WO2004078909A2 - Identifizierung von antigen-epitopen - Google Patents

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WO2004078909A2
WO2004078909A2 PCT/EP2004/002170 EP2004002170W WO2004078909A2 WO 2004078909 A2 WO2004078909 A2 WO 2004078909A2 EP 2004002170 W EP2004002170 W EP 2004002170W WO 2004078909 A2 WO2004078909 A2 WO 2004078909A2
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Herwig Brunner
Günter Tovar
Thomas Schiestel
Claudia A. MÜLLER
Thomas Flad
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Definitions

  • the present invention relates to methods for identifying and / or detecting T cell epitopes of a protein antigen, methods for producing peptide vaccines against a protein antigen, methods for quality control of receptor-ligand complexes and / or their components , Process for the production of nanoparticles with at least one immobilized receptor unit or an immobilized receptor, Process for the production of nanoparticles with immobilized peptide-presenting MHC molecules, Process for the enrichment and / or isolation of specific CD4 + -T- or CD8 + -T Lymphocytes from peripheral mononuclear blood cells, methods for priming and / or restimulating a CD4 + T or CD8 + T lymphocyte reaction in vitro, nanoparticles with an immobilized receptor unit, in particular an immobilized chain of an MHC molecule, nanoparticles with an immobilized receptor, in particular an immobilized MHC molecule, Nanoparticles with an immobilized peptide-presenting MHC receptor, a peptide vaccine,
  • the health of an animal or human organism depends, among other things, on the extent to which the organism can protect itself against pathogenic agents from its environment or how far the organism can recognize and eliminate changed body material.
  • the immune system of the human or animal body that fulfills these functions can be divided into two functional areas, namely the innate and the acquired immune system. Innate immunity is the first line of defense against infection and most potential pathogens are rendered harmless before they can cause a recognizable infection, for example.
  • the acquired immune system reacts to surface structures of the penetrating organism called antigens.
  • T cells become active, which can destroy other cells.
  • proteins associated with a disease are present in a cell, they are proteolytically fragmented into peptides within the cell. Then specific cell proteins bind to the resulting fragments of the protein or antigen and transport them to the surface of the cell, where they are presented to the molecular defense mechanisms, in particular T cells of the body.
  • MHC main histocompatibility complex
  • the MHC proteins are divided into class I and class II MHC proteins. Although the proteins of the two MHC Classes are structurally very similar, their function differs relatively clearly. MHC class I proteins are on. the surface of almost all body cells. The MHC class I proteins present antigens, which normally come from the body's own proteins, against cytotoxic T lymphocytes (CTLs).
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • the class II MHC proteins are only present on B lymphocytes, macrophages and other antigen-presenting cells. They mainly present peptides to T-helper (Th) cells that come from external, i.e. non-body antigen sources.
  • Class I MHC molecules are constitutively formed on the surface of almost all cell types within the body.
  • the peptides bound by the class I MHC proteins are derived from cytoplasmic proteins normally produced in the healthy host organism, which are not related to foreign cells or degenerate cells. Such class I MHC proteins do not normally stimulate an immune response. Cytotoxic T-lymphocytes which recognize such "soapy" (self) -peptide-presenting MHC molecules of class I are therefore transported into the thymus or tolerated by the body after their release from the thymus. MHC molecules can only have one Stimulate immune response when a "non-self" peptide is bound to which cytotoxic T lymphocytes bind.
  • T cell receptors TCR
  • CD8 CD8 molecules on their surface.
  • the T cell receptors can only recognize and bind non-self peptides if they are in the form of a complex with the MHC class I molecules.
  • T cell receptors In order for a T cell receptor to bind a peptide-MHC complex, two conditions must be met his. First, the T cell receptors must have a structure that allows them to bind to the peptide-MHC complex. Second, the CD8 molecule must bind to the ⁇ -3 domain of the MHC class I molecules. Each cytotoxic T lymphocyte expresses a unique T cell receptor that can only bind a specific MHC-peptide complex.
  • the peptides bind to the MHC class I molecules through competitive affinity binding within the endoplasmic reticulum before they are presented on the cell surface.
  • the affinity of a single peptide is directly related to its amino acid sequence and the presence of specific binding motifs at defined positions within the amino acid sequence. Knowing the sequence of such a “non-self” peptide makes it possible, for example, to manipulate the immune system against diseased cells, for example using peptide vaccines.
  • the direct analysis of such “non-self” peptides becomes several factors make it difficult, for example, relevant epitopes, ie relevant peptide sequences, are very often underrepresented.
  • MHC molecules have a high degree of polymorphism. An individual can do up to six with MHC class I molecules alone have different polymorphisms, in some cases very different peptide sequences being bound.
  • T-cell epitopes ie peptide sequences
  • MHC molecules of class I or II in the form of a peptide-presenting complex
  • T-cell receptors cytotoxic T lymphocytes
  • the technical problem on which the present invention is based is to provide an improved method for screening potential T cell epitopes, which enables a simultaneous and rapid analysis of a large number of peptide sequences, for example those sequences which are already used as potential binding partners using computer algorithms were determined for specific MHC molecules in terms of their ability to bind to specific MHC molecules.
  • the present invention solves the underlying technical problem by providing a method for the identification and / or detection of T cell epitopes of a protein antigen in vitro, wherein a population of peptide fragments of the antigen competitively bind to a first one immobilized receptor unit, preferably and optionally in the presence of a second receptor unit, which together with the first receptor unit Can form receptor, subjected and binds the bound peptide fragment (s) with affinity for the receptor to at least the first receptor unit, preferably to the two receptor units, and then the bound peptide fragment (s) isolated and analyzed will or will be comprehensive
  • the present invention therefore solves the technical problem on which it is based by providing a method in which a receptor / ligand complex, in particular a receptor-peptide fragment complex, is generated under conditions which correspond to the actual in vivo conditions, for example in a Cell with MHC molecules of class I correspond as far as possible.
  • a population of peptide fragments which can represent, for example, the complete amino acid sequence of a protein antigen, is generated and the entire peptide fragment population is then linked in one step to an immobilized receptor, in particular an MHC complex, or to one immobilized receptor unit, i.e.
  • the receptor is a protein of MHC class I
  • the binding of the peptide fragment or fragments to the immobilized first receptor unit, in particular the ⁇ chain can be sufficient for the identification according to the invention without a second receptor -Unity must be present. Of course, this second unit can still be present.
  • the receptor is an MHC class II protein.
  • the peptide fragment or fragments which have or have affinity for the receptor which has a receptor unit and / or the two receptor units can then in fact be a receptor-ligand complex or a receptor-peptide fragment complex which is present in immobilized form form form.
  • the resulting receptor-ligand complex can be separated in a simple manner from the peptide fragments which cannot form a receptor-ligand complex, that is to say have no affinity for the first or both receptor units, since they are have no or a significantly lower affinity for the receptor compared to the peptide fragment bound in the complex.
  • the peptide fragment or the peptide fragments can be separated and analyzed with affinity from the population of peptide fragments.
  • this peptide fragment can be analyzed in bound form, ie as a receptor-ligand complex, for example using MALDI mass spectrometry.
  • the peptide fragment bound in the complex can, according to the invention, also be separated from the immobilized complex and analyzed separately, for example subjected to sequencing.
  • the peptide fragment population provided for the procedure according to the invention each contains the individual, individual peptide fragments in sufficient quantity to enable identification according to the invention.
  • T cell epitope is understood to mean a peptide sequence which is bound by the MHC molecules of class I or II in the form of a peptide-presenting MHC molecule or MHC complex and then in this form can be recognized and bound by cytotoxic T lymphocytes or T helper cells.
  • a “receptor” is understood to mean a biological molecule or a group of molecules which can bind a ligand.
  • a receptor can, for example, serve to transmit information in a cell, a cell cluster or an organism.
  • the receptor consists of at least one receptor unit and preferably two receptor units, each receptor unit consisting of a protein mo lekül, especially a glycoprotein molecule.
  • the receptor has a structure complementary to a ligand and can complex the ligand as a binding partner. The information is passed on in particular by changing the conformation of the receptor after complexing the ligand on the surface of a cell.
  • a receptor is understood in particular to mean proteins of MHC classes I and II which can form a receptor-ligand complex with a ligand, in particular a peptide or peptide fragment of suitable length.
  • a “ligand” is understood to mean a molecule which has a structure which is complementary to a receptor and can form a complex therewith.
  • a ligand is understood in particular to mean a peptide or peptide fragment which has a suitable length and binding motifs suitable in its amino acid sequence has, so that the peptide or peptide fragment can form a complex with proteins of MHC class I or MHC class II.
  • a “receptor-ligand complex” also includes a “receptor-peptide complex” or “receptor-peptide fragment complex”, in particular a MHC molecule of class I or peptide or peptide fragment presenting understood the class II.
  • proteins or molecules of the main histocompatibility complex are understood in particular to be proteins, the peptides which result from the proteolytic cleavage result from protein antigens and represent potential T cell epitopes, bind them, transport them to the cell surface and present them to specific cells, in particular cytotoxic T lymphocytes or T helper cells.
  • the main histocompatibility complex in the genome encompasses the genetic region, the gene products of which are expressed on the cell surface are important for the detection of endogenous and / or foreign antigens and thus for the regulation of immunological processes.
  • the main histocompatibility complex is divided into two gene groups which encode different proteins, namely molecules of MHC class I and molecules of MHC class II.
  • the molecules of the two MHC classes specialize in different antigen sources.
  • the MHC class I molecules present endogenously synthesized antigens, for example viral proteins.
  • the MHC class II molecules present protein antigens originating from exogenous sources, for example bacterial products.
  • the cell biology and expression patterns of both MHC classes are geared towards these different roles.
  • Class I MHC molecules consist of a heavy chain of approximately 45 kDa and a light chain of approximately 12 kDa and can bind a peptide of approximately 8 to 10 amino acids, if this has suitable binding motifs, and against cytotoxic T-lymphocytes present.
  • the peptide bound by the class I MHC molecules comes from an endogenous protein antigen.
  • the heavy chain of the class I MHC molecules is preferably an HLA-A, HLA-B or HLA-C monomer and the light chain is ⁇ -2 microglobulin.
  • Class II MHC molecules consist of an ⁇ chain of approximately 34 kDa and a ⁇ chain of approximately 30 kDa and can bind a peptide of approximately 15 to 24 amino acids, provided that this has suitable binding motifs, and compared to T helper molecules. cells.
  • the peptide bound by the class II MHC molecules comes from an exogenous protein antigen.
  • the ⁇ chain and the ⁇ chain are in particular HLA-DR, HLA-DQ and HLA-DP monomers.
  • a “nanoparticle” is understood to mean a particulate binding matrix which has on its surface molecule-specific recognition sites comprising at least first functional chemical groups.
  • the nanoparticles used according to the invention comprise a core with a surface on which the first functional groups are arranged.
  • the first functional groups can bind complementary second functional groups of a molecule covalently or non-covalently ..
  • the molecule preferably biomolecule, is immobilized on and / or can be immobilized on the nanoparticle.
  • the nanoparticles used according to the invention have a size of ⁇ 500 nm, preferably ⁇ 1 50 nm.
  • the core of the nanoparticles preferably consists of chemically inert inorganic or organic materials, particularly preferably of silica.
  • a “first functional group” is understood to mean a chemical group which is present in a receptor unit, in particular a chain of an MHC molecule, and which is capable of having a complementary group functional group, which is present, for example, on the surface of the nanoparticle, in such a way that an affine, preferably covalent, bond can take place between the two binding partners.
  • the first functional group is selected from the group consisting of carboxy groups, amino groups, thiol groups, biotin groups, His tag, FLAG tag, Strep tag I groups, Strep tag II groups, histidine tag groups and FLAG tag groups.
  • the second functional group that is to say the functional group on the surface of the nanoparticle, is selected according to the invention from the group consisting of amino groups, carboxy groups, maleimido groups, avidin groups, streptavidin groups, neutravidin groups and metal chelate complexes.
  • a nanoparticle used according to the invention thus has at least one second functional group on its surface, which is linked covalently or non-covalently to a first functional group of a receptor unit, the first functional group being a different group than the second functional group ,
  • the two groups that bond with one another must be complementary to one another, that is, be able to form a covalent or non-covalent bond with one another.
  • the second functional group on the surface of the nanoparticles is an amino group.
  • the second functional group on the nanoparticle surface is one Carboxy group.
  • a thiol group is selected as the first functional group of the receptor unit, the second functional group is, according to the invention, a maleinimido group.
  • the second functional group on the nanoparticle surface is an avidin group and / or a streptavidin group or a neutravidin group. If, according to the invention, a thiol group is used as the first functional group of the receptor unit, the second functional group on the nanoparticle surface is a maleinimido group.
  • the aforementioned first and / or second functional groups can be connected to the receptor unit to be immobilized or the surface of the nanoparticles with the aid of a spacer or can be introduced to the nanoparticle surface or into the receptor unit by means of a spacer.
  • the spacer thus serves on the one hand as a spacer between the functional group and the nanoparticle surface or receptor unit, and on the other hand as a carrier for the functional group.
  • such a spacer can be alkylene groups or ethylene oxide oligomers with 2 to 50 C atoms, which is substituted in a preferred embodiment and has heteroatoms.
  • the spacer can be flexible and / or linear.
  • the first functional groups are a natural component of the receptor unit.
  • the first functional groups by means of genetic engineering, biochemical, enzymatic and / or to introduce chemical derivatization or chemical synthesis processes into the receptor unit.
  • unnatural amino acids can be inserted into the receptor unit by genetic engineering methods or during chemical protein synthesis, for example together with spacers or linkers.
  • Such unnatural amino acids are compounds which have an amino acid function and a radical R and are not defined by the naturally occurring genetic code, these amino acids preferably having a thiol group.
  • it can also be provided to modify a naturally occurring amino acid, for example lysine, for example by derivatizing its side chain, in particular its primary amino group with the carboxylic acid function of levulinic acid.
  • tags can be introduced into the receptor unit by modification, the tags, ie labels, being added to the receptor unit, preferably at the C-terminus or the N-terminus.
  • these tags can also be arranged intramolecularly.
  • a protein receptor is modified by adding at least one strep tag, for example a strep tag I or strep tag II or biotin, for example via BirA.
  • a strep tag is also understood to mean functional and / or structural equivalents, provided that they can bind streptavidin groups and / or their equivalents.
  • the term “streptavidin” therefore also covers its functional and / or structural equivalents.
  • the surface of the nanoparticle is characterized according to the invention in that it is modified by the application of the complementary second functional groups which bind the first functional groups.
  • the functional groups are applied to the nanoparticle surface using standard methods such as graft polymerization, silanization, chemical derivatization and similar suitable methods.
  • the nanoparticle surface can be modified by applying additional functionalities.
  • the surface of the nanoparticles can have chemical compounds which prevent or reduce non-specific adsorption of other proteins on the nanoparticles.
  • the surface particularly preferably has ethylene glycol oligomers.
  • ion exchange functions are anchored separately or additionally on the surface of the nanoparticles.
  • the analysis of the receptor-ligand complex obtained, in particular the peptide-presenting MHC molecule and / or the peptide fragment bound therein is to be analyzed using MALDI methods.
  • the salt content of the matrix is often a critical parameter, since ion accumulation suppresses ionization or leads to a broadening of the peaks, or there are also interference peaks. With nanoparticles that have a high ion exchange capacity possess and thereby fix disruptive salts in the matrix, this problem can be avoided.
  • the second receptor unit which is preferably present, is freely available in solution before the competitive binding reaction is carried out, in particular in the case of MHC I molecules ⁇ -2 -Micro-globulin. That is, in this preferred embodiment, in which a second receptor unit is used, the buffer used to carry out the competitive binding reaction according to the invention contains both the second receptor unit and the population of the peptide fragments of the protein antigen.
  • the receptor-ligand complex formed is immobilized on the nanoparticles via the immobilized first receptor unit.
  • the second receptor unit is immobilized on the nanoparticles together with the first receptor unit before the competitive binding reaction is carried out in the form of a dimer forming the receptor, in particular an MHC molecule.
  • the second receptor unit has at least one third functional group and the surface of the nanoparticle has at least one complementary fourth functional group which binds the third functional group. Both receptor units, which form the receptor dimer, are preferably directed and immobilized on the nanoparticle while maintaining the biological activity of the receptor.
  • the term “directionally immobilized” or “directional immobilization” means that a molecule, in particular the receptor dimer, is immobilized on a nanoparticle at defined positions within the two receptor units in such a way that the three-dimensional structure of the for the domain (s) of the receptor required for biological activity is not changed compared to the non-immobilized state and that this receptor domain (s), in particular the binding pocket for binding a suitable peptide, is / are freely accessible to them upon contact with suitable peptides
  • “Directionally immobilized” also means that the fixation of the two receptor units which form the receptor dimer takes place in such a way that the immobilized receptor does not, or only very slowly, when used later in a cellular or cell-like environment by protein-degrading enzymes This means that the immobilized receptor dimer on the surface of the nanoparticles is oriented in such a way that it offers as few targets for proteases as possible.
  • “Maintaining biological activity” means that the receptor units forming the receptor, after immobilization on the surface of a nanoparticle, can perform the same or almost the same biological functions to at least a similar extent as the same receptor units or the receptor formed by both units in the non-immobilized state under suitable in vitro conditions or the same receptor units or the same receptor in their natural cellular environment.
  • a “dimer” or “receptor dimer” is understood to mean a compound which is formed by linking two subunits or units.
  • the two linked receptor subunits are different molecules which can differ both in terms of their composition, that is to say amino acid sequence, and in terms of their length.
  • each receptor subunit or receptor unit is preferably bound to the surface of the nanoparticle. It is also provided according to the invention that only one receptor unit of the receptor dimer is fixed to the nanoparticle via a covalent bond between the first functional group and the second functional group.
  • the third functional group of the second receptor unit is different from the first functional group of the first receptor unit and is selected from the group consisting of carboxy groups, amino groups, thiol groups, biotin Groups, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag I groups, Strep-Tag Il groups, histidine-Tag groups and FLAG- Tag groups. It is provided according to the invention that the third functional group is a natural component of the second receptor unit or is introduced into the second receptor unit by means of genetic engineering methods, enzymatic methods and / or chemical derivatization.
  • the fourth functional group on the nanoparticle surface is different from the second functional group of the nanoparticles which binds the first functional group.
  • the fourth functional group that is to say the functional group on the surface of the nanoparticle, is selected according to the invention from the group consisting of amino groups, carboxy groups, maleimido groups, avidin groups, streptavidin groups, neutravidin groups and metal chelate complexes. It is provided according to the invention that the fourth functional group, just like the second functional group, is applied to the nanoparticle surface by means of graft silanization, silanization, chemical derivatization or similar suitable processes.
  • the first and second receptor units are molecules that occur naturally or are produced by means of genetic engineering processes or chemical synthesis processes, in particular chains of an MHC molecule.
  • the receptor is a class I MHC molecule.
  • the first receptor unit is preferably a heavy chain of approximately 45 kDa and the second receptor unit is a light chain of approximately 12 kDa or by one for the first receptor unit light chain of about 12 kDa and the second receptor unit around a heavy chain of about 45 kDa.
  • Modifications, mutations or variants of these chains can of course also be used, for example shortened forms of these chains, for example those which lack the transmembrane region.
  • Such truncated forms can be, for example, heavy chains without a transmembrane region with a molecular weight of 35 kDa.
