JP2003511014A - 副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）のポリペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規な副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ポリペプチド誘導体が開示され、このポリペプチドを含む薬学的組成物、ならびにこのポリペプチドを作製するための合成方法および組換え方法も開示される。このポリペプチドを含む治療的に有効な薬学的組成物を使用して骨質量の減少によって特徴づけられる哺乳動物の状態を処置するための方法もまた開示される。副甲状腺ホルモンレセプター作用に対するアンタゴニスト効果またはアゴニスト効果について、本発明の候補化合物をスクリーニングするための方法もまた、開示される。上記化合物についての診断方法および治療方法もまた、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （連邦政府の援助による研究および開発の下でなされた発明に対する権利の陳
述） 本発明の開発中に行われた研究の一部は、米国政府基金を利用した。米国政府
は、本発明において特定の権利を有する。

【０００２】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、新規な副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ポリペプチド誘導体、このＰＴ
Ｈ誘導体をコードする核酸ならびにＰＴＨ誘導体を調製する方法およびＰＴＨ誘
導体を使用する方法に関する。

【０００３】 （関連技術の説明） （副甲状腺ホルモン） 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、主要な標的細胞が骨および腎臓中に見出され
るカルシウムホメオスタシスの主要なレギュレーターである。ネイティブなヒト
副甲状腺ホルモンは、８４アミノ酸のポリペプチドである。これは、低血液カル
シウムレベルに応答して上皮小体から分泌し、そして骨の骨芽細胞（骨構築細胞
）においてそして腎臓の尿細管上皮細胞において作用する。ホルモンは、ＰＴＨ
−１レセプターまたはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターと呼ばれる細胞表面レセプ
ター分子（これは、骨芽細胞と尿細管細胞の両方によって発現される）と相互作
用する。ＰＴＨの断続的な用量の投与は、骨に対して強力な同化効果を有する。

【０００４】 ＰＴＨｒＰ（悪性の液性高カルシウム血症の主要な原因）はまた、発生におけ
る役割を含む正常な機能を有する。ＰＴＨｒＰは、１４１アミノ酸を有するが、
選択的遺伝子スプライシング機構から生じる改変体もまた、生じる。ＰＴＨｒＰ
は、ＰＴＨ−１レセプターへの結合もまた含むプロセスを通じる骨格の形成にお
ける重要な役割を果たす（Ｋａｒａｐｌｉｓ，Ａ．Ｃ．ら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ
Ｄｅｖ．８：２７７〜２８９（１９９４）およびＬａｎｓｋｅ，Ｂ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７３：６６３〜６６６（１９９６））。

【０００５】 カルシウム濃度の調節は、胃腸系、骨格系、神経系、神経筋系、および心血管
系の正常な機能に必要とされる。ＰＴＨの合成および放出は、血清カルシウムレ
ベルによって主に制御され；低レベルは、ホルモンの合成および放出の両方を刺
激し、そして高レベルは、ホルモンの合成および放出の両方を抑制する。次いで
、ＰＴＨは、カルシウム交換の３つの部位（腸、骨、および腎臓）にて、血液中
へのカルシウムの進入を直接的または間接的に促進することによって、血清カル
シウムレベルを維持する。ＰＴＨは、ビタミンＤの活性形態の腎臓での合成を助
けることによって、カルシウムの正味の胃腸吸収に寄与する。ＰＴＨは、骨再吸
収細胞である破骨細胞の分化を刺激することによって、間接的に、骨からのカル
シウム再吸収を促進する。これはまた、腎臓に対する少なくとも３つの主要な効
果（尿細管カルシウム再吸収の刺激、リン酸クリアランスの増強、およびビタミ
ンＤの活性形態の合成を完了する酵素における増加の促進）を媒介する。ＰＴＨ
は、主に、アデニル酸シクラーゼおよび／またはホスホリパーゼＣのレセプター
媒介性活性化を通して、これらの効果を発揮すると考えられる。

【０００６】 カルシウムホメオスタシスの破壊は、多くの臨床的な障害（例えば、重篤な骨
疾患、貧血、腎臓障害、潰瘍、ミオパシー、および神経障害）を生じ得、そして
通常、副甲状腺ホルモンのレベルにおける変化を生じる状態から生じる。高カル
シウム血症は、血清カルシウムレベルにおける上昇によって特徴付けられる状態
である。これは、しばしば、過剰なＰＴＨ産生が上皮小体の病変（例えば、腺腫
、過形成、または癌腫）の結果として生じる原発性上皮小体機能亢進症と関連す
る。別の型の高カルシウム血症である、悪性の液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）
は、最も一般的な腫瘍随伴性症候群である。これは、ＰＴＨとアミノ酸相同性を
共有するタンパク質ホルモンのクラスの腫瘍（例えば、扁平癌、腎臓癌、卵巣癌
、または膀胱癌）による産生からのほとんどの例を生じるようである。これらの
ＰＴＨ関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）は、ＰＴＨの特定の腎臓作用および骨格作
用を模倣するようであり、そしてこれらの組織においてＰＴＨレセプターと相互
作用すると考えられる。ＰＴＨｒＰは、通常、多くの組織（ケラチノサイト、脳
、下垂体、上皮小体、副腎皮質、髄質、胎児肝臓、骨芽細胞様細胞、および乳汁
分泌性乳房組織を含む）中で低レベルで見出される。多くのＨＨＭ悪性疾患にお
いて、ＰＴＨｒＰは、循環系において高レベルで見出され、それによってＨＨＭ
と関連するカルシウムレベルの上昇を生じる。

【０００７】 ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの薬理学的プロフィールは、ほとんどのインビトロで
のアッセイ系においてほぼ同一であり、そして上昇した血液レベルのＰＴＨ（す
なわち、原発性上皮小体機能亢進症）またはＰＴＨｒＰ（すなわち、ＨＨＭ）は
、ミネラルイオンのホメオスタシスに対して匹敵する効果を有する（Ｂｒｏａｄ
ｕｓ，Ａ．Ｅ．およびＳｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．「Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈ
ｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｏ
ｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｏｎｓ」Ｂａ
ｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、Ｂｉｌｚｉｋｉａｎ，
Ｊ．Ｐ．ら編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、２５
９〜２９４頁；Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．Ｍ．ら、「Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ
ｈｏｒｍｏｎｅ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｃｔｉｏｎ」Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｍｕｎｄｙ，Ｇ．Ｒ．およびＭａｒｔ
ｉｎ，Ｔ．Ｊ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（
１９９３）、１８５〜２０１頁）。この２つのリガンドの生物学的活性における
類似性は、骨および腎臓において豊富に発現される共通のレセプターであるＰＴ
Ｈ／ＰＴＨｒＰレセプターとのそれらの相互作用によって説明され得る（Ｕｒｅ
ｎａ，Ｐ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４：４５１〜４５６（１９９
４））。

【０００８】 （ＰＴＨレセプター） ＰＴＨ−１レセプターは、ペプチドホルモン（例えば、セクレチン（Ｉｓｈｉ
ｈａｒａ，Ｔ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１６３５〜１６４１（１９９１））、
カルシトニン（Ｌｉｎ，Ｈ．Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２２〜１０
２４（１９９１）およびグルカゴン（Ｊｅｌｉｎｅｋ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５９：１６１４〜１６１６（１９９３））を結合する多くの他のレセプ
ターに対して、一次構造において相同であり；ともに、これらのレセプターは、
レセプターファミリーＢと呼ばれる異なるファミリーを形成する（Ｋｏｌａｋｏ
ｗｓｋｉ，Ｌ．Ｆ．、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ２：１
〜７（１９９４））。このファミリー内では、ＰＴＨ−１レセプターは、それが
２つのペプチドリガンドに結合し、それによって２つの別々の生物学的プロセス
を調節するという点で独特である。最近同定されたＰＴＨレセプターサブタイプ
（ＰＴＨ−２レセプターと呼ばれる）は、ＰＴＨを結合するが、ＰＴＨｒＰを結
合しない（Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４５５
〜１５４５８（１９９５））。この観察は、ＰＴＨリガンドおよびＰＴＨｒＰリ
ガンドにおける構造的差異が、ＰＴＨ−２レセプターとの相互作用についての選
択性を決定することを暗示した。このＰＴＨ−２レセプターは、脳、膵臓、およ
び血管系において、ＲＮＡ法によって検出されているが、その生物学的機能は、
決定されていない（Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１
５４５５〜１５４５８（１９９５））。ファミリーＢレセプターは、それら自体
の同属ペプチドホルモンを係合する、共通の分子機構を使用すると仮定されてい
る（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６４６９
〜２６４７２（１９９６））。

【０００９】 放射性標識したＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨｒＰ（１〜３６）のいずれか
のＰＴＨ−１レセプターへの結合は、いずれかの非標識リガンドによって競合的
に阻害される（Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：８
５５７〜８５６０（１９８８）；Ｎｉｓｓｅｎｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２８６６〜１２８７１（１９８８））。従って、ＰＴ
Ｈ−１レセプターの２つのリガンドに対する認識部位は、おそらく重複する。Ｐ
ＴＨおよびＰＴＨｒＰの両方において、１５〜３４の領域は、ＰＴＨ−１レセプ
ターへの結合に対する主要な決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を含む。これら
の領域は、最小の配列相同性（３アミノ酸のみの同一性）を示すが、各々の１５
〜３４ペプチドは、ＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨｒＰ（１〜３４）のいずれ
かのＰＴＨ−１レセプターへの結合をブロックし得る（Ｎｕｓｓｂａｕｍ，Ｓ．
Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０１８３〜１０１８７（１９８０
）；Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７：
８３〜８７（１９９０）；Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．−Ｂ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ １２５：２２１５〜２２１７（１９８９））。さらに、各リガ
ンドのアミノ酸末端部分は、生物活性のために必要とされ、そしてこれらは、お
そらく、類似の様式にてＰＴＨ−１レセプターと相互作用する。なぜなら、これ
らの残基の１３のうちの８は、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰにおいて同一であるから
である。

【００１０】 ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの両方は、ｎＭ範囲の親和性で、ＰＴＨ−１レセプタ
ーに結合し；リガンド−占有レセプターは、中間にヘテロ三量体ＧＴＰ結合タン
パク質（Ｇタンパク質）を含む機構を通じて、細胞内エフェクター酵素へと細胞
膜を横切って「シグナル」を伝達する。ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰに応答してＰＴ
Ｈ−１レセプターによって活性化される一次性細胞内エフェクター酵素は、アデ
ニルシクラーゼ（ＡＣ）である。従って、ＰＴＨは、骨リモデリング（骨形成お
よび骨吸収）に関与する、弱く特徴付けられた「下流」の細胞プロセスを調節し
続ける、「セカンドメッセンジャー」分子であるサイクリックアデノシン一リン
酸（ｃＡＭＰ）における強い増大を誘導する。特定の細胞ベースのアッセイ系に
おいて、ＰＴＨは、イノシトール三リン酸（ＩＰ₃）、ジアシルグリセロール（
ＤＡＧ）、および細胞内カルシウム（ｉＣａ²⁺）の産生を生じる、ＡＣ以外のエ
フェクター酵素（ホルホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を含む）を刺激し得る。骨代謝に
おける種々のセカンドメッセンジャー分子の役割は、現在未知である。

【００１１】 （骨粗しょう症） 骨粗しょう症は、高齢集団の実質的な部分において、妊娠女性において、およ
び若年においてさえも観察される潜在的な損傷性（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）骨格疾
患である。用語骨粗しょう症は、異質なグループの障害をいう。臨床的には、骨
粗しょう症は、Ｉ型およびＩＩ型に分類される。Ｉ型骨粗しょう症は、中年の女
性において主に生じ、閉経におけるエストロゲン損失と関連するが、ＩＩ型骨粗
しょう症は、加齢と関連する。骨粗しょう症を有する患者は、骨折修復を促進す
るように設計される新たな治療から、あるいはこの疾患と関連する骨折を阻止す
るかまたは減少させるように設計された治療から利益を得る。

【００１２】 この疾患は、骨質量の減少、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の減少、骨強度の減少
および骨折の危険性の増大によって特徴付けられる。現在、エストロゲン、カル
シトニンおよびビスホスホネートを介して骨粗しょう症の有効な治療法はなく、
エチドロネートおよびアレンドロネート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）が、種々の
レベルの成功で、この疾患を処置するために使用される。これらの薬剤は、骨再
吸収を減少するように作用する。副甲状腺ホルモンは、断続的に投与される場合
、血液カルシウムおよびリン酸レベルを調節し、そして動物における骨格に対す
る強力な同化（骨形成）効果（Ｓｈｅｎ，Ｖ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ
Ｉｎｔ．５０：２１４〜２２０（１９９２）；Ｗｈｉｔｅｆｉｌｄ，Ｊ．Ｆ．
ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．５６：２２７〜２３１（１９９５）
およびＷｈｉｔｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎ
ｔ．６０：２６〜２９（１９９７）、およびヒトにおける骨格に対する強力な同
化（骨形成）効果（Ｓｌｏｖｉｋ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒ
ｅｓ．１：３３７〜３８１（１９８６）；Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｎ
ｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１４：６９０〜７０９（１９９３）およびＤｅｍｐｓｔｅｒ
，Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５：２６１（１９９４））を有するの
で、ＰＴＨまたはＰＴＨ誘導体は、骨粗しょう症についての新規かつ効果的な治
療のための一番の候補である。

【００１３】 （ＰＴＨ誘導体） ＰＴＨ誘導体は、アミノ酸置換を有するかまたは全長分子と比較して短縮され
たポリペプチドを含む。ＰＴＨの１４アミノ酸末端短縮形態と３４アミノ酸末端
短縮形態の両方、ならびにＣ末端短縮形態が研究されている。さらに、短縮ポリ
ペプチド内のアミノ酸置換もまた、調査されている。しばしば、それぞれ、ヒト
ＰＴＨまたはラットＰＴＨであるｈＰＴＨまたはｒＰＴＨのいずれもが、調べら
れる。

【００１４】 短縮型ＰＴＨ誘導体（例えば、ＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ（１−３１）
）は、ほとんどのアッセイ系において活性であり、そして骨形成を促進する（Ｗ
ｈｉｔｅｆｉｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．５６：
２２７〜２３１（１９９５）；Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃａｌｃｉｆ
．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．６０：２６〜２９（１９９７）；Ｓｌｏｖｉｋ，Ｄ．
Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１：３３７〜３８１（１９８６）
；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９３：１３４９
〜１３５３（１９７３）；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ
．Ｒｅｓ．９：１１７９〜１１８９（１９９４）；Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ
．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１
６：３７２〜３８６（１９９５）ならびにＷｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃ
ａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．５８：８１〜８７（１９９６））。しかし
、これらのペプチドは、効率的な非経口送達のためにはなお大きすぎ、かつ低コ
ストである。ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰのさらにより小さな「最小化された」バー
ジョンの発見は、骨粗しょう症のための新しい処置を開発する試みにいて重要な
前進である。

【００１５】 ＰＴＨのより短い短縮型誘導体もまた研究されている。これには、ＰＴＨ（１
−１４）フラグメント（Ｌｕｃｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：６
７０〜８０（１９９９））、ＰＴＨ（１−１３）フラグメント（Ｂｅｒｇｗｉｔ
ｚ Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４２１７〜４２２４（１９９６
））が挙げられる。短縮型２７アミノ酸ＰＴＨもまた報告されている。Ｐｏｔｔ
ｓ、Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１５４’’Ｓ１５〜Ｓ１２（１９９７）。
さらなる誘導体は、米国特許第５，３９３，８６９号；同第５，７２３，５５７
号；同第５，６９３，６１６号およびＥ．Ｐ．特許第７４８８１７号において議
論される。

【００１６】 １〜１４の領域において、アミノ酸の置換または欠失を有する、ＰＴＨ誘導体
およびＰＴＨｒＰ誘導体は、通常、活性の減少を示す（Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ
．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９３：１３４９〜１３５３（１９７３）；
Ｇｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：３１９９〜３２
０３（１９７５）；Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｎ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：１０
５３〜１０５５（１９８３）およびＧａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１３１４１〜１３１４６（１９９１））。さらに、大き
なＰＴＨフラグメントにおける単一のアミノ酸置換の研究がある（Ｇｏｍｂｅｒ
ｔ、Ｆ．Ｏ．ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １４ ^th Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、６月１８日〜２
３日、１９９６；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：
１９９７〜２００４、１９９１；Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈら、Ｐｅｐｔｉｄｅ １１
：１１３９〜１１４２、１９９０）。

【００１７】 いくつかの短いＮＨ₂末端ＰＴＨペプチドまたはＰＴＨｒＰペプチドは、以前
に調査されているが、活性は、全く検出されなかった。例えば、ｂＰＴＨ（１−
１２）は、ラット腎臓膜において行われたアデニリルシクラーゼアッセイにおい
て不活性であり（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｍ．、「Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈ
ｏｕｍｏｎｅ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ」Ｐａｔｈｏｂｉｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ，Ｉｏａ
ｃｈｉｍ，Ｈ．Ｌ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８１
）、５３〜８４頁）、そしてＰＴＨｒＰ（１−１６）は、クローニン化されたラ
ットＰＴＨ−１レセプターを発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞において行われたＡＣアッセイにおいて不活性であった（Ａｚｕｒａｎｉ
，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４９３１〜１４９３６（１９９
６））。ＰＴＨの１５−３４のドメインにおける残基が、レセプター結合親和性
に重要に寄与することが既知である。なぜなら、ＰＴＨ（１５−３４）フラグメ
ントは、このレセプターに弱く結合するが、このペプチドは、ＡＣを活性化しな
いからである（Ｎａｕｓｓｂａｕｍ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５５：１０１８３〜１０１８７（１９８０）およびＧａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．
ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０２４〜２０３０（１９９３））
。

【００１８】 ＰＴＨ（１−１４）が、ＰＴＨ−１レセプターを発現する細胞においてアデニ
ルシクラーゼを活性化するが、効力はＰＴＨ（１−３４）の効力よりも非常に低
かった（それぞれ、Ｅ_c５０＝１００μＭおよび約１ｎＭ）ことが以前に報告さ
れている（Ｌｕｃｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｃｒｉｎ．１３（１９９０））。さらに
、ＰＴＨ（１−１４）のアラニン−スキャニング置換分析により、３位および１
０−１４位がトレオニン部位であり、一方、２位および４−９位が比較的不耐性
の部位であることが示されている。

【００１９】 さらに、ＰＴＨ（１−１４）における置換のさらなる特徴付けが報告されてい
る（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃３９８：１９９９ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔ
ｙ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓａｒｃｈ Ｍｅｅｔｉｎ
ｇ、９月３０日〜１０月４日）。ＰＴＨ（１−１４）におけるアミノ酸をさらに
特徴付けるために、かつ活性を強力に改善するために、種々の単一置換を導入し
て、その結果、少なくとも１つの型のアミノ酸（例えば、極性、無極性、カチオ
ン性、低分子、芳香族）およびプロリンを各位置に提示した。

【００２０】 従って、本発明は、骨関連欠損もしくは疾患、または副甲状腺ホルモンが関与
する任意の状態の処置を必要とする患者を処置するために用いられ得る、新規の
ＰＴＨ誘導体に関する、当該分野における必要性を満たす。このように、本発明
は、ＰＴＨの新規の短縮型誘導体（ＰＴＨ（１−１４）、ＰＴＨ（１−２０）、
ＰＴＨ（１−２２）、ＰＴＨ（１−２４）、ＰＴＨ（１−２６）、ＰＴＨ（１−
２８）、ＰＴＨ（１−３０）、ＰＴＨ（１−３２）およびＰＴＨ（１−３４））
、この誘導体を作製する方法およびこの誘導体を使用する方法、ならびのこの誘
導体を使用して、種々の骨関連欠損または疾患を有する患者を処置する方法に関
する。

【００２１】 （発明の要旨） 本発明は、とりわけ、ポリヌクレオチドの選択された位置でのアミノ酸置換を
含む、新規のＰＴＨポリペプチド誘導体に関する。この誘導体は、ＰＴＨ−１レ
セプターの完全、またはほぼ完全なアゴニストとして機能し得る。固有の特性に
より、これらのポリペプチドは、骨格のヒト疾患（例えば、骨粗しょう症）を処
置するための薬物としての有用性を有する。

【００２２】 本発明は、ＰＴＨ（１−１４）、ＰＴＨ（１−２２）、ＰＴＨ（１−２４）、
ＰＴＨ（１−２６）、ＰＴＨ（１−２８）、ＰＴＨ（１−３０）、ＰＴＨ（１−
３２）およびＰＴＨ（１−３４）のポリペプチドの誘導体、ならびにこれらのポ
リペプチドをコードする核酸に関する。これらのポリペプチドのフラグメントも
また、本発明の一部である。本発明はさらに、望まれない骨損失の危険性がある
脊椎動物においてこのような骨損失を制限する際の使用、望まれない骨損失また
は骨成長のための必要性により特徴付けられる状態を処置する際（例えば、骨折
または軟骨疾患を処置する際）の使用、ならびに必要であると考えられる細胞に
おいてｃＡＭＰレベルを上昇させるための使用、のための組成物および方法に関
する。

