ES2316354T3

ES2316354T3 - Derivados polipeptidos de la hormona paratiroidea (pth).

Info

Publication number: ES2316354T3
Application number: ES00910323T
Authority: ES
Inventors: Thomas J. Gardella; Henry M. Kronenberg; John T. Potts; Harald Juppner
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1999-09-29
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2020-02-25
Also published as: EP1222208B1; WO2001023427A1; EP1222208A1; JP2003511014A; DE60040678D1; EP2030986A1; ATE412670T1; JP4723144B2

Abstract

Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste en AlaValAlaGlulleGlnLeuMetHisX 01X 02X 03 LysX04 (SEQ ID NO: 1), en la que: X01 es Ala, Asp o Gln; X 02 es Leu, Arg o homoArg; X03 es Arg o Ala; y X 04 es Phe o Trp.

Description

Derivados polipéptidos de la hormona paratiroidea (PTH).

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos derivados polipeptídicos de la hormona paratiroidea (PTH), ácidos nucleicos que codifican los derivados de la PTH y métodos para preparar y usar los derivados de la PTH.

Descripción de la técnica relacionada Hormona paratiroidea

La hormona paratiroidea (PTH) es un regulador principal de la homeostasis del calcio cuyas células diana principales se encuentran en los huesos y en los riñones. La hormona paratiroidea natural humana es un polipéptido de 84 aminoácidos. Se secreta desde las paratiroides como respuesta a los bajos niveles de calcio en la sangre y actúa en los osteoblastos (las células que construyen el hueso) en el hueso, y en células epiteliales tubulares del riñón. La hormona interacciona con una molécula receptora de la superficie de la célula, llamado receptor PTH-1 o receptor PTH/PTHrP, que se expresa tanto por osteoblastos como por células tubulares renales. La administración de dosis intermitentes de PTH tiene potentes efectos anabólicos en el hueso.

El PTHrP, la causa principal de la hipercalcemia humoral de malignidad, también tiene funciones normales que incluyen funciones en el desarrollo. El PTHrP tiene 141 aminoácidos, aunque también se dan variantes que se originan por mecanismos de empalme de genes alternativos. El PTHrP desempeña un papel fundamental en la formación del esqueleto a través de un proceso que también implica la unión al receptor PTH-1 (Karaplis, A. C., et al., Genes and Dev. 8:277-289 (1994) y Lanske, B., et al., Science 273:663-666 (1996)).

La regulación de la concentración de calcio es necesaria para la función normal de los sistemas gastrointestinal, esquelético, neurológico, neuromuscular y cardiovascular. La síntesis de PTH y la liberación son controladas principalmente por el nivel de calcio en suero; un nivel bajo estimula y un nivel alto suprime tanto la síntesis como la liberación hormonal. La PTH, por su parte, mantiene el nivel de calcio en suero promocionando directamente o indirectamente la entrada de calcio en la sangre en tres sitios de intercambio de calcio: intestino, hueso y riñón. La PTH contribuye a la absorción gastrointestinal neta de calcio favoreciendo la síntesis renal de la forma activa de la vitamina D. La PTH promueve la resorción de calcio desde el hueso indirectamente estimulando la diferenciación de las células que reabsorbentes de hueso, los osteoclastos. También media al menos tres efectos principales en el riñón: la estimulación de la reabsorción de calcio tubular, la potenciación del aclaramiento de fosfato y la promoción de un aumento en la enzima que completa la síntesis de la forma activa de la vitamina D. Se piensa que la PTH ejerce estos efectos principalmente por la activación mediada del receptor de la adenilato ciclasa y/o la fosfolipasa C.

La alteración de la homeostasis de calcio puede producir muchos desórdenes clínicos (p. ej., enfermedad ósea severa, anemia, daño renal, úlceras, miopatía y neuropatía) y por lo general genera condiciones que producen una modificación en el nivel de la hormona paratiroidea. La hipercalcemia es una condición que se caracteriza por una elevación del nivel de calcio en suero. Esto a menudo tiene que ver con un hiperparatiroidismo primario en el cual un exceso de la producción de PTH ocurre a consecuencia de una lesión de la paratiroides (p. ej., adenoma, hiperplasia o carcinoma). Otro tipo de hipercalcemia, la hipercalcemia humoral de la malignidad (HHM) es el síndrome paraneoplásico más común. Parece causar la mayor parte de casos de la producción por tumores (p. ej., carcinomas escamoso, renal, ovárico o de vejiga) de una clase de hormona proteíca que comparte una homología de aminoácidos con PTH. Estas proteínas relacionadas con PTH (PTHrP) parecen imitar ciertas de las acciones renales y esqueléticas de la PTH y se cree que están relacionadas con el receptor de PTH en estos tejidos. Las PTHrP se encuentran normalmente a niveles bajos en muchos tejidos, incluyendo queratinocitos, cerebro, glándula pituitaria, paratiroides, corteza suprarrenal, medula, hígado fetal, células tipo osteoblastos y tejidos mamarios lactantes. En muchas malignidades de HHM, PTHrP se encuentra en el sistema circulatorio a niveles altos, produciendo así niveles de calcio elevados asociados con HHM.

Los perfiles farmacológicos de PTH y PTHrP son casi idénticos en la mayor parte de los sistemas de ensayo in vitro, y los niveles de sangre elevados de PTH (es decir, hiperparatiroidismo primario) o PTHrP (es decir, HHM) tienen efectos comparables sobre la homeostasis del ión mineral (Broadus, A. E. y Stewart, A. F., "Parathyroid hormone-related protein: Structure, processing and physiological actions" en Basic and Clinical Concepts, Bilzikian, J. P. et al., ed., Raven Press, Nueva York (1994), págs. 259-294; Kronenberg, H. M. et al., "Parathyroid hormone: Biosynthesis, secretion, chemistry and action" en Handbook of Experimental Pharmacology, Mundy, G. R. y Martin, T. J., ed., Springer-Verlag, Heidelberg (1993), págs. 185-201). Las semejanzas en las actividades biológicas de los dos ligandos pueden ser explicadas por su interacción con un receptor común, el receptor PTH/PTHrP, que se expresa en abundancia en hueso y riñón (Urena, P. et al., Endocrinology 134:451-456 (1994)).

Receptor de PTH

El receptor PTH-1 es homólogo en la estructura primaria con varios otros receptores que se unen a hormonas peptídicas, tales como secretina (Ishihara, T. et al., EMBO J. 10:1635-1641 (1991)), calcitonina (Lin, H. Y. et al., Science 254:1022-1024 (1991)) y glucagón (Jelinek, L. J. et al., Science 259:1614-1616 (1993)); juntos estos receptores forman una familia distinta llamada la familia B del receptor (Kolakowski, L. F., Receptors and Channels 2:1-7 (1994)). Dentro de esta familia, el receptor PTH-1 es único, porque se une a dos ligandos peptídicos y regula así dos procesos biológicos separados. Un subtipo del receptor de PTH recientemente identificado, llamado el receptor PTH-2, se une a PTH, pero no a PTHrP (Usdin, T., et al., J. Biol. Chem. 270:15455-15458 (1995)). Esta observación implicaba que las diferencias estructurales en los ligandos de PTH y PTHrP determinaban la selectividad para la interacción con el receptor PTH-2. El receptor PTH-2 ha sido descubierto por métodos de ARN en cerebro, páncreas y sistema vascular, sin embargo, no ha sido determinada su función biológica (Usdin, T., et al., J. Biol. Chem. 270:15455-15458 (1995)). Se supone que los receptores de la familia B usan un mecanismo molecular común para engancharse a su propia hormona peptídica cognada (Bergwitz, C., et al., J. Biol. Chem. 271:26469-26472 (1996)).

La unión de PTH (1-34) o de PTHrP (1-36) radiomarcado al receptor PTH-1 está competitivamente inhibida por cualquier ligando no marcado (Jüppner, H. et al., J. Biol. Chem. 263:8557-8560 (1988); Nissenson, R. A. et al., J. Biol. Chem. 263:12866-12871 (1988)). Así, los sitios de reconocimiento para los dos ligandos en el receptor PTH-1 probablemente se superponen. Tanto en PTH como en PTHrP, la región 15-34 contiene los determinantes principales para unirse al receptor PTH-1. Aunque estas regiones muestren una homología de secuencia sólo mínima (sólo 3 identidades de aminoácidos), cada péptido 15-34 puede bloquear la unión de PTH (1-34) o de PTHrP (1-34) al receptor PTH-1 (Nussbaum, S. R. et al., J. Biol. Chem. 255:10183-10187 (1980); Caulfield, M. P. et al., Endocrinology 127:83-87 (1990); Abou-Samra, A.-B. et al., Endocrinology 125:2215-2217 (1989)). Además, la parte amino terminal de cada ligando es requerida por su bioactividad, y ésta probablemente está relacionada con el receptor PTH-1 de modo similar, ya que 8 de 13 de estos residuos son idénticos en PTH y PTHrP.

Tanto PTH como PTHrP se unen al receptor PTH-1 con una afinidad en el rango nM; el receptor ocupado por el ligando transmite una "señal" a través de la membrana celular a las enzimas efectoras intracelulares por un mecanismo que implica a proteínas de unión a GTP (proteínas G) heterotriméricas intermediarias. La enzima efectora intracelular primaria activada por el receptor PTH-1 en respuesta a PTH o PTHrP es la adenilciclasa (AC). Así, la PTH induce un fuerte aumento de moléculas "segundo mensajero", adenosín monofosfato cíclico (cAMP) que continúa para regular los procesos celulares "corriente abajo" mal caracterizados implicados en la remodelación del hueso (procesos de formación de hueso y resorción de hueso). En ciertos sistemas de ensayo basados en células, la PTH puede estimular a enzimas efectoras además de a la AC, incluyendo fosfolipasa C (PLC), que causa la producción de inositol trifosfato (IP3), diacilglicerol (DAG) y calcio intracelular (iCa^{2+}). Las funciones de diversas moléculas que actúan como segundos mensajeros en el metabolismo del hueso son desconocidas actualmente.

Osteoporosis

La osteoporosis es una enfermedad esquelética potencialmente lisante observada en una gran parte de la población adulta mayor, en mujeres embarazadas y hasta en menores. El término osteoporosis se refiere a un grupo heterogéneo de desórdenes. Clínicamente, la osteoporosis se divide en tipo I y tipo II. La osteoporosis del tipo I se da predominantemente en mujeres de mediana edad y tiene que ver con la pérdida de estrógenos en la menopausia, mientras que la osteoporosis del tipo II tiene que ver con el avance de la edad. Los pacientes con osteoporosis se beneficiarían de las nuevas terapias diseñadas para promover la reparación de fracturas, o de terapias diseñadas para prevenir o disminuir las fracturas asociadas con la enfermedad.

La enfermedad se caracteriza por una disminución de la masa ósea, disminución de la densidad mineral ósea (BMD), disminución de la resistencia ósea y un mayor riesgo de fractura de huesos. Actualmente, no hay ninguna cura eficaz para la osteoporosis, aunque se usan estrógenos, calcitonina y los bisfosfonatos, etidronato y alendronato, para tratar la enfermedad con niveles variables de éxito. Estos agentes actúan disminuyendo la reabsorción de hueso. Ya que la hormona paratiroidea regula los niveles de calcio en sangre y de fosfato, y tiene potentes efectos anabólicos (formadores de hueso) en el esqueleto, en animales (Shen, V., et al., Calcif. Tissue Int. 50:214-220 (1992); Whitefild, J. F., et al., Calcif. Tissue Int. 56:227-231 (1995) y Whitfield, J. F., et al., Calcif. Tissue Int. 60:26-29 (1997)) y seres humanos (Slovik, D. M., et al., J. J. Bone Miner. Res. 1:377-381 (1986); Dempster, D. W., et al., Endocr. Rev 14:690-709 (1993) y Dempster, D. W., et al., Endocr. Rev. 15:261 (1994)) cuando se administran intermitentemente, la PTH, o los derivados de PTH, son candidatos principales para nuevas y eficaces terapias para la osteoporosis.

Derivados de PTH

Los derivados de PTH incluyen a polipéptidos que tienen sustituciones de aminoácidos o están truncados con relación a la molécula de longitud completa. Se ha estudiado tanto una forma truncada del extremo amino-terminal de PTH de 14 aminoácidos como de 34, así como una forma truncada del extremo C-terminal. Además, han sido investigadas también sustituciones de aminoácidos dentro de los polipéptidos truncados. Con frecuencia, se dice que hPTH o rPTH son respectivamente de PTH humano o de rata.

Los derivados de PTH truncados tales como PTH (1-34) y PTH (1-31) son activos en la mayor parte de los sistemas de ensayo y promueven la formación de hueso (Whitefild, J. F., et al., Calcif. Tissue Int. 56:227-231 (1995); Whitfield, J. F., et al., Calcif. Tissue Int. 60:26-29 (1997); Slovik, D. M., et al., J. Bone Miner. Res. 1:377-381 (1986); Tregear, G. W., et al., Endocrinology 93:1349-1353 (1973); Rixon, R. H., et al., J. Bone Miner. Res. 9:1179-1189 (1994); Whitfield, J. F. y Morley, P., Trends Pharmacol. Sci. 16:372-386 (1995) y Whitfield, J. F., et al., Calcif. Tissue Int. 58:81-87 (1996)). Pero estos péptidos son todavía demasiado grandes para administrarlos no parenteralmente de forma eficiente y a bajo coste. El descubrimiento de una versión "minimizada" aún más pequeña de PTH o PTHrP sería un avance importante en el esfuerzo para desarrollar nuevos tratamientos para la osteoporosis.

También se han estudiado derivados truncados más pequeños de PTH. Estos incluyen un fragmento de PTH (1-14) (Luck et al., Mol. Endocrinol. 13:670-80 (1999)), un fragmento de PTH (1-13) (Bergwitz C., et al., J. Biol. Chem. 271:4217-4224 (1996)). Un PTH de 27 aminoácidos truncado también ha sido publicado. Potts, J. et al., J. Endocrin. 154 ''S15-S21 (1997). Se discuten otros derivados en las patentes de EE.UU. N^{os}. 5.393.869; 5.723.577; 5.693.616 y la patente europea EP 748817.

Los derivados de PTH y PTHrP que tienen sustituciones o deleciones de aminoácidos en la región 1-14 por lo general muestran una menor actividad (Tregear, G. W., et al., Endocrinology 93:1349-1353 (1973); Goltzman, D., et al., J. Biol. Chem. 250:3199-3203 (1975); Horiuchi, N., et al., Science 220:1053-1055 (1983) y Gardella, T. J., et al., J. Biol. Chem. 266:13141-13146 (1991)). Además, ha habido estudios de sustitución de aminoácidos simples en fragmentos de PTH grandes (Gombert, F. O. et al., "Peptide Chemistry, Structure and Biology" en Proceedings of the 14th American Peptide Symposium, 18-23 de junio de 1996; Cohen, F. E. et al., J. Biol. Chem. 266:1997-2004, 1991; Juppner, H. et al., Peptides 11:1139-1142, 1990).

La patente europea EP0748817 describe análogos de hPTH que tienen una o varias sustituciones en al menos las posiciones 10 y 11. Estos análogos mostraron una potente actividad productora de cAMP y actividad en la formación del hueso.

Varios péptidos de PTH o PTHrP NH_{2}-terminal cortos han sido investigados previamente, pero no fue detectada ninguna actividad. Por ejemplo, bPTH (1-12) era inactivo en ensayos con adenilciclasa realizados en membranas renales de rata (Rosenblatt, M., "Parathyroid Hormone: Chemistry and Structure-Activity Relations", en Pathobiology Anual, Ioachim, H. L., ed., Raven Press, Nueva York (1981), pp. 53-84) y PTHrP (1-16) era inactivo en ensayos de AC realizados en células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan al receptor de PTH-1 de rata clonado (Azurani, A., et al., J. Biol. Chem. 271:14931-14936 (1996)). Se sabe que los residuos en el dominio 15-34 de PTH contribuyen de forma importante a la afinidad de unión del receptor, ya que el fragmento de PTH (15-34) se une débilmente al receptor, pero este péptido no activa a AC (Naussbaum, S. R., et al., J. Biol. Chem. 255:10183-10187 (1980) y Gardella, T. J., et al., Endocrinology 132:2024-2030 (1993)) Neugebauer et al.; Biochemistry 34: 8835-8842 (1995) por la investigación con truncamientos del extremo C-terminal de hPTH sugiere que se requiere una hélice \alpha en los residuos 21-28 para la unión del receptor y la estimulación de la actividad de la adenilato ciclasa.

Se ha publicado previamente (Luck et al., Mol. Endocrin. 13 (1999)) que PTH (1-14) activa a la adenilciclasa en células que expresan los receptores PTH-1, aunque la potencia fuera mucho más débil que la de PTH (1-34) (E_{c}50s=100 \muM y \sim1 nM respectivamente). Además, por análisis de sustitución por exploración de alanina de PTH (1-14), fue mostrado que las posiciones 3 y 10-14 son sitios tolerantes, mientras que las posiciones 2 y 4-9 son sitios comparativamente intolerantes.

Además, se ha publicado una caracterización más de sustituciones en PTH (1-14) (Resumen Nº. 398:1999 American Society of Bone and Mineral Research Meeting, 30 sept.-4 oct.). A fin de caracterizar más los aminoácidos en PTH (1-14), y mejorar potencialmente la actividad, fue introducida una variedad de sustituciones simples tal que fue representado al menos un tipo de aminoácido (p. ej., polar, apolar, catiónico, pequeño, aromático) así como prolina en cada posición.

Así, esta invención satisface una necesidad en la técnica de nuevos derivados de PTH que pueden ser usados para tratar a pacientes en necesidad de tratamiento de defectos o enfermedades relacionadas con los huesos o cualquier condición en la cual esté implicada la hormona paratiroidea. Como tal, la invención se refiere a nuevos derivados truncados de PTH, incluyendo PTH (1-14), PTH (1-20), PTH (1-22), PTH (1-24), PTH (1-26), PTH (1-28), PTH (1-30), PTH (1-32) y PTH (1-34), métodos para preparar y usar los derivados así como métodos para usar los derivados para tratar a pacientes con diversos defectos o enfermedades relacionadas con los huesos.

