MXPA05012936A - Formacion de conjugados novedosos de eritropoietina utilizando transglutaminasa. - Google Patents

Formacion de conjugados novedosos de eritropoietina utilizando transglutaminasa.

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Abstract

La invencion provee composiciones de conjugado de eritropoietina (EPO) biologicamente activas en donde se emplea una reaccion de transglutaminasa para conjugar covalentemente y de manera sitio especifica la molecula EPO a un polimero hidrofilo no antigenico que tambien se puede enlazar covalentemente a una molecula organica cualesquiera de dichas modificaciones incrementa la vida media en suero en circulacion de la composicion.

Description

FORMACION DE CONJUGADOS NOVEDOSOS DE ERITROPOIETINA UTILIZANDO TRANSGLUTAMINASA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a formulaciones novedosas de eritropoietina preparadas utilizando un método enzimático de unión de grupos a la estructura o alterando la bioactividad a través de mutaciones de la secuencia primaria. En particular, la invención se refiere a compuestos de conjugado de eritropoietina que tienen propiedades fisicoquímicas y farmacocinéticas alteradas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La eritropoietina (EPO) es una glicorpoteína que se forma de manera natural la cual funciona como un factor estimulante de la colonia y sirve como el factor principal implicado en la regulación de la síntesis de eritrocitos. La eritropoietina actúa al estimular a las células precursoras en la médula ósea ocasionando que se dividan y diferencien hacia eritrocitos maduros. Este procedimiento está estrechamente controlado en el cuerpo de tal manera que la destrucción o remoción de eritrocitos a partir de la circulación coincide con la velocidad de formación de células nuevas. La EPO que se presenta de manera natural es una glucoproteína producida en el riñon (Jacobs, et al. Nature 313 (6005), 806-810 (1985). La eritropoietina ha sido elaborada utilizando tecnología de ADN recombinante a través de la clonación del gen EPO y la expresión en las células de ovario de hámster Chino (Lin, Patente de E.U.A. No. 5618698). La EPO recombinantemente producida ha estado disponible por cierto tiempo como un agente terapéutico efectivo en el tratamiento de diversas formas de anemia, incluyendo anemia asociada con insuficiencia renal crónica, pacientes infectados con VIH tratados con zidovidina, y pacientes cancerosos bajo quimioterapia mielosupresora. La glucoproteína se administra parenteralmente, ya sea como una onyección intravenosa (IV) o subcutánea (SC) en soluciones acuosas convencionales con pH regulado las cuales contienen albúmina de suero de humano (HSA) como un vehículo. Dichas formulaciones se comercializan en los Estados Unidos bajo los nombres registrados EPOGEN® y PROCRIT®. Estos productos contienen eritropoietina en dosis particular de 1 mi, libre de conservador o en viales de 2 mi de dosis múltiples con conservador. Aunque se ha probado que estas formulaciones son altamente exitosas, ciertas desventajas están asociadas con los productos. Actualmente, el periodo de bioactividad de terapéuticos de proteína tales como la eritropoietina se limita por las vidas medias cortas en plasma y la susceptibilidad a la degradación por proteasa. La vida media corta de las proteínas terapéuticas tales como la EPO, cuatro horas, necesita la administración frecuente para una eficiencia clínica máxima. Esta es una desventaja para el tratamiento de condiciones crónicas y puede resultar en poca aceptación por parte del paciente, y por lo tanto en un resultado menos que óptimo. Por consiguiente, se han realizado intentos para incrementar la vida media en plasma de la EPO. En años recientes, los polímeros solubles en agua no antigénicos, tales como el polietilenglicol (PEG) han sido utilizados para la modificación covalente de los polipéptidos de importancia terapéutica y diagnóstica. Por ejemplo, la unión covalente de la PEG a los polipéptidos terapéuticos tales como las interleucinas (Knauf, M. J. et al., J. Biol. Chem. 1988, 263, 15, 064; Tsutsumi, Y. et al., J. Controlled Reléase 1995, 33, 447), interferones (Kita, Y. et at., Drug Des Delivery 1990, 6, 157), catalasa (Abuchowski, A. et al., J. Biol Chem. 1977, 252, 3, 582), superóxido dismutasa (Beauchamp, C. O. et al., Anal Biochem. 1983, 131, 25), y adenosina desaminasa (Chen, R. ét al, Biochim, Biophys. Acta 1981 , 660, 293), se ha reportado que extienden su vida media ¡n vivo, y/o reducen su inmunogenicidad y antigenicidad. Los compuestos derivados de PEG han sido previamente descritos (US 5438040, 1 de agosto de 1995, Conjugation-Stabilized Polypeptide Compositions, Therapeutic Delivery and Diagnostic Formulations Comprising Same, and Method of Making and Using the Same, N. N. Ekwuribe). Este método para la derivación post-traduccional también se ha aplicado a la EPO. Por ejemplo, el documento WO 94/28024 describe conjugados poliméricos modificados por carbohidrato con actividad de eritropoietina en donde el PEG se asocia vía un carbohidrato oxidado. El documento US 4904584 describe la conjugación de óxido de polialquileno de variantes de polipéptido sin lisina, incluyendo EPO. El documento WO 90/12874 describe la preparación de un monometoxi-PEG-EPO (mPEG-EPO) en el cual el EPO contiene un residuo de cisteína introducido mediante ingeniería genética al cual se une covalentemente el reactivo PEG específico. Otras composiciones PEG-EPO se describen en EP 605693, US 6,077,939, WO 01/02017 y EP 539167. Un aspecto frecuentemente limitante de muchos métodos para modificar proteínas mediante la conjugación al PEG ("Proteinglicosilación") utilizando métodos puramente químicos, es la reacción indiscriminada y frecuentemente incompleta con grupos amina la cual se puede presentar sobre residuos de lisina accesibles y/o sobre la amina N-terminal de la proteína. Otros métodos químicos requieren la oxidación de los grupos carbohidrato como parte de la estrategia de modificación que lleva de manera similar a las reacciones incompletas o inconsistentes y a composiciones de productos no definido. Por lo tanto, considerando las presentes opciones disponibles, podría ser ventajoso un método para modificar a la EPO de manera ligera, sitio específica. Las transglutaminasas (TGasas) [EC2.3.2.13; proteína-glutamina:gamma-glutamiltransferasa] son una familia de proteínas que catalizan la adición de acilo dependiente de calcio a una amina primaria en donde el grupo gamma-carboxamida del residuo de glutamina unida al péptido es el donante acilo y la amina primaria es el aceptor de acilo y el donante de amina. En la naturaleza, las TGasas entrecruzan a las proteínas mediante la catalización de la formación de enlaces amida entre residuos de lisina y de glutamina con proteínas opuestas. Un ejemplo bien conocido es el entrecruzamiento de la fibrina por el factor XHIa de la TGasa. Este enlace es estable y resistente a las proteasas y por lo tanto, las TGases generalmente se utilizan para enlazar componentes estructurales de las células. Además de la forma en plasma anteriormente mencionada, las TGasas se encuentran en tejidos tales como el hígado, piel, y en fluidos extracelulares (Greenberg, C. Set al. FASEB J. 1991 , 5, 3071-3077). También se conocen las formas procariónticas de la TGasa (Ando, H. et al. Agrie. Biol. Chem 53 (10), 2613-2617, 1989; Washizu, K. et al. Biosci. Biotech. Biochem 58 (1 ), 82-87, 1994). La especificidad de las TGasas es bastante pronunciada con usualmente solamente uno, o én algunos casos dos, residuos de glutamina por proteína sirviendo como aceptores de amina. Las TGasas a partir de diversos tejidos de mamífero y especies se han estudiados de manera extensa (Folk, J. E. y Chung, S. I. Adv. Enzym Molec. Biol. 1973, 38, 109-191 ; Folk, J. E. y Finlayson, J. S. Adv.Protein Chem. 1977, 31 , 1-133; Folk, J. E y Colé, P. W. Biochim Biophys. Acta 1966, 122, 244-264; Folk, J. E.; Chung, S. I. Methods in Enzymology 1985, 1 13, 358-375;). Por lo tanto, las TGasas podrían y han sido empleadas para modificar de manera sitio específica a los residuos de glutamina en algunas proteínas (US6010871 ; US6331422; US6322996).
