JPH05328966A - 相同組換え細胞選別法 - Google Patents
相同組換え細胞選別法Info
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- JPH05328966A JPH05328966A JP4158592A JP15859292A JPH05328966A JP H05328966 A JPH05328966 A JP H05328966A JP 4158592 A JP4158592 A JP 4158592A JP 15859292 A JP15859292 A JP 15859292A JP H05328966 A JPH05328966 A JP H05328966A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 胚性未分化（ＥＳ）細胞で発現していない遺
伝子にも適用可能であり、しかも選択効率の高い相同組
換え細胞選別法の提供。 【構成】 ｎｅｏ遺伝子及びＭＣ１プロモーターを有す
るジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子を組み込んだゲ
ノムＤＮＡを、胚性未分化（ＥＳ）細胞中で相同組換え
させて、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子を欠失又は改変したゲ
ノムＤＮＡを含む細胞を、Ｇ４１８及びジフテリア毒素
Ａにより選別する方法において、ｎｅｏ遺伝子がその上
流にＰＧＫプロモーターを有し、かつｎｅｏ遺伝子とジ
フテリア毒素Ａフラグメント遺伝子のＭＣ１プロモータ
ーとの間に、ＭＶＭポーズシクナル及びプルースクリプ
トＤＮＡを挿入したゲノムＤＮＡを用いることを特徴と
する相同組換え細胞選別法。
伝子にも適用可能であり、しかも選択効率の高い相同組
換え細胞選別法の提供。 【構成】 ｎｅｏ遺伝子及びＭＣ１プロモーターを有す
るジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子を組み込んだゲ
ノムＤＮＡを、胚性未分化（ＥＳ）細胞中で相同組換え
させて、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子を欠失又は改変したゲ
ノムＤＮＡを含む細胞を、Ｇ４１８及びジフテリア毒素
Ａにより選別する方法において、ｎｅｏ遺伝子がその上
流にＰＧＫプロモーターを有し、かつｎｅｏ遺伝子とジ
フテリア毒素Ａフラグメント遺伝子のＭＣ１プロモータ
ーとの間に、ＭＶＭポーズシクナル及びプルースクリプ
トＤＮＡを挿入したゲノムＤＮＡを用いることを特徴と
する相同組換え細胞選別法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ジフテリア毒素Ａフラ
グメント遺伝子を用いた相同組換え細胞選別法に関す
る。
グメント遺伝子を用いた相同組換え細胞選別法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】酵母、カビ、粘菌やトリパノソーマなど
の単細胞生物においては相同組換えの頻度が高く、遺伝
子導入された細胞の約半分で相同組換えが起こる。これ
らの生物では相同組換えを積極的に遺伝子修復に利用し
ていることが示唆されている。これに対して、マウスを
含む高等生物では相同組換えの頻度は低く、遺伝子導入
された細胞の１０-4〜１０-3に過ぎない。相同組換えに
よりある特定の遺伝子を欠失、改変させたマウス個体を
得る方法としては、受精卵に遺伝子を導入し相同組換え
の起こった個体を得る方法がある。実際に組織適合抗原
のクラスII遺伝子について報告があるが、この方法では
１０5 以上の受精卵、１０００匹以上のトランスジェニ
ックマウスを処理しなければならず一般的ではなかっ
た。
の単細胞生物においては相同組換えの頻度が高く、遺伝
子導入された細胞の約半分で相同組換えが起こる。これ
らの生物では相同組換えを積極的に遺伝子修復に利用し
ていることが示唆されている。これに対して、マウスを
含む高等生物では相同組換えの頻度は低く、遺伝子導入
された細胞の１０-4〜１０-3に過ぎない。相同組換えに
よりある特定の遺伝子を欠失、改変させたマウス個体を
得る方法としては、受精卵に遺伝子を導入し相同組換え
の起こった個体を得る方法がある。実際に組織適合抗原
のクラスII遺伝子について報告があるが、この方法では
１０5 以上の受精卵、１０００匹以上のトランスジェニ
ックマウスを処理しなければならず一般的ではなかっ
た。
【０００３】一方、マウス４日胚より生殖細胞分化能を
維持した胚性末分化（ＥＳ）細胞の比較的安定な培養が
可能となり、培養ＥＳ細胞をマウス個体と等価として扱
えるようになった。培養細胞を用いれば１０8 までの細
胞を処理でき、薬剤耐性などの選別が行え、相同組換え
による遺伝子改変が可能である。
維持した胚性末分化（ＥＳ）細胞の比較的安定な培養が
可能となり、培養ＥＳ細胞をマウス個体と等価として扱
えるようになった。培養細胞を用いれば１０8 までの細
胞を処理でき、薬剤耐性などの選別が行え、相同組換え
による遺伝子改変が可能である。
【０００４】しかし、自血病阻害因子（leukemia inhib
itory factor(LIF) などを添加しても現在の培養条件下
では継代数・培養期間が長くなるにつれＥＳ細胞細胞の
生殖細胞分化能は低下する。相同組換えの起こる頻度が
ランダムな遺伝子導入体の１０-4〜１０-3ほどであるこ
とを考慮すると、数多くの遺伝子導入細胞から目的とす
る相同組換えの起こった細胞を短期間に効率よく得るた
めの選別方法の工夫が必要である。ＥＳ細胞での相同組
換え体選別法については、これまでいくつかの方法が知
られている。中でもジフテリア毒素Ａフラグメント（Ｄ
Ｔ−Ａ）遺伝子を用いた方法は、単純ヘルプスウイルス
（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を用いる
方法と同様に選別効果が高い方法として知られている。
itory factor(LIF) などを添加しても現在の培養条件下