Resumen de la invención

La invención se refiere, inter alia, a nuevos derivados polipeptídicos de PTH que contienen sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas en los polipéptidos. Los derivados pueden funcionar como agonistas completos, o casi completos, del receptor PTH-1. A causa de sus propiedades únicas, estos polipéptidos tienen utilidad como medicinas para tratar enfermedades humanas del esqueleto, tales como la osteoporosis.

La invención se refiere a derivados de los polipéptidos PTH (1-14), PTH (1-20), PTH (1-22), PTH (1-24), PTH (1-26), PTH (1-28), PTH (1-30), PTH (1-32) y PTH (1-34) y los ácidos nucleicos que codifican a estos polipéptidos. Los fragmentos de los polipéptidos son también parte de la invención. La invención se refiere además a composiciones y métodos para uso en la limitación de la pérdida de hueso indeseada en un vertebrado en peligro de tal pérdida de hueso, en el tratamiento de condiciones que están caracterizadas por una pérdida de hueso indeseada o por la necesidad del crecimiento de los huesos, p. ej. en el tratamiento de fracturas o desórdenes del cartílago y para generar niveles de cAMP en células que se juzga que son necesarias.

La invención se refiere en primer lugar a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste en AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisX_{01}X_{02}X_{03}LysX_{04} (SEQ ID NO:1), en la que: X_{01} es Ala, Asp o Gln, X_{02} es Leu, Arg u homoArg; X_{03} es Arg o Ala; y X_{04} es Phe o Trp. En una realización específica, esta invención proporciona un polipéptido al menos 90% idéntico al polipéptido de SEQ ID NO:1.

La invención se refiere además a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisX_{01}ArgAlaLysX_{02} (SEQ ID NO:2), en la que; X_{01} es Ala, Asp o Gln; y X_{02} es Trp o His. En una realización específica, esta invención proporciona un polipéptido al menos 85% idéntico a este péptido. Más preferiblemente el polipéptido es un 90% idéntico.

En una realización, la invención se refiere expresamente a un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos siguientes:

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHis: (SEQ ID NO:3)

AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnArgGlyLysHis: (SEQ ID NO:4)

AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnArgAlaLysHis: (SEQ ID NO:5)

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAsnArgAlaLysHis: (SEQ ID NO:6),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysTrp: (SEQ ID NO:7) y

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisGlnArgAlaLysHis: (SEQ ID NO:8).

\vskip1.000000\baselineskip

La invención se refiere además a derivados de PTH específicos más cortos que tienen las secuencias de aminoácidos siguientes:

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLys: (SEQ ID NO:9),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAla: (SEQ ID NO:10),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArg: (SEQ ID NO:11), y

AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHis: (SEQ ID NO:13).

\vskip1.000000\baselineskip

La invención también se refiere a las secuencias

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisX_{01}X_{02}X_{03}LysX_{04}LeuAsnSerMetGluArgValGlu TrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspX05 \hskip0,3cm (SEQ ID NO:16) o

SerValAlaGluIleGlnLeuMetHisX_{01}X_{02}X_{03}LysX_{04}LeuAlaSerValGluMetGlnGlu TrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspX05 \hskip0,3cm (SEQ ID NO:21)

en la que X_{01} es Ala o Asp; X_{02} es Leu o Arg; X_{03} es Arg o Ala; X_{04} es Phe o Trp y X_{05} es Phe o Tyr. Una realización específica de la invención se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHisLeuAsnSer MetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr \hskip0,3cm (SEQ ID NO:12).

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHisLeuAlaSer ValGluArgMetGlnTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr \hskip0,3cm (SEQ ID NO:20),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHisLeu AsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr \hskip0,3cm (SEQ ID NO:22),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHis LeuAlaSerValArgArgMetGlnTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr \hskip0,3cm (SEQ ID NO:23) y

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHisLeuAsnSerMet ArgArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr \hskip0,3cm (SEQ ID NO:24).

La invención proporciona además tanto un polipéptido biológicamente activo sintético como recombinante de la invención. Las realizaciones preferibles de la invención contienen los aminoácidos 1-9, 1-10, 1-11, 1-12 y 1-13 de SEQ ID NO. 1. La invención también se refiere a sales farmacéuticas y derivados del extremo N- o C-terminal de los polipéptidos descritos más arriba.

Una realización preferible de la invención se refiere a cualquiera de los susodichos polipéptidos mencionados, en la que dicho polipéptido contiene una amida C-terminal. Los ejemplos de derivados del polipéptido PTH con una amida C-terminal incluyen, pero no están limitados a:

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHis-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:3),

AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnArgGlyLysHis-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:4),

AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnArgAlaLysHis-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:5),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAsnArgAlaLysHis-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:6),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysTrp-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:7) y

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisGlnArgAlaLysHis-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:8),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLys-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:9),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAla-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:10),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArg-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:11),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGlu TrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:12),

AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHis-amida \hskip0,3cm(SEQ ID NO:13),

AlaValAlaGlulleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysFisLeuAlaSerValGluArgMetGln TrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr-amida \hskip0,3cm(SEQ ID NO:20),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHisLeuAsnSerMetGluArgvalGlu TrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr-amida \hskip0,3cm(SEQ ID NO:22)

AlaValAlaGlulleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHisLeuAlaSerValArgArgMetGln TrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr-amida \hskip0,3cm(SEQ ID NO:23) y

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHisLeuAsnSerMetArgArgVal GluTrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr-amida \hskip0,3cm (SEQ ID NO:24).

La invención se refiere además a cualquiera de los mencionados polipéptidos marcados con un marcador seleccionado del grupo que consiste en: un radiomarcador, un marcador flourescente, un marcador bioluminiscente o un marcador quimioluminiscente. En una realización preferible el radiomarcador es ^{99m}Tc.

De acuerdo con un aspecto adicional más de la invención, esta invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado de PTH y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o una solución farmacéuticamente aceptable tal como una solución salina o una solución fisiológicamente tamponada.

La invención proporciona además una molécula de ADN recombinante o aislada que codifica cualquiera de los derivados polipeptídicos de la invención. Una realización preferible de la invención proporciona una molécula de ADN recombinante o aislada que comprende: (1) una región de control de la expresión, dicha región operativamente unida con (2) una secuencia de polinucleótidos que codifica un derivado de PTH. Las realizaciones preferibles de la invención incluyen un polinucleótido que codifica un derivado de PTH seleccionado del grupo que consiste en: AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisX_{01}X_{02}X_{03}LysX_{04} \hskip0,3cm (SEQ ID NO:1) en el que: X_{01} es Ala, Asp o Gln; X_{02} es Leu o Arg; X_{03} es Arg o Ala; y X_{04} es Phe o Trp; AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisX_{01}ArgAlaLysX_{02} \hskip0,3cm (SEQ ID NO:2), en el que: X_{01} es Ala, Asp o Gln; y X_{02} es Trp o His.

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHis \hskip0,3cm (SEQ ID NO:3),

AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnArgGlyLysHis \hskip0,3cm (SEQ ID NO:4),

AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnArgAlaLysHis \hskip0,3cm (SEQ ID NO:5),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAsnArgAlaLysHis \hskip0,3cm (SEQ ID NO:6),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysTrp \hskip0,3cm (SEQ ID NO:7), y

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisGlnArgAlaLysHis \hskip0,3cm (SEQ ID NO:8).

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLys \hskip0,3cm (SEQ ID NO:9),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAla \hskip0,3cm (SEQ ID NO:10),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArg \hskip0,3cm (SEQ ID NO:11),

AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGlu TrpLeuArgLysLysLeuGlnAspVal
HisAspTyr (o Phe) \hskip0,3cm (SEQ ID NO:12) y

AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAlaArgAlaLysHis \hskip0,3cm (SEQ ID NO:13). Las realizaciones preferibles también incluyen regiones de control que son promotores bacterianos, virales, fúngicos o mamíferos.

La invención se refiere además a métodos para preparar los polipéptidos de la invención. La realización preferible incluye la preparación de los polipéptidos usando síntesis en fase líquida o sólida o técnicas de ADN recombinante.

Una realización preferible de la invención se refiere a métodos para preparar vectores recombinantes que comprenden el ADN que codifica los polipéptidos de la invención. Las realizaciones preferibles incluyen además la fabricación y la preparación de los polipéptidos introduciendo moléculas de ADN recombinante de la invención en una célula huésped y expresando el polipéptido codificado por dichas moléculas. El huésped puede ser procariótico o eucariótico. Las realizaciones preferibles incluyen una célula huésped que es bacteriana o mamífera.

De acuerdo con un aspecto adicional más de la invención, esta invención proporciona el uso de un polipéptido de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar condiciones mamíferas caracterizadas por disminuciones en la masa ósea.

Una realización preferible de la invención se refiere a condiciones tales como la osteoporosis. Los tipos de osteoporosis incluyen, pero no están limitados a la osteoporosis en la vejez y la osteoporosis postmenopáusica. Realizaciones preferibles adicionales incluyen la utilización de unas cantidades eficaces del polipéptido de aproximadamente 0,01 \mug/kg/día a aproximadamente 1,0 \mug/kg/día en el que el polipéptido puede ser administrado parenteralmente, subcutáneamente o por insuflación nasal.

La invención se refiere además al uso de ADN que codifica un polipéptido de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades de la masa ósea.

De acuerdo con un aspecto adicional más de la invención, esta invención también proporciona un método para determinar tasas de reformación de hueso, resorción de hueso y/o remodelación de hueso que comprende determinar la absorción de dicho polipéptido de la invención en los huesos de dicho paciente.

El péptido puede ser marcado con un marcador seleccionado del grupo que consiste en: radiomarcador, marcador flourescente, marcador bioluminiscente o marcador quimioluminiscente. Un ejemplo de un radiomarcador conveniente es ^{99m}Tc.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a sustituciones de aminoácidos en las posiciones 1-14 en el polipéptido que produce un derivado de PTH para antagonizar o agonizar el receptor PTH-1/PTH-2.

La invención se refiere además a un método para aumentar el cAMP en una célula mamífera que tiene receptores PTH-1, comprendiendo dicho método poner en contacto la célula con una cantidad suficiente del polipéptido de la invención para aumentar el cAMP.

Breve descripción de las figuras Figura 1 Efectos de mutaciones simples en PTH (1-14)

Cada gráfico muestra los efectos en la señalización de cAMP en células HKRK-B7 de sustituciones de aminoácido simples en la posición en rPTH natural (1-14) indicado más arriba en el gráfico. Las células HKRK-B7 son un derivado clónico de la línea de células de riñón porcino, LLC-PK1, que es establemente transfectada con el receptor PTH-1 humano. Cada péptido fue probado a una dosis de 100 \muM. Todos los péptidos mostrados fueron probados por duplicado y simultáneamente; y el experimento fue repetido dos veces. Los datos son promedios combinados (\pm) S.E.M. de los dos experimentos. Para las secuencias de polipéptidos referidos en las Figuras 2-7, véanse, por ejemplo, las Tablas 2, 3 ó 4.

Figura 2A-2C Análisis de dosis-respuesta de análogos de PTH sustituido (1-14)

Los análogos de PTH (1-14) con sustituciones dobles (Figura 2A), triples (Figura 2B) o cuádruples y quíntuples (Figura 2C) fueron probados a dosis variables por su actividad estimuladora de cAMP en células HKRK-B7. Como controles, también fueron probados rPTH natural (1-14), rPTH (1-34) y [Nleu^{8,21}Tyr^{34}rPTH (1-34)amida. Los símbolos corresponden a los péptidos indicados en la leyenda. Cada gráfica muestra los datos combinados de tres experimentos separados (promedio \pmS.E.M.), cada uno realizado por duplicado.

Figura 3 Análisis de dosis-respuesta de análogos de PTH sustituidos en células HKRK-B7

Los análogos de PTH indicados en la leyenda fueron probados a dosis variables según la actividad estimuladora de cAMP en células HKRK-B7. Cada curva muestra los datos combinados de tres o más experimentos separados (promedio \pmS.E.M.), cada uno realizado por duplicado.

Figura 4 Unión de los análogos de PTH en HK-B7

El péptido de control parenteral, hPTH (1-34), y el análogo de PTH (1-34) (péptido Nº. 7), fueron probados a dosis variables según su capacidad de inhibir la unión de ^{125}I-rPTH (1-34) (100.000 CPM/pocillo) a células HKRK-B7. Los datos son el promedio \pmS.E.M. de valores duplicados de un experimento solo.

Figura 5 Análisis de dosis-respuesta de análogos de PTH sustituidos en células que expresan el receptor de PTH-2

Los análogos de PTH indicados en la leyenda fueron probados a dosis variables según su capacidad de estimular la formación de cAMP en células LLC-PK1 establemente transfectadas con el receptor de PTH-2. Los datos son el promedio \pmS.E.M. de valores duplicados de un experimento solo.

Figura 6A-6B Análisis de dosis-respuesta de análogos de PTH sustituidos en células COS-7

Las células COS-7 fueron transfectadas pasajeramente con el receptor PTH-1 humano intacto (HK-WT) (Figura 6A) o un receptor PTH-1 truncado que carece de la mayor parte del dominio amino-terminal (h\DeltaNt o hDeINt) (Figura 6B) y se probaron por su capacidad de mediar la producción de cAMP cuando se trata con dosis variables de los análogos de PTH indicados en la leyenda. Cada gráfica muestra los datos que fueron combinados a partir de tres experimentos separados (promedio \pmS.E.M.), cada uno realizado por duplicado.

Figura 7A-7B Análisis de dosis-respuesta de análogos de PTH sustituidos en células de osteoblastos

Fueron tratadas líneas de células osteoblásticas ROS 17/2.8 (Figura 7A) y SAOS-2 (Figura 7B), que expresan endógenamente a los receptores PTH-1 de rata y humano, respectivamente, con los análogos de PTH indicados en la leyenda, y fueron cuantificados los niveles que resultan de cAMP. Cada curva en el panel A muestra las respuestas de cAMP combinadas (promedio \pmS.E.M.) observadas para cada péptido en dos experimentos separados, cada uno realizado por duplicado. Las curvas en el panel B son de un experimento solo, realizado por duplicado.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones

A fin de proporcionar un entendimiento más claro de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se proporcionan las definiciones siguientes.

Secuencias de aminoácidos - Las secuencias de aminoácidos en esta aplicación usan tanto designaciones de una letra sola como de tres letras para los aminoácidos. Estas designaciones son conocidas por los expertos en la técnica y pueden ser encontradas en numerosas referencias muy disponibles, tales como por ejemplo en Cooper, G. M, The Cell 1997, ed. ASM, Washington, D.C. o Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994. Cuando hay sustituciones en una secuencia se puede hacer referencia, por ejemplo, como Ser-3-> Ala, esto significa que la serina en la tercera posición del extremo N-terminal del polipéptido puede ser sustituida por otro aminoácido. Por alanina, en este caso.

Actividad biológica de la proteína: Esta expresión se refiere a cualquier actividad biológica del polipéptido. Los ejemplos de estas actividades incluyen, pero no están limitados a la función metabólica o fisiológica de los compuestos de SEQ ID NO:1 o sus derivados incluyendo actividades similares o actividades mejoradas o aquellas actividades con menores efectos secundarios indeseables. También se incluyen actividades antigénicas e inmunogénicas de dichos compuestos tales como, por ejemplo, SEQ ID NO:1 o sus derivados.

Vector de clonación: Un plásmido o ADN de fago u otra secuencia de ADN que sea capaz de replicarse autónomamente en una célula huésped, y que está caracterizada por uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción en las cuales tales secuencias de ADN pueden ser cortadas de una manera determinable, y en la que un fragmento de ADN puede ser empalmado a fin de causar su replicación y clonación. El vector de clonación puede contener además un marcador adecuado para su uso en la identificación de células transformadas con el vector
de clonación. Los marcadores, por ejemplo, proporcionan resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina.

Constructo de ADN. Como se usa en este documento, un "constructo de ADN" debe ser entendido que se refiere a un ADN recombinante, artificial, lineal o circular.

Derivado o derivado funcional: El término "derivado" o "derivado funcional" se requiere que incluya las "variantes", los "derivados", o los "derivados químicos" de la molécula PTH. Una "variante" de una molécula tal como, por ejemplo, un compuesto de SEQ ID NO:1 o su derivado se supone que se refiere a una molécula sustancialmente similar a la molécula entera, o a su fragmento. Un "análogo" de una molécula tal como, por ejemplo, un compuesto de SEQ ID NO:1 o su derivado se supone que se refiere a una molécula artificial sustancialmente similar a las moléculas de SEQ ID NO:1 o sus fragmentos.

Los derivados de PTH contienen cambios en el polipéptido con relación al polipéptido PTH natural del mismo tamaño. La secuencia del polipéptido PTH (1-14) natural es la de SEQ. ID NO:14 (humano) o 17 (rata). Se dice que una molécula es "sustancialmente similar" a otra molécula si la secuencia de aminoácidos en ambas moléculas es sustancialmente la misma, y si ambas moléculas poseen una actividad biológica similar. Así, dos moléculas que posean una actividad similar, pueden ser consideradas variantes, derivados, o análogos cuando aquel término se usa en este caso incluso si una de las moléculas contiene residuos de aminoácidos adicionales no encontrados en la otra, o si la secuencia de residuos de aminoácidos no es idéntica. Los derivados de PTH, sin embargo, no tienen que tener sustancialmente una actividad biológica similar a la molécula natural. En algunos casos los derivados de PTH pueden tener una actividad sustancialmente diferente que la PTH natural. Por ejemplo, un derivado puede ser un antagonista o un agonista del receptor de PTH.