  • the first and the second receptor unit can form a class I MHC complex, they can bind a peptide fragment of approximately 8 to 18, preferably approximately 8 to 10 amino acids in the competitive binding reaction and thus a peptide-presenting one Form receptor.
  • the heavy chain is preferably an HLA-A, HLA-B or HLA-C monomer and the light chain is ⁇ -2 microglobulin.
  • the receptor is an MHC molecule of class II.
  • the first receptor unit is preferably an ⁇ chain of approximately 34 kD and the second receptor unit is a ⁇ chain of approximately 30 kD or, in the case of the first receptor unit, by a ⁇ chain of approximately 30 kD and the second receptor unit by an ⁇ chain of approximately 34 kD.
  • the ⁇ chain and the ⁇ chain are preferably HLA-DR, HLA-DQ or HLA-DP monomers. According to the invention, mutations, modifications or variants thereof can also be used.
  • the peptide fragment to be analyzed is derived from an exogenous protein antigen, that is, if, according to the invention, the first and second receptor units form an MHC class II complex, they can be a peptide fragment of about 8 to 18, preferably about 8 to 10 Bind amino acids in the competitive binding reaction and thus form a peptide-presenting receptor.
  • the first and the second receptor unit are chains which occur naturally or are produced by means of genetic engineering processes or chemical synthesis processes.
  • the population of peptide fragments of the protein antigen to be analyzed is produced by means of enzymatic protein cleavage, genetic engineering processes or chemical synthesis processes.
  • the peptide fragments thus obtained of the matured population completely represent the entire amino acid sequence of the protein antigen.
  • a second embodiment of the invention provides that the peptide fragments of the population only partially represent the amino acid sequence of the protein antigen.
  • These are in particular peptide fragments which, as determined by means of a computer algorithm, represent potential T cell epitopes.
  • computer algorithms such as SYFPEETHI (Rammenee et al., 1999) and HLA.BIND (Parker et al., 1994) can be used to predict potential T cell epitopes.
  • the receptor is an MHC molecule of type I
  • the peptide fragments of the population to be produced have a length of 8 to 10 amino acids.
  • the receptor is a type II MHC molecule
  • the peptide fragments of the population to be produced are preferably 15 to 24 amino acids in length.
  • the peptide fragments of the population are provided with a marker and / or a fifth functional group.
  • the marker is used in particular to detect the peptide fragments. At the marker. it can be, for example, a fluorescent marker or a radioactive marker.
  • the fifth functional group of the peptide fragments is preferably used to isolate and / or purify the peptide fragments.
  • the peptide fragment bound in the peptide-presenting MHC molecule can be immobilized after release from the complex by binding the fifth functional group to complementary sixth functional groups on suitable nanoparticles and thus separated from the other components of the complex.
  • the fifth functional group is preferably different from the first, second, third and / or fourth functional group and cannot form a bond with them.
  • the immobilization of the first receptor unit or the immobilization of the first and second receptor units on the nanoparticles is carried out by incubating the receptor unit (s) with the nanoparticles in a PBS buffer over a period of one Hour to four hours, preferably two hours, at room temperature in a shaking device, nanoparticles with immobilized first receptor units or nanoparticles with immobilized first and second receptor units being obtained.
  • the immobilization of receptor units on the nanoparticles can also be carried out by using a peptide of known sequence and a suitable length, from which it is known that it can bind to the receptor used, ie the MHC molecule used, and the first receptor unit and the second receptor unit in solution, a peptide-presenting receptor is produced.
  • the peptide-presenting receptor thus produced is then immobilized on the nanoparticles and the nanoparticles obtained in this way with the immobilized peptide-presenting receptor are then subjected to a treatment for removing at least the bound peptide, so that nanoparticles with one or more immobilized receptor units are obtained become.
  • the peptide-presenting receptor is reduced by incubating the first receptor unit, the second receptor unit and the peptide used in a buffer containing 100 ml Tris, 2 mM EDTA, 400 mM L-arginine, 5 mM Glutathione and 0.5 mM oxidized glutathione over a period of more than 36 hours, preferably 48 hours, at a temperature of less than 20 ° C., preferably 10 ° C.
  • first receptor unit with first functional groups and a second receptor unit that does not contain any functional third groups is used to produce the peptide-presenting receptor
  • the peptide-presenting receptor made in solution is only used by binding the first functional group of the first receptor unit immobilized on the second functional group of the nanoparticles on the nanoparticles.
  • the receptor ligand is immobilized. Complex to the nanoparticles via the bond between the first and second functional groups and the bond between the third and fourth functional groups.
  • the nanoparticles thus obtained are immobilized with the immobilized receptor-ligand complex with a stripping buffer, pH 3.0, containing 50 mM sodium citrate over a period of less than 20 seconds. preferably 10 seconds.
  • a stripping buffer pH 3.0, containing 50 mM sodium citrate over a period of less than 20 seconds. preferably 10 seconds.
  • the second receptor unit is also removed from the nanoparticles in the treatment of the nanoparticles obtained, in addition to the bound peptide that a nanoparticle with the immobilized first receptor unit is obtained.
  • the peptide-presenting receptor is immobilized on the nanoparticles by binding of the first functional group of the first receptor unit to the second functional group of the nanoparticles and binding of the third functional group of the second receptor unit to the fourth functional group of the nanoparticles , only the bound peptide is removed from the nanoparticles in the treatment of the nanoparticles obtained with the stripping buffer. Nanoparticles with the immobilized first and second receptor units are thus obtained.
  • the nanoparticles thus produced which contain either the immobilized first receptor unit or the immobilized first and second receptor unit, can then, if appropriate after purification, for example by means of at least one centrifugation and at least one washing operation, be separated from the buffer and again in a suitable one Buffer to be suspended. The so get The nanoparticles can be used to carry out the competitive binding reactions of the population of peptide fragments produced.
  • the competitive binding of the peptide fragment population produced to the nanoparticles which have the first or the first and second immobilized receptor unit is achieved by incubating the peptide fragment population with the nanoparticles in a PBS buffer over a period of 2 Hours to 6 hours, preferably 4 hours, at a temperature from room temperature to 39 ° C, preferably 37 ° C, performed. Becomes. If the nanoparticles only have the immobilized first receptor unit, the PBS buffer used for competitive binding also contains the second receptor unit.
  • an immobilized receptor-ligand complex is obtained, which is then separated from the buffer and the unbound peptide fragments of the population by means of centrifugation and at least one washing process and resuspended in a buffer.
  • the peptide-presenting receptor and / or the bound peptide fragment are then analyzed according to the invention.
  • the suspension of the nanoparticles which have the immobilized peptide-presenting receptor with the bound peptide are analyzed by means of matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) methods.
  • the MALDI method is a mass spectrometric method.
  • Mass spectrometry is a process for the structure elucidation of substances, whereby atomic and molecular particles are separated according to their mass. It is based on a reaction between molecules and electrons or photons.
  • a MALDI method which is preferably used according to the invention is the MALDI-TOF-MS method (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry).
  • the main advantages of this method include the extremely quick positive identification of a substance to be analyzed, for example a protein or peptide, by its mass to charge ratio (m / z) and the extremely low detection limit, which is in the Femtomol range or below ,
  • the nanoparticles obtained for example in the form of a suspension, are centrifuged and washed on a MALDI sample carrier or MALDI target and analyzed.
  • a matrix used in the course of the MALDI process in particular MALDI-TOF-MS process, can be applied to the MALDI sample carrier before or after the deposition of the suspension containing nanoparticles or together therewith.
  • the at least one peptide fragment bound in the immobilized receptor-ligand complex is detached from the receptor, isolated and analyzed.
  • the nanoparticles which have the immobilized receptor with the at least one bound peptide fragment, can be released over a period of time in a stripping buffer, pH 3.0, containing 50 mM sodium citrate to release the peptide fragment less than 20 seconds, preferably 10 seconds.
  • a stripping buffer pH 3.0, containing 50 mM sodium citrate to release the peptide fragment less than 20 seconds, preferably 10 seconds.
  • the at least one peptide fragment if it has a fifth functional group, is isolated and purified using nanoparticles.
  • these nanoparticles contain a sixth functional group which binds the fifth functional group, so that there is the possibility of specifically isolating the released peptide fragments from an aqueous solution or suspension.
  • the at least one isolated peptide fragment is subsequently sequenced.
  • the present invention also relates to a method for producing a peptide vaccine against a protein antigen, in particular against cells or biological materials expressing or presenting the protein antigen, the amino acid sequence of a T cell epitope of the protein antigen being identified in vitro , a peptide with the identified amino acid sequence is produced and in a preferred embodiment thereafter using the peptide produced and a first and optionally second receptor unit, in particular a first and second chain of an MHC molecule, a receptor-ligand complex, in particular a peptide -Presenting MHC molecule is produced, which as Vaccine can be used.
  • the method according to the invention comprises
  • a “vaccine” is understood to mean a composition for generating immunity for the prevention and / or treatment of disease states.
  • Vaccines are therefore medicaments which contain antigens and which are intended for the production of humans or animals specific defense and protective substances to be used by vaccination, vaccines are used for the active formation of antibodies.
  • the population of peptide fragments of the protein antigen is produced by means of enzymatic protein cleavage, genetic engineering processes or chemical synthesis processes.
  • the peptides contained in the peptide population completely represent the entire amino acid sequence of the protein antigen.
  • the peptide fragments of the population preferably having those amino acid sequences which represent certain potential T cell epitopes by means of a computer algorithm.
  • the peptide fragments have a length of 8 to 10 amino acids if the MHC molecule to be produced is a MHC molecule of type I. If the MHC molecule to be produced is a MHC molecule type II, the peptide fragments are preferably 15 to 24 amino acids in length.
  • the MHC molecule to be produced is a Type I MHC molecule
  • the first chain is a heavy chain of approximately 45 kDa and the second chain is a light chain of approximately 12 kDa.
  • the first chain is an HLA-A, HLA-B or HLA-C monomer and the second chain is ⁇ -2-microglobulin.
  • the first chain according to the invention is an ⁇ chain of approximately 34 kDa and the second chain is a ⁇ chain of approximately 30 kDa.
  • the first chain and the second chain are preferably HLA-DR, HLA-DQ or HLA-DP monomers. Both the chains of the MHC type I and the MHC type II class can be used in mutated, modified, modified, in particular shortened form.
  • the first chain preferably contains a first functional group, so that the first chain binds the first functional group Group is immobilized on a second functional group present on the surface of the nanoparticles on the surface of the nanoparticles.
  • the functional group is a natural component of the first chain or is introduced into the first chain by means of genetic engineering processes, biochemical, enzymatic and / or chemical derivatization or chemical synthesis processes.
  • the first functional group is preferably a group selected from the group consisting of carboxy groups, amino groups, thiol groups, biotin groups, His-Tag, Flag-Tag, Strep-Tag I groups, Strep- Tag II groups, histidine tag groups and flag tag groups.
  • the second functional group present on the surface of the nanoparticles is preferably selected from the group consisting of amino groups, carboxy groups, maleimido groups, avidin groups, streptavidin groups, neutravidin groups and metal gelate complexes.
  • the second functional group can be applied to the surface of the nanoparticles by means of graft silanization, silanization, chemical derivatization or similar suitable processes.
  • the nanoparticles to be used are preferably those which have a core made of a chemically inert material, preferably silica, and a diameter of 30 to 400 nm, preferably 50 nm to 150 nm.
  • the nanoparticles having a first immobilized chain on their surface are obtained by the following steps:
  • the peptide fragment population is bound competitively to the nanoparticle having the first immobilized chain by incubating the peptide fragment population with the nanoparticles in a suitable buffer under suitable conditions. After the peptide fragment of the population and at least the second chain, which has at least one affinity, has bound to form an immobilized MHC molecule, the nanoparticles with the immobilized MHC molecule are separated from the buffer and the unbound peptide fragments by means of centrifugation and washing. The nanoparticles comprising the immobilized MHC molecule are then treated with a suitable buffer, for example a stripping buffer, to release the bound peptide fragment. The released peptide fragment is then isolated and its amino acid sequence determined.
  • a suitable buffer for example a stripping buffer
  • the bound peptide fragment can then be produced in large quantities, for example using genetic engineering methods.
  • a nucleic acid encoding the determined amino acid sequence can be generated on the basis of the determined amino acid sequence of the released peptide fragment and inserted into a suitable expression vector. This vector is then transferred to a suitable host cell for expression of the amino acid sequence.
  • a peptide can be expressed in large quantities in the host cell and isolated therefrom.
  • the present invention also relates to a method for quality control of receptor-ligand complexes and / or their constituents, comprising the preparation or provision of a receptor-ligand complex in solution from at least one receptor unit, preferably two receptor units, wherein at least one receptor unit has a first functional group, and a ligand, the immobilization of the receptor-ligand complex on nanoparticles which have at least one second functional group binding the first functional group on their surface, and analysis of the immobilized receptor ligand Complex nanoparticles using a MALDI process.
  • the receptor is preferably an MHC molecule in which the ligand is a peptide of known sequence and defined length that binds to the receptor. zeptor-ligand complex around a peptide-presenting MHC molecule.
  • the receptor is a class I MHC molecule, the receptor units being a heavy chain of approximately 45 kDa and the receptor unit being a light chain of approximately 12 kDa.
  • the heavy chain is an HLA-A, HLA-B or HLA-C monomer and the light chain is ⁇ -2 microglobulin.
  • the receptor is a class II MHC molecule, a receptor unit being an ⁇ chain of approximately 34 kDa and a receptor unit being a ⁇ chain of approximately 30 kDa.
  • the ⁇ chain and the ⁇ chain are HLA-DR, HLA-DQ or HLA-DP monomers.
  • a MALDI method in particular a MALDI-TOF method, is used for the analysis.
  • the present invention also relates to a method for producing nanoparticles which have at least one immobilized receptor unit or one immobilized receptor on their surface
  • the immobilization of the receptor-ligand complex on the nanoparticle surface takes place exclusively via the binding of the first functional group of the first receptor unit to the second functional group of the nanoparticles.
  • the second receptor unit is also released in addition to the ligand, and nanoparticles with the immobilized first receptor unit are obtained.
  • the second receptor unit has a third functional group, while on its surface the nanoparticles have a fourth functional group which binds the third functional group of the second receptor unit.
  • the immobilization of the receptor-ligand complex on the nanoparticles thus takes place via the binding of the first functional group of the first receptor unit to the second functional group of the nanoparticles and the binding of the third functional group of the second receptor unit to the fourth functional group of the nanoparticles.
  • an acidic buffer only the ligand is released and nanoparticles with the immobilized first and second receptor units are obtained.
  • the first and second receptor units are preferably immobilized in a directional manner and form a receptor which can bind a ligand.
  • the receptor is an MHC molecule
  • the ligand is a peptide of known sequence and defined length binding to the receptor and the receptor-ligand complex is a peptide-presenting MHC molecule.
  • the receptor is a class I MHC molecule which has a heavy chain of approximately 45 kDa as the first unit and a light chain of approximately 12 kDa as the second receptor unit or a light chain of approximately 12 kDa as the first receptor unit and a heavy chain of about 45 kDa as the second receptor unit.
  • the heavy chain is an HLA-A, HLA-B or HLA-C monomer and the light chain is b-2 microglobulin.
  • the receptor is a class II MHC molecule which has as the first receptor unit an ⁇ chain of approximately 34 kDa and as the second receptor unit has a ⁇ chain of approximately 30 kDa or is the first Receptor unit has a ⁇ chain of approximately 30 kDa and as the second receptor unit an ⁇ chain of approximately 34 kDa.
  • the ⁇ chain and the ⁇ chain are HLA-DR, HLA-DQ or HLA-DP monomers.
  • the first functional group and the third functional group differ from one another and are selected from the group consisting of carboxy groups, amino groups, thiol groups, biotin groups, His tag, FLAG tag, Strep -Tag I groups, Strep-Tag II groups, histidine-Tag groups and FLAG-Tag groups.
  • the second functional group on the nanoparticle surface that binds the first functional group and the fourth functional group on the nanoparticle surface that binds the third functional group differ from one another and are selected from the group consisting of amino groups, carboxy groups, maleimido groups, avidin groups, streptavidin groups, neutravidin groups and metal chelate complex.
  • the nanoparticles comprising the immobilized receptor-peptide complex are preferably treated with a stripping buffer, pH 3.0, containing 50 mM sodium citrate for a period of less than 20 s, preferably 10 s, in order to remove the bound peptide.
  • a stripping buffer pH 3.0, containing 50 mM sodium citrate for a period of less than 20 s, preferably 10 s, in order to remove the bound peptide.
  • the present invention also relates to a method for producing nanoparticles with immobilized peptide-presenting MHC molecules, nanoparticles having at least one first immobilized chain of an MHC molecule which, according to a method according to the invention, for producing nanoparticles with at least one immobilized receptor.
  • Unit or with an immobilized receptor in the presence of a second chain, which can form an MHC molecule with the first chain, with a peptide which can bind to the MHC molecule, and a peptide presenting immobilized on the nanoparticles MHC molecule is obtained.
  • the MHC molecule is preferably a class I molecule, the peptide being about 8 to about 10 amino acids in length.
  • the MHC molecule can also be a class II molecule, the peptide being about 15 to about 24 amino acids in length.
  • the present invention also relates to a method for the enrichment and / or isolation of specific CD4 + -T lymphocytes or CD8 + -T lymphocytes from peripheral mononuclear blood cells (PBMCs), comprising a) Production of nanoparticles with immobilized peptide-presenting MHC molecules, the peptide being a T cell epitope
  • PBMCs peripheral mononuclear blood cells
  • the bound T lymphocytes are then released from the nanoparticles and multiplied clonally in vitro.
  • the released and / or clonally increased T lymphocytes can then be introduced into an organism, for example.
  • the peptide-presenting MHC molecule is a class I molecule and the bound T lymphocytes are CD8 + T lymphocytes.
  • the peptide presenting MHC molecule is a class II molecule, the bound T lymphocytes being CD4 + T lymphocytes.
  • the present invention also relates to a method of priming and / or restimulating a CD4 + T and / or CD8 + T lymphocyte cyten reaction in vitro, comprising a) identification of a T cell epitope and determination of its amino acid sequence,
  • the present invention also relates to nanoparticles containing at least one receptor unit on the surface, in particular an immobilized chain of an MHC molecule.
  • the immobilized chain can form a peptide-presenting MHC molecule by binding a peptide of 8 to 24 amino acids and a second chain of an MHC molecule.
  • the MHC molecule chain is immobilized on the nanoparticle surface by binding a first functional group contained therein to a second functional group present on the nanoparticle surface.
  • the present invention also relates to nanoparticles with an immobilized MHC molecule, the MHC molecule comprising a first and a second chain and the MHC molecule by binding a first functional group contained in the first chain to a second functional group present on the nanoparticle surface Group or by binding the first functional group contained in the first chain to the second functional group present on the nanoparticle surface and binding a third functional group contained in the second chain to a fourth functional group present on the nanoparticle surface on the nanoparticle surface.
  • Surface is immobilized.
  • the present invention also relates to nanoparticles with a peptide-presenting MHC molecule immobilized on the nanoparticle surface, the peptide-presenting MHC molecule comprising a first chain, a second chain and a peptide of 8 to 24 amino acids and the MHC molecule by binding a first functional group contained in the first chain to a second functional group present on the nanoparticle surface or by binding the first functional group contained in the first chain to the second functional group present on the nanoparticle surface and binding one third functional group contained in the second chain is immobilized on the nanoparticle surface with a fourth functional group present on the nanoparticle surface.