では継代数・培養期間が長くなるにつれＥＳ細胞細胞の
生殖細胞分化能は低下する。相同組換えの起こる頻度が
ランダムな遺伝子導入体の１０-4〜１０-3ほどであるこ
とを考慮すると、数多くの遺伝子導入細胞から目的とす
る相同組換えの起こった細胞を短期間に効率よく得るた
めの選別方法の工夫が必要である。ＥＳ細胞での相同組
換え体選別法については、これまでいくつかの方法が知
られている。中でもジフテリア毒素Ａフラグメント（Ｄ
Ｔ−Ａ）遺伝子を用いた方法は、単純ヘルプスウイルス
（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を用いる
方法と同様に選別効果が高い方法として知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】相同組換え細胞の選別
法では、相同組換えにより欠失させる遺伝子がＨｐｒｔ
などの薬剤耐性遺伝子である特殊な場合を除き、一般的
にはまず遺伝子導入細胞をネオマイシン・ホスホトラン
スフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子の発現によるＧ４１８耐
性細胞として選別する。ついでこれらＧ４１８耐性細胞
より相同組換え細胞を選別・同定するが、ＤＴ−Ａを用
いる方法では、この選別・同定を、ジフテリア毒素によ
る細胞の死滅によって行う。〔細胞工学、Vol.１０，Ｎ
ｏ.6 Ｐ４０８〜４１５（１９９１）、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,Vol.87,pp991-8-9922（１９９０）〕。即
ち、ターゲッティングベクターにはプロモーターのない
ｎｅｏ遺伝子（ポリＡシグナルは付加されている）と転
写終結領域を持たないＤＴ−Ａ遺伝子（ポリＡシグナル
は付加されていない。ＭＣ１プロモーターは付加されて
いる）が挿入される。
法では、相同組換えにより欠失させる遺伝子がＨｐｒｔ
などの薬剤耐性遺伝子である特殊な場合を除き、一般的
にはまず遺伝子導入細胞をネオマイシン・ホスホトラン
スフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子の発現によるＧ４１８耐
性細胞として選別する。ついでこれらＧ４１８耐性細胞
より相同組換え細胞を選別・同定するが、ＤＴ−Ａを用
いる方法では、この選別・同定を、ジフテリア毒素によ
る細胞の死滅によって行う。〔細胞工学、Vol.１０，Ｎ
ｏ.6 Ｐ４０８〜４１５（１９９１）、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,Vol.87,pp991-8-9922（１９９０）〕。即
ち、ターゲッティングベクターにはプロモーターのない
ｎｅｏ遺伝子（ポリＡシグナルは付加されている）と転
写終結領域を持たないＤＴ−Ａ遺伝子（ポリＡシグナル
は付加されていない。ＭＣ１プロモーターは付加されて
いる）が挿入される。
【０００６】このターゲティングベクターを用いて相同
組換え体濃縮のストラテジーを図１に示す。まず非相同
的にＥＳ細胞で発現していないＤＮＡ領域にベクターが
組み込まれた場合（右）は、ｎｅｏに発現調節単位がつ
いていないためｎｅｏは発現されず、培養液中のＧ４１
８によりこのような組換え体は死滅する。また、非相同
的にＥＳ細胞で発現しているＤＮＡ領域に組み込まれた
場合（中）は、ｎｅｏが発現されＧ４１８耐性となるも
のの、多くの遺伝子発現領域の下流には転写終結領域が
あるので、３’端についているジフテリア毒素遺伝子の
下流に転写終結領域がくることとなり、ジフテリア毒素
遺伝子も発現され、細胞は死滅する。
組換え体濃縮のストラテジーを図１に示す。まず非相同
的にＥＳ細胞で発現していないＤＮＡ領域にベクターが
組み込まれた場合（右）は、ｎｅｏに発現調節単位がつ
いていないためｎｅｏは発現されず、培養液中のＧ４１
８によりこのような組換え体は死滅する。また、非相同
的にＥＳ細胞で発現しているＤＮＡ領域に組み込まれた
場合（中）は、ｎｅｏが発現されＧ４１８耐性となるも
のの、多くの遺伝子発現領域の下流には転写終結領域が
あるので、３’端についているジフテリア毒素遺伝子の
下流に転写終結領域がくることとなり、ジフテリア毒素
遺伝子も発現され、細胞は死滅する。
【０００７】これに対し、相同組換えが起こった場合
（左）には非相同的な３’端のジフテリア毒素遺伝子は
外れ、ｎｅｏは目的遺伝子（この場合にはｆｙｎ遺伝
子）の発現調節領域により発現されＧ４１８耐性とな
る。このような選別の後、Ｇ４１８耐性として生き残る
細胞は、ほとんどが相同組換え体である。
（左）には非相同的な３’端のジフテリア毒素遺伝子は
外れ、ｎｅｏは目的遺伝子（この場合にはｆｙｎ遺伝
子）の発現調節領域により発現されＧ４１８耐性とな
る。このような選別の後、Ｇ４１８耐性として生き残る
細胞は、ほとんどが相同組換え体である。
【０００８】しかるに、上記の従来技術（ポリＡ付き、
プロモーター無しｎｅｏ遺伝子＋ポリＡ無し、プロモー
ター付きＤＴ−Ａ遺伝子は、ＥＳ細胞で発現している遺
伝子についてのみ適用可能であり、他の大部分のＥＳ細
胞で発現していない遺伝子には適用出来ないという欠点
があった。
プロモーター無しｎｅｏ遺伝子＋ポリＡ無し、プロモー
ター付きＤＴ−Ａ遺伝子は、ＥＳ細胞で発現している遺
伝子についてのみ適用可能であり、他の大部分のＥＳ細
胞で発現していない遺伝子には適用出来ないという欠点
があった。
【０００９】そこで本発明の目的は、ＥＳ細胞で発現し
ていない遺伝子にも適用可能であり、しかも選別効率の
高い相同組換え細胞選別法を提供することにある。
ていない遺伝子にも適用可能であり、しかも選別効率の
高い相同組換え細胞選別法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、ｎｅｏ遺伝子
及びＭＣ１プロモーターを有するジフテリア毒素Ａフラ
グメント遺伝子を組み込んだゲノムＤＮＡを、胚性末分
化（ＥＳ）細胞中で相同組換えさせて、ゲノムＤＮＡ中
の遺伝子を欠失又は改変したゲノムＤＮＡを含む細胞
を、Ｇ４１８及びジフテリア毒素により選別する方法に