A pesar de numerosos estudios, se han elucidado pocos detalles acerca de los determinantes de la especificidad de la TGasa. Las TGasas difieren en especificidades al sustrato, y cuando se eligen residuos como donantes o aceptores de acilo, generalmente no se ha identificado la preferencia para motivos específicos de secuencia como que contienen o que rodean el residuo del sustrato para enzimas individuales (Gorman, J. J.; Folk, J. E. J. Biol. Chem. 1981 , 256, 2712-2715; Gorman, J. J.; Folk, J. E. J. Biol. Chem. 1980, 255, 419-427). La única regla definitiva es que un residuo de glutamina se debe de colocar al menos a tres residuos del N-terminal para servir como un sustrato para cualquier TGasa. En general, se ha mostrado que los repetidos de glutamina mejoran las propiedades de aceptor de cada residuo de glutamina en el repetido, y también se ha mostrado que la accesibilidad de los residuos de glutamina es importante para determinar su capacidad de funcionar como sustratos de TGasa (Kahlem, P. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996, 93, 14580-14585). Aunque la naturaleza sitio específica de las modificaciones de la TGasa ha sido conocida desde la década de los 1960s, y se practican los usos industriales en la estabilización del alimento, solamente recientemente se han empezado a explorar los usos en la modificación de la proteína terapéutica. El uso de las TGasas para unirse a polímeros de 5 kilodaltones o a polímeros más grandes que contienen grupos amino alifáticos hacia residuos de glutamina unidos a la proteína se descubrió recientemente por Sato, et al en la Patente de E.U.A. No. 6,322,996. Esta patente también describe los métodos para diseñar proteínas para que contengan péptidos N-terminalmente o C-terminalmente añadidos los cuales se sabe que son sustratos de TGasa para el propósito de la unión subsecuente de polímeros grandes utilizando la cataliza de la TGasa. La proteinglicosilación de la IL-2 se ha logrado utilizando estos métodos (Sato, H.; Ikeda, M.; Suzuki, K.; Hirayama, K. Biochemistry 1996, 35, 13072- 13080), también se ha demostrado el entrecruzamiento de la IL-2 a diversas otras proteínas utilizando TGasa bacteriana (Takahara, Y. et al. Patente de E.U.A. No. 6010871), y el uso del factor Xllla en la producción de una matriz de fibrina modificada para ingeniería del tejido (Patente de E.U.A. No. 6331422). La modificación o adición de motivos a una molécula que se presenta de manera natural porta múltiples riesgos que se conocen bien por aquellos que practican la técnica de ingeniería genética para el propósito de proveer métodos para la elaboración de proteínas terapéuticas. El más obvio de estos efectos es la pérdida o pérdida parcial de actividad biológica. En otros casos, el nivel de expresión a partir de los vectores de expresión construidos es inaceptablemente bajo cuendo se incorpora en líneas celulares de mamífero. El método alternativo de acoplamiento o fusión de una secuencia sustrato conocida a partir de un sustrato protéico que se presenta de manera natural puede crear un epítope antigénico y puede ocasionar reacciones inmunes no deseables en el sujeto el cual finalmente limita la eficiencia a largo plazo de la proteína terapéutica. Además, la modificación de la proteínas utilizando métodos químicos que atacan el grupo funcional más reactivo, lisina, también cambia el punto isoeléctrico de la proteína y el pKa. Por lo tanto, cuando el objetivo es proveer productos seguros y económicamente producidos, es importante entender estas limitaciones. La conversión del grupo amida de la glutamina hacia una amina alquilada no cambia el punto isoeléctrico o carga de esa glutamina. Por lo tanto, sería deseable el uso de un procedimiento enzimático que crea un enlace covalente estable a la vez que no se modifica la carga eléctrica de la proteína. Hasta ahora, la EPO no ha sido considerada un sustrato natural de TGasa ni tiene la re-ingeniería de la molécula con el objeto de crear o eliminar sitios de sustrato de TGasa en EPO.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención provee composiciones de conjugado de EPO biológicamente activas en donde EPO es eritropoietina o sus derivados farmacéuticamente aceptables que tienen propiedades biológicas que ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y eritrocitos, en donde una reacción de transglutaminasa se emplea para conjugar covalentemente y de manera sitio específica la molécula de EPO a un polímero hidrófilo no antigénico que también se puede enlazar covalentemente a una molécula orgánica, cualesquiera de dichas modificaciones incrementa la vida media en suero en circulación de la composición. Más particularmente, por lo tanto una modalidad de la invención se refiere a derivados de EPO descritos por la fórmula EPO-[Gln-A-X-(M)„]y (I) en donde EPO es eritropoietina o sus derivados farmacéuticamente aceptables que tienen propiedades biológicas que ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y eritrocitos; GIn es un residuo de glutamina seleccionado a partir de uno o más residuos de glutamina dentro de la secuencia primaria de EPO; y es un entero de 1 a 7 que indica el número de residuos modificados de glutamina; A es una porción donante de amina o un grupo hidroxilo, X es una porción polimérica hidrófila opcional; M es una molécula orgánica opcional (incluyendo péptidos y proteínas) que incrementa la vida media en circulación de la construcción; y n es un entero de 0 a 15. Las porciones X y M se pueden modificar como sea necesario para incluir grupo diseñados para proveer la funcionalidad adecuada para el acoplamiento o la valencia. La molécula orgánica, M, es opcional, y está covalentemente unida al polímero hidrófilo. M se selecciona a partir de una porción orgánica que es capaz de incrementar la vida media in vivo de la construcción resultante e incluye ácidos grasos, ácidos dicarboxílicos, monoésteres o monoamidas de ácidos dicarboxílicos, lípidos que contienen ácidos grasos saturados, lípidos que contienen ácidos grasos ¡nsaturados, lípidos que contienen mezclas de ácidos grasos saturados e ¡nsaturados, carbohidratos simples, carbohidratos complejos, carbociclos (tales como esteroides), heterociclos (tales como alcaloides), cadenas de aminoácidos, proteínas, enzimas, cofactores enzimáticos, o vitaminas. El polímero hidrófilo preferiblemente es un óxido de polialquileno tal como polietilenglicol. Otra modalidad de la invención se refiere a derivados de EPO descritos por la fórmula EPO-[Lys-Gln-Z-X-(M)n]y (II) en donde EPO es eritropoietina o sus derivados farmacéuticamente aceptables que tienen propiedades biológicas que ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y eritrocitos; Lys es un residuo de lisina seleccionado a partir de uno o más residuos de lisina dentro de la secuencia primaria de EPO; y es un entero de 1 a 8 que indica el número de residuos modificados de lisina; GIn es un residuo de glutamina; Z es un péptido o proteína que contiene el residuo GIn que es capaz de actuar como un aceptor de transglutaminasa amina, X es un polímero hidrófilo opcional; M es una molécula orgánica opcional (incluyendo péptidos y proteínas) que incrementa la vida media en circulación de la construcción; N es un entero de 0 a 15. Las porciones X y se pueden modificar como sea necesario para incluir grupos diseñados para proveer la funcionalidad adecuada para acoplamiento o valencia. La presente invención también provee métodos para preparar los conjugados. Los métodos incluyen el paso de utilizar una TGasa para catalizar la transferencia de acilo de un grupo donante amino o un alquilamina conjugado a uno o más residuos específicos de glutamina en una EPO glicosilada o no glicosilada o una glicoproteína que tiene actividad eritropoiética que tiene un residuo de glutamina. Los métodos también incluyen el paso de utilización de la TGasa para catalizar la transferencia de acilo de un grupo donante amino sobre la EPO a uno o más residuos de glutamina en un péptido, proteína, u otro polímero. Incluido en la presente invención se encuentra la descripción de EPO como un sustrato de TGasa. Por lo tanto, también se incluye en esta invención un método para alterar una molécula de EPO mediante métodos recombinanfes o químicos para mutar, añadir o modificar cualesquiera residuos de glutamina o lisina o cualesquiera otros residuos, para permitir o para mejorar la capacidad de la molécula EPO para actuar como un sustrato de TGasa cuyas propiedades permiten así la conjugación de la molécula de EPO a un polímero hidrófilo o a otra porción orgánica que contiene una porción donante de amina o aceptora de amina. Puesto que las propiedades del sustrato de TGasa pueden estar involucradas en la actividad biológica de las proteínas, también se incluye en esta invención la mejoría o disminución de las propiedades del sustrato de TGasa de una molécula de EPO a través de métodos recombinantes o químicos. Por lo tanto, de conformidad con la invención, la molécula de EPO se puede modificar para incrementar la vida media en circulación o para mejorar de otra manera la actividad biológica de la eritropoietina de mamífero o cualquier conjugado o proteína eritropoiética mutante. La invención también provee métodos para tratar la anemia u otras condiciones asociadas con eritropoietina endógena reducida o eritropoiesis o condiciones bajo las cuales se desea un incremento en los eritrocitos. En este aspecto de la invención, el tratamiento incluye la administración de una cantidad efectiva de los conjugados descritos en la presente invención a los mamíferos que requieren de dicha terapia. Como un resultado de la presente invención, se proveen los conjugados que tienen actividad eritropoiética ]n vivo sustancialmente prolongada. Las técnicas descritas en la presente invención tienen la ventaja de proveer molecular de EPO con una vida media en circulación incrementada y una potencia eritropoiética mejorada. Además, las moléculas de EPO modificadas de la invención tienen una ventaja en tanto que la conjugación y/o mutaciones estén bien controladas llevando a productos terminales que están sustancialmente bien definidos y caracterizados.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena madura de la eritropoietina de humano con los residuos de glutamina en cajas. La figura 2 es una imagen de un gel de SDS-PAGE en el cual un sustrato de TGasa fluorescentemente marcado, dansil cadaverina (DC), se incubó con proteínas en la presencia o ausencia de TGasa. La marca se visualiza utilizando exposición de UV: Línea 1 = marcadores de peso molecular. Línea 2 = EPO + DC + TGasa. Líneas 3 y 4 = EPO + DC; Línea 5 = EPO estándar; y línea 6 = b-caseína + DC + TGasa. La b-caseína es un sustrato conocido para la TGasa y se utilizó como un control positivo. La banda fluorescente de 35 K en la línea 2 corresponde a EPO con una o más porciones DC unidas. Las bandas con peso molecular más elevado en la línea 2 probablemente corresponden a los dímeros y trímeros de la EPO. El mismo gel se tiñó con plata para identificar los marcadores de peso molecular y otras bandas, no fluorescentes. Las figuras 3A-3D son los análisis MALDI S de una (a) EPO desglicosilada, (b) EPO desglicosilada-cadaverina-X-biotina (deben observarse adiciones de +424), (c) EPO desglicosilada-DC (deben observarse adiciones de +318), y (d) EPO desglicosilada-cbz (deben observarse adiciones de +319).
