JP2632014B2 - 骨髄機能障害性貧血治療剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はヒトエリスロポエチンを有効成分として含有
する白金錯体制ガン剤誘発性の骨髄機能障害性貧血治療
剤に関する。

［従来の技術］ 貧血とは血液の中の血色素の量が正常の人より減少し
た状態であって、様々な原因によって起こることが知ら
れている。骨髄での造血機能が何らかの障害を受けて起
こる貧血もその１つであるが、該障害の原因としては遺
伝的なもの、制ガン剤等の薬剤或いは放射線等があげら
れている〔高久史麿編，血液病学（第２版），医学書
院，第14項〜第24項〕。

この骨髄機能障害性貧血の治療法としては従来、メス
タノロン、ナンドロロンシピオネート、ナンドロロンフ
リルプロピオネート等の蛋白同化ホルモンやエナント酸
テストステロン等の男性ホルモンを投与する方法がとら
れてきた。そしてこれらホルモン剤の投与によってもな
お症状が改善されない場合に、最後の手段として骨髄移
植が行われるというのが現状であった。

［発明が解決しようとする課題］ しかし、上記した蛋白同化ホルモン剤には肝機能障
害、月経異常、その他多くの副作用があり、且つ禁忌症
もあるという問題点があり、又、男性ホルモン剤にも肝
臓への副作用がある他、女性及び男性に対し夫々ホルモ
ン剤特有の副作用がある〔大阪府病院薬剤師会編，医薬
品要覧（第４版），薬業時報社版,1977,P662〜P699参
照〕。さらに、骨髄移植に於ても、間質性肺炎等の合併
症、移植後の免疫不全等の問題があり、又高度な療法の
ため簡単にどこででも行なえるものではないという難点
があった（臨床免疫、15（９）:687〜699,1983参照）。

本発明者らは、制ガン剤により誘発される骨髄機能障
害制貧血の改善に着目した。制ガン剤の中でも、特に、
シスプラチン等の白金錯体制ガン剤により誘発される貧
血は、他の制ガン剤により誘発される貧血に比べて一般
に重症である。それは白金錯体制ガン剤により、骨髄障
害の他にEPO産生臓器である腎臓に対し重篤な腎障害を
も引き起こすためと考えられる（代謝,Vol.22,臨時増刊
号，癌'85（1985），第957〜967頁）。このことは、後
述の実験例にも示したように、ラットにシスプラチン
（CDDP）を単独投与した場合（実験例、図１、●印）で
は、５−FUを単独投与した場合（比較実験例、図２、○
印）に比べ、血中ヘモグロビン値の回復が遅くなってい
ることからも分る。

［課題を解決するための手段］ そこで本発明者らは、白金錯体制ガン剤誘発性の骨髄
機能障害性貧血に、より安全で優れた効果を有する治療
剤を得るべく鋭意検討した結果、本出願人が以前より研
究してきたエリスロポエチン（以下「EPO」と略記す
る）により、所期の目的が達成されることを見出し本発
明を完成するに至った。

すなわち、本発明はヒトエリスロポエチンを有効成分
として含有する白金錯体制ガン剤誘発性の骨髄機能障害
性貧血治療剤を提供するものである。又、本発明の製剤
は白金錯体制ガン剤による骨髄機能障害という副作用を
軽減する薬理効果をも同時に有するものであるから、こ
れに基づきヒトエリスロポエチンを有効成分として含有
する白金錯体制ガン剤の副作用軽減剤を提供するもので
もある。

以下本発明を詳細に説明する。

上記した骨髄機能障害の原因となる白金錯体制ガン剤
としては、例えばシスプラチン等があげられる。又、前
述の通り本発明製剤はこれらの白金錯体制ガン剤の副作
用軽減剤でもある。

EPOはヒトに限らず、種々の動物において、骨髄に存
在する赤芽球系幹細胞に働いて、赤血球系細胞への分化
成熟、増殖を促進する作用を示す微量生理活性物質とい
うが、本発明で用いるヒトEPOは、その１つでありヒト
固有のアミノ酸配列を有するポリペプタイドであって、
適宜糖鎖を有するかまたは有さないものである。具体的
には、ヒト尿由来のもの、ヒドEPOのアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現させることによ
り得られるもの（以下「ヒトrEPO」という）、ヒト腎癌
細胞の組織培養物から得られるもの、あるいはヒトEPO
産性能を有するヒト由来の細胞株を細胞融合して得たハ
イブリドーマを培養して得られるもの等である。