Como se usa en este documento, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando ésta contiene restos químicos adicionales, no normalmente una parte de la molécula. Tales restos pueden mejorar la solubilidad de la molécula, la absorción, el período de semivida biológica, etc. Los restos pueden disminuir alternativamente la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Ejemplos de restos capaces de mediar tales efectos se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) y serán evidentes para los expertos ordinarios en la técnica.

Vector de expresión. Como se usa en este documento, un "vector de expresión" es un constructo de ADN que contiene un gen estructural operativamente unido a una secuencia control de la expresión de modo que el gen estructural pueda ser expresado cuando el vector de expresión es transformado en una célula huésped apropiada. Se dice que dos secuencias de ADN están "operativamente unidas" si la actividad biológica de una región afectará a la otra región y también si la naturaleza del encadenamiento entre las dos secuencias de ADN (1) no causa la introducción de una mutación de cambio de marco, (2) no interfiere en la capacidad de la secuencia de la región promotora de dirigir la trascripción de la secuencia deseada, o (3) no interfiere en la capacidad de la secuencia deseada de ser transcrita por la secuencia de la región promotora. Así, una región promotora estaría operativamente unida a una secuencia de ADN deseada si el promotor fuera capaz de efectuar la trascripción de aquella secuencia de ADN deseada.

Fragmento: Un " fragmento" de una molécula tal como, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o su derivado se supone que se refiere a cualquier subconjunto de polipéptidos de estas moléculas.

Proteína de fusión: Por el término "proteína de fusión" se entiende una proteína fusionada que comprende compuestos tales como, por ejemplo, SEQ ID NO:1 o sus derivados, con o sin "un punto de corte selectivo" unido en su extremo N-terminal, que está a su vez unido a una secuencia de polipéptido líder de aminoácido adicional.

Terapia génica. Como se usa en este documento, "terapia génica" significa, inter alia, la capacidad de mejorar, eliminar o atenuar un defecto o una enfermedad cambiando un gen de interés o el producto expresado por el gen de interés, cambiando el genotipo de la célula u organismo de interés o cambiando el modelo normal de expresión de los genes de un organismo. Por ejemplo, esto puede ser llevado a cabo sustituyendo el gen de interés por un gen mutado, desactivando el gen de interés o insertando un gen diferente que produzca un producto que inhiba o estimule al gen de interés o usando otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Generalmente, se introduce un polinucleótido recombinante en células o tejidos de un organismo para efectuar un cambio en la expresión del gen. La manipulación del material genético puede ser llevada a cabo in vivo o ex vivo. No se debe entender que los mencionados ejemplos limiten los diferentes modos en los cuales puede ser efectuada la terapia génica. Cualquier técnica conocida para los expertos en la técnica de la terapia génica puede ser usada con la invención reivindicada.

Animal huésped: La expresión animales transgénicos se refiere a aquellos animales cuyas células germinales y somáticas contienen un constructo de ADN de la invención. Tales animales transgénicos son, en general, vertebrados. Los animales huésped preferidos son mamíferos tales como primates no humanos, ratones, ovejas, cerdos, ganado, cabras, conejillos de indias, roedores, p.ej. ratas, y otros similares. La expresión "animal huésped" también incluye a animales en todas las etapas del desarrollo, incluyendo etapas embrionarias y fetales.

% de identidad: Si alguno de los dos polipéptidos o polinucleótidos son, por ejemplo, al menos un 90% "idéntico" pueden ser determinados usando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa "FAST A", usando, por ejemplo, los parámetros por defecto como en Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988). O bien puede ser usada para determinar la identidad la función BLAST de la base de datos del Centro Nacional para la Información en Biotecnología.

Los términos homología e identidad a menudo son usados de modo intercambiable. En este aspecto, puede ser determinado el tanto por ciento de homología o identidad por métodos conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, comparando la información de secuencia usando el programa informático GAP, versión 6.0, disponible de la Universidad de Grupo Informático de Genética de Wisconsin (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443 (1970), como se revisa por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981). Brevemente, el programa GAP define semejanzas como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias.

En general, las secuencias son alineadas de modo que sea obtenida la coincidencia de orden más alto. La "identidad" en sí tiene un sentido reconocido en la técnica y puede ser calculada usando técnicas publicadas. (Véase, p.ej: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., ediciones de la Universidad de Oxford, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Aunque existen varios métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es conocido por los expertos en la técnica (Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)). Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad o semejanza entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, aquellos descritos en la Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988). Los métodos para determinar la identidad y semejanza son codificados en programas informáticos. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y semejanza entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, el paquete informático de GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(i):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403
(1990)).

Por lo tanto, como se usa en este documento, el término "identidad" representa una comparación entre un polipéptido de ensayo o de referencia o polinucleótido. Más expresamente, un polipéptido de ensayo puede ser definido como cualquier polipéptido que sea 90% o más idéntico a un polipéptido de referencia. Como se usa en este documento, el término al menos un "90% idéntico" se refiere a porcentages de identidad de 90 a 99,99 con relación a los polipéptidos de referencia. La identidad a un nivel del 90% o más es indicativa del hecho de que, asumiendo que es para fines ilustrativos, una longitud de polinucleótido de ensayo y referencia de 100 aminoácidos, que no más que 10% de aminoácidos (es decir, 10 de 100) en los polipéptidos de ensayo se diferencian del de los polipéptidos de referencia. Tales diferencias pueden ser representadas como mutaciones de punto distribuidas al azar sobre la longitud entera de la secuencia de aminoácidos de la invención o pueden ser agrupadas en una o varias posiciones de la longitud variante hasta un máximo aceptable, p. ej. una diferencia de aminoácido de 1/14 (identidad de aproximadamente el 90%). Las diferencias son definidas como sustituciones o deleciones de aminoácidos.

Un ejemplo de la determinación de la identidad relativa entre polipéptidos diferentes se muestra en la Tabla 1.

TABLA 1

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1

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Aislado: Un término que significa modificado respecto a su estado natural. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presentes naturalmente en un animal vivo no están "aislados", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado a partir de los materiales que coexisten de su estado natural está "aislado", cuando el término es empleado en este documento. Así, un polipéptido o polinucleótido producido y/o contenido dentro de una célula huésped recombinante es considerado aislado para los fines de la presente invención. También se entiende como un "polipéptido aislado" o "polinucleótido aislado" los polipéptidos o polinucleótidos que han sido purificados, parcialmente o sustancialmente, a partir de una célula huésped recombinante o a partir de una fuente natural. Por ejemplo, una versión recombinantemente producida de compuestos de, por ejemplo, SEQ ID NO:1 y sus derivados puede ser sustancialmente purificada por el método de una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Los términos aislados y purificados son a veces usados de modo intercambiable.

Por "aislado" se entiende que el ADN está sin las secuencias de codificación de aquellos genes que, en el genoma natural del organismo (si existe alguno) a partir del cual el ADN de la invención se deriva, inmediatamente flanquean al gen que codifica el ADN de la invención. El ADN aislado puede ser de monocatenario o bicatenario, y puede ser ADN genómico, cADN, ADN híbrido recombinante o ADN sintético. Puede ser idéntico a una secuencia de ADN natural que codifica compuestos de, por ejemplo, SEQ ID NO:1 y sus derivados, o puede diferenciarse de tal secuencia por la deleción, adición o sustitución de uno o varios nucleótidos. Los ADN monocatenarios de la invención tienen generalmente al menos 8 nucleótidos, (preferiblemente al menos 18 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 30 nucleótidos) variando hasta la longitud completa de la molécula de ADN que codifica los compuestos de SEQ ID NO:1 y sus derivados (es decir, 42 nucleótidos); preferiblemente son marcados detectablemente para uso como sondas de hibridación, y pueden ser antisentido.

Aislado o purificado cuando se refiere a preparaciones hechas a partir de células biológicas o huéspedes debe ser entendido que significa cualquier extracto de células que contiene el ADN indicado o la proteína incluyendo un extracto a granel del ADN o la proteína del interés. Por ejemplo, en caso de una proteína, una preparación purificada puede ser obtenida siguiendo una técnica individual o una serie de técnicas preparatorias o bioquímicas y el ADN o la proteína de interés puede estar presente en varios grados de pureza en estas preparaciones. Los procedimientos pueden incluir por ejemplo, pero no están limitados a, fraccionamiento con sulfato de amonio, filtración de gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, centrifugación por gradiente de densidades y electroforesis.

Debe entenderse que una preparación de ADN o proteína que es "pura" o está "aislada" significa una preparación libre de materiales naturales con los cuales tal ADN o proteína normalmente están asociadas en la naturaleza. "Esencialmente puro" debe ser entendido para que signifique una preparación "muy" purificada que contiene al menos el 95% del ADN o de la proteína de interés.

Debe entenderse que un extracto de células que contiene el ADN o la proteína de interés significa una preparación de homogeneado o preparación sin células obtenida a partir de células que expresan la proteína o contienen el ADN de interés. La expresión "extracto de células" se entiende que incluye medios de cultivo, medios de cultivo especialmente agotados de los cuales las células han sido quitadas.

Secuencia líder: Por la expresión "secuencia líder" se entiende una secuencia de polinucleótidos unida a compuestos de, por ejemplo, SEQ ID NO:1, y expresada en células huésped como una proteína de fusión fusionada al punto de corte selectivo y compuestos de SEQ ID NO:1. La expresión "polipéptido líder" describe la forma expresada de la "secuencia líder" como se obtiene en la proteína de fusión.

La proteína de fusión, que a menudo es insoluble y se encuentra en cuerpos de inclusión cuando se sobreexpresa, se purifica a partir de otra proteína bacteriana por métodos conocidos en la técnica. En una realización preferida, la proteína de fusión insoluble se centrifuga y se lava después de la lisis celular, y se resolubiliza con guanidina-HCl. Puede permanecer soluble después de la eliminación del desnaturante por diálisis. (Para la purificación de proteínas refráctiles, véase Jones, patente de EE.UU. Nº. 4.512.922; Olson, patente de EE.UU. Nº. 4.518.526; y Builder et al., patentes de EE.UU. N^{os}. 4.511.502 y 4.620.948).

Los compuestos recombinantemente producidos de, por ejemplo, SEQ ID NO:1 o sus derivados pueden ser purificados para que estén sustancialmente sin contaminantes naturales de la proteína de fusión solubilizada por el uso de cualquiera de una variedad de metodologías. Como se usa en este documento, se dice que un compuesto está "sustancialmente sin contaminantes naturales" si ha sido sustancialmente purificado a partir de materiales con los cuales se encuentra después de la expresión en células huésped bacterianas o eucarióticas. Los compuestos de SEQ ID NO:1 o sus derivados pueden ser purificados por la aplicación de la tecnología estándar de separación cromatográfica.

O bien, el péptido puede ser purificado usando cromatografía de inmuno-afinidad (Rotman, A. et al., Biochim. Biophys. Acta 641:114-121 (1981); Sairam, M. R. J. Chromatog. 215:143-152 (1981); Nielsen, L. S. et al., Biochemistry 21:6410-6415 (1982); Vockley, J. et al., Biochem. J. 217:535-542 (1984); Paucha, E. et al., J. Virol. 51:670-681 (1984); y Chong, P. et al., J. Virol. Meth. 10:261-268 (1985)).

Después de la purificación parcial o sustancial, la proteína de fusión es tratada enzimáticamente con la enzima correspondiente al punto de corte. O bien, la proteína de fusión en su estado más impuro, hasta en la forma refráctil, puede ser tratada con la enzima. De ser necesario, los compuestos maduros resultantes de, por ejemplo, SEQ ID NO:1 o sus derivados, pueden ser purificados después. Las condiciones para el tratamiento enzimático son conocidas por los expertos en la técnica.

Operativamente unidas: Se dice que dos secuencias de ADN (tal como una secuencia de la región promotora y una secuencia que codifica un derivado de PTH) están operativamente unidas si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN (1) no causa la inserción de una mutación de cambio de marco, (2) no interfiere con la capacidad de la secuencia de la región promotora de dirigir la trascripción de la secuencia deseada, o (3) no interfiere con la capacidad de la secuencia deseada que se transcribe por la secuencia de la región promotora. Así, una región promotora estaría operativamente unida a una secuencia de ADN deseada si el promotor fuera capaz de efectuar la trascripción de aquella secuencia de ADN.

Polinucleótido: Este término se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin limitación, ADN mono- y bi-catenario, ADN que es una mezcla de regiones mono- y bi-catenarias, ARN mono- y bi-catenario y ARN que es una mezcla de regiones mono- y bi-catenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o una mezcla de regiones mono- y bi-catenarias. Además, el "polinucleótido" se refiere a regiones tri-catenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término "polinucleótido" también incluye los ADN o ARN que contienen una o varias bases modificadas y los ADN o ARN con estructuras modificadas por estabilidad o por otros motivos''. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se ha hecho una variedad de modificaciones a ADN y ARN; así, "polinucleótido" abarca formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de polinucleótidos como se encuentran típicamente en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y de ARN características de virus y cé-
lulas. "Polinucleótido" también abarca polinucleótidos relativamente cortos, a menudo denominados oligonucleótidos.

Polipéptido: Polipéptido y péptido son usados de modo intercambiable. El término polipéptido se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por uniones peptídicas u uniones peptídicas modificadas, es decir, isoésteres peptídicos. "Polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente denominadas péptidos, oligopéptidos u oligómeros, y a cadenas más largas, generalmente denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden contener otros aminoácidos a parte de los 20 aminoácidos codificados por genes e incluir secuencias de aminoácidos modificadas por procesos naturales, tales como el procesamiento post-translacional, o por técnicas de modificación química que son conocidas en la técnica. Tales modificaciones se encuentran descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la bibliografía de investigación. Pueden darse modificaciones en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la estructura del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremo amino- o carboxilo-terminal. Se entiende que el mismo tipo de modificación puede estar presente en los mismos o diferentes grados en varios sitios en un polipéptido dado. También, cualquier polipéptido puede contener muchos tipos de modificaciones.

Los polipéptidos pueden ser ramificados y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Se pueden obtener polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados a partir de modificaciones post-translacionales o pueden prepararse por métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, enlace covalente de flavina, enlace covalente de una mitad hemo, enlace covalente de un nucleótido o derivado nucleótido, enlace covalente de un lípido o derivado lipídico, enlace covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición medida por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación. Véase, por ejemplo, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2ª ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman y compañía, Nueva York, 1993 y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, págs. 1-12 en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, ed., Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Methods in Enzymol. 182:626-646 (1990) y Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992).

Promotor: Una secuencia de ADN generalmente descrita como la región 5' de un gen, proximal localizado en el codón de inicio. La trascripción de un(varios) gen(es) adyacente(s) es iniciada en la región promotora. Si un promotor es un promotor inducible, entonces la tasa de trascripción aumenta como respuesta a un agente de inducción. En contraste, la tasa de trascripción no está regulada por un agente de inducción si el promotor es un promotor constitutivo. Los ejemplos de promotores incluyen al promotor CMV (InVitrogen, San Diego, California.), los promotores SV40, MMTV y hMTIIa (patente de EE.UU. Nº. 5.457.034), el promotor HSV-1 4/5 (patente de EE.UU. Nº. 5.501.979), y el promotor HCMV intermedio temprano (documento internacional WO92/17581). También, pueden ser empleados elementos potenciadores específicos de tejido. Además, tales promotores pueden incluir promotores específicos de tejido y célula de un organismo.

Huésped recombinante: Según la invención, un huésped recombinante puede ser cualquier célula huésped procariótica o eucariótica que contenga los genes clonados deseados en un vector de expresión o vector de clonación. También se entiende que este término incluye aquellas células procarióticas o eucarióticas que han sido genéticamente modificadas que contienen el(los) gen(es) deseado(s) en el cromosoma o el genoma de aquel organismo. Como ejemplo de tales huéspedes, véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). Los huéspedes recombinantes preferidos son células eucarióticas transformadas con el constructo de ADN de la invención. Más expresamente, las células de mamíferos son las preferidas.

Sitio de punto de corte selectivo: La expresión "punto de corte selectivo" se refiere a un residuo de aminoácido o residuos que pueden ser selectivamente cortados con productos químicos o con enzimas de una manera previsible. Un punto de corte de enzima selectivo es una secuencia de aminoácidos o péptidos que es reconocido e hidrolizado por una enzima proteolítica. Los ejemplos de tales sitios incluyen, sin limitación, sitios de corte de tripsina o quimiotripsina.

Hibridación rigurosa. Como se usa en este documento debe entenderse que las condiciones de "hibridación rigurosa" son aquellas condiciones normalmente usadas por cualquier experto en la técnica para establecer al menos una homología del 95% entre trozos complementarios de ADN o ADN y ARN.

Hay sólo tres requerimientos para una hibridación a una cadena desnaturalizada del ADN que se da. (1) Debe haber cadenas sencillas complementarias en la muestra. (2) La fuerza iónica de la solución del ADN monocatenario debe ser lo bastante alta para que las bases puedan acercarse entre sí; operativamente, esto significa más de 0,2 M. (3) La concentración de ADN debe ser lo bastante alta para que se den colisiones intermoleculares a una frecuencia razonable. La tercera condición sólo afecta a la velocidad, no cuando se da renaturalización/hibridación.

Las condiciones rutinariamente usadas por los expertos en la técnica están disponibles en textos de procedimiento fácilmente obtenibles, p. ej., Ausubel. F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1, Capítulo 2.10, John Wiley & Sons, Ed. (1994) o Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989), cuyos documentos enteros son incorporados en este documento como referencia. Como sería entendido por cualquier experto en la técnica, la última severidad de hibridación refleja tanto las condiciones de hibridación actuales como las condiciones de lavado después de la hibridación, como cualquier experto en la técnica conocería la manera apropiada para cambiar estas condiciones para obtener un resultado deseado.