【００２３】 本発明は、始めに、以下から本質的になるアミノ酸配列を有するポリペプチド
に関する：ＡｌａＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁Ｘ₀₂ Ｘ₀₃ＬｙｓＸ₀₄（配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：））、ここで、Ｘ₀₁はＡｌ
ａ、ＡｓｐまたはＧｌｎであり；Ｘ₀₂はＬｅｕ、ＡｒｇまたはホモＡｒｇであり
；Ｘ₀₃はＡｒｇまたはＡｌａであり；そしてＸ₀₄は、ＰｈｅまたはＴｒｐである
。１つの特定の実施形態では、本発明は、配列番号１のポリペプチドに少なくと
も９０％同一のポリペプチドを提供する。別の実施形態では、Ａｌａ−３は、セ
リンと置換され得る。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＸ₀₁、Ｘ₀₂、
Ｘ₀₃またはＸ₀₄は、その位置についてネイティブのアミノ酸で有り得る。但し、
ラットまたはヒトのいずれかのネイティブＰＴＨ（１−１４）を生じるように、
Ｘの全ては置換されない。

【００２４】 本発明は、以下から本質的になるアミノ酸配列を有するポリペプチドにさらに
関する：ＡｌａＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁Ａｒｇ
ＡｌａＬｙｓＸ₀₂（配列番号２）、ここで、Ｘ₀₁はＡｌａまたはＧｌｎであり；
そしてＸ₀₂はＴｒｐまたはＨｉｓである。１つの特定の実施形態では、本発明は
、このペプチドに少なくとも８５％同一のポリペプチドを提供する。より好まし
くは、このポリペプチドは９０％同一である。

【００２５】 １つの実施形態では、本発明は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
特に関する：

【００２６】

【化６】 本発明は、さらに、以下のアミノ酸配列を有する特定のより短いＰＴＨ誘導体
に関する：

【００２７】

【化７】 本発明はまた、より長いＰＴＨ誘導体に関する、ここで、最初の１４個のアミ
ノ酸は、配列ＡｌａＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁Ｘ ₀₂ Ｘ₀₃ＬｙｓＸ₀₄（配列番号１）を有し、ここで、Ｘ₀₁はＡｌａＡｓｐであり；
Ｘ₀₂は、Ｌｅｕ、ホモＡｒｇまたはＡｒｇであり；Ｘ₀₃は、ＡｒｇまたはＡｌａ
であり；そしてＸ₀₄は、ＰｈｅまたはＴｒｐである。本発明が提供する１つのＰ
ＴＨ誘導体である、ＰＴＨ（１−２０）は、アミノ酸配列ＡｌａＶａｌＡｌａＧ
ｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁Ｘ₀₂Ｘ₀₃ＬｙｓＸ₀₄ＬｅｕＡｓｎＳｅ
ｒＭｅｔＸ₀₅Ａｒｇ（配列番号２５）を有し、ここで、Ｘ₀₅は、ＡｒｇまたはＡ
ｌａである。本発明が提供する別のＰＴＨ誘導体であるＰＴＨ（１−２２）は、
アミノ酸配列ＡｌａＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁Ｘ ₀₂ Ｘ₀₃ＬｙｓＸ₀₄ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＸ₀₅ＡｒｇＶａｌＧｌｕ（配列番号
２６）を有し、ここで、Ｘ₀₅は、ＡｒｇまたはＡｌａである。本発明が提供する
別のＰＴＨ誘導体であるＰＴＨ（１−２４）は、アミノ酸配列ＡｌａＶａｌＡｌ
ａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁Ｘ₀₂Ｘ₀₃ＬｙｓＸ₀₄ＬｅｕＡｓｎ
ＳｅｒＭｅｔＸ₀₅ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕ（配列番号２７）を有し、こ
こで、Ｘ₀₅は、ＡｒｇまたはＡｌａである。本発明が提供するさらに別のＰＴＨ
誘導体であるＰＴＨ（１−２６）は、アミノ酸配列ＡｌａＶａｌＡｌａＧｌｕＩ
ｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁Ｘ₀₂Ｘ₀₃ＬｙｓＸ₀₄ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅ
ｔＸ₀₅ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓ（配列番号２８）を有し、
ここで、Ｘ₀₅はＡｒｇまたはＡｌａである。本発明が提供するさらに別のＰＴＨ
誘導体であるＰＴＨ（１−２８）は、アミノ酸配列ＡｌａＶａｌＡｌａＧｌｕＩ
ｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁Ｘ₀₂Ｘ₀₃ＬｙｓＸ₀₄ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅ
ｔＸ₀₅ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号２
９）、ここで、Ｘ₀₅は、ＡｒｇまたはＡｌａである。本発明が提供するさらに別
のＰＴＨ誘導体であるＰＴＨ（１−３０）は、アミノ酸配列ＡｌａＶａｌＡｌａ
ＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁Ｘ₀₂Ｘ₀₃ＬｙｓＸ₀₄ＬｅｕＡｓｎＳ
ｅｒＭｅｔＸ₀₅ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌ
ｎＡｓｐ（配列番号３０）を有し、ここで、Ｘ₀₅は、ＡｒｇまたはＡｌａである
。そして、本発明が提供するさらに別のＰＴＨ誘導体であるＰＴＨ（１−３２）
は、アミノ酸配列は、ＡｌａＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉ
ｓＸ₀₁Ｘ₀₂Ｘ₀₃ＬｙｓＸ₀₄ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＸ₀₅ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴ
ｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌＨｉｓ（配列番号３１
）を有し、ここで、Ｘ₀₅は、ＡｒｇまたはＡｌａである。あるいは、本発明の１
つの実施形態は、Ａｌａ−３をセリンに置換し得る。さらに別の実施形態では、
Ｘ_01、Ｘ_02、Ｘ_03、Ｘ₀₄またはＸ₀₅の少なくとも１つは、この位置についてネイ
ティブのアミノ酸であり得る。但し、ｒＰＴＨまたはｈＰＴＨの種々の誘導体の
いずれかについてネイティブのアミノ酸を生じるように、Ｘの全ては置換されな
い。

【００２８】 この誘導体の全３４個のアミノ酸配列は、以下：

【００２９】

【化８】 であり、ここで、Ｘ₀₁は、ＡｌａまたはＡｓｐであり；Ｘ₀₂は、Ｌｅｕ、ホモＡ
ｒｇまたはＡｒｇであり；Ｘ₀₃は、ＡｒｇまたはＡｌａであり；Ｘ₀₄は、Ｐｈｅ
またはＴｒｐであり、そしてＸ₀₅は、ＰｈｅまたはＴｙｒである。あるいは、本
発明の１つの実施形態では、ＰＴＨ誘導体のいずれかにおいて、Ａｌａ−３をセ
リンに置換し得る。さらに別の実施形態では、Ｘ_01、Ｘ_02、Ｘ_03、Ｘ₀₄またはＸ ₀₅ の少なくとも１つは、この位置についてネイティブのアミノ酸である。但し、
ラットまたはヒトのいずれかのネイティブＰＴＨ（１−１４）を生じるように、
Ｘの全ては置換されない。本発明の特定の実施形態は、以下の配列を有するポリ
ペプチドに関する：

【００３０】

【化９】 本発明のなお別の実施形態では、本発明のＰＴＨ（１−３４）ポリペプチドの
いずれかは、Ｇｌｕ−１９をＡｒｇと置換し得る。

【００３１】 本発明は、さらに、本発明のＰＴＨ誘導体のフラグメント、または保存的アミ
ノ酸置換がポリペプチド配列の中で行われるようなＰＴＨ誘導体に類似するポリ
ペプチドに関する。

【００３２】 本発明は、さらに、ＰＴＨ（１−１４）、ＰＴＨ（１−２０）、ＰＴＨ（１−
２２）、ＰＴＨ（１−２４）、ＰＴＨ（１−２６）、ＰＴＨ（１−２８）、ＰＴ
Ｈ（１−３０）、ＰＴＨ（１−３２）およびＰＴＨ（１−３４）の合成および組
換えの両方の生物学的に活性なポリペプチド誘導体を提供する。本発明の好まし
い実施形態は、アミノ酸１−９、１−１０、１−１１、１−１２および１−１３
を含む。本発明はまた、薬学的塩および上記のポリペプチドのＮ末端誘導体また
はＣ末端誘導体に関する。

【００３３】 本発明の好ましい実施形態は、上記のポリペプチドのいずれかに関し、ここで
、このポリペプチドは、Ｃ末端アミドを含む。Ｃ末端アミドを有するＰＴＨポリ
ペプチド誘導体の例は、以下を含むがこれらに限定されない：

【００３４】

【化１０】 本発明の実施形態はまた、本明細書中に記載される配列のいずれかを含むアミ
ノ酸を有するポリペプチド、または本明細書中に記載される配列のいずれかを含
むポリペプチドに関する。同様に、本発明はまた、明細書中に記載される配列の
いずれかを含む核酸を有するポリヌクレオチド、または本明細書中に記載される
配列のいずれかを含むポリヌクレオチドに関する。

【００３５】 本発明は、さらに、ネイティブのラットまたはヒトのＰＴＨ（配列番号１４お
よび配列番号１７）に対する単一アミノ酸置換を有するＰＴＨ１−１４ポリペプ
チドに関する。いくつかの実施形態では、単一アミノ酸置換は、ＨＫＲＫ−Ｂ７
細胞におけるネイティブのＰＴＨに対してｃＡＭＰ刺激を増加させるが、他の実
施形態では、この置換は、ＰＴＨが、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞においてｃＡＭＰを刺
激する能力を低下させる。

【００３６】 ＡＭＰ刺激を増加させる本発明の好ましい実施形態は、以下置換の１つからな
る群より選択されるＰＴＨ１−１４における単一アミノ酸置換を有する。

【００３７】

【化１１】 上記の言葉は、例えば、ネイティブのポリペプチドにおける１０位のアミノ酸ア
スパラギンは、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＧｌｎのいずれか１つと置換され得ること
を意味する。同様に、Ｌｙｓ−１３は、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＴｒｐと
置換され得る。本願の好ましい実施形態は、ＰＴＨのアミノ酸１−９、１−１０
、１−１１、１−１２、１−１３、１−１４または１−３４を含むポリペプチド
である。

【００３８】 本発明は、さらに、ネイティブのラットまたはヒトのＰＴＨ（配列番号１８お
よび配列番号１９）に対する単一アミノ酸置換を有するＰＴＨ（１−３４）ポリ
ペプチドのフラグメントの誘導体に関する。いくつかの実施形態では、単一アミ
ノ酸置換は、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞におけるネイティブのＰＴＨに対してｃＡＭＰ
刺激を増加させるが、他の実施形態では、この置換は、ＰＴＨが、ＨＫＲＫ−Ｂ
７細胞においてｃＡＭＰを刺激する能力を低下させる。

【００３９】 本発明の好ましい実施形態は、ＰＴＨ（１−２０）、ＰＴＨ（１−２２）、Ｐ
ＴＨ（１−２４）、ＰＴＨ（１−２６）、ＰＴＨ（１−２８）、ＰＴＨ（１−３
０）、およびＰＴＨ（１−３２）（これらは、ｃＡＭＰ刺激を増大する単一アミ
ノ酸置換を有する）からなる群より選択されるポリペプチドである。好ましくは
、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞におけるｃＡＭＰ刺激の増大の原因であるアミノ酸置換は
、以下の置換の１つ以上からなる群より選択される。

【００４０】

【化１２】 上記の言葉は、例えば、ネイティブのポリペプチドにおける１０位にアミノ酸ア
スパラギンは、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＧｌｎのいずれか１つと置換され得ること
を意味する。同様に、Ｌｙｓ−１３は、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＴｒｐと
置換され得る。本願の好ましい実施形態は、ＰＴＨのアミノ酸１−９、１−１０
、１−１１、１−１２、１−１３、１−１４、１−２０、１−２２、１−２４、
１−２６、１−２８、１−３０または１−３２を含むポリペプチドである。

【００４１】 本発明は、さらに、ＰＴＨ（１−１４）ポリペプチドに関し、ここで、単一ア
ミノ酸置換は、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞におけるネイティブＰＴＨに対してｃＡＭＰ
刺激を低下させる。但し、この置換は、任意の位置のアラニンではなく、Ｓｅｒ
−１での置換は、Ｔｙｒ、ＰｒｏまたはＡｓｐではなく、Ｖａｌ−２での置換は
、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、ＡｒｇまたはＧｌｕではなく、Ｓｅｒ−３での置換は、Ｔｈ
ｒ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＡｓｎではなく、そしてＧｌｕ−４での置換は、Ｇｌ
ｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＶａｌまたはＡｓｐではない。

【００４２】 本発明は、さらに、以下からなる群より選択される標識を用いて標識された上
記ポリペプチドのいずれかに関する：放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、ま
たは化学発光標識。好ましい実施形態では、放射性標識は、^99mＴｃである。

【００４３】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明はまた、ＰＴＨ誘導体および薬学
的に受容可能な賦形剤および／または薬学的に受容可能な溶液（例えば、生理食
塩水または生理学的緩衝化溶液）を含む薬学的組成物を提供する。

【００４４】 本発明は、さらに、本発明のポリペプチド誘導体のいずれかをコードする、組
換えまたは単離されたＤＮＡ分子を提供する。本発明の好ましい実施形態は、以
下からなる組換えまたは単離されたＤＮＡ分子を提供する：（１）発現制御領域
、この領域は（２）ＰＴＨ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列と作動可能
に連結される。本発明の好ましい実施形態は、以下からなる群より選択されるＰ
ＴＨ誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む：ＡｌａＶａｌＡｌａＧｌｕＩ
ｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁Ｘ₀₂Ｘ₀₃ＬｙｓＸ₀₄（配列番号１）、ここで
、Ｘ₀₁はＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｎであり；Ｘ₀₂はＬｅｕまたはＡｒｇであり
；Ｘ₀₃はＡｒｇまたはＡｌａであり；そしてＸ₀₄は、ＰｈｅまたはＴｒｐである
；ＡｌａＶａｌＡｌａＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＸ₀₁ＡｒｇＡｌａ
ＬｙｓＸ₀₂（配列番号２）、ここで、Ｘ₀₁はＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｎであり
；そしてＸ₀₂はＴｒｐまたはＨｉｓである；

【００４５】

【化１３】 好ましい実施形態はまた、細菌プロモーター、ウイルスプロモーター、真菌プロ
モーターまたは哺乳動物プロモーターである制御領域を含む。

【００４６】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドを作製する方法に関する。好ましい実
施形態は、液相合成もしくは固相合成または組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプ
チドを作製する工程を包含する。

【００４７】 本発明の好ましい実施形態は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含
む組換えベクターを作製する方法に関する。好ましい実施形態は、さらに、本発
明の組換えＤＮＡ分子を宿主細胞に導入して、この分子によりコードされるポリ
ペプチドを発現させることによりポリペプチドを作製および調製する工程を包含
する。宿主は、原核生物または真核生物のいずれかであり得る。好ましい実施形
態は、細菌または哺乳動物である宿主細胞を含む。

【００４８】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明は、骨質量の減少により特徴付け
られる哺乳動物の状態を処置するための方法を提供し、ここで、この方法は、生
物学的に活性なＰＴＨポリペプチドの、骨質量を増加するのに有効な量を、骨質
量を増加する必要のある被験体に投与する工程を包含する。本発明の好ましい実
施形態は、骨粗しょう症のような状態に関する。骨粗しょう症の型としては、老
年性骨粗しょう症および閉経後の骨粗しょう症を含むがこれらに限定されない。
さらに好ましい実施形態は、約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１．０μｇ／ｋｇ／
日のポリペプチドの有効量を用いることを包含し、ここで、このポリペプチドは
、非経口投与、皮下投与され得るかまたは経鼻吸入により投与され得る。

【００４９】 本発明は、さらに、骨質量の減少を処置するための方法に関し、ここで、この
ポリペプチドの骨質量を増加するのに有効な量が、このポリペプチドをコードす
るＤＮＡを患者に提供し、そしてインビボでこのポリペプチドを発現させること
により投与される。

【００５０】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明はまた、骨再形成、骨吸収、およ
び／または骨再造形の速度を決定するための方法を提供する。この方法は、標識
したＰＴＨポリペプチド（例えば、配列番号１）またはその誘導体の有効量を患
者に投与する工程、そしてこの患者の骨への、このペプチドの取込みを決定する
工程を包含する。このペプチドは、以下からなる群より選択される標識を用いて
標識され得る：放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、または化学発光標識。好
ましい実施形態では、放射性標識は、^99mＴｃである。

【００５１】 本発明のさらなる局面は、ＰＴＨ１／ＰＴＨ２レセプターをアンタゴナイズま
たはアゴナイズするＰＴＨ誘導体を生成するポリペプチドの１−１４位でのアミ
ノ酸置換に関する。

【００５２】 本発明は、さらに、ＰＴＨ−１レセプターを有する哺乳動物細胞においてｃＡ
ＭＰを増加させる方法に関し、この方法は、この細胞をｃＡＭＰを増加するのに
十分な量の本発明のポリペプチドと接触させる工程を包含する。

【００５３】 （好ましい実施形態の詳細な説明） （定義） 明細書および特許請求の範囲のより明確な理解を提供するために、以下の定義
を提供する。

【００５４】 （アミノ酸配列）−本願のアミノ酸配列は、アミノ酸の１文字表記または３文
字表記のいずれかを用いる。これらの命名は当業者に周知であり、そして例えば
、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．，Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １９９７，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ
，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．またはＡｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４のよ
うな多数の容易に入手可能な参考文献に見出され得る。配列における置換は、例
えば、Ｓｅｒ−−＞Ａｌａと言及され得、これは、ポリペプチドのＮ末端から３
番目の位置のセリンが、別のアミノ酸（この場合、アラニン）と交換され得る意
味する。

【００５５】 （タンパク質の生物学的活性）：この表現は、ポリペプチドの任意の生物学的
活性をいう。これらの活性の例としては、配列番号１の化合物またはその誘導体
の代謝機能または生理学的機能（同様の活性、もしくは改善された活性、または
低下した望まれない副作用を有するそれらの活性を含む）が挙げられるが、これ
らに限定されない。例えば、配列番号１のような化合物またはその誘導体の、抗
原性活性および免疫原性活性もまた含まれる。

【００５６】 （クローニングベクター）：宿主細胞において自律的に複製し得、かつ１また
は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられる、プラスミド
もしくはファージのＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列であって、この部位において、
このようなＤＮＡ配列は、決められた様式で切断され得、そしてこの部位に、Ｄ
ＮＡフラグメントがスプライスされて、その複製およびクローニングをもたらし
得る。このクローニングベクターは、このクローニングベクターで形質転換され
た細胞の同定における使用に適切なマーカーをさらに含み得る。マーカーは、例
えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する。

【００５７】 （ＤＮＡ構築物） 本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ構築物」は、組換え
、人工ＤＮＡ（線状または環状のいずれか）をいうと理解されるべきである。

【００５８】 （誘導体または機能的誘導体）：用語「誘導体」または「機能的誘導体」とは
、ＰＴＨ分子の「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ
ｓ）」または「化学的誘導体（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」
を含むことを意図する。例えば配列番号１の化合物またはそれの誘導体のような
分子の「改変体」とは、分子全体またはそれのフラグメントのいずれかに実質的
に類似の分子をいうことを意味する。例えば配列番号１の化合物またはそれらの
誘導体の化合物のような分子の「アナログ」は、配列番号１の分子またはそれら
のフラグメントのいずれかに実質的に類似の非天然の分子をいうことを意味する
。

【００５９】 ＰＴＨ誘導体は、同じサイズのネイティブＰＴＨポリペプチドと比較して、ポ
リペプチド中に変化を含む。ネイティブＰＴＨ（１−１４）ポリペプチドの配列
は、配列番号１４（ヒト）または１７（ラット）の配列である。分子が別の分子
と「実質的に類似である」といわれるのは、両方の分子のアミノ酸の配列が、実
質的に同じものである場合、および両方の分子が、類似した生物学的活性を有す
る場合である。従って、類似した活性を有する２つの分子は、分子のうちの１つ
が他方で見出されないさらなるアミノ酸残基を含むか、またはアミノ酸残基の配
列が同一でない場合でさえも、その語が本願明細書において使われる場合、それ
らは改変体、誘導体またはアナログとみなされ得る。しかし、ＰＴＨ誘導体は、
ネイティブの分子と実質的に類似の生物学的活性を有する必要はない。いくつか
の例では、ＰＴＨ誘導体は、ネイティブＰＴＨと実質的に異なる活性を有し得る
。例えば、誘導体は、ＰＴＨレセプターのアンタゴニストまたはアゴニストのい
ずれかであり得る。

【００６０】 本明細書中で用いられる場合、分子は、それが通常は、分子の一部ではない、
さらなる化学部分を含む場合に、別の分子の「化学誘導体」であると言われる。
このような部分は、分子の溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。こ
れらの部分は、あるいは分子の毒性を減少させ得るか、分子の任意の望まれない
副作用などを排除し得るか、または減弱し得る。このような効果を媒介し得る部
分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ（１９８０）に開示され、そして当業者に明らかである。

