然のインテインに比べて分子量が小さいので、分子シャペロンと目的蛋白質との融合蛋白質の分子量を小さくすることができる。したがって、遺伝子組み換え技術により該融合蛋白質をより容易に発現させることができる。
本発明のインテインの部分配列蛋白質の遺伝子によれば、遺伝子組み換え技術によりインテインの部分配列蛋白質を発現することができる。
本発明のベクターによれば、目的蛋白質の遺伝子を導入するだけで、分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子を作製することができ、容易に該融合蛋白質の遺伝子を宿主に導入することができる。また、本発明のベクターによれば、インテインの部分配列蛋白質の遺伝子を容易に宿主に導入することができる。
本発明の形質転換体によれば、分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質を製造することができる。また、本発明の形質転換体によれば、インテインの部分配列蛋白質を製造することができる。
図１は、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉの主要部を示す構成図である。図中、（ＴＣＰβ）４はシャペロニンβサブユニット４連結体をコードする遺伝子、ＳｓｐＩはインテインをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図２は、実施例１及び比較例１で得た菌体破砕上清についての、抗体軽鎖を認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析結果を示す写真である。
図３（ａ）は、実施例２で得た菌体破砕上清についての、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原を認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析結果を示す写真である。
図３（ｂ）は、比較例２で得た菌体破砕上清についての、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原を認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析結果を示す写真である。
図４は、発現ベクターｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７Ｉの主要部を示す構成図である。図中、（ＧｒｏＥＬ）７はＧｒｏＥＬサブユニット７連結体をコードする遺伝子、ＮＳｓｐＩはＮ末端のみが切断できるよう改変してあるインテイン配列をコードする遺伝子、ＦＬＡＧはＦＬＡＧペプチドをコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図５は、実施例３及び比較例３で得た菌体破砕上清についての、抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティング解析結果（１：比較例３の菌体破砕上清、２：実施例３の菌体破砕上清）を示す写真である。
図６は、発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉの主要部を示す構成図である。図中、ＴＰＰＩａｓｅはＴＰＰＩａｓｅ配列コードする遺伝子を、ＳｓｐＩはインテインをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図７は、実施例４及び比較例４で得た菌体破砕上清についての、ヒスチジンを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析結果（１：実施例４の菌体破砕上清、２：比較例４の菌体破砕上清、３：ＧＦＰ−６Ｈｉｓ標準品）を示す写真である。
図８は、実施例５及び比較例５におけるウエスタンブロッティング解析結果（１：ＳｓｐＩ遺伝子を含まないベクターによるコントロール、２：実施例５の菌体破砕上清、３：比較例５の菌体破砕上清）を示す写真である。
図９は、実施例５及び比較例５におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ解析結果（１：比較例５の菌体破砕上清、２：比較例５の菌体破砕上清のＦＬＡＧカラム精製画分、３：ＳｓｐＩ遺伝子を含まないベクターによるコントロール、４：ＳｓｐＩ遺伝子を含まないベクターによるコントロールのＦＬＡＧカラム精製画分）を示す写真である。
図１０は、実施例６及び比較例６におけるウエスタンブロッティング解析結果（１：比較例６の菌体破砕上清、２：実施例６の菌体破砕上清）を示す写真である。
図１１、実施例７及び比較例７におけるウエスタンブロッティング解析結果（１：ＧＦＰ−６Ｈｉｓ標準品、２：実施例７の菌体破砕上清、３：比較例７の菌体破砕上清）を示す写真である。
図１２は、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２の主要部を示す構成図である。図中、（ＴＣＰβ）４はシャペロンβサブユニット４連結体をコードする遺伝子、ＳｓｐＩはインテインをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図１３は、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２の主要部を示す構成図である。図中、（ＴＣＰβ）４はシャペロンβサブユニット４連結体をコードする遺伝子、ＭＭＩはＭＭＩをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図１４は、実施例８及び比較例８で得られた菌体破砕液上清のウエスタンブロッティング解析結果（１：実施例８のｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＬ−２導入菌体破砕上清、２：実施例８のｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２導入菌体破砕上清、３：比較例８）を示す写真である。
図１５（ａ）は、実施例９で得られた菌体破砕液上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色を行った解析結果（１：実施例９の菌体破砕上清）を示す写真である。
図１５（ｂ）は、比較例９で得られた菌体破砕液上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色を行った解析結果（２：比較例９の菌体破砕上清、３：宿主菌体破砕上清）を示す写真である。
図１６は、実施例９のウェスタンブロッティング解析結果（１：実施例９の菌体破砕上清、２：宿主菌体破砕上清）を示す写真である。
図１７は、発現ベクターｐＧＥＸ ＭＭＩの主要部を示す構成図である。図中、ＧＳＴはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする遺伝子、ＭＭＩはＭＭＩをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図１８は、実施例１０及び比較例１０で得られた菌体破砕液上清ウェスタンブロッティング解析結果（１：実施例１０−１の菌体破砕上清、２：実施例１０−２の菌体破砕上清、３：比較例１０の菌体破砕上清）を示す写真である。
図１９は、発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅＭＭＩの主要部を示す構成図である。図中、ＴＰＰＩａｓｅはＴＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子、ＭＭＩはＭＭＩをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図２０は、実施例１１及び比較例１１におけるウエスタンブロッティング解析結果（１：ＧＦＰ−６Ｈｉｓ標準品、２：比較例１１−１の菌体破砕上清、３：実施例１１の菌体破砕上清、４：比較例１１−２の菌体破砕上清）を示す写真である。
図２は、実施例１及び比較例１で得た菌体破砕上清についての、抗体軽鎖を認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析結果を示す写真である。
図３（ａ）は、実施例２で得た菌体破砕上清についての、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原を認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析結果を示す写真である。
図３（ｂ）は、比較例２で得た菌体破砕上清についての、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原を認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析結果を示す写真である。
図４は、発現ベクターｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７Ｉの主要部を示す構成図である。図中、（ＧｒｏＥＬ）７はＧｒｏＥＬサブユニット７連結体をコードする遺伝子、ＮＳｓｐＩはＮ末端のみが切断できるよう改変してあるインテイン配列をコードする遺伝子、ＦＬＡＧはＦＬＡＧペプチドをコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図５は、実施例３及び比較例３で得た菌体破砕上清についての、抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティング解析結果（１：比較例３の菌体破砕上清、２：実施例３の菌体破砕上清）を示す写真である。
図６は、発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉの主要部を示す構成図である。図中、ＴＰＰＩａｓｅはＴＰＰＩａｓｅ配列コードする遺伝子を、ＳｓｐＩはインテインをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図７は、実施例４及び比較例４で得た菌体破砕上清についての、ヒスチジンを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析結果（１：実施例４の菌体破砕上清、２：比較例４の菌体破砕上清、３：ＧＦＰ−６Ｈｉｓ標準品）を示す写真である。
図８は、実施例５及び比較例５におけるウエスタンブロッティング解析結果（１：ＳｓｐＩ遺伝子を含まないベクターによるコントロール、２：実施例５の菌体破砕上清、３：比較例５の菌体破砕上清）を示す写真である。
図９は、実施例５及び比較例５におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ解析結果（１：比較例５の菌体破砕上清、２：比較例５の菌体破砕上清のＦＬＡＧカラム精製画分、３：ＳｓｐＩ遺伝子を含まないベクターによるコントロール、４：ＳｓｐＩ遺伝子を含まないベクターによるコントロールのＦＬＡＧカラム精製画分）を示す写真である。
図１０は、実施例６及び比較例６におけるウエスタンブロッティング解析結果（１：比較例６の菌体破砕上清、２：実施例６の菌体破砕上清）を示す写真である。
図１１、実施例７及び比較例７におけるウエスタンブロッティング解析結果（１：ＧＦＰ−６Ｈｉｓ標準品、２：実施例７の菌体破砕上清、３：比較例７の菌体破砕上清）を示す写真である。
図１２は、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２の主要部を示す構成図である。図中、（ＴＣＰβ）４はシャペロンβサブユニット４連結体をコードする遺伝子、ＳｓｐＩはインテインをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図１３は、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２の主要部を示す構成図である。図中、（ＴＣＰβ）４はシャペロンβサブユニット４連結体をコードする遺伝子、ＭＭＩはＭＭＩをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図１４は、実施例８及び比較例８で得られた菌体破砕液上清のウエスタンブロッティング解析結果（１：実施例８のｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＬ−２導入菌体破砕上清、２：実施例８のｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２導入菌体破砕上清、３：比較例８）を示す写真である。
図１５（ａ）は、実施例９で得られた菌体破砕液上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色を行った解析結果（１：実施例９の菌体破砕上清）を示す写真である。
図１５（ｂ）は、比較例９で得られた菌体破砕液上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色を行った解析結果（２：比較例９の菌体破砕上清、３：宿主菌体破砕上清）を示す写真である。
図１６は、実施例９のウェスタンブロッティング解析結果（１：実施例９の菌体破砕上清、２：宿主菌体破砕上清）を示す写真である。
図１７は、発現ベクターｐＧＥＸ ＭＭＩの主要部を示す構成図である。図中、ＧＳＴはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする遺伝子、ＭＭＩはＭＭＩをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図１８は、実施例１０及び比較例１０で得られた菌体破砕液上清ウェスタンブロッティング解析結果（１：実施例１０−１の菌体破砕上清、２：実施例１０−２の菌体破砕上清、３：比較例１０の菌体破砕上清）を示す写真である。
図１９は、発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅＭＭＩの主要部を示す構成図である。図中、ＴＰＰＩａｓｅはＴＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子、ＭＭＩはＭＭＩをコードする遺伝子、６Ｈｉｓはヒスチジン６残基をコードする遺伝子、終は終止コドンを示す。
図２０は、実施例１１及び比較例１１におけるウエスタンブロッティング解析結果（１：ＧＦＰ−６Ｈｉｓ標準品、２：比較例１１−１の菌体破砕上清、３：実施例１１の菌体破砕上清、４：比較例１１−２の菌体破砕上清）を示す写真である。
本発明の融合蛋白質は、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と、分子シャペロンと、目的蛋白質とから構成される。本発明の融合蛋白質によれば、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって融合蛋白質から目的蛋白質を切り出し、目的蛋白質を得ることができる。
ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質には、プロテアーゼのように他の蛋白質に作用してその蛋白質のペプチド結合を切断するものと、インテインのように自分自身に作用して自己触媒的にペプチド結合を切断するものの両方が含まれる。本発明の融合蛋白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の例としては、プロテアーゼ、インテイン、ヘッジホッグ蛋白質、セルフスプライシング蛋白質等が挙げられる。
インテインは真核動物、古細菌、真正細菌のすべてで見つかっているプロテインスプライシングを行なう蛋白質である。そして、本発明の融合蛋白質を構成するペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がインテインの場合は、インテインの自己触媒的作用によってその融合蛋白質が切断され、目的蛋白質が切り出される。天然のインテインは、自分自身のＮ末端及びＣ末端のペプチド結合を切断する活性を持ち、さらに切断した両端をペプチド結合でつなぐ活性を有する。本発明の融合蛋白質を構成するためのインテインは、ペプチド結合切断活性のみを有し、切断した両端をペプチド結合でつなぐ活性を欠失させた改変型インテインであることが好ましい。すなわち、このような改変型インテインを用いることにより、目的蛋白質と分子シャペロンが再結合することを防ぐことができ、より簡便に融合蛋白質から目的蛋白質を切り出すことができる。改変型インテインは、天然型インテインの一部のアミノ酸残基を置換することにより得ることができる。例えば、天然型インテインのＮ末端のシステインをアラニンに改変することにより、Ｎ末端の切断活性を有さずＣ末端の切断活性のみを有する改変型インテイン（以下、「Ｃインテイン」と称する）を得ることができる。また、天然型インテインのＣ末端のアスパラギンをアラニンに改変することにより、Ｃ末端の切断活性を有さずＮ末端の切断活性のみを有する改変型インテイン（以下、「Ｎインテイン」と称する）を得ることができる。（Ｍａｔｈｙｓ Ｓら、Ｇｅｎｅ、１９９９年、第２３１巻、ｐ．１−１３）。このような改変型インテインによれば、その両端ともが切断されることはないので、分子シャペロンと目的蛋白質が再結合する恐れはない。
本発明の融合蛋白質を構成するためのインテインの由来としては、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（例えば、シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株 ＤｎａＢ ｈｅｌｉｃａｓｅインテイン）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ Ｇｙｒａｓｅ Ａインテイン）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｖａｃｕｏｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＡＴＰａｓｅインテイン）等が挙げられる。特に、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株 ＤｎａＢ ｈｅｌｉｃａｓｅインテインは、エンドヌクレアーゼ活性を有している中央ドメインを削除してＮ末端ドメインとＣ末端ドメインのみからなるように改変しても、切断活性を保持する。したがって、そのようにして改変したインテインを用いることにより、他の由来のインテインに比べて分子量を小さくすることができ、遺伝子組換え手法によって発現させる際には好都合である。なお、ここに挙げた以外のインテインであっても、ペプチド結合切断活性を有するものであれば、本発明の融合蛋白質を構成するペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質として採用可能である。
ここで、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株 ＤｎａＢ ｈｅｌｉｃａｓｅインテインのエンドヌクレアーゼ領域を除き、Ｎ末端のアミノ酸をアラニンに置換したＣインテイン（以下、「ＳｓｐＩ」と称する。）をコードする遺伝子の塩基配列と対応するアミノ酸配列を配列番号３に、対応するアミノ酸配列のみを配列番号４に示す。
また、本発明の融合蛋白質においては、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質は、全長のインテインではなくインテインの部分配列蛋白質で全長のインテインと同様の活性を有するものでもよい。本発明の融合蛋白質におけるインテインの部分配列蛋白質は、インテインのＣ末端から２０〜１２０個のアミノ酸残基からなる蛋白質群から選択される。これらのインテインの部分配列蛋白質は、全長のインテインと同様の蛋白質スプライシング機能、自身のＣ末端のペプチド結合を切断する活性を有する。
例えば、配列番号４で示されるＳｓｐＩの、アミノ酸配列のＣ末端から２０〜１２０個のアミノ酸残基からなる蛋白質は全長のＳｓｐＩと同様の各機能を有しており、本発明の融合蛋白質に適用される。より好ましくは、配列番号４で示されるＳｓｐＩの、アミノ酸配列のＣ末端から４８個のアミノ酸残基からなる蛋白質（以下、「ＭＭＩ」と称する）が、本発明の融合蛋白質の構成要素として好適である。ＭＭＩのアミノ酸配列を配列番号３２に示す。さらに、配列番号３２で示されるアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質、すなわち、ＭＭＩと実質同一の蛋白質も、本発明の融合蛋白質の構成要素として好適である。さらに、配列番号３２で示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは８０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは９０％以上の相同性を有する蛋白質、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、且つペプチド切断活性を有する蛋白質も、本発明の融合蛋白質の構成要素となりうる。さらに、上記の例示以外のインテインの部分配列蛋白質でも、ペプチド結合切断活性を有するものであれば、本発明の融合蛋白の構成要素となりうる。
なお、上記したＭＭＩをコードする遺伝子としては、配列番号３１に示される塩基配列を有する単離されたＤＮＡが挙げられる。さらに、配列番号３１に示されるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能で、且つペプチド切断活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、ＭＭＩと実質同一の蛋白質をコードする。ここで、ハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、あるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより検出されるＤＮＡを意味する。また、ストリンジェントな条件とは、０．１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、１％ＳＤＳ、６５℃、２４時間の条件をいう。この条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号３１で示されるＭＭＩ遺伝子と実質同一のＤＮＡである。なお、ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）などに記載されている方法に準じて行うことができる。
また、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能か否かを問わず、配列番号３１に示される塩基配列と少なくとも約６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡで、ペプチド結合切断活性を有する蛋白質をコードするものについては、その産物が本発明の融合蛋白質構成要素となりうる。
ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がインテイン以外の場合、例えば、プロテアーゼの場合は、そのプロテアーゼが認識するアミノ酸配列をプロテアーゼと目的蛋白質の間に挿入しておくことによって、該プロテアーゼの作用によって融合蛋白質を切断することができる。また、ヘッジホッグ蛋白質はショウジョウバエの細胞外分泌性のシグナル伝達因子であり、自身のプロセシングのためにペプチド結合を切断する活性を持つものであるが、このヘッジホッグ蛋白質も本発明の融合蛋白質を構成することができる。また、プロテアーゼやヘッジホッグ蛋白質においても、その全長を有する天然型のものだけではなく、その部分配列蛋白質で同様の活性をもつものも本発明の融合蛋白質を構成することができる。本発明においては、プロテアーゼやヘッジホッグ蛋白質という語には、その部分配列蛋白質であって全長を有する天然型のものと同様の活性を有する蛋白質も含むものとする。
本発明の融合蛋白質を構成する目的蛋白質としては特に限定されず、ヒト、マウスなどの高等動物由来の疾病関連遺伝子産物や、化学プロセスに有効な酵素群の全て、あるいは前記疾病関連遺伝子産物や酵素群などの有用な蛋白質が挙げられる。具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルスなどの病原性ウイルスゲノムにコードされる、外被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼなどの蛋白質（ウイルス抗原）が挙げられる。さらに、これら病原性ウイルスに対する抗体となる蛋白質、哺乳動物由来抗体の重鎖、哺乳動物由来抗体の軽鎖、哺乳動物由来抗体の定常領域、哺乳動物由来抗体のＦｖ領域単鎖抗体（ｓｃＦＶ）の全長、又はそれらの６残基以上の部分蛋白質、Ｆａｂ（抗原結合フラグメント）、（Ｆａｂ’）２フラグメント、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３フラグメント、ＣＨ１−ＣＨ２フラグメント、ＣＨ２−ＣＨ３フラグメント、ＣＨ１フラグメント、ＣＨ２フラグメント、ＣＨ３フラグメント、ＣＬフラグメント、及び、完全抗体型である治療・診断用抗体が挙げられる。さらに、７回貫通型受容体（Ｇ蛋白質共役型受容体）、血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子などの成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）；腫瘍壊死因子、インターフェロン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン３やインターロイキン５などのインターロイキン、アルブミン、ヒト成長ホルモンなどのサイトカイン類、などが挙げられる。また、例えば、生きた細胞内における現象を観察するために細胞内の機能蛋白質の蛍光標識として使用できる緑色蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「ＧＦＰ」と称する）なども挙げられる。さらに、これらの蛋白質から選ばれる２以上の蛋白質を連結させた人工蛋白質も、本発明の融合蛋白質を構成する目的蛋白質として適用可能である。