Por ejemplo, una solución de prehibridación debería contener suficiente sal y el ADN no específico para tener sitios de hibridación a no específicos en la matriz sólida, a la temperatura deseada y en el tiempo de prehibridación deseado. Por ejemplo, para una hibridación rigurosa, tal solución de prehibridación podría contener 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (1xSSC es NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M; pH 7,0), 5x solución de Denhardt, pirofosfato de sodio al 0,05% y 100 \mug por ml de ADN de esperma de arenque. Una mezcla de hibridación rigurosa apropiada podría contener entonces 6x SSC, 1x solución de Denhardt, 100 \mug por ml de tRNA de levadura y pirofosfato de sodio al 0,05%.

Condiciones alternativas para análisis ADN-ADN podrían implicar lo siguiente:

1): prehibridación a temperatura ambiente e hibridación a 68ºC.;

2): lavado con % 0,2x SSC/0,1 SDS a temperatura ambiente;

3): cuando se desee, lavados adicionales al 0,2x SSC/0,1% SDS a 42ºC (lavado de severidad moderada); o

4): cuando se desee, lavados adicionales al 0,1x SSC/0,1% SDS a 68ºC (severidad alta).

Mezclas de hibridación conocidas, p. ej., la de Church y Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (1984), que comprende la composición siguiente también pueden ser usados: albúmina de suero bovino de grado cristalino al 1%/EDTA 1 mM/NaHPO_{4} 0,5M, pH 7,2/7% SDS. Además, también pueden ser encontradas condiciones de reacción alternativas pero similares en Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989). También puede ser incluida formamida en soluciones de prehibridación/hibridación, cuando se desee. La invención puede incluir secuencias de ADN que se hibriden severamente a secuencias de ácidos nucleicos que codifican los derivados PT.

Transgénicos. Como se usa en este documento, un organismo "transgénico" es un organismo que contiene un transgen, en el que el transgen fue introducido en el organismo o un antepasado del organismo en una etapa prenatal, p. ej., una etapa embrionaria. El transgen causa un cambio definido en su línea germinal, en el que el cambio no se encuentra generalmente en organismos tipo salvaje. Este cambio puede ser pasado a la progenie del organismo y por lo tanto la progenie son también animales transgénicos. El cambio en la línea germinal del organismo puede ser una inserción, una sustitución o una deleción en el gen de interés. Los animales no humanos son organismos en los cuales pueden ser introducidos transgenes por técnicas conocidas en la técnica, tales animales incluyen, pero no están limitados a ratones, cabras, ovejas, cerdos, vacas y otros animales de granja domésticos. Los métodos para generar a animales transgénicos se han vuelto comunes en la técnica y son descritos, por ejemplo, en Hogan B. et al., "A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, Nueva York. (1986) o la patente de EE.UU. Nº. 5.922.927 o 5.917.123. Un animal transgénico que lleva un transgen puede ser criado además a otro animal transgénico que lleva un segundo transgen para crear un animal "doble transgénico" que lleva dos transgenes.

Se sobrentiende que estas condiciones no se pretenden que sean definitivas o restrictivas y pueden ser ajustadas según se requiera por los expertos ordinarios en la técnica para llevar a cabo el objetivo deseado.

Compuestos de la invención - Propiedades estructurales y funcionales

Se describen en este documento nuevas variantes "minimizadas" de PTH que son bastante pequeñas para ser administrables por métodos no inyectables simples. También se describen derivados de PTH más grandes que tienen sustituciones en los 14 primeros aminoácidos del polipéptido. Los nuevos polipéptidos corresponden a la secuencia de aminoácidos 1-34, 1-32, 1-30, 1-28, 1-26, 1-24, 1-22, 1-20, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10 y 1-9 de PTH natural. Las variantes más cortas (<PTH 1-14) tienen un peso molecular de menos de 2.000 daltons.

La secuencia de aminoácidos primaria del péptido PTH (1-14) humano natural (del extremo N-terminal al C-terminal) es SerValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHis (SEQ ID NO:14), mientras que la secuencia de aminoácidos primaria del péptido (1-14) PTHrP natural (del extremo N-terminal al C-terminal) es AlaValSerGluHisGlnLeuLeu
HisAspLysGlyLysSer (SEQ ID NO:15).

Con frecuencia en esta sección, se hace referencia al polipéptido de SEQ ID NO:1. Esto es simplemente ilustrativo y no debería suponerse que implica que esto sea restrictivo de ningún modo con relación a las otras secuencias de polipéptidos de la invención. Como productos proteicos, los compuestos de la invención son susceptibles para la producción por técnicas de solución - o síntesis de péptidos en fase sólida o biología recombinante.

La técnica de síntesis de péptidos en fase sólida, en particular, se ha aplicado con éxito en la producción de PTH humano y puede ser usada para la producción de compuestos de SEQ ID NO:1 o sus derivados (para una guía, véase Kimura et al., supra, y véase Fairwell et al., Biochem. 22:2691 (1983)). El éxito con la producción de PTH humano a una escala relativamente grande ha sido publicado por Goud et al., en J. Bone Min. Res. 6 (8):781 (1991), incorporado en este documento como referencia. El intento de síntesis de péptidos sintéticos generalmente implica el uso de sintetizadores automatizados y una resina apropiada como fase sólida, a la cual es unido el aminoácido del extremo C-terminal de los compuestos deseados de SEQ ID NO:1 o sus derivados. La extensión del péptido en la dirección N-terminal es conseguida entonces conectando sucesivamente una forma apropiadamente protegida del siguiente aminoácido deseado, usando cualquiera de los protocolos químicos basados en FMOC o BOC típicamente, hasta que la síntesis sea completa. Los grupos protectores son cortados entonces desde el péptido, por lo general simultáneamente con el corte del péptido desde la resina, y el péptido es aislado entonces y purificado usando técnicas convencionales, tales como por HPLC de fase inversa usando ácido acetonitrilo como disolvente y tri-fluoroacético como agente de emparejamiento de iones. Tales procedimientos son generalmente descritos en numerosas publicaciones y puede hacerse referencia, por ejemplo, a Stewart Young, "Solid Phase Peptide Synthesis" 2ª Edición, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill. (1984). Será apreciado que el intento de la síntesis de péptidos es requerido para la producción de, por ejemplo, SEQ ID NO:1 y sus derivados incorporando aminoácidos que no son genéticamente codificados, tales como homoarginina.

En un aspecto de la invención, cualquier sustitución de aminoácido a las posiciones 1-9, y más en particular aquellas sustituciones de aminoácido a las posiciones de aminoácidos 10, 11, 12, 14 y/o 19, que no destruyen la actividad biológica del polipéptido PTH para antagonizar o agonizar el receptor PTH-1/PTH-2 (como se determina por los ensayos conocidos por el experto en la técnica y discutida en este documento), también son incluidas dentro del ámbito de la presente invención.

El análogo sintético de PTH bovino, PTH (3-34) ha sido reconocido como un potente antagonista PTH in vitro. Las variantes de PTH que carecen de aminoácidos N-terminal 1-2 y 1-7, fueron mostrado que estaban carentes de actividad agonista y que eran capaces de mostrar actividad antagonista (Born, W. et al., Endocrinol. 23:1848-1853 (1988)). Las potenciales variantes de antagonista preferidas de SEQ ID NO:1 de esta invención son variantes truncadas en el extremo N-terminal.

Cuando una variante es truncada por un aminoácido en el extremo N-terminal, es llamada PTH o PTHrP (2-14), porque carece del residuo de aminoácido Nº. 1, pero contiene los residuos de aminoácidos Nº. 2-14. Cuando una variante es truncada por un aminoácido en el extremo C-terminal, se llama PTH o PTHrP (1-13), porque carece del residuo de aminoácido Nº. 14, pero contiene los residuos de aminoácidos Nº. 1-13. Este sistema de enumeración también se aplica a versiones más truncadas de PTH.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, los sustituyentes pueden ser unidos a aminas libres del aminoácido N-terminal de compuestos tales como, por ejemplo, SEQ ID NO:1 o sus derivados por métodos estándares conocidos en la técnica. Por ejemplo, grupos alquilo, p. ej., alquilo C_{1-12}, puede ser unido usando alquilación reductora. Los grupos hidroxialquilo, p. ej. hidroxialquilo C_{1-12}, también pueden ser unidos usando alquilación reductora en la que el grupo hidroxi libre está protegido con éster de t-butilo. Los grupos acilo, p. ej., COE_{1}, pueden ser unidos conectando el ácido libre, p. ej., E_{1}COOH, al amino libre del aminoácido N-terminal. Además, las modificaciones químicas posibles del extremo C-terminal del polipéptido están abarcadas dentro del ámbito de la invención. Estas modificaciones pueden modificar la afinidad de unión al receptor.

También se contempla dentro del ámbito de esta invención aquellos compuestos tales como, por ejemplo, SEQ ID NO:1 y sus derivados que cambian la estructura secundaria o terciaria, o la estabilidad de compuestos tales como SEQ ID NO:1 o sus derivados que todavía retienen la actividad biológica. Tales derivados podrían ser conseguidos por ciclación con lactama, uniones disulfuro, u otros medios conocidos para una persona experta ordinaria en la técnica.

Vectores, células huésped y expresión recombinante

La presente invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido de la presente invención, y células huésped que son genéticamente modificadas con los vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. También pueden ser empleados sistemas de traducción sin células para producir tales proteínas usando ARN derivados del constructo de ADN de la presente invención.

Para la producción recombinante, las células huésped pueden ser genéticamente modificadas para incorporar sistemas de expresión o sus partes para polinucleótidos de la presente invención. La inserción de polinucleótidos en células huésped puede ser efectuada por métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) tal como transfección con fosfato de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano, transfección, microinyección, transfección catiónica mediada en lípidos, electroporación, transducción, carga de raspado, inserción balística o infección.

Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, células tales como Streptococci, Staphylococci, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; células fungosas, tales como células de levadura y células de Aspergillus; células de insecto tales como S2 de Drosophila y células Sf9 de Spodoptera; células de animal tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 y células de melanoma de Bowes; y células de planta.

Puede ser usado una gran variedad de sistemas de expresión. Tales sistemas incluyen, entre otros, sistemas cromosómicos, episomales y derivados de virus, p. ej., vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriofagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, virus papova, tales como SV40, virus de vacuna, adenovirus, virus de viruela de ave, virus de pseudorabia y retrovirus y vectores derivados de sus combinaciones, como los derivados de plásmido y elementos genéticos bacteriofagos, tales como cósmidos y fagómidos. Los sistemas de expresión pueden contener regiones control reguladoras así como expresión de engendro. Generalmente, puede ser usado cualquier sistema o vector adecuado para mantener, para propagarse o expresar polinucleótidos para producir un polipéptido en un huésped. La secuencia de nucleótidos apropiada puede ser insertada en un sistema de expresión por cualquiera de una variedad de técnicas famosas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las expuestas además en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (supra).

También pueden ser utilizados vectores de ARN para la expresión de los ácidos nucleicos que codifican los compuestos de la invención o sus derivados revelados en esta invención. Estos vectores están basados en virus de ARN de cadena positiva o negativa que naturalmente se reproducen en una amplia variedad de células eucarióticas (Bredenbeek, P. J. y Rice, C. M., Virology 3: 297-310, 1992). A diferencia de los retrovirus, estos virus carecen de una fase del ciclo vital del ADN intermedio, existiendo completamente en la forma de ARN. Por ejemplo, los virus alfa son usados como vectores de expresión para proteínas ajenas porque pueden ser utilizados en una amplia variedad de células huésped y proporcionar un alto nivel de expresión; los ejemplos de virus de este tipo incluyen el virus Sindbis y el virus Semliki Forest (Schlesinger, S., TIBTECH 11:18-22, 1993; Frolov, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 11371-11377, 1996). Como se ejemplifica por el sistema de expresión Sinbis de Invitrogen, el investigador puede mantener cómodamente la molécula recombinante en forma de ADN (plásmido pSinrep5) en el laboratorio, pero la propagación en la forma de ARN es factible también. En la célula huésped usada para la expresión, el vector que contiene el gen de interés existe completamente en la forma de ARN y puede ser continuamente propagado en aquel estado de ser deseado.

Para la secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el ambiente extracelular pueden ser incorporadas las señales de secreción apropiadas en el polipéptido deseado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

La expresión de una secuencia de ADN requiere que la secuencia de ADN esté "operativamente unida" a secuencias de ADN que contienen información transcripcional y reguladora de la translación. Una unión operable es una unión en la que las secuencias control o de ADN reguladoras y la secuencia de ADN que se procuraron expresar están relacionados de tal modo que permiten la expresión de los genes. La naturaleza precisa de las "regiones de control" necesarias para la expresión de genes puede variar de un organismo a otro organismo, pero incluirá en general una región promotora que, en células procarióticas, contiene a ambas secuencias del promotor (que dirige la iniciación de la trascripción de ARN) así como de ADN que, cuando se transcriben en el ARN, señalarán la iniciación de la síntesis de la proteína. Las regiones reguladoras en células eucarióticas incluirán en general una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis de ARN.

La conexión de varios fragmentos de ADN, para producir los vectores de expresión de esta invención se realiza de acuerdo con técnicas convencionales, empleando los términos terminado en romo o terminados escalonados para la ligación, digestión con enzima de restricción para proporcionar términos apropiados, rellenando de finales cohesivos cuando sea apropiado, tratamiento alcalino y de fosfatasa para evitar la conexión indeseable, y la ligación con ligados apropiados. En caso de una proteína de fusión, el constructo genético codifica a un promotor inducible que es operativamente unido a la secuencia de genes 5' de la proteína de fusión para permitir la expresión eficiente de la proteína de fusión.

Para expresar compuestos de la invención o su derivado en una célula procariótica (tal como, por ejemplo, E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces, etc.), es necesario unir operativamente, por ejemplo, la SEQ ID NO: secuencia de ADN de codificación 1 a un promotor procariótico funcional. Tales promotores pueden ser constitutivos o, más preferiblemente, regulables (es decir, inducibles o irrepresibles). Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen al promotor int del bacteriofago \lambda, el gen del promotor bla del \beta-lactamasa de pBR322, y el promotor CAT del gen de cloramfenicol acetil transferasa de pBR325, etc. Los ejemplos de promotores procarióticos inducibles incluyen a los promotores derechos e izquierdos principales del bacteriofago \lambda, (PL y PR), los promotores trp, recA, lacZ, lacI y gal de E. coli, \alpha-amilasa (Ulmanen, I. et al., J. Bacteriol. 162:176-182 (1985)), y los promotores específicos \sigma-28 de B. subtilis (Gilman, M. Z. et al., Gene 32:11-20 (1984)), los promotores del bacteriofago de Bacillius (Gryczan, T. J., En: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc, NY (1982)), y promotores de Streptomyces (Ward, J. M. et al., Mol. Gen. Genet. 203:468-478 (1986)). Los promotores procarióticos son examinados por Glick, B. R., J. Ind. Microbiol. 1:277-282 (1987); Cenatiempo, Y., Biochimie 68:505-516 (1986)); y Gottesman, S., Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984)).

El promotor procariótico preferido para esta invención es el promotor trp de E. coli, que es inducible con el ácido acrílico de indol.

Si es deseada la expresión en una célula eucariótica, tales como células de levadura, hongos, células de mamífero, o planta, entonces es necesario emplear a un promotor capaz de dirigir la trascripción en un tal huésped eucariótico. Los promotores eucarióticos preferidos incluyen al promotor del gen de metalotioneina I de ratón (Hamer, D. et al., J. Mol. Appl. Gene 1:273-288 (1982)); el promotor TK de virus del Herpes (McKnight, S., Cell 31:355-365 (1982)); el promotor SV40 temprano (Benoist, C., et al., Nature (Londres) 290:304-310 (1981)); y el promotor del gen gal4 de levadura (Johnston, S. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975 (1982); Silver, P. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5955 (1984)).

Preferentemente, la secuencia de genes introducida será incorporada en un plásmido o vector viral capaz de una replicación autónoma en el huésped receptor. Cualquiera de una amplia variedad de vectores puede ser empleada para este fin. Los factores de importancia en la selección de un plásmido particular o vector viral incluyen: la facilidad con la cual las células receptoras que contienen el vector pueden ser reconocidas y seleccionadas a partir de aquellas células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que son deseadas en un huésped particular; y si es deseable ser capaz de "trasladar" el vector entre células huésped de especies diferentes.

Los vectores procarióticas preferidos incluyen plásmidos como aquellos capaces de replicarse en E. coli (tales como, por ejemplo, pBR322, ColEl, pSC101, pACYC 184, \piVX. Tales plásmidos son, por ejemplo, descritos por Maniatis, T., et al., En: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982)). Los vectores de expresión de plásmido preferidos incluyen el plásmido pGFP-1 descrito en Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1989), o un plásmido modificado basado en uno de los vectores favoritos descritos por Studier y Dunn, Methods in Enzymology 185:60-89 (1990). Los plásmidos de bacilo incluyen pC194, pC221, pT127, etc. Tales plásmidos son descritos por Gryczan, T. En: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, pp. 307-329 (1982). Los plásmidos de Streptomyces adecuados incluyen pIJIOI (Kendall, K. J. et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183 (1987)), y bacteriofagos de Streptomyces tales como \phiC31 (Chater, K. F. et al., En: Sexto Simposio Internacional de la Biología de Actinomycetales, Akademiai Kaido, Budapest, Hungría, pp. 45-54 (1986)). Los plásmidos de Pseudomonas se revisan en John, J. F. et al., Rev. Infect. Dis. 8:693-704 (1986)), e Izaki, K., Jon. J. Bacteriol. 33:729-742 (1978)).

Los vectores de expresión eucarióticos preferidos incluyen, sin limitación, BPV, vacuna, círculo de 2 micrones, etc. Tales vectores de expresión son conocidos en la técnica (Botstein, D., et al., Miami Wntr. Symp. 19:265-274 (1982); Broach, J. R., En; The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, pp. 445-470 (1981); Broach, J. R., Cell 28:203-204 (1982); Bollon, D. P., et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:3948 (1980); Maniatis, T., En: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, volumen 3, "Gene Expresión", Prensa Académica, NY, pp. 563-608 (1980)).