【００６１】 （発現ベクター） 本明細書中で使用される場合、「発現ベクター」は、発現
ベクターが適切な宿主細胞に形質転換される場合に構造遺伝子が発現され得るよ
うに、発現制御配列に作動可能に連結される構造遺伝子を含むＤＮＡ構築物であ
る。２つのＤＮＡ配列は、１つの領域の生物学的活性が他の領域に影響を及ぼす
場合、およびまたその２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフ
ト変異の導入を生じない場合、（２）プロモーター領域配列が所望の配列の転写
を指向する能力を妨害しない場合、または（３）所望の配列がプロモーター領域
配列によって転写される能力を妨害しない場合に、「作動可能に連結される」と
いわれる。従って、プロモーター領域は、このプロモーターがその所望のＤＮＡ
配列の転写をなし得た場合に、その所望のＤＮＡ配列に作動可能に連結される。

【００６２】 （フラグメント）：例えば配列番号１またはその誘導体のような分子の「フラ
グメント」とは、これらの分子の任意のポリペプチドサブセットをいうことを意
味する。

【００６３】 （融合タンパク質）：用語「融合タンパク質」によって、そのＮ末端に連結し
た「選択的切断部位」を有するかまたは有さないかのいずれかの、例えば配列番
号１の化合物、またはその誘導体のような化合物を含む、融合タンパク質が意図
される。この選択的切断部位は、次いで、さらなるアミノ酸リーダーポリペプチ
ド配列に連結される。

【００６４】 （遺伝子治療） 本明細書で使用される場合、「遺伝子治療」は、とりわけ、
目的の遺伝子もしくはその目的の遺伝子により発現される産物を変更することに
より、目的の細胞もしくは生物の遺伝子型を変更することにより、または生物の
遺伝子発現の通常パターンを変更することにより、欠損または疾患を、改善、排
除または減弱する能力を意味する。例えば、これは、目的の遺伝子を変異遺伝子
で置き換えることにより、目的の遺伝子をノックアウトすることにより、または
目的の遺伝子を阻害もしくは刺激する産物を産生する異なる遺伝子を挿入するこ
とにより、あるいは当業者に公知の他の方法を使用することにより達成され得る
。一般に、組換えポリヌクレオチドは、遺伝子発現における変化をもたらすため
に生物の細胞または組織に導入される。遺伝物質の操作は、インビボまたはエキ
ソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）のいずれかで達成され得る。上記の例は、遺伝子治療
がなされ得る異なる様式を制限することを意味しない。遺伝子治療の当業者に公
知の任意の技術は、特許請求される本発明と共に使用され得る。

【００６５】 （宿主動物）：用語トランスジェニック動物とは、その生殖細胞および体細胞
が本発明のＤＮＡ構築物を含む動物をいう。このようなトランスジェニック動物
は、一般に脊椎動物である。好ましい宿主動物は、哺乳動物（例えば、非ヒト霊
長類動物、マウス、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、モルモット、げっ歯類動物（例
えば、ラット）など）である。用語、「宿主動物」はまた、胚段階および胎仔段
階を含む、発生の全ての段階における動物を含む。

【００６６】 （％同一性）：任意の２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、例えば
少なくとも９０％「同一」であるか否かは、「ＦＡＳＴ Ａ」プログラムのよう
な公知のコンピュータープログラムを使用して（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎおよび
Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４
４（１９８８）のようなデフォルトパラメーターを使用して）決定され得る。あ
るいは、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベースの
ためのＮａｔｉｏｎａｌ ＣｅｎｔｅｒのＢＬＡＳＴ関数を使用して、同一性を
決定し得る。

【００６７】 用語相同性および同一性は、頻繁に相互交換可能に使用される。この点では、
パーセント相同性または同一性は、当業者に公知の方法により決定され得る。例
えば、ＧＡＰコンピュータプログラム（バージョン６．０）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒ
ｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能）を使用して配列情報を比較することによる
。このＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐ
ｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）により改訂された、Ｎｅｅｄｌｅｍａ
ｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））の
整列方法を利用する。手短には、ＧＡＰプログラムは、類似性を、２つの配列の
うちのより短い配列におけるシンボル（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸
）の全数で除される、類似である整列されたシンボルの数として規定する。

【００６８】 一般に、最高の大きさのマッチが得られるように、配列は整列される。「同一
性」とは、本来、当該分野で認識された意味を有し、そして公表された技術を用
いて算出され得る。（例えば、以下を参照のこと：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃ
ｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊ
ｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ Ｄａｔａ．Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆ
ｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、１９９４
；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８
７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓ
ｋｏｖ，Ｍ．および Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。２つのポリヌクレオチド配列またはポ
リペチド配列の間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、用語「同
一性」は、当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ、Ｈ．およびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ
．ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３ （１９８８））
。２つの配列の間の同一性または類似性を決定するために通常用いられる方法と
しては、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ」Ｍａｒｔｉｎ
Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１
９９４およびＣａｒｉｌｌｏ，ＨおよびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８）に開示される方法が挙げ
られるがこれらに限定されない。同一性および類似性を決定するための方法は、
コンピュータープログラムにおいて確認される。２つの配列の間の同一性および
類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法としては、ＧＣ
Ｇプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、Ｂ
ＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉ
ｏｌ ２１５：４０３（１９９０））が挙げられるがこれらに限定されない。

【００６９】 従って、本明細書において用いられる場合、用語「同一性」は、試験ポリペプ
チドまたは試験ポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチ
ドとの間の比較を示す。より詳細には、試験ポリペプチドは、参照ポリペプチド
に９０％以上同一である任意のポリペプチドと規定される。本明細書において用
いる場合、用語少なくとも９０％同一とは、参照ポリペプチドに対して９０〜９
９．９９％同一であることをいう。９０％以上のレベルの同一性とは、１００ア
ミノ酸の試験ポリヌクレオチド長および参照ポリヌクレオチド長の例示目的と仮
定した場合、試験ポリペプチドにおける１０％未満（すなわち、１００のうち１
０）のアミノ酸が参照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示す。この
ような差異は、本発明のアミノ酸配列の全長にわたって無作為に分布された点変
異として示され得るかまたは、最大許容数例えば、１／１４アミノ酸相違数（約
９０％同一性）まで長さを変化させる１つ以上の位置においてクラスター化され
得る。差異はアミノ酸置換または欠失として規定される。

【００７０】 異なるポリペプチド間の相対同一性の決定の例を、表１に示す。

【００７１】

【表１】 ％同一性を、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｐｅａｒｓｏｎのｌａｌｉｇｎプログラムにより
算出した。ｌａｌｉｇｎプログラムは、ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ（Ａｄｖ
．Ａｐｐｌ．Ｍｅｔｈ．１２：３３７−３５７（１９９１）に公開される）のア
ルゴリズムを実行する。このプログラムは、配列分析プログラムのＦＡＳＴＡパ
ッケージの一部である。デフォルトパラメーター（ＢＬＯＳＵＭ５０，ギャップ
ペナルティー：−１４／−４）を用いる包括的整列法を使用した。ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆ
ｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を参照のこと。

【００７２】 単離した（単離された）（Ｉｓｏｌａｔｅｄ）：天然状態から変化したことを
意味する用語。例えば、生存する動物において天然に存在するポリヌクレオチド
またはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存する物質か
ら分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その用語が本明細書
において使用される場合「単離されている」。従って、組換え宿主細胞内で生成
されるおよび／または組換え宿主細胞内に含まれるポリペチドまたはポリヌクレ
オチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。また、「単離された
ポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」と意図されるのは、部分
的にまたは実質的に、組換え型宿主細胞から、またはネイティブな供給源から精
製されたポリペチドまたはポリヌクレオチドである。例えば、配列番号１の化合
物の組換え的に生成されたバージョンおよびそれの誘導体は、Ｓｍｉｔｈおよび
Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載されている一
段法（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ）によって、実質的に精製され得る。用
語単離されたおよび精製されたは、時々交換可能に使用される。

【００７３】 「単離された（単離した）（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、ＤＮＡが、本発明の
ＤＮＡが誘導される生物の天然に存在するゲノム（もしあれば）において、本発
明のＤＮＡをコードしている遺伝子にすぐ隣接するそれらの遺伝子のコード配列
を含まないことを意味する。単離したＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であっ
てもよく、そしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え型ハイブリッドＤＮＡまたは
合成ＤＮＡであってもよい。それは、例えば配列番号１の化合物をコードしてい
るネイティブなＤＮＡ配列およびその誘導体と同一でもよく、または一つ以上の
ヌクレオチドの欠失、付加または置換によってこのような配列と異ってもよい。
本発明の一本鎖ＤＮＡは一般に少なくとも８つのヌクレオチド長（好ましくは少
なくとも１８ヌクレオチド長、そしてより好ましくは、少なくとも３０ヌクレオ
チド長）である。これは、配列番号１の化合物をコードするＤＮＡ分子およびそ
れらの誘導体の全長（すなわち、４２ヌクレオチド）にわたる；それらは、好ま
しくは、ハイブリダイゼーションプローブとしての用途のために検出可能に標識
され、そしてアンチセンスであってもよい。

【００７４】 生物学的細胞または宿主から作製された調製物を言及する場合の単離されたま
たは精製されたは、示されたＤＮＡを含有する任意の細胞抽出物または目的のＤ
ＮＡまたはタンパク質の粗製抽出物を含むタンパク質を意味すると理解されるべ
きである。例えば、タンパク質の場合、精製された調製物は、個々の技術または
一連の調製技術または生化学的技術に従って得られ得、そして目的のＤＮＡまた
はタンパク質は、これらの調製物中に種々の純度で存在し得る。これらの手順と
しては、例えば、硫酸アンモニウム分別、ゲル濾過、イオン交換変換（ｃｈａｎ
ｇｅ）クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、密度勾配遠心分
離および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。

【００７５】 「純粋」であるかまたは「単離された」ＤＮＡまたはタンパク質の調製物は、
通常はこのようなＤＮＡまたはタンパク質に天然で付随する、天然に存在する材
料を含まない調製物を意味すると理解されるべきである。「本質的に純粋」は、
少なくとも９５％の目的のＤＮＡまたはタンパク質を含有する「高度に」精製さ
れた調製物を意味すると理解されるべきである。

【００７６】 目的のＤＮＡまたはタンパク質を含有する細胞抽出物は、目的のタンパク質を
発現するか目的のＤＮＡを含む細胞から得られた均質化調製物または無細胞調製
物を意味すると理解されるべきである。用語「細胞抽出物」は、培養培地、特に
細胞が除去された使用後の培養培地を含むことを意図される。

【００７７】 （リーダー配列）：用語「リーダー配列」によって、例えば、配列番号１の化
合物に連結し、かつ選択的切断部位および配列番号１の化合物に融合した融合タ
ンパク質として宿主細胞において発現される、ポリヌクレオチド配列を意図され
る。用語「リーダーポリペプチド」は、融合タンパク質において得られるような
、「リーダー配列」の発現された形態を記載する。

【００７８】 融合タンパク質（これは、それが過剰発現される場合に、しばしば、不溶性で
あり、かつ封入体において見出される）は、当該分野において周知の方法によっ
て、他の細菌タンパク質から精製される。好ましい実施形態において、不溶性融
合タンパク質は、細胞溶解後に遠心分離および洗浄され、そしてグアニジンＨＣ
ｌを用いて再溶解される。それは、透析による変性剤の除去後に可溶性のままで
あり得る。（屈折タンパク質の精製については、Ｊｏｎｅｓ、米国特許第４，５
１２，９２２号；Ｏｌｓｏｎ、米国特許第４，５１８，５２６号；ならびにＢｕ
ｉｌｄｅｒら、米国特許第４，５１１，５０２号および同第４，６２０，９４８
号を参照のこと）。

【００７９】 例えば配列番号１の組換え産生された化合物、またはその誘導体は、種々の方
法論のいずれかの使用を通じて、可溶化された融合タンパク質から、天然の夾雑
物を実質的に含まないように精製され得る。本明細書中で用いられる場合、化合
物は、それが、細菌宿主細胞または真核生物宿主細胞における発現の後に、共に
見出される物質から実質的に精製されている場合に、「天然の夾雑物を実質的に
含まない」といわれる。配列番号１の化合物またはその誘導体は、標準的なクロ
マトグラフィー分離技術の適用により精製され得る。

【００８０】 あるいは、このペプチドは、免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いて
精製され得る（Ｒｏｔｍａｎ，Ａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ ６４１：１１４−１２１（１９８１）；Ｓａｉｒａｍ，Ｍ．Ｒ．Ｊ．Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇ ２１５：１４３−１５２（１９８１）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌ．Ｓ
．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：６４１０−６４１５（１９８２）；Ｖ
ｏｃｋｌｅｙ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１７：５３５−５４２（１９８
４）；Ｐａｕｃｈａ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６７０−６８１（１９８
４）；およびＣｈａｎｇ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０：２６１−
２６８（１９８５））。

【００８１】 部分的精製または実質的精製の後、融合タンパク質は、切断部位に対応する酵
素を用いて酵素的に処理される。あるいは、そのより不純な状態において融合タ
ンパク質は、たとえ屈折形態であっても、酵素を用いて処理され得る。必要とさ
れる場合、例えば配列番号１の得られた成熟化合物、またはその誘導体は、さら
に精製され得る。酵素処理の条件は、当業者に公知である。

【００８２】 （作動可能に連結される）：２つのＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域配
列およびＰＴＨ誘導体をコードする配列）は、２つのＤＮＡ配列間の連結の性質
が、（１）フレームシフト変異の導入を生じない場合、（２）プロモーター領域
配列が所望の配列の転写を指向する能力を妨害しない場合または（３）所望の配
列がプロモーター領域配列によって転写される能力を妨害しない場合に、作動可
能に連結されているといわれる。従って、プロモーター領域は、このプロモータ
ーがＤＮＡ配列を転写し得た場合に、所望のＤＮＡ配列に作動可能に連結される
。

【００８３】 ポリヌクレオチド：この用語は一般に、未改変のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは
改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまた
はポリデオキシリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ）をいう。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、
一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮ
Ａ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であり
得るか、より代表的には二本鎖または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であ
り得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるがこれらに限
定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。用語「ポリヌクレオチド」は
また、１以上の改変された塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ、および安定性に関
してまたは他の理由について改善された骨格を有するＤＮＡもしくはＲＮＡを含
む。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基およびイノシンのよ
うな普通でない塩基が挙げられる。種々の改変がＤＮＡおよびＲＮＡに行われて
いる；従って、「ポリヌクレオチド」は、天然に代表的に見出されるような、化
学的に、酵素的にまたは代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびに
ウイルスおよび細胞に特有の化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「ポリヌ
クレオチド」はまた、比較的短いポリヌクレオチド（しばしば、オリゴヌクレオ
チドと呼ばれる）を含む。

【００８４】 （ポリペプチド）：ポリペプチドおよびペプチドは、交換可能に使用される。
用語ポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合（すなわち、
ペプチド同配体）によって互いに連結された２以上のアミノ酸を含む任意のペプ
チドまたはタンパク質をいう。「ポリペプチド」は、短鎖（通常、ペプチド、オ
リゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる）およびより長い鎖（一般にタンパク
質と呼ばれる）の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子にコードされる２０種の
アミノ酸以外のアミノ酸を含み得、自然のプロセス（例えば、翻訳後プロセシン
グ）または当該分野で周知である化学的改変技術のいずれかによって改変された
アミノ酸配列を含む。このような改変は、基本的教科書に十分に記載されており
、そして単行本および調査文献に、より詳細に記載されている。改変は、ペプチ
ド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプ
チドにおいてどこでも生じ得る。同じ型の改変が所定のポリペプチドにおいて同
じまたは種々の程度でいくつかの部位に存在し得ることが認識される。また、所
定のポリペプチドは、多くの型の改変を含み得る。

【００８５】 ポリペプチドは分枝状であり得、そして分枝を含むかまたは含まない環状であ
り得る。環状ポリペプチド、分枝したポリペプチドおよび分枝した環状ポリペプ
チドは、翻訳後改変から生じてもよいし、または合成方法によって作製されても
よい。改変としては以下が挙げられる：アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシ
ル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファ
チジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合
、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチ
ンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコ
シル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨー素化、メチル化、ミリスト
イル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノ
イル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、タンパク質へのトランスファ
ーＲＮＡ媒介アミノ酸付加（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン結合。
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３およびＷｏ
ｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ
，１〜１２頁、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏ
ｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，編
、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３；Ｓｅｉｆｔｅ
ｒら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６（１９９０）ならびにＲａｔｔ
ａｎら「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏ
ｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ」Ａｎｎ ＮＹ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８〜６２（１９９２）を参照のこと。

【００８６】 プロモーター：一般的に、開始コドンの近位に位置する、遺伝子の５’領域と
記載されるＤＮＡ配列。隣接遺伝子の転写は、プロモーター領域で開始される。
プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤に応答して
増大する。対照的に、転写速度は、プロモーターが構成性プロモーターである場
合、誘導剤によって調節されない。プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモー
ター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＶ４０、ＭＭＴ
ＶおよびｈＭＴＩＩａプロモーター（米国特許第５，４５７，０３４号）、ＨＳ
Ｖ−１ ４／５プロモーター（米国特許第５，５０１，９７９号）ならびに前初
期ＨＣＭＶプロモーター（ＷＯ９２／１７５８１）が挙げられる。また、組織特
異的エンハンサーエレメントは、用いられ得る。さらに、このようなプロモータ
ーは、生物の組織特異的プロモーターおよび細胞特異的プロモーターを含み得る
。

【００８７】 （組換え宿主）：本発明によれば、組換え宿主は、発現ベクターまたはクロー
ニングベクター上の所望のクローニングされた遺伝子を含む、任意の原核生物宿
主細胞または真核生物細胞であり得る。この用語はまた、所望の遺伝子をその生
物の染色体またはゲノム中に含むように遺伝子操作された、原核生物細胞または
真核生物細胞を含むことを意味する。このような宿主の例については、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
８９）を参照のこと。好ましい組換え宿主は、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換
された真核生物細胞である。より詳細には、哺乳動物細胞が好ましい。

【００８８】 （選択的切断部位）：用語「選択的切断部位」とは、予想可能な様式で、化学
薬品または酵素のいずれかを用いて、選択的に切断され得るアミノ酸残基（単数
または複数）をいう。選択的な酵素切断部位とは、タンパク質分解酵素によって
認識されかつ加水分解されるアミノ酸またはペプチドの配列である。このような
部位の例としては、制限なしに、トリプシン切断部位またはキモトリプシン切断
部位が挙げられる。

【００８９】 （ストリンジェントハイブリダイゼーション） 本明細書中で使用される場合
、「ストリンジェントハイブリダイゼーション」条件は、ＤＮＡまたはＤＮＡお
よびＲＮＡの相補的断片間の少なくとも９５％の相同性を確立するために、当業
者により通常使用される条件であると理解されるべきである。

【００９０】 ＤＮＡの変性鎖へのハイブリダイゼーションが起きるための必要条件は３つし
かない。（１）サンプル中に相補一本鎖が存在しなければならない。（２）１本
鎖ＤＮＡの溶液のイオン強度は、塩基が互いに接近し得るようにかなり高くなけ
ればならず；操作上、これは０．２Ｍより上を意味する。（３）ＤＮＡ濃度は、
分子間衝突が妥当な頻度で起きるほど十分高く高くなければならない。第３の条
件は、速度のみに影響するが、再変性／ハイブリダイゼーションが起きるか否か
には影響しない。

【００９１】 当業者により慣用的に使用される条件は、容易に入手可能な手順テキスト（例
えば、Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｃｈａｐ．２．１０，Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９４）またはＳ
ａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）（これらの文章全体が本明細書中に参考として
援用される））に記述される。当業者に公知のように、最終的なハイブリダイゼ
ーションストリンジェンシーは、実際のハイブリダイゼーション条件およびハイ
ブリダイゼーション後の洗浄条件を反映し、そして当業者は、これらの条件を変
化させて所望の結果を得る適切な様式を理解する。

【００９２】 例えば、プレハイブリダイゼーション溶液は、所望の温度および所望のプレハ
イブリダイゼーション時間で、固体マトリックス上の非特異的部位へのハイブリ
ダイゼーションを可能にするために、十分な塩および非特異的ＤＮＡを含有する
べきである。例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーションのために、この
ようなプレハイブリダイゼーション溶液は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナト
リウム（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ；
ｐＨ７．０である）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．０５％ピロリン酸ナトリ
ウムおよび１００μｇ／ｍｌのニシン精液ＤＮＡを含有し得る。次いで、適切な
ストリンジェントハイブリダイゼーション混合物は、６×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡおよび０．０５％ピロリン酸ナ
トリウムを含む。

【００９３】 ＤＮＡ−ＤＮＡ分析のための代替条件は、以下を必要とする： １）室温でのプレハイブリダイゼーションおよび６８℃でのハイブリダイゼー
ション； ２）室温での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの洗浄； ３）所望の場合、４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでのさらなる洗
浄（穏やかなストリンジェンシー洗浄）；または ４）所望の場合、６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでのさらなる洗
浄（高ストリンジェンシー）。