本発明の融合蛋白質を構成する分子シャペロン又はそのサブユニットとしては特に限定はなく、蛋白質の折り畳みを助ける作用を有するものであれば、すべて適用可能である。例としては、複数のシャペロニンサブユニットによる複合体であるシャペロニン、又はペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（以下、ＰＰＩａｓｅという。）などが挙げられる。
なお、分子シャペロンには、単一分子で作用する分子シャペロンと、複数のサブユニットからなる複合体を形成する分子シャペロンとがある。そして、本発明の融合蛋白質において、前者の分子シャペロンを含む場合は、その単一分子の分子シャペロンと介在蛋白質が連結されている。一方、後者の分子シャペロンを含む場合は、そのサブユニットと介在蛋白質が連結されている。前者の例としては、ＰＰＩａｓｅがあり、後者の例としてはシャペロニンが挙げられる。
シャペロニンは、約６０ｋＤａのサブユニット（シャペロニンサブユニット）が１〜約２０個程度集まった複合体である。シャペロニンは、細胞に熱ショックなどのストレスを与えることにより誘導されるヒートショック蛋白質の一種としても知られている。シャペロニンは、バクテリア（例えば、大腸菌など）、古細菌（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘなど）及び真核生物（例えば、酵母、マウス、ヒトなど）などの全ての生物に存在し、蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。
複数のシャペロニンサブユニット同士がペプチド結合を介して直列に連結された人工蛋白質（以下、「シャペロニンサブユニット連結体」と称する）も、天然のシャペロニンと同様に複合体を形成することが知られている。この際、２〜約１０個のシャペロニンサブユニットは、天然のシャペロニンと同様に直線状あるいはリング状（以下、シャペロニンリングともいう。）の構造をとることが知られている。なお、「シャペロニンサブユニット連結体」という用語に対比して、他のシャペロニンサブユニットとはペプチド結合を介して連結されていないシャペロニンサブユニットを「単独のシャペロニンサブユニット」と呼ぶこととする。
本発明の融合蛋白質において、目的蛋白質は、単独のシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体のＮ末端、単独のシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体のＣ末端、シャペロニンサブユニット連結体のシャペロニンサブユニット同士の連結部、から選択される１又は２以上の部位に、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質を介して連結される。いずれの場合も、目的蛋白質が複数のシャペロニンサブユニット間によって構成される空洞（キャビティ）、すなわち１層又は２層以上のシャペロニンリングの内部に格納されるよう、目的蛋白質の結合部位を選択することが好ましい。
本発明の融合蛋白質を構成する分子シャペロンの例であるシャペロニンは、１０〜２０個のシャペロニンサブユニットからなる２層のリング構造、すなわち５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングが、リング面を介して非共有結合的に会合した２層構造（以下、２層のリング構造をシャペロニン複合体ともいう。）を形成するものが好適である。例えば、内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有する大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬが好適である。シャペロニンを分子シャペロンとして用いる場合は、目的蛋白質はシャペロニンリングの内部に収納されるよう融合蛋白質を構成することが好ましい。なお、バクテリア又は古細菌由来のシャペロニンは、宿主内で容易に発現させることができるので、本発明の融合蛋白質を製造する際には特に好適である。
また、上記シャペロニンとしては、リング構造への自己集合能が維持されていれば、野生型のみならずアミノ酸変異体も使用可能である。例えば、各シャペロニンサブユニットの会合力が弱められた変異体を用いた場合、格納された目的蛋白質の回収がより容易になる。また、宿主としてバクテリアを用いてシャペロニンを発現させる場合、宿主と同じバクテリア由来のシャペロニンサブユニットを発現させると、その発現量が多くなることが多い。その結果、目的蛋白質の生産効率が向上することが多い。
なお、シャペロニンを構成するシャペロニンサブユニットの数は、その由来生物によって異なる。例えば、バクテリア由来のシャペロニンではシャペロニンサブユニットの数は通常７個である。一方、古細菌由来のシャペロニンでは通常８〜９個、真核生物由来のシャペロニンでは通常８個である。したがって、本発明の融合蛋白質を構成するシャペロニンのシャペロニンサブユニットの数は、その由来によって最適の数を選択することができる。
また、分子シャペロンにシャペロニンを使用した本発明の融合蛋白質において、リング構造を形成するためのシャペロニンサブユニットと目的蛋白質の数比については、通常１：１〜１０：１の範囲内であり、好ましくは１：１〜９：１である。なお、１０：１よりもシャペロニンサブユニットの数の比が大きくなると、発現する目的蛋白質の実質的な生産量が少なくなるとともに、シャペロニンのリング構造の形成が困難となることがある。
具体的には、シャペロニンサブユニットの構成数が７個であるバクテリア由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニンサブユニット：目的蛋白質の数の比は、１：１又は７：１であることが好ましい。また、シャペロニンサブユニットの構成数が８個である古細菌由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：目的蛋白質の数の比は、１：１、２：１、４：１又は８：１であることが好ましい。
分子シャペロンの他の例として、ＰＰＩａｓｅが挙げられる。ＰＰＩａｓｅは、蛋白質のフォールディングに関与する蛋白質折り畳み因子の１つであり、細胞内でフォールディング途上のターゲット蛋白質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する。
ＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン型及びパーブリン型の３種類に分類される。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは免疫阻害剤の１つであるＦＫ５０６により活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、別の免疫阻害剤であるシクロスポリンに対して感受性を持つＰＰＩａｓｅ又はそのホモログである。一方、パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ジュグロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）によりその活性が阻害される。この３種類のＰＰＩａｓｅは、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどない。
本発明の融合蛋白質を構成するＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、上記の３種類のＰＰＩａｓｅのうち、いずれのタイプのＰＰＩａｓｅであってもよい。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、例えば、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（Ｈｕａｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，第９巻、ｐ．１２５４，２０００年）、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ａｒｉｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第３９巻，ｐ．１９９，２００１年）、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｏｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７４巻，ｐ．１７１５，１９９６年）が挙げられる。また、シクロフィリンタイプＰＰＩａｓｅとしては、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅなどが挙げられる（Ｐｉｒｋｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第３０８巻，ｐ．７９５，２００１年）。さらに、パーブリンタイプＰＰＩａｓｅとしては、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｅｈｒｅｎｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．，ｐ．第２０巻，ｐ．２８５，２００１年）が挙げられる。なお、本発明において、これらのＰＰＩａｓｅには、アミノ酸配列が極めて似ており、且つ同様の作用を有する実質的に同等のポリペプチド、少なくともこれらのＰＰＩａｓｅの一部分を含み、且つ同様の作用を有するポリペプチド、及び、これらのＰＰＩａｓｅの一部のアミノ酸が他のアミノ酸に改変され、且つ同様の作用を有するポリペプチドも含まれる。
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの機能については、興味深いことに、ＰＰＩａｓｅ活性だけでなく、蛋白質の不可逆的凝集を抑制すると同時に、変性蛋白質のリフォールディングを促進させる分子シャペロン活性を有することが見出されている（Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３９巻，ｐ．４５３，２０００年；Ｉｄｅｎｏ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２６７巻，ｐ．３１３９，２０００年；Ｉｄｅｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，第３５７巻，ｐ．４６５，２００１年；Ｉｄｅｎｏ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第６８，ｐ．４６４，２００２年）。分子シャペロン活性は、本来、分子シャペロンの１つとして知られるシャペロニンやＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ系の蛋白質折り畳みシステムに見いだされた活性である。これらは、細胞内で合成されたポリペプチドが正しい形に折り畳まれるよう、サポートする機能を果たしている。その際、ＡＴＰなどの高エネルギー物質の加水分解を必要とする。一方、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子シャペロン活性を発揮する際、上記高エネルギー物質の加水分解反応を必要としない点でその性質が異なる。古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、分子シャペロン活性を有しないＰＰＩａｓｅに比べて、目的蛋白質をより正しく折り畳むことができるので、本発明の融合蛋白質を構成するＰＰＩａｓｅとして、特に好適である。
本発明における分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては上記例示のもの以外であっても、同等の分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであれば、好適に用いることができる。
本発明の目的蛋白質の製造方法は、インテイン等のペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって、融合蛋白質を切断し、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出すものである。さらに具体的には、融合蛋白質を単離する工程と、単離した融合蛋白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質のペプチド結合切断活性を惹起する工程と、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用により、融合蛋白質の一部を切断し、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる工程とを含む。本発明の目的蛋白質の製造方法によれば、単独では不溶化等してしまう目的蛋白質を分子シャペロンの作用で正常型蛋白質として発現することができ、さらに、プロテアーゼ等を加えることなく目的蛋白質を切り出すことができる。この際、融合蛋白質の発現は、宿主内で行ってもよいし、無細胞翻訳系で行ってもよい。
宿主内で融合蛋白質の発現を行って目的蛋白質を製造する場合は、まず、融合蛋白質の遺伝子を宿主内に導入する。例えば、適宜のベクターに融合蛋白質をコードする遺伝子を導入して発現ベクターを構築し、適宜の宿主に導入して形質転換体を得る。そして、この形質転換体を培養して融合蛋白質を発現させ、該形質転換体から融合蛋白質を単離する。一方、無細胞翻訳系において融合蛋白質の発現を行う場合は、例えば大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等の無細胞抽出液に、ヌクレオチド３リン酸や各種アミノ酸を加えた反応液中で、融合蛋白質を発現させることができる。
次に、単離された融合蛋白質に対して、介在蛋白質のペプチド切断活性を惹起する処理を行い、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる。介在蛋白質のペプチド切断活性を惹起する処理としては、介在蛋白質がインテインであれば、ｐＨの制御、温度の制御、トリガー物質の添加等が挙げられる。例えば、ｐＨが６〜８の範囲、好ましくは７付近になるように水素イオン濃度を変化させることにより、インテインのペプチド結合切断活性を惹起することができる。また、２０〜３７℃の範囲になるように温度を変化させることにより、インテインのペプチド結合切断活性を惹起することができる。また、トリガー物質としてジチオスレイトールやβ−メルカプトエタノールのようなチオールを添加することにより、インテインのペプチド結合切断活性を惹起することができる。特に、チオールはＮインテインの切断活性を惹起するのに有効である。
逆に、インテインのペプチド結合切断活性が融合蛋白質を単離する前、すなわち宿主内又は試験管内で惹起されないようにすることも、目的蛋白質の収量を増加させるためには有効である。そのための方法としては、例えば、宿主の培養温度を２０℃未満にしたり、無細胞蛋白合成を２０℃未満で行うことが挙げられる。
また介在蛋白質がプロテアーゼであれば、プロテアーゼの種類に応じて、至適緩衝液条件、温度、ｐＨなどを制御することにより、ペプチド結合切断活性を惹起することができる。
宿主内で融合蛋白質をコードする遺伝子を発現させる際の宿主としては特に限定されず、例えば、大腸菌等のバクテリア、その他の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物培養細胞、植物培養細胞、及びトランスジェニック動・植物等が挙げられる。なかでも、高い細胞増殖特性を有し、培養操作が簡便で且つ培養に用いる栄養源等のコストが安価であることから、大腸菌等のバクテリアや酵母等が特に好適である。また、融合蛋白質は宿主の細胞質内、細胞外のいずれに発現させてもよいが、大量に発現させる場合には細胞内に発現させる方が望ましい。
なお、宿主が大腸菌の場合は、導入されたプラスミドの大きさが１０ｋｂｐ以上になるとプラスミドのコピー数が減少し、結果的に融合蛋白質の合成量が低下することがある。このときは、融合蛋白質を同一の宿主内で共発現させる手段により発現量の低下を防ぐことができる。例えば、同一の融合蛋白質を合成する同一遺伝子を、異なる複製領域及び薬剤耐性遺伝子を有する２種類のプラスミドなどのベクターに導入し、これら２種類のベクターで２種の薬剤の存在下で大腸菌を形質転換し、融合蛋白質の合成を行うことで、高発現をもたらすことが可能である。
また、本発明の目的蛋白質の製造方法では、融合蛋白質をコードする遺伝子と、分子シャペロンのみをコードする遺伝子とをそれぞれ、同一の宿主内で共存させ、複製することが可能な２種類の異なるプラスミドなどのベクターに導入し、同一の宿主内で共発現させてもよい。例えば、目的蛋白質に対するシャペロニンサブユニットの数比が小さい場合は、融合蛋白質をコードする遺伝子とシャペロニンサブユニットのみをコードする遺伝子とをそれぞれ、同一宿主内で共存・複製可能な２種類のプラスミドに導入して、融合蛋白質とシャペロニンサブユニットを共発現させるとよい。
インテインの部分配列蛋白質と、全長のインテインから該部分配列蛋白質を除いた残余の蛋白質（以下、「インテインの残余の部分配列蛋白質」と称する）は、いわゆるｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ（ウィ・エイチ（Ｗｕ Ｈ）ら、バイオケミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ）、１９９８年、第１３８７巻、ｐ．４２２−４３２）を行うことが知られている。インテインの部分配列蛋白質とインテインの残余の部分配列蛋白質が互いに近くに存在する場合は、隣接する蛋白質同士をアセンブルしやすいと考えられる。ここで、２種類の蛋白質をアセンブルするとは、これらの蛋白質同士を接近させ、共有結合又は非共有結合（水素結合、疎水性相互作用、分子間力等）によって結合又は会合させることをいう。そして、インテインの部分配列蛋白質とインテインの残余蛋白質は、２種類の蛋白質をアセンブルする機能（アセンブリー機能）を有している。このアセンブリー機能を利用して、２種類の目的蛋白質をアセンブルすることができる。例えば、２種類の蛋白質がある目的蛋白質の前駆体となるものであるとき、これらの前駆体をアセンブルして目的蛋白質を製造することができる。
目的蛋白質が免疫グロブリン、前駆体が抗体軽鎖及び抗体重鎖である場合を例に挙げると、第１の例は、分子シャペロンのＣ末端にインテインのＣ末端側部分配列蛋白質を介して抗体重鎖を連結させた融合蛋白質を作製する。一方、別の分子シャペロンのＮ末端にインテインの残余蛋白質を介して抗体軽鎖を連結させた融合蛋白質を作製する。そして、これら２つの融合蛋白質を接近させてアセンブリーを起こさせ、抗体重鎖と抗体軽鎖がジスルフィド結合によって結合した免疫グロブリンを作製することができる。また、第２の例は、分子シャペロンのＣ末端にインテインのＣ末端側部分配列蛋白質を介して抗体重鎖を連結させ、且つ分子シャペロンのＮ末端側にインテインの残余蛋白質を介して抗体軽鎖を連結させた融合蛋白質を作製する。そして、インテインのアセンブリー機能を利用して抗体重鎖と抗体軽鎖をアセンブリーし、抗体重鎖と抗体軽鎖がジスルフィド結合によって結合した免疫グロブリンを作製することができる。なお、インテインの残余蛋白質には、エンドヌクレアーゼ活性部分を含んでいてもよい。
ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質には、プロテアーゼのように他の蛋白質に作用してその蛋白質のペプチド結合を切断するものと、インテインのように自分自身に作用して自己触媒的にペプチド結合を切断するものの両方が含まれる。本発明の融合蛋白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の例としては、プロテアーゼ、インテイン、ヘッジホッグ蛋白質、セルフスプライシング蛋白質等が挙げられる。
インテインは真核動物、古細菌、真正細菌のすべてで見つかっているプロテインスプライシングを行なう蛋白質である。そして、本発明の融合蛋白質を構成するペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がインテインの場合は、インテインの自己触媒的作用によってその融合蛋白質が切断され、目的蛋白質が切り出される。天然のインテインは、自分自身のＮ末端及びＣ末端のペプチド結合を切断する活性を持ち、さらに切断した両端をペプチド結合でつなぐ活性を有する。本発明の融合蛋白質を構成するためのインテインは、ペプチド結合切断活性のみを有し、切断した両端をペプチド結合でつなぐ活性を欠失させた改変型インテインであることが好ましい。すなわち、このような改変型インテインを用いることにより、目的蛋白質と分子シャペロンが再結合することを防ぐことができ、より簡便に融合蛋白質から目的蛋白質を切り出すことができる。改変型インテインは、天然型インテインの一部のアミノ酸残基を置換することにより得ることができる。例えば、天然型インテインのＮ末端のシステインをアラニンに改変することにより、Ｎ末端の切断活性を有さずＣ末端の切断活性のみを有する改変型インテイン（以下、「Ｃインテイン」と称する）を得ることができる。また、天然型インテインのＣ末端のアスパラギンをアラニンに改変することにより、Ｃ末端の切断活性を有さずＮ末端の切断活性のみを有する改変型インテイン（以下、「Ｎインテイン」と称する）を得ることができる。（Ｍａｔｈｙｓ Ｓら、Ｇｅｎｅ、１９９９年、第２３１巻、ｐ．１−１３）。このような改変型インテインによれば、その両端ともが切断されることはないので、分子シャペロンと目的蛋白質が再結合する恐れはない。
本発明の融合蛋白質を構成するためのインテインの由来としては、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（例えば、シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株 ＤｎａＢ ｈｅｌｉｃａｓｅインテイン）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ Ｇｙｒａｓｅ Ａインテイン）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｖａｃｕｏｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＡＴＰａｓｅインテイン）等が挙げられる。特に、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株 ＤｎａＢ ｈｅｌｉｃａｓｅインテインは、エンドヌクレアーゼ活性を有している中央ドメインを削除してＮ末端ドメインとＣ末端ドメインのみからなるように改変しても、切断活性を保持する。したがって、そのようにして改変したインテインを用いることにより、他の由来のインテインに比べて分子量を小さくすることができ、遺伝子組換え手法によって発現させる際には好都合である。なお、ここに挙げた以外のインテインであっても、ペプチド結合切断活性を有するものであれば、本発明の融合蛋白質を構成するペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質として採用可能である。
ここで、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株 ＤｎａＢ ｈｅｌｉｃａｓｅインテインのエンドヌクレアーゼ領域を除き、Ｎ末端のアミノ酸をアラニンに置換したＣインテイン（以下、「ＳｓｐＩ」と称する。）をコードする遺伝子の塩基配列と対応するアミノ酸配列を配列番号３に、対応するアミノ酸配列のみを配列番号４に示す。
また、本発明の融合蛋白質においては、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質は、全長のインテインではなくインテインの部分配列蛋白質で全長のインテインと同様の活性を有するものでもよい。本発明の融合蛋白質におけるインテインの部分配列蛋白質は、インテインのＣ末端から２０〜１２０個のアミノ酸残基からなる蛋白質群から選択される。これらのインテインの部分配列蛋白質は、全長のインテインと同様の蛋白質スプライシング機能、自身のＣ末端のペプチド結合を切断する活性を有する。
例えば、配列番号４で示されるＳｓｐＩの、アミノ酸配列のＣ末端から２０〜１２０個のアミノ酸残基からなる蛋白質は全長のＳｓｐＩと同様の各機能を有しており、本発明の融合蛋白質に適用される。より好ましくは、配列番号４で示されるＳｓｐＩの、アミノ酸配列のＣ末端から４８個のアミノ酸残基からなる蛋白質（以下、「ＭＭＩ」と称する）が、本発明の融合蛋白質の構成要素として好適である。ＭＭＩのアミノ酸配列を配列番号３２に示す。さらに、配列番号３２で示されるアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質、すなわち、ＭＭＩと実質同一の蛋白質も、本発明の融合蛋白質の構成要素として好適である。さらに、配列番号３２で示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは８０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは９０％以上の相同性を有する蛋白質、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、且つペプチド切断活性を有する蛋白質も、本発明の融合蛋白質の構成要素となりうる。さらに、上記の例示以外のインテインの部分配列蛋白質でも、ペプチド結合切断活性を有するものであれば、本発明の融合蛋白の構成要素となりうる。