Además de los microorganismos, también pueden ser usados como huéspedes los cultivos de células derivadas de organismos multicelulares. En principio, cualquier tal cultivo de células es realizable, tanto de fuentes celulares vertebradas como invertebradas. El interés, sin embargo, ha sido mayor con células de fuentes vertebradas. Los ejemplos de líneas de células huésped vertebradas útiles son células VERO y HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO), W138, BHK, COS 7, y líneas de células MDCK. Los vectores de expresión para tales células generalmente incluyen (si es necesario) un origen de replicación, un promotor localizado delante de o corriente arriba al gen que se expresa, junto con cualesquiera sitios de unión de ribosoma necesarios, sitios de empalme de ARN, sitio de poliadenilación y secuencias del terminador transcripcional.

Para el uso en células mamíferas, las funciones de control en los vectores de expresión a menudo son proporcionadas por el material viral. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados son derivados de polioma, Adenovirus 2, Virus Símico 40 (SV40) y citomegalovirus. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 son en particular útiles porque ambos son obtenidos fácilmente a partir del virus como un fragmento que también contiene el origen del vial SV40 de la replicación (Fiers et al., Nature 273:113 (1978)).

Un origen de replicación puede ser proporcionado por la construcción del vector para incluir un origen exógeno, tal como puede ser derivado de SV40 u otra fuente viral (p. ej. Polioma, Adeno, VSV, BPV) o puede ser proporcionado por el mecanismo de replicación cromosómico de la célula huésped. Si el vector es integrado en el cromosoma de la célula huésped, éste a menudo es suficiente.

Si se usan células sin barreras de membrana celulares formidables como células huésped, la transfección se realiza por el método de precipitación con fosfato de calcio como se describe por Graham y Van der Erb, Virology 52:546 (1978). Sin embargo, también pueden ser usados otros métodos para introducir ADN en células, tales como por la inyección nuclear o por la fusión de protoplastos. En caso de la terapia génica, el método de inyección de plásmido desnudo directo o de ADN viral, con o sin agentes facilitadores de la transfección tales como, sin limitación, liposomas, proporciona un intento alternativo a los métodos corrientes de transfección de células mamíferas in vivo o in vitro. Si son usadas células procarióticas o células que contienen construcciones de pared de células sustanciales, el método preferido de transfección es el tratamiento con calcio, usando cloruro de calcio como se describe en Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110 (1972).

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Terapia génica

Un paciente (humano o no humano) que padece síntomas de una enfermedad tal como la osteoporosis u otras enfermedades que requieren PTH puede ser tratado por terapia génica. Emprendiendo este enfoque, debería haber una atenuación de los síntomas de la enfermedad. La terapia génica ha demostrado ser eficaz o se ha pensada que es prometedora en el tratamiento de ciertas formas de hemofilia humana (Bontempo, F. A., et al., Blood 69:1721-1724 (1987); Palmer, T. D., et al., Blood 73:438-445 (1989); Axelrod, J. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5173-5177 (1990); Armentano, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145 (1990)), así como en el tratamiento de otras enfermedades mamíferas tales como la fibrosis cística (Drumm, M. L., et al., Cell 62:1227-1233 (1990); Gregory, R. J., et al., Nature 347:358-363 (1990); Rich, D. P., et al., Nature 347:358-363 (1990)), enfermedad de Gaucher (Sorge, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:906-909 (1987); Fink, J. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2334-2338 (1990)), distrofia muscular (Partridge, T. A., et al., Nature 337:176-179 (1989); Law, P. K., et al., Lancet 336:114-115 (1990); Morgan, J. E., et al., J. Cell Biol. 111:2437-2449 (1990)), y melanoma metastásico (Rosenberg, S. A., et al., Science 233:1318-1321 (1986); Rosenberg, S. A., et al., N. Eng. J. Med. 319:1676-1680 (1988); Rosenberg, S. A., et al., N. Eng. J. Med. 323:570-578 (1990)). Más recientemente, se ha demostrado que la terapia génica proporciona la actividad antitumoral o anticáncer en pacientes con cáncer de próstata (Herman, J. R. et al., Hum. Gene Ther. 10:1239-1249 (1999) y melanoma metastásico (Nemunaitis, J. et al., Hum. Gene Ther. 20:1289-1298 (1999)). Además, varias patentes han conseguido métodos de terapia génica. Por ejemplo, las patentes de EE.UU. N^{os}. 5.836.905, 5.741.486, 5.871.486 y 5.656.465.

En un intento preferido, puede ser incorporado un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos para el derivado del polipéptido PTH en un vector adecuado para introducir la molécula de ácido nucleico en las células del mamífero que se tratan, para formar un vector transfección.

Se han desarrollado una variedad de vectores para la administración de genes y la terapia génica posible. Los vectores adecuados para este fin incluyen retrovirus, adenovirus y virus adeno asociado (AAV). O bien, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser complejados en un conjugado molecular con un virus (p. ej., un adenovirus) o con componentes virales (p. ej., proteínas de cápsido viral). Los vectores se derivan del virus tipo 1 del herpes simplex (HSV-1), adenovirus, virus adeno-asociado (AAV) y constructos de retrovirus (para una revisión véase Friedmann, T., Trends Genet 10:210-214 (1994); Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1 (1994); Mulligan, R. C., Science 260:926-932 (1993); Smith, F. et al., Rest. Neurol. Neurosci. 8:21-34 (1995)). Los vectores basados en HSV-1, incluyendo tanto vectores de virus recombinantes como incluyendo vectores de amplicón, así como vectores adenovirus pueden asumir un estado extracromosómico en el núcleo de la célula y mediar la expresión de genes limitada y a largo plazo en células postmitóticas, pero no en células mitóticas. Los vectores amplicón de HSV-1 pueden ser cultivados a títulos relativamente altos (10^{7} unidades transformadas/ml) y tener la capacidad de acomodar fragmentos grandes de ADN ajeno (al menos 15 kb, con 10 copias de concateméricas por virión). Los vectores de AAV (rAAV), disponibles a títulos comparables a vectores de amplicón, pueden suministrar genes (<4,5 kb) a células postmitóticas como mitóticas en combinación con adenovirus o virus del herpes tales como virus ayudantes. La expresión transgénica a largo plazo es conseguida por la replicación y formación de elementos "episomales" y/o por la integración en el genoma de la célula huésped al azar o en sitios específicos (para una revisión véase Samulski, R. J., Current Opinion in Genetics and Development 3:74-80 (1993); Muzyczka, N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129 (1992)). Los vectores de HSV, adenovirus y rAAV son todos introducidos en partículas estables. Los vectores de retrovirus pueden albergar 7-8 kb de ADN ajeno e integrarse en el genoma de la célula huésped, pero sólo en células mitóticas, y las partículas son relativamente inestables con títulos bajos. En estudios recientes se ha manifestado que pueden ser combinados diferentes elementos de virus para aumentar la capacidad de suministro de vectores. Por ejemplo, la incorporación de elementos del VIH virión, incluyendo la proteína de matriz e integrasa, en vectores retrovirus permite que casetes del transgen entren en el núcleo no mitótico, así como células mitóticas y potencialmente integrarse en el genoma de estas células (Naldini, L. et al., Science 272:263-267 (1996)); y la inclusión de la glicoproteina de la envuelta del virus de somatitis vesicular (VSV-G) aumenta la estabilidad de partículas de retrovirus (Emi, N. et al., J. Virol. 65:1202-1207 (1991)).

El HSV-1 es un virus de ADN bicatenario que es clonado y transcrito en el núcleo de la célula. El HSV-1 tiene tanto un ciclo lítico como latente. El HSV-1 tiene una amplia rango de huéspedes, e infecta a muchos tipos de células en mamíferos y aves (incluyendo pollo, rata, ratones, mono y humano) Spear et al., DNA Tumor Viruses, J. Tooze, ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1981, pp. 615-746). El HSV-1 puede infectar líticamente una amplia variedad de células incluyendo neuronas, fibroblastos y macrófagos. Además, el HSV-1 infecta a neuronas post-mitóticas en animales adultos y puede ser mantenido indefinidamente en un estado latente. Stevens, Stevens, Current Topics in Microbiology and Immunology 70:31 (1975). El HSV-1 latente es capaz de expresar
genes.

El AAV también tiene una amplia rango de huéspedes y se piensa que la mayor parte de células humanas son inyectables. Se cree que el rango de huéspedes para la integración es igualmente amplio. El AAV es un parvovirus de ADN monocatenario endógeno a la población humana, haciéndolo un candidato de vector de terapia génica adecuado. El AAV no está asociado a ninguna enfermedad, lo que hace por lo tanto que sea seguro para aplicaciones de transferencia de genes (Cukor et al., Parvoviruses, ed. K. I. Bems, Plenum, Nueva York, (1984) pp. 33-36; Ostrove et al., Virology 113: 521 (1981)). El AAV se integra en el genoma huésped bajo la infección de modo que los transgenes puedan ser expresados indefinidamente (Kotin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 221 (1990); Samulski et al., Embo J. 10: 3941 (1991)). La integración de AAV en el genoma celular es independiente de la replicación de las células lo que es particularmente importante ya que AAV puede transferir así genes en células quietas (Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988 (1988)).

Tanto HSV como AAV pueden suministrar genes a células en división y en no división. En general, los viriones de HSV son considerados mucho más infecciosos que los viriones de AAV, con una proporción de partículas de virus: unidades infecciosas en el intervalo de 10 para HSV (Browne, H. et al., J. Virol. 70:4311-4316 (1996)) y hasta miles para AAV (Snyder, R. O. et al., En Current Protocols in Human Genetics, Ed. Dracopoli, N. et al., John Wiley and Sons: Nueva York (1996), pp. 1-24), y que tienen ambos una amplia variedad de especies. De todos modos, cada virión tiene trofismos específicos que afectarán a la eficacia de infección de tipos de células específicos. La reciente identificación de un receptor de membrana para HSV-1 que es un miembro de la familia del factor alfa de necrosis tumoral (Montgomery, R. I. et al., Resumen Nº. 167 del 21º Taller de Virus del Herpes (1996)) indica que la distribución de este receptor afectará a la capacidad de infección relativa de células, aunque la mayoría de los tipos de células de mamíferos parezcan ser infectables con HSV-1. El AAV también tiene un rango huésped muy amplio y de tipos de células. El receptor celular para AAV no es conocido, pero se ha descrito una glicoproteina de 150 kDA cuya presencia en células cultivadas guarda correlación con su capacidad de unirse a AAV (Mizukami, H. et al., Virology 217:124-130 (1996)).

Las técnicas para la formación de tales vectores son famosas en la técnica, y son generalmente descritas en " Working Toward Human Gene Therapy", Capítulo 28 en Recombinant DNA, 2ª ed., Watson, J. D. et al., ed., Nueva York: Scientific American Books, pp. 567-581 (1992). Además, pueden ser encontrados métodos generales para la construcción de vectores de terapia génica y su inserción en animales afectados para fines terapéuticos en las publicaciones arriba mencionadas, cuyas descripciones son expresamente incorporadas en este documento como referencia en su totalidad.

En un método general, los vectores que comprenden polinucleótidos que codifican el gen del derivado de PTH son directamente introducidos en las células o los tejidos del individuo afectado, preferiblemente por inyección, inhalación, ingestión o inserción en una membrana mucosa vía una solución; tal intento se conoce generalmente como terapia génica "in vivo". O bien, las células o los tejidos, p. ej., células hematopoyéticas de la médula ósea, pueden ser retiradas del animal afectado y colocadas en un cultivo según métodos que son conocidos por cualquier experto ordinario en la técnica; los vectores que comprenden los polinucleótidos pueden ser introducidos entonces en estas células o tejidos por cualquiera de los métodos descritos generalmente más arriba para introducir polinucleótidos aislados en una célula o tejido, y, después de una cantidad suficiente de tiempo para permitir la incorporación de los polinucleótidos, las células o los tejidos pueden ser entonces insertados de nuevo en el animal afectado o un segundo animal en necesidad del tratamiento. Ya que la inserción del ADN de interés es realizada fuera del cuerpo del animal afectado, este intento es generalmente conocido como terapia génica "ex vivo".

Tanto para terapia génica in vivo como ex vivo, los polinucleótidos de la invención pueden ser alternativamente unidos operativamente a una secuencia de ADN reguladora, que puede ser una secuencia de ADN reguladora heteróloga, para formar un constructo genético como se describe más arriba. Este constructo genético puede ser insertado entonces en un vector, que es directamente introducido entonces en el animal afectado en un intento de terapia génica in vivo, o en las células o los tejidos del animal afectado en un intento ex vivo. En otra realización preferida, los constructos genéticos pueden ser introducidos en las células o los tejidos del animal, in vivo o ex vivo, en un conjugado molecular con un virus (p. ej., un adenovirus) o componentes virales (p. ej., proteínas de la cápsida viral).

Los mencionados intentos causan (a) la recombinación homóloga entre la molécula de ácido nucleico y el gen defectuoso en las células del animal afectado; (b) la inserción aleatoria del gen en el genoma de la célula huésped; o (c) la incorporación del gen en el núcleo de las células donde puede existir como un elemento genético extracromosómico. Las descripciones generales de tales métodos e intentos a la terapia génica pueden ser encontradas, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº. 5.578.461; el documento internacional WO 94/12650; y el documento internacional WO 93/09222.

De forma alternativa, las células huésped transfectadas, que pueden ser homólogas o heterólogas, pueden ser encapsuladas dentro de un dispositivo de barrera semipermeable e implantadas en el animal afectado, permitiendo al paso de, por ejemplo, el derivado del polipéptido PTH en los tejidos y la circulación del animal, pero previniendo el contacto entre el sistema inmunológico del animal y las células transfectada (véase el documento WO 93/09222).

Utilidad y administración de los compuestos de la invención

Los compuestos de la invención o sus derivados tienen usos múltiples. Éstos incluyen, inter alia, agonistas o antagonistas del receptor de PTH, la prevención y el tratamiento de una variedad de condiciones mamíferas manifestadas por la pérdida del masa ósea, sondas diagnósticas, antígenos para preparar anticuerpos para uso como sondas diagnósticas e incluso marcadores de pesos moleculares. Ser capaz de sustituir expresamente uno o varios aminoácidos en el polipéptido PTH permite la construcción de polipéptidos de pesos moleculares específicos, según se requiera.

En particular, los compuestos de esta invención son indicados para la profilaxis y el tratamiento terapéutico de la osteoporosis y la osteopenia en seres humanos. Además, los compuestos de esta invención son indicados para la profilaxis y el tratamiento terapéutico de otras enfermedades óseas. Los compuestos de esta invención también son indicados para la profilaxis y el tratamiento terapéutico del hipoparatiroidismo. Finalmente, los compuestos de esta invención son indicados para uso como agonistas para la reparación de fracturas y como antagonistas para la hipercalcemia.

En general, los compuestos de, por ejemplo, SEQ ID NO:1 o sus derivados, o sus sales, son administrados en cantidades entre aproximadamente 0,01 y 1 \mug/kg peso corporal por día, preferiblemente de aproximadamente 0,07 a aproximadamente 0,2 \mug/kg peso corporal por día. Para un sujeto femenino humano de 50 kilogramos, la dosis diaria del compuesto biológicamente activo es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 \mug, preferiblemente de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 10 \mug. En otros mamíferos, tales como caballos, perros y ganado, pueden ser requeridas dosis más altas. Esta dosis puede ser administrada en una composición farmacéutica convencional por una administración sola, por aplicaciones múltiples, o vía liberación controlada, cuando sea necesario conseguir resultados más eficaces, preferiblemente una o varias veces diariamente por inyección. Por ejemplo, esta dosis puede ser administrada en una composición farmacéutica convencional por insuflación nasal.

La selección de la dosis exacta y la composición y el régimen de administración más apropiado estará bajo la influencia de, inter alia, las propiedades farmacológicas de los compuestos seleccionados de la invención, la naturaleza y la severidad de la condición tratada, y el estado físico y la agudeza mental del recipiente.

Los regímenes de administración representativos preferidos incluyen, sin limitación, oral, parenteral, subcutánea, transcutánea, intramuscular e intravenosa, rectal, bucal (incluyendo sublingual), transdérmica e insuflación intranasal.

Las sales farmacéuticamente aceptables retienen la actividad biológica deseada de los compuestos de la invención sin efectos secundarios tóxicos. Los ejemplos de tales sales son (a) sales de adición ácida formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y otros similares; y sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, tanino, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácidos naftalenosulfónicos, ácidos naftaleno disulfónicos, ácido poligalacturónico y otros similares; (b) sales de adición básica formadas con cationes metálicos polivalentes tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio y otros similares; o con un catión orgánico formado a partir de N,N'-dibenciletilendiamina o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b), p. ej., una sal de tanato de cinc y otros similares. Los tampones farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, solución salina o solución salina tamponada con fosfato en un tampón. También pueden incluirse en estas soluciones conservantes aceptables conocidos por los expertos en la técnica.

Un aspecto adicional de la presente invención está relacionado con composiciones farmacéuticas que comprenden como ingrediente activo compuestos de la invención o sus derivados de la presente invención, o sus sales farmacéuticamente aceptable, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, no tóxico. Como se menciona anteriormente, tales composiciones pueden ser preparadas para administración parenteral (subcutánea, transcutánea, intramuscular o intravenosa), en particular en forma de soluciones líquidas o suspensiones; para la administración oral o bucal, en particular en forma de pastillas o cápsulas; para administración rectal, transdérmica; y para administración intranasal, en particular en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Las composiciones pueden ser cómodamente administradas en una forma de dosificación unitaria y puede ser preparada por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985), incorporado en este documento como referencia. Las formulaciones para la administración parenteral pueden contener excipientes tales como agua estéril o solución salina, alquilenglicoles tales como propilenglicol, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y otros similares. Para la administración oral, la formulación puede ser realzada por la adición de sales de bilis o acilcarnitinas. Las formulaciones para la administración nasal pueden ser sólidas y pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa o dextrano, o pueden ser soluciones acuosas o aceitosas para uso en forma de gotas nasales o pulverizaciones dosificadas. Para la administración bucal, los excipientes típicos incluyen azúcares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidón pregelatinado y otros similares.