おいて、ｎｅｏ遺伝子がその直上流にＰＧＫプロモータ
ーを有し、かつｎｅｏ遺伝子とジフテリア毒素Ａフグメ
ント遺伝子のＭＣ１プロモーターとの間に、ＭＶＭポー
ズシグナル及びブルースクリプトＤＮＡを挿入したゲノ
ムＤＮＡを用いることを特徴とする相同組換え細胞選別
方法に関する。
及びＭＣ１プロモーターを有するジフテリア毒素Ａフラ
グメント遺伝子を組み込んだゲノムＤＮＡを、胚性末分
化（ＥＳ）細胞中で相同組換えさせて、ゲノムＤＮＡ中
の遺伝子を欠失又は改変したゲノムＤＮＡを含む細胞
を、Ｇ４１８及びジフテリア毒素により選別する方法に
おいて、ｎｅｏ遺伝子がその直上流にＰＧＫプロモータ
ーを有し、かつｎｅｏ遺伝子とジフテリア毒素Ａフグメ
ント遺伝子のＭＣ１プロモーターとの間に、ＭＶＭポー
ズシグナル及びブルースクリプトＤＮＡを挿入したゲノ
ムＤＮＡを用いることを特徴とする相同組換え細胞選別
方法に関する。
【００１１】以下の本発明について説明する。本発明の
方法は、基本的に以下のａ〜ｇの工程に従って実施され
る。 ａ．対象とする遺伝子を例えばＥＳ細胞由来のゲノムＤ
ＮＡよりクローニングする。 ｂ．対象とする遺伝子に応じて、ＰＧＫプロモーターを
有するｎｅｏ遺伝子と外来の遺伝子とのカセット、例え
ばLacZ-neoカセットを、破壊又は改変しようとする遺伝
子の適当な部位に挿入する。 ｃ．ｂの遺伝子の３’端に、ＭＣ１プロモーター、ＭＶ
Ｍポーズシグナル及びブルースクリプトＤＮＡを有する
ＤＴ−Ａ遺伝子のカセットを連結してターゲティングベ
クターを作成する。 ｄ．作成したターゲティングベクターをＤＴ−Ａカセッ
ト下で切断し直鎖状とし、エレクトロポレーション（電
気閃孔）法によりＥＳ細胞に導入する。 ｅ．細胞をシャーレに播種、４８時間後より６から９日
間Ｇ４１８で選別する。 ｆ．生成したＧ４１８耐性コロニーを１つずつ１２穴プ
レート中で培養し、成育させて一部を冷結保存し、一部
よりＤＮＡを抽出する。 ｇ．抽出したＤＮＡを用いサザン法により相同組換え体
を同定する。
方法は、基本的に以下のａ〜ｇの工程に従って実施され
る。 ａ．対象とする遺伝子を例えばＥＳ細胞由来のゲノムＤ
ＮＡよりクローニングする。 ｂ．対象とする遺伝子に応じて、ＰＧＫプロモーターを
有するｎｅｏ遺伝子と外来の遺伝子とのカセット、例え
ばLacZ-neoカセットを、破壊又は改変しようとする遺伝
子の適当な部位に挿入する。 ｃ．ｂの遺伝子の３’端に、ＭＣ１プロモーター、ＭＶ
Ｍポーズシグナル及びブルースクリプトＤＮＡを有する
ＤＴ−Ａ遺伝子のカセットを連結してターゲティングベ
クターを作成する。 ｄ．作成したターゲティングベクターをＤＴ−Ａカセッ
ト下で切断し直鎖状とし、エレクトロポレーション（電
気閃孔）法によりＥＳ細胞に導入する。 ｅ．細胞をシャーレに播種、４８時間後より６から９日
間Ｇ４１８で選別する。 ｆ．生成したＧ４１８耐性コロニーを１つずつ１２穴プ
レート中で培養し、成育させて一部を冷結保存し、一部
よりＤＮＡを抽出する。 ｇ．抽出したＤＮＡを用いサザン法により相同組換え体
を同定する。
【００１２】この方法を、マウスのｆｙｎゲノミック遺
伝子をＬａｃＺ遺伝子を挿入して破壊する場合について
具体的に、図２〜５に従ってさらに説明する。
伝子をＬａｃＺ遺伝子を挿入して破壊する場合について
具体的に、図２〜５に従ってさらに説明する。
【００１３】
【実施例】ｆｙｎ遺伝子は非レセプター型チロシンキナ
ーゼをコードするｓｒｃファミリーの一員である。まず
この遺伝子に特異的な５’末端を含むマウスゲノミック
ＤＮＡを単離した。ｆｙｎゲノミック遺伝子の制限酵素
地図を図２に示す。ｆｙｎ遺伝子はハプロイド当たり１
コピーのみ存在し、偽遺伝子は存在しない。図中のブラ
ックボックスはエクソン２（ｅｘ２）とエクソン３（ｅ
ｘ３）を表す。１０．５ｋｂフラグメントを、Ｂｇ１Ｉ
Ｉサイト（ｅｘ２の上流）とＳｐｈＩ部位（ｅｘ３の下
流）でエクサイティングすることにより、ターゲットベ
ッターを構築するのに用いた。
ーゼをコードするｓｒｃファミリーの一員である。まず
この遺伝子に特異的な５’末端を含むマウスゲノミック
ＤＮＡを単離した。ｆｙｎゲノミック遺伝子の制限酵素
地図を図２に示す。ｆｙｎ遺伝子はハプロイド当たり１
コピーのみ存在し、偽遺伝子は存在しない。図中のブラ
ックボックスはエクソン２（ｅｘ２）とエクソン３（ｅ
ｘ３）を表す。１０．５ｋｂフラグメントを、Ｂｇ１Ｉ
Ｉサイト（ｅｘ２の上流）とＳｐｈＩ部位（ｅｘ３の下
流）でエクサイティングすることにより、ターゲットベ
ッターを構築するのに用いた。
【００１４】図３にターゲットベクターｐＨＦＺｐｒＮ
ｅｏＤＴの制限地図を示す。ｌａｃＺ−ｎｅｏカセット
をｅｘ３のＳｓｐＩ部位に挿入した。Ｔｒｐ−ｌａｃＺ
（ｈｐｒｔとＳＶ４０最期遺伝子の２重ポリアデニル化
配列（ｐＡ）を有する）をｆｙｎ遺伝子とともにインフ
レーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）中に配置した。また、ｎｅ
ｏ遺伝子はポリアデニル化配列（ｐＡ）を有さず、ＰＧ
Ｋ−１プロモーターを有するものである。このベクター
は３’末端Ｓｐｈｌ部位にＤＴ−Ａカセット（ｍＲＮＡ
本安定化配列（Ａ＋Ｔ）、ポーズシグナル（ｐａｕ）、
ブルースフリプトＳＫ- ＤＮＡ及びＭＣ１ＤＴ−Ａから
なる）を有する。図４には、ｐＨＦＺｐｒＮｅｏＤＴベ
クターで相同組換えしたターゲットｆｙｎ遺伝子座の予
想図及びｆｙｎとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子間の融合
時の領域の部分配列を示す。
ｅｏＤＴの制限地図を示す。ｌａｃＺ−ｎｅｏカセット
をｅｘ３のＳｓｐＩ部位に挿入した。Ｔｒｐ−ｌａｃＺ
（ｈｐｒｔとＳＶ４０最期遺伝子の２重ポリアデニル化
配列（ｐＡ）を有する）をｆｙｎ遺伝子とともにインフ
レーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）中に配置した。また、ｎｅ
ｏ遺伝子はポリアデニル化配列（ｐＡ）を有さず、ＰＧ
Ｋ−１プロモーターを有するものである。このベクター
は３’末端Ｓｐｈｌ部位にＤＴ−Ａカセット（ｍＲＮＡ