なお、上記したＭＭＩをコードする遺伝子としては、配列番号３１に示される塩基配列を有する単離されたＤＮＡが挙げられる。さらに、配列番号３１に示されるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能で、且つペプチド切断活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、ＭＭＩと実質同一の蛋白質をコードする。ここで、ハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、あるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより検出されるＤＮＡを意味する。また、ストリンジェントな条件とは、０．１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、１％ＳＤＳ、６５℃、２４時間の条件をいう。この条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号３１で示されるＭＭＩ遺伝子と実質同一のＤＮＡである。なお、ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）などに記載されている方法に準じて行うことができる。
また、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能か否かを問わず、配列番号３１に示される塩基配列と少なくとも約６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡで、ペプチド結合切断活性を有する蛋白質をコードするものについては、その産物が本発明の融合蛋白質構成要素となりうる。
ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がインテイン以外の場合、例えば、プロテアーゼの場合は、そのプロテアーゼが認識するアミノ酸配列をプロテアーゼと目的蛋白質の間に挿入しておくことによって、該プロテアーゼの作用によって融合蛋白質を切断することができる。また、ヘッジホッグ蛋白質はショウジョウバエの細胞外分泌性のシグナル伝達因子であり、自身のプロセシングのためにペプチド結合を切断する活性を持つものであるが、このヘッジホッグ蛋白質も本発明の融合蛋白質を構成することができる。また、プロテアーゼやヘッジホッグ蛋白質においても、その全長を有する天然型のものだけではなく、その部分配列蛋白質で同様の活性をもつものも本発明の融合蛋白質を構成することができる。本発明においては、プロテアーゼやヘッジホッグ蛋白質という語には、その部分配列蛋白質であって全長を有する天然型のものと同様の活性を有する蛋白質も含むものとする。
本発明の融合蛋白質を構成する目的蛋白質としては特に限定されず、ヒト、マウスなどの高等動物由来の疾病関連遺伝子産物や、化学プロセスに有効な酵素群の全て、あるいは前記疾病関連遺伝子産物や酵素群などの有用な蛋白質が挙げられる。具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルスなどの病原性ウイルスゲノムにコードされる、外被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼなどの蛋白質（ウイルス抗原）が挙げられる。さらに、これら病原性ウイルスに対する抗体となる蛋白質、哺乳動物由来抗体の重鎖、哺乳動物由来抗体の軽鎖、哺乳動物由来抗体の定常領域、哺乳動物由来抗体のＦｖ領域単鎖抗体（ｓｃＦＶ）の全長、又はそれらの６残基以上の部分蛋白質、Ｆａｂ（抗原結合フラグメント）、（Ｆａｂ’）２フラグメント、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３フラグメント、ＣＨ１−ＣＨ２フラグメント、ＣＨ２−ＣＨ３フラグメント、ＣＨ１フラグメント、ＣＨ２フラグメント、ＣＨ３フラグメント、ＣＬフラグメント、及び、完全抗体型である治療・診断用抗体が挙げられる。さらに、７回貫通型受容体（Ｇ蛋白質共役型受容体）、血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子などの成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）；腫瘍壊死因子、インターフェロン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン３やインターロイキン５などのインターロイキン、アルブミン、ヒト成長ホルモンなどのサイトカイン類、などが挙げられる。また、例えば、生きた細胞内における現象を観察するために細胞内の機能蛋白質の蛍光標識として使用できる緑色蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「ＧＦＰ」と称する）なども挙げられる。さらに、これらの蛋白質から選ばれる２以上の蛋白質を連結させた人工蛋白質も、本発明の融合蛋白質を構成する目的蛋白質として適用可能である。
本発明の融合蛋白質を構成する分子シャペロン又はそのサブユニットとしては特に限定はなく、蛋白質の折り畳みを助ける作用を有するものであれば、すべて適用可能である。例としては、複数のシャペロニンサブユニットによる複合体であるシャペロニン、又はペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（以下、ＰＰＩａｓｅという。）などが挙げられる。
なお、分子シャペロンには、単一分子で作用する分子シャペロンと、複数のサブユニットからなる複合体を形成する分子シャペロンとがある。そして、本発明の融合蛋白質において、前者の分子シャペロンを含む場合は、その単一分子の分子シャペロンと介在蛋白質が連結されている。一方、後者の分子シャペロンを含む場合は、そのサブユニットと介在蛋白質が連結されている。前者の例としては、ＰＰＩａｓｅがあり、後者の例としてはシャペロニンが挙げられる。
シャペロニンは、約６０ｋＤａのサブユニット（シャペロニンサブユニット）が１〜約２０個程度集まった複合体である。シャペロニンは、細胞に熱ショックなどのストレスを与えることにより誘導されるヒートショック蛋白質の一種としても知られている。シャペロニンは、バクテリア（例えば、大腸菌など）、古細菌（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘなど）及び真核生物（例えば、酵母、マウス、ヒトなど）などの全ての生物に存在し、蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。
複数のシャペロニンサブユニット同士がペプチド結合を介して直列に連結された人工蛋白質（以下、「シャペロニンサブユニット連結体」と称する）も、天然のシャペロニンと同様に複合体を形成することが知られている。この際、２〜約１０個のシャペロニンサブユニットは、天然のシャペロニンと同様に直線状あるいはリング状（以下、シャペロニンリングともいう。）の構造をとることが知られている。なお、「シャペロニンサブユニット連結体」という用語に対比して、他のシャペロニンサブユニットとはペプチド結合を介して連結されていないシャペロニンサブユニットを「単独のシャペロニンサブユニット」と呼ぶこととする。
本発明の融合蛋白質において、目的蛋白質は、単独のシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体のＮ末端、単独のシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体のＣ末端、シャペロニンサブユニット連結体のシャペロニンサブユニット同士の連結部、から選択される１又は２以上の部位に、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質を介して連結される。いずれの場合も、目的蛋白質が複数のシャペロニンサブユニット間によって構成される空洞（キャビティ）、すなわち１層又は２層以上のシャペロニンリングの内部に格納されるよう、目的蛋白質の結合部位を選択することが好ましい。
本発明の融合蛋白質を構成する分子シャペロンの例であるシャペロニンは、１０〜２０個のシャペロニンサブユニットからなる２層のリング構造、すなわち５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングが、リング面を介して非共有結合的に会合した２層構造（以下、２層のリング構造をシャペロニン複合体ともいう。）を形成するものが好適である。例えば、内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有する大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬが好適である。シャペロニンを分子シャペロンとして用いる場合は、目的蛋白質はシャペロニンリングの内部に収納されるよう融合蛋白質を構成することが好ましい。なお、バクテリア又は古細菌由来のシャペロニンは、宿主内で容易に発現させることができるので、本発明の融合蛋白質を製造する際には特に好適である。
また、上記シャペロニンとしては、リング構造への自己集合能が維持されていれば、野生型のみならずアミノ酸変異体も使用可能である。例えば、各シャペロニンサブユニットの会合力が弱められた変異体を用いた場合、格納された目的蛋白質の回収がより容易になる。また、宿主としてバクテリアを用いてシャペロニンを発現させる場合、宿主と同じバクテリア由来のシャペロニンサブユニットを発現させると、その発現量が多くなることが多い。その結果、目的蛋白質の生産効率が向上することが多い。
なお、シャペロニンを構成するシャペロニンサブユニットの数は、その由来生物によって異なる。例えば、バクテリア由来のシャペロニンではシャペロニンサブユニットの数は通常７個である。一方、古細菌由来のシャペロニンでは通常８〜９個、真核生物由来のシャペロニンでは通常８個である。したがって、本発明の融合蛋白質を構成するシャペロニンのシャペロニンサブユニットの数は、その由来によって最適の数を選択することができる。
また、分子シャペロンにシャペロニンを使用した本発明の融合蛋白質において、リング構造を形成するためのシャペロニンサブユニットと目的蛋白質の数比については、通常１：１〜１０：１の範囲内であり、好ましくは１：１〜９：１である。なお、１０：１よりもシャペロニンサブユニットの数の比が大きくなると、発現する目的蛋白質の実質的な生産量が少なくなるとともに、シャペロニンのリング構造の形成が困難となることがある。
具体的には、シャペロニンサブユニットの構成数が７個であるバクテリア由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニンサブユニット：目的蛋白質の数の比は、１：１又は７：１であることが好ましい。また、シャペロニンサブユニットの構成数が８個である古細菌由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：目的蛋白質の数の比は、１：１、２：１、４：１又は８：１であることが好ましい。
分子シャペロンの他の例として、ＰＰＩａｓｅが挙げられる。ＰＰＩａｓｅは、蛋白質のフォールディングに関与する蛋白質折り畳み因子の１つであり、細胞内でフォールディング途上のターゲット蛋白質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する。
ＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン型及びパーブリン型の３種類に分類される。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは免疫阻害剤の１つであるＦＫ５０６により活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、別の免疫阻害剤であるシクロスポリンに対して感受性を持つＰＰＩａｓｅ又はそのホモログである。一方、パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ジュグロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）によりその活性が阻害される。この３種類のＰＰＩａｓｅは、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどない。
本発明の融合蛋白質を構成するＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、上記の３種類のＰＰＩａｓｅのうち、いずれのタイプのＰＰＩａｓｅであってもよい。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、例えば、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（Ｈｕａｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，第９巻、ｐ．１２５４，２０００年）、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ａｒｉｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第３９巻，ｐ．１９９，２００１年）、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｏｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７４巻，ｐ．１７１５，１９９６年）が挙げられる。また、シクロフィリンタイプＰＰＩａｓｅとしては、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅなどが挙げられる（Ｐｉｒｋｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第３０８巻，ｐ．７９５，２００１年）。さらに、パーブリンタイプＰＰＩａｓｅとしては、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｅｈｒｅｎｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．，ｐ．第２０巻，ｐ．２８５，２００１年）が挙げられる。なお、本発明において、これらのＰＰＩａｓｅには、アミノ酸配列が極めて似ており、且つ同様の作用を有する実質的に同等のポリペプチド、少なくともこれらのＰＰＩａｓｅの一部分を含み、且つ同様の作用を有するポリペプチド、及び、これらのＰＰＩａｓｅの一部のアミノ酸が他のアミノ酸に改変され、且つ同様の作用を有するポリペプチドも含まれる。
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの機能については、興味深いことに、ＰＰＩａｓｅ活性だけでなく、蛋白質の不可逆的凝集を抑制すると同時に、変性蛋白質のリフォールディングを促進させる分子シャペロン活性を有することが見出されている（Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３９巻，ｐ．４５３，２０００年；Ｉｄｅｎｏ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２６７巻，ｐ．３１３９，２０００年；Ｉｄｅｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，第３５７巻，ｐ．４６５，２００１年；Ｉｄｅｎｏ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第６８，ｐ．４６４，２００２年）。分子シャペロン活性は、本来、分子シャペロンの１つとして知られるシャペロニンやＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ系の蛋白質折り畳みシステムに見いだされた活性である。これらは、細胞内で合成されたポリペプチドが正しい形に折り畳まれるよう、サポートする機能を果たしている。その際、ＡＴＰなどの高エネルギー物質の加水分解を必要とする。一方、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子シャペロン活性を発揮する際、上記高エネルギー物質の加水分解反応を必要としない点でその性質が異なる。古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、分子シャペロン活性を有しないＰＰＩａｓｅに比べて、目的蛋白質をより正しく折り畳むことができるので、本発明の融合蛋白質を構成するＰＰＩａｓｅとして、特に好適である。
本発明における分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては上記例示のもの以外であっても、同等の分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであれば、好適に用いることができる。
本発明の目的蛋白質の製造方法は、インテイン等のペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって、融合蛋白質を切断し、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出すものである。さらに具体的には、融合蛋白質を単離する工程と、単離した融合蛋白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質のペプチド結合切断活性を惹起する工程と、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用により、融合蛋白質の一部を切断し、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる工程とを含む。本発明の目的蛋白質の製造方法によれば、単独では不溶化等してしまう目的蛋白質を分子シャペロンの作用で正常型蛋白質として発現することができ、さらに、プロテアーゼ等を加えることなく目的蛋白質を切り出すことができる。この際、融合蛋白質の発現は、宿主内で行ってもよいし、無細胞翻訳系で行ってもよい。
宿主内で融合蛋白質の発現を行って目的蛋白質を製造する場合は、まず、融合蛋白質の遺伝子を宿主内に導入する。例えば、適宜のベクターに融合蛋白質をコードする遺伝子を導入して発現ベクターを構築し、適宜の宿主に導入して形質転換体を得る。そして、この形質転換体を培養して融合蛋白質を発現させ、該形質転換体から融合蛋白質を単離する。一方、無細胞翻訳系において融合蛋白質の発現を行う場合は、例えば大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等の無細胞抽出液に、ヌクレオチド３リン酸や各種アミノ酸を加えた反応液中で、融合蛋白質を発現させることができる。
次に、単離された融合蛋白質に対して、介在蛋白質のペプチド切断活性を惹起する処理を行い、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる。介在蛋白質のペプチド切断活性を惹起する処理としては、介在蛋白質がインテインであれば、ｐＨの制御、温度の制御、トリガー物質の添加等が挙げられる。例えば、ｐＨが６〜８の範囲、好ましくは７付近になるように水素イオン濃度を変化させることにより、インテインのペプチド結合切断活性を惹起することができる。また、２０〜３７℃の範囲になるように温度を変化させることにより、インテインのペプチド結合切断活性を惹起することができる。また、トリガー物質としてジチオスレイトールやβ−メルカプトエタノールのようなチオールを添加することにより、インテインのペプチド結合切断活性を惹起することができる。特に、チオールはＮインテインの切断活性を惹起するのに有効である。
逆に、インテインのペプチド結合切断活性が融合蛋白質を単離する前、すなわち宿主内又は試験管内で惹起されないようにすることも、目的蛋白質の収量を増加させるためには有効である。そのための方法としては、例えば、宿主の培養温度を２０℃未満にしたり、無細胞蛋白合成を２０℃未満で行うことが挙げられる。
また介在蛋白質がプロテアーゼであれば、プロテアーゼの種類に応じて、至適緩衝液条件、温度、ｐＨなどを制御することにより、ペプチド結合切断活性を惹起することができる。
宿主内で融合蛋白質をコードする遺伝子を発現させる際の宿主としては特に限定されず、例えば、大腸菌等のバクテリア、その他の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物培養細胞、植物培養細胞、及びトランスジェニック動・植物等が挙げられる。なかでも、高い細胞増殖特性を有し、培養操作が簡便で且つ培養に用いる栄養源等のコストが安価であることから、大腸菌等のバクテリアや酵母等が特に好適である。また、融合蛋白質は宿主の細胞質内、細胞外のいずれに発現させてもよいが、大量に発現させる場合には細胞内に発現させる方が望ましい。
なお、宿主が大腸菌の場合は、導入されたプラスミドの大きさが１０ｋｂｐ以上になるとプラスミドのコピー数が減少し、結果的に融合蛋白質の合成量が低下することがある。このときは、融合蛋白質を同一の宿主内で共発現させる手段により発現量の低下を防ぐことができる。例えば、同一の融合蛋白質を合成する同一遺伝子を、異なる複製領域及び薬剤耐性遺伝子を有する２種類のプラスミドなどのベクターに導入し、これら２種類のベクターで２種の薬剤の存在下で大腸菌を形質転換し、融合蛋白質の合成を行うことで、高発現をもたらすことが可能である。
また、本発明の目的蛋白質の製造方法では、融合蛋白質をコードする遺伝子と、分子シャペロンのみをコードする遺伝子とをそれぞれ、同一の宿主内で共存させ、複製することが可能な２種類の異なるプラスミドなどのベクターに導入し、同一の宿主内で共発現させてもよい。例えば、目的蛋白質に対するシャペロニンサブユニットの数比が小さい場合は、融合蛋白質をコードする遺伝子とシャペロニンサブユニットのみをコードする遺伝子とをそれぞれ、同一宿主内で共存・複製可能な２種類のプラスミドに導入して、融合蛋白質とシャペロニンサブユニットを共発現させるとよい。
インテインの部分配列蛋白質と、全長のインテインから該部分配列蛋白質を除いた残余の蛋白質（以下、「インテインの残余の部分配列蛋白質」と称する）は、いわゆるｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ（ウィ・エイチ（Ｗｕ Ｈ）ら、バイオケミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ）、１９９８年、第１３８７巻、ｐ．４２２−４３２）を行うことが知られている。インテインの部分配列蛋白質とインテインの残余の部分配列蛋白質が互いに近くに存在する場合は、隣接する蛋白質同士をアセンブルしやすいと考えられる。ここで、２種類の蛋白質をアセンブルするとは、これらの蛋白質同士を接近させ、共有結合又は非共有結合（水素結合、疎水性相互作用、分子間力等）によって結合又は会合させることをいう。そして、インテインの部分配列蛋白質とインテインの残余蛋白質は、２種類の蛋白質をアセンブルする機能（アセンブリー機能）を有している。このアセンブリー機能を利用して、２種類の目的蛋白質をアセンブルすることができる。例えば、２種類の蛋白質がある目的蛋白質の前駆体となるものであるとき、これらの前駆体をアセンブルして目的蛋白質を製造することができる。
目的蛋白質が免疫グロブリン、前駆体が抗体軽鎖及び抗体重鎖である場合を例に挙げると、第１の例は、分子シャペロンのＣ末端にインテインのＣ末端側部分配列蛋白質を介して抗体重鎖を連結させた融合蛋白質を作製する。一方、別の分子シャペロンのＮ末端にインテインの残余蛋白質を介して抗体軽鎖を連結させた融合蛋白質を作製する。そして、これら２つの融合蛋白質を接近させてアセンブリーを起こさせ、抗体重鎖と抗体軽鎖がジスルフィド結合によって結合した免疫グロブリンを作製することができる。また、第２の例は、分子シャペロンのＣ末端にインテインのＣ末端側部分配列蛋白質を介して抗体重鎖を連結させ、且つ分子シャペロンのＮ末端側にインテインの残余蛋白質を介して抗体軽鎖を連結させた融合蛋白質を作製する。そして、インテインのアセンブリー機能を利用して抗体重鎖と抗体軽鎖をアセンブリーし、抗体重鎖と抗体軽鎖がジスルフィド結合によって結合した免疫グロブリンを作製することができる。なお、インテインの残余蛋白質には、エンドヌクレアーゼ活性部分を含んでいてもよい。
以下に、実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．ＳｓｐＩ遺伝子の単離
ｐＴＷＩＮ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を鋳型とし、配列番号１と２に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＳｓｐＩをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。配列番号３にその塩基配列と対応するアミノ酸配列、配列番号４にアミノ酸配列のみを示す。なお、ＳｓｐＩは、シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ ＰＣＣ６８０３株由来のＤｎａＢ ｈｅｌｉｃａｓｅインテインのエンドヌクレアーゼ領域を除き、Ｎ末端アミノ酸をアラニンに置換した改変型インテイン（Ｃインテイン）である。
２．古細菌由来シャペロニンサブユニット連結体の発現系構築