Las figuras 4A-4D son los espectros de masas MALDI TOF para (a) Lys-C digerido de EPO (control); (b) Lys-C digerido de EPO-X-biotina; (c) Lys-C digerido de EPO desglicosilada (control); (d) Lys-C digerido de EPO-DC desglícosilada. Las figuras 5A-5D son los espectros de masas MALDI TOF para (a) EPO desglicosilada-(Cbz-QG) lote #1 ; (b) EPO desglicosilada-(Cbz-QG) lote #2; (c) Lys-C digerido de EPO desglicosilada-(Cbz-QG) lote #1 ; (d) Lys-C digerido de EPO desglicosilada-(Cbz-QG) lote #1. La figura 6 muestra una gráfica de la absorbancia contra la concentración de especies de EPO añadidas para la hematopoiesis de células UT7 incubadas con EPO-(Cbz-QG) o EPO no modificada (EPO- control). La figura 7 es una imagen de un gel de poliacrilamida teñido con plata que muestra la unión de cadaverina-PEG (20K) a EPO vía catálisis por TGasa: Línea 1 = marcadores de peso molecular. Línea 2 = EPO + TGasa + DC. Línea 3 = EPO estándar. Línea 4 = EPO + TGasa (6 horas); Línea 5 = EPO + TGasa (22 horas); Líneas 6 y 7 = TGasa (6 horas y 22 horas resp.); Línea 8 = PEG (20K)-cadaverina; Líneas 9, 10 y 11 = EPO + PEG 20K-cadaverina + TGasa (6 horas, 22 horas, y 22 horas (reducida), resp.). Nótese que la muestra de EPO + DC estaba sobrecargada de tal manera que la señal de fluorescencia de la DC pudo ser maximizada. La figura 8 muestra un trazado de la intensidad contra la masa para la relación de carga en un SELDI-MS de la mezcla de reacción de EPO + PEG 20K-cadaverina + TGasa. El pico a 51 ,010 corresponde al producto de EPO polietilenglicosilado. La figura 9 muestra un gel de SDS-PAGE teñido con plata (4- 20%) de la EPO (línea 1) y EPO pur¡f¡cada-PEG5K-putrescína (línea 2). Nótese que muy poca EPO no modificada está presente en la muestra de EPO- putrescina-PEG5K. La figura 10 muestra un trazado de la intensidad contra la masa para la relación de carga en un SELDI- S de la mezcla de reacción (EPO + PEG (5K) -putrescina + TGasa). La figura 11 muestra un trazado de la intensidad contra la masa para la relación de carga en un SELDI-MS para la EPO purificada -PEG (5K)-putrescina. (Nótese que la muestra del grupo PEG tiende a suprimir la ionización y por lo tanto las áreas pico no son indicativas de la cantidad relativa de cada especie presente.) La figura 12 muestra una gráfica de la absorbancia contra la concentración de especies de EPO añadidas para la hematopoiesis de las células UT7 incubadas con EPO-putrescina-PEG (5K) (EPO-PEG) o EPO no modificada (EPO-control). La figura 13 muestra un trazado de la intensidad contra la masa para la relación de carga en un SELDI-MS de la reacción de EPO + putrescina-PEG-DSPE3.4K + TGasa (55% de etanol y 45% de regulador de pH para reacción de TGasa, pH 7.5). El pico en 28.8 K corresponde a EPO no modificada, mientras que los picos en 33.7K, 37.5K y 41.6K corresponden a la adición de uno, dos y tres porciones de putrescina-PEG-DSPE3.4K por EPO. (Nótese que el grupo lipídico tiende a suprimir la ionización y por lo tanto las áreas de pico no son indicativas de la cantidad relativa de cada especie presente.) DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La EPO se produce principalmente en los ríñones y funciona a través de la unión a los dimeros del receptor sobre las células precursoras que lleva a la diferenciación hacia eritrocitos y su proliferación subsecuente (Livnah, O. et al. Science 1999, 283, 987-990). La secuencia primaria de la EPO tiene 7 residuos de glutamina (SEQ ID NO: 1). El archivo NCBI ensamblado, ?0 588, evidencia a las glutaminas en las posiciones; 85, 86, 92, 105, 113, 119, y 142 de la proteína precursora que corresponden a; 58, 59, 65, 78, 86, 92, y 115 de la cadena madura. Estas se muestran en la figura 1. La EPO se une a los receptores a través de dos superficies de unión, una de las cuales tienen una mayor actividad para el receptor que la otra. Se ha resuelto la estructura cristalina de la EPO (Syed, et al. Nature 395 (6701), 511-516 (1998); Cheetham, J. C. et al. Human Erythropoietin, NMR minimized average structure. 8-Sep-1998. Protein data base ID 1 BUY). También se ha descrito la estructura cristalina de la EPO unida a sus receptores (véase Stroud, R. M. y Reid, S. W., Erythropoietin complexed with extracelluiar domains of erythropoietin receptor. Protein data base ID1CN4). Dentro del complejo, cuatro de los ocho residuos de lisina sobre la EPO hacen contactos directos con los receptores mientras que de los 7 residuos de glutamina, todos excepto uno son accesibles al solvente y solamente Gln78 muestra cualquier interacción posible con los receptores. A partir de estas observaciones, es evidente que los residuos de glutamina en la EPO ofrecen un potencial significativo para la unión del PEG o de otros polímeros sin interferir con la unión al receptor, aunque la modificación indiscriminada de los residuos de lisina es casi seguro que interfiere con la unión hasta cierto grado. Aunque varios de los residuos de lisina presentes en la EPO participan en la unión al receptor, otros podrían ofrecer un potencial significativo para la unión a los PEGs o a otros polímeros si éstos pudieran ser específicamente modificados. Puesto que las TGasas son extremadamente selectivas con respecto a las lisinas sobre las proteínas que pueden servir "como sitios del sustrato para donación de amina, existe la posibilidad de que el uso de las TGasas para unir polímeros a estos residuos de lisina sean direccionados de manera selectiva por las TGasas. Puesto que las TGasas están presentes en muchos fluidos y tejidos de mamíferos, el descubrimiento de que la EPO es un sustrato de la TGasa indica que, como tal, las reacciones in vivo catalizadas por transglutaminasa podrían tener un impacto sobre la biodisponibilidad y distribución de cualquier proteína terapéutica que contiene secuencias a partir de la eritropoietina de mamífero que incluye residuos de glutamina y/o de lisina. Por lo tanto, se continua que la eliminación, enmascaramiento, o modificación de estos residuos para disminuir o eliminar sus propiedades inherentes de sustrato de TGasa podría alterar significativamente las propiedades biológicas de dicho agente biofarmacéutico y mejorar la eficiencia de cualesquiera de dichas proteínas eritropoiéticas. Dichas modificaciones se realizan mediante la mutación de dichos residuos de glutamina y/o de lisina hacia cualesquiera de los otros 19 aminoácidos que se presentan de manera natural, modificando químicamente dichos residuos de lisina y/o de glutamina, o mediante la unión de pequeños sutratos donantes de acilo o donantes de amina a estos sitios utilizando TGasas eliminándolos así como sustratos de TGasa. También, se ha sugerido que algunos residuos mejoran o disminuyen las propiedades del sustrato de los residuos de lisina o de glutamina contenidos dentro de los péptidos o proteínas. Por lo tanto, la mutación, adición, o modificación química de otros residuos dentro de la secuencia de ' una proteína eritropoiética podría mejorar o disminuir las propiedades del sustrato de los residuos de lisina o de glutamina contenidos dentro de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína. En un artículo reciente (Dale, et al. Nature 415 (10), 175-179 (2002)) los autores mostraron que la serotonina es un sustrato de la TGasa y se une a las plaquetas activadas a través de entrecruzamiento catalizado por la TGasa a las proteínas de superficie. El factor XIII de las TGasas y la transglutaminasa de tejido se Identificaron sobre la superficie de plaquetas activadas. El entrecruzamiento de la serotonina a la superficie de la plaqueta aumenta la retención de las proteínas de procoagulación sobre la superficie celular. Este estudio muestra que las TGasas extracelulares pueden entrecruzar proteínas que contienen sitios de sustrato de la TGasa a las superficies celulares y que esta actividad puede facilitar potencialmente la unión de una proteína con su receptor. Esto sugiere que las propiedades del sustrato de la TGasa exhibidas por la EPO podrían participar directamente en la potencia eritropoiética de la proteína si las TGasas participan en la unión de la proteína a las células eritroides progenitoras o a otras líneas celulares blanco.
EPO La materia prima para la modificación hacia una forma bioactiva de la EPO preferiblemente es eritropoietina o sus derivados que tienen las propiedades biológicas que ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y eritrocitos. La glicoproteína EPO se puede obtener a partir de fuentes naturales o se puede producir de manera recombinante utilizando procedimientos conocidos como los que se describen en las Patentes de E.UA 4,703,008; 5,441 ,868; 5,547,933; 5,618,698 y 5,621 ,080 aquí incorporadas como referencia. También se pueden utilizar las formas no glicosiladas o hiperglicosiladas de la proteína eritropoietina con la actividad biológica deseada. Los métodos para la producción de EPO hiperglicosilada se enseñan en los documentos WO 0249673 y EP6406 9.
Transglutaminasas Cualesquiera de las enzimas que catalizan la transferencia de acilo a partir de la glutamina hacia un aceptor son adecuadas para uso en la presente invención. La transglutaminasa, derivada a partir de hígado de conejillo de Indias, es particularmente adecuada, y fácilmente disponible a través de fuentes comerciales por ejemplo Sigma Chemical Co., ICN Chemicals, y los similares. Las TGasas de origen microbiano también se pueden utilizar, por ejemplo, la transglutaminasa independiente de calcio de Streptoverticillium sp. o a partir de Streptoverticillium mobaraense (Ando et al. Agrie. Biol. Chem. , 53 (10), 2613-17, 1989).
Aceptores de acilo/donantes de amina Las TGasas tienen una amplia especificidad para donantes de amina primaria los cuales pueden ser ya sea compuestos que contienen amina primaria, o grupos epsilo-amino de lisina unidos a péptido o a proteína. Los sustratos donantes de amina para TGasas incluyen: amoniaco, hidroxilamina, metilamina, etanolamina, feniletilamina, histamina, espermina, espermidina, cadaverina, putrescina, grupos lisina unidos a proteína o a péptido, amina amidas tal como glicinamida pero no L-tirosinamida. La N-(5-aminopentanil)-5-dimetilamino-1-naftalen-sulfonamida (dansílcadaverina) es un sustrato útil para la evaluación de sustratos protéicos debido a su fluorescencia natural y a su capacidad para actuar como un excelente donante de amina (véase Folk y Chung, 1973 anteriormente mencionado).