本安定化配列（Ａ＋Ｔ）、ポーズシグナル（ｐａｕ）、
ブルースフリプトＳＫ- ＤＮＡ及びＭＣ１ＤＴ−Ａから
なる）を有する。図４には、ｐＨＦＺｐｒＮｅｏＤＴベ
クターで相同組換えしたターゲットｆｙｎ遺伝子座の予
想図及びｆｙｎとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子間の融合
時の領域の部分配列を示す。
【００１５】図５に本発明の方法における相同組換え体
濃縮のストラテジーを示す。ベクターがポリＡを含まな
い非相同領域に挿入された場合、ポリＡシグナルを有さ
ないためにｎｅｏ遺伝子は効率的に発現せず、その結
果、組換え体はＧ４１８によって死滅する（右）。ベク
ターがポリＡを含む非相同領域に挿入された場合、ｎｅ
ｏ遺伝子は、ポリＡシグナルを受けて効率的に翻訳され
る。しかし、同時にＤＴ−Ａ遺伝子もポリＡシグナルを
受けて効率的に翻訳され、組換え体は死滅する（中）。
一方、相同組換えにおいては（左）、ＤＴ−Ａ遺伝子が
失われ、細胞はｆｙｎのポリＡシグナルを受けてｎｅｏ
遺伝子を発現する。ベクターがポリＡシグナルを含むゲ
ノミック領域に挿入された場合、ｎｅｏ遺伝子の上流の
ＰＧＫ−１遺伝子プロモーターは、下流のＤＴ−Ａ遺伝
子のＭＣ１プロモーターを阻害する可能性がある。何故
なら両者は同じ向きだからである。
濃縮のストラテジーを示す。ベクターがポリＡを含まな
い非相同領域に挿入された場合、ポリＡシグナルを有さ
ないためにｎｅｏ遺伝子は効率的に発現せず、その結
果、組換え体はＧ４１８によって死滅する（右）。ベク
ターがポリＡを含む非相同領域に挿入された場合、ｎｅ
ｏ遺伝子は、ポリＡシグナルを受けて効率的に翻訳され
る。しかし、同時にＤＴ−Ａ遺伝子もポリＡシグナルを
受けて効率的に翻訳され、組換え体は死滅する（中）。
一方、相同組換えにおいては（左）、ＤＴ−Ａ遺伝子が
失われ、細胞はｆｙｎのポリＡシグナルを受けてｎｅｏ
遺伝子を発現する。ベクターがポリＡシグナルを含むゲ
ノミック領域に挿入された場合、ｎｅｏ遺伝子の上流の
ＰＧＫ−１遺伝子プロモーターは、下流のＤＴ−Ａ遺伝
子のＭＣ１プロモーターを阻害する可能性がある。何故
なら両者は同じ向きだからである。
【００１６】この可能性を克服するため、ＭＶＭポーズ
シグナルとブルースクリプトＤＮＡをｎｅｏ遺伝子とＤ
Ｔ−ＡとＭＣ−１プロモーターの間に挿入した。ポーズ
シグナルは、ＲＮＡポリメラーゼを止め又は分離すると
考えられる。ｍＲＮＡ不安定シグナルは、ランダムイン
テグレーション時のリードスルーから起こる転写を不安
定化する。
シグナルとブルースクリプトＤＮＡをｎｅｏ遺伝子とＤ
Ｔ−ＡとＭＣ−１プロモーターの間に挿入した。ポーズ
シグナルは、ＲＮＡポリメラーゼを止め又は分離すると
考えられる。ｍＲＮＡ不安定シグナルは、ランダムイン
テグレーション時のリードスルーから起こる転写を不安
定化する。
【００１７】ターゲットベクターｐＨＦ２ｐＡＮｅｏＤ
ＴとコントロールベクターｐＨＦ２ｐＡＮｅｏｐＡを直
鎖状にし、ＴＴ２ＥＳ細胞（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９７
１）にエレクトロポレーション法により導入した。Ｇ４
１８で選択した後、Ｇ４１８耐性コロニーを５コロニー
のプール中でＰＣＲによりスクリーニングした。各コロ
ニーの半分の細胞はプール分析に供い残りの半分は、
３．５ｃｍ2 ウエル中で各々に培養した。上記ＰＣＲは
２サイクルで行った。第１サイクルではｎｅｏ遺伝子か
ら誘導した外側プライマーＡＧＮ１とターゲットベクタ
ーには含まれていない下流ｆｙｎゲノミック配列からプ
ライマーＦＳｐｃ１とを用いて結合（ジャンクション）
フラグメントを増幅した。
ＴとコントロールベクターｐＨＦ２ｐＡＮｅｏｐＡを直
鎖状にし、ＴＴ２ＥＳ細胞（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９７
１）にエレクトロポレーション法により導入した。Ｇ４
１８で選択した後、Ｇ４１８耐性コロニーを５コロニー
のプール中でＰＣＲによりスクリーニングした。各コロ
ニーの半分の細胞はプール分析に供い残りの半分は、
３．５ｃｍ2 ウエル中で各々に培養した。上記ＰＣＲは
２サイクルで行った。第１サイクルではｎｅｏ遺伝子か
ら誘導した外側プライマーＡＧＮ１とターゲットベクタ
ーには含まれていない下流ｆｙｎゲノミック配列からプ
ライマーＦＳｐｃ１とを用いて結合（ジャンクション）
フラグメントを増幅した。
【００１８】第２サイクルでは、第１ＰＣＲ主成物を内
側プライマーＡＧＮＺとＦＳｐｅＺを用いて増幅し、相
同組換え体中の約１．５ｋｂのフラグメントを検出し
た。ネガティブプール中のクローンは捨て、ポジティグ
又は擬ポジティブプールのクローンは各々２１ｃｍ2 皿
中に繁殖させた。この後、各クローンの一部を取りＰＣ
Ｒにより分析し、ネガティブクローンは捨てた。
側プライマーＡＧＮＺとＦＳｐｅＺを用いて増幅し、相
同組換え体中の約１．５ｋｂのフラグメントを検出し
た。ネガティブプール中のクローンは捨て、ポジティグ
又は擬ポジティブプールのクローンは各々２１ｃｍ2 皿
中に繁殖させた。この後、各クローンの一部を取りＰＣ
Ｒにより分析し、ネガティブクローンは捨てた。
【００１９】ポジティグクローンは２５ｃｍ2 ビンと２
１ｃｍ2 皿に移し、前者を凍結し、後者をサザンブロッ
トハイブリダイゼーション分析用のＤＮＡの単離に用い
た。用いたプローブは０．８ｋｂＳｐｈ１フラグメント
である。このプローブを用いた場合、普通のｆｙｎ遺伝
子座は４．７ｋｂバンドを与え、一方ターゲット遺伝子
座は１．２ｋｂバンドを与える。
１ｃｍ2 皿に移し、前者を凍結し、後者をサザンブロッ
トハイブリダイゼーション分析用のＤＮＡの単離に用い
た。用いたプローブは０．８ｋｂＳｐｈ１フラグメント
である。このプローブを用いた場合、普通のｆｙｎ遺伝
子座は４．７ｋｂバンドを与え、一方ターゲット遺伝子
座は１．２ｋｂバンドを与える。
【００２０】エレクトロポレートした細胞１０7 １当た
りのＧ４１８耐性コロニーの数はコントロールベクター
による４８からターゲットベクターによる３に減少した