Cuando se formula para la ruta de administración más preferida, la administración nasal, la absorción a través de la membrana mucosa nasal puede ser realzada por ácidos surfactantes, tales como, por ejemplo, ácido glicochólico, ácido chólico, ácido taurochólico, ácido etochólico, ácido desoxichólico, ácido chenodesoxichólico, ácido deshidrochólico, ácido glicodesoxichólico, ciclodextrinas y otros similares en una cantidad en el rango de aproximadamente 0,2 y 15 por ciento en peso, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y 4 por ciento en peso, más preferiblemente aproximadamente 2 por ciento en peso.

La administración de los compuestos de la presente invención al sujeto durante períodos prolongados del tiempo, por ejemplo, durante períodos de una semana a un año, puede ser llevada a cabo por una administración única de un sistema de liberación controlado que contiene el ingrediente activo suficiente para el período de liberación deseado. Varios sistemas de liberación controlada, tales como microcápsulas monolíticas o de tipo reservorio, implantaciones de liberación retardada, bombas osmóticas, vesículas, micelas, liposomas, parches transdérmicos, dispositivos yiontoforéticos y formas de dosis inyectables alternativas pueden ser utilizados para este fin. La localización en el sitio al cual es deseada la administración del ingrediente activo es un rasgo adicional de algunos dispositivos de liberación controlada, lo que pueden mostrar beneficios en el tratamiento de ciertos desórdenes.

Una forma de la formulación de liberación controlada contiene el polipéptido o su sal dispersada o encapsulada en un polímero no tóxico, no antigénico de degradación lenta, tal como ácido copoli(láctico/glicólico), como se describe en el trabajo pionero de Kent, Lewis, Sanders y Tice, patente de EE.UU. Nº. 4.675.189, incorporado como referencia en este documento. Los compuestos o, preferiblemente, sus sales relativamente insolubles, también pueden ser formuladas en colesterol u otras bolitas de matriz lipídica o implantaciones de matriz silastómera. Otras formulaciones de liberación lenta, implantación de liberación retardada o inyectables serán evidentes para cualquier experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc, Nueva York, 1978, y R. W. Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987, incorporado como referencia en este documento.

Como PTH, las variantes de PTH pueden ser administradas en combinación con otros agentes útiles en el tratamiento de una condición clínica dada. Cuando se trata la osteoporosis y otros desórdenes relacionados con los huesos, por ejemplo, las variantes de PTH pueden ser administradas junto con un suplemento alimenticio de calcio o con un análogo de la vitamina D (véase la patente de EE.UU. Nº. 4.698.328). O bien, la variante de PTH puede ser administrada, preferiblemente usando un régimen terapéutico cíclico, en combinación con bisfosfonatos, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº. 4.761.406, o en combinación con uno o varios agentes terapéuticos óseos tales como, sin limitación, calcitonina y estrógenos.

Actividades de señalización del receptor de los compuestos de la invención o sus derivados

Una etapa crucial en la expresión de la acción hormonal es la interacción de hormonas con receptores en la superficie de la membrana plasmática de células diana. La formación de complejos hormona-receptor permite que la transducción de las señales extracelulares en la célula produzca una variedad de respuestas biológicas.

Los polipéptidos de la invención pueden ser rastreados según sus propiedades agonistas o antagonistas usando el ensayo de acumulación de cAMP. Las células que expresan el receptor de PTH-1 en la superficie de la célula son incubadas con PTH natural (1-84) durante 5-60 minutos a 37ºC., en presencia de IBMX 2 mM (3-isobutil-1-metil-xantina, Sigma, San. Louis, MO). La acumulación de AMP cíclico se mide por un radio-inmunoensayo específico. Un compuesto de la invención que compite con PTH natural (1-84) o PTH (1-34) por unirse al receptor PTH-1, y que inhibe el efecto de PTH natural (1-84) o PTH (1-34) en la acumulación de cAMP, es considerado un antagonista competitivo. Tal compuesto sería útil para tratar la hipercalcemia.

A la inversa, un compuesto de la invención o su derivado que no compite con PTH natural (1-84) o PTH (1-34) por unirse al receptor PTH-1, pero que todavía previene la activación de PTH natural (1-84) o PTH (1-34) de la acumulación de cAMP (probablemente bloqueando el sitio de activación del receptor) es considerado un antagonista no competitivo. Tal compuesto sería útil para tratar la hipercalcemia.

Un compuesto de la invención o su derivado que compite con PTH natural (1-84) o PTH (1-34)) por unirse al receptor PTH-1, y que estimula la acumulación de cAMP en presencia o ausencia de PTH natural (1-84) o PTH (1-34) es un agonista competitivo. Un compuesto de la invención o su derivado que no compite con PTH natural (1-84) o PTH (-34) por unirse al receptor PTH-1, pero que es todavía capaz de estimular la acumulación de cAMP en presencia o ausencia de PTH natural (1-84) o PTH (1-34), o que estimula una acumulación de cAMP más alta que la observada por un compuesto de la invención o su derivado sencillo, sería considerado un agonista no competitivo.

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Usos terapéuticos de compuestos de la invención o sus derivados

Algunas formas de hipercalcemia e hipocalcemia están relacionadas con la interacción entre PTH y PTHrP y los receptores de PTH-1 y PTH-2. La hipercalcemia es una condición en la cual hay una elevación anormal en el nivel de calcio en suero; esto a menudo está asociado con otras enfermedades, incluyendo el hiperparatiroidismo, la osteoporosis, los carcinomas de pecho, pulmón y próstata, cánceres epidermoides de cabeza y cuello y esófago, mieloma múltiple e hipernefroma. La hipocalcemia, una condición en la cual el nivel de calcio en suero es anormalmente bajo, puede resultar de una deficiencia de PTH eficaz, p. ej., después de una cirugía de tiroides.

Los ácidos nucleicos de la invención que codifican los compuestos de la invención o sus derivados también pueden ser unidos a un promotor específico de tejido seleccionado y/o potenciados y el gen híbrido resultante puede ser introducido, por métodos estándares (p. ej., como se describe por Leder et al., patente de EE.UU. Nº. 4.736.866, incorporado en este documento como referencia), en un embrión de animal en una etapa del desarrollo temprana (p. ej., la etapa del oocito fertilizado), para producir un animal transgénico que exprese niveles elevados de compuestos de la invención o sus derivados en tejidos seleccionados (p. ej., el promotor osteocalcina para el hueso). Tales promotores son usados para dirigir la expresión específica de tejido de los compuestos de la invención o sus derivados en animal transgénicos.

Además, cualquier otra sustitución de aminoácidos de una naturaleza, que no destruya la capacidad del derivado de PTH de antagonizar o agonizar el receptor PTH-1/PTH-2 (como se determina por los ensayos conocidos por los expertos en la técnica y se discute más abajo) es incluida en el alcance de la presente invención.

Por "agonista" se entiende un ligando capaz de realzar o potenciar una respuesta celular mediada por el receptor PTH-1. Por "antagonista" se entiende un ligando capaz de inhibir una respuesta celular mediada por el receptor PTH-1. Si algún candidato "agonista" o "antagonista" de la presente invención puede realzar o inhibir una tal respuesta celular puede ser determinado usando ensayos de respuesta celular de la proteína ligando/receptor o de unión conocidos en la técnica, incluyendo aquellos descritos en otra parte en esta aplicación.

Los compuestos de la invención también pueden ser usados en un método para tratar un desorden médico que resulta de la acción alterada o excesiva del receptor PTH-1, que comprende administrar a un paciente la cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención o su derivado suficiente para inhibir la activación del receptor PTH-1 de dicho paciente.

En esta realización, un paciente que se sospeche que tiene un desorden que resulta de la acción alterada del receptor PTH-1 puede ser tratado usando los compuestos de la invención o sus derivados de la invención que son unos antagonistas selectivos del receptor PTH-1. Tales antagonistas incluyen los compuestos de la invención o sus derivados de la invención que han sido determinado (por los ensayos descritos en este documento) para interferir con la activación de célula mediada del receptor de PTH-1 u otros derivados que tienen propiedades similares.

Para administrar al antagonista, el compuesto apropiado de la invención o su derivado se usa en la fabricación de un medicamento, siendo formulado generalmente en un vehículo apropiado o excipiente tal como, p. ej., solución salina fisiológica, y preferiblemente administrado intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, oralmente o intranasalmente, en una dosis que proporcione una inhibición adecuada de un compuesto de la invención o su derivado ligando al receptor PTH-1. La dosis típica sería de 1 ng a 10 mg del péptido por peso corporal de kilogramo por día.

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Los compuestos de la invención también pueden ser usados en un método para tratar la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención o su derivado, suficiente para activar el receptor PTH-1 de dicho paciente. Pueden ser usadas dosis similares y la administración como se describe más arriba para el antagonista PTH/PTHrP, para la administración de un agonista de PTH/PTHrP, p. ej., para el tratamiento de condiciones tales como la osteoporosis, otros desórdenes metabólicos de los huesos e hipoparatiroidismo y desórdenes relacionados.

Habiendo descrito ahora totalmente la invención, la mismo será más fácilmente entendida en cuanto a los ejemplos específicos que son proporcionados mediante la ilustración, y se entiende que no son restrictivos de la invención, a menos que se especifique en este documento.

Introducción a los ejemplos

La unión de afinidad alta de la hormona paratiroidea al receptor tipo 1 de PTH (receptor de PTH-1) y la inducción subsecuente de la activación del receptor implica sitios múltiples de la interacción ligando-receptor. El análisis de fragmentos de péptidos de longitud variante definieron ampliamente las regiones dentro de la molécula de PTH totalmente activa (1-34) que contiene los determinantes principales del la afinidad de unión del receptor y la potencia estimulante de cAMP (Nussbaum, S. R., et al., J. Biol. Chem. 255:10183-10187 (1980); Rosenblatt, M., et al., Endocrinology 107:545-550 (1980); Tregear, G. W., et al., Endocrinology 93:1349-1353 (1973)). Estos estudios representaban las funcionalidades a las partes del extremo N-terminal y C-terminal del péptido, respectivamente. Las deleciones de los residuos N-terminal, en particular, los residuos 1-6, produce péptidos que se unen eficazmente al receptor, pero dejan de estimular la producción de cAMP, y así proporcionaron la base para el desarrollo de la mayor parte de antagonistas del receptor PTH-1 (Horiuchi, N., et al., Science 220:1053-1055 (1983)). Las deleciones desde el extremo C-terminal de PTH (11-34) produce péptidos que no se unen de forma detectable al receptor, y fragmentos cortos que contienen sólo los residuos del extremo C-terminal {p. ej. PTH (15-34)} se unen débilmente al receptor (kD \sim 4 M), pero son inactivos en los ensayos de respuesta de cAMP (Caulfield, M. P., et al., Endocrinology 127:83-87 (1990); Abou-Samra, A.-B., et al., Endocrinology 125:2215-2217 (1989)). En contraste, los fragmentos que contienen sólo los residuos del extremo N-terminal y más corto de longitud que PTH (1-27) fueron encontrados previamente que eran inactivos en la unión del receptor o en ensayos de señalización (Nussbaum, S. R., et al., J. Biol. Chem. 255:10183-10187 (1980); Rosenblatt, M. (1981) en Pathobiology Annual, volumen 11, Ioachim, H. L., ed., Raven Press, Nueva York (1981), pp. 53-58).

El receptor PTH-1 es un receptor acoplado a la proteína G clase II que, bajo la activación agonista, estimula fuertemente la ruta de señalización la adenilil ciclasa proteína quinasa A (Segre, G. V., y Goldring, S. R., Trends in Endo. Metab. 4:309-314 (1993); Kolakowski, L. F., Receptors & Channels 2:1-7 (1994); Jüppner, H., et al., Science 254:1024-1026 (1991)). Se piensa que el gran dominio extracelular del extremo amino-terminal del receptor (167 aminoácidos) proporciona la unión principal o el sitio de acoplamiento para las partes del extremo C-terminal de PTH (1-34), mientras que se piensa que la parte del receptor que contiene los siete dominios transmembrana y bucles extracelulares se relaciona con la parte de señalización del extremo N-terminal del ligando (Mannstadt, M., et al., J. Biol. Chem. 273:16890-16896 (1998); Bergwitz, C., et al., J. Biol. Chem. 272:28861-28868 (1997); Hoare, S., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 289:1323-1333 (1999)). Este esquema bipartito para la interacción receptor de PTH-PTH es apoyado por un cuerpo considerable de datos tanto de estudios mutacionales como de reticulación (Bergwitz, C., et al., J. Biol. Chem. 272:28861-28868 (1997); Bergwitz, C., et al., J. Biol. Chem. 271:26469-26472 (1996); Bisello, A., et al., J. Biol. Chem. 273:22498-22565 (1998)) y probablemente será verdadero para los otros receptores clase II (Dong, M., et al., J. Biol. Chem. 274:903-909 (1999); Holtmann, M., et al., J. Biol. Chem. 270:14394-14398 (1995); Holtmann, M. H., et al., J. Pharmacol. Exp Ther. 279:555-560 (1996); Stroop, S., et al., Biochem. 34:1050-1057 (1995)). Sin embargo, este esquema es mejor visto como una simplificación gruesa de lo que probablemente será un problema complejo que implica una gran red de interacciones que en toto determina la afinidad de unión agonista plena y la potencia de señalización.

A causa de los papeles importantes que el receptor PTH-1 y sus dos agonistas, PTH y el péptido relacionado con PTH juegan en la homeostasis del calcio y el desarrollo del hueso (Kronenberg, H., et al., en Genetics of Endocrine and Metabolic disorders, Thakker, R., ed., Chapman & Hall, Londres (1997), pp. 389-420), y el conocimiento de que PTH y PTHrP tienen efectos anabólicos en el hueso (Dempster, D. W., et al., Endocr. Rev 14:690-709 (1993); Dempster, D. W., et al., (errata publicada), Endocr. Rev 15:261 (1994); Roe, E., et al., J Bone Mineral Res. 14 (Supl. 1):S137 (1999); Plotkin, H., et al., J. Clin. Endocrinol. & Metabol. 83:2786-2791 (1998)), hay un interés considerable en desarrollar agonistas del receptor PTH-1 como la terapéutica para enfermedades óseas tales como la osteoporosis. Un péptido tal como PTH (1-34) no es ideal para fines terapéuticos porque su gran tamaño no es adecuado para rutas de administración no parenterales. Además, las moléculas peptídicas mucho más grandes que 5 aminoácidos no son adecuadas como puntos de partida en estrategias de diseño de medicinas racionales dirigidas al desarrollo de miméticos de pépticos. Sin embargo, una estrategia en la cual la longitud de cadena mínima de PTH natural requerida para la activación del receptor es determinada, y luego posteriormente optimizada y además reducida en el tamaño podría conducir potencialmente a nuevos agonistas del receptor de PTH-1 de bajo peso molecular. Para unas hormonas peptídicas moderadamente clasificadas, tales estrategias iterativas de minimización y optimización han resultado ser acertadas en el desarrollo de agonistas peptídicos "mimético" que son mucho más pequeños que la hormona parenteral (Kimura, T., et al., J. Biochem. 122:1046-1051 (1997); Cwirla, S. E., et al., Science 276:1696-1699 (1997); Wells, J. A., Science 273:449-450 (1996); Wrighton, N. C., et al., Science 273:458-464 (1996); Livnah, O., et al., Science 273:464-471 (1996); Li, B., et al., Science 270:1657-1660 (1995)).

Fue encontrado recientemente que en células transfectadas que expresan niveles altos del receptor PTH-1, la débil actividad de señalización del cAMP podría ser detectada para un péptido del extremo N-terminal tan corto como PTH (1-14) (Luck, M., et al., Molecular Endocrinology 13:670-680 (1999)).

La débil actividad relativa de este péptido puede ser reconciliada por la ausencia de la parte del extremo C-terminal de PTH (1-34) que se sabe que contiene residuos de unión del receptor importantes que sirven para anclar la hormona al receptor, probablemente "acoplando" el dominio amino-terminal del receptor. Esta noción está apoyada por la observación de que PTH (1-14) era tan potente con un receptor de PTH de rata truncado que carecía del dominio extracelular del extremo N-terminal como lo era con el receptor rPTH-1 intacto, mientras que, en contraste, PTH (1-34) era 1000 veces más débil con el receptor truncado que lo era con el receptor intacto (Luck, M., et al., Molecular Endocrinology 13:670-680 (1999)). Estas conclusiones, los fuertes efectos deletéreos en la activación que resultan de suprimir los residuos del extremo N-terminal, y la alta conservación evolutiva de estos aminoácidos, predicen que los péptidos PTH del extremo N-terminal cortos deberían relacionarse productivamente con el receptor, y además, si la afinidad de unión del receptor pudiera ser mejorada, entonces tales péptidos podrían ser agonistas totalmente potentes.

Los requerimientos de la cadena lateral para la activación del receptor en PTH (1-14) usa así este péptido como una estructura inicial para identificar nuevas modificaciones que i) realcen la actividad agonista con el receptor PTH-1; ii) permitan reducciones adicionales del tamaño del péptido e iii) fue estudiada la función como sondas del mecanismo de interacción ligando-receptor. Los resultados muestran que la potencia de PTH (1-14) puede ser sustancialmente mejorada en varias modificaciones, y que estos aumentos son debidos a interacciones con la parte del receptor que contiene los siete dominios transmembrana y los bucles extracelulares.

Ejemplo 1 Sustituciones únicas de aminoácidos en PTH (1-14)

El efecto de las sustituciones de aminoácidos únicas en PTH (1-14) fue inicialmente estudiado. Varios métodos usados en estos estudios son descritos más abajo.