  • the present invention further relates to a peptide vaccine comprising at least one peptide-presenting MHC molecule or the peptide fragment itself identified according to the invention, the peptide vaccine being obtainable according to the method according to the invention.
  • the peptide vaccine can be present as a lyophilisate.
  • the vaccine is in the form of an aqueous colloidal solution or suspension.
  • the peptide vaccine according to the invention can additionally contain at least one adjuvant.
  • the present invention also relates to a kit for the identification and / or detection of T cell epitopes of a protein antigen in vitro, comprising a container with a suspension of nanoparticles with an immobilized MHC molecule.
  • the kit can comprise a container with a suspension of nanoparticles with immobilized first chains of an MHC molecule and a container with a lyophilizate of a second chain.
  • the present invention also relates to the use of a nanoparticle according to the invention for the identification and / or detection of T cell epitopes of a protein antigen in vitro.
  • the present invention further relates to the use of a nanoparticle according to the invention for the production of a peptide vaccine.
  • the present invention relates to the use of a nanoparticle for the enrichment and / or isolation of specific CD4 + T lymphocytes or CD8 + T lymphocytes in vitro.
  • the present invention further relates to the use of a nanoparticle of the invention for priming and / or restimulating a CD4 + T and / or CD8 + T lymphocyte response in vitro.
  • the present invention also relates to the use of an invented Peptide vaccine according to the invention for the active immunization of an animal or human organism against a protein antigen.
  • FIG. 1 shows, in schematic form, a preferred embodiment of the method according to the invention for identifying and / or detecting T cell epitopes, an HLA-A2 complex prepared in solution and presenting the peptide being immobilized on nanoparticles. Subsequently, a treatment is carried out of the complex having nanoparticles with an acidic "stripping" buffer, the EBV EBNA-6 peptide (position 284-293, LLDFVRFMGV) and ß2-microglobulin (beta 2 -m) are removed.
  • an acidic "stripping" buffer the EBV EBNA-6 peptide (position 284-293, LLDFVRFMGV) and ß2-microglobulin (beta 2 -m) are removed.
  • Nanoparticles produced with the immobilized HLA chain are then used to carry out a competitive binding reaction using a peptide population in the presence of ⁇ 2 -m, the peptide (s ) binding / binding to HLA and ⁇ 2 -m, whereby a HLA complex presenting this peptide is formed on the nanoparticle surface
  • the nanoparticles which have the immobilized peptide-presenting complex are subjected to analysis by means of MALDI mass spectrometry.
  • FIG. 2 shows mass spectrograms of nanoparticles obtained by means of MALDI mass spectrometry with immobilized peptide-presenting HLA complexes.
  • FIG. 2.1 relates to the peptide mixture from equimolar amounts of the 5 peptides mentioned in Example 4. en and FIG. 2.2 the two peptides that were recognized as binding after selection.
  • FIG. 3 shows the MALDI spectrum of all SAV nanoparticle-immobilized molecular components of the HLA-A2-EBNA-6 complex.
  • the insert shows the MALDI spectrum of the EBNA-6 peptide [M + H] + with the sequence LLDFVRFMGV (theoretical monoisotopic mass [M + H] + 1196.6502 ⁇ ).
  • the peak at 11727 characterizes ß 2 -m
  • the peaks at about 12900 characterize the SAV nanoparticles in monomeric form
  • the peak at 34383 characterizes the biotinylated alpha chain.
  • Peptides were synthesized using the Fmoc solid phase method on a MillGen 9050 continuous flow synthesizer (Millipore, Bedford, USA). After RP-HPLC purification, the peptides were lyophilized and dissolved in PBS buffer at a concentration of 1 mg / ml.
  • Soluble HLA-A * 0201 peptide tetramers were synthesized as described by Altman et al., Science, 274 (1996), 94-96.
  • Recombinant heavy HLA-A * 0201 chains (positions 1-276) were in soluble form and ß-2-microglobulin (ß 2 -m) separately in Escherichia coli cells, which were labeled with appropriate expression plasmids had been transformed.
  • the 3 'end of the extracellular domains of the HLA-A * 0201 heavy chain was modified with a Bir A biotinylation sequence.
  • the Escherichia coli cells which had been transformed with the corresponding expression plasmids encoding the HLA-A * 0201 chain or ⁇ 2 - m, were cultivated until the mid-log growth phase. This was followed by induction with 0.5 isopropyl- ⁇ -galactosidase. After further cultivation and expression of the recombinant proteins, the Escherichia coli cells were harvested and purified. After cell disruption, the inclusion bodies contained in the cells were isolated, purified and solubilized in 8 M urea, pH 8.0.
  • the heavy HLA-A * 0201 chain and ⁇ 2 -m were diluted in 100 mM Tris, 2 mM EDTA, 400 mM L-arginine, 5 mM reduced glutathione and 0.5 mM oxidized glutathione and with 10 ⁇ M of the peptide LLDFVRFMGV (EBV EBNA-6, positions 284-293). This was followed by a 48-hour incubation at 10 ° C. with stirring. The folded 48 kDa complexes ( ⁇ chain: approx. 35 kDa, ⁇ 2 -m: approx. 12 kDa, peptide: approx.
  • Silica particles were prepared as described by Stoeber et al., J. Colt, inter. Sci., 26 (1968), 62-62. Spherical silica particles with an average hydrodynamic particle diameter of 100 nm were obtained, as determined by means of dynamic light scattering measurements with a Zetasiser 3000 HSA device (Malvern Instruments, Berlinberg, Germany). 500 ⁇ g of the carboxy-modified particles were mixed with 15 ⁇ g streptavidin (Röche, Tutzing, Germany). The immobilized streptavidin was quantified by quenching the fluorescence from bio-tin-4-fluorescein. It was shown that the entire 15 ⁇ g streptavidin were immobilized on the nanoparticles.
  • All washing steps of the nanoparticles were carried out by centrifugation for 10 minutes at 15000 ⁇ g at 20 ° C. in a temperature-controlled centrifuge in 1.5 ml reaction vessels and by means of Suspension of the beads is carried out using a micropipette.
  • 55 ⁇ g SAV nanoparticles and 3.5 ⁇ g of the soluble HLA-A2 complex, which contained the peptide LLDFVRFMGV (EBV EBNA-6, positions 284-293) were suspended in 20 ⁇ l PBS. The mixture was incubated for 2 hours at room temperature in a horizontal shaker to prevent sedimentation. After centrifugation at 20 ° C.
  • the beads were incubated in 150 ⁇ l “stripping” buffer (50 mM sodium citrate, pH 3.0) for 90 seconds and washed with 150 ⁇ l water after centrifugation.
  • the beads were then resuspended with 30 ⁇ l PBS containing 1.2 ⁇ g ß 2 m molecules (Sigma, Kunststoff, Germany) and a mixture of peptides, the mixture comprising a total of 5 peptides in an amount of 0.072 ⁇ g each Peptides had the sequences ILMEHIHKL, DQKDHAVF, ALSDHHIYL, VITLVYEK and SNEEPPPPY
  • the nanoparticles were pelleted by centrifugation and, after removing the supernatant, washed with 50 ⁇ l PBS buffer and then with the last 50 ⁇ l water Centrifugation, the nanoparticles were resuspended in 0.1% water / TFA (v / v) and transferred to a MALDI target, and analysis was performed using a Voyager DE-STR mass spectrometer (Applied Biosystems Foster City, USA) in positive ion reflectctron mode.
  • biotinolated HLA-A2 complex can be detected and quantified using the MALDI-TOF method.
  • HLA-A2 complexed SAV nanoparticles bind only the peptides predicted for HLA-A2 when competitively bound using a peptide mixture.
  • FIG. 2 shows the MALDI spectra of a peptide mixture comprising two HLA-A2 peptides that bind and three peptides that do not bind, each peptide being present in an amount of approximately 70 prol.
  • the predicted binding of the peptides was carried out using the SYFPEITHI Program determined, with a very strong binding a score of 32 for the peptide ILMEHIHKL, with a strong binding a score of 23 was determined for the peptide ALSDHHIYL and a score of 0 for the three non-binding proteins.
  • the differences in the signal intensities of each peptide in the mixture used are due to different ionization capabilities.
  • the identity of the observed peaks was confirmed by MALDI-PSD sequencing.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein-Antigens, Verfahren zur Herstellung von Peptid-Impfstoffen gegen ein Protein-Antigen, Verfahren zur Qualitätskontrolle von Rezeptor-Ligand-Komplexen und/oder deren Bestandteilen, Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln mit mindestens einer immobilisierten Rezeptor-Einheit oder einem immobilisierten Rezeptor, Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln mit immobilisierten Rezeptor-Ligand-Komplexen, insbesondere Peptid-präsentierenden MHC-Molekülen, Verfahren zur Anreicherung und/oder Isolierung spezifischer CD4+-T- oder CD8+-T-Lymphozyten aus peripheren mononucleären Blutzellen, Verfahren zum Primen einer CD8+-T-Lymphozyten-Reaktion in vitro, Nanopartikel mit einer immobilisierten Rezeptor-Einheit, insbesondere einer immobilisierten Kette eines MHC-Moleküls, Nanopartikel mit einem immobilisierten Rezeptor, insbesondere einem immobilisierten MHC-Molekül, Nanopartikel mit einem immobilisierten Rezeptor-Ligand-Komplex, insbesondere einem Peptid-präsentierenden MHC-Molekül, einen Peptid-Impfstoff, einen Kit zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein-Antigens, sowie die Verwendung der Nanopartikel zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen, zur Herstellung von Peptid-Impfstoffen, zur Anreicherung und/oder Isolierung spezifischer T-Lymphozyten sowie zum Primen einer CD8+-T-Lymphozyten-Reaktion in vitro.

Description

Identifizierung von Antigen-Epitopen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein-Antigens, Verfahren zur Herstellung von Peptid-Impfstoffen gegen ein Protein- Antigen, Verfahren zur Qualitätskontrolle von Rezeptor-Ligand- Komplexen und/oder deren Bestandteilen, Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln mit mindestens einer immobilisierten Rezeptor- Einheit oder einem immobilisierten Rezeptor, Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln mit immobilisierten Peptid-prasentierenden MHC-Molekülen, Verfahren zur Anreicherung und/oder Isolierung spezifischer CD4+-T- oder CD8+-T-Lymphozyten aus peripheren mononuclearen Blutzellen, Verfahren zum Primen und/oder Restimulieren einer CD4+-T- oder CD8+-T-Lymphozyten-Reaktion in vitro, Nanopartikel mit einer immobilisierten Rezeptor-Einheit, insbesondere einer immobilisierten Kette eines MHC-Moleküls, Nanopartikel mit einem immobilisierten Rezeptor, insbesondere einem immobilisierten MHC-Molekül, Nanopartikel mit einem immobilisierten Peptid- prasentierenden MHC-Rezeptor, einen Peptid-Impfstoff, einen Kit zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein-Antigens, sowie die Verwendung der Nanopartikel zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen, zur Herstellung von Peptid-Impfstoffen, zur Anreicherung und/oder Isolierung spezifischer T-Lymphozyten sowie zum Primen einer CD4+-T- oder CD8+-T-Lymphozyten-Reaktion in vitro.
Die Gesundheit eines tierischen oder menschlichen Organismus hängt unter anderem davon ab, inwieweit der Organismus sich gegen pathogene Agenzien aus seiner Umwelt schützen kann bezie- hungsweise inwieweit der Organismus verändertes körpereigenes Material erkennen und eliminieren kann. Das Immunsystem des menschlichen oder tierischen Körpers, das diese Funktionen erfüllt, lässt sich in zwei funktioneile Bereiche unterteilen, nämlich das an- geborene und das erworbene Immunsystem. Die angeborene Immunität ist die erste Verteidigungslinie gegen Infektionen und die meisten potentiellen Krankheitserreger werden unschädlich gemacht, bevor sie beispielsweise eine erkennbare Infektion verursachen können. Das erworbene Immunsystem reagiert auf als Antigene be- zeichnete Oberflächenstrukturen des eindringenden Organismus. Es gibt zwei Typen erworbener Immunreaktionen, nämlich die humorale Immunreaktion und die zellvermittelte Immunreaktion. Bei der humoralen Immunreaktion binden in den Körperflüssigkeiten vorhandene Antikörper an Antigene und zerstören diese. Bei der zellvermittelten Immunreaktion werden T-Zellen aktiv, die andere Zellen zerstören können. Wenn beispielsweise mit einer Krankheit im Zusammenhang stehende Proteine in einer Zelle vorhanden sind, werden sie innerhalb der Zelle proteolytisch zu Peptiden fragmentiert. Danach binden spezifische Zellproteine an die so entstandenen Fragmente des Proteins oder Antigens und transportieren diese an die Oberfläche der Zelle, wo sie den molekularen Abwehrmechanismen, insbesondere T-Zellen des Körpers präsentiert werden.
Die Moleküle, die die Peptide an die Zelloberfläche transportieren und dort präsentieren, werden als Proteine des Haupthistokompatibi- litäts-Komplexes (MHC) bezeichnet. Die Bedeutung der MHC- Proteine besteht insbesondere darin, dass sie T-Zellen ermöglichen, „selbst" (self)-Antigene von „nicht selbst" (non-self)-Antigenen zu unterscheiden. Die MHC-Proteine werden in MHC-Proteine der Klasse I und der Klasse II unterteilt. Obwohl die Proteine der beiden MHC- Klassen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheidet sich ihre Funktion relativ deutlich. Proteine der MHC-Klasse I sind auf. der Oberfläche fast aller Körperzellen vorhanden. Die Proteine der MHC-Klasse I präsentieren Antigene, die normalerweise von körpereigenen Prote- inen stammen, gegenüber cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs). Die MHC-Proteine der Klasse II sind nur auf B-Lymphozyten, Makropha- gen und anderen Antigen-präsentierenden Zellen vorhanden. Sie präsentieren hauptsächlich Peptide, die aus externen, also nicht körpereigenen Antigen-Quellen stammen, gegenüber T-Helfer (Th)- Zellen.
MHC-Moleküle der Klasse I werden konstitutiv auf der Oberfläche fast aller Zelltypen innerhalb des Körpers gebildet. Die von den MHC-Proteinen der Klasse I gebundenen Peptide stammen von normalerweise im gesunden Wirtsorganismus selbst produzierten zytoplasmatischen Proteinen ab, die weder im Zusammenhang mit Fremdzellen noch entarteten Zellen stehen. Normalerweise wird durch solche MHC-Proteine der Klasse I auch keine Immunreaktion stimuliert. Zytotoxische T-Lymphozyten, die solche „seif" (selbst)- Peptide präsentierende MHC-Moleküle der Klasse I erkennen, wer- den daher in den Thymus transportiert oder nach ihrer Freisetzung aus dem Thymus vom Körper toleriert. MHC-Moleküle können nur dann eine Immunreaktion stimulieren, wenn ein „non-self" (nicht- selbst)-Peptid gebunden ist, an das zytotoxische T-Lymphozyten binden. Die meisten zytotoxischen T-Lymphozyten besitzen sowohl T-Zell-Rezeptoren (TCR) und CD8-Moleküle auf ihrer Oberfläche. Die T-Zell-Rezeptoren können nur dann non-self-Peptide erkennen und daran binden, wenn sie in Form eines Komplexes mit den Molekülen der MHC-Klasse I vorliegen. Damit ein T-Zell-Rezeptor einen Peptid-MHC-Komplex binden kann, müssen zwei Bedingungen erfüllt sein. Erstens müssen die T-Zell-Rezeptoren eine Struktur aufweisen, die ihnen eine Bindung an den Peptid-MHC-Komplex erlaubt. Zweitens muss das CD8-Molekül an die α-3-Domäne der MHC-Klasse I- Moleküle binden. Jeder zytotoxische T-Lymphozyt exprimiert einen unikalen T-Zell-Rezeptor, der nur einen spezifischen MHC-Peptid- Komplex binden kann.
Die Peptide binden an die Moleküle der MHC-Klasse I durch kompe- titive Affinitätsbindung innerhalb des endoplasmatischen Retikulums, bevor sie auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Die Affinität ei- nes einzelnen Peptides steht dabei in direktem Zusammenhang mit seiner Aminosäuresequenz und dem Vorhandensein von spezifischen Bindungsmotiven an definierten Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz. Die Kenntnis der Sequenz eines solchen „non- self" -Peptides ermöglicht es beispielsweise, das Immunsystem ge- gen erkrankte Zellen zu manipulieren, zum Beispiel unter Verwendung von Peptid-Impfstoffen. Die direkte Analyse von solchen „non- self'-Peptiden wird jedoch durch mehrere Faktoren erschwert. Beispielsweise sind sehr häufig relevante Epitope, d.h. relevante Pep- tidsequenzen unterrepräsentiert. Erschwerend kommt hinzu, dass MHC-Moleküle einen hohen Polymorphismus-Grad aufweisen. So kann ein Individuum allein bei den Molekülen der MHC-Klasse I bis zu sechs verschiedene Polymorphismen aufweisen, wobei in jedem Fall zum Teil sehr unterschiedliche Peptidsequenzen gebunden werden.