（コントロールベクターはＤＴ−Ａカセットを有さな
い）。従って、ＤＴ−Ａネガティブ選択によって１６倍
の濃縮が観測された。表１に示すＰＣＲプール分析で
は、試験した１７のうち、４つのプールがポジティブで
あり、５つのプールが擬ポジティブであった。結果とし
て、ＰＣＲクローン分析から、５つのクローンが相同組
換え体であると同定された。分析は１７のプール中の８
５のクローンについて始めた。従ってＧ４１８耐性コロ
ニー中の相同組換え体の頻度は１／１７であった。全て
のＰＣＲポジティブクローン（Ｆｚ４５、Ｆｚ５５、Ｆ
ｚ６２、Ｆｚ８０、Ｆｚ８２）は、サザンブロットハイ
ブリダイゼーション分析において等モル比で４．７及び
１．２ｋｂのバンドを与えた。相同性はいくつかのプロ
ーブ及び制限酵素を用いたサザンブロット分析によって
も確認された。
りのＧ４１８耐性コロニーの数はコントロールベクター
による４８からターゲットベクターによる３に減少した
（コントロールベクターはＤＴ−Ａカセットを有さな
い）。従って、ＤＴ−Ａネガティブ選択によって１６倍
の濃縮が観測された。表１に示すＰＣＲプール分析で
は、試験した１７のうち、４つのプールがポジティブで
あり、５つのプールが擬ポジティブであった。結果とし
て、ＰＣＲクローン分析から、５つのクローンが相同組
換え体であると同定された。分析は１７のプール中の８
５のクローンについて始めた。従ってＧ４１８耐性コロ
ニー中の相同組換え体の頻度は１／１７であった。全て
のＰＣＲポジティブクローン（Ｆｚ４５、Ｆｚ５５、Ｆ
ｚ６２、Ｆｚ８０、Ｆｚ８２）は、サザンブロットハイ
ブリダイゼーション分析において等モル比で４．７及び
１．２ｋｂのバンドを与えた。相同性はいくつかのプロ
ーブ及び制限酵素を用いたサザンブロット分析によって
も確認された。
【００２１】
【表１】
【００２２】尚、各実験操作は以下の方法により行っ
た。 ＬａｃＺ−ｎｅｏカセット ＢａｍＨＩカセットは５’から３’の順に以下の各フラ
ッグメントを有している。ｐａｃｔ−β−ｇａｌからの
ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ３．５ｋｂＴｒｐ−ｌａｃＺフラ
グメント（前川ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６，６２７−６
３２（１９９１））、ｐＭＣ１ＮｅｏポリＡからのＮａ
ｅ Ｉ−ＢａｍＨＩ１５７ｂｐ ｈｐｒｔポリＡシグナ
ル（トーマスら、Ｎａｔｕｒｅ ３４６，８４７−５８
０（１９９０））、ｐＳＶ２ｅｒｂＢ２からのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ１．７ｋｂＳＶ４０初期遺伝子ポリ
Ａシグナル（須田ら，ＥＭＢＯ Ｊ．６，４０５５−４
０６５（１９８７））及びＰＧＫＩＩｎｅｏからのＥｃ
ｏＲＩＢａｍＨ１１．５ｋｂＰＧＫｎｅｏ遺伝子（カセ
ットＡ）又はＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ１．３ｋｂＰＧＫｎ
ｅｏｐＡ遺伝子（カセットＢ）（ボーエ（Ｂｏｅｒ）
ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２８，
２９９−３０７（１９９０））。
た。 ＬａｃＺ−ｎｅｏカセット ＢａｍＨＩカセットは５’から３’の順に以下の各フラ
ッグメントを有している。ｐａｃｔ−β−ｇａｌからの
ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ３．５ｋｂＴｒｐ−ｌａｃＺフラ
グメント（前川ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６，６２７−６
３２（１９９１））、ｐＭＣ１ＮｅｏポリＡからのＮａ
ｅ Ｉ−ＢａｍＨＩ１５７ｂｐ ｈｐｒｔポリＡシグナ
ル（トーマスら、Ｎａｔｕｒｅ ３４６，８４７−５８
０（１９９０））、ｐＳＶ２ｅｒｂＢ２からのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ１．７ｋｂＳＶ４０初期遺伝子ポリ
Ａシグナル（須田ら，ＥＭＢＯ Ｊ．６，４０５５−４
０６５（１９８７））及びＰＧＫＩＩｎｅｏからのＥｃ
ｏＲＩＢａｍＨ１１．５ｋｂＰＧＫｎｅｏ遺伝子（カセ
ットＡ）又はＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ１．３ｋｂＰＧＫｎ
ｅｏｐＡ遺伝子（カセットＢ）（ボーエ（Ｂｏｅｒ）
ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２８，
２９９−３０７（１９９０））。
【００２３】ＤＴ−Ａカセット Ｇ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ不安定化配列（シャウ（Ｓｈａ
ｗ）ら，Ｃｅｌｌ４６，６５９−６６７（１９８６））
及びＭＶＭポーズシグナル配列（レスネコフ（Ｒｅｓｎ
ｅｋｏｖ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８６，１２−１６（１９８９））を含有する
ＤＮＡフラグメントは合成した。このフラグメントは以
下の配列を有した。
ｗ）ら，Ｃｅｌｌ４６，６５９−６６７（１９８６））
及びＭＶＭポーズシグナル配列（レスネコフ（Ｒｅｓｎ
ｅｋｏｖ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８６，１２−１６（１９８９））を含有する
ＤＮＡフラグメントは合成した。このフラグメントは以
下の配列を有した。
【００２４】５’ＣＣＴＣＧＡＧＡＧＴＡＡＴＡＴＴＴ
ＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴ
ＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧ
ＴＴＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＴＡＡＡ
ＧＧＡＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣ
ＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＣＣ３’
ＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴ
ＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧ
ＴＴＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＴＡＡＡ
ＧＧＡＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣ
ＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＣＣ３’
【００２５】Ｎｏｔ Ｉ部位はブルースクリプト ＳＫ
- （マトラタジーン）から削除した。合成ＤＮＡフラグ
メントはＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐＭＣ１ＤＴ−Ａから
のＸｈｏＩ−Ｓａ１Ｉ０．８ｋｂＭＣ１−ＤＴ遺伝子
（八木ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ８７，３４３５−３４３９（１９９０））を修飾ブ
ルースフリプトＳＫ- のＳａｌＩ部位に挿入した。最後
にＳａｌＩはＮｏｔＩ部位に修飾した。
- （マトラタジーン）から削除した。合成ＤＮＡフラグ
メントはＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐＭＣ１ＤＴ−Ａから
のＸｈｏＩ−Ｓａ１Ｉ０．８ｋｂＭＣ１−ＤＴ遺伝子
（八木ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ８７，３４３５−３４３９（１９９０））を修飾ブ
ルースフリプトＳＫ- のＳａｌＩ部位に挿入した。最後
にＳａｌＩはＮｏｔＩ部位に修飾した。
【００２６】相同組換え体の構築 マウスゲノミックｆｙｎＤＮＡをＥＭＢＬ３Ｂａｌｂ／
ｃゲノミックＤＮＡライブラリーから単離した（八木
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
７，３４３５−３４３９（１９９０））。エクソン３中
のＳｓｐＩ部位の上流約９．５ｋｂのＢｇｌＩＩＩ部位
から、ＳｓｐＩ部位の下流約０．８ｋｂのＳｐｈＩ部位
までの１０．３ｋｂＤＮＡフラグメント（図２）を用い
てターゲットベクターｐＨＦＺｐｒＮｅｏＤＴを構築し
た。５’Ｂｇ／ＩＩ部位はＮｏｔＩ部位に修飾され、
３’ＳｐｈＩ部位はＸｈｏＩ部位に修飾された。エクソ
ン３中のＳｓｐＩ部位は結合ＢｇｌIIリンカーによりＢ
ｇｌＩＩ部位に変化させた。ｌａｃＺ−ｎｅｏカセット
Ａの６．８ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメント、ｐＺｐＡＮ
ｅｏ、をこのＢｇｌＩＩ部位に挿入した。（ｌａｃＺ−
ｎｅｏカセットＢの７．０ｋｂＢａｍＨＩフラグメン
ト、ｐＺｐＡＮｅｏＡ、の挿入によりコントロールベク
ター、ｐＨＦＺｐｒＮｅｏｐＡを得た。）得られた１
６．５ｋｂＮｏｔＩ−ＸｈｏＩフラグメントは、ＤＴ−
Ａカセット、ｐＡＴＰＤＴ、のＮｏｔＩとＸｈｏＩ部位
に挿入され、ターゲットベクターｐＨＦＺｐｒＮｅｏＤ
Ｔを得た。
ｃゲノミックＤＮＡライブラリーから単離した（八木
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
７，３４３５−３４３９（１９９０））。エクソン３中
のＳｓｐＩ部位の上流約９．５ｋｂのＢｇｌＩＩＩ部位
から、ＳｓｐＩ部位の下流約０．８ｋｂのＳｐｈＩ部位
までの１０．３ｋｂＤＮＡフラグメント（図２）を用い
てターゲットベクターｐＨＦＺｐｒＮｅｏＤＴを構築し
た。５’Ｂｇ／ＩＩ部位はＮｏｔＩ部位に修飾され、
３’ＳｐｈＩ部位はＸｈｏＩ部位に修飾された。エクソ
ン３中のＳｓｐＩ部位は結合ＢｇｌIIリンカーによりＢ
ｇｌＩＩ部位に変化させた。ｌａｃＺ−ｎｅｏカセット
Ａの６．８ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメント、ｐＺｐＡＮ
ｅｏ、をこのＢｇｌＩＩ部位に挿入した。（ｌａｃＺ−
ｎｅｏカセットＢの７．０ｋｂＢａｍＨＩフラグメン
ト、ｐＺｐＡＮｅｏＡ、の挿入によりコントロールベク
ター、ｐＨＦＺｐｒＮｅｏｐＡを得た。）得られた１
６．５ｋｂＮｏｔＩ−ＸｈｏＩフラグメントは、ＤＴ−
Ａカセット、ｐＡＴＰＤＴ、のＮｏｔＩとＸｈｏＩ部位
に挿入され、ターゲットベクターｐＨＦＺｐｒＮｅｏＤ
Ｔを得た。
【００２７】細胞株 雄ＴＴ２ＥＳ細胞本体（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９７１）は
Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡマウスとの交配により得られた
普通の非着床遅延、Ｆ１胚盤胞から確立された。ＥＳ細
胞は（八木ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８７，３４３５−３４３９（１９９０））に
記載の方法に従って、普通の又は形質転換したネオマイ
シンホスホトランスフェラーゼを有するマウスの１６日
胚から得たマイミトマイシンＣ処理支持細胞上で培養し
た。
Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡマウスとの交配により得られた
普通の非着床遅延、Ｆ１胚盤胞から確立された。ＥＳ細
胞は（八木ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８７，３４３５−３４３９（１９９０））に
記載の方法に従って、普通の又は形質転換したネオマイ
シンホスホトランスフェラーゼを有するマウスの１６日
胚から得たマイミトマイシンＣ処理支持細胞上で培養し
た。
【００２８】トランスフェクション及び選択 細胞はトリプシン処理し、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に４×１