本発明に用いられるヒトEPOは種々の手段によって得
ることができる。

例えば、ヒト尿EPOは正常人尿や再生不良性貧血患者
の尿又は血漿（血清を含む）から抽出することにより得
ることができる〔T.MIYAKE等，ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミスト リー（J.B.C.）,252巻5558頁
（1977年）;J.P.Lewin等、ジャーナル オブ ラボラト
リー アンド クリニカル メディシン（J.Lab.Clin.M
ed.）,66巻987頁（1965年）〕。

またヒトrEPOは例えばヒトEPOのアミノ酸配列に対応
するメッセンジャーRNA（mRNA）を採取し、そのmRNAを
利用して組換DNA体を作成し、次いで適当な宿主細胞
（例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母類、植物又は動物
の細胞株等）で生産させるような、所謂、遺伝子工学的
方法によって得られる。〔例えば、SYLVIA L.H.等；プ
ローシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミ
ー オブ サイエンシーズ オブ ザ ユー エス エ
ー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）81巻2708頁（1984年）を
参照〕。

前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができ
るが好ましくはヒト又は哺乳動物由来の培養細胞株であ
り、例えば、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（C
HO）細胞、マウスＣ−127細胞等を挙げることができ
る。この他、ヒト腎癌細胞の組織培養物から製造する方
法〔特開昭54−55790号〕、ヒトEPO産生能を有するヒト
由来のリンパ芽球様細胞から製造する方法〔特開昭57−
40411号〕、ヒト細胞株を細胞融合して得られるハイブ
リドーマを培養して得る方法等によっても製造すること
ができる。

これらの方法によって得られたヒトEPOは白金錯体制
ガン剤誘発性の骨髄機能障害性貧血の治療に有効である
ような十分な酸素運搬機能を有する成熟赤血球細胞を増
殖させる限り、全て本発明に使用され得る。

上記の方法に於て、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトEPOは、所望により通常の単離・精製法によって
さらに濃縮・精製することができる。例えば、安息香
酸、エタノール、アセトン、タンニン酸等の有機溶媒に
よる沈殿法、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透
析法、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の
各種クロマトグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気
泳動等の電気泳動法等が挙げられ、これらの方法は単独
でまたは適宜組合せて用いてもよい。

得られたヒトEPOは凍結保存とするかまたは凍結乾
燥、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存するこ
とができる。さらにはヒトEPO含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出さ
せ、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。
また所望により、ヒトEPOを適当な緩衝液に溶解した
後、ミリポアフィルター等で無菌ろ過して注射剤とする
ことができる。

本発明の白金錯体制ガン剤誘発性の骨髄機能障害性貧
血治療剤は場合によりその他の貧血治療剤、例えば鉄
剤、ビタミンB12製剤、男性ホルモン剤等を処方的に配
合するかまたは使用時に混合することができ、前記鉄剤
の例としては乾燥硫酸第一鉄、フマール酸鉄、デキスト
ラン鉄、グルコン酸鉄、グルクロン酸鉄、オロチン酸鉄
等を挙げることができる。

本発明の白金錯体制ガン剤誘発性の骨髄機能障害性貧
血治療剤に含まれるヒトEPOの投与量、投与回数は対象
の疾患患者の病状を配慮して決めることができるがヒト
EPOとして成人１人当たり500〜100000U/日を連日もしく
は少なくとも２週間に１回投与される。

又、投与方法としては通常静脈注射又は皮下投与がと
られる。

本発明の白金錯体制ガン剤誘発性の骨髄機能障害性貧
血治療剤は安定化物質を含んでいてもよく、該安定化物
質として、例えば、ポリエチレングリコール、タンパク
質、糖類、アミノ酸、無機塩、有機塩および含硫還元剤
が挙げられ、これらの１つ又は２つ以上を含有してもよ
い。

これらの安定化物質の添加量は、ヒトEPOの１重量部
に対して0.11〜10000重量部の割合で配合することが好
ましい。なお、２つ以上の安定化物質を混合して使用す
る場合においてもそれらの総量が上記範囲以内であれば
よい。

これらの安定化物質は相応する量を適当な濃度とpHの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は0.
1〜3.0の範囲とし、より好ましくは0.8〜1.2である。水
溶液のpHは5.0〜9.0に調整し、特にpH6〜８に調整する
のが好ましい。

また本発明の製剤を調整するにあたっては、吸着防止
剤を添加してもよい。

［実施例］ 以下参考例（ヒトEPOの製造例）、実験例（薬理効
果）、実施例（製剤例）をあげて本発明を具体的に説明
する。

参考例１ ヒト尿EPOの製造 Step1）人尿からの部分精製 MIYAKE.T.等の方法〔ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（J.B.C.）52巻5558頁（1977年）〕
に従って再生不良性貧血患者尿から １）Sephadex G5
0による脱塩 ２）DEAEセルロースによるバッチ吸着
３）エタノール沈殿 ４）DEAEアガロースカラムクロマ
トグラフィーを用いて部分精製されたヒト尿EPOを得
た。