Unter Verwendung von Computeralgorithmen lassen sich potentielle T-Zell-Epitope, also Peptidsequenzen, die von den MHC-Molekülen der Klasse I oder II in Form eines Peptid-prasentierenden Komplexes gebunden und dann in dieser Form von den T-Zell-Rezeptoren zytotoxischer T-Lymphozyten erkannt werden, vorhersagen. Das heißt, das Ergebnis solcher Analysen erlaubt Aussagen über die Wahrscheinlichkeit einer Bindung eines Peptides an spezifische MHC-Moleküle, beispielsweise HLA-Phänotypen. Derzeit werden insbesondere zwei Programme, nämlich SYFPEITHI (Rammensee et al., Immunogenetics, 50 (1999), 213-219) und HLA_BIND (Parker et al., J. Immunol., 152 (1994), 163-175) verwendet. Die so ermittelten Peptidsequenzen, die potentiell mit MHC-Molekülen der Klasse I eine Bindung eingehen können, müssen dann in vitro hinsichtlich ihrer tatsächlichen Bindungskapazität untersucht werden. Die dazu erforderlichen Verfahren sind jedoch in ihrer Wirksamkeit stark beschränkt, da nur eine äußerst geringe Anzahl von Peptiden simultan gescreent und untersucht werden kann.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Prob- lern besteht darin, ein verbessertes Verfahren zum Screenen potentieller T-Zell-Epitope bereitzustellen, das eine simultane und schnelle Untersuchung einer Vielzahl von Peptidsequenzen, beispielsweise solcher Sequenzen, die unter Verwendung von Computeralgorithmen bereits als potentielle Bindungspartner für spezifische MHC- Moleküle ermittelt wurden, hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bindung an spezifische MHC-Moleküle erlaubt.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein-Antigens in vitro, wobei eine Population von Peptid-Fragmenten des Antigens einer kompetitiven Bindung an eine erste immobilisierte Rezeptor- Einheit, vorzugsweise und optional in Gegenwart einer zweiten Rezeptor-Einheit, die zusammen mit der ersten Rezeptor-Einheit einen Rezeptor bilden kann, unterworfen und das oder die gebundenen Peptid-Fragmente mit Affinität zu dem Rezeptor an zumindest die erste Rezeptor-Einheit, vorzugsweise an die beiden Rezeptor- Einheiten bindet, und das oder die gebundene(n) Peptid-Fragmente anschließend isoliert und analysiert wird beziehungsweise werden, umfassend
a) Immobilisierung mindestens der ersten Rezeptor-Einheit, die mindestens eine erste funktionelle Gruppe aufweist, an einem Nanopartikel, dessen Oberfläche mindestens eine die erste funktioneile Gruppe bindende zweite funktioneile Gruppe aufweist,
b) Herstellung beziehungsweise Bereitstellung einer Population von Peptid-Fragmenten des Protein-Antigens, die unterschiedliche Sequenzbereiche des Protein-Antigens umfassen,
c) Durchführung einer kompetitiven Bindung der Peptidfragment- Population an die am Nanopartikel immobilisierte erste Rezeptor- Einheit, optional, insbesondere bei MHC-Molekülen der Klasse II, in Gegenwart einer zweiten Rezeptor-Einheit, wobei das oder die Peptid-Fragmente mit Affinität zu der ersten beziehungsweise beiden Rezeptor-Einheiten, insbesondere, wenn vorhanden, zusammen mit der zweiten Rezeptor-Einheit, an die erste Rezeptor-Einheit bindet und ein an dem Nanopartikel immobilisierter Rezeptor- Peptidfragment-Komplex erhalten wird, und
d) Analyse des immobilisierten Rezeptor-Peptidfragment-Komplex und/oder des beziehungsweise der gebundenen Peptid- Fragmente(s). Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem also durch die Bereitstellung eines Verfahrens, wobei in vitro ein Rezeptor/Ligand-Komplex, insbesondere ein Rezeptor- Peptidfragment-Komplex unter Bedingungen erzeugt wird, die den tatsächlichen in vivo-Verhältnisse, beispielsweise in einer Zelle mit MHC-Molekülen der Klasse I weitestgehend entsprechen. Dabei wird erfindungsgemäß eine Population von Peptidfragmenten, die beispielsweise die vollständige Aminosäuresequenz eines Protein- Antigens repräsentieren können, erzeugt und die gesamte Peptid- fragment-Population wird dann in einem Schritt einer Bindung an einen immobilisierten Rezeptor, insbesondere einen MHC-Komplex, oder an eine immobilisierte Rezeptor-Einheit, also eine Kette des MHC-Komplexes unterworfen. In Fällen, in denen der Rezeptor ein Protein der MHC-Klasse I ist, kann die Bindung des oder der Peptid- fragmente an die immobilisierte erste Rezeptor-Einheit, insbesondere die α-Kette, für die erfindungsgemäße Identifizierung ausreichen, ohne dass eine zweite Rezeptor-Einheit vorhanden sein muss. Selbstverständlich kann diese zweite Einheit dennoch vorhanden sein. Dies gilt insbesondere für den Fall, dass der Rezeptor ein Pro- tein der MHC-Klasse II ist. Das oder die Peptid-Fragmente, die Affinität zu dem Rezeptor, der einen Rezeptor-Einheit und/oder den beiden Rezeptor-Einheiten aufweist beziehungsweise aufweisen, kann dann tatsächlich einen in immobilisierter Form vorliegenden Rezeptor-Ligand-Komplex oder einen Rezeptor-Peptidfragment-Komplex bilden. Da erfindungsgemäß die Immobilisierung an Nanopartikeln erfolgt, kann der resultierende Rezeptor-Ligand-Komplex auf einfache Weise von den Peptid-Fragmenten abgetrennt werden, die keinen Rezeptor-Ligand-Komplex bilden können, also keine Affinität zu dem ersten oder beiden Rezeptor-Einheiten aufweisen, da sie also im Vergleich zu dem im Komplex gebundenen Peptid-Fragment keine oder eine erheblich geringere Affinität zu dem Rezeptor aufweisen. Erfindungsgemäß kann das Peptid-Fragment oder die Peptid- Fragmente mit Affinität aus der Population von Peptid-Fragmenten abgetrennt und analysiert werden. Dieses Peptid-Fragment kann erfindungsgemäß in gebundener Form, d.h. als Rezeptor-Ligand- Komplex beispielsweise unter Verwendung von MALDI- Massenspektrometrie analysiert werden. Das im Komplex gebundene Peptid-Fragment kann jedoch erfindungsgemäß auch von dem immobilisierten Komplex abgetrennt und separat analysiert werden, beispielsweise einer Sequenzierung unterworfen werden. Die für die erfindungsgemäße Verfahrensweise bereitgestellte Peptid- Fragment-Population enthält die einzelnen, individuellen Peptid- Fragmente jeweils in ausreichender Menge, um eine erfindungsge- mäße Identifizierung zu ermöglichen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „T-Zell-Epitop" eine Peptidsequenz verstanden, die von den MHC- Molekülen der Klasse I oder II in Form eines Peptid-prasentierenden MHC-Moleküls oder MHC-Komplexes gebunden und dann in dieser Form von zytotoxischen T-Lymphozyten oder T-Helfer-Zellen erkannt und gebunden werden kann.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Rezeptor" ein biologisches Molekül oder eine Molekülgruppierung verstanden, das/die einen Liganden binden kann. Ein Rezeptor kann zum Beispiel der Informationsübermittlung in einer Zelle, einem Zellverband oder einem Organismus dienen. Der Rezeptor besteht aus mindestens einer Rezeptor-Einheit und vorzugsweise aus zwei Rezeptor-Einheiten, wobei jede Rezeptor-Einheit aus einem Proteinmo- lekül, insbesondere einem Glykoproteinmolekül bestehen kann. Der Rezeptor weist zu einem Liganden eine komplementäre Struktur auf und kann den Liganden als Bindungspartner komplexieren. Die Informationsweiterleitung erfolgt insbesondere durch Änderung der Konformation des Rezeptors nach Komplexierung des Liganden an der Oberfläche einer Zelle. Erfindungsgemäß werden unter einem Rezeptor insbesondere Proteine der MHC-Klassen I und II verstanden, die mit einem Liganden, insbesondere einem Peptid oder Pep- tidfragment geeigneter Länge, einen Rezeptor-Ligand-Komplex bil- den können.
Unter einem „Liganden" wird ein Molekül verstanden, das zu einem Rezeptor eine komplementäre Struktur aufweist und mit diesem einen Komplex bilden kann. Erfindungsgemäß wird unter einem Liganden insbesondere ein Peptid oder Peptid-Fragment verstanden, das eine geeignete Länge und in seiner Aminosäuresequenz geeignete Bindungsmotive aufweist, so dass das Peptid oder Peptid- Fragment mit Proteinen der MHC-Klasse I oder der MHC-Klasse II einen Komplex bilden kann.
Unter einem „Rezeptor-Ligand-Komplex" wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch ein „Rezeptor-Peptid-Komplex" oder „Rezeptor-Peptidfragment-Komplex", insbesondere ein Peptid- oder Peptidfragment-präsentierendes MHC-Molekül der Klasse I o- der der Klasse II verstanden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „Proteinen oder Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC)", „MHC-Molekülen" oder „MHC-Proteinen" insbesondere Proteine verstanden, die Peptide, die aus der proteolytischen Spaltung von Protein-Antigenen resultieren und potentielle T-Zell-Epitope darstellen, binden, an die Zelloberfläche transportieren und dort gegenüber spezifischen Zellen, insbesondere zytotoxischen T- Lymphozyten oder T-Helfer-Zellen präsentieren können. Der Haupthistokompatibilitätskomplex im Genom umfasst die genetische Region, deren exprimierte Genprodukte auf der Zelloberfläche wichtig für die Erkennung körpereigener und/oder körperfremder Antigene und damit für die Regulation immunologischer Vorgänge sind. Der Haupthistokompatibilitätskomplex wird in zwei Gengruppen ein- geteilt, die unterschiedliche Proteine codieren, nämlich Moleküle der MHC-Klasse I und Moleküle der MHC-Klasse II. Die Moleküle der beiden MHC-Klassen sind auf unterschiedliche Antigen-Quellen spezialisiert. Die Moleküle der MHC-Klasse I präsentieren endogen synthetisierte Antigene, beispielsweise virale Proteine. Die Moleküle der MHC-Klasse II präsentieren aus exogenen Quellen stammende Pro- tein-Antigene, beispielsweise bakterielle Produkte. Die Zellbiologie und die Expressionsmuster beider MHC-Klassen sind auf diese unterschiedlichen Rollen ausgerichtet.
MHC-Moleküle der Klasse I bestehen aus einer schweren Kette von etwa von etwa 45 kDa und einer leichten Kette von etwa 12 kDa und können ein Peptid von etwa 8 bis 10 Aminosäuren, sofern dieses über geeignete Bindungsmotive verfügt, binden und gegenüber zytotoxischen T-Lymphozyten präsentieren. Das von den MHC- Molekülen der Klasse I gebundene Peptid stammt von einem endo- genen Protein-Antigen. Bei der schweren Kette der MHC-Moleküle der Klasse I handelt es sich vorzugsweise um ein HLA-A-, HLA-B- oder HLA-C-Monomer und bei der leichten Kette um ß-2- Mikroglobulin. MHC-Moleküle der Klasse II bestehen aus einer α-Kette von etwa 34 kDa und einer ß-Kette von etwa 30 kDa und können ein Peptid von etwa 15 bis 24 Aminosäuren binden, sofern dieses über geeignete Bindungsmotive verfügt, und gegenüber T-Helfer-zellen präsentie- ren. Das von den MHC-Molekülen der Klasse II gebundene Peptid stammt von einem exogenen Protein-Antigen. Bei der α-Kette und der ß-Kette handelt es sich insbesondere um HLA-DR-, HLA-DQ- und HLA-DP-Monomere.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Nanopartikel" eine partikuläre Bindematrix verstanden, die an ihrer Oberfläche mindestens erste funktioneile chemische Gruppen umfassende molekülspezifische Erkennungsstellen aufweist. Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel umfassen einen Kern mit einer Oberfläche, auf der die ersten funktionellen Gruppen angeord- net sind, wobei die ersten funktionellen Gruppen komplementäre zweite funktioneile Gruppen eines Moleküls kovalent oder nicht- kovalent binden können. Durch Wechselwirkung zwischen den ersten und zweiten funktionellen Gruppen wird das Molekül, vorzugsweise Biomolekül, an dem Nanopartikel immobilisiert und/oder kann daran immobilisiert werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel weisen eine Größe von < 500 nm, vorzugsweise <1 50 nm auf. Der Kern der Nanopartikel besteht vorzugsweise aus chemisch inerten anorganischen oder organischen Materialien, besonders bevorzugt aus Silica.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird Unter einer „ersten funktionellen Gruppe" eine in einer Rezeptor-Einheit, insbesondere einer Kette eines MHC-Moleküls, vorhandene chemische Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer komplementären funktionellen Gruppe, die beispielsweise auf der Oberfläche des Nanopartikels vorhanden ist, derart zu interagieren, dass eine affine, bevorzugt kovalente Bindung zwischen den beiden Bindungspartnern stattfinden kann. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die erste funktioneile Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Biotin- Gruppen, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag I-Gruppen, Strep-Tag II- Gruppen, Histidin-Tag-Gruppen und FLAG-Tag-Gruppen.
Die zweite funktionelle Gruppe, also die funktionelle Gruppe auf der Oberfläche des Nanopartikels, ist erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Ma- leinimido-Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen, Neutravi- din-Gruppen und Metallchelatkomplexen.
Ein erfindungsgemäß verwendetes Nanopartikel weist also an seiner Oberfläche mindestens eine zweite funktionelle Gruppe auf, die ko- valent oder nicht-kovalent mit einer ersten funktionellen Gruppe einer Rezeptor-Einheit verknüpft wird, wobei die erste funktionelle Gruppe eine andere Gruppe als die zweite funktionelle Gruppe ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen müssen komplemen- tär zueinander sein, das heißt fähig sein, eine kovalente oder nicht- kovalente Bindung miteinander einzugehen.
Wird erfindungsgemäß als erste funktionelle Gruppe beispielsweise eine Carboxy-Gruppe eingesetzt, so ist die zweite funktionelle Gruppe auf der Oberfläche der Nanopartikel eine Amino-Gruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Amino-Gruppe als erste funktionelle Gruppe der Rezeptor-Einheit verwendet, ist erfindungsgemäß die zweite funktionelle Gruppe auf der Nanopartikel-Oberfläche eine Carboxy-Gruppe. Wird erfindungsgemäß eine Thiol-Gruppe als erste funktionelle Gruppe der Rezeptor-Einheit ausgewählt, ist die zweite funktionelle Gruppe erfindungsgemäß eine Maleinimido-Gruppe. Werden erfindungsgemäß als erste funktionelle Gruppen der Rezep- tor-Einheit Biotin-Gruppen und/oder Strep-Tag I-Gruppen und/oder Strep-Tag I I-Gruppen verwendet, ist die zweite funktionelle Gruppe auf der Nanopartikel-Oberfläche eine Avidin-Gruppe und/oder eine Streptavidin-Gruppe oder eine Neutravidin-Gruppe. Wird erfindungsgemäß als erste funktionelle Gruppe der Rezeptor-Einheit eine Thiol- Gruppe eingesetzt, ist die zweite funktionelle Gruppe auf der Nanopartikel-Oberfläche eine Maleinimido-Gruppe.
Die vorgenannten ersten und/oder zweiten funktionellen Gruppen können mit Hilfe eines Spacers mit der zu immobilisierenden Rezeptor-Einheit beziehungsweise der Oberfläche der Nanopartikel ver- bunden beziehungsweise mittels eines Spacers an die Nanopartikel- oberfläche oder in die Rezeptor-Einheit eingeführt werden. Der Spacer dient also einerseits als Abstandshalter der funktionellen Gruppe zur Nanopartikel-Oberfläche beziehungsweise Rezeptor- Einheit, andererseits als Träger für die funktionelle Gruppe. Ein der- artiger Spacer kann erfindungsgemäß Alkylen-Gruppen oder Ethy- lenoxid-Oligomere mit 2 bis 50 C-Atomen sein, der in bevorzugter Ausführungsform substituiert ist und Heteroatome aufweist. Der Spacer kann flexibel und/oder linear sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die ersten funktionellen Gruppen ein natürlicher Bestandteil der Rezeptor-Einheit sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, die ersten funktionellen Gruppen mittels gentechnischer Verfahren, biochemischer, enzymatischer und/oder chemischer Derivatisierung oder chemischer Syntheseverfahren in die Rezeptoreinheit einzuführen. Beispielsweise können unnatürliche Aminosäuren durch gentechnische Verfahren oder während einer chemischen Proteinsynthese in die Rezeptor-Einheit ein- gefügt werden, beispielsweise zusammen mit Spacern oder Linkern. Derartige unnatürliche Aminosäuren sind Verbindungen, die eine Aminosäurefunktion und einen Rest R aufweisen und nicht über den natürlich vorkommenden genetischen Code definiert sind, wobei diese Aminosäuren in bevorzugter Weise eine Thiol-Gruppe aufweisen. Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, eine natürlicherweise vorkommende Aminosäure, beispielsweise Lysin, zu modifizieren, beispielsweise durch Derivatisierung ihrer Seitenkette, insbesondere deren primäre Amino-Gruppe mit der Carbonsäurefunktion von Lävu- linsäure.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können funktionelle Gruppen durch Modifikation in die Rezeptor-Einheit eingeführt werden, wobei der Rezeptor-Einheit Tags, also Markierungen, hinzugefügt werden, vorzugsweise an den C- Terminus oder den N-Terminus. Diese Tags können jedoch auch intramolekular angeordnet sein. Insbesondere ist vorgesehen, dass ein Protein-Rezeptor dadurch modifiziert wird, dass mindestens ein Strep-Tag, beispielsweise ein Strep-Tag I oder Strep-Tag II oder Bio- tin, zum Beispiel über BirA, hinzugefügt wird. Erfindungsgemäß werden unter einem Strep-Tag auch funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente verstanden, sofern sie Streptavidin-Gruppen und/oder dessen Äquivalente binden können. Der Begriff „Streptavidin" erfasst erfindungsgemäß also auch dessen funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente. Die Oberfläche des Nanopartikels ist erfindungsgemäß dadurch charakterisiert, dass sie durch Aufbringen der die ersten funktionellen Gruppen bindenden komplementären zweiten funktionellen Gruppen modifiziert ist. Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die funktionellen Gruppen unter Verwendung von Standardverfahren wie Pfropf-Polymerisation, Silanisierung, chemischer Derivatisierung und ähnlicher geeigneter Verfahren auf die Nanopartikel-Oberfläche aufgebracht sind.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel-Oberfläche durch Aufbringen zusätzlicher Funktionalitäten modifiziert sein kann.
In bevorzugter Ausführungsform kann die Oberfläche der Nanopartikel chemische Verbindungen aufweisen, die eine unspezifische Adsorption von anderen Proteinen an den Nanopartikeln verhindern oder verringern. Besonders bevorzugt weist die Oberfläche Ethylen- glykol-Oligomere auf.