０7 ／ｍｌの濃度となるように再懸濁した。細胞懸濁液
を１２ｎＭ直鎖状ＤＮＡと等量ずつ混合し、バイオーラ
ド・ジーン・パルサー（２５０Ｖ、９６０μ下）を用い
て、０．４ｃｍの行路長のキュベット中で室温でエネク
トロポレートを行った。処理した細胞は、１０分間放置
した後、９ｃｍ皿当たり３×１０6 細胞の濃度でプレー
トした。３６〜４８時間後にＧ４１８（１５０μｇ／ｍ
ｌ）を添加し、８〜１０日間で選択した。
０7 ／ｍｌの濃度となるように再懸濁した。細胞懸濁液
を１２ｎＭ直鎖状ＤＮＡと等量ずつ混合し、バイオーラ
ド・ジーン・パルサー（２５０Ｖ、９６０μ下）を用い
て、０．４ｃｍの行路長のキュベット中で室温でエネク
トロポレートを行った。処理した細胞は、１０分間放置
した後、９ｃｍ皿当たり３×１０6 細胞の濃度でプレー
トした。３６〜４８時間後にＧ４１８（１５０μｇ／ｍ
ｌ）を添加し、８〜１０日間で選択した。
【００２９】ＰＣＲ及びサザンブロットによる遺伝子型
分析 須田らの方法（ＥＭＢＯ Ｊ．６，４０５５−４０６５
（１９８７））によりＤＮＡを単離し、（１μｇＤＮＡ
を０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー
及び５０Ｕ／ｍｌのＴａｇポリメラーゼを含有する１×
ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ９．０、
５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ2、０．０１％ゼ
ラチン（ｗ／ｖ）、０．１％トライトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）×−１００）に溶解して最終５０μｌとした。増幅
は、熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔ
ｕｓ）で３０サイクルで行った。各サイクルは４５秒９
５℃の変性、２５秒６０℃のアニール及び３分７２℃の
伸長からなる。
分析 須田らの方法（ＥＭＢＯ Ｊ．６，４０５５−４０６５
（１９８７））によりＤＮＡを単離し、（１μｇＤＮＡ
を０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー
及び５０Ｕ／ｍｌのＴａｇポリメラーゼを含有する１×
ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ９．０、
５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ2、０．０１％ゼ
ラチン（ｗ／ｖ）、０．１％トライトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）×−１００）に溶解して最終５０μｌとした。増幅
は、熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔ
ｕｓ）で３０サイクルで行った。各サイクルは４５秒９
５℃の変性、２５秒６０℃のアニール及び３分７２℃の
伸長からなる。
【００３０】使用したプライマーは、（１）ターゲット
ベクターに含まれていないＳｐｈＩ部位の下流のイント
ロン３中のｆｙｎ遺伝子配列：ＦＳｐｈ１（５’ＣＡＧ
ＴＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＴ３’）
ＦＳｐｅ１（５’ＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴ
ＡＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＴ３’）及びＦＳｐｅ２
（５’ＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡ
ＴＴＴＡＧＡＡＧＡ３’）（２）イントロン２中のゲノ
ミック配列ＦＧＰ２（５’ＣＴＴＡＧＴＡＴＣＡＡＴＴ
ＣＣＣＴＧＴＧ３’）並びに（３）ｎｅｏ配列；ＡＧＮ
１（５’ＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧ
ＣＴＣＣＣＧＡＴＴ３’）及びＡＧＮ２（５’ＴＴＧＡ
ＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＡ３’）１６μｌの反応サン
プルを用いて１％アガロースゲル中で常法により行っ
た。サザンブロット分析は、上記須田らの方法により行
った。
ベクターに含まれていないＳｐｈＩ部位の下流のイント
ロン３中のｆｙｎ遺伝子配列：ＦＳｐｈ１（５’ＣＡＧ
ＴＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＴ３’）
ＦＳｐｅ１（５’ＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴ
ＡＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＴ３’）及びＦＳｐｅ２
（５’ＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡ
ＴＴＴＡＧＡＡＧＡ３’）（２）イントロン２中のゲノ
ミック配列ＦＧＰ２（５’ＣＴＴＡＧＴＡＴＣＡＡＴＴ
ＣＣＣＴＧＴＧ３’）並びに（３）ｎｅｏ配列；ＡＧＮ
１（５’ＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧ
ＣＴＣＣＣＧＡＴＴ３’）及びＡＧＮ２（５’ＴＴＧＡ
ＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＡ３’）１６μｌの反応サン
プルを用いて１％アガロースゲル中で常法により行っ
た。サザンブロット分析は、上記須田らの方法により行
った。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来法のＤＴ−Ａを用いた相同組換え体濃縮の
ストラテジーを示す。
ストラテジーを示す。
【図２】ｆｙｎゲノミック遺伝子の制限酵素地図であ