【００９４】 以下の組成を含む公知のハイブリダイゼーション混合物（例えば、Ｃｈｕｒｃ
ｈ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ，ＵＳ
Ａ ８１：１９９１−１９９５ （１９８４）の混合物）もまた使用され得る：
１％結晶等級ウシ血清アルブミン／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．５Ｍ ＮａＨＰＯ₄
、ｐＨ ７．２／７％ ＳＤＳ。さらに、代替であるが類似の反応条件はまた、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）に見出され得る。ホルムアミドはまた、所望
の場合、プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション溶液に含まれ得
る。本発明は、ＰＴ誘導体をコードする核酸配列にストリンジェントにハイブリ
ダイズするＤＮＡ配列を含み得る。

【００９５】 （トランスジェニック） 本明細書中で使用される場合、「トランスジェニッ
ク」生物は、導入遺伝子を含有する生物であり、ここで導入遺伝子は、生物また
はその生物の先祖に、出生前段階（例えば、胚段階）で導入されていた。この導
入遺伝子は、その生殖細胞系に規定された変化を生じ、ここでこの変化は、通常
野生型生物には見出されない。この変化は、この生物の子孫まで継代し得、そし
て従ってその子孫もまたトランスジェニック動物である。生物の生殖細胞系への
変化は、目的の遺伝子における挿入、置換、または欠失であり得る。非ヒト動物
は、当該分野で公知の技術により導入遺伝子が導入され得る生物であり、このよ
うな動物としては、マウス、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシおよび他の家畜動物が挙
げられるがこれらに限定されない。トランスジェニック動物を作製するための方
法は、当該分野で慣例になり、そして例えば、Ｈｏｇａｎ Ｂ．ら，「Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎ．Ｙ，（１９８６）または米国特許第５，９２２，９２７号もしくは同第５，
９１７，１２３号に記載される。１つの導入遺伝子を保有するトランスジェニッ
ク動物は、第２の導入遺伝子を保有する別のトランスジェニック動物にさらに交
配されて、２つの導入遺伝子を保有する「二重トランスジェニック」動物を生成
し得る。

【００９６】 これらの条件は、限定的または制限することを意味せず、そして必要な場合に
、所望の目的を達成するために当業者によって調整され得るということが理解さ
れるべきである。

【００９７】 （本発明の化合物−構造的特徴ならびに機能的特徴） 簡便な非注射法により送達され得るのに十分に小さい、ＰＴＨの新規の「最小
型」改変体を本明細書中に記載する。このポリペプチドの１次１４アミノ酸に置
換基を有するより大きなＰＴＨ誘導体をまた記載する。新規のペプチドは、ネイ
ティブのＰＴＨの１〜３４、１〜３２、１〜３０、１〜２８、１〜２６、１〜２
４、１〜２２、１〜２０、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０
および１〜９アミノ酸配列に対応する。こののより短い改変体（≦ＰＴＨ１〜１
４）は、２，０００ダルトン未満の分子量を有する。

【００９８】 ネイティブヒトＰＴＨ（１−１４）ペプチド（Ｎ−末端〜Ｃ末端）の１次アミ
ノ酸配列は、ＳｅｒＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎ
ＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ（配列番号１４）であり、一方、このネイティブＰＴ
ＨｒＰ（１〜１４）ペプチド（Ｎ末端〜Ｃ末端）の１次アミノ酸配列は、Ａｌａ
ＶａｌＳｅｒＧｌｕＨｉｓＧｌｎＬｅｕＬｅｕＨｉｓＡｓｐＬｓｙＧｌｙＬｙｓ
Ｓｅｒ（配列番号１５）である。

【００９９】 この節において頻繁に、参照が、配列番号１のポリペプチドに対してなされる
。これは、単なる例示に過ぎず、これにより、本発明の他のポリペプチド配列に
対して任意の方法に限定することを暗示することを意味すべきではない。タンパ
ク質産物の場合、本発明の化合物は、液相ペプチド合成もしくは固相ペプチド合
成または組換え生物学の技術による産物に従う。

【０１００】 固相ペプチド合成技術は、特に、ヒトＰＴＨの産生に首尾良く適用されており
、そして配列番号１の化合物またはその誘導体の産生のために有用であり得る（
ガイダンスについては、Ｋｉｍｕｒａら、前出、を参照のこと、およびＦａｉｒ
ｗｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：２６９１（１９８３）を参照のこと）。比
較的大きな規模のヒトＰＴＨを産生することの成功は、Ｇｏｕｄら、Ｊ．Ｂｏｎ
ｅ．Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．６（８）：７８１（１９９１）（本明細書中で参考として
援用される）により報告されている。合成ペプチド合成アプローチは、一般的に
、自動合成機および固相として適切な樹脂の使用を必要とする。この樹脂は、配
列番号１の所望の化合物またはその誘導体のＣ末端アミノ酸に付着される。次い
で、Ｎ末端方向での、ペプチドの伸長は、代表的には、ＦＭＯＣ−またはＢＯＣ
−のいずれかに基づく化学プロトコルを用いて、合成が完了するまで、次に所望
されるアミノ酸の適切に保護された形態を、連続的にカップリングすることによ
り達成される。次いで、保護基は、通常、樹脂からのペプチドの切断と同時に、
ペプチドから切断され、次いでこのペプチドは、従来技術（例えば、溶媒として
アセトニトリルおよびイオン対形成剤（ｉｏｎ−ｐａｉｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）
としてトリフルオロ酢酸を用いる逆相ＨＰＬＣによる）を用いて単離され、そし
て精製される。このような手順は、一般に多数の刊行物に記載されており、そし
て例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）を、参照されても良い
。ペプチド合成アプローチが、遺伝的にコードされないアミノ酸を組み込む、例
えば、配列番号１およびその誘導体（例えば、ホモアルギニン）の生成のために
必要とされる。

【０１０１】 本発明の１つの局面において、１〜９位の任意のアミノ酸置換基そしてより詳
細には、アミノ酸の１０位、１１位、１２位、１３位、１４位および／または１
９位でのこれらのアミノ酸置換基であって、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプター
をアンタゴナイズまたはアゴナイズする（当業者に公知のアッセイおよび本明細
書中で議論されるアッセイにより決定されるような）ために、ＰＴＨポリペプチ
ドの生物学的活性を破壊しない置換基もまた、本発明の範囲内に含まれる。

【０１０２】 ウシＰＴＨ、ＰＴＨ（３〜３４）の合成アナログは、インビトロにおける強力
なＰＴＨアンタゴニストとして認識されている。Ｎ末端アミノ酸１〜２および１
〜７を欠くＰＴＨの改変体は、アゴニスト活性を欠き、そしてアンタゴニスト活
性の能力があることが示された（Ｂｏｒｎ，Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２
３：１８４８−１８５３（１９８８））。本発明の配列番号１の好ましい強力な
アンタゴニスト改変体は、Ｎ末端で短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｅ）された改変体で
ある。

【０１０３】 改変体が、Ｎ末端で１つのアミノ酸により短縮化される場合、それはアミノ酸
残基＃１を欠くが、アミノ酸残基＃２〜１４を含むという点で、ＰＴＨまたはＰ
ＴＨｒＰ（２〜１４）と称される。改変体がＣ末端で１つのアミノ酸により短縮
化される場合、それはアミノ酸残基＃１４を欠くが、アミノ酸残基＃１〜１３を
含むという点で、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ（１〜１３）と称される。この番号付
けシステムはまた、より短縮化されたＰＴＨの改変体に適用される。

【０１０４】 本発明の別の局面に従って、置換基は、当該分野において公知の標準的方法に
よって、例えば、配列番号１の化合物またはその誘導体のＮ末端アミノ酸の遊離
アミンに付加され得る。例えば、アルキル基（例えば、Ｃ_1-12アルキル）は、還
元的アルキル化を使用して付加され得る。ヒドロキシアルキル基（例えば、Ｃ_{1- 12} ヒドロキシアルキル）もまた、還元的アルキル化を使用して付加され得、ここ
では遊離ヒドロキシ基をｔ−ブチルエステルで保護する。アシル基（例えば、Ｃ
ＯＥ₁）は、遊離酸（例えば、Ｅ₁ＣＯＯＨ）をＮ末端アミノ酸の遊離アミン（ａ
ｍｉｎｏ）にカップリングすることにより、付加され得る。さらに、ポリペプチ
ドのＣ末端の強力な化学的改変体が、本発明の範囲内に含まれる。これらの改変
体は、レセプターに対する結合親和性を改変し得る。

【０１０５】 配列番号１の化合物もしくはその誘導体の二次構造または三次構造、または安
定性を変更し、なお生物学的活性を保持する、例えば、配列番号１のそれらの化
合物およびその誘導体もまた、本発明の範囲内と意図される。このような誘導体
は、ラクタム環化、ジスルフィド結合、または当業者に公知の他の手段を通して
達成され得る。

【０１０６】 （ベクター、宿主細胞、および組換え発現） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベ
クターで遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組換え技術による本発明のポリペ
プチドの産生に関する。細胞を含まない翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物由
来のＲＮＡを使用して、このようなタンパク質を産生するために使用され得る。

【０１０７】 組換え産生のために、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドについての発現
系またはその部分を組込むように遺伝子操作され得る。宿主細胞へのポリヌクレ
オチドの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン媒介性トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉ
ｏｎ）、微量注入、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポ
レーション、形質導入、切屑負荷（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道的導
入、または感染のような、多くの標準的実験室マニュアル（例えば、Ｄａｖｉｓ
ら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載される方法によって、もたらさ
れ得る。

【０１０８】 適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｉ細胞、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ細胞およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞）；真菌細胞
（例えば、酵母細胞およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞）；昆虫細胞（例えば、
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；
動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３
Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植
物細胞が挙げられる。

【０１０９】 非常に種々の発現系が、使用され得る。このような系としては、特に、染色体
由来の系、エピソーム由来の系およびウイルス由来の系（例えば、細菌性プラス
ミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、トランスポゾン由来
のベクター、酵母エピソーム由来のベクター、挿入エレメント由来のベクター、
酵母染色体エレメント由来のベクター、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、
パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、
家禽ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）由来のベク
ター、ならびにそれらの組合せ由来のベクター（例えば、プラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝的エレメント（例えば、コスミドおよびファージミド）由来
のベクター）が挙げられる。発現系は、発現を調節しならびに発現を生じる制御
領域を含み得る。一般に、宿主においてポリペプチドを産生するためにポリヌク
レオチドを維持、増殖または発現するために適切な任意の系またはベクターが、
使用され得る。適切なヌクレオチド配列は、任意の種々の周知および慣用的な技
術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（前出）に示される技術）によって、発現
系へ挿入され得る。

【０１１０】 ＲＮＡベクターはまた、本発明に開示される本発明の化合物またはその誘導体
をコードする核酸の発現のために利用され得る。これらのベクターは、広範な種
々の真核生物細胞において天然に複製される、＋（プラス）鎖または−（マイナ
ス）鎖のＲＮＡウイルスに基づく（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．およびＲｉ
ｃｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：２９７−３１０、１９９２）。レトロ
ウイルスとは異なり、これらのウイルスは、ＲＮＡ形態において完全に存在する
、中間のＤＮＡライフサイクル相を欠如する。例えば、αウイルスは、外来タン
パク質のための発現ベクターとして使用される。なぜなら、これらは、広範囲の
宿主細胞において利用され得、そして高レベルの発現を提供し得るからである；
この型のウイルスの例としては、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイル
スが挙げられる（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１８
−２２、１９９３；Ｆｒｏｌｏｖ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．（ＵＳＡ）９３：１１３７１−１１３７７、１９９６）。Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎのシンビス発現系によって例示されるように、研究者らは、簡便に、研究
室でＤＮＡ形態（ｐＳｉｎｒｅｐ５プラスミド）において組換え分子を維持し得
るが、ＲＮＡ形態における増殖も同様に可能である。発現のために使用される宿
主細胞において、目的の遺伝子を含むベクターは、完全にＲＮＡ形態で存在し、
そして所望であれば、この状態において連続的に増殖され得る。

【０１１１】 翻訳されたタンパク質の、小胞体の管腔への分泌、ペリプラズム空間への分泌
または細胞外環境への分泌について、適切な分泌シグナルは、所望のポリペプチ
ドへ組み込まれ得る。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり
得るか、またはこれらは、異質性シグナルであり得る。

【０１１２】 ＤＮＡ配列の発現は、そのＤＮＡ配列が転写調節情報および翻訳調節情報を含
むＤＮＡ配列に「作動可能に連結される」必要がある。作動可能な連結は、制御
ＤＮＡ配列または調節ＤＮＡ配列および発現されようとしているＤＮＡ配列が、
遺伝子発現を許容するような方法で連結される、連結である。遺伝子発現のため
に必要な「制御領域」の正確な性質は、生物間で変化し得るが、一般に、プロモ
ーター領域（原核生物細胞において、プロモーター（これは、ＲＮＡ転写の開始
を指向する）ならびにＤＮＡ配列（ＲＮＡへ転写される場合に、タンパク質合成
の開始をシグナル伝達する）の両方を含む）を含む。真核生物細胞における調節
領域は、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指向するに十分なプロモーター領域を含む
。

【０１１３】 本発明の発現ベクターを生成するための、種々のＤＮＡフラグメントの結合は
、従来の技術に従い、連結のために平滑末端または付着末端、適切な末端を提供
するための制限酵素消化、適切な粘着末端の充填、望まない結合を回避するため
のアルカリおよびホスファターゼ処理、ならびに適切な連結物との連結を使用し
て、実施される。融合タンパク質の場合において、遺伝的構築物は、この融合タ
ンパク質の５’遺伝子配列に作動可能に連結された誘導性プロモーターをコード
して、この融合タンパク質の効率的な発現を可能にする。

【０１１４】 原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどのような）において、本発明の化合
物またはその誘導体を発現するために、例えば、配列番号１をコードするＤＮＡ
配列を機能性原核生物プロモーターに作動可能に連結する必要がある。このよう
なプロモーターは、構成性であり得るか、またはより好ましくは、調節性（すな
わち、誘導性または抑制解除性（ｄｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ））であり得る。構成
性プロモーターの例としては、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐ
ＢＲ３２２のβラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＢＲ３２５
のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモータ
ーなどが挙げられる。誘導性原核生物プロモーターの例としては、バクテリオフ
ァージλの主要な（ｍａｊｏｒ）右鎖プロモーターおよび左鎖プロモーター（Ｐ
ＬおよびＰＲ）、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩおよび
ｇａｌプロモーター、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２（１９８５））、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｇｅｎｅ
３２：１１−２０（１９８４））、Ｂａｃｉｌｌｉｕｓのバクテリオファージの
プロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．Ｊ．：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８２））、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのプロモー
ター（Ｗａｒｄ，Ｊ：Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−
４７８（１９８６））が挙げられる。原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ，Ｂ
．Ｒ．、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２（１９８７）；
Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ，Ｙ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６（１
９８６））；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．
１８：４１５−４４２（１９８４）によって総説されている。

【０１１５】 本発明のために好ましい原核生物プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロ
モーターであり、これは、インドールアクリル酸に対して誘導性である。

【０１１６】 発現が真核生物細胞（例えば、酵母、真菌、哺乳動物細胞、または植物細胞）
において所望される場合、このような真核生物宿主において転写を指向し得るプ
ロモーターを使用することが必要である。好ましい真核生物プロモーターとして
は、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８ （１９８２））；ヘルペス
ウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．、Ｃｅｌｌ ３１：３５
５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．
ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０（１９８１））；な
らびに酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５（１
９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））が挙げられる。

【０１１７】 好ましくは、導入される遺伝子配列は、レシピエント宿主において自立的に複
製し得るプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる。任意の広範な種々
のベクターが、この目的のために使用され得る。特定のプラスミドまたはウイル
スベクターを選択する際に重要な因子としては、以下が挙げられる：ベクターを
含むレシピエント細胞が、ベクターを含まないレシピエント細胞を認識し得、そ
してその細胞から選択され得る、容易性；特定の宿主において所望されるベクタ
ーのコピー数；および異なる種の宿主細胞間でベクターを「往復（ｓｈｕｔｔｌ
ｅ）」し得ることが望ましいか否か。

【０１１８】 好ましい原核生物ベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて複製可能なプラス
ミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ １８４
、πＶＸのような）が挙げられる。このようなプラスミドは、例えば、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）によって開示される
。好ましいプラスミド発現ベクターとしては、ｐＧＦＰ−１プラスミド（Ｇａｒ
ｄｅｌｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４−１５８５９（１
９８９）に記載される）；またはｐＥＴベクターの１つに基づく改変プラスミド
（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＤｕｎｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ １８５：６０−８９（１９９０）に記載される）が挙げられる。Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓプラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などが挙げら
れる。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、３０７−３２９頁（１９８２）によって開示される。適切な
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドとしては、ｐＩＪＩＯＩ（Ｋｅｎｄａｌｌ
，Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３（１９８
７））、およびｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ（例えば、φＣ３
１（Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．ら：Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓ
ｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ、４５−
５４頁（１９８６））が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミドは、Ｊ
ｏｈｎ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４（１
９８６）、およびＩｚａｋｉ，Ｋ．、Ｊｏｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：
７２９−７４２（１９７８）によって総説される。

【０１１９】 好ましい真核生物発現ベクターとしては、限定はしないが、ＢＰＶ、ワクシニ
ア、２−ミクロンサークル（２−ｍｉｃｒｏｎ ｃｉｒｃｌｅ）などが挙げられ
る。このような発現ベクターは、当該分野において周知である（Ｂｏｔｓｔｅｉ
ｎ，Ｄ．ら、Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４（１９８
２）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃ
ｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、４
４５−４７０頁（１９８１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．、Ｃｅｌｌ ２８：２０
３−２０４（１９８２）；Ｂｏｌｌｏｎ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａ
ｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．
：Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉ
ｓｅ、第３巻、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，ＮＹ、５６３−６０８頁（１９８０））。

【０１２０】 微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞の培養物もまた、宿主として使用され
得る。原理的に、任意のこのような細胞培養物は、脊椎動物細胞供給源または無
脊椎動物細胞供給源のいずれかから実行可能である。しかし、脊椎動物供給源由
来の細胞を用いるものが、大いに興味深い。有用な脊椎動物宿主細胞株の例は、
ＶＥＲＯ細胞株およびＨｅＬａ細胞株、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞
株、ＷＩ３８細胞株、ＢＨＫ細胞株、ＣＯＳ−７細胞株、およびＭＤＣＫ細胞株
である。このような細胞のための発現ベクターは、通常（必要であれば）、任意
の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位およ
び転写終結部位とともに、複製起点、発現される遺伝子の前またはその上流に位
置するプロモーターを含む。

【０１２１】 哺乳動物細胞における使用に関しては、発現ベクターの制御機能は、しばしば
、ウイルス物質により提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、
ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびサイ
トメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期
プロモーターは、特に有用である。なぜなら、両方とも、ＳＶ４０ウイルスの複
製起点もまた含むフラグメントとしてこのウイルスから容易に得られるからであ
る（Ｆｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３（１９７８））。

【０１２２】 複製起点は、ベクターの構築により以下のいずれかを提供されて、外因性の起
点（ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰ
Ｖ）の供給源由来であってもよく、宿主細胞染色体複製機構により提供されても
よい）を含み得る。ベクターが宿主染色体に組み込まれる場合、後者はしばしば
充分である。

【０１２３】 多くの（ｆｏｒｍｉｄａｂｌｅ）細胞膜障壁のない細胞が宿主細胞として使用
される場合、トランスフェクションは、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅ
ｒｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５４６（１９７８）に記載されるように、リン
酸カルシウム沈澱法により行われる。しかし、細胞にＤＮＡを導入するための他
の方法（例えば、核注入によるか、またはプロトプラスト融合による）もまた使
用され得る。遺伝子治療の場合では、トランスフェクション促進剤（例えば、リ
ポソームが挙げられるが、これに限定されない）の有無に拘わらず、裸のプラス
ミドまたはウイルスＤＮＡの直接注入法が、哺乳動物細胞のインビボまたはイン
ビトロのトランスフェクションという現在の方法に対する代替アプローチを提供
する。実質的な細胞壁構築物を備える原核生物細胞が使用される場合、好ましい
トランスフェクション法は、Ｃｏｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０（１９７２）に記載のように、塩化カルシウムを
用いたカルシウム処理である。