Step2）逆相クロマトグラフィー 得られた部分精製ヒト尿EPOを24％プロパノール（和
光純薬社製）を含む0.1％トリフルオロ酢酸（Aldrich社
製）溶液に溶解せしめたのちHPLCによる精製を行った。
HPLC装置は日立638−50型を用い280nmと220nmの紫外部
吸収により検出を行った。

24％ｎ−プロパノールを含んだ0.1％トリフルオロ酢
酸溶液で予め平衡化したYMC−C8カラム（6mm×30cm山村
化学社製）に上記で得られた試料を注入し、前記平衡化
溶液で溶出させた。未吸着画分が溶出後、ｎ−プロパノ
ールの濃度を26％に高めて溶出させた。EPOの活性画分
を集めた後、Centricon−100（Amicon社商品名）を用い
た限外ろ過法により、0.1〜0.2mlに濃縮した。

Step3）高速分子篩クロマトグラフィー 上記濃縮試料を26％ｎ−プロパノールを含む0.1％TFA
溶液で予め平衡化したTSK−G300 SWカラム（7.8mm×60
cm東洋曹達社製）に注入し、前記平衡液で溶出させた。
分子量25000〜30000の位置にEPO活性を有するピークが
得られたので、この部分を集めて凍結乾燥した。比活性
は約９×10⁴U/mgであった。

各ステップに於ける比活性を表Ｉに示す。

＊アッセイ法Iscove N.N等〔ジャーナル オブ セル
ラー フィジオロジー（J.Cell.Physiol.）83巻309頁
（1974年）〕の方法に従った。

参考例２ CHO細胞由来ヒトrEPOの製造 12月27日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転
換のための補助DNAを含むベクター」（特願昭59−28186
2号）に開示された方法に従って、ヒトEPOのアミノ酸配
列をコードする遺伝子を組込んだプラスミドをチャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）で形質発現させる
ことによってヒトrEPOを得た。要約すると以下の如くで
ある。

ヒト胎児肝細胞から得られたヒトEPOのアミノ酸配列
をコードする遺伝子を組込んだラムダHEOPEL13クローン
からのDNAをEcoR1で消化させ、ヒトEPOのアミノ酸配列
をコードする遺伝子を含む小さなR1フラグメントを取り
出しプラスミドRKI−４のEcoR1部位へ挿入した。このヒ
トEPOの遺伝子を組込んだプラスミドRKI−４をDHFR−欠
損CHO細胞に組入れて形質転換させた。CHO細胞を核酸を
欠如きたアルファ培地中で培養することによって少なく
とも１つのDHFR遺伝子を有する細胞を選択した後、段階
的にメトトレキサートの濃度を高めてゆくことによって
ヒトrEPOを産生させた。最終的な培養上清中のヒトrEPO
の活性は20U/mlであった。

CHO細胞を無血清培養液で３日間培養した後、ヒト尿E
POで用いた精製方法に準じてヒトrEPOを精製した。得ら
れたヒトrEPOはKrystal等の方法〔ジャーナル オブ
ラボラトリー アンド クリニカル メディスン（J.La
b.Clin.Med.）97巻144頁（1981年）〕により6600U/mlの
活性を有していた。またこのヒトrEPOはSDSポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果、単一のバンドであること
が確認された。

得られたヒトrEPOに0.1％BSAを加え、生理食塩水にて
透析した後、実験に供した。

実験例 シスプラチン誘発貧血に対するヒトEPOの貧血改善効果 1.実験動物： 体重140〜160gの雄性SDラット（静岡実験動物）を用
いた。一群４〜５匹とし、水、餌を自由に摂取できる環
境下で飼育した。

2.薬剤： シスプラチン（CDDP）（Aldrichより購入）は生理食
塩液に溶解させ、ラット体重100g当たり1mlを尾静脈よ
り静注した。なお、CDDPの構造は以下の通りである。

CHO−細胞由来のヒトrEPOを希釈液（５％マンニトー
ル、0.05％ヒト血清アルブミン）で希釈後、ラット体重
100g当たり、0.5mlを尾静脈より投与した。

3.実験方法： ラットにCDDP8mg/kgを単回投与し、13日目に下記の方
法で血液検査を行い、ヘモグロビンが均一になるように
群分けした。ヒトrEPOの投与を13日目より開始し、隔日
１回、計10回投与を行った。ヒトrEPO非投与群には溶媒
（vehicle）の処置を行わなかった。正常ラット（CDDP
非投与群）にヒトrEPOを投与する場合も同様に行った。