Erfindungsgemäß besteht auch die Möglichkeit, dass auf der Oberfläche der Nanopartikel separat oder zusätzlich lonenaustausch- Funktionen verankert sind. Dies gilt insbesondere für den Fall, dass die Analyse des erhaltenen Rezeptor-Ligand-Komplexes, insbesondere des Peptid-prasentierenden MHC-Moleküls und/oder des darin gebundenen Peptid-Fragmentes unter Verwendung von MALDI- Verfahren analysiert werden soll. In der MALDI-Analytik ist der Salz- Gehalt der Matrix oft eine kritische Größe, da es durch lonenanlage- rung zu einer Unterdrückung der Ionisation oder zu einer Peak- Verbreiterung kommt beziehungsweise dass sich auch Störpeaks ergeben. Mit Nanopartikeln, die eine hohe lonenaustausch-Kapazität besitzen und dadurch störende Salze in der Matrix fixieren, lässt sich dieses Problem umgehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell- Epitopen ist vorgesehen, dass die bevorzugt vorhandene zweite Rezeptor-Einheit vor Durchführung der kompetitiven Bindungsreaktion frei in Lösung vorliegt, insbesondere bei MHC I-Molekülen ß-2-Mikro- globulin. Das heißt, in dieser bevorzugten Ausführungsform, in der eine zweite Rezeptor-Einheit eingesetzt wird, enthält der zur Durch- führung der erfindungsgemäßen kompetitiven Bindungsreaktion verwendete Puffer sowohl die zweite Rezeptor-Einheit als auch die Population der Peptidfragmente des Protein-Antigens. Die Nanopartikel mit der immobilisierten ersten Rezeptor-Einheit, wobei die Immobilisierung durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche erfolgt, werden dann zu dem die zweite Rezeptor- Einheit und die Peptidfragment-Population enthaltenden Puffer gegeben und in diesem inkubiert, wobei die erste Rezeptor-Einheit, die zweite Rezeptor-Einheit und das mindestens eine Peptidfragment mit Affinität zu den beiden Rezeptor-Einheiten beziehungsweise dem durch die beiden Rezeptor-Einheiten gebildeten Rezeptor oder Re- zeptor-Dimer einen Rezeptor-Ligand-Komplex, insbesondere ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül bilden können. Der gebildete Rezeptor-Ligand-Komplex ist dabei über die immobilisierte erste Re- zeptor-Einheit an den Nanopartikeln immobilisiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T- Zell-Epitopen ist vorgesehen, das die zweite Rezeptor-Einheit zu- sammen mit der ersten Rezeptor-Einheit vor Durchführung der kompetitiven Bindungsreaktion in Form eines den Rezeptor, insbesondere ein MHC-Molekül, bildenden Dimers an den Nanopartikeln immobilisiert wird. In dieser Ausführungsform ist vorgesehen, dass die zweite Rezeptor-Einheit mindestens eine dritte funktionelle Gruppe aufweist und die Oberfläche des Nanopartikels mindestens eine komplementäre, die dritte funktionelle Gruppe bindende vierte funktionelle Gruppe aufweist. Vorzugsweise werden beide Rezeptoreinheiten, die das Rezeptor-Dimer bilden, gerichtet und unter Beibehal- tung der biologischen Aktivität des Rezeptors an dem Nanopartikel immobilisiert.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „gerichtet immobilisiert" oder „gerichtete Immobilisierung", dass ein Molekül, insbesondere das Rezeptor-Dimer an definierten Positionen innerhalb der beiden Rezeptor-Einheiten dergestalt an einem Nanopartikel immobilisiert ist, dass die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderlichen Domäne(n) des Rezeptors gegenüber dem nicht-immobilisierten Zustand nicht verändert ist und dass diese Rezeptor-Domäne(n), insbesondere die Bindungstasche zur Bindung eines geeigneten Peptides, bei Kontakt mit geeigneten Peptiden für diese frei zugänglich ist/sind. „Gerichtet immobilisiert" bedeutet auch, dass die Fixierung der beiden Rezeptor-Einheiten, die das Rezeptor-Dimer bilden, so erfolgt, dass der immobilisierte Rezeptor bei einer späteren Verwendung in einer zel- lulären beziehungsweise zellähnlichen Umgebung durch Proteindegradierende Enzyme nicht oder nur sehr langsam degradiert werden kann. Das heißt, dass das immobilisierte Rezeptor-Dimer auf der Oberfläche der Nanopartikel so ausgerichtet ist, dass es so wenig wie möglich Angriffspunkte für Proteasen bietet. „Beibehaltung der biologischen Aktivität" bedeutet, dass die den Rezeptor bildenden Rezeptor-Einheiten nach Immobilisierung an der Oberfläche eines Nanopartikels die gleichen oder nahezu gleichen biologischen Funktionen in zumindest ähnlichem Ausmaß ausüben können wie die gleichen Rezeptor-Einheiten oder der durch beide Einheiten gebildete Rezeptor im nicht-immobilisierten Zustand unter geeigneten in vitro-Bedingungen beziehungsweise die gleichen Rezeptor-Einheiten oder der gleiche Rezeptor in ihrer/seiner natürlichen zellulären Umgebung.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Dimer" oder „Rezeptor-Dimer" eine Verbindung verstanden, die durch Verknüpfung von zwei Untereinheiten oder Einheiten gebildet wird. Bei den zwei verknüpften Rezeptor-Untereinheiten handelt es sich um unterschiedliche Moleküle, die sich sowohl bezüglich ihrer Zusammensetzung, das heißt Aminosäuresequenz, als auch bezüglich ihrer Länge unterscheiden können. Vorzugsweise ist bei dem immobiliserten Rezeptor-Dimer jede Rezeptor-Untereinheit oder Rezeptor-Einheit an der Oberfläche des Nanopartikels gebunden. Erfindungsgemäß ist auch vorgesehen, dass nur eine Rezeptor-Einheit des Rezeptor-Dimers über eine kovalente Bindung zwischen der ersten funktionellen Gruppe und der zweiten funktionellen Gruppe am Nanopartikel fixiert ist.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die dritte funktionelle Gruppe der zweiten Rezeptor-Einheit von der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit verschieden ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen, Thi- ol-Gruppen, Biotin-Gruppen, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag I- Gruppen, Strep-Tag Il-Gruppen, Histidin-Tag-Gruppen und FLAG- Tag-Gruppen. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die dritte funktionelle Gruppe ein natürlicher Bestandteil der zweiten Rezeptor- Einheit oder mittels gentechnischer Verfahren, enzymatischer Verfahren und/oder chemischer Derivatisierung in die zweite Rezeptor- Einheit eingeführt wird.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die vierte funktionelle Gruppe auf der Nanopartikel-Oberfläche von der die erste funktionelle Gruppe bindenden zweiten funktionellen Gruppe der Nanopartikel verschieden ist. Die vierte funktionelle Gruppe, also die funktionelle Gruppe auf der Oberfläche des Nanopartikels, ist erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Maleinimido-Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin- Gruppen, Neutravidin-Gruppen und Metallchelatkomplexen. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die vierte funktionelle Gruppe e- benso wie die zweite funktionelle Gruppe mittels Propfsilanisierung, Silanisierung, chemischer Derivatisierung oder ähnlicher geeigneter Verfahren auf die Nanopartikel-Oberffläche aufgebracht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die erste und zweite Rezeptor-Einheit natürlicherweise vor- kommende oder mittels gentechnischer Verfahren oder chemischer Syntheseverfahren hergestellte Moleküle, insbesondere Ketten eines MHC-Moleküls, sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse I. Erfindungsgemäß bevorzugt han- delt es sich bei der ersten Rezeptor-Einheit um eine schwere Kette von etwa 45 kDa und der zweiten Rezeptor-Einheit um eine leichte Kette von etwa 12 kDa oder bei der ersten Rezeptor-Einheit um eine leichte Kette von etwa 12 kDa und der zweiten Rezeptor-Einheit um eine schwere Kette von etwa 45 kDa. Selbstverständlich können auch Modifikationen, Mutationen oder Varianten dieser Ketten eingesetzt werden, zum Beispiel verkürzte Formen dieser Ketten, zum Beispiel solche, denen die Transmembranregion fehlt. Derartige truncierte Formen können zum Beispiel schwere Ketten ohne Transmembranregion mit einem Molekulargewicht von 35 kDa sein. Wenn also erfindungsgemäß die erste und die zweite Rezeptor- Einheit einen MHC-Komplex der Klasse I bilden können, können sie ein Peptid-Fragment von etwa 8 bis 18, vorzugsweise etwa 8 bis 10 Aminosäuren in der kompetitiven Bindungsreaktion binden und so ein Peptid-präsentierender Rezeptor bilden. Vorzugsweise handelt es sich bei der schweren Kette um ein HLA-A-, HLA-B- oder HLA-C- Monomer und bei der leichten Kette um ß-2-Microglobulin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse II. Erfindungsgemäß bevorzugt handelt es sich bei der ersten Rezeptor-Einheit um eine α-Kette von etwa 34 kD und bei der zweiten Rezeptor-Einheit um eine ß- Kette von etwa 30 kD oder bei der ersten Rezeptor-Einheit um eine ß-Kette von etwa 30 kD und der zweiten Rezeptor-Einheit um eine α- Kette von etwa 34 kD. Vorzugsweise handelt es sich bei der α-Kette und der ß-Kette um HLA-DR-, HLA-DQ- oder HLA-DP-Monomere. Erfindungsgemäß können auch Mutationen, Modifikationen oder Varianten davon eingesetzt werden. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass bei Verwendung der α-Kette und der ß-Kette das zu analysierende Peptid-Fragment von einem exogenen Protein-Antigen abstammt, Wenn also erfindungsgemäß die erste und die zweite Rezeptor-Einheit einen MHC-Komplex der Klasse II bilden, können sie ein Peptid-Fragment von etwa 8 bis 18, vorzugsweise etwa 8 bis 10 Aminosäuren in der kompetitiven Bindungsreaktion binden und so ein Peptid-präsentierender Rezeptor bilden. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die erste und die zweite Rezeptor-Einheit natürlicherweise vorkommende oder mittels gentechnischer Verfahren oder chemischer Syntheseverfahren hergestellte Ketten sind.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Population von Peptid- Fragmenten des zu analysierenden Protein-Antigens mittels enzyma- tischer Protein-Spaltung, gentechnischer Verfahren oder chemischer Syntheseverfahren hergestellt wird.
In einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die so erhaltenen Peptid-Fragmente der hergesteiften Population die gesamte Aminosäuresequenz des Proteins-Antigens vollständig repräsentieren. In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Peptidfragmente der Population die Aminosäure- sequenz des Protein-Antigens nur teilweise repräsentieren. Dabei handelt es sich insbesondere um Peptid-Fragmente, die, wie mittels eines Computer-Algorithmus bestimmt, potentielle T-Zell-Epitope darstellen. Erfindungsgemäß können zur Vorhersage potentieller T- Zell-Epitope Computer-Algorithmen wie SYFPEETHI (Rammensee et al., 1999) und HLA.BIND (Parker et al., 1994) eingesetzt werden. Wenn es sich bei dem Rezeptor um ein MHC-Molekül vom Typ I handelt, ist vorgesehen, dass die Peptid-Fragmente der herzustellenden Population eine Länge von 8 bis 10 Aminosäuren aufweisen. Handelt es sich hingegen bei dem Rezeptor um ein MHC-Molekül vom Typ II, weisen die Peptid-Fragmente der herzustellenden Population vorzugsweise eine Länge von 15 bis 24 Aminosäuren auf. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Peptid-Fragmente der Population mit einem Marker und/oder einer fünften funktionellen Gruppe versehen werden. Der Marker dient insbesondere zum Nachweis der Peptid-Fragmente. Bei dem Marker. kann es sich bei- spielsweise um einen Fluoreszenzmarker oder einen radioaktiven Marker handeln. Die fünfte funktionelle Gruppe der Peptid- Fragmente dient vorzugsweise zur Isolierung und/oder Aufreinigung der Peptidfragmente. Beispielsweise kann das im Peptid- prasentierenden MHC-Molekül gebundene Peptid-Fragment nach Freisetzung aus dem Komplex durch Bindung der fünften funktionellen Gruppe an komplementäre sechste funktionelle Gruppen an geeignete Nanopartikel immobilisiert und so von den übrigen Bestandteilen des Komplexes abgetrennt werden. Die fünfte funktionelle Gruppe ist vorzugsweise von der ersten, zweiten, dritten und/oder vierten funktionellen Gruppe verschieden und kann mit diesen keine Bindung eingehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Immobilisierung der ersten Rezeptor-Einheit oder die Immobilisierung der ersten und zweiten Rezeptor-Einheit an die Nanopartikel durch eine Inkubation der Rezeptor-Einheit(en) mit den Nanopartikeln in einen PBS-Puffer über einen Zeitraum von einer Stunde bis vier Stunden, vorzugsweise zwei Stunden, bei Raumtemperatur in einer Schüttelvorrichtung, wobei Nanopartikel mit immobilisierten ersten Rezeptor-Einheiten oder Nanopartikel mit immobilisierten ersten und zweiten Rezeptor-Einheiten erhalten werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Immobilisierung von Rezeptor-Einheiten an die Nanopartikel auch dadurch erfolgen, dass unter Verwendung eines Peptides bekannter Sequenz und geeigneter Länge, von dem bekannt ist, dass es an den verwendeten Rezeptor, also das verwendete MHC-Molekül binden kann, sowie der ersten Rezeptor-Einheit und der zweiten Rezeptor- Einheit in Lösung ein Peptid-präsentierender Rezeptor hergestellt wird. Der so hergestellte Peptid-präsentierende Rezeptor wird dann an den Nanopartikeln immobilisiert und die dabei erhaltenen Nanopartikeln mit den immobilisierten Peptid-prasentierenden Rezeptor werden dann einer Behandlung zur Entfernung von mindestens dem gebundenen Peptid unterworfen, so dass Nanopartikel mit einer oder mehreren immobilisierten Rezeptor-Einheiten erhalten werden. Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass der Peptid- präsentierende Rezeptor durch Inkubation der ersten Rezeptor- Einheit, der zweiten Rezeptor-Einheit und des eingesetzten Peptides in einem Puffer, enthaltend 100 mfvl Tris, 2 mM EDTA, 400 mM L- Arginin, 5 mM reduziertes Glutathion und 0,5 mM oxidiertes Glu- tathion über einen Zeitraum von mehr als 36 Stunden, vorzugsweise 48 Stunden, bei einer Temperatur von weniger als 20°C, vorzugsweise 10°C, hergestellt wird.
Wird zur Herstellung des Peptid-prasentierenden Rezeptors eine erste Rezeptor-Einheit mit ersten funktionellen Gruppen und eine zweite Rezeptor-Einheit, die keine funktionellen dritten Gruppen enthält, verwendet, wird der in Lösung hefgestellte Peptid- präsentierende Rezeptor nur durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Grup- pe der Nanopartikel an den Nanopartikeln immobilisiert. Werden hingegen zur Herstellung des Peptid-prasentierenden Rezeptors in Lösung eine erste Rezeptor-Einheit mit ersten funktionellen Gruppen und eine zweite Rezeptor-Einheit mit dritten funktionellen Gruppen eingesetzt, so erfolgt die Immobilisierung des Rezeptor-Ligand- Komplexes an die Nanopartikel über die Bindung zwischen der ersten und zweiten funktionellen Gruppe und die Bindung der dritten und vierten funktionellen Gruppe.
Nach Immobilisierung des Peptid-prasentierenden Rezeptors an den Nanopartikeln werden die so erhaltenen Nanopartikel mit dem immobilisierten Rezeptor-Ligand-Komplex mit einem Stripping-Puffer, pH-Wert 3,0, enthaltend 50 mM Natriumeitrat, über einen Zeitraum von weniger als 20 Sekunden, vorzugsweise 10 Sekunden, behandelt. Erfindungsgemäß wird dabei im Fälle, dass der Rezeptor- Ligand-Komplex nur durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe an die zweite funktionelle Gruppe immobilisiert ist, bei der Behandlung der erhaltenen Nanopartikel neben dem gebundenen Peptid auch die zweite Rezeptor-Einheit von den Nanopartikeln entfernt, so dass ein Nanopartikel mit der immobilisierten ersten Rezeptor- Einheit erhalten wird. Im Falle, dass der Peptid-präsentierende Rezeptor durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nanopartikel und Bindung der dritten funktionellen Gruppe der zweiten Rezeptor- Einheit an die vierte funktionelle Gruppe der Nanopartikel an den Nanopartikeln immobilisiert ist, wird bei der Behandlung der erhaltenen Nanopartikel mit dem Stripping-Puffer nur das gebundene Peptid von den Nanopartikeln entfernt. Dabei werden also Nanopartikel mit der immobilisierten ersten und zweiten Rezeptor-Einheit erhalten. Die so hergestellten Nanopartikel, die entweder die immobilisierte erste Rezeptor-Einheit oder die immobilisierte erste und zweite Rezeptor-Einheit enthalten, können dann, gegebenenfalls nach einer Äufreinigung, beispielsweise mittels mindestens einer Zentrifugation und mindestens eines Waschvorganges, vom Puffer abgetrennt und erneut in einem geeigneten Puffer suspendiert werden. Die so erhal- tenen Nanopartikel können zur Durchführung der kompetitiven Bindungsreaktionen der hergestellten Population von Peptidfragmenten eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die kompetitive Bindung der hergestellten Peptidfragment-Population an die Nanopartikel, die die erste oder die erste und zweite immobilisierte Rezeptor-Einheit aufweisen, mittels Inkubation der Peptidfragment-Population mit den Nanopartikeln in einem PBS-Puffer über einen Zeitraum von 2 Stunden bis 6 Stunden, vorzugsweise 4 Stunden, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 39°C, vorzugsweise 37°C, durchgeführt. Wird. Falls die Nanopartikel nur die immobilisierte erste Rezeptor- Einheit aufweisen, enthält der zur kompetitiven Bindung verwendete PBS-Puffer auch die zweite Rezeptor-Einheit.
Nach Bindung des oder der Peptid-Fragmente mit Affinität zu einer oder den beiden Rezeptor-Einheiten wird ein immobilisierter Rezeptor-Ligand-Komplex erhalten, der dann mittels einer Zentrifugation und mindestens eines Waschvorganges vom Puffer und den nicht gebundenen Peptid-Fragmenten der Population abgetrennt und erneut in einem Puffer suspendiert wird.
Anschließend erfolgt erfindungsgemäß die Analyse des erhaltenen Peptid-prasentierenden Rezeptors und/oder des gebundenen Pep- tid-Fragmentes. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Suspension der Nanopartikel, die den immobilisierten Peptid- prasentierenden Rezeptor mit dem gebundenen Peptid aufweisen, mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-Ionisations- (MALDI)- Verfahren analysiert werden. Bei den MALDI-Verfahren handelt es sich um massenspektrometri- sche Verfahren. Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren zur Strukturaufklärung von Substanzen, wobei atomare und molekulare Teilchen entsprechend ihrer Masse abgetrennt werden. Sie beruht auf einer Reaktion zwischen Molekülen und Elektronen oder Photonen. Durch Beschuss der Probe mit Elektronen entstehen infolge der Abspaltung von Elektronen positive Molekülionen, die anschließend in verschiedene ionische, radikalische und/oder neutrale Fragmente zerfallen. Molekülionen und Fragmente werden in geeigneten Trenn- Systemen nach der Größe der Massezahl aufgetrennt. Bei einer Massenspektrometrie werden also die aufgrund chemischer Zerfallsreaktionen infolge eines lonisationsprozesses entstehenden Molekülionen beziehungsweise Fragmente zur Strukturaufklärung von Stoffen herangezogen. Ein erfindungsgemäß bevorzugt eingesetztes MALDI-Verfahren ist das MALDI-TOF-MS-Verfahren (Matrix-unter- stützte Laser-Desorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie). Die Hauptvorteile dieses Verfahrens umfassen die äußerst schnelle positive Identifizierung eines zu analysierenden Stoffes, beispielsweise eines Proteins oder Peptides, durch dessen Masse- zu La- dungs-Verhältnis (m/z) und die äußerst geringe Nachweisgrenze, die im Femtomol-Bereich oder darunter liegt.
Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die erhaltenen Nanopartikel, beispielsweise in Form einer Suspension, nach Zentri- fugieren und Waschen auf einem MALDI-Probenträger oder MALDI- Target abgeschieden und analysiert werden. Dabei kann eine im Verlauf des MALDI-Verfahrens, insbesondere MALDI-TOF-MS- Verfahrens eingesetzte Matrix vor oder nach dem Abscheiden der Nanopartikel-haltigen Suspension oder gemeinsam damit auf den MALDI-Probenträger aufgetragen werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das in dem immobilisierten Rezeptor-Ligand-Komplex gebundene mindestens eine Peptid-Fragment aus dem Rezeptor herausgelöst, isoliert und analysiert wird. Beispielsweise können die Nano- partikel, die den immobilisierten Rezeptor mit dem mindestens einen gebundenen Peptid-Fragment aufweisen, zur Freisetzung des Pep- tid-Fragmentes in einem Stripping-Puffer, pH-Wert 3,0, enthaltend 50 mM Natriumeitrat, über einen Zeitraum von weniger als 20 Sekunden, vorzugsweise 10 Sekunden, behandelt werden. Erfindungs- gemäß besteht auch die Möglichkeit, dass das mindestens eine Peptid-Fragment, falls es eine fünfte funktionelle Gruppe aufweist, unter Verwendung von Nanopartikeln isoliert und aufgereinigt wird. In diesem Fall enthalten diese Nanopartikel eine die fünfte funktionelle Gruppe bindende sechste funktionelle Gruppe, so dass die Möglich- keit gegeben ist, die freigesetzten Peptid-Fragmente spezifisch aus einer wässrigen Lösung oder Suspension zu isolieren. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass das mindestens eine isolierte Peptid- fragment anschließend sequenziert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptid-Impfstoffes gegen ein Protein-Antigen, insbesondere gegen das Protein-Antigen exprimierende oder präsentierende Zellen oder biologische Materialien, wobei die Aminosäuresequenz eines T-Zell-Epitopes des Protein-Antigens in vitro identifiziert wird, ein Peptid mit der identifizierten Aminosäuresequenz hergestellt wird und in bevorzugter Ausführung danach unter Verwendung des hergestellten Peptides und einer ersten und gegebenenfalls zweiten Rezeptor-Einheit, insbesondere einer ersten und zweiten Kette eines MHC-Moleküs, ein Rezeptor-Ligand-Komplex, insbesondere ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül hergestellt wird, welches als Impfstoff eingesetzt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst
a) die Bereitstellung einer Population von Peptid-Fragmenten des Protein-Antigens,
b) die Bereitstellung von Nanopartikeln, die an ihrer Oberfläche mindestens eine erste immobilisierte Kette eines MHC- Moleküls aufweisen, wobei die Kette eine die Bildung eines MHC-Moleküls ermöglichende Konformation aufweist,
c) die Durchführung einer kompetitiven Bindung der Peptidfrag- ment-Population an die an den Nanopartikeln immobilisierte erste Kette, optional und vorzugsweise in Gegenwart einer zweiten Kette eines MHC-Moleküls, wobei das Peptidfragment mit Affinität, insbesondere der größten Affinität zu der ersten Kette, insbesondere zu den beiden Ketten des MHC- Moleküls, gegebenenfalls zusammen mit der zweiten Kette, an die erste Kette bindet und ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül erhalten wird, und
d) die Isolierung des Peptid-Fragmentes aus dem MHC-Molekül und Bestimmung seiner Aminosäuresequenz zum Erhalt des Peptid-Impfstoffes, der in Form des Peptidfragmentes selbst oder seines MHC-Komplexes eingesetzt werden kann.
Optional können sich daran die folgenden Schritte anschließen
1) gentechnische Herstellung oder chemische Synthese eines Peptids auf der Basis der bestimmten Aminosäu- resequenz des Peptid-Fragmentes in geeigneten Mengen,
2) gentechnische Herstellung oder chemische Synthese der ersten und zweiten Kette in geeigneten Mengen,
3) Herstellung von Peptid-prasentierenden MHC-
Molekülen in geeigneten Mengen durch gemeinsame Inkubation der ersten Kette, der zweiten Kette und des hergestellten Peptids, und
4) Herstellung eines Peptid-Impfstoffes in Form eines Ly- ophilisats oder einer wässrigen kolloidalen Lösung oder
Suspension der Peptid-prasentierenden MHC- Moleküle.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Impfstoff" eine Zusammensetzung zur Erzeugung einer Immunität zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krankheitszuständen verstanden. Impfstoffe sind daher Arzneimittel, die Antigene enthalten, und die dazu bestimmt sind, bei Mensche oder Tieren zur Erzeugung von spezifischen Abwehr- und Schutzstoffen mittels Impfen angewandt zu werden. Impfstoffe dienen zur aktiven Bildung von Antikör- pern.
Erfindungsgemäß ist dabei vorgesehen, dass die Population von Peptid-Fragmenten des Protein-Antigens mittels enzymatischer Protein-Spaltung, gentechnischer Verfahren oder chemischer Syntheseverfahren hergestellt wird. In bevorzugter Ausführungsform repräsen- tieren die in der Peptid-Population enthaltenen Peptide die gesamte Aminosäuresequenz des Protein-Antigens vollständig. In einer alter- nativen Ausführungsform repräsentieren die in der. Peptid-Population enthaltenen Peptidfragmente die Aminosäuresequenz des Protein- Antigens nur teilweise, wobei die Peptid-Fragmente der Population vorzugsweise solche Aminosäuresequenzen aufweisen, die mittels eines Computer-Algorithmus bestimmte potentielle T-Zell-Epitope darstellen. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Peptid- Fragmente, wenn das herzustellende MHC-Molekül ein MHC- Molekül Typ I ist, eine Länge von 8 bis 10 Aminosäuren aufweisen. Wenn das herzustellende MHC-Molekül ein MHC-Molekül Typ II ist, weisen die Peptid-Fragmente vorzugsweise eine Länge von 15 bis 24 Aminosäuren auf.
Wenn das herzustellende MHC-Molekül ein MHC-Molekül Typ I ist, handelt es sich bei der ersten Kette um eine schwere Kette von etwa 45 kDa und bei der zweiten Kette um eine leichte Kette von etwa 12 kDa. Insbesondere handelt es sich in diesem Fall bei der ersten Kette um ein HLA-A-, HLA-B- oder HLA-C-Monomer und bei der zweiten Kette um ß-2-Mikroglobulin.
Wenn das herzustellende MHC-Molekül ein MHC-Molekül Typ II ist, handelt es sich erfindungsgemäß bei der ersten Kette um eine α - Kette von etwa 34 kDa und bei der zweiten Kette um eine ß-Kette von etwa 30 kDa. Vorzugsweise handelt es sich In diesem Fall bei der ersten Kette und der zweiten Kette um HLA-DR-, HLA-DQ- oder HLA-DP-Monomere. Sowohl die Ketten der MHC-Typ I- als auch der MHC-Typ Il-Klasse können in mutierter, abgewandelter, modifizier- ter, insbesondere verkürzter Form eingesetzt werden.
Vorzugsweise enthält die erste Kette eine erste funktionelle Gruppe, so dass die erste Kette durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe an einer auf der Oberfläche der Nanopartikel vorhandene zweite funktionelle Gruppe an der Oberfläche der Nanopartikel immobilisiert wird. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die funktionelle Gruppe ein natürlicher Bestandteil der ersten Kette ist oder mit- tels gentechnischer Verfahren, biochemischer, enzymatischer und/oder chemischer Derivatisierung oder chemischer Syntheseverfahren in die erste Kette eingeführt ist. Bei der ersten funktionellen Gruppe handelt es sich vorzugsweise um eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen Thiol-Gruppen, Biotin-Gruppen, His-Tag, Flag-Tag, Strep-Tag I- Gruppen, Strep-Tag Il-Gruppen, Histidin-Tag-Gruppen und Flag- Tag-Gruppen. Die an der Oberfläche der Nanopartikel vorhandene zweite funktionelle Gruppe ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Maleini- mido-Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen, Neutravidin- Gruppen und Metallgelatkomplexen. Dabei kann die zweite funktionelle Gruppe mittels Pfropfsilanisierung, Silanisierung, chemischer Derivatisierung oder ähnlicher geeigneter Verfahren auf die Oberfläche der Nanopartikel aufgebracht sein. Bei den einzusetzenden Na- nopartikeln handelt es sich vorzugsweise um solche, die einen Kern aus einem chemisch inerten Material, vorzugsweise Silika, und einen Durchmesser von 30 bis 400 nm, vorzugsweise 50 nm bis 150 nm, aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die an ihrer Oberflä- ehe eine erste immobilisierte Kette aufweisende Nanopartikel durch folgende Schritte erhalten:
a) Inkubation der die erste funktionelle Gruppe enthaltende erste Kette, der zweiten Kette und eines Peptids, von dem die Aminosäu- resequenz und die Fähigkeit zur Bildung eines MHC-Moleküls unter geeigneten Bedingungen bekannt ist,
b) Inkubation des gebildeten MHC-Moleküls mit Nanopartikeln, deren Oberfläche eine die erste funktionelle Gruppe bindende zweite funk- tionelle Gruppe aufweist, unter geeigneten Bedingungen zur Immobilisierung des MHC-Moleküls an den Nanopartikeln,
c) Behandlung des Nanopartikels mit den immobilisierten MHC- Molekülen mit einem geeigneten Puffer zur Entfernung der zweiten Kette und des Peptids bekannter Aminosäuresequenz aus dem MHC-Molekül, und
d) Aufreinigung der die erste immobilisierte Kette aufweisenden Nanopartikel.
Erfindungsgemäß ist bevorzugt vorgesehen, dass die kompetitive Bindung der Peptidfragment-Population an die die erste immobilisier- te Kette aufweisende Nanopartikels durch Inkubation der Peptid- Fragment-Population mit den Nanopartikeln in einem geeigneten Puffer unter geeigneten Bedingungen erfolgt. Nach Bindung des mindestens einen Affinität aufweisenden Peptidfragmentes der Population und gegebenenfalls der zweiten Kette unter Bildung eines immobilisierten MHC-Moleküls werden die Nanopartikel mit den immobilisierten MHC-Molekül mittels Zentrifugation und Waschen vom Puffer und den nicht gebundenen Peptid-Fragmenten abgetrennt. Anschließend werden die das immobilisierte MHC-Molekül aufweisende Nanopartikel mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise ei- nem Stripping-Puffer, zur Freisetzung des gebundenen Peptid- Fragmentes behandelt. Das freigesetzte Peptid-Fragment wird dann isoliert und seine Aminosäuresequenz ermittelt. Auf der Basis der ermittelten Aminosäuresequenz kann das gebundene Peptid-Fragment anschließend in großen Mengen, beispielsweise unter Verwendung gentechnischer Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann auf der Basis der ermittelten Aminosäure- sequenz des freigesetzten Peptid-Fragmentes eine die ermittelte Aminosäuresequenz codierende Nucleinsäure erzeugt und in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert werden. Dieser Vektor wird dann in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der Aminosäuresequenz überführt. Dadurch kann in der Wirtszelle ein Peptid in größe- ren Mengen exprimiert und daraus isoliert werden.
Auf der Basis der ermittelten Aminosäuresequenz des freigesetzten Peptid-Fragmentes lässt sich auch eine größere Peptid-Menge auf synthetischem Wege herstellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Qualitäts- kontrolle von Rezeptor-Ligand-Komplexen und/oder deren Bestandteilen, umfassend die Herstellung oder Bereitstellung eines Rezeptor-Ligand-Komplexes in Lösung aus mindestens einer Rezeptor- Einheit, vorzugsweise zwei Rezeptor-Einheiten, wobei mindestens eine Rezeptor-Einheit eine erste funktionelle Gruppe aufweist, und eines Liganden, die Immobilisierung des Rezeptor-Ligand- Komplexes an Nanopartikeln, die an ihrer Oberfläche mindestens eine die erste funktionelle Gruppe bindende zweite funktionelle Gruppe aufweisen, und Analyse der den immobilisierten Rezeptor- Ligand-Komplex aufweisenden Nanopartikel unter Verwendung ei- nes MALDI-Verfahrens.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Rezeptor um ein MHC- Molekül, bei dem der Liganden um ein an den Rezeptor bindendes Peptid bekannter Sequenz und definierter Länge .und bei dem Re- zeptor-Ligand-Komplex um ein Peptid-präsentierendes MHC- Molekül.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Rezeptor um ein MHC-Molekül der Klasse I, wobei die Rezeptor-Einheiten eine schwere Kette von etwa 45 kDa und die Rezeptor-Einheit eine leichte Kette von etwa 12 kDa sind. Dabei ist die schwere Kette ein HLA- A-, HLA-B- oder HLA-C-Monomer und die leichte Kette ß-2- Microglobulin.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah- rens ist der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse II, wobei eine Rezeptor-Einheit eine α-Kette von etwa 34 kDa und eine Rezeptor- Einheit eine ß-Kette von etwa 30 kDa ist. Dabei sind die α-Kette und die ß-Kette HLA-DR-, HLA-DQ- oder HLA-DP-Monomere.
Zur Analyse wird erfindungsgemäß ein MALDI-Verfahren, insbeson- dere ein MALDI-TOF-Verfahren eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln, die an ihrer Oberfläche mindestens eine immobilisierte Rezeptor-Einheit oder einen immobilisierten Rezeptor aufweisen, umfassend
a) Herstellung eines Rezeptor-Ligand-Komplexes durch Inkubation einer ersten Rezeptor-Einheit mit einer ersten funktionellen Gruppe, gegebenenfalls in bevorzugter Ausführungsform einer zweiten Rezeptor-Einheit, die mit der ersten Rezeptor-Einheit einen Rezeptor bilden kann, und ei- nes Liganden in Lösung,
b) Immobilisierung des gebildeten Rezeptor-Ligand- Komplexes an Nanopartikeln, die mindestens eine die erste funktionelle Gruppe bindende zweite funktionelle Gruppen an der Oberfläche aufweisen, und c) Behandlung der den immobilisierten Rezeptor-Ligand- Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem sauren Puffer zur Freisetzung mindestens des gebundenen Liganden, wobei Nanopartikel mit immobilisierten Rezeptor- Einheiten erhalten werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Immobilisierung des Rezeptor-Ligand-Komplexes an der Nanopartikel-Oberfläche auschließlich über die Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nano- partikel. In diesem Fall wird nach Behandlung der den immobilisierten Rezeptor-Ligand-Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem sauren Puffer neben dem Liganden auch die zweite Rezeptor-Einheit freigesetzt und es werden Nanopartikel mit der immobilisierten ersten Rezeptor-Einheit erhalten.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die zweite Rezeptor-Einheit eine dritte funktionelle Gruppe auf, während die Nanopartikel an ihrer Oberfläche eine die dritte funktionelle Gruppe der zweiten Rezeptor-Einheit bindende vierte funktionelle Gruppe aufweisen. Die Immobilisierung des Rezeptor- Ligand-Komplexes an den Nanopartikeln erfolgt also über die Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nanopartikel und die Bindung der dritten funktionellen Gruppe der zweiten Rezeptor-Einheit an die vierte funktionelle Gruppe der Nanopartikel. In diesem Fall wird nach Behandlung der den immobilisierten Rezeptor-Ligand-Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem sauren Puffer ausschließlich der Ligand freigesetzt und es werden Nanopartikel mit der immobilisierten ersten und zweiten Rezeptor-Einheit erhalten. Vorzugsweise liegen die erste und zweite Rezeptor-Einheit gerichtet immobilisiert vor und bilden einen Rezeptor, der einen Liganden binden kann. In bevorzugter Ausführungsform ist der Rezeptor ein MHC-Molekül, der Ligand ein an den Rezeptor bindendes Peptid bekannter Sequenz und definierter Länge und der Rezeptor-Ligand-Komplex ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül.
Insbesondere ist der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse I, der als erste Einheit eine schwere Kette von etwa 45 kDa und als zweite Rezeptor-Einheit eine leichte Kette von etwa 12 kDa aufweist oder als erste Rezeptor-Einheit eine leichte Kette von etwa 12 kDa und als zweite Rezeptor-Einheit eine schwere Kette von etwa 45 kDa. Bei der schweren Kette handelt es sich um ein HLA-A-, HLA-B- oder HLA-C-Monomer und bei der leichten Kette um b-2-Microglobulin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse II, der als erste Rezeptor- Einheit eine α-Kette von etwa 34 kDa und als zweite Rezeptor- Einheit eine ß-Kette von etwa 30 kDa aufweist oder als erste Rezeptor-Einheit eine ß-Kette von etwa 30 kDa und als zweite Rezeptor- Einheit eine α-Kette von etwa 34 kDa. Bei der α-Kette und der ß- Kette handelt es sich um HLA-DR-, HLA-DQ- oder HLA-DP- Monomere.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass sich die erste funktionelle Gruppe und die dritte funktionelle Gruppe voneinander unterscheiden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Carboxy- Gruppen, Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Biotin-Gruppen, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag I-Gruppen, Strep-Tag Il-Gruppen, Histidin- Tag-Gruppen und FLAG-Tag-Gruppen.
Erfindungsgemäß ist ebenfalls vorgesehen, dass sich die zweite funktionelle Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche, die die erste funktionelle Gruppe bindet, und die vierte funktionelle Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche, die die dritte funktionelle Gruppe bindet, voneinander unterscheiden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Maleinimido- Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen, Neutravidin- Gruppen und Metallchelatkomplex.
Vorzugsweise werden die den immobilisierten Rezeptor-Peptid- Komplex aufweisenden Nanopartikel zur Entfernung des gebundenen Peptids mit einem Stripping-Puffer, pH-Wert 3,0, enthaltend 50 mM Natriumeitrat, über einen Zeitraum von weniger als 20 s, vorzugsweise 10 s, behandelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstel- lung von Nanopartikeln mit immobilisierten Peptid-prasentierenden MHC-Molekülen, wobei Nanopartikel mit mindestens einer ersten immobilisierten Kette eines MHC-Moleküls, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln mit mindestens einer immobilisierten Rezeptor-Einheit oder mit einem immobilisierten Rezeptor hergestellt wurden, in Gegenwart einer zweiten Kette, die mit der ersten Kette ein MHC-Molekül bilden kann, mit einem Peptid, das an das MHC-Molekül binden kann, inkubiert und ein an den Nanopartikeln immobilisierter Peptid-präsentierendes MHC-Molekül erhalten wird.
Bei dem MHC-Molekül handelt es sich vorzugsweise um ein Molekül der Klasse I, wobei das Peptid eine Länge von etwa 8 bis etwa 10 Aminosäuren aufweist. Bei dem MHC-Molekül kann es sich auch um ein Molekül der Klasse II handeln, wobei das Peptid eine Länge von etwa 15 bis etwa 24 Aminosäuren aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Anreicherung und/oder Isolierung spezifischer CD4+-T-Lymphocyten oder CD8+-T-Lymphocyten aus peripheren mononuclearen Blutzellen (PBMCs), umfassend a) Herstellung von Nanopartikeln mit immobilisierten Peptid- prasentierenden MHC-Molekülen, wobei das Peptid ein T- Zell-Epitop ist
b) Isolierung peripherer mononucleärer Blutzellen aus einem geeigneten Ausgangsmaterial,
c) Inkubation der isolierten mononucleärer Blutzellen mit den die immobilisierten Peptid-prasentierenden MHC-Molekülen aufweisenden Nanopartikeln, wobei T-Lymphozyten an das T-Zell-Epitop der immobilisierten Peptid-prasentierenden MHC-Moleküle binden,
d) Abtrennung der Nanopartikel mit den an die immobilisierten Peptid-prasentierenden MHC-Molekülen gebundenen T- Lymphozyten von den nicht-gebundenen peripheren mononuclearen Zellen.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die gebundenen T- Lymphozyten von den Nanopartikeln anschließend freigesetzt und in vitro clonal vermehrt werden. Die freigesetzten und/oder clonal vermehrten T-Lymphozyten können dann beispielsweise in einen Organismus eingeführt werden.