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＫＳ−１株（ＪＣＭ Ｎｏ．１１８１６）からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と６に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号７に示されたシャペロニンβサブユニット（以下、「ＴＣＰβ」と称する。）の遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。さらに、増幅したＴＣＰβ遺伝子を含むＤＮＡ断片をタンデムに４回連結して、ＴＣＰβ４回連結体（以下、「（ＴＣＰβ）４」と称する。）の遺伝子を作製した。
一方、配列番号３６と３７で示される互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これらをアニーリングさせてマルチクローニングサイトを有する２本鎖ＤＮＡを得た。この２本鎖ＤＮＡは、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩ、ＨｐａＩの各サイトが順に配置され、その下流にヒスチジン６残基からなるヒスチジンタグ（６Ｈｉｓ、配列番号８）をコードする遺伝子、終始コドン及びＮｏｔＩサイトを有する。次に、この２本鎖ＤＮＡをｐＥＴ２１ｄプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ−ＮｏｔＩサイトに導入した。
このプラスミドのＢａｍＨＩサイトに、本実施例で単離した（ＴＣＰβ）４遺伝子を導入し、ＰＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４を構築した。さらに、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４の（ＴＣＰβ）４遺伝子の下流に、本実施例で単離したＳｓｐＩ遺伝子を挿入し、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉを構築した。
図１にｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉの構造を示す。すなわち、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＩはＴ７プロモーターを有し、その下流に、（ＴＣＰβ）４遺伝子、ＳｓｐＩ遺伝子、及び６ＨＩｓ遺伝子が順に配置されている。また、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＩのＳｐｅＩサイトとＨｐａＩサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子と終始コドンを挿入することにより、Ｃ末端に６Ｈｉｓを有する、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
３．抗体軽鎖の発現及び切り出し
長鎖ＤＮＡ合成を行い、配列番号９に示されるヒト由来抗ＨＢｓ（Ｂ型肝炎ウイルス表層蛋白）抗体の軽鎖（ＡｂＬ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。なお、このＤＮＡ断片にはプライマーに由来して５’末端にはＳｐｅＩサイトを、３’末端にはＨｐａＩサイトが設けられた。このＤＮＡ断片をＳｐｅＩ及びＨｐａＩで処理し、あらかじめ同制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉに組込んだ。これにより、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬを構築した。
得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で３０℃、２４時間培養し、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質を発現させた。次いで、菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液 ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７・０）に懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社）存在下、超音波処理にて菌体を破砕後、遠心により菌体破砕液上清を得た。
（比較例１）
図１に示すｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＩのＢａｍＨＩサイトとＳｐｅＩサイトの間に、ＳｓｐＩをコードする遺伝子の代わりに、プレシジョンプロテアーゼの認識配列をコードする遺伝子（配列番号１０）を導入し、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｐを構築した。ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉの代わりにｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｐを用いる以外は全て実施例１と同様にして、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｐ・ＡｂＬを構築した。さらに、実施例１と同様にして、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。
実施例１と比較例１で調製したそれぞれの菌体破砕液上清を室温で２時間処理したものにつき、抗体軽鎖を認識する抗体（ＰＩＥＲＣＥ社 ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＡｂＬがシャペロニンから切断されているか否かを試験した。結果を図２に示す。実施例１の菌体破砕液ではＡｂＬが分子量２５ｋＤａ付近に検出され、ＡｂＬが融合蛋白質から切断されていることが確認された（レーン１）。なお、２５０ｋＤａ付近のバンドは（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質である。一方、比較例１の菌体破砕液では分子量２５０ｋＤａ付近にのみ検出され、ＡｂＬは融合蛋白質から切り出されていなかった（レーン２）。
ｐＴＷＩＮ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を鋳型とし、配列番号１と２に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＳｓｐＩをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。配列番号３にその塩基配列と対応するアミノ酸配列、配列番号４にアミノ酸配列のみを示す。なお、ＳｓｐＩは、シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ ＰＣＣ６８０３株由来のＤｎａＢ ｈｅｌｉｃａｓｅインテインのエンドヌクレアーゼ領域を除き、Ｎ末端アミノ酸をアラニンに置換した改変型インテイン（Ｃインテイン）である。
２．古細菌由来シャペロニンサブユニット連結体の発現系構築
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＫＳ−１株（ＪＣＭ Ｎｏ．１１８１６）からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と６に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号７に示されたシャペロニンβサブユニット（以下、「ＴＣＰβ」と称する。）の遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。さらに、増幅したＴＣＰβ遺伝子を含むＤＮＡ断片をタンデムに４回連結して、ＴＣＰβ４回連結体（以下、「（ＴＣＰβ）４」と称する。）の遺伝子を作製した。
一方、配列番号３６と３７で示される互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これらをアニーリングさせてマルチクローニングサイトを有する２本鎖ＤＮＡを得た。この２本鎖ＤＮＡは、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩ、ＨｐａＩの各サイトが順に配置され、その下流にヒスチジン６残基からなるヒスチジンタグ（６Ｈｉｓ、配列番号８）をコードする遺伝子、終始コドン及びＮｏｔＩサイトを有する。次に、この２本鎖ＤＮＡをｐＥＴ２１ｄプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ−ＮｏｔＩサイトに導入した。
このプラスミドのＢａｍＨＩサイトに、本実施例で単離した（ＴＣＰβ）４遺伝子を導入し、ＰＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４を構築した。さらに、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４の（ＴＣＰβ）４遺伝子の下流に、本実施例で単離したＳｓｐＩ遺伝子を挿入し、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉを構築した。
図１にｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉの構造を示す。すなわち、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＩはＴ７プロモーターを有し、その下流に、（ＴＣＰβ）４遺伝子、ＳｓｐＩ遺伝子、及び６ＨＩｓ遺伝子が順に配置されている。また、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＩのＳｐｅＩサイトとＨｐａＩサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子と終始コドンを挿入することにより、Ｃ末端に６Ｈｉｓを有する、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
３．抗体軽鎖の発現及び切り出し
長鎖ＤＮＡ合成を行い、配列番号９に示されるヒト由来抗ＨＢｓ（Ｂ型肝炎ウイルス表層蛋白）抗体の軽鎖（ＡｂＬ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。なお、このＤＮＡ断片にはプライマーに由来して５’末端にはＳｐｅＩサイトを、３’末端にはＨｐａＩサイトが設けられた。このＤＮＡ断片をＳｐｅＩ及びＨｐａＩで処理し、あらかじめ同制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉに組込んだ。これにより、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬを構築した。
得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で３０℃、２４時間培養し、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質を発現させた。次いで、菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液 ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７・０）に懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社）存在下、超音波処理にて菌体を破砕後、遠心により菌体破砕液上清を得た。
（比較例１）
図１に示すｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＩのＢａｍＨＩサイトとＳｐｅＩサイトの間に、ＳｓｐＩをコードする遺伝子の代わりに、プレシジョンプロテアーゼの認識配列をコードする遺伝子（配列番号１０）を導入し、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｐを構築した。ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉの代わりにｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｐを用いる以外は全て実施例１と同様にして、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｐ・ＡｂＬを構築した。さらに、実施例１と同様にして、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。
実施例１と比較例１で調製したそれぞれの菌体破砕液上清を室温で２時間処理したものにつき、抗体軽鎖を認識する抗体（ＰＩＥＲＣＥ社 ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＡｂＬがシャペロニンから切断されているか否かを試験した。結果を図２に示す。実施例１の菌体破砕液ではＡｂＬが分子量２５ｋＤａ付近に検出され、ＡｂＬが融合蛋白質から切断されていることが確認された（レーン１）。なお、２５０ｋＤａ付近のバンドは（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質である。一方、比較例１の菌体破砕液では分子量２５０ｋＤａ付近にのみ検出され、ＡｂＬは融合蛋白質から切り出されていなかった（レーン２）。
１．Ｃ型肝炎ウイルス抗原の発現及び切出し
長鎖ＤＮＡ合成を行い、配列番号１１に示されるＣ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＣｃ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。実施例１と同様にして、このＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉに組み込み、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＨＣｃとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＨＣｃを構築した。得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＨＣｃを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を実施例１と同様にして培養し、菌体破砕液上清を得た。
（比較例２）
ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉの代わりにｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｐを用いる以外は全て実施例２と同様にして、発現ベクターの構築、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。
実施例２の菌体破砕液上清を室温で２時間処理した。一方、比較例２の菌体破砕液上清をプレシジョンプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によって処理（４℃、２０時間）した。処理後の反応液それぞれにつき、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原を認識する抗体（ＡＢＲ社 抗ＨＣＶマウスモノクローナル抗体）を用いたウエスタンブロッティング解析を行った。結果を図３（ａ）（実施例２）及び図３（ｂ）（比較例２）に示す。図３（ａ）のレーン１が実施例２のサンプルで、レーン２は宿主のみのコントロールである。図３（ｂ）のレーン３が比較例２のサンプルである。
すなわち、図３（ａ）に示すように、実施例２の菌体破砕液ではＨＣｃが分子量２１ｋＤａ付近に検出され、融合蛋白質からＨＣｃが分解されることなく切り出されていることが確認された。一方、図３（ｂ）に示すように、比較例２の菌体破砕液では分子量２１ｋＤａ付近のシグナル以外に１８ｋＤａ、１５ｋＤａ及び１２ｋＤａ付近にシグナルが検出され、ＨＣｃが分解されていることがわかった。これは、ＨＣｃが特に疎水性が高く、限定分解型プロテアーゼによる認識配列の厳密性が崩れ、認識配列以外のＨＣｃの内部で切断が起こったものと考えられる。
長鎖ＤＮＡ合成を行い、配列番号１１に示されるＣ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＣｃ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。実施例１と同様にして、このＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉに組み込み、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＨＣｃとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＨＣｃを構築した。得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＨＣｃを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を実施例１と同様にして培養し、菌体破砕液上清を得た。
（比較例２）
ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉの代わりにｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｐを用いる以外は全て実施例２と同様にして、発現ベクターの構築、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。
実施例２の菌体破砕液上清を室温で２時間処理した。一方、比較例２の菌体破砕液上清をプレシジョンプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によって処理（４℃、２０時間）した。処理後の反応液それぞれにつき、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原を認識する抗体（ＡＢＲ社 抗ＨＣＶマウスモノクローナル抗体）を用いたウエスタンブロッティング解析を行った。結果を図３（ａ）（実施例２）及び図３（ｂ）（比較例２）に示す。図３（ａ）のレーン１が実施例２のサンプルで、レーン２は宿主のみのコントロールである。図３（ｂ）のレーン３が比較例２のサンプルである。
すなわち、図３（ａ）に示すように、実施例２の菌体破砕液ではＨＣｃが分子量２１ｋＤａ付近に検出され、融合蛋白質からＨＣｃが分解されることなく切り出されていることが確認された。一方、図３（ｂ）に示すように、比較例２の菌体破砕液では分子量２１ｋＤａ付近のシグナル以外に１８ｋＤａ、１５ｋＤａ及び１２ｋＤａ付近にシグナルが検出され、ＨＣｃが分解されていることがわかった。これは、ＨＣｃが特に疎水性が高く、限定分解型プロテアーゼによる認識配列の厳密性が崩れ、認識配列以外のＨＣｃの内部で切断が起こったものと考えられる。
１．Ｎ末端のみを切断する改変型ＳｓｐＩをコードする遺伝子の単離
ｐＴＷＩＮ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を鋳型とし、配列番号１２と１３に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号６に示されるＮ末端のみが切断できるよう改変されたＳｓｐＩ（以下、「ＮＳｓｐＩ」と称する。）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。すなわち、ＮＳｓｐＩは、シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ ＰＣＣ６８０３株由来のＤｎａＢ ｈｅｌｉｃａｓｅインテインのエンドヌクレアーゼ領域を除き、Ｃ末端アミノ酸をアラニンに置換した改変型インテイン（Ｎインテイン）である。
２．大腸菌シャペロニンサブユニット連結体の発現系構築
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５と１６に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号１７に示されたＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。一方、配列番号３８と３９に示される互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これらをアニーリングさせてマルチクローニングサイトを有する２本鎖ＤＮＡを得た。この２本鎖ＤＮＡは、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩ，ＸｈｏＩ、の各サイトが順に配置され、その下流にＦＬＡＧペプチド（配列番号１８）をコードする遺伝子と終始コドンを有する。次に、この２本鎖ＤＮＡをプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入した。さらに、導入されたＸｂａＩサイトに、上記で増幅したＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入した。同様の操作を繰り返すことにより、ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子がタンデムに７個連結されたＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（以下、「（ＧｒｏＥＬ）７」と称する。）の遺伝子を挿入し、ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７を構築した。さらに、（ＧｒｏＥＬ）７遺伝子の下流のＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩサイトに、本実施例で得られたＮＳｓｐＩ遺伝子を挿入し、発現ベクターｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩを構築した。図４にｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩの構造を示す。すなわち、ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩはｔｒｃプロモーターを有し、その下流に、７個のＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子がタンデムに並んだＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（（ＧｒｏＥＬ）７）の遺伝子、ＮＳｓｐＩ遺伝子、及びＦＬＡＧペプチドをコードする遺伝子が順に配置されている。また、ＢｇｌＩＩサイトとＸｈｏＩサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子を挿入することにより、（ＧｒｏＥＬ）７とＮＳｓｐＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
３．アセチルコリンムスカリンレセプターの発現及び切断
長鎖ＤＮＡ合成により配列番号１９に示されるアセチルコリンムスカリンレセプター（ＭＲ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩのＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩサイトの間に組み込んだ。これにより、（ＧｒｏＥＬ）７とＮＳｓｐＩとＭＲとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩ・ＭＲを構築した。ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩ・ＭＲを用い、培養温度が２５℃である以外は実施例１と同様にして、形質転換、形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。
菌体破砕液上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製後、最終濃度４０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、ＮＳｓｐＩのＮ末端のペプチド結合を切断した。抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングを行なった。その結果を図５のレーン２に示す。
（比較例３）
実施例３で得られた菌体破砕液上清をＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムにて精製後、ＤＴＴを添加せず、抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングを行なった。その結果を図５のレーン１に示す。
実施例３では、ＮＳｓｐＩとＭＲの融合蛋白質のシグナルが分子量５２ｋＤａ付近に検出され、融合蛋白質からＭＲが切り出されていることが確認された（レーン２）。一方、比較例３では、分子量５２ｋＤａ付近のシグナルは検出されず、融合蛋白質からＭＲが切り出されていないことが確認された（レーン１）。このように、インテインの切断活性がＤＴＴによって惹起された。
ｐＴＷＩＮ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を鋳型とし、配列番号１２と１３に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号６に示されるＮ末端のみが切断できるよう改変されたＳｓｐＩ（以下、「ＮＳｓｐＩ」と称する。）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。すなわち、ＮＳｓｐＩは、シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ ＰＣＣ６８０３株由来のＤｎａＢ ｈｅｌｉｃａｓｅインテインのエンドヌクレアーゼ領域を除き、Ｃ末端アミノ酸をアラニンに置換した改変型インテイン（Ｎインテイン）である。