Polipéptidos

Todos los polipéptidos en este estudio contenían una amida carboxi-terminal. Todos los análogos de (r)PTH(1-14)NH_{2} de rata {PTH (1-14)} y péptidos de PTH de longitud más corta fueron sintetizados en un sintetizador de péptidos múltiple (Advanced Chemtech Model 396 MBS) usando la química del grupo protector N-(9-fluorenil)metoxicarbonil (Fmoc) y corte mediado por TFA/desprotección (MGH Biopolymer Synthesis Facility, Boston, Mass.); y desalado por adsorción en un cartucho que contiene C18 (Sep-Pak). (h)PTH(1-34)NH_{2} [Tyr^{34}]humano {(hPTH (1-34)} y [Nle^{8,21}, Tyr^{34}]-rPTH (1-34)NH_{2} {rPTH (1-34)} fueron preparados en un sintetizador de péptidos modelo 431A de Applied Biosystems usando la misma química de Fmoc y corte mediado por TFA/desprotección; seguido de cromatografía líquida de alto resolución (HPLC). Todos los péptidos fueron reconstituidos en ácido acético 10 mM, y fueron almacenados a -80ºC. La pureza, la identidad y la concentración de reserva de cada compuesto fueron controladas por HPLC analítico, espectrometría de masas de MALDI y análisis de aminoácidos.

Cultivo de células

Las células fueron cultivadas a 37ºC en matraces T-75 (75 mm^{2}) en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (10%), penicilina G (20 unidades/ml), sulfato de estreptomicina (20 \mug/ml) y amfotericina B (0,05 \mug/ml) en una atmósfera humedecida que contenía de CO_{2} al 5%. Las soluciones madre de EGTA/tripsina y los antibióticos fueron de GIBCO; el suero bovino fetal fue de Laboratorios Hyclone (Logan, Utah). Las células fueron subcultivadas en placas de 24 pocillos y, cuando se alcanzó la confluencia, fueron tratados con medios recién preparados y fueron cambiados a 33ºC durante 12 a 24 h antes del ensayo (Bergwitz, C., et al., J. Biol. Chem. 272:28861-28868 (1997); Abell, A., et al., J. Biol. Chem. 271:4518-4527 (1996)).

Los derivados establemente transfectados de la línea celular de riñón porcino LLC-PK1, HKRK-B7 (Takasu, H., et al., J Bone Miner. Res. 14:11-20 (1999)) y hPR2-20, expresa los receptores PTH-1 humano y PTH-2 humano, respectivamente. La línea celular HKRK-B7 LLC-PK_{1} expresa el receptor hPTH-1 a \sim1x10^{6} receptores/célula (Takasu, H., et al., J. Bone Miner. Res. 14:11-20 (1999)), y la línea celular hPR2-22 LLC-PK1 expresa el receptor hPTH-2 a \sim0,8x10^{6} receptores/célula (proporcionado por H. Takasu y F. R. Bringhurst, Unidad Endocrina, Hospital General de Massachusetts).

La línea celular ROS 17/2.8 osteoblástica de rata (Majeska, R. J., et al., Endocrinology 107:1494-1503 (1980)) expresa los receptores PTH-1 endógenos a niveles de \sim80.000 por célula y la línea celular osteoblástica humana, SAOS-2, expresa los receptores PTH-1 endógenos a niveles de 30.000 por célula.

Mutagénesis del receptor

El receptor truncado, denominado en este documento como hCNt, o hDeINt, fue construido por mutagénesis dirigida de oligonucleótido (Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)) usando un cebador mutagénico y ADN de plantilla monocatenario que contiene uracilo derivado de HK-WT. Este receptor de mutante es suprimido para los residuos 24 a 181 y, asumiendo que la señal de corte de peptidasa ocurre entre Ala^{22} y Tyr^{3} (Nielsen, H., et al., Protein Engineering 10:1-6 (1997)), se predice que tiene Tyr^{3} como su residuo N-terminal unido a Glu^{182} localizado en o cerca del límite del primer dominio transmembrana. Una receptor de PTH de rata truncado similar fue publicado por los inventores recientemente (Luck, M., et al., Molecular Endocrinology 13:670-680 (1999)). Las secuencias de ADN del plásmido mutante fueron verificadas en una región de aprox. 600 nucleótidos que atraviesa el sitio de mutación usando el método de secuenciación de ciclo Taq DyeDeoxy Terminator de Applied Biosystems, con el análisis de muestra realizado en un secuenciador automatizado 377 PRISMA de ABI.

Células COS 7 y transfección de ADN

Las transfecciones pasajeras de células COS 7 con plásmidos derivados del vector pcADN-1 (InVitrogen, San Diego, California) que codifica el receptor hPTH-1 intacto (HK-WT) (Schipani, E., et al., Endocrinology 132:2157-2165 (1993)), o el receptor PTH-1 humano truncado, h\DeltaNt, fueron realizadas usando DEAE-dextrano como se ha descrito previamente (Bergwitz, C., et al., J. Biol. Chem. 272:28861-28868 (1997)). Las células COS 7 fueron transfectadas en placas de 24 pocillos cuando las células estaban del 85 al 95% de confluencia usando 200 ng de ADN del plásmido que fue purificado mediante centrifugación de gradiente con cloruro de cesio/bromuro de etidio para cada pocillo. Los ensayos fueron llevados a cabo de 72 a 96 horas después de la transfección. En estas condiciones aproximadamente el 20% de las células COS 7 se vuelve transfectada y expresan aproximadamente 5x10^{6} receptores de PTH superficiales intactos por célula en el momento del ensayo (Bergwitz, C., et al., J. Biol. Chem. 272:28861-28868 (1997)).

Estimulación de cAMP

La estimulación de células con análogos peptídicos fue realizada en placas de 24 pocillos. Las células fueron aclaradas con 0,5 mL de tampón de unión y fueron tratadas con 200 \muL de tampón de ensayo de cAMP (medio Eagle modificado de Dulbecco que contiene 3-isobutil-1-metilxantina 2 mM, 1 mg/mL de albúmina de suero bovino, Hepes-NaOH 35 mM, pH 7,4) y 100 \muL de tampón de unión que contiene cantidades variables del análogo peptídico (volumen final = 300 \muL). El medio fue quitado después de una incubación de 1 h a temperatura ambiente, y las células fueron congeladas (-80ºC), lisadas con 0,5 mL de HCl 50 mM, y fueron congeladas de nuevo (-80ºC). El contenido de cAMP del lisado diluido fue determinado por radioinmunoensayo. Cuando fue posible, los valores de EC_{50} de cAMP y respuesta máxima fueron determinados usando regresión no lineal (véase más abajo).

La acumulación de cAMP intracelular puede ser medida como se describe por Abou-Samra et al., J. Biol. Chem. 262:1129, 1986) u otros métodos conocidos para los expertos en la técnica. El cAMP intracelular es extraído descongelando las células en 1 ml de HCl 50 mM y es analizado por un radioinmunoensayo específico usando un anticuerpo anti-cAMP (p. ej., Sigma, San. Louis, Mo). Un análogo de cAMP (2'-O-monosuccinil-adenosin 3':5'-éster de metilo de monofosfato cíclico de tirosilo, obtenido de Sigma) que es usado como trazador para el cAMP se iodina por el método de cloramina T. El yodo libre es quitado adsorbiendo el análogo de cAMP yodado en un cartucho C18 Sep-pak (Waters, Milford, Mass.). Después de lavar con dH_{2}O, el análogo de cAMP yodado se eluye del cartucho Sep-pak con acetonitrilo al 40% (ACN) y ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA). El análogo de cAMP yodado se liofiliza, se reconstituye en 1 ml de TFA al 0,1%, se inyecta en una columna C 18 de fase inversa de HPLC (Waters). La columna se equilibra con ACN al 10% en TFA al 0,1%, y se eluye con gradiente de ACN al 10-30% en TFA al 0,1%. Esto permite la separación del análogo de cAMP mono-yodado del análogo de cAMP no yodado. El trazador es estable hasta 4 meses cuando se almacena a -20ºC. El estándar usado para el ensayo, adenosin 3':5'-monofosfato cíclico, se compra en Sigma. Las muestras (1-10 82 l de extractos de HCl) o estándares (0,04-100 fmol/tubo) son diluidas en Na-acetato 50 mM (pH 5,5), y acetiladas con 10 \mul de mezcla de trietilamina y anhídrido acético (2:1 vol:vol). Después de la acetilación, se añade antisuero de cAMP (100 \mul) de una solución madre (1:4000) hecha en PBS (pH 7,4), EDTA 5 mM y suero de conejo normal al 1%. El trazador es diluido en PBS (pH 7,4) con BSA al 0,1%, y añadido (20.000 cpm/tubo). El ensayo se incuba a 4ºC durante la noche. El trazador ligado se precipita añadiendo 100 \mul de antisuero anticonejo de cabra (1:20 en PBS) y 1 ml de polietilenglicol al 7% (PM 5000-6000), centrifugando a 2000 revoluciones por minuto durante 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante se quita y la radiactividad ligada se cuenta en un contador gamma (Micromedic). Para calcular los datos de cAMP, los cálculos logit fueron realizados en hojas de cálculo Excel. Típicamente, la sensibilidad del ensayo es 0,1 fmol/tubo, y la concentración estándar que desplaza el 50% del trazador es 5 fmol/tubo.

Ensayos de unión

Fueron realizadas reacciones de unión con células HKRK-B7 establemente transfectadas en placas de 24 pocillos. Las células fueron aclaradas con 0,5 mL de tampón de unión (Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, suero de caballo inactivado con calor del 5%, suero bovino fetal del 0,5%, ajustado a pH 7,7 con HCl), y fueron tratadas sucesivamente con 100 \muL de tampón de unión, 100 \muL de tampón de unión que contenía varias cantidades del ligando competidor no marcado, y 100 \muL de tampón de unión que contenía aprox. 100.000 cpm de ^{125}I-tPTH (1-34) (aprox. 26 fmol). Las incubaciones (volumen final = 300 \muL) estuvieron a 15ºC durante 4 h. Las células fueron colocadas entonces en hielo, fue quitado el medio de unión y la monocapa fue aclarada tres veces con 0,5 mL de tampón de unión frío. Las células fueron posteriormente lisadas con 0,5 mL de NaOH 5N y fueron contadas según su radiactividad. La unión no específica para cada experimento fue determinada por competición con una dosis 1 \muM de rPTH no marcado (1-34). La unión específica máxima (B_{0}) fue la radiactividad total ligada en ausencia del ligando de PTH no marcado, corregido para la unión no específica. Los valores de unión de IC_{50} fueron determinados usando regresión no lineal (véase más abajo).

Cálculo de datos

Todos los cálculos fueron realizados usando Microsoft Excel. El análisis de regresión no lineal de los datos de estimulación de cAMP fue realizado usando parámetros, definidos como el Mínimo, Máximo, E_{max}, punto mediano (EC_{50}) y la pendiente de la curva respuesta. La respuesta predicha (y_{p}) para una dosis dada (x) de péptido fue calculada usando la ecuación siguiente: y_{p} = Min + [(Max - Min)/(1 + (EC_{50}/x)^{pendiente}). Los valores del parámetro inicial fueron estimados a partir de los datos primarios, y la "función solucionadora" del Excel fue usada entonces para variar los cuatro parámetros a fin de minimizar las diferencias entre las respuestas predichas y las reales (método de mínimos cuadrados) (Bowen, W., y Jerman, J., Trends in Pharmacol. Sci. 16:413-417 (1995)). El significado estadístico entre dos juegos de datos fue determinado usando la prueba t de Student de una cola, asumiendo varianzas desiguales para los dos juegos.

Las sustituciones de aminoácidos en PTH (1-14) fueron descubiertas en un rastreo de 137 análogos sintéticos de PTH (1-14) que cada uno tenía una sola sustitución. Las sustituciones fueron elegidas por una estrategia de "sustitución tipo" en la cual al menos uno de cada tipo de los 20 aminoácidos naturales, y al menos un enantiómero D fue introducido en cada posición en la secuencia 1-14. Cada uno de los péptidos que resultan fue examinado por su capacidad de estimular la formación de cAMP en un análisis de dosis individual en células HKRK-B7.

Como se muestra en la Figura 1, la mayor parte de sustituciones, en particular en el segmento (1-9), produjeron péptidos que eran inactivos, pero algunos condujeron a péptidos que eran casi tan activos como PTH natural (1-14) y unos cuantos causaron el realce de la respuesta de señalización (Figura 1). El análisis dosis-respuesta indicó que estas pocas sustituciones simples mejoraron la potencia en varias veces, con relación a PTH natural (1-14) (no mostrado).

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Ejemplo 2 Sustituciones combinadas de aminoácidos en PTH (1-14)

Varias de las susodichas sustituciones que realzan la actividad fueron primero combinadas por parejas para probar los posibles efectos aditivos en la actividad. Cada péptido mutante doble (Figura 2A) era más potente que el otro péptido parenteral individualmente alterado (no mostrado). Igualmente, cada ligando mutante triple era más potente que el ligando del mutante doble o simple correspondiente que contenía las mismas sustituciones (Figura 2B) (Comparar las Figura 2A a 2B). Finalmente, los péptidos PTH (1-14) que contenían cuatro sustituciones de aminoácidos (péptidos Nº. 1 y 3) o cinco sustituciones de aminoácidos (péptido Nº. 2) fueron los péptidos PTH (1-14) más eficaces probados y fueron de 160 a 220 veces más potentes que PTH (1-14) natural en células HKRK-B7 (Figura 2C; Tabla 2).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Respuestas de cAMP dependiente de ligando en células LLC-PK1 estables

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\quad: El análisis de dosis-respuesta para la producción de cAMP fue realizado con los péptidos indicados en células LLC-PK1 transfectadas estables con el receptor (h) PTH-1 humano (células HKRK-B7) o el receptor hPTH-2 (células P2R-22), como se describe en el texto.

\quad: rPTH natural (1-14) - AVSEIQLMHNLGKH (SEQ. ID NO: 17).

\quad: hPTH natural (1-14) - SVSEIQLMHNLGKH (SEQ. ID NO: 14).

\quad: rPTH natural (1-34) - AVSEIQLMHNLGKHLASVERMQWLRKKLQDVHNF (SEQ. ID NO: 18).

\quad: hPTH natural (1-34) - SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ. ID NO: 19).

\quad: (Véase Potts et al., J. Endocrinol. 154: S15-S21, 1997)

\quad: *Los valores de EC_{50} y la respuesta máxima correspondiente (Emax) (promedio \pm SEM) fueron derivados de las ecuaciones de regresión no lineal de cuatro parámetros usados para ajustar los datos de la curva. En estos cálculos, Emax fue limitado a dentro de (\pm) 1 desviación estándar de la respuesta observada para rPTH (1-34) en 100 nM.

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Ejemplo 3 Substituciones de aminoácidos en polipéptidos más cortos que PTH (1-14)

Fue encontrado previamente que los análogos de fragmento de PTH de rata naturales, PTH (1-13), PTH (1-12) PTH (1-11) PTH (1-10) y PTH (1-9) inducian poca o ninguna respuesta de cAMP en células HKRK-B7 (Luck, M. et al., Mol. Endocrinol. 13:670-680 (1999)). Sin embargo, cuando todas o algunas de las sustituciones del péptido Nº. 1 fueron transpuestas en estos péptidos más cortos, como en los péptidos Nº. 4, Nº. 5 y Nº. 6, la actividad de señalización fue entonces fácilmente observada (Figura 3, Tabla 1). Esta es la primera indicación de que un péptido tan pequeño como de 11 aminoácidos (péptido Nº. 6) puede estimular una respuesta de cAMP con el receptor PTH-1; y hasta el análogo [A3, Q10] rPTH (1-10) derivó alguna actividad (Figura 3). Nótese que no fueron observados para la mayor parte de los péptidos de longitud más corta en este estudio máximos de respuesta claros; las estimaciones de las respuestas máximas (Emax) y los correspondientes valores de EC50 para estos péptidos fueron obtenidos a partir de los cálculos de regresión no lineal usados para el ajuste de los datos de la curva.

Ejemplo 4 Sustituciones de aminoácidos en PTH (1-34)

Para determinar si estas sustituciones podrían realzar la actividad de PTH (1-34), las sustituciones de Ser3 -> Ala, Asn10 -> Ala, Leu11 -> Arg y Gly12 -> Ala fueron introducidas en el análogo [Ala1, Tyr34] hPTH (1-34) para proporcionar el péptido Nº. 7. En células HKRK-B7 este péptido era aprox. 2 veces más potente que los dos controles, rPTH (1-34) y hPTH (1-34) (Tabla 2). Los estudios de unión competitivos realizados en células HKRK-B7 con el radioligando trazador ^{125}I-rPTH (1-34) y dosis variables del péptido Nº. 7 indicaron una mejora de aprox. 2 veces conmensurada de la afinidad de unión, comparado con rPTH (1-34) (Figura 4).

Ejemplo 5 Estimulación del receptor PTH-2

El subtipo del receptor PTH-2 responde selectivamente a PTH (1-34) y no PTHrP (1-34) (Usidin et al., J. Biol. Chem. 270:15455-15458 (1995)). Aunque, el papel fisiológico del subtipo del receptor no sea conocido es ampliamente expresado, en particular en el cerebro, aorta y páncreas (Usidin et al., J. Biol. Chem. 270:15455-15458 (1995)). El PTH (1-14) natural no estimuló al receptor PTH-2 expresado en células LLC-PK1; sin embargo, el péptido Nº. 1 era activo en estas células (Figura 5, Tabla 1), aunque su potencia fuera todavía de cuatro a cinco órdenes de magnitud más débil que la de PTH (1-34) (Figura 5, Tabla 2). Así, el péptido Nº. 1 es un agonista débil del receptor PTH-2.