【０１２４】 （遺伝子治療） ＰＴＨを必要とする骨粗しょう症または他の疾患のような疾患の症状を患った
患者（ヒトまたは非ヒト）は、遺伝子治療によって処置され得る。このアプロー
チを受けることによって、この疾患症状の減衰が存在すべきである。遺伝子治療
は、以下において効果的であると証明されるか、または見込みが有ると考えられ
る：ヒトの血友病の特定の形態の治療において（Ｂｏｎｔｅｍｐｏ，Ｆ．Ａ．ら
、Ｂｌｏｏｄ ６９：１７２１−１７２４（１９８７）；Ｐａｌｍｅｒ，Ｔ．Ｄ
．ら、Ｂｌｏｏｄ ７３：４３８−４４５（１９８９）；Ａｘｅｌｒｏｄ，Ｊ．
Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：５１７３−５
１７７（１９９０）；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５（１９９０））；ならびに以
下のような他の哺乳動物の処置において：嚢胞性線維症（Ｄｒｕｍｍ，Ｍ．Ｌ．
ら、Ｃｅｌｌ ６２：１２２７−１２３３（１９９０）；Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｒ．
Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３４７：３５８−３６３（１９９０）；Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｐ
．ら、Ｎａｔｕｒｅ３４７：３５８−３６３（１９９０））、ゴシェ病（Ｓｏｒ
ｇｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４ ９０６
−９０９（１９８７）；Ｆｉｎｋ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２３３８（１９９０））、筋ジストロフィー（Ｐａｒ
ｔｒｉｄｇｅ，Ｔ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：１７６−１７９（１９８９
）；Ｌａｗ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｌａｎｃｅｔ ３３６：１１４−１１５（１９９０）
；Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：２４３７−２
４４９（１９９０））および転移性黒色腫（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：１３１８−１３２１（１９８６）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇ，Ｓ．Ａ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：１６７６−１６８０（１９
８８）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．らＮ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３：５
７０−５７８（１９９０））。より最近になって、遺伝子治療は、前立腺癌（Ｈ
ｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１２３９−１２
４９（１９９９））および転移性黒色腫（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ，Ｊ．ら、Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０：１２８９−１２９８（１９９９））を患った患
者において抗癌活性または抗腫瘍活性を提供することが示されている。さらに、
数種の特許が、遺伝子治療の方法に与えられている。例えば、米国特許第５，８
３６，９０５号、同第５，７４１，４８６号、同第５，８７１，４８６号、およ
び同第５，６５６，４６５号。

【０１２５】 好ましいアプローチにおいて、ＰＴＨポリペプチド誘導体に関して、ヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドは、形質移入ベクターを形成するために、処
理されるべき哺乳動物の細胞中に核酸分子を導入するのに適したベクター中に取
り込まれ得る。

【０１２６】 種々のベクターが、遺伝子送達および強力な遺伝子治療のために開発された。
この目的のために適切なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルスお
よびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられる。あるいは、本発明の核酸分子
は、ウイルス（例えば、アデノウイルス）またはウイルス成分（例えば、ウイル
ス性カプシドタンパク質）との分子結合体に複合化され得る。このベクターは、
単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（
ＡＶＶ）およびレトロウイルス構築物由来である（概説のために、例えば、Ｆｒ
ｉｅｄｍａｎｎ，Ｔ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １０：２１０−２１４（１
９９４）；Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １（
１９９４）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９
３２（１９９３）；Ｓｍｉｔｈ，Ｆ．ら、Ｒｅｓｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．８：２１−３４（１９９５）を参照のこと）。ＨＳＶ−１に基づくベク
ター（組換えウイルスベクターおよびアンプリコンベクターの両方を含む）およ
びアデノウイルスベクターは、細胞核中での染色体外状態および有糸分裂後の細
胞（有糸分裂細胞ではない）中での制限された長期の遺伝子発現を想定し得る。
ＨＳＶ−１アンプリコンベクターは、比較的高度のタイター（１０⁷形質導入ユ
ニット／ｍｌ）まで増殖され得、そして外来ＤＮＡ（少なくとも１５ｋｂ（１ビ
リオンあたり１０鎖状のコピーを有する））の大きなフラグメントに順応する能
力を有する。ＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）（アンプリコンベクターに適切なタイ
ターで利用可能である）は、有糸分裂後に遺伝子（＜４．５ｋｂ）を、ヘルパー
ウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスと組合せた有糸分裂細胞
を送達し得る。長期の導入遺伝子の発現を、「エピゾーム」エレメントの複製お
よび形成によって、ならびに／またはランダム部位または特異的部位で宿主細胞
ゲノムへの組込みを介して達成される（概説のために、Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．
Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：７４−８０（１９９３）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｎ．
，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１２９（
１９９２）を参照のこと）。ＨＩＶ、アデノウイルスおよびｒＡＶＶベクターは
、安定な粒子中に全てパッケージングされる。レトロウイルスベクターは、７〜
８ｋｂの外来ＤＮＡに適応し、そして有糸分裂細胞中でのみ宿主細胞ゲノム中に
組み込まれ、そして粒子は、低いタイターで比較的不安定である。最近の研究に
よると、異なるウイルスからのエレメントがベクターの送達能力を増大するよう
に組合せられ得ることが示された。例えば、ＨＩＶビリオンのエレメント（マト
リクスタンパク質およびインテグラーゼを含む）をレトロウイルスベクターに取
り込むことで、導入遺伝子カセットを非有糸分裂細胞および有糸分裂細胞の核に
入れること、ならびにこれらの細胞のゲノムに取り込むことを可能にし（Ｎａｌ
ｄｉｎｉ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：２６３−２６７（１９９６））；そ
して水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）の封入は、
レトロウイルス粒子の安定性を増大させる（Ｅｍｉ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６
５：１２０２−１２０７（１９９１））。

【０１２７】 ＨＳＶ−１は、細胞の核中で複製および転写される二重鎖ＤＮＡウイルスであ
る。ＨＳＶ−１は、溶解性サイクルと潜伏性サイクルの両方を有する。ＨＳＶ−
１は、広範な宿主範囲を有し、そして哺乳動物および鳥類（ニワトリ、ラット、
マウスサル、およびヒトを含む）の中の多くの細胞型を影響を与える（Ｓｐｅａ
ｒら、ＤＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｊ．Ｔｏｏｚｅ編（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１，第６１５頁〜７４６頁））。ＨＳＶ−１は
、ニューロン、線維芽細胞およびマクロファージを含む広範な種々の細胞を溶解
感染し得る。さらに、ＨＳＶ−１は、成人動物において有糸分裂後のニューロン
に感染し、潜伏状態で無期限に維持され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ ７０：３１（１９７０）。潜伏ＨＳＶ−１は、遺伝子を発現し得る。

【０１２８】 ＡＡＶはまた、広範の宿主範囲を有し、そしてほとんどのヒト細胞は、感染さ
れると考えられている。組込みのための宿主範囲は、同様に幅広いと考えられる
。ＡＡＶは、ヒトの集団に対して内因的な単鎖ＤＮＡパルボウイルスであり、安
定な遺伝子治療ベクター候補物にする。ＡＡＶは、任意の疾患と関係なく、従っ
て、遺伝子の転移適用を安全にする（Ｃｕｋｏｒら、Ｔｈｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒ
ｕｓｅｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．，（１９８４）
第３３〜３６頁；Ｏｓｔｒｏｖｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１１３：５２１（１９８
１））。ＡＡＶは、感染で宿主ゲノムに取り込み、その結果、導入遺伝子は、無
限に発現され得る（Ｋｏｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ８７：２２１（１９９０）；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｅｍｂｏ Ｊ．１０：３
９４１（１９９１））。ＡＡＶの細胞ゲノムへの組込みは、細胞の複製と独立し
ており、このことは、ＡＡＶが遺伝子を静止状態の細胞へ転移し得るので、特に
重要である（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８
８（１９８８））。

【０１２９】 ＨＳＶとＡＶＶの両方は、分割細胞および非分割細胞に遺伝子を送達し得る。
一般に、ＨＳＶウイルスは、ＨＳＶに対して１０の範囲（Ｂｒｏｗｎｅ，Ｈ．ら
、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４３１１−４３１６（１９９６））およびＡＡＶに対
して１０００までの範囲（Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．ら、ＩｎＣｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ編、Ｄｒａｃｏｐｏｌ
ｉ，Ｎ．ら、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９
６）第１〜２４頁）のウイルス粒子：感染ユニットの比率でＡＡＶウイルスより
もより高度に感染し、そして両方は、幅広い種類の範囲を有すると考えられる。
さらに、各ビリオンは、特定の細胞型の感染の有効性に影響を与える特定の栄養
機能を有する。腫瘍壊死因子αファミリーのメンバーであるＨＳＶ−１に対する
膜レセプターの最近の検証（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、Ｒ．Ｉ．ら、２１ｓｔ Ｈ
ｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｗｉｒｋｓｈｏｐ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃１６７（１
９９６））によると、ほとんどの動物細胞型がＨＳＶ−１に感染可能であるよう
だとしても、このレセプターの分配は、細胞の相対的感染能力に影響を与えるこ
とを示している。ＡＡＶはまた、非常に広範の宿主および細胞型範囲を有する。
ＡＡＶに対する細胞レセプターは、未知であるが、１５０ｋＤＡの糖タンパク質
は、記載されており、培養細胞中でのこの存在は、ＡＡＶと結合するそれらの能
力と相関する（Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１７：１２４−１
３０（１９９６））。

【０１３０】 このようなベクターの形成のための技術は、当該分野で周知であり、そして一
般に「Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｔｏｗａｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
」の第２章ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，第２版、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら
編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、
第５６７〜５８１頁（１９９２）に記載されている。さらに、遺伝子治療ベクタ
ーの構築物および治療目的のための感染した動物へのその導入のための一般的な
方法は、上記で参照した刊行物に見出され得、これらの開示は、本明細書中でそ
の全体が参考として特に援用される。

【０１３１】 一つの一般的な方法において、ＰＴＨ誘導遺伝子をコードするポリヌクレオチ
ドを含むベクターは、好ましくは、注入、吸入、摂取または溶液で粘膜に導入す
ることによって、影響を受けた固体の細胞または組織に直接的に導入され；この
ようなアプローチは、一般的に「インビボ」遺伝子治療と呼ばれている。あるい
は、細胞または組織（例えば、骨髄由来の造血細胞）は、影響を受けた動物から
取り出されて、そして当業者に周知の方法に従って培地に配置され；次いで、ポ
リヌクレオチドを含むベクターが、細胞または組織へ単離されたポリヌクレオチ
ドを導入するための一般に上記の任意の方法によってこれらの細胞または組織に
導入され、そして十分な時間後にポリヌクレオチドの取り込みを可能にし、次い
で、細胞または組織は、処置が必要な影響を受けた動物または第２動物へ再挿入
され得る。目的のＤＮＡの導入は影響を受けた動物の体の外で行われるので、こ
のアプローチは、一般に、「エキソビボ」遺伝子治療と呼ばれている。

【０１３２】 インビボ遺伝子治療とエキソビボ遺伝子治療の両方について、本発明のポリヌ
クレオチドは、代替的に制御ＤＮＡ配列（この配列は、非相同的調節ＤＮＡ配列
であり得る）に作動的に連結されており、上記のように遺伝子構築物を形成する
。次いで、この遺伝子構築物は、ベクターに挿入され得、これは、次いで、イン
ビボ遺伝子治療アプローチにおいて影響を受けた動物に、またはエキソビボアプ
ローチにおいて影響を受けた動物の細胞または組織に直接的に導入される。別の
好ましい実施形態において、この遺伝子構築物は、ウイルス（例えば、アデノウ
イルス）またはウイルス成分（例えば、ウイルスカプシドタンパク質）との分子
結合体で、インビボまたはエキソビボのいずれかで動物の細胞または組織に導入
され得る。

【０１３３】 上記のアプローチは、（ａ）罹患した動物の細胞におけるこの核酸分子と欠陥
遺伝子との間の相同組換え、（ｂ）宿主細胞のゲノムへのこの遺伝子のランダム
挿入；または（ｃ）細胞の核へのこの遺伝子の組み込み（ここで、この遺伝子は
染色体外の遺伝因子として存在し得る）を生じる。このような遺伝子治療のため
の方法およびアプローチの一般的な記載は、例えば、米国特許第５，５７８，４
６１号；ＷＯ９４／１２６５０；およびＷＯ９３／０９２２２において見出され
得る。

【０１３４】 あるいは、トランスフェクトされた宿主細胞（これは、同種または異種であり
得る）は、半透過性バリアデバイス内に封入され得、そして罹患した動物に移植
され、例えば、ＰＴＨポリペプチド誘導体の、この動物の組織および循環への通
過を可能にするが、この動物の免疫系とこのトランスフェクトされた細胞との間
の接触を防止する（ＷＯ９３／０９２２２を参照のこと）。

【０１３５】 （本発明の化合物の有用性および投与） 本発明の化合物またはその誘導体は、複数の用途を有する。これらとしては、
とりわけ、ＰＴＨレセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト、骨質量の損失
によって現れる種々の哺乳動物の状態の予防および処置、診断プローブ、診断プ
ローブおよびさらに分子量マーカーとしての使用のための抗体を調製するための
抗原が挙げられる。ＰＴＨポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸を特異的に置換
し得ることは、要求に応じた特定の分子量のポリペプチドの合成を可能にする。

【０１３６】 特に、本発明の化合物は、ヒトにおける骨粗しょう症およびオステオペニアの
予防処置および治療処置に関して記載される。さらに、本発明の化合物は、他の
骨疾患の予防処置および治療処置に関して記載される。本発明の化合物はまた、
上皮小体低下症の予防処置および治療処置に関して記載される。最終的に、本発
明の化合物は、骨折修復のためのアゴニストとしての使用、および高カルシウム
血症のためのアンタゴニストとしての使用に関して記載される。

【０１３７】 一般に、例えば、配列番号１の化合物、またはその誘導体、あるいはそれらの
塩は、１日あたり約０．０１μｇ／ｋｇ体重と１μｇ／ｋｇ体重との間、好まし
くは、１日あたり約０．０７〜約０．２μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。５０
ｋｇのヒト女性被験体に関しては、生物学的に活性な化合物の毎日の用量は、約
０．５〜約５０μｇ、好ましくは約３．５〜約１０μｇである。他の哺乳動物（
例えば、ウマ、イヌ、およびウシ）においては、より高い用量が必要であり得る
。この用量は、最も有効な結果を達成するために必要とされるように、１回の投
与により、複数回の適用により、または徐放により、好ましくは、１日１回以上
の注射により、従来の薬学的組成物において送達され得る。例えば、この投薬量
は、経鼻吸入法により、従来の薬学的組成物において送達され得る。

【０１３８】 正確な用量および組成物ならびに最も適切な送達レジメンの選択は、特に、選
択された本発明の化合物の薬理学的特性、処置される状態の性質および重篤度、
ならびにレシピエントの物理的状態および精神的明瞭度により影響される。

【０１３９】 代表的な好ましい送達レジメンとしては、経口、非経口、皮下、経皮、筋肉内
および静脈内、直腸、口内（舌下を含む）、経皮、および経鼻吸入法が挙げられ
るが、これらに限定されない。

【０１４０】 薬学的に受容可能な塩は、有毒な副作用なく、本発明の化合物の所望される生
物学的活性を保持する。このような塩の例としては、（ａ）無機酸（例えば、塩
酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）を用いて形成された酸付加塩；有機
酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グル
コン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸
（ｐａｍｏｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスル
ホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸など）を用いて形成され
た酸付加塩；（ｂ）多価金属カチオン（例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、
バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム
など）を用いて形成された塩基付加塩；またはＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジ
アミンまたはエチレンジアミンから形成された有機カチオンを用いて形成された
塩基付加塩；あるいは（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組み合わせ（例えば、亜鉛の
タンニン酸塩など）である。薬学的に受容可能な緩衝液としては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水。当業者
に公知な受容可能な防腐剤もまた、これらの溶液に含まれ得る。

【０１４１】 本発明のさらなる局面は、薬学的に受容可能な非毒性キャリアとの混合物中に
、活性成分として、本発明の化合物または本発明のそれらの誘導体、あるいは薬
学的に受容可能なそれらの塩を含む薬学的組成物に関する。上記のように、この
ような組成物は、非経口（皮下、経皮、筋肉内または静脈内）投与のために、特
に、液体溶液または懸濁液の形態で；経口または口内投与のために、特に錠剤ま
たはカプセル剤の形態で；直腸、経皮投与のために；および鼻腔内投与のために
、特に散剤、経鼻小滴またはエアロゾルの形態で調製され得る。

【０１４２】 この組成物は、単位投薬形態で簡便に投与され得、そして薬学分野において周
知の任意の方法（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，Ｍａ
ｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（１９
８５）に記載）によって調製され得る。非経口投与のための処方物は、賦形剤（
滅菌水または生理食塩水、アルキレングリコール（例えば、プロピレングリコー
ル）、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、植物起
源の油、硬化ナフタレンなど）を含み得る。経口投与に関しては、この処方物は
、胆汁酸塩またはアシルカルニチンの付加により増強され得る。経鼻投与のため
の処方物は、固体であってもよく、そして賦形剤（例えば、ラクトースまたはデ
キストラン）を含み得るか、経鼻ドロップまたは用量測定スプレーの形態で使用
するための水溶液または油溶液であってもよい。口内投与に関しては、代表的な
賦形剤として、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、予め
ゼラチン様にしたデンプンなどが挙げられる。

【０１４３】 最も好ましい投与経路である経鼻投与のために処方される場合、鼻粘膜を通る
吸収は、界面活性剤の酸（例えば、グリココール酸、コール酸、タウロコール酸
、エトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸
、グリコデオキシコール酸、シクロデキストリンなど）の約０．２〜１５重量％
の間、好ましくは約０．５〜４重量％の間、最も好ましくは約２重量％の範囲の
量により増強され得る。

【０１４４】 本発明の化合物を長期間（例えば、１週間から１年）にわたり被験体に送達す
ることは、所望の放出期間にわたり十分な活性成分を含む徐放系の１回の投与に
より達成され得る。種々の徐放系（例えば、モノリシックまたはリザーバ型マイ
クロカプセル、デポー（ｄｅｐｏｔ）インプラント、浸透圧ポンプ、小胞、ミセ
ル、リポソーム、経皮パッチ、イオン導入デバイスおよび代替的な注射可能投薬
形態）がこの目的のために利用され得る。活性成分の送達が所望される部位にお
ける局在化は、特定の障害の処置において利益があることが証明され得るいくつ
かの徐放デバイスのさらなる特徴である。

【０１４５】 徐放性処方物の１つの形態は、ゆっくりと分解され、非毒性で、非抗原性のポ
リマー（例えば、Ｋｅｎｔ，Ｌｅｗｉｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ，およびＴｉｃｅ，米
国特許第４，６７５，１８９号（本明細書中に参考として援用される）の先駆的
研究において記載される、コポリ（乳酸／グリコール酸））中に分散されるか、
またはカプセル化される、ポリペプチドまたはその塩を含む。この化合物、また
は好ましくはそれらの比較的不溶性の塩もまた、コレステロールもしくは他の脂
質マトリクスペレット、またはシラストマー（ｓｉｌａｓｔｏｍｅｒ）マトリク
スインプラントに処方され得る。さらなる遅延型放出、デポーインプラントまた
は注射可能処方物は当業者に明らかである。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎ
ｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉ
ｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８，およびＲ．Ｗ．Ｂａｋｅｒ，Ｃｏｎｔｒ
ｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ
Ａｇｅｎｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８
７（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。

【０１４６】 ＰＴＨと同様に、ＰＴＨ改変体は、所定の臨床状態を処置する際に有用な他の
薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、骨粗しょう症および他の骨関連障害
を処置する場合、ＰＴＨ改変体は、カルシウム補助食品またはビタミンＤアナロ
グとともに投与され得る（米国特許第４，６９８，３２８号を参照のこと）。あ
るいは、ＰＴＨ改変体は、例えば、米国特許第４，７６１，４０６号に記載の二
リン酸と組み合わせて、またはカルシトニンおよびエストロゲン（限定はされな
い）のような１つ以上の骨治療剤と組み合わせて、好ましくは、循環的治療レジ
メンを用いて投与され得る。

【０１４７】 （本発明の化合物またはその誘導体のレセプターシグナル伝達活性） ホルモン作用の発現における重大な工程は、ホルモンと、標的細胞の原形質膜
表面上のレセプターとの相互作用である。ホルモン−レセプター複合体の形成は
、細胞への細胞外シグナルの伝達を可能にし、種々の生物学的応答を誘発する。

【０１４８】 本発明のポリペプチドは、ｃＡＭＰ蓄積アッセイを使用して、それらのアゴニ
ストまたはアンタゴニストの特性についてスクリーニングされ得る。その細胞表
面上にＰＴＨ−１レセプターを発現する細胞を、２ｍＭ ＩＢＭＸ（３−イソブ
チル−１−メチル−キサンチン、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在
下、ネイティブＰＴＨ（１−８４）と共に５〜６０分間、３７℃でインキュベー
トする。サイクリックＡＭＰ蓄積を、特異的放射免疫アッセイによって測定する
。ＰＴＨ−１レセプターへの結合についてネイティブＰＴＨ（１−８４）または
ＰＴＨ（１−３４）と競合し、そしてｃＡＭＰ蓄積に対するネイティブＰＴＨ（
１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）の効果を阻害する本発明の化合物を、競合
的アンタゴニストとみなす。このような化合物は、高カルシウム血症を処置する
ために有用である。

【０１４９】 反対に、ＰＴＨ−１レセプターへの結合についてネイティブＰＴＨ（１−８４
）またはＰＴＨ（１−３４）と競合しないが、なおｃＡＭＰ蓄積のネイティブＰ
ＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）の活性化を妨げる（おそらく、レセ
プター活性化部位をブロックすることによる）、本発明の化合物またはその誘導
体を、非競合的アンタゴニストとみなす。このような化合物は、高カルシウム血
症を処置するために有用である。