２．大腸菌シャペロニンサブユニット連結体の発現系構築
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５と１６に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号１７に示されたＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。一方、配列番号３８と３９に示される互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これらをアニーリングさせてマルチクローニングサイトを有する２本鎖ＤＮＡを得た。この２本鎖ＤＮＡは、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩ，ＸｈｏＩ、の各サイトが順に配置され、その下流にＦＬＡＧペプチド（配列番号１８）をコードする遺伝子と終始コドンを有する。次に、この２本鎖ＤＮＡをプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入した。さらに、導入されたＸｂａＩサイトに、上記で増幅したＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入した。同様の操作を繰り返すことにより、ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子がタンデムに７個連結されたＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（以下、「（ＧｒｏＥＬ）７」と称する。）の遺伝子を挿入し、ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７を構築した。さらに、（ＧｒｏＥＬ）７遺伝子の下流のＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩサイトに、本実施例で得られたＮＳｓｐＩ遺伝子を挿入し、発現ベクターｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩを構築した。図４にｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩの構造を示す。すなわち、ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩはｔｒｃプロモーターを有し、その下流に、７個のＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子がタンデムに並んだＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（（ＧｒｏＥＬ）７）の遺伝子、ＮＳｓｐＩ遺伝子、及びＦＬＡＧペプチドをコードする遺伝子が順に配置されている。また、ＢｇｌＩＩサイトとＸｈｏＩサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子を挿入することにより、（ＧｒｏＥＬ）７とＮＳｓｐＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
３．アセチルコリンムスカリンレセプターの発現及び切断
長鎖ＤＮＡ合成により配列番号１９に示されるアセチルコリンムスカリンレセプター（ＭＲ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩのＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩサイトの間に組み込んだ。これにより、（ＧｒｏＥＬ）７とＮＳｓｐＩとＭＲとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩ・ＭＲを構築した。ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩ・ＭＲを用い、培養温度が２５℃である以外は実施例１と同様にして、形質転換、形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。
菌体破砕液上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製後、最終濃度４０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、ＮＳｓｐＩのＮ末端のペプチド結合を切断した。抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングを行なった。その結果を図５のレーン２に示す。
（比較例３）
実施例３で得られた菌体破砕液上清をＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムにて精製後、ＤＴＴを添加せず、抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングを行なった。その結果を図５のレーン１に示す。
実施例３では、ＮＳｓｐＩとＭＲの融合蛋白質のシグナルが分子量５２ｋＤａ付近に検出され、融合蛋白質からＭＲが切り出されていることが確認された（レーン２）。一方、比較例３では、分子量５２ｋＤａ付近のシグナルは検出されず、融合蛋白質からＭＲが切り出されていないことが確認された（レーン１）。このように、インテインの切断活性がＤＴＴによって惹起された。
１．ＰＰＩａｓｅとの融合蛋白質発現系構築
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＫＳ−１株（ＪＣＭ Ｎｏ．１１８１６）からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２０と２１に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号２２に示される超好熱性古細菌由来ＰＰＩａｓｅ（ＴＰＰＩａｓｅ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。
実施例１で調製したｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４・ＩをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで処理してＳｓｐＩ遺伝子とＨｉｓタグと終始コドンを含むＤＮＡ断片を単離した。一方、配列番号３５に示されるオリゴヌクレオチドと、それに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これらをアニーリングさせて２本鎖ＤＮＡ断片を得た。この２本鎖ＤＮＡ断片をｐＥＴ２１ｄプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩサイトに導入した。さらに、導入したＤＮＡ断片に含まれるＮｃｏＩ−ＳｐｅＩサイトに、本実施例で増幅したＴＰＰＩａｓｅ遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入した。さらに、挿入したオリゴヌクレオチドに含まれるＢａｍＨＩサイトとｐＥＴ２１ｄのマルチクローニングサイト内にあるＮｏｔＩサイトの間のＤＮＡ断片を除去し、代わりに、上記で単離したＳｓｐＩ遺伝子とＨｉｓタグと終始コドンを含むＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉを構築した。図６にｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉの構造を示す。すなわち、ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＩはＴ７プロモーターを有し、その下流に、ＴＰＰＩａｓｅ遺伝子、ＳｓｐＩ遺伝子、及び６Ｈｉｓ遺伝子が順に配置されている。また、ＳｐｅＩサイトとＨｐａＩサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子を挿入することにより、ＴＰＰＩａｓｅとＳｓｐＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
２．緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現、切断
ｐＩＶＥＸ２．３−ＧＦＰ ＷＴ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を鋳型とし、配列番号２３と２４に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号２５に示される緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。なお、このＤＮＡ断片にはプライマーに由来して５’末端にはＳｐｅＩサイトを、３’末端にはＨｐａＩサイトがそれぞれ設けられた。このＤＮＡ断片をＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理し、あらかじめ同制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉに組み込んだ。これにより、超好熱性古細菌由来ＰＰＩａｓｅ（ＴＰＰＩａｓｅ）とＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉ・ＧＦＰを構築した。
得られた発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉ・ＧＦＰを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体をカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地で２５℃、２４時間培養し、ＴＰＰＩａｓｅとＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質を発現させた。次いで、菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７・０）に懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル存在下、超音波処理にて菌体を破砕後、遠心により菌体破砕液上清を得た。
（比較例４）
図１に示すｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉについて、ＢａｍＨＩサイトとＳｐｅＩサイトの間にＳｓｐＩをコードする遺伝子の代わりに、プレシジョンプロテアーゼの認識配列をコードする遺伝子を導入したｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｐを構築した。
ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉの代わりにｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｐを用いる以外は全て実施例４と同様にして、発現ベクターの構築、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。
実施例４と比較例４で調製したそれぞれの菌体破砕液上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲル（キアゲン社）で精製した後、室温で２時間処理したものにつき、ヒスチジンタグを認識する抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 抗Ｈｉｓマウスモノクローナル抗体）を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されているか否かを試験した。結果を図７に示す。実施例４の菌体破砕液（レーン１）では、ＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に検出され、ＧＦＰが融合蛋白質から切り出されていることが確認された。なお、レーン１の６２ｋＤａ付近のシグナルはＴＰＰＩａｓｅとＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質である。一方、比較例４の菌体破砕液（レーン２）では、ＴＰＰＩａｓｅとＧＦＰとの融合蛋白質の分子量４５ｋＤａ付近にのみシグナルが検出され、ＧＦＰの切り出しは確認されなかった。なおレーン３はＧＦＰの標品である。
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＫＳ−１株（ＪＣＭ Ｎｏ．１１８１６）からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２０と２１に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号２２に示される超好熱性古細菌由来ＰＰＩａｓｅ（ＴＰＰＩａｓｅ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。
実施例１で調製したｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４・ＩをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで処理してＳｓｐＩ遺伝子とＨｉｓタグと終始コドンを含むＤＮＡ断片を単離した。一方、配列番号３５に示されるオリゴヌクレオチドと、それに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これらをアニーリングさせて２本鎖ＤＮＡ断片を得た。この２本鎖ＤＮＡ断片をｐＥＴ２１ｄプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩサイトに導入した。さらに、導入したＤＮＡ断片に含まれるＮｃｏＩ−ＳｐｅＩサイトに、本実施例で増幅したＴＰＰＩａｓｅ遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入した。さらに、挿入したオリゴヌクレオチドに含まれるＢａｍＨＩサイトとｐＥＴ２１ｄのマルチクローニングサイト内にあるＮｏｔＩサイトの間のＤＮＡ断片を除去し、代わりに、上記で単離したＳｓｐＩ遺伝子とＨｉｓタグと終始コドンを含むＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉを構築した。図６にｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉの構造を示す。すなわち、ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＩはＴ７プロモーターを有し、その下流に、ＴＰＰＩａｓｅ遺伝子、ＳｓｐＩ遺伝子、及び６Ｈｉｓ遺伝子が順に配置されている。また、ＳｐｅＩサイトとＨｐａＩサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子を挿入することにより、ＴＰＰＩａｓｅとＳｓｐＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
２．緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現、切断
ｐＩＶＥＸ２．３−ＧＦＰ ＷＴ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を鋳型とし、配列番号２３と２４に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号２５に示される緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。なお、このＤＮＡ断片にはプライマーに由来して５’末端にはＳｐｅＩサイトを、３’末端にはＨｐａＩサイトがそれぞれ設けられた。このＤＮＡ断片をＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理し、あらかじめ同制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉに組み込んだ。これにより、超好熱性古細菌由来ＰＰＩａｓｅ（ＴＰＰＩａｓｅ）とＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉ・ＧＦＰを構築した。
得られた発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉ・ＧＦＰを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体をカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地で２５℃、２４時間培養し、ＴＰＰＩａｓｅとＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質を発現させた。次いで、菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７・０）に懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル存在下、超音波処理にて菌体を破砕後、遠心により菌体破砕液上清を得た。
（比較例４）
図１に示すｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉについて、ＢａｍＨＩサイトとＳｐｅＩサイトの間にＳｓｐＩをコードする遺伝子の代わりに、プレシジョンプロテアーゼの認識配列をコードする遺伝子を導入したｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｐを構築した。
ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉの代わりにｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｐを用いる以外は全て実施例４と同様にして、発現ベクターの構築、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。
実施例４と比較例４で調製したそれぞれの菌体破砕液上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲル（キアゲン社）で精製した後、室温で２時間処理したものにつき、ヒスチジンタグを認識する抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 抗Ｈｉｓマウスモノクローナル抗体）を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されているか否かを試験した。結果を図７に示す。実施例４の菌体破砕液（レーン１）では、ＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に検出され、ＧＦＰが融合蛋白質から切り出されていることが確認された。なお、レーン１の６２ｋＤａ付近のシグナルはＴＰＰＩａｓｅとＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質である。一方、比較例４の菌体破砕液（レーン２）では、ＴＰＰＩａｓｅとＧＦＰとの融合蛋白質の分子量４５ｋＤａ付近にのみシグナルが検出され、ＧＦＰの切り出しは確認されなかった。なおレーン３はＧＦＰの標品である。
１．エンドセリンレセプターの発現及び切断
実施例１で調製したＳｓｐＩ遺伝子を用い、実施例３と同様の手順で、ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７Ｉを構築した。ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７Ｉは、図４に示されるｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩのＮＳｓｐＩ遺伝子の代わりにＳｓｐＩ遺伝子を導入したベクターである。一方、ヒトｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号２６と２７に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号２８に示されるエンドセリンＡレセプター（ＥＴＡＲ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＩのＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩサイトの間に組み込んだ。これにより、（ＧｒｏＥＬ）７とＳｓｐＩとＥＴＡＲとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７Ｉ・ＥＴＡＲを構築した。この発現ベクターを用い、実施例１と同様にして、形質転換体を作製した。形質転換体を、温度１８℃、１１０ｒｐｍの条件で培養し、菌体を回収した。この菌体から実施例１と同様にして菌体破砕液上清を得た。この菌体破砕液上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製後、ＳｓｐＩのＣ末端のペプチド結合の切断の有無を、抗ＦＬＡＧペプチド抗体（ＳＩＧＭＡ社 ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。結果を図８のレーン２に示す。
（比較例５）
実施例５の形質転換体の培養温度を１８℃でなく、２５℃で行なった以外は、実施例５と同様に培養を行い、菌体破砕液上清を得た。菌体破砕液上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製後、ＳｓｐＩのＣ末端のペプチド結合の切断の有無を、抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認した。結果を図８のレーン３に示す。
実施例５の菌体破砕液ではＥＴＡＲのシグナルが分子量４２ｋＤａ付近に検出され、融合蛋白質からＥＴＡＲが切り出されていることが確認された（レーン２）。一方、比較例５の菌体破砕液では分子量４２ｋＤａ付近にバンドは検出されず、融合蛋白質からＥＴＡＲは切り出されていなかった（レーン３）。なお、レーン１はＳｓｐＩ遺伝子を含まないベクターによるコントロールである。
また、比較例５で得た菌体破砕上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製した画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色を行い、バンドの有無を確認した。対照として、ＳｓｐＩが入っていない（ＧｒｏＥＬ）７とＥＴＡＲとの融合蛋白質について、同様に培養、破砕、精製を行なった画分についてもＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。結果を図９に示す。図９で、レーン１は比較例５で得られた菌体破砕液上清、レーン２はその上清のＦＬＡＧカラム精製画分、レーン３は対照の菌体破砕液上清、レーン４はその上清のＦＬＡＧカラム精製画分である。その結果、ＳｓｐＩが入っていない（ＧｒｏＥＬ）７とＥＴＡＲとの融合蛋白質の場合、抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製した画分にはバンドが検出された（レーン４）。一方、ＳｓｐＩが入っている（ＧｒｏＥＬ）７とＳｓｐＩとＥＴＡＲとの融合蛋白質の場合、抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製した画分には、どこにもバンドが検出されなかった（レーン２）。すなわち、レーン２のサンプルには、抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムと結合する蛋白質は検出されなかった。このことは、レーン１で検出されたバンドは（ＧｒｏＥＬ）７のみの蛋白質で、ＦＬＡＧペプチドがついていないということを示す。これは、２５℃培養をすることにより、ＳｓｐＩの作用によりＦＬＡＧペプチドをつけたＥＴＡＲ部分が切断されて、さらに分解されてしまっていることを示唆する。
実施例１で調製したＳｓｐＩ遺伝子を用い、実施例３と同様の手順で、ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７Ｉを構築した。ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７Ｉは、図４に示されるｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩのＮＳｓｐＩ遺伝子の代わりにＳｓｐＩ遺伝子を導入したベクターである。一方、ヒトｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号２６と２７に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号２８に示されるエンドセリンＡレセプター（ＥＴＡＲ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＩのＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩサイトの間に組み込んだ。これにより、（ＧｒｏＥＬ）７とＳｓｐＩとＥＴＡＲとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７Ｉ・ＥＴＡＲを構築した。この発現ベクターを用い、実施例１と同様にして、形質転換体を作製した。形質転換体を、温度１８℃、１１０ｒｐｍの条件で培養し、菌体を回収した。この菌体から実施例１と同様にして菌体破砕液上清を得た。この菌体破砕液上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製後、ＳｓｐＩのＣ末端のペプチド結合の切断の有無を、抗ＦＬＡＧペプチド抗体（ＳＩＧＭＡ社 ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。結果を図８のレーン２に示す。