（血液検査） CDDP投与後、経時的に、背中足静脈より血液20μを
ザーリーピペットで採取し、自動血球計数装置（Sysmex
CC−180A）でヘモグロビンを測定した。

4.結果： 結果を図１に示す。図にみるとおり、ヒトrEPOを22U/
kgから170U/kgに変えて投与した結果から、CDDP誘発貧
血に対し用量依存的に貧血改善がなされることがわか
る。

比較実験例 ５−FU誘発貧血に対するヒトEPOの貧血改善効果 1.実験動物： 体重150〜160gの雄性SDラット（静岡実験動物）を用
いた。一群６匹とし、水、餌を自由に摂取できる環境下
で飼育した。

2.薬剤： ５−FUを150mg/kg使用した他は実験例と同じ。

3.実験方法： ５−FUを150mg/kgラットに群注する。一方該５−FU投
与８日前からヘモグロビンが最低になる12日後までヒト
rEPOを計11回静注するスケジュールを用いて、ヒトrEPO
の用量を170,860,1730,3460U/kgにかえて投与した。採
血は経時的に背中足静脈より行い、ヘモグロビン値を測
定した。

4.結果： 結果を図２に示す。図から明らかなとおり、５−FU
150mg/kgを静脈投与すると、投与後１週間目ぐらいから
貧血症状が出現するが、12日目以降はすみやかに回復す
る（５−FU投与群）。

一方５−FUとヒトrEPO併用群では、ヒトrEPOの前投与
により、貧血発症前（４日前）に、ヘモグロビンが正常
レベル以上に増加した。貧血が発症する８日以降では、
ヒトrEPO併用群でもヘモグロビンの減少がみられるもの
の、用量依存的に明らかな貧血改善効果が認められた。
ヒトrEPO1730U/kg以上の投与ではヘモグロビンはほぼ正
常レベルを維持した。

実施例 １ CHO細胞由来ヒトrEPO １重量部 ヒト血清アルブミン 100重量部 注射用蒸留水にて全量 100000重量部 上記組成比で無菌的に溶液を調整し、バイアルに分注
し、凍結乾燥し密封した。

実施例 ２ 実施例１におけるヒト血清アルブミンに代えてデキス
トラン40を100重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を作
製した。

実施例 ３ 100ml中にマンニトール5g、ヒト尿EPO1mg、ヒト血清
アルブミン100mg、アセチルトリブトファンナトリウム
2.154mg、カプリル酸ナトリウム1.33mgを含む水溶液を
無菌的に調整し、1mlずつバイアルに分注し凍結乾燥し
密封する。

実施例 ４ pH7.0の0.05Mリン酸緩衝液100ml中にヒト尿EPO1mg、
ポリエチレングリコール4000 500mg、エチレンオキサ
イドプロピレンオキサイド共重合体30mg、塩化ナトリウ
ム800mgを含む水溶液を無菌的に調整し、1mlずつアンプ
ルに分注熔閉する。

実施例 ５ pH7.0の0.05Mリン酸緩衝液50ml中にCHO細胞由来ヒトr
EPO0.5mg、グリシン1g、ソルビトール1gを含む水溶液を
無菌的に調整し、0.5mlずつバイアルに分注し、凍結乾
燥し密封する。別に0.1％メチルセルロース水溶液を無
菌的に調整し、1mlずつアンプルに分注し、溶解用溶液
とする。

実施例 ６ 100ml中にヒト尿EPO1mg、ヒト血清アルブミン500mg、
マンニトール500mgを含む水溶液を無菌的に調整し、1ml
ずつバイアルに分注し凍結乾燥し密封する。

別に300ml中にグリコン酸第二鉄3g、NaCl2.7gを含む
水溶液を無菌的に調整し、3mlずつアンプルに分注し、
熔封する。上記１バイアルを１アンプルに溶解し徐々に
（２〜３分で）静注する。

【図面の簡単な説明】

図１はCDDP誘発貧血マウスに対するヒトrEPO投与効果を
示す図であり、図２は５−FU誘発貧血マウスに対するヒ
トrEPO投与効果を示す図である。

フロントページの続き (72)発明者 松本 智子 静岡県御殿場市駒門705―１ 中外製薬 株式会社内 (56)参考文献 特開 昭62−30（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−252729（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−41614（ＪＰ，Ａ) 「新版日本血液学全書１ 血球の分 化」第66〜72頁 昭和57年１月25日（丸 善) 関正利他編「実験動物の血液学」第 205〜208頁 昭和56年５月20日（リフト サイエンス社)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトエリスロポエチンを有効成分として含
   有する白金錯体制ガン剤誘発性の骨髄機能障害性貧血治
   療剤。