【０１５０】 ＰＴＨ−１レセプターへの結合についてネイティブＰＴＨ（１−８４）または
ＰＴＨ（１−３４）と競合し、そしてネイティブＰＴＨ（１−８４）またはＰＴ
Ｈ（１−３４）の存在下または非存在下でｃＡＭＰ蓄積を刺激する本発明の化合
物またはその誘導体は、競合的アゴニストである。ＰＴＨ−１レセプターへの結
合についてネイティブＰＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）と競合しな
いが、ネイティブＰＴＨ（１−８４）またはＰＴＨ（１−３４）の存在下または
非存在下で、なおｃＡＭＰ蓄積を刺激し得るか、あるいは本発明の化合物または
その誘導体単独で観察されるよりも、より高いｃＡＭＰ蓄積を刺激する、本発明
の化合物またはその誘導体を、非競合的アゴニストとみなす。

【０１５１】 （本発明の化合物またはその誘導体の治療的使用） 高カルシウム血症および低カルシウム血症のいくつかの形態は、ＰＴＨとＰＴ
ＨｒＰとの間の相互作用、ならびにＰＴＨ−１レセプターとＰＴＨ−２レセプタ
ーとの間の相互作用に関連する。高カルシウム血症は、血清カルシウムレベルの
異常な上昇が存在する状態であり；これは、しばしば、以下を含む他の疾患に関
連する：上皮小体機能亢進症、骨粗しょう症、乳房、肺および前立腺の癌腫、頭
部および頸部、ならびに食道の類表皮癌、多発性骨髄腫、および副腎腫。低カル
シウム血症（血清カルシウムレベルが異常に低い状態）は、効果的ＰＴＨの欠損
（例えば、甲状腺手術後の）から生じ得る。

【０１５２】 本発明の化合物またはその誘導体をコードする本発明の核酸はまた、選択され
た組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーに連結され得、そして得
られたハイブリッド遺伝子を、標準的な方法（例えば、Ｌｅｄｅｒら、米国特許
第４，７３６，８６６号（本明細書中に参考として援用される）に記載のような
）によって初期発生段階（例えば、受精卵母細胞段階）の動物胚に導入し、選択
された組織において上昇したレベルの本発明の化合物またはその誘導体を発現す
るトランスジェニック動物を生成し得る（例えば、骨についてのオステオカルシ
ンプロモーター）。このようなプロモーターを使用して、このトランスジェニッ
ク動物における本発明の化合物またはその誘導体の組織特異的発現を指向する。

【０１５３】 さらに、ＰＴＨ誘導体のＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターを拮抗または作動
する能力（当業者に公知のアッセイによって決定され、そして以下に議論される
ような）を破壊しない、天然の任意の他のアミノ酸置換が、本発明の範囲に含ま
れる。

【０１５４】 「アゴニスト」によって、ＰＴＨ−１レセプターによって媒介される細胞性応
答を増強または強化し得るリガンドが意図される。「アンタゴニスト」によって
、ＰＴＨ−１レセプターによって媒介される細胞性応答を阻害し得るリガンドが
意図される。本発明の任意の候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」が、
このような細胞性応答を増強または阻害し得るか否かは、当該分野で公知のタン
パク質リガンド／レセプターの細胞性応答アッセイまたは結合アッセイ（本出願
の他の箇所に記載されるアッセイを含む）を使用して決定され得る。

【０１５５】 本発明のさらなる局面に従って、ＰＴＨ−１レセプターの変化した作用または
過剰な作用から生じる医学的障害を処置するための方法が提供され、この方法は
、患者のＰＴＨ−１レセプターの活性化を阻害するのに十分な、治療有効量の本
発明の化合物またはその誘導体を、その患者に投与する工程を包含する。

【０１５６】 この実施形態において、ＰＴＨ−１レセプターの変化された作用から生じる障
害を有することが疑われる患者は、ＰＴＨ−１レセプターの選択的アンタゴニス
トである本発明の化合物またはその誘導体を使用して処置され得る。このような
アンタゴニストとしては、ＰＴＨ−１レセプター媒介細胞活性化に干渉すること
が決定されている（本明細書中に記載のアッセイによって）本発明の化合物また
はその誘導体、あるいは類似の特性を有する他の誘導体が挙げられる。

【０１５７】 アンタゴニストを投与するために、本発明の適切な化合物またはその誘導体を
、一般的に、適切なキャリアまたは賦形剤（例えば、生理食塩水）中に処方する
ことによって、医薬の製造において使用して、そして好ましくは、ＰＴＨ−１レ
セプターに対する本発明の化合物またはその誘導体の結合の十分な阻害を提供す
る投薬量で、静脈内、筋内、皮下、経口または鼻内投与する。代表的な投薬量は
、１ｎｇ〜１０ｍｇのペプチド／ｋｇ体重／日である。

【０１５８】 本発明のなおさらなる局面に従って、骨粗しょう症を処置するための方法が提
供され、この方法は、患者のＰＴＨ−１レセプターを活性化するのに十分な、治
療有効量の本発明の化合物またはその誘導体を、その患者に投与する工程を包含
する。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰアンタゴニストについて上記されたような同様の投薬
量および投与が、例えば、骨粗しょう症、他の代謝性骨障害、ならびに上皮小体
機能低下症および関連する障害のような状態の処置のための、ＰＴＨ／ＰＴＨｒ
Ｐアゴニストの投与に使用され得る。

【０１５９】 本発明が、本発明またはその任意の実施形態の精神または範囲から逸脱するこ
となく、組成、濃度、投与形態および状態の広範な等価のパラメーターの範囲内
で実施され得ることが、当業者に理解される。

【０１６０】 本発明をここで十分に記載しているが、本発明が、特定の実施例を参照するこ
とによって、より容易に理解される。本明細書中に明記されない限り、これらの
特定の実施例は、例示目的で提供され、そして本発明を限定することが意図され
ない。

【０１６１】 （実施例への導入） １型ＰＴＨレセプター（ＰＴＨ−１レセプター）への副甲状腺ホルモンの高親
和性結合および引き続くレセプター活性化の誘導は、リガンド−レセプター相互
作用の多数の部位に関わる。種々の長さのペプチドフラグメントの分析は、レセ
プター結合親和性およびｃＡＭＰ刺激効力の主な決定因子を含む完全に活性なＰ
ＴＨ（１−３４）分子内の領域を広く規定した（Ｎｕｓｓｂａｕｍ，Ｓ．Ｒ．ら
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０１８３−１０１８７（１９８０）；Ｒ
ｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １０７：５４５−
５５０（１９８０）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ ９３：１３４９−１３５３（１９７３））。これらの研究は、それぞれペプ
チドのＣ末端部分およびＮ末端部分との機能性をマッピングした。Ｎ末端残基（
特に、残基１〜６）の欠失はレセプターには効率的に結合するが、ｃＡＭＰの産
生は刺激しないペプチドを生じ、そして従って大部分のＰＴＨ−１レセプターア
ンタゴニストの開発のための基礎を提供した（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｎ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２２０：１０５３−１０５５（１９８３））。ＰＴＨ（１−３４）
のＣ末端からの欠失は、レセプターに検出可能に結合できないペプチド、および
このレセプターに弱く結合する（ｋ_D〜^-４Ｍ）Ｃ末端残基｛例えば、ＰＴＨ（１
５〜３４）｝のみを含む短いフラグメントを生じるが、これはｃＡＭＰ応答アッ
セイにおいて不活性である（Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｐ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ １２７：８３−８７（１９９０）；Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．
-Ｂ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２５：２２１５−２２１７（１９８
９））。対照的に、Ｎ末端残基のみを含み、そしてＰＴＨ（１−２７）よりも長
さが短いフラグメントは、レセプター結合アッセイまたはシグナル伝達アッセイ
のどちらにおいても不活性であることが以前に見出された（Ｎｕｓｓｂａｕｍ，
Ｓ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０１８３−１０１８７（１９
８０）；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｍ．（１９８１）Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ａｎｎｕａｌ，第１１巻，Ｉｏａｃｈｉｍ，Ｈ．Ｌ．編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８１）５３−５８頁）。

【０１６２】 ＰＴＨ−１レセプターは、アゴニスト活性化の際にアデニリルシクラーゼプロ
テインキナーゼＡシグナル伝達経路を強く刺激する、クラスＩＩ Ｇタンパク結
合レセプターである（Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．Ｖ．＆Ｇｏｌｄｒｉｎｇ，Ｓ．Ｒ．，Ｔ
ｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．４：３０９−３１４（１９９３）；
Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．Ｆ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ＆Ｃｈａｎｎｅｌｓ ２
：１−７（１９９４）；Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１
０２４−１０２６（１９９１））。このレセプターの大きなアミノ末端細胞外ド
メイン（〜１６７アミノ酸）は、ＰＴＨ（１−３４）のＣ末端位の主要な結合部
位またはドッキング部位を提供すると考えられるが、一方、７つの膜貫通ドメイ
ンおよび細胞外ループを含むレセプターの部分は、このリガンドのＮ末端シグナ
ル伝達部分と相互作用すると考えられる（Ｍａｎｎｓｔａｄｔ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６８９０−１６８９６（１９９８）；Ｂｅｒｇｗ
ｉｔｚ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８８６１−２８８６８（
１９９７）；Ｈｏａｒｅ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ
．２８９：１３２３−１３３３（１９９９））。ＰＴＨ−ＰＴＨレセプター相互
作用のための２連のスキームは、変異の研究および架橋の研究の両方からのかな
りの集団のデータによって支持され（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７２：２８８６１−２８８６８（１９９７）；Ｂｅｒｇｗｉｔｚ
，Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４９８−２２５０５（１９９
８））、そしてこのスキームは、おそらく他のクラスＩＩレセプターについても
当てはまる（Ｄｏｎｇ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：９０３−９
０９（１９９９）；Ｈｏｌｔｍａｎｎ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
０：１４３９４−１４３９８（１９９５）；Ｈｏｌｔｍａｎｎ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｊ
．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２７９：５５５−５６０（１９９６
）；Ｓｔｒｏｏｐ、Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１０５０−１０５７（１９
９５））。それにもかかわらず、このスキームは、全体として全アゴニスト結合
親和性およびシグナル伝達力価を決定する相互作用の大きなネットワークを含む
おそらく複雑な問題であるものの全体の単純化として最も良くみなされる。

【０１６３】 ＰＴＨ−１レセプターおよびその２つのアゴニスト、ＰＴＨおよびＰＴＨ関連
ペプチドが、カルシウムのホメオスタシスおよび骨の発達において果たす重要な
役割（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．ら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｅ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｔｈａｋｋｅｒ，
Ｒ．編，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９７），３８９−４２
０頁）、ならびにＰＴＨおよびＰＴＨｒＰが骨に対してタンパク同化性効果を有
するという知識（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１４
：６９０−７０９（１９９３）；Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら，（誤植で発行
），Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５：２６１（１９９４）；Ｒｏｅ，Ｅ．ら，Ｊ．
Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．１４（補遺１）：Ｓ１３７（１９９９）；
Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．＆Ｍｅｔａｂ
ｏｌ．８３：２７８６−２７９１（１９９８））のために、骨粗しょう症のよう
な骨の疾患の治療剤としてのＰＴＨ−１レセプターアゴニストの開発における多
くの目的が存在する。ＰＴＨ（１−３４）のようなペプチドは、治療目的には理
想的ではない。なぜなら、その大きなサイズが送達の非経口的でない経路に適切
ではないためである。さらに、５アミノ酸よりも非常に大きなサイズのペプチド
分子は、ペプチド模倣物の開発を目的とする合理的な薬物設計ストラテジーにお
いて、開始点として適切ではない。しかし、レセプター活性化のために必要とさ
れるネイティブＰＴＨの最低の鎖長が決定され、引き続いて最適化され、そして
さらにサイズが減少されるストラテジーは、新しい低分子量ＰＴＨ−１レセプタ
ーアゴニストを潜在的に導き得る。少数の中程度のサイズのペプチドホルモンに
ついて、このような最小化および最適化の反復のストラテジーは、親ホルモンよ
りも非常に小さな「模倣性」ペプチドアゴニストの開発において功を奏すること
が証明される（Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：１０４６
−１０５１（１９９７）；Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６
：１６９６−１６９９（１９９７）；Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７３：４４９−４５０（１９９６）；Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｎ．Ｃ．ら，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７３：４５８−４６４（１９９６）；Ｌｉｖｎａｈ，Ｏ．ら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７３：４６４−４７１（１９９６）；Ｌｉ，Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７０：１６５７−１６６０（１９９５））。

【０１６４】 高レベルのＰＴＨ−１レセプターを発現するトランスフェクトされた細胞にお
いて、弱いｃＡＭＰシグナル伝達活性は、ＰＴＨ（１−１４）のように短いＮ末
端ペプチドについて検出され得ることが最近見出された（Ｌｕｃｋ，Ｍ．ら，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３：６７０−６８０（１９
９９））。

【０１６５】 このペプチドの比較的弱い活性は、おそらくこのレセプターのアミノ末端ドメ
インへの「ドッキング」によってこのホルモンをレセプターに係留するように貢
献する、重要なレセプター結合残基を含むことが公知のＰＴＨ（１−３４）のＣ
末端部分が存在しないことによって満足され得る。この概念は、ＰＴＨ（１−１
４）が、インタクトなｒＰＴＨ−１レセプターを有した状態と同程度に、Ｎ末端
細胞外ドメインを欠失した短縮型ラットＰＴＨレセプターを有した状態で強力で
あったが、一方、対照的に、ＰＴＨ（１−３４）は短縮型レセプターを有する状
態でインタクトなレセプターを有するものよりも１０００倍弱いという知見によ
って支持される（Ｌｕｃｋ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １３：６７０−６８０（１９９９））。これらの知見（Ｎ末端残基の
欠失から生じる、活性化の際の強力な有害効果、およびこれらのアミノ酸の高度
な進化論的保存）は、以下のことを予想する：短いＮ末端ＰＴＨペプチドは、こ
のレセプターと生産的に相互作用すべきであり、そしてさらに、レセプター結合
親和性が改善され得る場合、このようなペプチドは完全に強力なアゴニストであ
り得る。

【０１６６】 従って、ＰＴＨ（１−１４）におけるレセプター活性化のための側鎖の要求は
、このペプチドを、以下の新しい改変を同定するための出発骨格として用いる：
ｉ）ＰＴＨ−１レセプターを用いるアゴニスト活性の増大；ｉｉ）ペプチドサイ
ズにおけるさらなる減少を可能にすること；およびｉｉｉ）リガンド−レセプタ
ー相互作用の機構の研究のプローブとしての機能。この結果は、ＰＴＨ（１−１
４）の効力がいくつかの改変によって有意に改善され得、そしてこれらの増大が
、７つの膜貫通ドメインおよび細胞外ループを含むレセプターの部分との相互作
用が原因であることを示す。

【０１６７】 （実施例１） （ＰＴＨ（１−１４）におけるアミノ酸の単一置換） ＰＴＨ（１−１４）における単一アミノ酸置換の効果を最初に研究した。この
研究において使用した種々の方法を以下に記載する。

【０１６８】 （ポリペプチド） この研究における全てのポリペプチドは、カルボキシ末端アミドを含んだ。ラ
ット（ｒ）ＰＴＨ（１−１４）ＮＨ₂｛ＰＴＨ（１−１４）｝およびより短い長
さのＰＴＨペプチドの全てのアナログを、Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカ
ルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基化学およびＴＦＡ−媒介切断／脱保護（ＭＧＨ Ｂ
ｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，
ＭＡ）を用いるマルチペプチド合成機（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ
Ｍｏｄｅｌ ３６９ ＭＢＳ）で合成し；そしてＣ１８含有カートリッジ（Ｓｅ
ｐ−Ｐａｋ）への吸着によって脱塩した。［Ｔｙｒ³⁴］ヒト（ｈ）ＰＴＨ（１−
３４）ＮＨ₂｛（ｈＰＴＨ（１−３４）｝および［Ｎｌｅ^8,21，Ｔｙｒ³⁴］−ｒ
ＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂｛ｒＰＴＨ（１−３４）｝を、同様のＦｍｏｃ化学お
よびＴＦＡ媒介切断／脱保護を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
モデル４３１Ａペプチド合成機で調製し；続いて高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）に適用した。全てのペプチドを、１０ｍＭの酢酸中で再構築し、そし
て−８０℃で保存した。各化合物の純度、同一性、およびストック濃度を、分析
ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ質量分析、およびアミノ酸分析によって確実に保った。

【０１６９】 （細胞培養物） 細胞を、３７℃でＴ−７５フラスコ（７５ｍｍ²）において、胎児ウシ血清（
１０％）、ペニシリンＧ（２０単位／ｍｌ）、ストレプトマイシンサルフェート
（２０μｇ／ｍｌ）およびアンホテリシンＢ（０．０５μｇ／ｍｌ）を補充した
ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％のＣＯ₂を含む加湿雰囲
気下で培養した。ＥＧＴＡ／トリプシンのストック溶液および抗生物質はＧＩＢ
ＣＯからのものであり；胎児ウシ血清はＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）からのものであった。細胞を、２４ウェルプレート中
で継代培養し、そしてコンフルエントな場合に新鮮な培地で処理し、そしてアッ
セイの前に１２〜２４時間、３３℃に変化させた（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８８６１−２８８６８（１９９７）；Ａｂ
ｅｌｌ，Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４５１８−４５２７（１９
９６））。

【０１７０】 ブタ腎臓細胞株ＬＬＣ−ＰＫ₁、ＨＫＲＫ−Ｂ７（Ｔａｋａｓｕ，Ｈ．ら，Ｊ
．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１４：１１−２０（１９９９））およびｈＰ
Ｒ２−２０の安定にトランスフェクトした誘導体は、それぞれヒトＰＴＨ−１レ
セプターおよびヒトＰＴＨ−２レセプターを発現する。このＨＫＲＫ−Ｂ７ Ｌ
ＬＣ−ＰＫ₁細胞株は、ｈＰＴＨ−１レセプターを〜１×１０⁶レセプター／細胞
で発現し（Ｔａｋａｓｕ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１４：
１１−２０（１９９９））、そしてこのｈＰＲ２−２２ ＬＬＣ−ＰＫ₁細胞株
は、ｈＰＴＨ−２レセプターを〜０．８×１０⁶レセプター／細胞で発現する（
Ｈ．ＴａｋａｓｕおよびＦ．Ｒ．Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ
Ｕｎｉｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌよ
り提供）。

【０１７１】 ラット骨芽細胞株ＲＯＳ １７／２．８（Ｍａｊｅｓｋａ，Ｒ．Ｊ．ら，Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １０７：１４９４−１５０３（１９８０））は、細胞
当たり〜８０，０００のレベルで内因性ＰＴＨ−１レセプターを発現し、そして
ヒト骨芽細胞株（ＳＡＯＳ−２）は、細胞当たり〜３０，０００のレベルで内因
性ＰＴＨ−１レセプターを発現する。

【０１７２】 （レセプター変異誘発） 短縮型レセプター（本明細書中においてｈＣＮｔまたはｈＤｅｌＮｔと称する
）を、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５））
によって、変異誘発プライマーおよびＨＫ−ＷＴ由来の一本鎖ウラシル含有テン
プレートＤＮＡを用いて、構築した。この変異体レセプターを、残基２４〜１８
１に関して欠失させ、そしてシグナルペプチダーゼ切断がＡｌａ²²とＴｙｒ²³と
の間で起こると仮定して（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６（１９９７））、Ｔｙｒ²³がそのＮ末端残基にお
いて、第一の膜貫通ドメインの境界またはその近くに位置するＧｌｕ¹⁸²に結合
していることを予測する。類似の短縮型ラットＰＴＨレセプターが、最近、本発
明者らによって報告された（Ｌｕｃｋ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３：６７０−６８０（１９９９））。変異体プラスミド
のＤＮＡ配列を、変異部位にわたる約６００ヌクレオチドの領域において、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎ
ａｔｏｒサイクル配列決定法を使用して、サンプル分析をＡＢＩ ３７７ ＰＲ
ＩＳＭ自動化シークエンサーで実施して、確認した。

【０１７３】 （ＣＯＳ−７細胞およびＤＮＡトランスフェクション） インタクトなｈＰＴＨ−１レセプター（ＨＫ−ＷＴ）（Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ
．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２１５７−２１６５（１９９３）
）、または短縮型ヒトＰＴＨ−１レセプター（ｈΔＮｔ）をコードするベクター
ｐＣＤＮＡ−１（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のプラ
スミドを用いる、ＣＯＳ−７細胞の一過性トランスフェクションを、ＤＥＡＥ−
デキストランを使用して、以前に記載されたように実施した（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ
，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８８６１−２８８６８（１９９
７））。ＣＯＳ−７細胞を、これらの細胞が８５〜９５％のコンフルエンシーの
場合に、塩化セシウム／エチジウムブロマイド勾配遠心分離によって精製したプ
ラスミドＤＮＡを各ウェルに対して２００ｎｇ使用して、２４ウェルプレートで
トランスフェクトした。アッセイを、トランスフェクションの７２〜９６時間後
に実施した。これらの条件下で、約２０％のＣＯＳ−７細胞がトランスフェクト
され、そしてアッセイの時点で、１つの細胞あたり約５×１０⁶のインタクトな
表面ＰＴＨレセプターを発現する（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７２：２８８６１−２８８６８（１９９７））。