（比較例５）
実施例５の形質転換体の培養温度を１８℃でなく、２５℃で行なった以外は、実施例５と同様に培養を行い、菌体破砕液上清を得た。菌体破砕液上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製後、ＳｓｐＩのＣ末端のペプチド結合の切断の有無を、抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認した。結果を図８のレーン３に示す。
実施例５の菌体破砕液ではＥＴＡＲのシグナルが分子量４２ｋＤａ付近に検出され、融合蛋白質からＥＴＡＲが切り出されていることが確認された（レーン２）。一方、比較例５の菌体破砕液では分子量４２ｋＤａ付近にバンドは検出されず、融合蛋白質からＥＴＡＲは切り出されていなかった（レーン３）。なお、レーン１はＳｓｐＩ遺伝子を含まないベクターによるコントロールである。
また、比較例５で得た菌体破砕上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製した画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色を行い、バンドの有無を確認した。対照として、ＳｓｐＩが入っていない（ＧｒｏＥＬ）７とＥＴＡＲとの融合蛋白質について、同様に培養、破砕、精製を行なった画分についてもＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。結果を図９に示す。図９で、レーン１は比較例５で得られた菌体破砕液上清、レーン２はその上清のＦＬＡＧカラム精製画分、レーン３は対照の菌体破砕液上清、レーン４はその上清のＦＬＡＧカラム精製画分である。その結果、ＳｓｐＩが入っていない（ＧｒｏＥＬ）７とＥＴＡＲとの融合蛋白質の場合、抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製した画分にはバンドが検出された（レーン４）。一方、ＳｓｐＩが入っている（ＧｒｏＥＬ）７とＳｓｐＩとＥＴＡＲとの融合蛋白質の場合、抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製した画分には、どこにもバンドが検出されなかった（レーン２）。すなわち、レーン２のサンプルには、抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムと結合する蛋白質は検出されなかった。このことは、レーン１で検出されたバンドは（ＧｒｏＥＬ）７のみの蛋白質で、ＦＬＡＧペプチドがついていないということを示す。これは、２５℃培養をすることにより、ＳｓｐＩの作用によりＦＬＡＧペプチドをつけたＥＴＡＲ部分が切断されて、さらに分解されてしまっていることを示唆する。
１．エンドセリンレセプターの発現及び切断（２）
実施例５と同様に、配列番号２８に示されるエンドセリンＡレセプター（ＥＴＡＲ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。
このＤＮＡ断片を、実施例３で調製したｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩのＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩサイトの間に組み込んだ。これにより、ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体とＮＳｓｐＩとＥＴＡＲとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩ・ＥＴＡＲを構築した。ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩ・ＥＴＡＲを用い、実施例１と同様にして、形質転換及び形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。この菌体破砕液上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製後、最終濃度４０ｍＭのＤＴＴを添加し、ＮＳｓｐＩのＮ末端のペプチド結合を切断した。抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングを行なった結果を図１０のレーン２に示す。
（比較例６）
実施例６の菌体破砕液上清をＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製後、ＤＴＴを添加せず、抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングを行なった結果を図１０のレーン１に示す。
実施例６の菌体破砕液ではＮＳｓｐＩとＥＴＡＲの融合蛋白質のシグナルが分子量５９ｋＤａ付近に検出され、融合蛋白質からＥＴＡＲが切り出されていることが確認された（レーン２）。一方、比較例６の菌体破砕液では、分子量５９ｋＤａ付近のシグナルは検出されず、融合蛋白質からＥＴＡＲが切り出されていないことが確認された（レーン１）。このように、インテインの切断活性がＤＴＴによって惹起された。
実施例５と同様に、配列番号２８に示されるエンドセリンＡレセプター（ＥＴＡＲ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。
このＤＮＡ断片を、実施例３で調製したｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩのＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩサイトの間に組み込んだ。これにより、ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体とＮＳｓｐＩとＥＴＡＲとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩ・ＥＴＡＲを構築した。ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７ＮＩ・ＥＴＡＲを用い、実施例１と同様にして、形質転換及び形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。この菌体破砕液上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製後、最終濃度４０ｍＭのＤＴＴを添加し、ＮＳｓｐＩのＮ末端のペプチド結合を切断した。抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングを行なった結果を図１０のレーン２に示す。
（比較例６）
実施例６の菌体破砕液上清をＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムで精製後、ＤＴＴを添加せず、抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングを行なった結果を図１０のレーン１に示す。
実施例６の菌体破砕液ではＮＳｓｐＩとＥＴＡＲの融合蛋白質のシグナルが分子量５９ｋＤａ付近に検出され、融合蛋白質からＥＴＡＲが切り出されていることが確認された（レーン２）。一方、比較例６の菌体破砕液では、分子量５９ｋＤａ付近のシグナルは検出されず、融合蛋白質からＥＴＡＲが切り出されていないことが確認された（レーン１）。このように、インテインの切断活性がＤＴＴによって惹起された。
１．ＧＦＰの発現及び切断２；無細胞蛋白合成
大腸菌の培養の代わりに、無細胞蛋白質発現（ロシュ・ダイアグノスティック社 ＲＴＳ５００使用）を行なった以外は実施例４と同様に蛋白合成を行なった。
（比較例７）
大腸菌の培養の代わりに、無細胞蛋白質発現（ロシュ・ダイアグノスティック社 ＲＴＳ５００使用）を行なった以外は比較例４と同様に蛋白合成を行なった。
実施例７と比較例７で調製したそれぞれの蛋白合成後の反応液を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲル（キアゲン社）で精製した後、室温で２時間処理したものにつき、抗ＧＦＰマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されているか否かを試験した。結果を図１１に示す。レーン１はＧＦＰ−６Ｈｉｓによるコントロールである。実施例７（レーン２）のｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉ・ＧＦＰでは、ＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に検出され、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されていることが確認された。なお、６２ｋＤａ付近のシグナルはＴＰＰＩａｓｅとＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質である。一方、比較例７（レーン３）ではＴＰＰＩａｓｅとＧＦＰとの融合蛋白質の分子量４５ｋＤａ付近にのみシグナルが検出され、ＧＦＰの切断は確認されなかった。
大腸菌の培養の代わりに、無細胞蛋白質発現（ロシュ・ダイアグノスティック社 ＲＴＳ５００使用）を行なった以外は実施例４と同様に蛋白合成を行なった。
（比較例７）
大腸菌の培養の代わりに、無細胞蛋白質発現（ロシュ・ダイアグノスティック社 ＲＴＳ５００使用）を行なった以外は比較例４と同様に蛋白合成を行なった。
実施例７と比較例７で調製したそれぞれの蛋白合成後の反応液を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲル（キアゲン社）で精製した後、室温で２時間処理したものにつき、抗ＧＦＰマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されているか否かを試験した。結果を図１１に示す。レーン１はＧＦＰ−６Ｈｉｓによるコントロールである。実施例７（レーン２）のｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉ・ＧＦＰでは、ＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に検出され、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されていることが確認された。なお、６２ｋＤａ付近のシグナルはＴＰＰＩａｓｅとＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質である。一方、比較例７（レーン３）ではＴＰＰＩａｓｅとＧＦＰとの融合蛋白質の分子量４５ｋＤａ付近にのみシグナルが検出され、ＧＦＰの切断は確認されなかった。
１．ＭＭＩ遺伝子の単離
ｐＴＷＩＮ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を鋳型とし、配列番号２９と３０に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ＳｓｐＩのＣ末端部分配列であるＭＭＩをコードする遺伝子（ＭＭＩ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を単離した。配列番号３１にその塩基配列と対応するアミノ酸配列、配列番号３２にアミノ酸配列のみを示す。すなわち、ＭＭＩは、ＳｓｐＩのＣ末端から４８番目のアミノ酸までの部分に相当する。
２．古細菌由来シャペロニンサブユニット連結体の発現系構築
配列番号４０と４１にそれぞれ示される２種のオリゴヌクレオチドを合成し、これらをアニーリングさせ、６Ｈｉｓをコードする２本鎖ＤＮＡを調製した。この２本鎖ＤＮＡを、実施例１で調製した発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ上の（ＴＣＰβ）４遺伝子の上流にあるＮｃｏＩサイトに導入し、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２を構築した。図１２にｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２の構成を示す。すなわち、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２はＴ７プロモーターを有し、その下流に、６Ｈｉｓ遺伝子、（ＴＣＰβ）４の遺伝子、及びＳｓｐＩ遺伝子が順に配置されている。また、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２のＳｐｅＩサイトとＨｐａＩサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子を挿入することにより、Ｎ末端にＨｉｓタグが付いた、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
同様にして、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２のＳｓｐＩの代わりに、ＭＭＩ遺伝子を導入した発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２を構築した。図１３にｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２の構成を示す。すなわち、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２の構成はｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２とほぼ同じであり、ＳｓｐＩ遺伝子がＭＭＩ遺伝子に置き換わっている点のみが異なる。ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２のＳｐｅＩサイトとＨｐａＩサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子を挿入することにより、Ｎ末端にＨｉｓタグが付いた、（ＴＣＰβ）４とＭＭＩＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
３．抗体軽鎖の発現、切断
実施例１で単離したＡｂＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２及びｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２にそれぞれ導入し、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２及びｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＬ−２を構築した。すなわち、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２によれば（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質を、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＬ−２によれば、（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＬとの融合蛋白質を発現することができる。
得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２及びｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＬ−２を、それぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換体を得た。これらの形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地で３０℃、２４時間培養し、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質、及び（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＬとの融合蛋白質を発現させた。これらの菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液 ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７・０）にそれぞれ懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル存在下、超音波処理にて各菌体を破砕後、遠心により各菌体破砕液上清を得た。
（比較例８）
実施例８で構築したｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２のＳｓｐＩ遺伝子の代わりにプレシジョンプロテアーゼの認識アミノ酸配列をコードする遺伝子を導入した発現ベクターｐＥＴ（ＴＣＰβ）４Ｐ・ＡｂＬ−２を構築した。
実施例８と比較例８で調製した各菌体破砕液上清を室温で２時間処理したものにつき、軽鎖抗体を認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＡｂＬがシャペロニンから切断されているか否かを試験した。結果を図１４に示す。すなわち、実施例８のｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＬ−２（レーン１）及びｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２（レーン２）ではＡｂＬが分子量２５ｋＤａ付近に検出され、ＡｂＬが各融合蛋白質から切り出されていることが確認された。なお、２５０ｋＤａ付近のバンドは（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＬとの融合蛋白質（レーン１）、又は（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質（レーン２）である。一方、比較例８（レーン３）では分子量２５０ｋＤａ付近にのみ検出され、ＡｂＬは各融合蛋白質から切り出されていなかった。また、シグナルの強度をレーン１とレーン２とで比較すると、これらは同程度であった。すなわち、ＭＭＩとＳｓｐＩとでは、目的蛋白質を切断する活性は同程度であった。
ｐＴＷＩＮ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を鋳型とし、配列番号２９と３０に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ＳｓｐＩのＣ末端部分配列であるＭＭＩをコードする遺伝子（ＭＭＩ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を単離した。配列番号３１にその塩基配列と対応するアミノ酸配列、配列番号３２にアミノ酸配列のみを示す。すなわち、ＭＭＩは、ＳｓｐＩのＣ末端から４８番目のアミノ酸までの部分に相当する。
２．古細菌由来シャペロニンサブユニット連結体の発現系構築
配列番号４０と４１にそれぞれ示される２種のオリゴヌクレオチドを合成し、これらをアニーリングさせ、６Ｈｉｓをコードする２本鎖ＤＮＡを調製した。この２本鎖ＤＮＡを、実施例１で調製した発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ上の（ＴＣＰβ）４遺伝子の上流にあるＮｃｏＩサイトに導入し、発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２を構築した。図１２にｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２の構成を示す。すなわち、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２はＴ７プロモーターを有し、その下流に、６Ｈｉｓ遺伝子、（ＴＣＰβ）４の遺伝子、及びＳｓｐＩ遺伝子が順に配置されている。また、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２のＳｐｅＩサイトとＨｐａＩサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子を挿入することにより、Ｎ末端にＨｉｓタグが付いた、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
同様にして、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２のＳｓｐＩの代わりに、ＭＭＩ遺伝子を導入した発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２を構築した。図１３にｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２の構成を示す。すなわち、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２の構成はｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２とほぼ同じであり、ＳｓｐＩ遺伝子がＭＭＩ遺伝子に置き換わっている点のみが異なる。ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２のＳｐｅＩサイトとＨｐａＩサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子を挿入することにより、Ｎ末端にＨｉｓタグが付いた、（ＴＣＰβ）４とＭＭＩＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
３．抗体軽鎖の発現、切断
実施例１で単離したＡｂＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２及びｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２にそれぞれ導入し、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２及びｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＬ−２を構築した。すなわち、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２によれば（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質を、ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＬ−２によれば、（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＬとの融合蛋白質を発現することができる。
得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２及びｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＬ−２を、それぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換体を得た。これらの形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地で３０℃、２４時間培養し、（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質、及び（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＬとの融合蛋白質を発現させた。これらの菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液 ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７・０）にそれぞれ懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル存在下、超音波処理にて各菌体を破砕後、遠心により各菌体破砕液上清を得た。
（比較例８）
実施例８で構築したｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２のＳｓｐＩ遺伝子の代わりにプレシジョンプロテアーゼの認識アミノ酸配列をコードする遺伝子を導入した発現ベクターｐＥＴ（ＴＣＰβ）４Ｐ・ＡｂＬ−２を構築した。