El agua también puede actuar como un nucleófilo en la presente invención, que resulta en la conversión de glutamina hacia ácido glutámico en cuyo caso la porción A en la fórmula I anteriormente mencionada es una porción hidroxilo. Se ha mostrado que los aminosacáridos, véase por ejemplo WO 0179474, y aminoalquilsacáridos, en JP2000300287, son los donantes adecuados de amina para la unión a proteínas catalizada por transglutaminasa. Los aminosacáridos son cualquier monosacárido, oligosacárido o polisacárido que contiene un grupo amino primario y cualquier monosacárido, oligosacárido o polisacárido preparado por medio de am ¡nación reductora de un monosacárido, oligosacárido o polisacárido con el objeto de introducir un grupo amina. Un ejemplo ventajoso de un aminosacárido es aminosorbitol. Por lo tanto, cualesquiera de los compuestos anteriormente mencionados o relacionados pueden actuar como el donante de amina y adicionalmente se pueden modificar a sí mismos adicionalmente con el objeto de que la reacción de trans-acilación catalizada por la TGasa conjugará efectivamente el grupo deseado para que sea añadido a la estructura EPO en dicho residuo de glutamina. Las moléculas particularmente preferidas que representan la porción A de la fórmula I son: cadaverina, putrescina, 1 ,5-diaminopentano, ,6-diaminohexano 1 ,7-diaminoheptano o diaminoalcanos similares.
Donantes de acilo/aceptores de amina Las TGasas son capaces de enlazar péptidos y proteínas que contienen glutamina al grupo e-amino de una lisina dentro de la estructura de una proteína si el residuo de lisina funciona como un sustrato del sitio de TGasa. Por lo tanto, de conformidad con la fórmula II anteriormente mencionada, Z representa un péptido o proteína que contiene el residuo Gln que es capaz de actuar como aceptor de transglutaminasa amina. Los péptidos que muestran entrecruzamiento a los residuos de lisina unidos a la proteína via catálisis por TGasa incluyen: TVQQEL, PGGQQIV, pEAQQIV, PKPQQFM, EAQQIVM, y múltiples derivados de Benciloxicarbonilo (Cbz)-QG (Grootjans, et al. JBC 270 (39), 22855-22858 (1995)), (Groenen et al. Eur. J. Biochem. 205, 671-674 ( 992)), (Gorman et al. JBC 255 (2), 419-427 (1980)). Los péptidos tales como éstos se pueden unir covalentemente a PEG o a otros polímeros, tales como aquellos anteriormente mencionados, y luego se unieron vía catálisis por TGasa a EPO u otras proteínas que contienen residuos de lisina donantes de amina.
Polímeros solubles en agua Un polímero soluble en agua particularmente preferido es una de las diversas especies de PEG. El PEG consiste de una unidad de carbón básica, HO-(CH2)2-OH, y se vende en diversas formas bajo los nombres: polietilenglicol (diversos pesos moleculares); óxido de polietileno; Carbowax PEG (diversos pesos moleculares); alfa-hidro-omega-hidroxipoli(oxi-1 ,2- etanediil); 1 ,2-etandiol etoxilado; Polioxietilen éter; emkapol 200; gafanol e 200; piuriol e 200; polidiol 200; polietilenglicol; PEG; Polyox WSR-301; PEG 200; Macrogol; y Polioxietileno. En aquellos aspectos de la invención en los cuales se utilizan los polímeros basados en PEG, se prefiere que tengan pesos moleculares promedio de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 100,000 Daltones, y preferentemente entre aproximadamente 2,000 y aproximadamente 40,000 Daltones. Las sustancias poliméricas alternativas solubles en agua incluyen materiales tales como dextranos, polivinilpirrolidonas, polisacáridos, almidones, alcoholes polivinílicos, poliacrilamidas u otros polímeros similares no inmunogénicos. Aquellos expertos en la técnica se dan cuenta de que lo precedente es meramente ilustrativo y no se pretende que restrinja el tipo de polímeros no antigénicos adecuados para uso en la presente invención.
Molécula orgánica que imparte vida media farmacocinética extendida ¡n vivo Las porciones orgánicas que se pueden unir al polímero hidrófilo para incrementar la vida media incluyen ácidos grasos, ácidos dicarboxílicos, monoésteres o monoamidas de ácidos dicarboxílicos, lípidos que contienen ácidos grasos saturados, lípidos que contienen ácidos grasos insaturados, lípidos que contienen mezclas de ácidos grasos saturados e insaturados, carbohidratos simples, carbohidratos complejos, carbociclos (tales como 2 esteroides), heterociclos (tales como alcaloides), cadenas de aminoácidos, proteínas, enzimas, cofactores enzimáticos, o vitaminas. En una modalidad, el grupo polimérico hidrófilo está sustituido con uno a aproximadamente seis grupos alquilo, ácido graso, éster de ácido graso, lípido o fosfolípido (como se describe en la presente invención, por ejemplo, fórmula I y fórmula II). Preferiblemente, el grupo polimérico hidrófilo sustituido es un PEG lineal o ramificado. Preferiblemente, el grupo polimérico hidrófilo sustituido es un PEG lineal (por ejemplo, PEG diamina) que está terminalmente sustituido con un grupo de ácido graso, éster de ácido graso, lípido o fosfolípido o un hidrocarburo. Los polímeros hidrófilos que están sustituidos con un grupo alquilo, ácido graso, éster de ácido graso, lípido o fosfolípido se pueden preparar utilizando métodos adecuados. Por ejemplo, un agente modificador se puede preparar mediante la reacción de PEG diamina monoprotegida con un ácido graso activado (por ejemplo, cloruro de palmitoilo). El producto resultante se puede utilizar para producir un EPO modificado que comprende un PEG que está sustituido con un grupo de ácido graso. Se puede utilizar una variedad de otros esquemas sintéticos adecuados. Por ejemplo, un polímero que contiene amina se puede acoplar a un ácido graso o éster de ácido graso como se describe en la presente invención, y un carboxilato activado (por ejemplo activado con ?,?'-carbonildiimidazol) sobre un ácido graso o éster de ácido graso se puede acoplar a un grupo hidroxilo sobre un polímero. De esta manera, se puede construir una multitud de estructuras multiméricas adecuadas de cadena lineal o ramificada que tienen las propiedades y finalmente asociada o ramificada para que contenga ya sea una amina primaria la cual actuará como el donante de transglutaminasa amina, o un péptido o polímero que contiene glutamina que puede actuar como el aceptor de transglutaminasa amina. Los ácido grasos y ésteres de ácido grasos adecuados para el uso en la presente invención pueden ser saturados o pueden contener uno o más unidades insaturadas. En una mortalidad preferida, los ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos comprenden de aproximadamente seis a aproximadamente cuarenta átomos de carbono. Los ácido grasos los cuales son adecuados para modificar la EPO en el método de la invención incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n-hexadecanoato (C16, palmitato), n-octadecanoato (C18, estearato), n-eicosanoato (C20, araquidato), n-docosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40), cis-D9-octadecanoato (C18, oleato), todos cis D5.8.1 1.14-eícosatetraenoato (C20, araquidonato), ácido octanedióico, ácido tetradecanedióico, ácido octadecandeióico, ácido docosanedióico, y los similares. Los ésteres de ácido graso adecuados incluyen monoésteres de ácidos dicarboxílicos los cuales comprenden un grupo alquilo inferior lineal o ramificado. El grupo alquilo inferior puede comprender de uno a aproximadamente doce, preferiblemente uno a aproximadamente seis, átomos de carbono. Los ésteres de ácidos grasos adecuados para modificar las proteínas de la invención incluyen, por ejemplo, metil octadecanoato, etil octadecanoato, propil octadecanoato, butil dodecanoato, sec-butil dodecanoati, ter-butil dodecanoato, neopentil tetradecanoato, hexil tetradecanoato, metil cis-A9-octadecanoato, y los similares.
Preparación del sustrato de TGasa para transferencia hacia Epo Por lo tanto, el experto en la técnica puede preparar conjugados de dos o de tres partes o más enlazadas a la porción amina donante de amina o a una porción aceptora de amina y el complejo resultante funcionará con el sustrato de TGasa. La preparación de los otros sustratos preferiblemente se lleva a cabo paso a paso y el paso final resultará en una amina primaria particular protegida o desprotegida. Por lo tanto, si por ejemplo, los grupos reactivos a la amina incluyendo grupos electrófilos tales como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, iodo), N-hidroxisuccinimidil ásteres (NHS), fenil ésteres sustituidos, haluros de acilo y los similares se utilizan para acoplar el polímero soluble en agua y las moléculas orgánicas, en la mayoría de los casos se debe proteger a la amina primaria. Se conocen bien otros métodos para conjugar moléculas orgánicas a polímeros e incluyen el uso de agentes las cuales pueden reaccionar con tioles, por ejemplo, maleimida, iodoacetilo, acrilolilo, piridil disulfuros, ácido tiol 5-tioI-2-nitrobenzóico (TNB-tiol), y los similares. Se conocen en la técnica los métodos adecuados para introducir dichos grupos tiol reactivos en las moléculas (véase por ejemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Un grupo funcional aldehido o cetona se puede acoplar a moléculas que contienen amina o hidrazida y un grupo azida se puede hacer reaccionar con un grupo fosforoso trivalente para formar enlaces fosforamidato o fosforimida. Un grupo reactivo se puede unir directamente al polímero hidrófilo, complejo conjugado o a través de una porción enlazadora, por ejemplo un grupo hidrocarbilo de C1-C12. Como se utiliza en la presente invención, "grupo hidrocarbilo" se refiere a una cadena hidrocarburo en donde uno o más átomos de carbono están opcionalmente reemplazados por un heteroátomo tal como oxígeno, nitrógeno o azufre. Las porciones enlazadoras adecuadas incluyen, por ejemplo, tetraetilenglicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- y -CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH-NH-. Se pueden producir los agentes modificadores los cuales comprenden una porción enlazadora, por ejemplo, mediante la reacción de un mono-Boc-alquildiamina (por ejemplo mono-Boc-etilendiamina, mono-Boc-diaminohexano) con un ácido graso en la presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para formar un enlace amina entre la amina libre y el carboxilato de ácido graso. El grupo protector Boc se puede remover a partir del producto mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) para exponer una amina primaria la cual puede estar acoplada a otro carboxilato como se describe, o se puede hacer reaccionar con anhídrido maléico y el producto resultante se formó en ciclo para producir un derivado maleimido activado del ácido graso. (Véase, por ejemplo, Thompson, et al., WO 92/16221 las enseñanzas totales del cual se incorporan en la presente invención como referencia).