【０１７４】 （ｃＡＭＰ刺激） ペプチドアナログでの細胞の刺激を、２４ウェルプレートで実施した。細胞を
、０．５ｍＬの結合緩衝液でリンスし、そして２００μＬのｃＡＭＰアッセイ緩
衝液（２ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１ｍｇ／ｍＬのウシ血
清アルブミン、３５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）を含むダルベッ
コ改変イーグル培地）および種々の量のペプチドアナログを含む１００μＬの結
合緩衝液（最終容量＝３００μＬ）で処理した。この培地を、室温での１時間の
インキュベーションの後に除去し、そして細胞を凍結し（−８０℃）、０．５ｍ
Ｌの５０ｍＭ ＨＣｌで溶解し、そして凍結した（−８０℃）。希釈した溶解物
のｃＡＭＰの内容量を、ラジオイムノアッセイによって決定した。可能である場
合には、ｃＡＭＰ ＥＣ₅₀および最大応答値を、非線形回帰を用いて決定した（
以下を参照のこと）。

【０１７５】 細胞内ｃＡＭＰ蓄積を、Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６２：１１２９、（１９８６）によって記載されたように、または当業者に公
知の他の方法で、測定し得る。１ｍｌの５０ｍＭ ＨＣｌ中で細胞を解凍するこ
とによって細胞内ｃＡＭＰを抽出し、そして抗ｃＡＭＰ抗体（例えば、Ｓｉｇｍ
ａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を使用する特異的ラジオイムノアッセイによって
、分析する。ｃＡＭＰについてのトレーサーとして使用されたｃＡＭＰアナログ
（２’−Ｏ−モノスクシニル−アデノシン ３’：５’−環状モノホスフェート
チロシルメチルエステル（Ｓｉｇｍａから得られた））を、クロラミンＴ方法に
よりヨウ素化する。遊離ヨウ素を、Ｃ１８ Ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジ（Ｗａ
ｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）上にヨウ素化ｃＡＭＰアナログを吸着
させることによって、除去する。ｄＨ₂Ｏでの洗浄後、ヨウ素化ｃＡＭＰアナロ
グを、４０％アセトニトリル（ＡＣＮ）および０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）でＳｅｐ−ｐａｋカートリッジから溶出する。ヨウ素化ｃＡＭＰアナログを
凍結乾燥し、１ｍｌの０．１％ ＴＦＡ中で再構成させ、そしてＣ１８逆相ＨＰ
ＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）内に注入する。このカラムを０．１％ ＴＦＡ中１
０％ ＡＣＮで平衡化し、そして０．１％ ＴＦＡ中１０〜３０％のＡＣＮの勾
配で溶出する。これは、非ヨウ素化ｃＡＭＰアナログからの、モノヨウ素化ｃＡ
ＭＰアナログの分離を可能にする。トレーサーは、−２０℃で保存される場合に
４ヶ月間まで安定である。アッセイに使用される標準であるアデノシン３’：５
’−環状モノホスフェートを、Ｓｉｇｍａから購入する。サンプル（ＨＣｌ抽出
物の１−１０ ８２ｌ）または標準（０．０４〜１００ ｆｍｏｌ／チューブ）
を、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中に希釈し、そしてトリエチルア
ミンおよび無水酢酸（２：１ 容量：容量）の混合物１０μｌでアセチル化する
。アセチル化の後、ｃＡＭＰ抗血清（１００μｌ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、
５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％正常ウサギ血清中に作製されたストック溶液（１：
４０００）から添加する。トレーサーを、０．１％ ＢＳＡを有するＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）中に希釈し、そして添加する（２０，０００ｃｐｍ／チューブ）。ア
ッセイを、４℃で一晩インキュベートする。結合したトレーサーを、１００μｌ
のヤギ抗ウサギ抗血清（ＰＢＳ中で１：２０）および１ｍｌの７％ポリエチレン
グリコール（ＭＷ ５０００〜６０００）を添加すること、２０００ｒｐｍで３
０分間４℃にて遠心分離することにより沈殿させる。上清を取り出し、そして結
合した放射能を、γ線計数器（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ）で計数する。ｃＡＭＰデ
ータを計算するために、エクセル（登録商標）のスプレッドシートでロジット計
算を実施した。代表的に、アッセイ感度は、０．１ ｆｍｏｌ／チューブであり
、そしてトレーサーの５０％が置き換わる標準濃度は、５ ｆｍｏｌ／チューブ
である。

【０１７６】 （結合アッセイ） 結合反応を、安定にトランスフェクトしたＨＫＲＫ−Ｂ７細胞を用いて、２４
ウェルプレート中で実施した。細胞を、０．５ｍＬの結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂
、５％熱不活化ウマ血清、０．５％ウシ胎仔血清、ＨＣｌでｐＨ７．７に調整）
でリンスし、そして引き続いて、１００μＬの結合緩衝液、種々の量の非標識競
争的リガンドを含む１００μＬの結合緩衝液、および約１００，０００ｃｐｍの ¹²⁵ Ｉ−ｒＰＴＨ（１−３４）（約２６ｆｍｏｌ）を含む１００μＬの結合緩衝
液で処理した。インキュベーション（最終容量＝３００μＬ）は、１５℃で４時
間であった。次いで、細胞を氷上に置き、結合媒体を除去し、そして０．５ｍＬ
の冷結合緩衝液で単層を３回リンスした。続いて、細胞を０．５ｍＬの５Ｎ Ｎ
ａＯＨで溶解し、そして放射能を計数した。各実験に対する非特異的結合を、１
μＭ用量の非標識ｒＰＴＨ（１−３４）との競合によって決定した。最大特異的
結合（Ｂ₀）は、非特異的結合に関して補正された、非標識ＰＴＨリガンドの非
存在下で結合した全放射能であった。結合ＩＣ₅₀値を、非線形回帰を使用して決
定した（以下を参照のこと）。

【０１７７】 （データ計算） 全ての計算を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標） Ｅｘｃｅｌ（登録商標）を
使用して実施した。ｃＡＭＰ刺激データの非線形回帰分析を、応答曲線の最小値
（Ｍｉｎ）、最大値（Ｍａｘ）、Ｅ_max、中点（ＥＣ５０）、および傾斜（ｓｌ
ｏｐｅ）と定義されるパラメータを使用して、実施した。所定の用量（ｘ）のペ
プチドに対して予測される応答（ｙ_p）を、以下の等式を用いて計算した：ｙ_p＝
Ｍｉｎ＋［（Ｍａｘ−Ｍｉｎ）／（１＋（ＥＣ５０／ｘ）^slope）］。初期のパ
ラメータ値を、一次データから推定し、次いでＥｘｃｅｌ（登録商標）の「Ｓｏ
ｌｖｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」を使用して、予測された応答と実際の応答との間
の差異を最小にするために、これら４つのパラメータを変化させた（最小二乗法
）（Ｂｏｗｅｎ，Ｗ．およびＪｅｒｍａｎ，Ｊ．、Ｔｒｅｎｓ ｉｎ Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１６：４１３−４１７（１９９５））。２つのデータセッ
ト間の統計学的有意性を、その２つのセットに関して等しくない分散を仮定して
、片側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を使用して決定した。

【０１７８】 ＰＴＨ（１−１４）におけるアミノ酸置換を、各々が単一の置換を有する１３
７の合成ＰＴＨ（１−１４）アナログのスクリーンにおいて発見した。これらの
置換を、「型置換（ｔｙｐｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｓｉｏｎ）」ストラテジー（こ
こで、各型の２０の天然アミノ酸の少なくとも１つ、および少なくとも１つのＤ
エナンチオマーが、１−１４の配列の各位置に導入された）によって選択した。
得られたペプチドの各々を、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞における単一用量分析において
ｃＡＭＰ形成を刺激する能力について、試験した。

【０１７９】 図１に示すように、大部分の置換（特に、（１−９）セグメントにおける置換
）は、不活性なペプチドを生じたが、いくつかは、ネイティブなＰＴＨ（１−１
４）とほぼ同等の活性のペプチドを生じ、そしてわずかなものは、シグナル伝達
応答の増強を生じた（図１）。用量−応答分析は、これらの少ない単一置換が、
ネイティブなＰＴＨ（１−１４）に対して、効力を数倍改善することを示した（
（データは）示さない）。

【０１８０】 （実施例２） （ＰＴＨ（１−１４）におけるアミノ酸の組み合わせられた置換） 上記活性増強置換のいくつかを、最初に１対ずつ組み合わせて、活性に対する
可能な相加効果を試験した。各二重変異体ペプチド（図２Ａ）は、単一に変更し
た親ペプチド（図示せず）のいずれよりもさらに強力であった。同様に、各三重
変異体リガンドは、同じ置換を含む対応する二重または単一の変異体リガンドよ
りさらに強力であった（図２Ｂ）（図２Ａと２Ｂとを比較のこと）。最後に、４
つのアミノ酸置換を含むＰＴＨ（１−１４）ペプチド（ペプチド＃１および３）
または５つのアミノ酸置換を含むＰＴＨ（１−１４）ペプチド（ペプチド＃２）
は、試験した最も効力のあるＰＴＨ（１−１４）ペプチドであり、そしてＨＫＲ
Ｋ−Ｂ７細胞において、ネイティブなＰＴＨ（１−１４）より１６０〜２２０倍
強力であった（図２Ｃ、表２）。

【０１８１】

【表２】 ｃＡＭＰ産生に対する用量−応答分析を、本文中に記載されるように、ヒト（ｈ
）ＰＴＨ−１レセプター（ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞）またはｈＰＴＨ−２レセプター
（Ｐ２Ｒ−２２細胞）で安定にトランスフェクト（ｔｒａｎｓｅｃｔ）されたＬ
ＬＣ−ＰＫ１細胞において、示されるペプチドを用いて実施した。

【０１８２】

【化１４】 ^*ＥＣ５０および対応する最大応答（Ｅｍａｘ）値（平均±ＳＥＭ）を、データ
の曲線当てはめのために使用した４つのパラメータの非線形回帰式から誘導した
。これらの計算において、Ｅｍａｘを、１００ｎＭにおいてｒＰＴＨ（１−３４
）に対して観察された応答の（±）１標準偏差以内に制限した。

【０１８３】 （実施例３） （ＰＴＨ（１−１４）より短いポリペプチドにおけるアミノ酸の置換） 以前に、ネイティブなラットＰＴＨフラグメントアナログであるＰＴＨ（１−
１３）、ＰＴＨ（１−１２）、ＰＴＨ（１−１１）、ＰＴＨ（１−１０）および
ＰＴＨ（１−９）が、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞においてｃＡＭＰ応答をほとんどまた
は全く誘導しないことが見出された（Ｌｕｃｋ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．１３：６７０−６８０（１９９０））。しかし、ペプチド＃１の全て
またはいくらかの置換がこれらのより短いペプチド（例えば、ペプチド＃４、＃
５、および＃６）に転移される場合には、シグナル伝達活性が、容易に観察され
た（図３、表１）。このことは、１１アミノ酸程度に小さなペプチド（ペプチド
＃６）が、ＰＴＨ−１レセプターでのｃＡＭＰ応答を刺激し得ることの最初の証
拠である；そしてアナログ［Ａ３、Ｑ１０］ｒＰＴＨ（１−１０）でさえも、い
くらかの活性を惹起した（図３）。この研究におけるより短い長さのペプチドの
大部分に関して、明らかな応答最大値は観察されなかったことに注目のこと；こ
れらのペプチドに対する最大応答（Ｅｍａｘ）および対応するＥＣ５０の値の推
定は、データの曲線当てはめに使用した非線形回帰計算から得られた。

【０１８４】 （実施例４） （ＰＴＨ（１−３４）におけるアミノ酸置換） これらの置換がＰＴＨ（１−３４）の活性を増強し得るか否かを決定するため
に、Ｓｅｒ３→Ａｌａ、Ａｓｎ１０→Ａｌａ、Ｌｅｕ１１→ＡｒｇおよびＧｌｙ
１２→Ａｌａの置換を、アナログ［Ａｌａ１，Ｔｙｒ３４］ｈＰＴＨ（１−３４
）に導入して、ペプチド＃７を得た。ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞において、このペプチ
ドは、２つのコントロールｒＰＴＨ（１−３４）およびｈＰＴＨ（１−３４）よ
り約２倍さらに強力であった（表２）。ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞において¹²⁵Ｉ−ｒ
ＰＴＨ（１−３４）トレーサー放射リガンドを用いてペプチド＃７の用量を変化
させて実施した競合結合研究は、ｒＰＴＨ（１−３４）と比較した場合に、結合
親和性において同量の約２倍の改善を示した（図４）。

【０１８５】 （実施例５） （ＰＴＨ−２レセプターの刺激） ＰＴＨ−２レセプターサブタイプは、ＰＴＨ（１−３４）に選択的に応答し、
そしてＰＴＨｒＰ（１−３４）には応答しない（Ｕｓｉｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４５５−１５４５８（１９９５））。レセプターサブ
タイプの生理学的役割は公知ではないが、これは特に脳、大動脈および膵臓にお
いて、広範に発現される（Ｕｓｉｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：
１５４５５−１５４５８（１９９５））。ネイティブなＰＴＨ（１−１４）は、
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞において発現されたＰＴＨ−２レセプターを刺激しなかった
；しかし、ペプチド＃１は、これらの細胞において活性であった（図５、表１）
が、その効力は依然として、ＰＴＨ（１−３４）の効力より４〜５桁弱かった（
図５、表２）。従って、ペプチド＃１は、弱いＰＴＨ−２レセプターアゴニスト
である。

【０１８６】 （実施例６） （ＣＯＳ−７細胞のＰＴＨ（１−１４）刺激） ＰＴＨ（１−１４）アナログのいくつかを、ＷＴ−ｈＰＴＨ−１レセプターで
一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞における活性に関して試験した（
図６Ａ、表３）。ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞において見られるように、各アナログは、
ｃＡＰＭ産生の刺激において、ネイティブなＰＴＨ（１−１４）よりさらに強力
であった。効力における類似の改善が、ｈΔＮｔ（ｈＤｅＩＮｔ）（アミノ末端
細胞外ドメインの大部分を欠く短縮型変異体ｈＰＴＨ−１レセプター）でトラン
スフェクトしたＣＯＳ−７細胞において観察された（図６Ｂ、表３）。重要なこ
とに、ペプチド＃７は、ｈΔＮｔを発現するＣＯＳ−７細胞において、ｒＰＴＨ
（１−３４）またはｈＰＴＨ（１−３４）より劇的に強力であった（図６のパネ
ルＡおよびＢを比較のこと、表３）。インタクトなＰＴＨレセプターを用いて実
施した研究において、ペプチド＃７のシグナル伝達効力において大きな改善が検
出し得なかったことは、理解されていないが、これらの感受性のある細胞系のう
ちの、高度に効力のあるアゴニスト間を区別する能力における制限を、反映し得
る（Ｃｏｌｑｕｈｏｕｎ，Ｄ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２５：９２４
−９４７（１９９８））。しかし、これらのペプチドは、ｈΔＮｔ（インタクト
なＰＴＨレセプターが過剰発現される系より固有的にずっと弱い細胞／レセプタ
ー系）により区別され得る。いずれの場合においても、ｈΔＮｔを用いる結果は
、ペプチド＃７が実際に、ｈＰＴＨ（１−３４）またはｒＰＴＨ（１−３４）よ
り強力であることを確認し、そしてアナログ間での効力および潜在能力の相対レ
ベルが、使用される薬理学的系に依存して変動し得ることを、実証する。

【０１８７】 本明細書中に報告されるペプチドのいずれも、トランスフェクトされていない
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞またはトランスフェクトされていないＣＯＳ−７細胞におい
て、ｃＡＭＰ応答を誘導しなかった（データは示さない）。このことは、観察さ
れた効果が、ＰＴＨ−１レセプターとの特異的な相互作用に起因したことを示す
。

【０１８８】

【表３】 ｃＡＭＰ産生に対する用量−応答分析を、本文中に記載されるように、ＷＴ ｈ
ＰＴＨ−１レセプターまたは短縮型レセプターｈＤｅＩＮｔで一時的にトランス
フェクト（ｔｒａｎｓｅｃｔ）されたＣＯＳ−７細胞において、示されるペプチ
ドを用いて実施した。ＥＣ５０および対応する最大応答（Ｅｍａｘ）値（平均±
ＳＥＭ）を、データの曲線当てはめのために使用した４つのパラメータの非線形
回帰式から誘導した。これらの計算において、Ｅｍａｘを、ＷＴについては１０
０ｎＭにおいてｒＰＴＨ（１−３４）に対して、そしてｈＤｅＩＮｔについては
ペプチド＃７（２０μＭ）に対して、観察された応答の（±）１標準偏差以内に
制限した。

【０１８９】 （実施例７） （ＰＴＨ（１−１４）誘導体によるＲＯＳ−１７／２．８およびＳＡＯＳ細胞
の刺激） この研究の主要なペプチドを、骨芽細胞（脊椎動物における主要な骨構築細胞
）から直接確立した２つの細胞株において、活性に関して試験した。これらの細
胞株ＲＯＳ１７／２．８（３３）およびＳＡＯＳ−２は、骨細胞に対するＰＴＨ
アナログの効果を調査するために、ＰＴＨの分野において広範に使用されてきた
。これらの細胞においてペプチドに関して観察された応答は、ＰＴＨ−１レセプ
ターで一時的にかまたは安定にトランスフェクトされた細胞において観察された
応答と、緊密に平行であった（図７ＡおよびＢ、表４）。

【０１９０】

【表４】 ｃＡＭＰ産生に対する用量−応答分析を、本文中に記載されるように、骨芽細胞
株ＲＯＳ１７／２．８およびＳＡＯＳ−２において、示されるペプチドを用いて
実施した。 ＥＣ５０および対応する最大応答（Ｅｍａｘ）値（平均±ＳＥＭ）を、データの
曲線当てはめのために使用した４つのパラメータの非線形回帰式から誘導した。
これらの計算において、Ｅｍａｘを、ｒＰＴＨ（１−３４）（１００ｎＭ）に対
して観察された応答の（±）１標準偏差以内に制限した。

【０１９１】 （実施例１〜７の要約） アナログの活性が、ヒトｈＰＴＨ−１レセプターを安定に発現するＬＬＣ−Ｐ
Ｋ−１細胞において、最初に評価された。不耐性位置における大部分の置換は、
ｃＡＭＰ刺激活性を無効にした。対照的に、耐性位置における大部分の置換は、
機能と適合性であり、そしていくつか（Ｓｅｒ³→Ａｌａ；Ａｓｎ¹⁰→Ｇｌｎ、
Ａｓｐ、Ａｌａ；Ｌｅｕ¹¹→ＡｒｇまたはＬｙｓ；Ｇｌｙ¹²→ＡｌａまたはＡｒ
ｇ；およびＨｉｓ¹⁴→ＴｒｐまたはＰｈｅ）は、活性を増強した。次いで、活性
増強置換の種々の組み合わせを有するＰＴＨ（１−１４）アナログを、合成した
。これらのアナログの各々は、ネイティブなＰＴＨ（１−１４）よりさらに強力
であり、そしてその置換の効果は、相加的であった。従って、［Ａ³、Ａ¹⁰、Ｒ^{1 1} 、Ａ¹²］ｒＰＴＨ（１−１４）アミドは、最も活性なアナログ試験物であり、
そしてネイティブなＰＴＨ（１−１４）より１００倍強力であった。本発明の目
的は、さらなるＰＴＨアナログを提供することである。

【０１９２】 ネイティブなＰＴＨ（１−１４）は、短縮型ＰＴＨ−１レセプターｒＰ１Ｒ−
ΔＮｔ（これは、アミノ末端細胞外ドメインの大部分を欠く）を発現するＣＯＳ
−７細胞において、ｃＡＭＰ形成を刺激した。上記活性増強置換の各々は、ｒＰ
１Ｒ−ΔｎｔでのＰＴＨ（１−１４）活性を改善した。

【０１９３】 さらに、ペプチド＃１は、ペプチド＃２、６および７とともに、ＰＴＨ−２レ
セプターを発現する細胞において活性であり（実施例５）、そして骨芽細胞にお
いて活性であった（実施例７）。さらに、１−１４領域において主要な置換を有
するＰＴＨ（１−３４）は、試験したいくつかの細胞株において、コントロール
ＰＴＨ（１−３４）よりさらに強力であった。

【０１９４】 従って、これらのアミノ酸改変は、レセプターの膜貫通／細胞外ループ領域と
の相互作用を、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで改善する。ＰＴＨ（１
−１４）の構造−活性関係の研究は、より強力な、低分子量のＰＴＨ−１レセプ
ターアゴニスト、ならびにリガンド−レセプター相互作用機構への新たな洞察を
導き得る。