実施例８と比較例８で調製した各菌体破砕液上清を室温で２時間処理したものにつき、軽鎖抗体を認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＡｂＬがシャペロニンから切断されているか否かを試験した。結果を図１４に示す。すなわち、実施例８のｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＬ−２（レーン１）及びｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ・ＡｂＬ−２（レーン２）ではＡｂＬが分子量２５ｋＤａ付近に検出され、ＡｂＬが各融合蛋白質から切り出されていることが確認された。なお、２５０ｋＤａ付近のバンドは（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＬとの融合蛋白質（レーン１）、又は（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＬとの融合蛋白質（レーン２）である。一方、比較例８（レーン３）では分子量２５０ｋＤａ付近にのみ検出され、ＡｂＬは各融合蛋白質から切り出されていなかった。また、シグナルの強度をレーン１とレーン２とで比較すると、これらは同程度であった。すなわち、ＭＭＩとＳｓｐＩとでは、目的蛋白質を切断する活性は同程度であった。
１．抗体重鎖の発現
長鎖ＤＮＡ合成を行い、配列番号３３に示されるヒト由来抗ＨＢｓ抗体の重鎖（ＡｂＨ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。なお、このＤＮＡ断片にはプライマーに由来して５’末端にはＳｐｅＩサイトを、３’末端にはＨｐａＩサイトがそれぞれ設けられた。このＤＮＡ断片を、実施例８に示したｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２のＳｐｅＩ及びＨｐａＩサイトの間に組み込んだ。これにより、Ｎ末端に６Ｈｉｓを有する、（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＨとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＨ−２を構築した。
得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＨ−２を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地で３０℃、２４時間培養し、（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＨとの融合蛋白質を発現させた。菌体を回収し、菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液 ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７・０）に懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル存在下、超音波処理にて菌体を破砕後、遠心により菌体破砕液上清を得た。
（比較例９）
ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２をの代わりにｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２を用いる以外は全て実施例９と同様にして、発現ベクターの構築、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。
実施例９と比較例９で調製した各菌体破砕液上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色を行った。結果を図１５に示す。すなわち、レーン１（実施例９）では２９０ｋＤａ付近に（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＨとの融合蛋白質に由来するバンドが検出された。一方、レーン２（比較例９）では、３００ｋＤａ付近に非常に薄いバンドしか検出されなかった。すなわち、比較例９の方は実施例９に比べて発現量がかなり低かった。
以上より、目的蛋白質が５０ｋＤａ程度のＡｂＨである場合、比較例９で調製した（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＨとの融合蛋白質では、ＳｓｐＩとＡｂＨがシャペロニンのキャビティに入りきらないため、発現しなくなるか、発現量が激減したと考えられた。一方、実施例９のように、ＳｓｐＩの代わりにその部分配列であるＭＭＩを導入した場合は、特に問題なく融合蛋白質を発現させることができた。これは、ＭＭＩとＡｂＨがシャペロニンのキャビティに納まるためと考えられた。
実施例９で得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＨからの菌体破砕液上清を室温で２時間処理し、融合蛋白質からＡｂＨを切り出した。抗体重鎖を認識する抗体（ＰＩＥＲＣＥ社 ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＡｂＨが融合蛋白質から切り出されているか否かを確認した。結果を図１６に示す。その結果、シグナルが分子量５０ｋＤａ付近に検出され、融合蛋白質からＡｂＨが切り出されていることが確認された。なお、２９０ｋＤａ付近のバンドはシャペロニンβサブユニットＴＣＰβ４量体とＭＭＩとＡｂＨとの融合蛋白質である。
長鎖ＤＮＡ合成を行い、配列番号３３に示されるヒト由来抗ＨＢｓ抗体の重鎖（ＡｂＨ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。なお、このＤＮＡ断片にはプライマーに由来して５’末端にはＳｐｅＩサイトを、３’末端にはＨｐａＩサイトがそれぞれ設けられた。このＤＮＡ断片を、実施例８に示したｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２のＳｐｅＩ及びＨｐａＩサイトの間に組み込んだ。これにより、Ｎ末端に６Ｈｉｓを有する、（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＨとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＨ−２を構築した。
得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＨ−２を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地で３０℃、２４時間培養し、（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＨとの融合蛋白質を発現させた。菌体を回収し、菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液 ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７・０）に懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル存在下、超音波処理にて菌体を破砕後、遠心により菌体破砕液上清を得た。
（比較例９）
ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ−２をの代わりにｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４Ｉ−２を用いる以外は全て実施例９と同様にして、発現ベクターの構築、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、菌体破砕液上清を得た。
実施例９と比較例９で調製した各菌体破砕液上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色を行った。結果を図１５に示す。すなわち、レーン１（実施例９）では２９０ｋＤａ付近に（ＴＣＰβ）４とＭＭＩとＡｂＨとの融合蛋白質に由来するバンドが検出された。一方、レーン２（比較例９）では、３００ｋＤａ付近に非常に薄いバンドしか検出されなかった。すなわち、比較例９の方は実施例９に比べて発現量がかなり低かった。
以上より、目的蛋白質が５０ｋＤａ程度のＡｂＨである場合、比較例９で調製した（ＴＣＰβ）４とＳｓｐＩとＡｂＨとの融合蛋白質では、ＳｓｐＩとＡｂＨがシャペロニンのキャビティに入りきらないため、発現しなくなるか、発現量が激減したと考えられた。一方、実施例９のように、ＳｓｐＩの代わりにその部分配列であるＭＭＩを導入した場合は、特に問題なく融合蛋白質を発現させることができた。これは、ＭＭＩとＡｂＨがシャペロニンのキャビティに納まるためと考えられた。
実施例９で得られた発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４ＭＭＩ・ＡｂＨからの菌体破砕液上清を室温で２時間処理し、融合蛋白質からＡｂＨを切り出した。抗体重鎖を認識する抗体（ＰＩＥＲＣＥ社 ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＡｂＨが融合蛋白質から切り出されているか否かを確認した。結果を図１６に示す。その結果、シグナルが分子量５０ｋＤａ付近に検出され、融合蛋白質からＡｂＨが切り出されていることが確認された。なお、２９０ｋＤａ付近のバンドはシャペロニンβサブユニットＴＣＰβ４量体とＭＭＩとＡｂＨとの融合蛋白質である。
１．グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質発現系構築
アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社から市販されているｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクターのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトに、配列番号３４に示される２本鎖ＤＮＡを挿入し、ＳｐｅＩサイト、ＨｐａＩサイト及び６Ｈｉｓ遺伝子を導入した。また、ＢａｍＨＩサイトと上記ＳｐｅＩサイトの間に実施例８で得られたＭＭＩ遺伝子を導入した。この発現ベクターをｐＧＥＸ ＭＭＩと命名した。図１７にｐＧＥＸ ＭＭＩの構成を示す。すなわち、ｐＧＥＸ ＭＭＩはｔａｃプロモーターを有し、その下流に、ＧＳＴ遺伝子、ＭＭＩ遺伝子、６Ｈｉｓ遺伝子が順に配置されている。そして、ＳｐｅＩサイトとＨｐａＩサイトの間に目的蛋白質の遺伝子を挿入することにより、ＧＳＴとＭＭＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
２．ＧＦＰの発現、切断
ｐＩＶＥＸ２．３−ＧＦＰ ＷＴベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を鋳型とし、配列番号２３と２４に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号２５に示されるＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。なお、このＤＮＡ断片にはプライマーに由来して５’末端にはＳｐｅＩサイトを、３’末端にはＨｐａＩサイトがそれぞれ設けられた。このＤＮＡ断片を、本実施例で構築したｐＧＥＸ ＭＭＩのＳｐｅＩ及びＨｐａＩサイトの間に組み込んだ。これにより、ＧＳＴとＭＭＩとＧＦＰとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＧＥＸ ＭＭＩ・ＧＦＰを構築した。同様にして、ＭＭＩ遺伝子の代わりに実施例１で調製したＳｓｐＩ遺伝子を導入した発現ベクターｐＧＥＸ Ｉ・ＧＦＰを構築した。
ｐＧＥＸ ＭＭＩ・ＧＦＰ（実施例１０−１）及びｐＧＥＸＩ・ＧＦＰ（実施例１０−１）をそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。これらの形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地で２５℃、２４時間培養し、ＧＳＴとＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質、及びＧＳＴとＭＭＩとＧＦＰとの融合蛋白質を発現させた。それぞれの菌体を回収し、各菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル存在下、超音波処理にて各菌体を破砕後、遠心により各菌体破砕液上清を得た。
（比較例１０）
図１７に示すｐＧＥＸ ＭＭＩについて、ＢａｍＨＩサイトとＳｐｅＩサイトの間にＭＭＩをコードする遺伝子の代わりに、プレシジョンプロテアーゼの認識配列をコードする遺伝子を導入したｐＧＥＸ Ｐを構築した。そして、ｐＧＥＸ ＭＭＩの代わりにｐＧＥＸ Ｐを用いる以外は全て実施例１０と同様に、発現ベクターの構築、形質転換、形質転換体の培養を行い、実施例１０と同様に菌体破砕液上清を得た。
実施例１０と比較例１０で調製したそれぞれの菌体破砕液上清を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲル（キアゲン社）で精製した後、室温で２時間処理したものにつき、ヒスチジンタグを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＧＦＰが各融合蛋白質から切り出されているか否かを確認した。結果を図１８に示す。すなわち、実施例１０のｐＧＥＸ Ｉ・ＧＦＰ（レーン１）ではＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に検出され、ＧＦＰが融合蛋白質から切り出されていることが確認された。また、ｐＧＥＸ ＭＭＩ・ＧＦＰ（レーン２）においても、ＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に検出され、ＧＦＰが融合蛋白質から切り出されていることが確認された。なお、５８ｋＤａ付近のバンドはＧＳＴとＭＭＩとＧＦＰとの融合蛋白質である。一方、比較例１０（レーン３）では分子量５３ｋＤａ付近にのみバンドが検出され、ＧＦＰは融合蛋白質から切り出されていなかった。
アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社から市販されているｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクターのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトに、配列番号３４に示される２本鎖ＤＮＡを挿入し、ＳｐｅＩサイト、ＨｐａＩサイト及び６Ｈｉｓ遺伝子を導入した。また、ＢａｍＨＩサイトと上記ＳｐｅＩサイトの間に実施例８で得られたＭＭＩ遺伝子を導入した。この発現ベクターをｐＧＥＸ ＭＭＩと命名した。図１７にｐＧＥＸ ＭＭＩの構成を示す。すなわち、ｐＧＥＸ ＭＭＩはｔａｃプロモーターを有し、その下流に、ＧＳＴ遺伝子、ＭＭＩ遺伝子、６Ｈｉｓ遺伝子が順に配置されている。そして、ＳｐｅＩサイトとＨｐａＩサイトの間に目的蛋白質の遺伝子を挿入することにより、ＧＳＴとＭＭＩと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
２．ＧＦＰの発現、切断
ｐＩＶＥＸ２．３−ＧＦＰ ＷＴベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を鋳型とし、配列番号２３と２４に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号２５に示されるＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。なお、このＤＮＡ断片にはプライマーに由来して５’末端にはＳｐｅＩサイトを、３’末端にはＨｐａＩサイトがそれぞれ設けられた。このＤＮＡ断片を、本実施例で構築したｐＧＥＸ ＭＭＩのＳｐｅＩ及びＨｐａＩサイトの間に組み込んだ。これにより、ＧＳＴとＭＭＩとＧＦＰとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＧＥＸ ＭＭＩ・ＧＦＰを構築した。同様にして、ＭＭＩ遺伝子の代わりに実施例１で調製したＳｓｐＩ遺伝子を導入した発現ベクターｐＧＥＸ Ｉ・ＧＦＰを構築した。
ｐＧＥＸ ＭＭＩ・ＧＦＰ（実施例１０−１）及びｐＧＥＸＩ・ＧＦＰ（実施例１０−１）をそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。これらの形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地で２５℃、２４時間培養し、ＧＳＴとＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質、及びＧＳＴとＭＭＩとＧＦＰとの融合蛋白質を発現させた。それぞれの菌体を回収し、各菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル存在下、超音波処理にて各菌体を破砕後、遠心により各菌体破砕液上清を得た。
（比較例１０）
図１７に示すｐＧＥＸ ＭＭＩについて、ＢａｍＨＩサイトとＳｐｅＩサイトの間にＭＭＩをコードする遺伝子の代わりに、プレシジョンプロテアーゼの認識配列をコードする遺伝子を導入したｐＧＥＸ Ｐを構築した。そして、ｐＧＥＸ ＭＭＩの代わりにｐＧＥＸ Ｐを用いる以外は全て実施例１０と同様に、発現ベクターの構築、形質転換、形質転換体の培養を行い、実施例１０と同様に菌体破砕液上清を得た。
実施例１０と比較例１０で調製したそれぞれの菌体破砕液上清を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲル（キアゲン社）で精製した後、室温で２時間処理したものにつき、ヒスチジンタグを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＧＦＰが各融合蛋白質から切り出されているか否かを確認した。結果を図１８に示す。すなわち、実施例１０のｐＧＥＸ Ｉ・ＧＦＰ（レーン１）ではＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に検出され、ＧＦＰが融合蛋白質から切り出されていることが確認された。また、ｐＧＥＸ ＭＭＩ・ＧＦＰ（レーン２）においても、ＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に検出され、ＧＦＰが融合蛋白質から切り出されていることが確認された。なお、５８ｋＤａ付近のバンドはＧＳＴとＭＭＩとＧＦＰとの融合蛋白質である。一方、比較例１０（レーン３）では分子量５３ｋＤａ付近にのみバンドが検出され、ＧＦＰは融合蛋白質から切り出されていなかった。
１．無細胞翻訳系における融合蛋白質の発現
実施例４で調製したｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉで、ＳｓｐＩ遺伝子に代わってＭＭＩ遺伝子が挿入されたプラスミドｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩを構築した（図１９）。実施例１０で調製した配列番号２５に示されるＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ＳｐｅＩおよびＨｐａＩ処理し、同制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩに組み込んだ。これにより、ＴＰＰＩａｓｅとＭＭＩとＧＦＰとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩ・ＧＦＰを構築した。
得られた発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩ・ＧＦＰについて、無細胞蛋白質発現（ロシュ・ダイアグノスティック社 ＲＴＳ５００使用）を行なった。
（比較例１１）
実施例４で構築したｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉを使用した（比較例１１−１）。さらに、ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩのＢａｍＨＩサイトとＳｐｅＩサイトの間に、ＭＭＩでなくプレシジョンプロテアーゼの認識配列をコードする遺伝子としたｐＥＴ ＴＰＰ Ｉａｓｅ Ｐを構築した（比較例１１−２）。ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩ・ＧＦＰをｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉ・ＧＦＰ又はｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｐ・ＧＦＰとする以外は全て実施例１１と同様にして蛋白合成を行なった。
実施例１１と比較例１１で調製したそれぞれの反応液をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲル（キアゲン社製）で精製した後、室温で２時間処理したものにつき、抗ＧＦＰマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されているか否かを試験した。結果を図２０に示す。実施例１１（レーン３）のｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩ・ＧＦＰではＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に観測され、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されていることが確認された。なお、５０ｋＤａ付近のシグナルはＴＰＰＩａｓｅとＭＭＩとＧＦＰとの融合蛋白質である。また、比較例１１−１（レーン２）のｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉ・ＧＦＰでもＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に観測され、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されていることが確認された。なお、６２ｋＤａ付近のシグナルはＴＰＰＩａｓｅとＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質である。一方、比較例１１−２のｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｐ・ＧＦＰ（レーン４）ではＴＰＰＩａｓｅとＧＦＰとの融合蛋白質の分子量４５ｋＤａ付近にのみシグナル観測され、ＧＦＰの切断は確認されなかった。これらの結果から、ＳｓｐＩと同様に、ＭＭＩは無細胞蛋白合成を行なった場合にも切断活性を有していることが確認された。
実施例４で調製したｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉで、ＳｓｐＩ遺伝子に代わってＭＭＩ遺伝子が挿入されたプラスミドｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩを構築した（図１９）。実施例１０で調製した配列番号２５に示されるＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ＳｐｅＩおよびＨｐａＩ処理し、同制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩに組み込んだ。これにより、ＴＰＰＩａｓｅとＭＭＩとＧＦＰとの融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩ・ＧＦＰを構築した。
得られた発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩ・ＧＦＰについて、無細胞蛋白質発現（ロシュ・ダイアグノスティック社 ＲＴＳ５００使用）を行なった。
（比較例１１）
実施例４で構築したｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉを使用した（比較例１１−１）。さらに、ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩのＢａｍＨＩサイトとＳｐｅＩサイトの間に、ＭＭＩでなくプレシジョンプロテアーゼの認識配列をコードする遺伝子としたｐＥＴ ＴＰＰ Ｉａｓｅ Ｐを構築した（比較例１１−２）。ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩ・ＧＦＰをｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉ・ＧＦＰ又はｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｐ・ＧＦＰとする以外は全て実施例１１と同様にして蛋白合成を行なった。
実施例１１と比較例１１で調製したそれぞれの反応液をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲル（キアゲン社製）で精製した後、室温で２時間処理したものにつき、抗ＧＦＰマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されているか否かを試験した。結果を図２０に示す。実施例１１（レーン３）のｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ ＭＭＩ・ＧＦＰではＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に観測され、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されていることが確認された。なお、５０ｋＤａ付近のシグナルはＴＰＰＩａｓｅとＭＭＩとＧＦＰとの融合蛋白質である。また、比較例１１−１（レーン２）のｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｉ・ＧＦＰでもＧＦＰが分子量２７ｋＤａ付近に観測され、ＧＦＰがＴＰＰＩａｓｅから切断されていることが確認された。なお、６２ｋＤａ付近のシグナルはＴＰＰＩａｓｅとＳｓｐＩとＧＦＰとの融合蛋白質である。一方、比較例１１−２のｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ Ｐ・ＧＦＰ（レーン４）ではＴＰＰＩａｓｅとＧＦＰとの融合蛋白質の分子量４５ｋＤａ付近にのみシグナル観測され、ＧＦＰの切断は確認されなかった。これらの結果から、ＳｓｐＩと同様に、ＭＭＩは無細胞蛋白合成を行なった場合にも切断活性を有していることが確認された。