る。
る。
【図３】ターゲットベクターｐＨＦＺｐｒＮｅｏＤＴの
制限酵素地図である。
制限酵素地図である。
【図４】ｐＨＦＺｐｒＮｅｏＤＴベクターで相同組換え
したターゲットｆｙｎ遺伝子座の予想図及びβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子間の融合時の領域の部分配列を示す。
したターゲットｆｙｎ遺伝子座の予想図及びβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子間の融合時の領域の部分配列を示す。
【図５】本発明の方法における相同組換え体濃縮のスト
ラテジーを示す。
ラテジーを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 井川 洋二 茨城県つくば市高野台３丁目１番１ 理化 学研究所ラフサイエンス筑波研究センター 内
Claims (1)
- 【請求項１】 ｎｅｏ遺伝子及びＭＣ１プロモーターを
有するジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子を組み込ん
だゲノムＤＮＡを、胚性末分化細胞中で相同組換えさせ
て、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子を欠失又は改変したゲノム
ＤＮＡを含む細胞を、Ｇ４１８及びジフテリア毒素Ａに
より選別する方法において、ｎｅｏ遺伝子がその直上流
にＰＧＫプロモーターを有し、かつｎｅｏ遺伝子とジフ
テリア毒素Ａフラグメント遺伝子のＭＣ１プロモーター
との間に、ＭＶＭポーズシグナル及びブルースクリプト
ＤＮＡを挿入したゲノムＤＮＡを用いることを特徴とす
る相同組換え細胞選別法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4158592A JP2651316B2 (ja) | 1992-05-26 | 1992-05-26 | 相同組換え細胞選別法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4158592A JP2651316B2 (ja) | 1992-05-26 | 1992-05-26 | 相同組換え細胞選別法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05328966A true JPH05328966A (ja) | 1993-12-14 |
| JP2651316B2 JP2651316B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=15675056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4158592A Expired - Fee Related JP2651316B2 (ja) | 1992-05-26 | 1992-05-26 | 相同組換え細胞選別法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2651316B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995010619A3 (en) * | 1993-10-08 | 1995-07-13 | Univ Michigan | Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors |
| US5811274A (en) * | 1994-12-09 | 1998-09-22 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods, compositions and apparatus for cell transfection |
| JPWO2006067913A1 (ja) * | 2004-12-22 | 2008-06-12 | 中外製薬株式会社 | フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 |
-
1992
- 1992-05-26 JP JP4158592A patent/JP2651316B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995010619A3 (en) * | 1993-10-08 | 1995-07-13 | Univ Michigan | Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors |
| US5534423A (en) * | 1993-10-08 | 1996-07-09 | Regents Of The University Of Michigan | Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors |
| US5866400A (en) * | 1993-10-08 | 1999-02-02 | The University Of Michigan | Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors |
| US5811274A (en) * | 1994-12-09 | 1998-09-22 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods, compositions and apparatus for cell transfection |
| JPWO2006067913A1 (ja) * | 2004-12-22 | 2008-06-12 | 中外製薬株式会社 | フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2651316B2 (ja) | 1997-09-10 |
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