Ejemplo 6 Estimulación de PTH (-14) de células COS-7

Varios de los análogos de PTH (1-14) fueron examinados por su actividad en células COS-7 pasajeramente transfectadas con el receptor WT-hPTH-1 (Figura 6A, Tabla 3). Como se ve en células HKRK-B7, cada análogo era más potente que PTH natural (1-14) en la estimulación de la producción de cAMP. Las mejoras similares de la potencia fueron observadas en células COS-7 transfectadas con h\DeltaNt (hDeINt), un receptor de hPTH-1 mutante truncado que carece de la mayor parte del dominio extracelular amino-terminal (Figura 6B, Tabla 3). De forma importante, el péptido Nº. 7 fue drásticamente más potente que rPTH (1-34) o hPTH (1-34) en células COS-7 que expresan h\DeltaNt (compárense los paneles A y B de la Figura 6, Tabla 3). La incapacidad de detectar una mejora grande de la potencia de señalización del péptido Nº. 7 en estudios realizados con el receptor PTH intacto no se entiende, pero puede reflejar un límite en la capacidad de distinguir entre agonistas muy eficaces en estos sistemas de células sensibles (Colquhoun, D. Br. J. Pharmacol. 125:924-947 (1998)). Estos péptidos, sin embargo, pueden ser distinguidos con h\DeltaNt, un sistema célula/receptor que es intrínsecamente mucho más débil que aquel en el cual los receptores de PTH intactos son sobreexpresados. En cualquier caso, los resultados con h\DeltaNt confirman que el péptido Nº. 7 es, en efecto, más potente que hPTH (1-34) o rPTH (1-34), y demuestran que los niveles relativos de eficacia y potencia entre análogos pueden variar según el sistema farmacológico empleado.

TABLA 3 Estimulación de cAMP con receptores PTH-1 intactos y truncados en células COS-7

3

\quad: El análisis dosis-respuesta para la producción de cAMP fue realizado con los péptidos indicados en células-COS 7 pasajeramente transfectadas con el receptor WT hPTH-1 o con el receptor truncado, hDeINt, como se describe en el texto. Los valores de EC50 y de respuesta máxima correspondientes (Emax) (Promedio \pm SEM) fueron derivados a partir de las ecuaciones de regresión no lineal de cuatro parámetros usadas para ajustar los datos de la curva. En estos cálculos, Emax fue limitado a dentro de (\pm) 1 desviación estándar de la respuesta observada para rPTH (1-34) a 100 nM para WT, y el péptido Nº. 7 (20 \muM) para hDeINt.

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Ninguno de los péptidos de esta invención indujo una respuesta de cAMP en células LLC-PK1 no transfectadas o en células COS-7 no transfectadas (datos no mostrados) indicando que los efectos observados eran debidos a interacciones específicas con el receptor PTH-1.

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Ejemplo 7 Estimulación de células ROS-17/2.8 y SAOS por derivados de PTH (1-14)

Los péptidos claves de este estudio fueron probados por su actividad en dos líneas celulares que fueron establecidas directamente a partir de osteoblastos, la célula primaria que construye hueso en los vertebrados. Estas líneas de células, ROS 17/2.8 (33) y SAOS-2, han sido ampliamente usadas en el campo de la PTH para investigar los efectos de análogos de PTH en células óseas. Las respuestas observadas para los péptidos en estas células acercó estrechamente de forma paralela las respuestas observadas en las células pasajeramente o establemente transfectadas con el receptor PTH-1 (Figuras 7A y B, Tabla 4).

TABLA 4 Respuestas de cAMP ligando-dependientes en osteoblastos

4

\quad: El análisis de dosis-respuesta para la producción de cAMP fue realizado con los péptidos indicados en las líneas de células osteoblásticas, ROS 17/2.8 y SAOS-2, como se describe en el texto. Los valores de EC50 y la respuesta máxima correspondiente (Emax) (Promedio \pm SEM) fueron derivados a partir de ecuaciones de regresión no lineal de cuatro parámetros usadas para ajustar los datos de la curva. En estos cálculos, Emax fue limitado a dentro de (\pm) 1 desviación estándar de la respuesta observada para rPTH (1-34) (100 nM).

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Resumen de los Ejemplos 1-7

La actividad del análogo fue primero evaluada en células LLC-PK-1 que expresan establemente el receptor hPTH-1 humano. La mayor parte de las sustituciones en las posiciones intolerantes abolieron la actividad estimulante de cAMP. En contraste, la mayor parte de sustituciones en las posiciones tolerantes eran compatibles con la función, y algunos, (Ser3 -> Ala; Asn10 -> Gln, Asp, Ala; Leu11 -> Arg o Lys; Gly12 -> Ala o Arg; y His14 -> Trp o Phe) realzaron la actividad. Fueron sintetizados entonces análogos de PTH (1-14) que tienen varias combinaciones de sustitución potenciadora de la actividad. Cada uno de estos análogos era más potente que PTH natural (1-14), y los efectos de las sustituciones eran aditivas. Así, [A^{3}, A^{10}, R^{11}, A^{12}]rPTH (1-14)amida fue el análogo más activo de las pruebas, y era 100 veces más potente que PTH natural (1-14). El objeto de esta invención es proporcionar otros análogos de
PTH.

La formación de cAMP estimulado con PTH natural (1-14) en células COS-7 que expresan un receptor PTH-1 truncado rP1R-\DeltaNt, que carece de la mayor parte del dominio extracelular amino-terminal. Cada una de las susodichas sustituciones que realzan la actividad mejoraron la actividad de PTH (1-14) con rp1r-\Deltant.

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Además, el péptido Nº. 1 era activo en células que expresaban el receptor PTH-2 (Ejemplo 5) y era activo en osteoblastos (Ejemplo 7), junto con los péptidos Nº. 2, 6 y 7. Además, PTH (1-34) con sustituciones claves en la región 1-14 era más potente que el control de PTH (1-34) en varias de las líneas celulares examinadas.

Así, estas modificaciones de aminoácidos mejoran las interacciones, directamente o indirectamente, con la región trans-membrana/bucle extracelular del receptor. Los estudios de relación de la actividad con la estructura de PTH (1-14) podrían conducir a agonistas del receptor de PTH-1 más potentes, de bajo peso molecular, así como a nuevos descubrimientos en el mecanismo de interacción ligando-receptor.

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Ejemplo 8 Estimulación del crecimiento óseo

Un ácido nucleico que codifica un derivado de PTH tal como, por ejemplo, aquel de SEQ ID NO:1, es transferido en células óseas in situ. Las técnicas para llevar a cabo esto son descritas en la patente de EE.UU. Nº. 5.763.416. Estas células pueden ser usadas entonces para estimular las células progenitoras y promover el crecimiento del hueso, la reparación y la regeneración in vivo. Los protocolos de transferencia de genes para llevar a cabo esto son conocidos por los expertos en la técnica y pueden ser usados si es necesario llevar a cabo el objetivo deseado. Los objetivos de tal procedimiento incluyen inter alia, tratar varias enfermedades y defectos relacionados con los huesos, tales como la prevención de fracturas, la promoción de la reparación de fracturas, el uso en relación a implantes y en el tratamiento de la osteoporosis y la osteogenesis imperfecta.

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Ejemplo 9 Métodos para tratar la osteoporosis

La administración subcutánea de PTH (1-34) en combinación con el tratamiento con estrógenos oral causa aumentos de la densidad ósea para la osteoporosis postmenopáusica. (Resumen Nº. 1019, 1999 American Society of Bone and Mineral Research Meeting, 30 de septiembre-4 de octubre, 1999). Los derivados de PTH de la invención reivindicada también deben ser eficaces en este aspecto. El derivado del polipéptido PTH es proporcionado al paciente, subcutáneamente, parenteralmente o por insuflación nasal en cantidades suficientes para disminuir la pérdida de hueso debido a la osteoporosis. La administración subcutánea del derivado de PTH puede ser administrada si es necesario, por ejemplo, diariamente a 400 UI/día. El estrógeno oral puede complementar la administración del derivado de PTH, por ejemplo, en 800 UI diarias.

La invención también describe la administración de un vector que comprende el ADN que codifica un derivado del polipéptido PTH. El vector es administrado ex vivo o in vivo y es proporcionado en una cantidad suficiente para proporcionar un nivel eficaz de PTH en el paciente o para aumentar el cAMP en células que tienen receptores de PTH. Un nivel "eficaz" es aquel nivel de PTH que es producido en un paciente sano o aquel nivel necesario para sustituir la pérdida de hueso en un paciente en necesidad de tal reemplazo.

O bien, el ADN que codifica el derivado de PTH es introducido en unas células cultivadas usando un retrovirus para crear células que secretan PTH. Las células que secretan PTH son trasplantadas entonces en un paciente en necesidad de tal tratamiento para proporcionar niveles de suero del derivado de PTH.

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Conclusiones

Se describe una nueva familia de análogos de PTH que son los péptidos más pequeños conocidos capaces de activar el receptor de PTH-1. Estos péptidos contienen una o varias de las sustituciones claves siguientes: Ser3 -> Ala,
Asn10 -> Ala o Gln; Leu11 -> Arg, Gly12 -> Ala e His14 -> Trp y rango en tamaños de PTH (1-14) a PTH (1-11). Incluso PTH (1-10) que contiene Ser3 -> Ala y Asn10 -> Ala o Gln es encontrado que es activo. Estos análogos eran activos en la estimulación de la formación de cAMP en osteoblastos derivadas de hueso. La potencia de estos péptidos, y su pequeño tamaño indican que deben ser útiles para tratar enfermedades óseas, tales como la osteoporosis.

Un análogo de PTH (1-34) que contiene las mismas sustituciones de aminoácidos claves (Péptido Nº. 7) es más potente que rPTH (1-34) y hPTH (1-34). El péptido Nº. 7 también debe tener utilidad en el tratamiento de la osteoporosis, ya que se ha mostrado que el péptido más débil, hPTH natural (1-34), en combinación con estrógenos, tiene drásticos efectos anabólicos en el hueso en mujeres postmenopáusicas (22).

Se piensa que los determinantes principales de la unión del receptor y la señalización de cAMP en PTH residen dentro de la parte del extremo N-terminal y C-terminal de PTH (1-34), respectivamente. Consecuente con esto, fue demostrado recientemente que PTH (1-14) puede estimular una respuesta de cAMP débil en células que expresan niveles altos de los receptores PTH-1 {EC_{50} \sim 100 \muM vs. \sim 3 nM para PTH (1-34)} (Luck, M. D., et al., Mol. Endocrin. 13:670-680, (1999)). Para identificar los determinantes de señalización del receptor en PTH (1-14), y mejorar potencialmente la potencia, fueron sintetizados 137 análogos de PTH (1-14) individualmente sustituidos funcionalmente evaluados en células LLC-PK1 que expresaban establemente el receptor hPTH-1. Aunque la mayor parte de sustituciones disminuyeran o anularan la actividad estimuladora de cAMP, algunos (p. ej. Ser3 -> Ala, Asn10 -> Ala; Leu11 -> Arg, Gly12 -> Ala e His14 -> Trp) potenciaron la actividad de 2 a 5 veces. Estos efectos potenciadores fueron aditivos, tal que [A^{3}, A^{10}, R^{11}, A^{12}]rPTH (1-14)amida (Péptido Nº. 1) [A^{3}, A^{10}, R^{11}, A^{12}, W^{14}]rPTH (1-14)amida (Péptido Nº. 2) fueron 160 y 220 veces más potentes que el PTH natural (1-14), respectivamente. El PTH (1-34), o análogos de PTH (1-11) que contienen unos o todas de estas sustituciones exhibieron una potencia realzada, con relación al péptido de control no modificado. El péptido Nº. 1 fue 100 veces más potente que PTH (1-14) natural cuando se prueba en un receptor de hPTH-1 truncado que carece de la mayor parte del dominio amino-terminal. Los resultados demuestran que la región (1-14) de PTH contiene un dominio central de activación crítica que se relaciona con la región de bucle de dominio transmembrana/región de bucle extracelular del receptor, y que esta interacción puede ser optimizada para proporcionar agonistas de péptido corto de potencia más alta.

<110> The General Hospital Corporation

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<120> Derivados polipéptidos de la hormona paratiroidea (PTH)

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<130> 0609.482PC01

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<140> PCT/US00/04716

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<141> 25-02-2000

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<150> US 60/156,927

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<151> 29-09-1999

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<160> 31

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (10)

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<223> Xaa puede ser Ala, Asp o Gln

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (11)

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<223> Xaa puede ser Leu, Arg, u homoArg

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (12)

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<223> Xaa puede ser Arg o Ala

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (14)

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<223> Xaa puede ser Phe o Trp

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<400> 1

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<210> 2

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (10)

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<223> Xaa puede ser Ala o Gln

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (14)

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<223> Xaa puede ser Trp o His

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 6

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<210> 7

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 7

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<210> 8

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 8

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<210> 9

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 9

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<210> 10

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 10

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<210> 11

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 11

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<210> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<400> 13

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<210> 14

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

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<210> 15

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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<210> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (10)

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<223> Xaa puede ser Ala o Asp

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (11)

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<223> Xaa puede ser Leu, Arg u homoArg

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (12)

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<223> Xaa puede ser Arg o Ala

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (14)

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<223> Xaa puede ser Phe o Trp

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (34)

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<223> Xaa puede ser Phe o Tyr

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<400> 16

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<210> 17

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 17

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<210> 18

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<211> 34

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 18

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<210> 19

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<211> 34

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Ala o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Leu, Arg u homoArg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Phe o Trp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Phe o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Ala o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Leu, Arg u homoArg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Phe o Trp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Ala o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Leu, Arg u homoArg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Phe o Trp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Ala o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Leu, Arg u homoArg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Phe o Trp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Ala o Asp

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Leu, Arg u homoArg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

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<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Phe o Trp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Ala o Asp

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<220>

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<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Leu, Arg u homoArg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

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<222> (12)

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<223> Xaa puede ser Arg o Ala

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (14)

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<223> Xaa puede ser Phe o Trp

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (10)

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<223> Xaa puede ser Ala o Asp

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

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<223> Xaa puede ser Leu, Arg u homoArg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POCO FIABLE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

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<223> Xaa puede ser Arg o Ala

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (14)

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<223> Xaa puede ser Phe o Trp

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido de la PTH modificada

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (10)

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<223> Xaa puede ser Ala o Asp

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (11)

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<223> Xaa puede ser Leu, Arg u homoArg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (12)

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<223> Xaa puede ser Arg o Ala

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (14)

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<223> Xaa puede ser Phe o Trp

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<220>

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<221> POCO FIABLE

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<222> (19)

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<223> Xaa puede ser Arg o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm36

Claims

1. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste en AlaValAlaGlulleGlnLeuMetHisX_{01}X_{02}X_{03}
LysX_{04} (SEQ ID NO: 1), en la que:

X_{01} es Ala, Asp o Gln;

X_{02} es Leu, Arg o homoArg;

X_{03} es Arg o Ala; y

X_{04} es Phe o Trp.

2. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido es un agonista de PTH-1.

3. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en AlaValAlaGluIleGlnLeuMetHisX_{01},Arg
AlaLysX_{02} (SEQ ID NO:2), en la que;

X_{01} es Ala, Asp o Gln; y

X_{02} es Trp o His.

4. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85% idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido es un agonista de PTH-1.

5. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias que consiste en:

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

6. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho polipéptido contiene una amida C-terminal.

7. Un fragmento del polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicho fragmento comprende los aminoácidos 1-9, 1-10, 1-11, 1-12 ó 1-13.

8. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicho péptido es marcado por un marcador seleccionado del grupo que consiste en: un radiomarcador, un marcador fluorescente, un marcador bioluminiscente o un marcador quimioluminiscente.

9. El polipéptido de la reivindicación 8, en el que dicho radiomarcador es ^{99m}Tc.

10. Una composición farmacéutica que comprende:

1.: un polipéptido de la reivindicación 1; y

2.: un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

12. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la reivindicación 5.

13. Una molécula de ADN recombinante que comprende: (1) una región control de expresión, dicha región operativamente unida a (2) una secuencia de polinucleótidos que codifica para el polipéptido de la reivindicación 1.

14. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 13, en el que dicha región de control incluye a un promotor bacteriano, viral, fúngico o mamífero.

15. Un método para preparar un polipéptido, que comprende introducir el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 11-14 en un huésped y expresar el polipéptido codificado por dicho ácido nucleico.

16. Un método para preparar un vector recombinante que comprende insertar una molécula de ácido nucleico cualquiera de las reivindicaciones 11-14 en un vector.

17. Una célula huésped procariótica o eucariótica que contiene la molécula de ADN recombinante de la reivindicación 13 o la reivindicación 14.

18. La célula de la reivindicación 17 que es bacteriana.

19. La célula de la reivindicación 17 que es una célula de levadura o una célula de mamífero.

20. El uso de un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de condiciones mamíferas caracterizadas por disminuciones en la masa ósea.

21. Un método para determinar tasas de reformación de hueso, resorción ósea y/o remodelación ósea que comprende determinar ña captación de un polipéptido de la reivindicación 1 en el hueso de un paciente.

22. El uso de una molécula de ADN que codifica un polipéptido de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de condiciones mamíferas caracterizadas por disminuciones en la masa ósea.

23. El uso de la reivindicación 20 o la reivindicación 22, en el que la condición que se trata es la osteoporosis.

24. El uso de la reivindicación 23, en el que dicha osteoporosis es osteoporosis de la vejez.

25. El uso de la reivindicación 23, en el que dicha osteoporosis es osteoporosis postmenopáusica.

26. El uso de la reivindicación 20, en el que dicho medicamento provee dicho polipéptido para aumentar la masa ósea en una dosis de 0,01 \mug/kg/día a aproximadamente 1,0 \mug/kg/día.

27. El uso de la reivindicación 20, en el que el medicamento es diseñado para ser administrado parenteralmente.

28. El uso de la reivindicación 20, en el que el medicamento es diseñado para ser administrado subcutáneamente.

29. El uso de la reivindicación 20, en el que el medicamento es diseñado para ser administrado por insuflación nasal.

30. Un método para aumentar el cAMP en una célula mamífera que tiene receptores de PTH-1, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad suficiente del polipéptido de la reivindicación 1 para aumentar el cAMP.

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31. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos:

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en el que X_{01} es Ala Asp; X_{02} es Leu o Arg; X_{03} es Arg o Ala; X_{04} es Phe o Trp; y X_{05} es Phe o Tyr.