【配列表】
Claims (43)
- ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブユニットをペプチド結合で連結させ、且つ、他方の末端には目的蛋白質をペプチド結合で連結させたことを特徴とする融合蛋白質。
- 分子シャペロンが、複数のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。
- ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、単独のシャペロニンサブユニット、又はシャペロニンサブユニット連結体に連結されており、前記シャペロニンサブユニット連結体は、２〜１０個のシャペロニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結したものであることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の融合蛋白質。
- ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、単独のシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体のＮ末端、単独のシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体のＣ末端、シャペロニンサブユニット連結体のシャペロニンサブユニット同士の連結部、から選択される１又は２以上の部位に連結されていることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の融合蛋白質。
- シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との数の比が１：１〜１０：１であることを特徴とする請求の範囲第３項又は第４項に記載の融合蛋白質。
- 分子シャペロンがペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。
- ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼのＮ末端及び／又はＣ末端に連結されていることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の融合蛋白質。
- 分子シャペロンが、バクテリア、古細菌又は真核生物に由来することを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の融合蛋白質。
- ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がインテイン又はインテインの部分配列蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の融合蛋白質。
- インテインが、Ｎ末端を切断するがＣ末端を切断しないものであることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の融合蛋白質。
- インテインが、Ｃ末端を切断するがＮ末端を切断しないものであること特徴とする請求の範囲第９項に記載の融合蛋白質。
- インテインの部分配列蛋白質が、インテインのＣ末端から２０〜１２０個のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の融合蛋白質。
- インテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．由来のものであることを特徴とする請求の範囲第９項〜第１２項のいずれかに記載の融合蛋白質。
- インテインが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．から選択される由来のものであることを特徴とする請求の範囲第９項〜第１２項のいずれかに記載の融合蛋白質。
- インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の融合蛋白質。
- インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の融合蛋白質。
- ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がプロテアーゼであることを特徴とする請求の範囲第１項〜第１６項のいずれかに記載の融合蛋白質。
- 請求の範囲第１項〜第１７項のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする単離された遺伝子。
- 請求の範囲第１項〜第１７項のいずれかに記載の融合蛋白質から、目的蛋白質を、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって切り出すことを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
- 請求の範囲第１項〜第１７項のいずれかに記載の融合蛋白質を調製する工程と、前工程で調製した融合蛋白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質のペプチド結合切断活性を惹起する工程と、前工程でペプチド結合切断活性を惹起したペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用により、融合蛋白質の一部を切断し、融合蛋白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる工程とを含むことを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
- 前記融合蛋白質を２０〜３７℃の温度に曝すことにより前記ペプチド結合切断活性を惹起することを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の目的蛋白質の製造方法。
- 前記融合蛋白質をｐＨ６〜８の水素イオン濃度に曝すことにより前記ペプチド結合切断活性を惹起することを特徴とする請求の範囲第２０項又は第２１項に記載の目的蛋白質の製造方法。
- チオールを添加することにより前記ペプチド結合切断活性を惹起することを特徴とする請求の範囲第２０項〜第２２項のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
- 前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製する工程と、前工程で得られた発現ベクターを宿主に導入して該融合蛋白質を発現する工程と、前工程で得られた融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す工程とを含むことを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の目的蛋白質の製造方法。
- 同一宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドに、前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んで２種類の発現ベクターを作製する工程と、前工程で得られた２種類の発現ベクターを同一宿主に導入し、該融合蛋白質を発現させる工程と、前工程で得られた融合蛋白質から、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用で目的蛋白質を切り出す工程とを含むことを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の目的蛋白質の製造方法。
- 同一宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドの、一方に前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込み、他方に分子シャペロンのみをコードする遺伝子を組み込んで、２種類の発現ベクターを作製する工程と、前工程で得られた２種類の発現ベクターを同一宿主に導入し、該融合蛋白質と該分子シャペロンを発現させる工程と、前工程で得られた融合蛋白質から、ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用で目的蛋白質を切り出す工程を含むことを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の目的蛋白質の製造方法。
- 宿主は、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする請求の範囲第２４項〜第２６項のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
- 宿主内で融合蛋白質を発現させ、前記宿主はバクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする請求の範囲第１９項〜第２６項のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
- 無細胞翻訳系で行うことを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の目的蛋白質の製造方法。
- 分子シャペロンがシャペロニンであり、５〜１０個のシャペロニンサブユニットがリング状に集合してシャペロニンリングを形成しており、前記目的蛋白質は、該シャペロニンリングの内部に収納されていることを特徴とする請求の範囲第１９項〜第２９項のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
- インテインのＣ末端から２０〜１２０個のアミノ酸残基からなることを特徴とするインテインの部分配列蛋白質。
- インテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．由来のものであることを特徴とする請求の範囲第３１項に記載のインテインの部分配列蛋白質。
- インテインが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．から選択される由来のものであることを特徴とする請求の範囲第３１項に記載のインテインの部分配列蛋白質。
- インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第３１項に記載のインテインの部分配列蛋白質。
- インテインの部分配列蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、且つペプチド切断活性を有する蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第３１項に記載のインテインの部分配列蛋白質。
- 請求の範囲第３１項〜第３５項のいずれかに記載のインテインの部分配列蛋白質をコードする単離された遺伝子。
- 請求の範囲第１８項又は第３６項に記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
- 請求の範囲第３７項に記載の発現ベクターを含有する形質転換体。
- インテインの部分配列蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブユニットをペプチド結合で連結させ、且つ、他方の末端には目的蛋白質第１前駆体をペプチド結合で連結させた第１の融合蛋白質を作製する工程１と、該インテインの残余の部分配列蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブユニットをペプチド結合で連結させ、且つ、他方の末端には目的蛋白質第２前駆体をペプチド結合で連結させた第２の融合蛋白質を作製する工程２と、インテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質の切断機能により、工程１で得られた第１の融合蛋白質から目的蛋白質第１前駆体を切り出し、さらに工程２で得られた第２の融合蛋白質から目的蛋白質第２前駆体を切り出す工程３と、インテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質のアセンブリー機能により、工程３で得られた目的蛋白質第１前駆体と目的蛋白質第２前駆体をアセンブルする工程４とを含むことを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
- 分子シャペロンの一方の末端にインテインの部分配列蛋白質、他方の末端に該インテインの残余の部分配列蛋白質がペプチド結合を介して連結され、さらに該インテインの部分配列蛋白質に目的蛋白質第１前駆体がペプチド結合を介して連結され、且つ該インテインの残余の部分配列蛋白質に目的蛋白質第２前駆体がペプチド結合を介して連結された融合蛋白質から、インテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質の切断機能により、目的蛋白質第１前駆体及び目的蛋白質第２前駆体を切り出し、さらにインテインの部分配列蛋白質と該インテインの残余の部分配列蛋白質のアセンブリー機能により、目的蛋白質第１前駆体と目的蛋白質第２前駆体をアセンブルすることを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
- 前記融合蛋白質を宿主内で発現させることを特徴とする請求の範囲第３９項又は第４０項に記載の目的蛋白質の製造方法。
- 前記宿主が、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の融合蛋白質の製造方法。
- 無細胞翻訳系で行うことを特徴とする請求の範囲第３９項又は第４０項に記載の目的蛋白質の製造方法。
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003124355 | 2003-04-28 | ||
| JP2003124354 | 2003-04-28 | ||
| JP2003124354 | 2003-04-28 | ||
| JP2003124355 | 2003-04-28 | ||
| JP2003421443 | 2003-12-18 | ||
| JP2003421443 | 2003-12-18 | ||
| JP2003421442 | 2003-12-18 | ||
| JP2003421442 | 2003-12-18 | ||
| PCT/JP2004/006191 WO2004096860A1 (ja) | 2003-04-28 | 2004-04-28 | 目的蛋白質の製造方法、融合蛋白質及びその遺伝子、インテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2004096860A1 true JPWO2004096860A1 (ja) | 2006-07-13 |
Family
ID=33425418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004569240A Withdrawn JPWO2004096860A1 (ja) | 2003-04-28 | 2004-04-28 | 目的蛋白質の製造方法、融合蛋白質及びその遺伝子、インテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070092937A1 (ja) |
| EP (1) | EP1621556A4 (ja) |
| JP (1) | JPWO2004096860A1 (ja) |
| AU (1) | AU2004234283A1 (ja) |
| CA (1) | CA2523034A1 (ja) |
| WO (1) | WO2004096860A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101215780B1 (ko) | 2004-10-15 | 2012-12-26 | 죠 지바 | 동물의 면역 방법, 면역용 조성물, 항체의 제조 방법,하이브리도마의 제조 방법 및 모노클로날 항체의 제조 방법 |
| CN100334216C (zh) * | 2004-11-16 | 2007-08-29 | 南京大学 | 一种在大肠杆菌中生产可溶性重组蛋白质的方法及其应用 |
| CN1884517B (zh) | 2006-06-08 | 2010-06-30 | 武汉禾元生物科技有限公司 | 利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法及应用 |
| CA2850411C (en) * | 2011-09-28 | 2023-08-15 | Era Biotech, S.A. | Split inteins and uses thereof |
| CN115074340B (zh) * | 2022-06-17 | 2023-02-28 | 广州市乾相生物科技有限公司 | 一种新内含肽及其在合成人源原弹性蛋白上的应用 |
| CN116731126B (zh) * | 2023-01-30 | 2024-02-23 | 态创生物科技(广州)有限公司 | 内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1175879A (ja) * | 1997-07-08 | 1999-03-23 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | プロテインジスルフィドイソメラーゼを含有する融合タンパク質をコードするｄｎａ |
| DE60040524D1 (de) * | 1999-02-12 | 2008-11-27 | New England Biolabs Inc | Intein-vermittelte ligation von exprimierten proteinen |
| GB9913437D0 (en) * | 1999-06-09 | 1999-08-11 | Medical Res Council | Fusion proteins |
| DE60141769D1 (de) * | 2000-12-26 | 2010-05-20 | Sekisui Chemical Co Ltd | Verfahren zur herstellung von rekombinantem protein und fusionsprotein |
-
2004
- 2004-04-28 WO PCT/JP2004/006191 patent/WO2004096860A1/ja active Application Filing
- 2004-04-28 EP EP04730018A patent/EP1621556A4/en not_active Withdrawn
- 2004-04-28 CA CA002523034A patent/CA2523034A1/en not_active Abandoned
- 2004-04-28 US US10/554,751 patent/US20070092937A1/en not_active Abandoned
- 2004-04-28 AU AU2004234283A patent/AU2004234283A1/en not_active Abandoned
- 2004-04-28 JP JP2004569240A patent/JPWO2004096860A1/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1621556A4 (en) | 2006-08-23 |
| AU2004234283A1 (en) | 2004-11-11 |
| EP1621556A1 (en) | 2006-02-01 |
| WO2004096860A1 (ja) | 2004-11-11 |
| US20070092937A1 (en) | 2007-04-26 |
| CA2523034A1 (en) | 2004-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1778729B1 (en) | Soluble fusion proteins comprising heterologous polypeptides | |
| JP7378106B2 (ja) | ゲノム的に再コードした生物におけるセレノ－生物製剤の製造 | |
| US7608424B2 (en) | Process for production of a recombinant protein and a fusion protein | |
| Ma et al. | High efficient expression, purification, and functional characterization of native human epidermal growth factor in Escherichia coli | |
| Quartley et al. | Heterologous expression of L. major proteins in S. cerevisiae: a test of solubility, purity, and gene recoding | |
| EP1619208B1 (en) | Chaperonine-target protein complex, method of producing the same, method of stabilizing target protein, method of immobilizing target protein, method of analyzing the structure of target protein, sustained-release preparation and method of producing antibody against target protein | |
| JPWO2005113768A1 (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
| JP2014512814A (ja) | 大腸菌での異種タンパク質生成のための新規発現および分泌ベクター系 | |
| JPWO2004096860A1 (ja) | 目的蛋白質の製造方法、融合蛋白質及びその遺伝子、インテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体 | |
| JP2842693B2 (ja) | 宿主細胞中でのタンパク質の過剰発現のための方法およびｄｎａ発現システム | |
| US20140154742A1 (en) | Novel expression and secretion vector systems for heterologous protein production in escherichia coli | |
| Jong et al. | Mutagenesis-based characterization and improvement of a novel inclusion body tag | |
| Demonte et al. | Postsynthetic domain assembly with Npu DnaE and Ssp DnaB split inteins | |
| JP2004024095A (ja) | タンパク質の生産方法、融合タンパク質及びタンパク質 | |
| JP2004081199A (ja) | 組換え抗体の製造方法 | |
| JPWO2004031243A1 (ja) | タンパク質ポリマー及びその製造方法 | |
| EP3390627B1 (en) | Method for enzymatically modifying the tri-dimensional structure of a protein | |
| Vijayakumar | Controlled Design and Production of Tunable Modular Protein Nanoparticles | |
| JP2006111572A (ja) | シャペロニン−タンパク質複合体及びその製造方法、並びに目的タンパク質の製造方法 | |
| KR20070035499A (ko) | 폴리펩티드의 제조방법 | |
| Wang | Halifax, Nova Scotia | |
| Wang | Engineering inteins for protein splicing in cis and in trans by rational design and directed evolution. | |
| JP2005046067A (ja) | 蛋白質生産用の新規なバクテリア及び蛋白質の製造方法 | |
| JP2005046066A (ja) | 蛋白質生産用の新規なバクテリア及び蛋白質の製造方法 | |
| JP2005269935A (ja) | 蛋白質の生産方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070202 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20081111 |