Los ejemplos de los compuestos eritropoiéticos derivados son: M-PEG-A-EPO en donde el M-PEG se une a las glutaminas o lisinas específicas utilizando una TGasa en donde M es un lípido, carbohidrato, polisacárido, ácido graso, derivado de ácido graso, alcohol graso o proteína y A es un donante de amina, preferiblemente cadaverina o putrescina, o un receptor de amina, preferiblemente un péptido corto de 1-30 aminoácidos, que contiene glutamina. (M-PEG)2-A-EPO en donde el M-PEG está esterificado a dos grupos carboxilo diferentes sobre A, en donde M es un lípido, carbohidrato, polisacárido, ácido graso, derivado de ácido graso, alcohol graso o proteína. Los ejemplos adecuados de la porción A que tienen dos diferentes grupos carboxilo para la esterificación incluyen derivados de diglicéridos o de triglicéridos así como derivados de ácido maléico, ácido citracónico, ácido glutámico u otros polímeros que contienen dos o más carbonos de carboxilo. También se incluyen múltiples superiores. (M-PEG)2-R-A-EPO en donde el (M-PEG)2-R es dos grupos carboxilo diferentes sobre A, en donde M es un lípido, carbohidrato, polisacárido, ácido graso, derivado de ácido graso, alcohol graso o proteína y R es una construcción mejoradora de la valencia, tal como dendrímeros de aminoácidos y los similares, que contienen múltiples grupos funcionales para la unión de múltiples (MPEG)2 u otras porciones. También se incluyen múltiples superiores. M-A-EPO en donde M es una proteína o péptido y A es una cadena lateral de lisina sobre dicha proteína o péptido. M-A-EPO en donde M es una proteína o péptido y A es una cadena lateral de glutamina sobre dicha proteína o péptido. M-A-EPO en donde M es un lípido y A es un aceptor de amina, preferiblemente un péptido corto, que contiene glutamina. M-A-EPO en donde M es un lípido y A es putrescina, cadaverina u otro diaminoalcano. M-A-EPO en donde M es biotina, dansilo, u otra porción que imparte características biofísicas a EPO que son útiles para propósitos de investigación, de diagnóstico o terapéuticos y A es putrescina, cadaverina, u otros sustrato adecuado a TGasa donante de amina o aceptor de amina. En el caso en donde se incorpora biotina u otra porción que tiene un patrón de unión conocido dentro del conjugado, se anticipa que dicho conjugado se puede utilizar en investigación, diagnóstico o terapia en un complejo con su patrón de unión conocido tal como en un complejo de biotina-avidina.
Usos terapéuticos Las formulaciones de EPO de la presente invención son útiles como una formulación parenteral en el tratamiento de trastornos sanguíneos caracterizados por una baja producción o una producción defectuosa de eritrocitos tales como diversas formas de anemia, incluyendo anemia asociada con insuficiencia renal crónica, pacientes infectados con VIH tratados con zidovidina, y pacientes cancerosos tratados con quimioterapia. Esta también puede tener aplicación en el tratamiento de una variedad de estados de enfermedad, trastornos y estados de irregularidad hematológica tales como enfermedad de célula falciforme, beta-talassemia, fibrosis quística, preñez y trastornos menstruales, anemia temprana de premadurez, lesión de médula espinal, enfermedad por viajes largos, pérdida aguda de sangre, envejecimiento y los similares. Esta también puede tener aplicaciones en situaciones en donde se desea un incremento en los eritrocitos tales como pacientes en pre-cirugía. Preferiblemente, la composición de la EPO de la presente invención se administra parenteralmente (por ejemplo IV, IM, SC o IP). Se espera que las dosis efectivas varíen considerablemente dependiendo de la condición a ser tratada y la ruta de administración pero se espera que se encuentren en el intervalo de 0.1 (-7U) a 100 (-7000U) µg/kg de peso corporal de material activado. Las dosis preferidas para el tratamiento de las condiciones anémicas son de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 Unidades/kg tres veces a la semana.
Composiciones farmacéuticas Los productos de glicoproteína eritropoietina preparados de conformidad con esta invención se pueden preparar en composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se han descrito las composiciones apropiadas en WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660, y WO 99/07401. Entre los vehículos farmacéuticos aceptables preferidos para la formulación de los productos de la invención se encuentra la albúmina de suero de humano, proteínas plasmáticas de humano, etc. Los compuestos de la presente invención se pueden formular en regulador de pH de fosfato de sodio/potasio 10 mM a un pH 7 que contiene un agente de tonicidad, por ejemplo cloruro de sodio 132 mM. Opcionalmente la composición farmacéutica puede contener un conservador. La composición farmacéutica puede contener diferentes cantidades de productos de eritropoietina, por ejemplo 10-2000 g/ml) por ejemplo 50 µg o 400 µg. La estabilidad de la composición se puede mejorar adicionalmente mediante la adición de antioxidantes tales como tocoferol, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, ascorbil palmitato, o edetatos tal como por ejemplo edetato disódico, con los edetatos uniéndose de manera adicional posiblemente a los metales pesados presentes. La estabilidad se puede mejorar adicionalmente mediante la adición de agentes conservadores tales como ácido benzoico y parabenos, por ejemplo metilparabeno, y/o propilparabeno.
Tratamiento de trastornos sanguíneos caracterizados por una baja producción o producción defectuosa de eritrocitos La administración de los productos de glicoproteína eritropoietina de la presente invención resulta en la formación de eritrocitos en humanos. Por lo tanto, la administración de los productos de la glicoproteína eritropoietina reabastece esta proteína EPO que es importante en la producción de eritrocitos. Las composiciones farmacéuticas que contienen los productos de glicoproteína eritropoietina se pueden formular a una fuerza efectiva para la administración mediante diversos métodos a un paciente humano que experimenta trastornos sanguíneos caracterizados por una baja producción o por una producción defectuosa de eritrocitos, ya sea sola o como parte de una condición o enfermedad. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante inyección tales como mediante inyección subcutánea, intravenosa o intramuscular. Las cantidades promedio de la glicoproteína eritropoietina pueden variar y en particular se deben basar en las recomendaciones y prescripción de un médico calificado. La cantidad exacta del conjugado es un asunto de preferencia del sujeto a dichos factores como el tipo exacto de condición a ser tratada, la condición del paciente a ser tratado, así como los otros ingredientes en la composición. Por ejemplo, 0.01 a 101 µg por kg de peso corporal, preferiblemente de 0.1 a 10 µg por kg de peso corporal, se pueden administrar por ejemplo una vez a la semana. A lo largo de esta solicitud, se ha hecho referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones se incorporan en la presente invención como referencia con el objeto de describir más completamente el estado de la técnica. La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que se presentan para propósitos de demostración, pero no limitantes, la preparación de los compuestos y composiciones de esta invención. A partir de los experimentos iniciales, al menos dos, y probablemente tres, de las 7 glutaminas sobre EPO son capaces de servir como sutratos de la TGasa. El mapeo peptídico ha mostrado que Gln115 puede servir como un donante de acilo con miras a la TGasa y que también puede al menos uno de los otros 6 résiduos de glutamina. Se logró la unión de los grupos PEG y de los grupos lipidíeos que contienen aminas alifáticas a la EPO utilizando TGasa de hígado de conejillo de Indias y se demostró que, después de la unión de un grupo PEG de 5 kilodaltones, la EPO retiene aproximadamente 40% de su actividad. La unión de Cbz-QG, un sustrato donante de acilo conocido para TGasa, y el mapeo subsecuente del péptido, indica que Lys45 sobre EPO sirve como un sustrato donante de amina muy eficiente con miras a la TGasa, y que Lys154 también puede servir como un sitio donante de amina.
EJEMPLO 1 Conjugación de sustrato de dansil-cadaverina a eritropoietina de humano con transglutaminasa de hígado de conejillo de Indias La EPO recombinante de humano (rhEPO) (10 uM) se incubó con dansil-cadaverina (DC) (Sigma, St Louis, MO) (3 mM) y TGasa (Sigma, St Louis, MO) (0.15 U/ml) en Tris 100 mM (pH 7.5) y CaCI2 10 mM por 3 horas a 37°C. La dansil-cadaverina es un sustrato bien conocido para las TGasas y provee un marcador fluorescente para facilidad de seguimiento de la reacción. La mezcla de reacción se sometió a SDS-PAGE y los resultados se muestran en la figura 2. La fluorescencia de la banda de EPO confirma la unión de DC vía TGasa e indica que los sitios de aceptor a amina existen en la EPO. El producto se purificó en una columna Zorbax GF-250 XL CLAR equilibrada con PBS. La presencia de los dímeros y trímeros fluorescentes en el gel indica que la EPO puede actuar por si misma como un sustrato de TGasa mediante la provisión de un sustrato de lisina para entrecruzamiento con uno o más de los residuos de glutamina en la EPO. El hecho de que estas bandas son fluorescentes y están entrecruzadas eleva la posibilidad de que al menos dos diferentes residuos de glutamina sobre la EPO puedan servir como sitios donantes del acilo de TGasa.