【０１９５】 （実施例８） （骨成長の刺激） ＰＴＨ誘導体をコードする核酸（例えば、配列番号１の核酸など）を、インサ
イチュで骨細胞に移入する。これを達成するための技術は、米国特許第５，７６
３，４１６号（本明細書中に参考として完全に援用される）に記載されている。
次いで、これらの細胞を使用して、前駆細胞を刺激し得、そして骨の成長、修復
および再生を、インビボで促進し得る。これを達成するための遺伝子移入プロト
コルは、当業者に公知であり、そして必要に応じて、所望の目的を達成するため
に使用し得る。このような手順の目的としては、とりわけ、種々の骨関連疾患お
よび欠損の処置（例えば、骨折の予防、骨折修復の促進）、移植物と組み合わせ
ての使用、ならびに骨粗しょう症および骨形成不全症の処置における使用が挙げ
られる。

【０１９６】 （実施例９） （骨粗しょう症の処置の方法） 経口エストロゲン処置と組み合わせての、ＰＴＨ（１−３４）の皮下投与は、
閉経後の骨粗しょう症に対する骨密度の増加を生じる（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃１
０１９、１９９９ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎ
ｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，９月３０日〜１０月
４日，１９９９）。特許請求される本発明のＰＴＨ誘導体もまた、この点に関し
て効果的であるはずである。ＰＴＨポリペプチド誘導体は、皮下的にか、非経口
的にか、または経鼻吸入法によってかのいずれかで、骨粗しょう症に起因する骨
の損失を減少させるに十分な量で、患者に施される。ＰＴＨ誘導体の皮下投与は
、必要に応じて、例えば、毎日４００ＩＵ／日で投与され得る。経口エストロゲ
ンは、例えば、毎日８００ＩＵにおいて、ＰＴＨ誘導体の相補的投与であり得る
。

【０１９７】 本発明の方法はまた、ＰＴＨポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡを含むベ
クターを投与することを包含する。このベクターは、エキソビボまたはインビボ
のいずれかで投与され、そして患者において効果的なレベルのＰＴＨを提供する
に十分な量で、またはＰＴＨレセプターを有する細胞においてｃＡＭＰを増加さ
せるに十分な量で、提供される。「効果的な」レベルとは、健全な患者において
産生されるＰＴＨのレベル、または骨の損失の置換を必要とする患者においてこ
のような置換のために必要なレベルである。

【０１９８】 あるいは、ＰＴＨ誘導体をコードするＤＮＡは、レトロウイルスを使用して、
培養された細胞に導入され、ＰＴＨ分泌細胞を作製する。次いで、ＰＴＨ分泌細
胞は、このような処置を必要とする患者に移植されて、ＰＴＨ誘導体の血清レベ
ルを提供する。

【０１９９】 （結論） ＰＴＨ−１レセプターを活性化させ得ることが公知の最小のペプチドである、
ＰＴＨアナログの新たなファミリーが記載される。これらのペプチドは、以下の
主要な置換のうちの１つ以上を含み：Ｓｅｒ３→Ａｌａ、Ａｓｎ１０→Ａｌａま
たはＧｌｎ、Ｌｅｕ１１→Ａｒｇ、Ｇｌｙ１２→ＡｌａおよびＨｉｓ１４→Ｔｒ
ｐ、そして大きさがＰＴＨ（１−１４）からＰＴＨ（１−１１）の範囲である。
Ｓｅｒ３→ＡｌａおよびＡｓｎ１０→ＡｌａまたはＧｌｎを含むＰＴＨ（１−１
０）でさえ、活性であることが見出されている。これらのアナログは、骨誘導骨
芽細胞において、ｃＡＭＰ形成を刺激する際に、活性であった。これらのペプチ
ドの効力、およびこれらの小さな大きさは、これらが骨の疾患（例えば、骨粗し
ょう症）を処置するために有用であることを示す。

【０２００】 同じ主要なアミノ酸置換を含むＰＴＨ（１−３４）アナログ（ペプチド＃７）
は、ｒＰＴＨ（１−３４）およびｈＰＴＨ（１−３４）よりさらに強力である。
ペプチド＃７もまた、骨粗しょう症を処置する際に有用であるはずである。なぜ
なら、より弱いペプチドであるネイティブなｈＰＴＨ（１−３４）が、エストロ
ゲンと組み合わせて、閉経後の女性の骨に対して劇的な同化効果を有することが
既に示されているからである（２２）。

【０２０１】 ＰＴＨにおけるレセプター結合およびｃＡＭＰシグナル伝達の主要な決定基は
、それぞれＰＴＨ（１−３４）のＣ末端およびＮ末端の部分に存在すると考えら
れる。このことと一致して、ＰＴＨ（１−１４）が、高レベルのＰＴＨ−１レセ
プターを発現する細胞において、弱いｃＡＭＰ応答を刺激し得ることが、最近示
された｛ＰＴＨ（１−３４）に対してＥＣ５０が約１００μＭ対約３ｎＭ｝（Ｌ
ｕｃｋ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１３：６７０−６８０（１９
９９））。ＰＴＨ（１−１４）におけるレセプター−シグナル伝達決定基を同定
するため、そして効力を潜在的に改善するために、１３７の単一置換されたＰＴ
Ｈ（１−１４）アナログを、ｈＰＴＨ−１レセプターを安定に発現するＬＬＣ−
ＰＫ１細胞を合成し、この細胞において機能的に評価した。大部分の置換は、ｃ
ＡＭＰ刺激活性を低減させるかまたは無効にしたが、いくつか（例えば、Ｓｅｒ
３→Ａｌａ、Ａｓｎ１０→Ａｌａ；Ｌｅｕ１１→Ａｒｇ、Ｇｌｙ１２→Ａｌａお
よびＨｉｓ１４→Ｔｒｐ）は、活性を２〜５倍増強した。これらの増強効果は、
相加的であり、その結果、［Ａ³、Ａ¹⁰、Ｒ¹¹、Ａ¹²］ｒＰＴＨ（１−１４）ア
ミド（ペプチド＃１）、［Ａ³、Ａ¹⁰、Ｒ¹¹、Ａ¹²、Ｗ¹⁴］ｒＰＴＨ（１−１４
）アミド（ペプチド＃２）は、ネイティブなＰＴＨ（１−１４）よりそれぞれ１
６０倍および２２０倍強力であった。ＰＴＨ（１−３４）、またはこれらの置換
のいくらかもしくは全てを含むＰＴＨ（１−１１）アナログは、改変されていな
いコントロールペプチドに対して、増強された効力を示した。ペプチド＃１は、
アミノ末端ドメインの大部分を欠く短縮型ｈＰＴＨ−１レセプターに関して試験
した場合に、ネイティブなＰＴＨ（１−１４）より１００倍強力であった。これ
らの結果は、ＰＴＨの（１−１４）領域が、レセプターの膜貫通ドメイン／細胞
外ループ領域と相互作用する重要な活性化コアドメインを含むこと、およびこの
相互作用が、より効力の高い短いペプチドアゴニストを得るために最適化され得
ることを実証する。

【０２０２】 本明細書中で言及した全ての参考文献は、本開示に参考として完全に援用され
る。

【０２０３】 ここで、本発明を、明瞭化および理解の目的で、図示および実施例によって十
分に記載したが、特定の変化および改変が、開示された実施形態においてなされ
得ることは、当業者に明らかであり、そしてこのような改変は、本発明の範囲内
であることが意図される。

【０２０４】 図２〜７において参照されるポリペプチドの配列については、例えば、表２、
３、または４を参照のこと。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＰＴＨ（１−１４）における単一変異の効果を示す。各グラフは、上
記のグラフに示されるネイティブｒＰＴＨ（１−１４）における位置での単一ア
ミノ酸置換の、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞におけるｃＡＭＰシグナル伝達の効果を示す
。ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞は、ブタの腎臓細胞株のクローンの誘導体、ＬＬＣ−ＰＫ
１である。ＬＬＣ−ＰＫ１は、ヒトＰＴＨ−１レセプターを用いて、安定にトラ
ンスフェクトされる。各ペプチドを１００μＭの用量で試験した。示される全て
ペプチドを二連でかつ同時に試験し；そして実験を二回繰り返した。このデータ
は、２つの実験からの平均（±）Ｓ．Ｅ．Ｍ．を合わせている。

【図２】 図２Ａ−２Ｃは、置換したＰＴＨ（１−１４）アナログの用量応答分析を示す
。２つの置換（図２Ａ）、３つの置換（図２Ｂ）、または４つおよび５つの置換
（図２Ｃ）のいずれかを有するＰＴＨ（１−１４）アナログを、ＨＫＲＫ−Ｂ７
細胞におけるｃＡＭＰ刺激活性について可変用量で試験した。コントロールとし
て、ネイティブのｒＰＴＨ（１−１４）、ｒＰＴＨ（１−３４）および［Ｎｌｅ
ｕ^8,21Ｔｙｒ³⁴ｒＰＴＨ（１−３４）アミドもまた試験した。記号は、長さで示
されるペプチドに対応する。各グラフは、各々二連で行われた、３つの別個の実
験（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）から組合されたデータを示す。

【図３】 図３は、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞における置換ＰＴＨアナログの用量応答分析を示
す。長さで示されるＰＴＨアナログを、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞におけるｃＡＭＰ刺
激活性について可変用量で試験した。各曲線は、各々二連で行われた、３つ以上
の別個の実験（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）から組合されたデータを示す。

【図４】 図４は、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞におけるＰＴＨアナログの結合を示す。親コント
ロールペプチド、ｈＰＴＨ（１−３４）、およびＰＴＨ（１−３４）アナログ（
ペプチド＃７）を、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞に対する¹²⁵Ｉ−ｒＰＴＨ（１−３４）
（１００，０００ＣＰＭ／ウェル）の結合を阻害する能力について、可変用量で
試験した。データは、単一の実験からの二連の値の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。

【図５】 図５は、ＰＴＨ−２レセプター発現細胞における置換ＰＴＨアナログの用量応
答分析を示す。長さで示されるＰＴＨアナログを、ＰＴＨ−２レセプターで安定
にトランスフェクトされたＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるｃＡＭＰ形成を刺激する
能力について、可変用量で試験した。データは、単一の実験からの二連の値の平
均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。

【図６】 図６Ａ−６Ｂは、ＣＯＳ−７細胞における置換ＰＴＨアナログの用量応答分析
を示す。ＣＯＳ−７細胞を、インタクトなヒトＰＴＨ−１レセプター（ＨＫ−Ｗ
Ｔ）（図６Ａ）または殆どのアミノ末端ドメインを欠く短縮型ＰＴＨ−１レセプ
ター（ｈΔＮｔまたはｈＤｅＩＮｔ）（図６Ｂ）を用いて一過性トランスフェク
トし、そして示される長さのＰＴＨアナログの種々の可変用量を用いて処理した
場合の、ｃＡＭＰ産生を媒介する能力について試験した。各グラフは、各々二連
で行われた、３つの別個の実験（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）から組合されたデータを
示す。

【図７】 図７Ａ−７Ｂは、骨芽細胞における置換ＰＴＨアナログの用量応答分析を示す
。骨芽細胞株、ＲＯＳ１７／２．８（図７Ａ）およびＳＡＯＳ−２（図７Ｂ）（
これは、それぞれ、ラットおよびヒトのＰＴＨ−１レセプターを内因的に発現す
る）を、示される長さのＰＴＨアナログを用いて処理し、そしてｃＡＭＰの得ら
れたレベルを定量した。パネルＡにおける各曲線は、各々二連で行った、二つの
別個の実験において各ペプチドについて観察された組合されたｃＡＭＰ応答（平
均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す。パネルＢにおける曲線は、二連で行った、単一の実
験に由来する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/10 Ｃ０７Ｋ 14/635 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ０７Ｋ 14/635 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/30 (72)発明者 クロネンバーグ， ヘンリー エム． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02478， ベルモント， ハスティングス ロード 48 (72)発明者 ポッツ， ジョン ティー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02465， ニュートン， チェスナット ストリート 129 (72)発明者 ユップナー， ハラルト アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139， ケンブリッジ， キナード ス トリート 59 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 CA05 DA02 DA03 HA17 4B064 AG15 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA91Y AA93X AB01 BA01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA17 BA18 BA19 BA23 CA18 DB32 MA01 MA55 MA59 MA63 NA14 ZA962 ZA972 ZB212 4H045 AA10 AA20 AA30 BA16 BA17 BA18 CA40 DA30 EA30 FA50

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリペプチドであって、以下 【化１】 から本質的になるアミノ酸配列を有し、ここで： Ｘ₀₁がＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｎであり； Ｘ₀₂が、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはホモＡｒｇであり； Ｘ₀₃が、ＡｒｇまたはＡｌａであり；そして Ｘ₀₄が、ＰｈｅまたはＴｒｐである、 ポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも
   ９０％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
3. 【請求項３】 ポリペプチドであって、以下 【化２】 から本質的になるアミノ酸配列を含み、ここで： Ｘ₀₁がＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｎであり；そして Ｘ₀₂が、ＴｒｐまたはＨｉｓである、 ポリペプチド。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも
   ８５％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
5. 【請求項５】 ポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列 【化３】 を含み、ここで： Ｘ₀₁がＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｎであり； Ｘ₀₂が、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはホモＡｒｇであり； Ｘ₀₃が、ＡｒｇまたはＡｌａであり； Ｘ₀₄が、ＰｈｅまたはＴｒｐであり；そして Ｘ₀₅が、ＡｒｇまたはＡｌａである、 ポリペプチド。
6. 【請求項６】 請求項５に記載のポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも
   ９０％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
7. 【請求項７】 ポリペプチドであって、以下： 【化４】 からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドであって、前
   記ポリペプチドが、Ｃ末端アミドを含む、ポリペプチド。
9. 【請求項９】 請求項１に記載のポリペプチドのフラグメントであって、該
   フラグメントが、アミノ酸１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２または１〜１
   ３を含む、フラグメント。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載のポリペプチドであって、該ペプチドが、
    放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、または化学発光標識からなる群より選択
    される標識で標識される、ポリペプチド。
11. 【請求項１１】 前記放射性標識が^99mＴｃである、請求項１０に記載のポ
    リペプチド。
12. 【請求項１２】 薬学的組成物であって、以下： １．請求項１に記載のポリペプチド；および ２．薬学的に受容可能なキャリア、 を含む、薬学的組成物。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列を含む、単離された核酸分子。
14. 【請求項１４】 請求項７に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列を含む、単離された核酸分子。
15. 【請求項１５】 組換えＤＮＡ分子であって、（１）発現制御領域を含み、
    該領域は、（２）請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    配列と作動可能に連結されている、組換えＤＮＡ分子。
16. 【請求項１６】 ポリペプチドを調製する方法であって、請求項１３に記載
    の前記核酸を宿主中に導入する工程、および該核酸によってコードされる該ポリ
    ペプチドを発現させる工程を包含する、方法。
17. 【請求項１７】 組換えベクターを作製するための方法であって、請求項１
    ３に記載の核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する、方法。
18. 【請求項１８】 前記制御領域が細菌プロモーター、ウイルスプロモーター
    、真菌プロモーターまたは哺乳動物プロモーターを含む、請求項１５に記載の組
    換えＤＮＡ分子。
19. 【請求項１９】 請求項１５に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、原核生物宿
    主細胞または真核生物宿主細胞。
20. 【請求項２０】 細菌細胞である、請求項１９に記載の細胞。
21. 【請求項２１】 酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項１９に記載の
    細胞。
22. 【請求項２２】 配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドであっ
    て、単一のアミノ酸置換が、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞においてネイティブなＰＴＨと
    比較してｃＡＭＰ刺激を減少し、但し、該置換が、任意の位置におけるアラニン
    ではなく、Ｓｅｒ−１における該置換が、Ｔｙｒ、ＰｒｏまたはＡｓｐではなく
    、Ｖａｌ−２における該置換が、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、ＡｒｇまたはＧｌｕではなく
    、Ｓｅｒ−３における該置換が、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＡｓｎではなく
    、そしてＧｌｕ−４における該置換が、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｖａｌまたは
    Ａｓｐではない、ポリペプチド。
23. 【請求項２３】 配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドであっ
    て、単一のアミノ酸置換が、ネイティブなＰＴＨポリペプチドと比較してＨＫＲ
    Ｋ−Ｂ７細胞においてｃＡＭＰ刺激を増加するが、但し、該置換が、アラニンで
    はない、ポリペプチド。
24. 【請求項２４】 請求項２１に記載のポリペプチドであって、前記単一のア
    ミノ酸置換が、以下： （ａ）Ａｓｎ−１０−−＞Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＧｌｎ； （ｂ）Ｌｅｕ−１１−−＞Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＴｒｐ； （ｃ）Ｇｌｙ−１２−−＞ＡｒｇまたはＨｉｓ； （ｄ）Ｌｙｓ−１３−−＞Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＴｒｐ；および （ｅ）Ｈｉｓ１４−−＞Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＰｈｅまたはＴｒｐ、 からなる群より選択される、ポリペプチド。
25. 【請求項２５】 請求項２１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチ
    ドが、アミノ酸１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２または１〜１３を含む、
    ポリペプチド。
26. 【請求項２６】 ＰＴＨ（１−２０）、ＰＴＨ（１−２２）、ＰＴＨ（１−
    ２４）、ＰＴＨ（１−２６）、ＰＴＨ（１−２８）、ＰＴＨ（１−３０）、ＰＴ
    Ｈ（１−３２）、およびＰＴＨ（１−３４）からなる群より選択されるポリペプ
    チドであって、単一のアミノ酸置換が、ネイティブなＰＴＨポリペプチドに比較
    して、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞においてｃＡＭＰ刺激を増加するが、ただし、該置換
    が、アラニンではない、ポリペプチド。
27. 【請求項２７】 請求項２５に記載のポリペプチドであって、前記単一のア
    ミノ酸置換が、以下： （ａ）Ａｓｎ−１０−−＞Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＧｌｎ； （ｂ）Ｌｅｕ−１１−−＞Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＴｒｐ； （ｃ）Ｇｌｙ−１２−−＞ＡｒｇまたはＨｉｓ； （ｄ）Ｌｙｓ−１３−−＞Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＴｒｐ； （ｅ）Ｈｉｓ１４−−＞Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＰｈｅまたはＴｒｐ；および （ｆ）Ｇｌｕ−１９−−＞Ａｒｇ、 からなる群より選択される、ポリペプチド。
28. 【請求項２８】 請求項２１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチ
    ドが、アミノ酸１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１３、１〜１４、
    １〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜２８、１〜３０、または１〜３
    ２を含む、ポリペプチド。
29. 【請求項２９】 骨質量における減少によって特徴付けられる哺乳動物の状
    態を処置するための方法であって、該方法は、該処置を必要とする被験体に、骨
    質量増加に有効な量の請求項１に記載のいずれか１つのポリペプチドを投与する
    工程を包含する、方法。
30. 【請求項３０】 骨の再形成、骨吸収および／または骨再造形の速度を決定
    するための方法であって、有効な量の請求項１に記載のいずれか１つのポリペプ
    チドを患者に投与する工程、ならびに該患者の骨への該ペプチドの取り込みを決
    定する工程を包含する、方法。
31. 【請求項３１】 請求項２９に記載の方法であって、前記有効な骨質量増加
    量のポリペプチドを、該ペプチドをコードするＤＮＡを患者に提供することによ
    って投与し、そしてインビボで該ペプチドを発現させる、方法。
32. 【請求項３２】 請求項２９に記載の方法であって、前記処置される状態が
    、骨粗しょう症である、方法。
33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の方法であって、前記骨粗しょう症が、
    老年性骨粗しょう症である、方法。
34. 【請求項３４】 前記骨粗しょう症が閉経後骨粗しょう症である、請求項３
    ２に記載の方法。
35. 【請求項３５】 骨質量を増加させるための、有効量の前記ポリペプチドが
    、一日あたり約０．０１μｇ／ｋｇ〜一日あたり約１．０μｇ／ｋｇである、請
    求項２９に記載の方法。
36. 【請求項３６】 投与方法が非経口である、請求項２９に記載の方法。
37. 【請求項３７】 投与方法が皮下である、請求項２９に記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記投与方法が経鼻吸入法である、請求項２９に記載の方
    法。
39. 【請求項３９】 ＰＴＨ−１レセプターを有する哺乳動物細胞においてｃＡ
    ＭＰを増加させる方法であって、該細胞を、ｃＡＭＰを増加させるのに十分な量
    の請求項１に記載のいずれか１つのポリペプチドと接触させる工程を包含する、
    方法。
40. 【請求項４０】 ポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列： 【化５】 を有し、ここでＸ₀₁が、Ａｌａ、Ａｓｐであり；Ｘ₀₂がＬｅｕまたはＡｒｇであ
    り；Ｘ₀₃がＡｒｇまたはＡｌａであり；Ｘ₀₄がＰｈｅまたはＴｒｐであり；およ
    びＸ₀₅がＰｈｅまたはＴｙｒである、ポリペプチド。