EJEMPLO 2 Conjugación de sustrato de cadaverína-X-biotina a la eritropoietina de humano con transglutaminasa de hígado de conejillo de Indias La EPO recombinante de humano (rhEPO) (50-100 uM) se incubó con cadaverina-X-biotina (Biotium, Hayward, CA) (30 mM) y TGasa (Sigma, St Louis, MO) (0.15 U/ml) en Tris 100 mM (pH 7.5) y CaCI2 10 mM por 3 horas a 37°C. El producto se purificó sobre una columna Zorbax GF-250 XL CLAR equilibrada con PBS.
EJEMPLO 3 Conjugación de sustrato Cbz-QG a la eritropoietina de humano con transglutaminasa de hígado de conejillo de Indias La EPO recombinante de humano (rhEPO) (1.96 mg/ml) se incubó con ?- -Benciloxicarbonil glutaminil glicina (Cbz-QG) (15 mM) (Sigma, St Louis, MO) y TGasa (Sigma, St Louis, MO) (0.15 U/ml) en Tris 00 mM (pH 7.5) y CaCI2 10 mM por 3 horas a 37°C. El producto se purificó sobre una columna Zorbax GF-250 XL CLAR equilibrada con PBS.
EJEMPLO 4 Caracterización y mapeo peptídico de EPO-DC. EPO-cadaverina-X- biotina, v EPO-fCbz-QG) Para la desglicosilación, 50 ul de rhEPO o conjugado (0.2-2 mg/ml) se diluyeron en 50 ul de RapiGest (Waters Corp., Milord, MA) (2 mg/ml en PBS). A esto se le añadieron 10 ul de solución de detergente NP-40 (15%), 10 ul de cada una de PNGasa F, Sialidasa A y O-glicanasa (Prozyme, San Leandro, CA). La solución se incubó por un total de 96 horas a 37 grados. Las masas intactas se obtuvieron mediante mezclado de las muestras con ácido sinapínico en 1 :1 agua/acetornitrilo (+ 0.1 % de ácido trifiruoroacético) y goteando sobre una placa de MALDI MS, seguido mediante análisis en un ABI Voyager DE-STR MALDI-TOF MS. Las proteínas se analizaron en modo lineal con un voltaje exacerbante de 25000 V (figuras 3A-3D y 5A-5D). Después de esto, se mezclaron 50 de DTT 45 mM y la solución se incubó a 65°C por 20 minutos. Luego, se añadieron 5 µ? de iodoacetamida 100 mM y la solución se incubó a TA en la oscuridad por 20 minutos. Posteriormente, se añadieron 5 µ? de Lys-C endoproteinasa (Calbiochem, San Diego, CA) (1.3 ug/ul) y las soluciones se incubaron a 37°C por 20-24 horas. Cada digerido de proteína se separó utilizando CLAR de fase reversa y una columna Waters Symmetry 300 1 x 50 mm C18. Cada digerido separado se colocó automáticamente sobre una placa MALDI y se analizó. Una matriz mezclada saturada de ácido -ciano-4-hidroxicinnámico/ácido dihidroxibenzóico (a-ciano/DHB) se utilizó para ionización (figuras 4A-4D). Las figuras 3A-3D muestra las masas intactas para la degilcosilación de la muestra de EPO y cada uno de los conjugados. El panel (B) muestra un pico pequeño en 18725 que corresponde a la adición de una porción cadaverina-X-biotina (cambio de PM calculado = +424). El panel (C) muestra un pico en 18603 que corresponde a la adición de una porción de dansil-cadaverina (cambio de PM calculado = +317), y el panel (D) muestra un pico en 18592 que corresponde a la adición de un péptido Cbz- QG (cambio de PM calculado = +319). A partir de estos datos, parece que la unión de Cbz-QG es más eficiente que aquella de dansil-cadaverina o cadaverina-X-biotina. No obstante, en los tres casos, EPO muestra unión de los sustratos de TGasa. Las figuras 4A-4D muestran los espectros del masa de la digestión de Lys-C de EPO-cadaverina-X-biotina y EPO-DC. El pico en 1958 en los paneles (A) y (B) corresponde a aquel que contiene los residuos 98-116 de EPO. El pico indicado por la flecha corresponde a la adición de cadaverina-X-biotina a ese péptido. Esto indica que Gln 15 sirve como un sustrato del sitio de TGasa puesto que solamente el residuo Gln en ese péptido y TGasa unirá la cadaverina a los residuos de Gln. Los paneles (C) y (D) de las figuras 4A-4D muestra MALDI MS de los digeridos de Lys-C de EPO desglicosilada y EPO-DC. El pico alrededor de 5038 corresponde a los residuos 53-97 (PM calculado = 5024.8) de EPO. En el panel (D), el pico en 5357 corresponde a un cambio de peso molecular de 319 indicado en la porción de adansil cadaverina se ha unido a un residuo dentro de esta región de la proteína. Puesto que 6 glutaminas están contenidas en este péptido, la identidad de los residuos modificados no pudo ser evaluada. Los paneles (A) y (B) de las figuras 5A-5D muestra espectros de masa MALDI TOF de dos lotes diferentes de rhEPO desglicosilada-(Cbz-QG). El pico alrededor de 18580 corresponde a la unión de una porción Cbz-QG (cambio de PM calculado = +319) a rhEPO y ambos espectros indican que una mayoría de la proteína está modificada en ambos lotes y que la unión de este péptido a rhEPO es muy reproducible. Los paneles (C) y (D) muestran espectros de masa MALDI TOF del digerido Lys-C de rhEPO desglicosilada-(Cbz-QG). El panel (C) muestra un pico en 4046 que corresponde a los residuos 21-52 de EPO con una porción adicional Cbz-QG en Lys45 (PM calculado = 4032.1). La Lys-C no se escinde en Lys45 debido a la modificación. El panel (D) muestra un pico en 1807 que corresponde a los residuos 153-165 con una porción adicional Cbz-QG (PM calculado = 1802.6). En este péptido, las Lys154 no se escinde debido a la unión del Cbz-QG indicando que Lys154 no está modificada. Fue necesaria una ventana grande de masa para la obtención de los espectros de masa MALDI TOF descritos en la presente invención. Debido a esto, se observó una desviación significativa en los espectros. Por esta razón, los cambios de peso molecular para los conjugados se calcularon mediante la comparación del peso molecular observado para EPO no modificada en cada muestra individual. Tomándolos juntos, los datos de masa para las muestras intactas, desglicosiladas y los datos de digestión de Lys-C, confirman que la Gln115 estuvo modificada con ambas cadaverina-X-biotina, y dansil-cadaverina, y que al menos otro residuo Gln en rhEPO recibió una modificación de dansil-cadaverina en la presencia de TGasa. Los datos también mostraron que Lys45 y Lys154 de rhEPO recibieron una modificación Cbz-QG en la presencia de TGasa y que en ambos lotes analizados, hasta 90% de la proteína estaba modificada.
EJEMPLO 5 Ensayo UT7 de rhEPO-(Cbz-QG) Un ensayo UT7 se llevó a cabo en rhEPO-(Cbz-QG) como sigue: las células UT7 se cosecharon en IMDM con L-glu y 5% de FBS sin Epo por 24 horas antes del ensayo. Las células se lavaron y sembraron a 30,000 células por pozo. Se añadieron las diluciones de EPO (20-0.01952 ng/mL) y rhEPO-(Cbz-QG) (20-0.01952 ng/mL) y se ensayaron por duplicado. La placa se incubó por 48 horas a 37°C y se ensayó con solución MTS de Promega con lecturas de DO tomadas a intervalos de 1 , 2 y 3 horas. Los valores fueron corregidos de fondo con SoftMax Pro. El fondo promedio fue de 0.292. El ensayo mostró que el conjugado es aproximadamente 4 veces menos activo que la EPO no modificada (véase la figura 6) indicando que la modificación no ocurrió en un residuo que participa significativamente en la unión del receptor. Esto implica que la modificación de Lys45 o Lys154 no contribuye a una pérdida significativa en la actividad y sugiere que otras modificaciones o mutaciones se pueden realizar en estos sitios sin afectar significativamente la capacidad de la rhEPO para unirse a su receptor.
EJEMPLO 6 Síntesis de cadaverina-PEG (20K) cadaverina-PEG (20K) se sintetizó utilizando reactivos comercialmente disponibles. 25 mg de sal de clorhidrato de cadaverina (Sigma, St. Louis, MO) se disolvieron en 5 mi de PBS y el pH se ajustó a 7. A esto se le añadieron 25 mg de mPEG (20K)-Succinimidil propionato (Shearwater Corp., Huntsville, Alabama) y la reacción se incubó a 22°C por 2 horas. La mezcla de reacción se dializó en contra de 0.1% de ácido acético en agua y se liofilizó.
EJEMPLO 7 Síntesis de putrescina-PEG (20K) La putrescina-PEG (5K) se sintetizó mediante la disolución de 300 mg de clorhidrato de putrescina (Sigma, St. Louis, MO) en 10 mi de PBS y el pH se ajustó a 7. Se añadieron 100 mg de mPEG (5K)-Succinimidil propionato (Shearwater Corp., Huntsville, Alabama) y se dejó reaccionar por dos horas a 22°C. La mezcla de reacción se dializó en contra de 0.1 % de ácido acético en agua y se liofilizó.
EJEMPLO 8 Síntesis de putrescina-PEG-DSPE 3.4K) La putrescina-PEG-DSPE (3.4K) se sintetizó mediante la disolución de 176.5 mg de putrescina en 1.765 mi de PBS (pH 7.4). Se disolvieron 13.5 mg de NHS-PEG-DSPE (3.4K) (Shearwater Corp., Huntsville, Alabama) en 1 mi de etanol/PBS (1 :1). Luego se añadió 1 mi de la solución HS-PEG-DSPE gota a gota a 1.704 mi de la solución de putrescina y la reacción se agitó a 22°C por 4 horas y luego se purificó en la columna Zorbax GF-250 XL equilibrada con 0.1 % de ácido acético (pH 4.5).
EJEMPLO 9 Conjugación del sustrato de cadaverina-PEG (20K) a eritropoietina de humano con transglutaminasa de hígado de conejillo de Indias La cadaverina-PEG (20K) se reaccionó con EPO utilizando las condiciones dadas en el ejemplo 1 excepto que se utilizó 3.3 mM de cadaverina-PEG (20K) en lugar de DC. La figura 7 muestra el gel de SDS-PAGE de los productos de reacción y la figura 8 muestra los espectros de masa SELDI de los productos. Ambos indican que la cadaverina-PEG(20K) se unió a EPO. Las muestras para SELDI-MS se prepararon mediante desalación con puntas C-4 zip (a partir de Millipore) y colocando sobre fragmentos de gold SELDI utilizando protocolos estándares.
, TGasa EPO-Gln < + H¾N jCHij — PEG Ca+I » N«2 EJEMPLO 10 Conjugación del sustrato de putrescina-PEG 15K) a eritropoietina de humano con transglutaminasa de hígado de conejillo de Indias La putrescina-PEG (5K) se reaccionó con EPO utilizando la condiciones descritas en el ejemplo 7 excepto que 5 mM de PEG(5K)-putrescina se utilizó en lugar de PEG (20K) cadaverina. Se sabe que la putrescina es un mejor sustrato para las TGasas que la cadaverina (Folk y Chung, 1973 anteriormente mencionado). La figura 9 muestra el gel de SDS-PAGE (4-20%) de ¡a EPO putrescina purificada-PEG (5K) en comparación con la solución de almacenamiento de EPO, la figura 10 muestra el SELDI-MS de la mezcla de reacción que consiste de EPO + TGasa + putrescina-PEG (5K), y la figura 1 muestra el SELDI-MS de la EPO purificada-putrescina-PEG (5K). Estos datos indican que la putrescina-PEG (5K) se conjugó exitosamente a EPO y que que la EPO putrescina pur¡f¡cada-PEG(5K) contenía solamente una pequeña cantidad de EPO no modificada. Las muestras de SELDI se prepararon mediante la colocación sobre fragmentos de H-4 SELDI, lavado con 3 ul de agua y añadiendo 1 ul de ácido sinnapínnico saturado. Se llevó a cabo un ensayo UT7 sobre la EPO-putrescina-PEG (5K) como sigue: las células UT7 se cosecharon en I DM con L-glu y 5% de FBS sin Epo por 24 horas antes del ensayo. Las células se lavaron y sembraron a 30,000 células por pozo. Las diluciones de EPO (2.5-0. 0025 ng/mL) y se añadieron EPO-PEG (20-0.01952 ng/mL) y se ensayaron por duplicado. La placa se incubó por 48 horas a 37°C y se ensayó con solución MTS de Promega con lecturas de DO tomadas a intervalos de 1, 2 y 3 horas. Los valores fueron corregidos de fondo con SoftMax Pro. El fondo promedio fue de 0.293. El ensayo mostró que el conjugado es aproximadamente 2.5 veces menos activo que la EPO no modificada (véase la figura 12) indicando que la modificación no se presentó en un residuo significativamente implicado en la unión del receptor. Más probablemente, la pérdida en actividad se debe a una interferencia estéricamente de PEG en la interfaz de unión.
EJEMPLO 11 Conjugación del sustrato de putrescina-PEG-DSPE (3.4K) para eritropoietina de humano con transglutaminasa de hígado de conejillo de Indias La putrescina-PEG-DSPE (3.4K) (5.1 mM) se incubó con EPO (4.8 uM) en concentraciones variables de etanol (hasta 55%) y TGasa (0.15 U/ml) en Tris 100 mM (pH 7.5) y CaCI2 10 mM. SELDI-MS indica que a 55% de etanol, hasta 3 porciones de putrescina-PEG- DSPE (3.4K) se unieron por EPO (véase la figura 13), aunque los volúmenes de reacción no fueron adecuados para cuantificar el porcentaje de EPO modificada. Estos datos también confirman que hasta tres residuos de glutamina sobre EPO pueden servir como sustratos de TGasa bajo estas condiciones. Las muestras SELDI se prepararon mediante la colocación sobre fragmentos de H-4 SELDI, lavando con 3 ul de agua y añadiendo 1 ul de ácido sinnapínnico saturado. Estos ejemplos muestran que al menos 3 residuos de glutamina sobre EPO pueden servir como sitios para la unión de moléculas pequeñas, grupos PEG (a partir de 5K-20K), lípidos polietilenglicosilados, y proteínas vía catálisis por TGasa. Se confirmó la bioactividad de una construcción proteinglicosilada, y se mostró que solamente se reduce de manera ligera. Si la vida media en circulación se mejora significativamente debido a cualesquiera de estas modificaciones, dicha pequeña pérdida de actividad podría ser insignificante cuando se compara con las farmacocinéticas potencialmente mejoradas de la proteína modificada.
EJEMPL012 Síntesis de sustratos aceptares de TGasa amina v unión a rhEPO Los péptidos que contienen al menos un residuo de glutamina se sintetizan mediante la química Fmoc en fase sólida estándar. Después del término de la síntesis, la resina peptídica se desprotegió con piperidina, se lavó, y se hizo reaccionar con PEG o con otro polímero que contenía un éster activado. Después de la reacción, el conjugado de péptido-PEG se escindió a partir de la resina utilizando condiciones estándares de TFA y se precipitó en éster. El conjugado de péptido-PEG se purificó entonces mediante CLAR de fase reversa y se liofilizó.
La EPO recombinante de humano (rhEPO) (10 uM) se incubó con conjugado de péptido-PEG (15 m ) y TGasa (Sigma, St Louis, MO) (0.15 U/ml) en Tris 100 mM (pH 7.5) y CaCI2 10 mM por 3 horas a 37°C. La mezcla de reacción se sometió a SDS-PAGE y el producto se purificó sobre una columna Zorbax GF-250 XL CLAR equilibrada con PBS.
EJEMPLO 13 Ensayo de proliferación de célula UT7 UT7 es una línea celular leucémica de humano que se ha adaptado para volverse EPO dependiente (Komatsu, N., et al. Blood 82 (2), 456-464, 1993). Las células UT7 se lavaron tres veces en PBS y se cosecharon para EPO por 24 horas antes del ensayo. Las células UT-7 se cosecharon en medio IMDM con L-glutamina añadida y FBS a 5% (15Q). Las células se lavaron una vez en 50 mL de DPBS y se contaron a la vez que se suspendía en DPBS y se suspendieron en el medio apropiado a una concentración final de 6 x 105 células/mL (produce una concentración final de 30,000 células por pozo). Una EPO estándar se preparó mediante la disolución de la solución de almacenamiento de EPO (1.7 mg/mL) a 0.85 g/mL (2 µL· en 4 mL de medio). La solución de almacenamiento se diluyó 2:340 a 5 ng/mL seguido por diluciones seriales de 1 :2 a una concentración de 0.0098 ng/mL en medio 15Q. Las diluciones resultantes proveyeron estándares a concentraciones de 2.5 ng/mL a 0.0024 ng/mL. La muestra prueba se diluyó de manera similar. Se transfirió una alícuota de 50 µ?_ de la suspensión de células UT-7 a los pozos correspondientes y las placas se colocaron a 37°C por 48 horas. La proliferación celular se evaluó utilizando solución MTS de Promega, añadiendo 20 µL· por pozo. Las lecturas empezaron 1 hora después de la adición de MTS.

Claims (48)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1.- Un conjugado eritropoiético que tiene las propiedades biológicas que ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de eritrocitos, que comprende una porción de la fórmula: EPO-[Gln-A-X-(M)n]y en donde EPO es eritropoietina o sus derivados farmacéuticamente aceptables que tienen propiedades biológicas que ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y eritrocitos; GIn es un residuo de glutamina seleccionado a partir de uno o más residuos de glutamina dentro de la secuencia primaria de EPO; y es un entero de 1 a 7 que indica el número de residuos modificados de glutamina; A es una porción donante de amina o un grupo hidroxilo, X es una porción polimérica hidrófila opcional; es una molécula orgánica opcional caracterizada porque es capaz de incrementar la vida media en circulación de la molécula EPO; y n es un entero de 0 a 15, y las sales farmacéuticamente aceptables o ásteres de las mismas.
2.- Un conjugado eritropoiético que tiene las propiedades biológicas que ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de eritrocitos, que comprende una porción de la fórmula: EPO-[Lys-Gln-z-x-(M)n]y (II) en donde EPO es eritropoietina o sus derivados farmacéuticamente aceptables que tiene las propiedades biológicas que ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y eritrocitos; Lys es un residuo de lisina seleccionado a partir de uno o más residuos de lisina dentro de la secuencia primaria de EPO; y es un entero de 1 a 8 que indica el número de residuos modificados de lisina; Gln es un residuo de glutamina; Z es péptido o proteína que contiene el residuo Gln que es capaz de actuar como aceptor de transglutaminasa amina, X es un polímero hidrófilo opcional; M es una molécula orgánica opcional caracterizada porque es capaz de incrementar la vida media en circulación de la molécula EPO; N es un entero de 0 a 15, y las sales farmacéuticamente aceptables o ésteres de las mismas.
3. - Los conjugados eritropoiéticos de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizados además porque ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de eritrocitos, y dicho incremento se mantiene después de la administración de dicho conjugado de eritropoietina por un periodo de tiempo mayor que aquel observado después de la administración del conjugado de eritropoietina.
4. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el efecto sostenido se debe a la vida media incrementada en suero sobre la eritropoietina no modificada de mamífero.
5. - El conjugado eritropoiético de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque M es una a aproximadamente seis porciones orgánicas, las cuales se seleccionan independientemente a partir de un grupo ácido graso, un grupo éster de ácido graso, un lípido o un fosfolípido.
6. - El conjugado de eritropoietina de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque el polímero hidrófilo es un óxido de polialquileno.
7. - El conjugado eritropoiético de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque dicha eritropoietina o porción eritropoiética se selecciona a partir de eritropoietina recombinante y no recombinante de mamífero.
8.- El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el óxido de polialquileno es un óxido de polietileno sustituido.
9. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el óxido de polialquileno se selecciona a partir de homopolímeros de polietiienglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, óxidos de alquil-polietileno, óxidos de bispolietileno y co-polímeros o co-polímeros en bloque de óxidos de polialquileno.
10. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polímero hidrófilo está enlazado a de uno a siete de GLN 58, GLN 59, GLN65, GLN78, GLN 86, GLN92, GLN115 del EPO de cadena madura.
11. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho polímero hidrófilo está enlazado a de uno a ocho de LYS 20, LYS 45, LYS 52, LYS 97, LYS 116, LYS 140, LYS 52, LYS 154 del EPO de cadena madura.
12. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho óxido de polialquileno es un homopolímero de polietilenglicol que tiene un peso molecular de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 100,000.
13. - El conjugado eritropoiético de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque dicho grupo polimérico hidrófilo es una cadena de polialcanoglicol lineal o ramificada, una cadena de carbohidrato, una cadena de aminoácido o una cadena de polivinilpirrolidona, y en donde dicho grupo polimérico hidrófilo tiene un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 120,000 Daltones.
14. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho grupo polimérico hidrófilo es una cadena de polialcanoglicol lineal o ramificada con un peso molecular mayor de 2,000 Daltones.
15. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho grupo polimérico hidrófilo es una cadena de polietilenglicol lineal o ramificada o una cadena de polietilenglicol sustituida lineal o ramificada, n es un entero diferente a 0 y la porción orgánica se selecciona a partir de un grupo alquilo, un grupo ácido graso de C6-C40, un grupo éster de ácido graso de C6-C40, un grupo lípido y un grupo fosfolípido.
16. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho grupo polimérico hidrófilo es una cadena de polietilenglicol lineal o ramificada que está terminalmente sustituida con una porción orgánica seleccionada a partir de un grupo alquilo, un grupo ácido graso de C6-C4o, un grupo éster de ácido graso de C6-C4o, un grupo lípido o un grupo fosfolípido.
17. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicha porción orgánica es palmitoilo.
18.- El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la porción orgánica es diesteroilfosfatidil etanolamina (DSPE).
19. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la porción hidrófila de polímero orgánico está covalentemente enlazada a de uno a siete de GLN 58, GLN59, GLN65, GLN78, GLN 86, GLN92, GLN 115 del EPO de cadena madura.
20. - El conjugado eritropoiético de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la porción hidrófila de polímero orgánico está covalentemente enlazada a de uno a ocho de LYS 20, LYS 45, LYS 52, LYS 97, LYS 116, LYS 140, LYS 152, LYS 154 del EPO de cadena madura.
21. - Ei conjugado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque A es un sustrato TGasa donante de amina, X es PEG u otro polímero soluble en agua y es opcional, y M es una biotina, dansilo, u otra porción orgánica que imparte características biofísicas a EPO que se utilizan para propósitos de investigación, de diagnóstico o terapéuticos.
22. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque A es un sustrato de TGasa que contiene glutamina, X es PEG u otro polímero soluble en agua y es opcional, y M es biotina, dansilo, u otra porción orgánica que imparte características biofísicas a EPO que, son útiles para propósitos de investigación, de diagnóstico o terapéuticos.
23. - Un método para preparar un EPO conjugado que tiene actividad eritropoiética de la fórmula: EPO-[Gln-A-x-(M)n]y en donde EPO es eritropoietina o sus derivados farmacéuticamente aceptables que tienen propiedades biológicas que ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y eritrocitos; Gln es un residuo de glutamina seleccionado a partir de uno o más residuos de glutamina dentro de la secuencia primaria de EPO; y es un entero de 1 a 7 que indica el número de residuos modificados de glutamina; A es una porción donante de amina o un grupo hidroxilo, X es una porción polimérica hidrófila opcional; M es una molécula orgánica opcional caracterizada porque tiene la capacidad de incrementar la vida media en circulación de la molécula EPO; y n es un entero de 0 a 15, y las sales farmacéuticamente aceptables o ésteres de las mismas; que comprende poner en contacto una eritropoietina o una proteína eritropoiética que tiene un residuo de glutamina accesible al agua con un complejo preconstruido de la porción de polímero-orgánico hidrófilo de la fórmula A-X(M)n, capaz de actuar cómo un sustrato de transglutaminasa en la presencia de transglutaminasa bajo condiciones de tal manera que se forma un conjugado de EPO-polímero-porción orgánica.
24. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho polímero es un óxido de polialquileno.
25. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicho óxido de polialquileno es un óxido de polialquileno alfa sustituido.
26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho óxido de polialquileno es un polietilenglicol.
27.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la transglutaminasa es una proteína de mamífero.
28.- Ei método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la transglutaminasa es una proteína bacteriana.
29.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la transglutaminasa es una proteína procarióntica.
30. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque A es un sustrato TGasa donante de amina, X es PEG u otro polímero soluble en agua y es opcional, y M es biotina, dansilo, u otra porción que imparte características biofísicas a EPO que se utilizan para propósitos de investigación, de diagnóstico o terapéuticos.
31. - Un método para preparar un EPO conjugado que tiene actividad eritropoiética de la fórmula: EPO-[Lys-Gln-Z-X-(M)n]y (11) en donde EPO es eritropoietina o sus derivados farmacéuticamente aceptables que tienen las propiedades biológicas que ocasionan que las células de médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y eritrocitos; Lys es un residuo de lisina seleccionado a partir de uno o más residuos de lisina dentro de la secuencia primaria de EPO; y es un entero de 1 a 8 que indica el número de residuos modificados de lisina; Gln es un residuo de glutamina; Z es un péptido o proteína que contiene el residuo Gln que es capaz de actuar como un aceptor de transglutaminasa amina, X es un polímero hidrófilo opcional; M es una molécula orgánica opcional caracterizada porque es capaz de incrementar la vida media en circulación de la molécula EPO; N es un entero de 0 a 15, y las sales farmacéuticamente aceptables o ésteres de las mismas; que comprende poner en contacto una eritropoietina o una proteína eritropoiética que tiene un residuo de lisina accesible al agua con un complejo preconstruido de la porción de polímero-orgánico hidrófilo de la fórmula Gln-Z-X(M)n, capaz de actuar como un sustrato de transglutaminasa, en la presencia de transglutaminasa bajo condiciones de tal manera que se forma un conjugado de EPO-polímero-porción orgánica.
32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque dicho polímero es un óxido de polialquileno.
33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque dicho óxido de polialquileno es un óxido de polialquileno alfa sustituido.
34. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho óxido de polialquileno es un polietilenglicol.
35. - El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque la transglutaminasa es una proteína de mamífero.
36. - El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque la transglutaminasa es una proteína bacteriana.
37. - El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque la transglutaminasa es una proteína procarióntica.
38. - El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque A es un péptido, proteína, u otro polímero que contiene un residuo de glutamina capaz de actuar como un sustrato de TGasa aceptor de amina, X es PEG u otro polímero soluble en agua y es opcional, y M es biotina, dansilo, u otra porción que imparte características biofísicas a EPO que se utilizan para propósitos de investigación, de diagnóstico o terapéuticos.
39.- El uso del conjugado de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, para preparar un medicamento para tratar anemia.
40.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 39, en donde dicho conjugado se caracteriza por vida media incrementada en suero en comparación con la eritropoietina no conjugada.
41.- Una proteína eritropoiética o conjugado de proteína que contiene eritropoietina recombinante o no recombinante de mamífero en la cual cualesquiera o todos los residuos GLN 58, GLN59, GLN65, GLN78, GLN86, GLN92 y GLN115 han sido modificados mediante métodos recombinantes, enzimáticos o químicos para modificar las propiedades del sustrato de TGasa e incrementar así la vida media en circulación o alterar de otra manera la actividad biológica de dicha poteína eritropoiética.
42.- La poteína eritropoiética o conjugado de proteína deconformidad con la reivindicación 41, caracterizada además porque uno o más de dichos residuos de glutamina están químicamente modificados, eliminados o cambiados a otro aminoácido de tal manera que se incrementa, disminuye o se elimina la capacidad del residuo de glutamina para actuar como un sustrato de TGasa.
43.- Una proteína eritropoiética o conjugado de proteína que contiene eritropoietina recombinante o no recombinante de mamífero en la cual cualesquiera o todos los residuos LYS 20, LYS 45, LYS 52, LYS 97, LYS 116, LYS 140, LYS 152, LYS 154 han sido modificados mediante métodos recombinantes, enzimáticos o químicos para modificar las propiedades del sustrato de TGasa e incrementar así la vida media en circulación o alterar de otra manera la actividad biológica de dicha poteína eritropoiética.
44.- Una proteína eritropoiética o conjugado de proteína que contiene eritropoietina recombinante o no recombinante de mamífero en la cual cualesquiera residuos han sido modificados mediante métodos recombinantes, enzimáticos o químicos para afectar las propiedades del sustrato de TGasa e incrementar así la vida media en circulación o alterar de otra manera la actividad biológica de dicha poteína eritropoiética.
45. - El conjugado de eritropoietina de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el donante de amina A contiene un segundo grupo funcional que permite la conjugación mediante métodos químicos del polímero X y/o la porción orgánica M a dicho segundo grupo funcional.
46. - El conjugado de eritropoietina de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque el segundo grupo funcional es un grupo tiol, aldehido, hidrazida, maleimida o cisteína.
47. - El conjugado de eritropoietina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el donante de amina A contiene un segundo grupo funcional, que permite la conjugación mediante métodos químicos del polímero X y/o la porción orgánica a dicho grupo funcional.
48.- El conjugado de eritropoietina de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque el segundo grupo funcional es un grupo tiol, aldehido, hidrazida, maleimida o cisteína.
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