In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist das Peptid- präsentierende MHC-Molekül ein Molekül der Klasse I und die gebundenen T-Lymphozyten sind CD8+-T-Lymphocyten. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid-präsentierende MHC-Molekül ein Molekül der Klasse II, wobei die gebundenen T- Lymphozyten CD4+-T-Lymphocyten sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Primen und/oder Restimulieren einer CD4+-T- und/oder CD8+-T-Lympho- cyten-Reaktion in vitro, umfassend a) Identifizierung eines T-Zell-Epitops und Bestimmung von dessen Aminosäuresequenz,
b) Herstellung einer Nucleinsäure, die ein Peptid mit der Aminosäuresequenz des T-Zell-Epitops codiert,
c) Einführung der bei b) hergestellten Nucleinsäure in einen geeigneten Vektor,
d) Einführung des bei c) erhaltenen Vektors in dendritische Zellen, die gegebenenfalls aus kultivierten peripheren mononuclearen Blutzellen isoliert wurden,
e) Vermehrung der bei d) resultierenden, den Vektor aufweisenden dendritischen Zellen in vitro, und
f) Stimulation autologer CD4+ und/oder CD8+-Zellen in vitro unter Verwendung der bei d) oder e) erhaltenen dendritischen Zellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Nanopartikel, enthaltend an der Oberfläche mindestens eine Rezeptor-Einheit, insbesondere eine immobilisierte Kette eines MHC-Moleküls. Dabei kann die immobilisierte Kette durch Bindung eines Peptids von 8 bis 24 Aminosäuren und einer zweiten Kette eines MHC-Moleküls ein Peptid- präsentierendes MHC-Molekül bilden. Die MHC-Molekül-Kette ist durch Bindung einer in ihr enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisiert. Bei den erfindungsgemäßen Nanopartikeln entweder die schwere Kette oder die leichte Kette eines MHC-Moleküls der Klasse I oder entweder die α-Kette oder die ß-Kette eines MHC-Moleküls der Klasse II in immobilisierter Form. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nanopartikel mit einem immobilisierten MHC-Molekül, wobei das MHC-Molekül eine erste und zweite Kette umfasst und das MHC-Molekül durch Bindung einer in der ersten Kette enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe oder durch Bindung der in der ersten Kette enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit der an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe und Bindung einer in der zweiten Kette enthaltenen dritten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen vierten funktionellen Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisiert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Nanopartikel mit einem an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisierten Peptid- prasentierenden MHC-Molekül, wobei das Peptid-präsentierende MHC-Molekül eine erste Kette, eine zweite Kette und ein Peptid von 8 bis 24 Aminosäuren umfasst und das MHC-Molekül durch Bindung einer in der ersten Kette enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe oder durch Bindung der in der ersten Kette enthalte- nen ersten funktionellen Gruppe mit der an der Nanopartikel- Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe und Bindung einer in der zweiten Kette enthaltenen dritten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen vierten funktionellen Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisiert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Peptid-Impfstoff umfassend mindestens ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül oder das erfindungsgemäß identifizierte Peptidfragment selbst, wobei der Peptid-Impfstoff gemäß erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. In einer Ausführungsform kann der Peptid-Impfstoff als Lyophylisat vorliegen. In einer anderen Ausführungsform liegt der Impfstoff als wässrige kolloidale Lösung oder Suspension vor. Der erfindungsgemäße Peptid-Impfstoff kann zusätzlich mindestens ein Adjuvans enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen Kit zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein- Antigens in vitro, umfassend einen Behälter mit eienr Suspension von Nanopartikeln mit einem immobilisierten MHC-Molekül. In einer weiteren Ausführungsform kann der Kit einen Behälter mit einer Suspension von Nanopartikeln mit daran immobiliserten ersten Ketten eines MHC-Moleküls sowie einen Behälter mit einem Lyophylisat einer zweiten Kette umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nanopartikels zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein-Antigens in vitro.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nanopartikels zur Herstellung eines Peptid- Impfstoffes.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Nanopartikels zur Anreicherung und/oder Isolierung spezifischer CD4+- T-Lymphozyten oder CD8+-T-Lymphozyten in vitro.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nanopartikels zum Primen und/oder Restimulieren einer CD4+-T- oder/und CD8+-T-Lymphozyten-Reaktion in vitro. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines erfin- dungsgemäßen Peptid-Impfstoffes zur aktiven Immunisierung eines tierischen oder menschlichen Organismus gegen ein Protein- Antigen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren 1 bis 3 und Beispiele näher erläutert.
Figur 1 zeigt in schematischer Form eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen, wobei ein in Lösung hergestellter, das Peptid präsentierender HLA-A2-Komplex an Na- nopartikeln immobilisiert wird. Anschließend erfolgt eine Behandlung der den Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem sauren „Stripping"-Puffer, wobei das EBV-EBNA-6-Peptid (Position 284-293, LLDFVRFMGV) und ß2-Mikroglobulin (ß2-m) entfernt werden. Die so hergestellten Nanopartikel mit der immobilisierten HLA-Kette werden dann zur Durchführung einer kompetitiven Bindungsreaktion unter Verwendung einer Peptid-Population in Gegenwart von ß2-m eingesetzt, wobei das oder die Peptide mit Affinität an HLA und ß2-m bindet/binden, wobei ein dieses Peptid präsentierender HLA-Komplex an der Nanopartikel-Oberfläche gebildet wird. Nach Entfernung der nicht gebundenen Peptide und von überschüssigem ß2-m werden die Nanopartikel, die den immobilisierten Peptid-prasentierenden Komplex aufweisen, einer Analyse mittels MALDI-Massenspektrometrie unterworfen.
Figur 2 zeigt mittels MALDI-Massenspektrometrie erhaltene Mas- senspektrogramme von Nanopartikeln mit immobilisierten Peptid- prasentierenden HLA-Komplexen. Figur 2.1 betrifft das Peptidge- misch aus äquimolaren Mengen der in Beispiel 4 genannten 5 Pepti- de und Figur 2.2 die zwei Peptide, die nach Selektion als bindend erkannt wurden.
Figur 3 zeigt das MALDI-Spektrum aller SAV-Nanopartikel- immobilisierter molekularer Komponenten des HLA-A2-EBNA-6- Komplexes. Das Insert zeigt das MALDI-Spektrum des EBNA-6- Peptides [M+H]+ mit der Sequenz LLDFVRFMGV (theoretische mo- noisotopische Masse [M+H]+ 1196.6502 μ). Der Peak bei 11727 kennzeichnet ß2-m, die Peaks bei etwa 12900 kennzeichnen die SAV-Nanopartikel in monomerer Form und der Peak bei 34383 kennzeichnet die biotinylierte alpha-Kette.
Beispiel 1
Peptidsynthese
Peptide wurden unter Verwendung des Fmoc-Festphasen- Verfahrens auf einer kontinuierlichen MillGen 9050 Flow-Synthese- Vorrichtung (Millipore, Bedford, USA) synthetisiert. Nach RP-HPLC- Aufreinigung wurden die Peptide lyophilisiert und in PBS-Puffer in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst.
Beispiel 2
Herstellung von löslichen biotinylierten HLA-A2-Monomeren
Lösliche HLA-A*0201-Peptid-Tetramere wurden synthetisiert, wie von Altman et al., Science, 274 (1996), 94-96, beschrieben. Dabei wurden rekombinante schwere HLA- A*0201 -Ketten (Positionen 1- 276) in löslicher Form und ß-2-Mikroglobulin (ß2-m) separat in Esche- richia coli-Zellen, die mit entsprechenden Expressionplasmiden transformiert worden waren, exprimiert. Das 3'-Ende der extrazellulären Domänen der schweren HLA-A*0201 -Kette wurde mit einer Bir A-Biotinylierungssequenz modifiziert. Die Escherichia coli-Zellen, die mit den entsprechenden die HLA-A*0201 -Kette beziehungsweise ß2- m codierenden Expressionsplasmiden transformiert worden waren, wurden bis zur mid-log-Wachstumsphase kultiviert. Danach erfolgte eine Induktion mit 0,5 Isopropyl-ß-Galactosidase. Nach weiterer Kultivierung und Expression der rekombinanten Proteine wurden die Escherichia coli-Zellen geerntet und gereinigt. Nach Zellaufschluss wurden die in den Zellen enthaltenen Einschlusskörperchen isoliert, aufgereinigt und in 8 M Harnstoff, pH 8,0, solubilisiert. Die schwere HLA-A*0201 -Kette und ß2-m wurden in 100 mM Tris, 2 mM EDTA, 400 mM L-Arginin, 5 mM reduziertem Glutathion und 0,5 mM oxidier- tem Glutathion verdünnt und mit 10 μM des Peptides LLDFVRFMGV (EBV EBNA-6, Positionen 284-293) versetzt. Anschließend erfolgte eine 48-stündige Inkubation bei 10°C unter Rühren. Die gefalteten 48 kDa-Komplexe (α-Kette: etwa 35 kDa, ß2-m: etwa 12 kDa, Peptid: etwa 1 kDa) wurden mittels Ultrafiltrations-Verfahren unter Verwendung einer Membran mit einem Rückhaltevermögen von 10 kDa (Mil- lipore, Bedford, USA) aufkonzentriert und mittels HPSEC-Verfahren unter Verwendung einer Superdex G75 HiLoad 26/60-Säule (Amers- ham Pharmacia Biotech. Upsala, Schweden) und 150 mM NaCI, 20 mM Tris-HCI, pH 7,8, als Laufpuffer aufgereinigt. Nach Gelfiltration wurden die aufgereinigten Monomere mit einer Biotinligase (BirA; Avidity, Denver, USA) biotinyliert und mittels HPSEC erneut aufgereinigt. Der Komplex wurde anschließend mittels Ultrafiltration auf eine Konzentration von 1 μg/μl eingestellt. Beispiel 3
Herstellung und Charakterisierung von Streptavidin- modifizierten Nanopartikeln (SAV-Nanoperlen)
Silika-Partikel wurden, wie von Stoeber et al., J. Colt, inter. Sei., 26 (1968), 62-62, beschrieben, hergestellt. Dabei wurden kugelförmige Silika-Partikel mit einem mittleren hydrodynamischen Partikel- Durchmesser von 100 nm erhalten, wie mittels dynamischen Lichtstreuungs-Messungen mit einer Zetasiser 3000 HSA- Vorrichtung (Malvern Instruments, Herrenberg, Deutschland) be- stimmt. 500 μg der Carboxy-modifizierten Partikel wurden mit 15 μg Streptavidin (Röche, Tutzing, Deutschland) gemischt. Das immobilisierte Streptavidin wurde durch Quenchen der Fluoreszenz von Bio- tin-4-fluorescein quantifiziert. Es zeigte sich, dass die gesamten 15 μg Streptavidin an den Nanopartikeln immobilisiert waren. Etwa 57 % der theoretischen Biotin-Bindungsstellen waren an der Partikel- Oberfläche frei zugänglich. Da dsnica - 00 nM, Osπics = 4 g/ml und Mstrepta idin = 52 kDa betragen, waren an jedem Partikel etwa 730 Streptavidin-Tetramere gebunden, so dass an der Oberfläche etwa 1600 Biotin-Bindungsstellen frei zugänglich waren. Die Streptavidin- modifizierten Partikel wurden auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml in PBS eingestellt.
Beispiel 4
HLA-A2-Peptid-Selektionstest
Alle Wasch-Sch ritte der Nanopartikel wurden mittels 10-minütiger Zentrifugation bei 15000 x g bei 20°C in einer Temperaturkontrollierten Zentrifuge in 1 ,5 ml-Reaktionsgefäßen und mittels Re- Suspension der Perlen unter Verwendung einer Mikropipette durchgeführt. 55 μg SAV-Nanopartikel und 3,5 μg des löslichen HLA-A2- Komplexes, der das Peptid LLDFVRFMGV (EBV EBNA-6, Positionen 284-293) enthielt, in 20 μl PBS suspendiert. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur in einem horizontalen Schüttler inkubiert, um eine Sedimentation zu verhindern. Nach einer 10- minütigen Zentrifugation bei 20°C wurde der Überstand verworfen und die Nanopartikel wurden mit 50 μl Wasser gewaschen. Zur Freisetzung von ß2 m-Molekülen und des im Komplex enthaltenen Pepti- des LLDFVRFMGV wurden die Perlen in 150 μl „Stripping"-Puffer (50 mM Natriumeitrat, pH 3,0) 90 Sekunden inkubiert und nach Zentrifugation mit 150 μl Wasser gewaschen. Die Perlen wurden dann mit 30 μl PBS, enthaltend 1,2 μg ß2 m-Moleküle (Sigma, München, Deutschland) und ein Peptid-Gemisch, resuspendiert. Das Gemisch umfasste insgesamt 5 Peptide in einer Menge von jeweils 0,072 μg. Die 5 Peptide wiesen die Sequenzen ILMEHIHKL, DQKDHAVF, ALSDHHIYL, VITLVYEK und SNEEPPPPY auf. Nach einer vierstündigen Inkubation bei 37°C wurden die Nanopartikel mittels Zentrifugation pelletiert und nach Entfernung des Überstandes mit 50 μl PBS-Puffer und anschließend 50 μl Wasser gewaschen. Nach der letzten Zentrifugation wurden die Nanopartikel in 0,1 % Wasser/TFA (Vol./Vol.) resuspendiert und auf ein MALDI-Target transferiert. Die Analyse wurde unter Verwendung eines Voyagers DE-STR-Massenspektrometers (Applied Biosystems Foster City, USA) in positive Ion Reflectron-Betriebsweise durchgeführt. Lösungen, die Proteine und Peptide enthielten, wurden auf dem Target mit einem gleichen Matrix-Volumen unter Verwendung einer 1:20- Verdünnung einer gesättigten α -Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure oder Sinapinsäure in 30 % Acetonitril/0,3 % TFA (Vol./Vol.) gemischt. Alle MALDI-Spektren wurden unter Verwendung eines Standard- Peptidgemisches extern kalibriert.
Erfindungsgemäß wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Alle Bestandteile des biotinolierten HLA-A2-Komplexes lassen sich unter Verwendung des MALDI-TOF-Verfahren nachweisen und quantitativ bestimmen.
Vollständige Komplexe, die auf den SAV-Partikeln (SAV- Nanoperlen) über Biotin immobilisiert waren, konnten mittels MALDI- Massenspektrometrie visualisiert werden, wobei die entsprechenden Masse-Signale für die biotinylierte HLA-A2-α-Kette 34379 Da, für ß2- m-Moleküle 11727 Da, das Streptavidin-Monomer 12907 Da und für das gebundene Peptid LLDFVRFMGV 1196,63 Da betrugen (Figur 3). Unter Verwendung des MALDI-TOF-Verfahrens konnten daher einerseits sowohl die korrekten Eigenschaften des HLA-A2- Komplexes als auch die Wirksamkeit des Verfahrens zur Immobilisierung des biotinylierten Komplexes an die SAV-Nanopartikel kontrolliert werden.
HLA-A2-komplexierte SAV-Nanopartikel binden bei kompetitiver Bindung unter Verwendung eines Peptidgemisch nur die für HLA-A2 vorhergesagten Peptide.
Figur 2 zeigt die MALDI-Spektren eines Peptidgemisches umfassend zwei HLA-A2-Peptide, die binden, und drei Peptide, die nicht binden, wobei jedes Peptid etwa in einer Menge von 70 pr ol vorlag Die vorhergesagte Bindung der Peptide wurde mit dem SYFPEITHI- Programm bestimmt, wobei bei einer sehr starken Bindung eine Punktzahl von 32 für das Peptid ILMEHIHKL, bei einer starken Bin- dung eine Punktzahl von 23 für das Peptid ALSDHHIYL und für die drei nicht bindenden Proteine eine Punktzahl von 0 bestimmt wurde. Die Unterschiede der Signalintensitäten jedes Peptides in dem verwendeten Gemisch sind auf unterschiedliche lonisierungsfähigkeiten zurückzuführen. Die Identität der beobachteten Peaks wurde mittels MALDI-PSD-Sequenzierung bestätigt. Nach Selektion der Peptide mit HLA-Rezeptoren verblieben nach Behandlung, das heißt Waschen mit dem PBS-Puffer, nur die Signale für die bindenden Peptide. Das im Falle der nicht-bindenden Proteine kein Signal nachweis- bar war, zeigt, dass keine unspezifischen Wechselwirkungen auftreten. Die Spektren zeigen die monoisotopische Masse für jedes Peptid in der protonierten Form ([M+H]+) als auch das Monoisotop in Natrium-Form ([M+Na]+).

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein-Antigens in vitro, wobei eine Population von Peptid-Fragmenten des Antigens einer kompetitiven Bindung an eine erste immobilisierte Rezeptor-Einheit, vorzugsweise in Gegenwart einer zweiten Rezeptor-Einheit, die zusammen mit der ersten Rezeptor-Einheit einen Rezeptor bilden kann, unterworfen wird, wobei mindes- tens ein Peptid-Fragment mit Affinität zu dem Rezeptor an mindestens die erste, vorzugsweise an die beiden Rezeptor-Einheiten bindet, und das gebundene Peptid-Fragment anschließend isoliert und analysiert wird, umfassend
a) Immobilisierung mindestens der ersten Rezeptor-Einheit, die mindestens eine erste funktionelle Gruppe aufweist, an einem Nanopartikel, dessen Oberfläche mindestens eine die erste funktionelle Gruppe binden- de zweite funktionelle Gruppe aufweist,
b) Herstellung einer Population von Peptid- Fragmenten des Protein-Antigens, die unterschiedliche Sequenzbereiche des Protein-Antigens umfassen,
c) Durchführung einer kompetitiven Bindung der Peptidfragment-Population an die am Nanopartikel immobilisierte erste Rezeptor-Einheit, vorzugsweise in Gegenwart einer zweiten Rezeptor-Einheit, wobei min- destens ein Peptid-Fragment mit Affinität zu mindestens der ersten Rezeptor-Einheit, vorzugsweise zu beiden Rezeptor-Einheiten, gegebenenfalls zusammen mit der zweiten Rezeptor-Einheit, an die erste Rezeptor- Einheit bindet und ein an dem Nanopartikel immobilisierter Rezeptor-Peptidfragment- Ko plex erhalten wird, und
d) Analyse des immobilisierten Rezeptor- Peptidfragment-Komplexes und/oder des ge- bundenen Peptid-Fragments .
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite Rezeptor-Einheit vor Durchführung der kompetitiven Bindungsreaktion frei in Lösung vorliegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite Re- zeptor-Einheit zusammen mit der ersten Rezeptor- Einheit vor Durchführung der kompetitiven Bindungsreaktion in Form eines den Rezeptor bildenden Di- mers an dem Nanopartikel immobilisiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die zweite Re- zeptor-Einheit mindestens eine dritte funktionelle
Gruppe aufweist und die Oberfläche des Nanopartikels mindestens eine die dritte funktionelle Gruppe bindende vierte funktionelle Gruppe aufweist.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Re- zeptor gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität an dem Nanopartikel immobilisiert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Rezeptor ein Haupthistokompatibili- tätskomplex (MHC) -Molekül, der Rezeptor-Peptid- fragment-Komplex ein Peptid-präsentierendes MHC- Molekül und die erste und die zweite Rezeptor- Einheit Ketten des MHC-Moleküls sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse I ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die erste Rezeptor-Einheit eine schwere Kette von etwa 45 kDa und die zweite Rezeptor-Einheit eine leichte Kette von etwa 12 kDa ist oder die erste Rezeptor- Einheit eine leichte Kette von etwa 12 kDa und die zweite Rezeptor-Einheit eine schwere Kette von etwa 45 kDa ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wo- bei die schwere Kette ein HLA-A-, HLA-B- oder HLA-
C-Monomer und die leichte Kette ß-2-Microglobulin ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das im Peptid-prasentierenden MHC-Molekül ge- bundene Peptid-Fragment von einem endogenen Protein-Antigen' stammt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei das im Rezeptor-Peptidfragment-Komplex gebundene Peptid-Fragment etwa 8 bis 10 Aminosäuren um- fasst.
12. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse II ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die erste Rezeptor-Einheit eine α-Kette von etwa 34 kD und die zweite Rezeptor-Einheit eine ß-Kette von etwa 30 kD ist oder die erste Rezeptor-Einheit eine ß-Kette
• 5 von etwa 30 kDa und die zweite Rezeptor-Einheit eine α-Kette von etwa 34 kDa ist.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die α-Kette und die ß-Kette HLA-DR-, HLA-DQ- oder HLA- DP-Monomere sind.
10 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei das im Rezeptor-Peptidfragment-Komplex gebundene Peptid-Fragment von einem exogenen Protein- Antigen stammt.
16. Verfahren nach- einem der Ansprüche 12 bis 15, 15 wobei das im Rezeptor-Peptidfragment-Komplex gebundene Peptid-Fragment etwa 15 bis 24 Aminosäuren umfasst.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die erste und die zweite Rezeptor-Einheit na-
20 türlicherweise vorkommende oder mittels gentechnischer Verfahren oder chemischer Syntheseverfahren hergestellte Ketten sind.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die erste funktionelle Gruppe ein natürlicher Bestandteil der
25 ersten Rezeptor-Einheit oder mittels gentechnischer Verfahren, biochemischer, enzymatischer und/oder chemischer Derivatisierung oder chemischer Syntheseverfahren in die erste Rezeptor-Einheit eingeführt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die dritte funktionelle Gruppe ein natürlicher Bestandteil der zweiten Rezeptor-Einheit oder mittels gentechnischer Verfahren, biochemischer, enzymatischer und/oder chemischer Derivatisierung oder chemischer Syntheseverfahren in die zweite Rezeptor-Einheit eingeführt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei sich die erste funktionelle Gruppe und die dritte funk- tionelle Gruppe voneinander unterscheiden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Carboxy- Gruppen, Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Biotin- Gruppen, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag I-Gruppen, Strep-Tag II-Gruppen, Histidin-Tag-Gruppen und FLAG-Tag-Gruppen.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei sich die zweite funktionelle Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche, die die erste funktionelle Gruppe bindet, und die vierte funktionelle Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche, die die dritte funktionelle Gruppe bindet, voneinander unterscheiden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Maleinimido- Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen, Neutravidin-Gruppen und Metallchelatkomplex.
22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die zweite funktionelle Gruppe und die vierte funktionelle Gruppe mittels Pfropfsilanisierung, Silanisierung, chemischer Derivatisierung und ähnlicher geeigneter Verfahren auf die Oberfläche der Nanopartikel aufgebracht sind.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Nanopartikel einen Kern aus einem chemisch inerten Material, vorzugsweise Silica, aufweisen.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Nanopar- tikel einen Durchmesser von 30 bis 400 nm, vorzugsweise 50 nm bis 150 nm, aufweisen.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Population von Peptid-Fragmenten des Protein-Antigens mittels enzymatischer Protein- Spaltung, gentechnischer Verfahren oder chemischer Syntheseverfahren hergestellt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Peptid- Fragmente der Population die gesamte Aminosäuresequenz des Protein-Antigens vollständig repräsentie- ren.
27. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Peptid- Fragmente der Population die Aminosäuresequenz des Protein-Antigens nur teilweise repräsentieren.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Peptid- Fragmente der Population Aminosäuresequenzen aufweisen, die vorhergesagte potentielle T-Zell- Epitope darstellen.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei die vorhergesagten potentiellen T-Zell-Epitope mittels eines Computer-Algorithmus bestimmt sind.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 29, wobei die Peptid-Fragmente eine Länge von 8 bis 10 Aminosäuren aufweisen, wenn der Rezeptor ein MHC- Molekül Typ I ist.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 29, wobei die Peptid-Fragmente eine Länge von 15 bis 24 Aminosäuren aufweisen, wenn der Rezeptor ein MHC- Molekül Typ II ist.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 31, wobei die Peptid-Fragmente der Population vor Durchführung der kompetitiven Bindung mit einem Marker und/oder einer fünften funktionellen Gruppe versehen werden.
33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Marker ein Fluoreszenzmarker oder radioaktiver Marker ist.
34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei sich die fünfte funktionelle Gruppe von der ersten, zweiten, dritten und/oder vierten funktionellen Gruppe unterscheidet und mit diesen keine Bindung eingehen kann .
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34, wobei die Immobilisierung der ersten Rezeptor- Einheit oder die Immobilisierung der ersten und zweiten Rezeptor-Einheit an die Nanopartikel durch eine Inkubation der Rezeptor-Einheit (en) mit den Nanopartikeln in einem PBS-Puffer über einen Zeit- räum von 1 h bis 4 h, vorzugsweise 2 h, bei Raumtemperatur in einer Schüttelvorrichtung erfolgt, wobei Nanopartikel mit immobilisierten ersten Rezeptor-Einheiten oder Nanopartikel mit immobilisierten ersten und zweiten Rezeptor-Einheiten er- halten werden.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34, wobei die Immobilisierung von Rezeptor-Einheit (en) an die Nanopartikel dadurch erfolgt, dass unter Verwendung eines Peptids bekannter Sequenz und ge- eigneter Länge, der ersten Rezeptor-Einheit und der zweiten Rezeptor-Einheit in Lösung ein Rezeptor- Peptid-Komplex hergestellt wird, der Rezeptor- Peptid-Komplex an den Nanopartikeln immobilisiert wird, die den immobilisierten Rezeptor-Peptid- Komplex aufweisenden Nanopartikel einer Behandlung zur Entfernung mindestens des gebundenen Peptids unterworfen und Nanopartikel mit immobilisierten Rezeptor-Einheiten erhalten werden.
37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei der Rezeptor- Peptid-Komplex durch Inkubation der ersten Rezeptor-Einheit, der zweiten Rezeptor-Einheit und des Peptids in einem Puffer, enthaltend 100 mM Tris, 2 mM EDTA, 400 mM L-Arginin, 5 mM reduziertes Glutathion und 0,5 mM oxidiertes Glutathion über einen Zeitraum von mehr als 36 h, vorzugsweise 48 h, bei einer Temperatur von weniger als 20°C, vorzugsweise 10°C, hergestellt wird.
38. Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, wobei der Rezeptor-Peptid-Komplex allein durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor- Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nanopartikel an den Nanopartikeln immobilisiert wird.
39. Verfahren nach Anspruch 36 oder '37, wobei der Rezeptor-Peptid-Komplex durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nanopartikel und Bindung der dritten funktionellen Gruppe der zweiten Rezeptor-Einheit an die vierte funktionelle Gruppe der Nanopartikel an den Nanopartikeln immobilisiert wird.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 bis 39, wobei die den immobilisierten Rezeptor-Peptid- Komplex aufweisenden Nanopartikel zur Entfernung des gebundenen Peptids mit einem Stripping-Puffer, pH-Wert 3,0, enthaltend 50 mM Natriumcitrat, über einen Zeitraum von weniger als 20 s, vorzugsweise 10 s, behandelt werden.
41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei im Falle, dass der Rezeptor-Peptid-Komplex allein durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe an die zweite funktionelle Gruppe der Nanopartikel immobilisiert ist, bei der Behandlung der erhaltenen Nanopartikel neben' dem Peptid auch die zweite Rezeptor-Einheit von den Nanopartikeln entfernt wird und Nanopartikel mit der immobilisierten ersten Rezeptor-Einheit erhalten werden.
42. Verfahren nach Anspruch 40, wobei im Falle, dass der Rezeptor-Peptid-Komplex durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor- Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nano- partikel und Bindung der dritten funktionellen Gruppe der zweiten Rezeptor-Einheit an die vierte funktionelle Gruppe der Nanopartikel an den Nanopartikeln immobilisiert ist, bei der Behandlung der erhaltenen Nanopartikel allein das gebundene Peptid von den Nanopartikeln entfernt wird und Nanoparti- kel mit der immobilisierten ersten und zweiten Rezeptor-Einheit erhalten werden.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 42, wobei die die immobilisierte (n) Rezeptoreinheit (en) aufweisenden Nanopartikel mittels mindestens einer Zentrifugation und mindestens eines Waschvorgangs vom Puffer abgetrennt und erneut in einem Puffer suspendiert werden.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 43, wobei die kompetitive Bindung der Peptidfragment- Population an die Nanopartikel, die die erste oder die erste und zweite immobilisierte Rezeptor- Einheit aufweisen, mittels Inkubation der Peptidfragment-Population mit den Nanopartikeln in einem PBS-Puffer über einen Zeitraum von 2 h bis 6 h, vorzugsweise 4 h, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 39°C, vorzugsweise 37°C, durchgeführt wird.
45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei der PBS- Puffer die zweite Rezeptor-Einheit enthält, falls die Nanopartikel allein die immobilisierte erste Rezeptor-Einheit aufweisen.
46. Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, wobei die Nanopartikel nach Bindung des Peptid-Fragmentes mit der höchsten Affinität zu den beiden Rezeptoreinheiten unter Bildung eines immobilisierten Re- zeptor-Peptidfragment-Komplexes mittels mindestens einer Zentrifugation und mindestens eines Waschvorgangs vom Puffer und den nicht gebundenen Peptid- Fragmenten abgetrennt und erneut in 'einem Puffer suspendiert werden.
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 46, wobei die Suspension der Nanopartikel, die den im- mobilisierten Rezeptor-Peptidfragment-Komplex mit dem gebundenen Peptid-Fragment aufweisen, mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions/Ionisations (MALDI) -Verfahren, insbesondere MALDI-TOF (Flugzeit) -Verfahrens analysiert wird.
48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei die erhaltene Nanopartikel-Suspension nach Zentrifugieren und Waschen auf einem MALDI-Probenträger abgeschieden und analysiert wird.
49. Verfahren nach . Anspruch 47 oder 48, wobei eine im Verlauf des MALDI-Verfahrens eingesetzte Matrix vor oder nach dem Abscheiden der Nanopartikel- haltigen Suspension oder gemeinsam damit auf den MALDI-Probenträger aufgetragen wird.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 46, wobei das in dem immobilisierten Rezeptor-
Peptidfragment-Komplex gebundene Peptid-Fragment aus dem Komplex herausgelöst, isoliert und analysiert wird.
51. Verfahren nach Anspruch 50, wobei die den immo- bilisierten Rezeptor-Peptidfragment-Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem Stripping-Puffer, pH- Wert 3,0, enthaltend 50 mM Natriumcitrat, über einen Zeitraum von weniger als 20 s, vorzugsweise 10 s, behandelt werden und das Peptidfragment in Lö- sung geht.
52. Verfahren nach Anspruch 50 oder 51, wobei die Nanopartikel mittels Zentrifugation von der das Peptid-Fragment enthaltenden Lösung abgetrennt werden.
53. Verfahren nach einem der Ansprüche 50 bis 52, wobei die das freigesetzte Peptid-Fragment enthaltende Lösung mit Nanopartikeln in Kontakt gebracht werden, die die fünfte funktionelle Gruppe des Pep- tid-Fragments bindende sechste funktionelle Gruppen aufweisen, so dass das Peptid-Fragment durch Bindung der fünften funktionellen Gruppe an die sechste funktionelle Gruppe an den Nanopartikel immobilisiert, und die das immobilisierte Peptid-Fragment aufweisenden Nanopartikel von der Lösung abgetrennt werden.
54. Verfahren nach einem der Ansprüche 50 bis 53, wobei das immobilisierte Peptid-Fragment von den Nanopartikeln abgetrennt und sequenziert wird.
55. Verfahren zur Identifizierung und/oder Herstel- lung eines Peptid-Impfstoffes gegen ein Protein- Antigen, wobei die Aminosäuresequenz eines T-Zell- Epitops des Protein-Antigens in vitro ' identifiziert, ein Peptid mit der identifizierten Aminosäuresequenz hergestellt und unter Verwendung des her- gestellten Peptids und einer ersten und zweiten Kette ein Peptid-präsentierender Haupthistokompati- bilitäts-ko plex (MHC) hergestellt wird, umfassend
a) Bereitstellung einer Population von Peptid- Fragmenten des Protein-Antigens, b) Bereitstellung von Nanopartikeln, die an ihrer Oberfläche mindestens eine erste immobilisierte Kette eines MHC-Moleküls aufweisen, wobei die Kette eine die Bildung eines MHC- Moleküls ermöglichende Konformation aufweist,
c) Durchführung einer kompetitiven Bindung der Peptidfragment-Population an die an den Nanopartikeln immobilisierte erste Kette in Gegenwart einer zweiten Kette eines MHC- Moleküls, wobei das Peptid-Fragment mit der größten Affinität zu den beiden Ketten des MHC-Moleküls zusammen mit der zweiten Kette an die erste Kette bindet und ein Peptidfrag- ment-präsentierendes MHC-Molekül erhalten wird, und
d) Isolierung des Peptid-Fragments aus dem MHC- Molekül zur Identifizierung eines für einen Peptid-Impfstoff geeignetes Peptid-Fragments und Bestimmung seiner Aminosäuresequenz, und optionale Durchführung der Schritte e) bis h) , nämlich
e) gentechnische Herstellung oder chemische Synthese eines Peptides auf der Basis der bestimmten Aminosäuresequenz des Peptid- Fragmentes in geeigneten Mengen,
f) gentechnische Herstellung oder chemische Synthese der ersten und zweiten Kette in geeigneten Mengen,
g) Herstellung von Peptid-prasentierenden MHC- Molekülen in geeigneten Mengen durch gemein- same Inkubation der ersten Kette, der zweiten Kette und des hergestellten Peptids, und
h) Herstellung eines Peptid-Impfstoffes in Form eines Lyophilisats oder einer wässrigen kol- loidalen Lösung oder Suspension der Peptid- prasentierenden MHC-Moleküle.
56. Verfahren nach Anspruch 55, wobei an der Oberfläche der Nanopartikel neben der ersten Kette auch die zweite Kette immobilisiert ist.
57. Verfahren nach Anspruch 55 oder 56, wobei die beiden Ketten in Form eines das MHC-Molekül bildenden Dimers an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisiert sind.
58. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 57, wobei die Population von Peptid-Fragmenten des
Protein-Antigens mittels enzymatischer Protein- Spaltung, gentechnischer Verfahren oder chemischer Syntheseverfahren hergestellt wird.
59. Verfahren nach Anspruch 58, wobei die Peptid- Fragmente der Population die gesamte Aminosäuresequenz des Protein-Antigens vollständig repräsentieren.
60. Verfahren nach Anspruch 58, wobei die Peptid- Fragmente der Population die Aminosäuresequenz des Protein-Antigens nur teilweise repräsentieren.
61. Verfahren nach Anspruch 60, wobei die Peptid- Fragmente der Population Aminosäuresequenzen auf- weisen, die mittels eines Computer-Algorithmus bestimmte potentielle T-Zell-Epitope darstellen.
62. Verfahren nach einem der Ansprüche 58 bis 61, wobei die Peptid-Fragmente oder das Peptid eine Länge von 8 bis 10 Aminosäuren aufweisen, wenn das herzustellende Peptidfragment- oder Peptid- präsentierende MHC-Molekül ein MHC-Molekül Typ I ist, oder eine Länge von 15 bis 24 Aminosäuren, wenn das herzustellende Peptidfragment- oder Pep- tid-präsentierende MHC-Molekül ein MHC-Molekül Typ II ist.
63. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 62, wobei die erste Kette eine schwere Kette von etwa 45 kD ist, die zweite Kette eine leichte Kette von etwa 12 kD ist und 'beide Ketten ein MHC-Molekül Typ I bilden können.
64. Verfahren nach Anspruch 63, wobei die erste Kette ein HLA-A-, HLA-B- oder HLA-C-Monomer ist und die zweite Kette ß-2-Microglobulin.
65. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 62, wobei die erste Kette eine α-Kette von etwa 34 kD ist, die zweite Kette eine ß-Kette von etwa 30 kD ist und beide Ketten ein MHC-Molekül Typ II bilden können.
66. Verfahren nach Anspruch 65, wobei die erste Kette und die zweite Kette HLA-DR-, ' HLA-DQ- oder HLA-DP-Monomere sind.
67. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 66, wobei die erste Kette eine erste funktionelle Grup- pe enthält und durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe an eine auf der Oberfläche der Nanopartikel vorhandene zweite funktionelle Gruppe an der Oberfläche der Nanopartikel immobilisiert ist.
68. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 67, wobei die zweite Kette eine dritte funktionelle Gruppe enthält und durch Bindung der dritten funktionellen Gruppe an eine auf der Oberfläche der Nanopartikel vorhandene vierte funktionelle Gruppe an der Oberfläche der Nanopartikel immobilisiert ist.
69. Verfahren nach Anspruch 67, wobei die erste funktionelle Gruppe ein natürlicher Bestandteil der ersten Kette ist oder mittels gentechnischer Verfahren, biochemischer, enzymatischer und/oder che- mischer Derivatisierung oder chemischer Syntheseverfahren in die erste Kette eingeführt ist.
70. Verfahren nach Anspruch 68, wobei die dritte funktionelle Gruppe ein natürlicher Bestandteil der zweiten Kette ist oder mittels gentechnischer Ver- fahren, biochemischer, enzymatischer und/oder chemischer Derivatisierung oder chemischer Syntheseverfahren in die zweite Kette eingeführt ist.
71. Verfahren nach Anspruch 69 oder 70, wobei sich die erste und dritte funktionelle Gruppe voneinan- der unterscheiden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Biotin-Gruppen, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag I-Gruppen, Strep-Tag II-Gruppen, Histi- din-Tag-Gruppen und FLAG-Tag-Gruppen.
72. Verfahren nach einem der Ansprüche 67 oder 68, wobei sich die an der Oberfläche der Nanopartikel vorhandenen zweiten und vierten funktionellen Gruppen voneinander unterscheiden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen,- Maleinimido-Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen, Neutravidin-Gruppen und Me- tallchelatkomplex .
73. Verfahren nach Anspruch 72, wobei die zweite und vierte funktionelle Gruppe mittels Pfropfsila- nisierung, Silanisierung, chemischer Derivatisierung und ähnlicher geeigneter Verfahren auf die 0- berfläche der Nanopartikel aufgebracht sind.
74. Verfahren nach Anspruch 72 oder 73, wobei die Nanopartikel einen • Kern aus einem chemisch inerten
Material, vorzugsweise Silica, und einen Durchmesser von 30 bis 400 nm, vorzugsweise 50 nm bis 150 nm, aufweisen.
75. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 74, wobei die an ihrer Oberfläche eine erste immobilisierte Kette aufweisenden Nanopartikel durch folgende Schritte erhalten werden:
a) Inkubation der die erste funktionelle Gruppe enthaltenden ersten Kette, der zweiten Kette und eines Peptids, von dem die Aminosäuresequenz und die Fähigkeit zur Bildung eines Peptid-prasentierenden MHC-Moleküls unter geeigneten Bedingungen bekannt ist,
b) Inkubation des Peptid-prasentierenden MHC- Moleküls mit Nanopartikeln, deren Oberfläche mindestens eine die erste funktionelle Gruppe bindende zweite funktionelle Gruppe aufweist, unter geeigneten Bedingungen zur Immobilisierung des Peptid-prasentierenden MHC-Moleküls an den Nanopartikeln,
c) Behandlung der Nanopartikel mit- den immobilisierten Peptid-prasentierenden MHC-Molekülen mit einem geeigneten Puffer zur Entfernung der zweiten Kette und des Peptids bekannter Aminosäuresequenz aus dem immobilisierten MHC-Molekül,
d) Aufreinigung der die erste immobilisierte Kette aufweisenden Nanopartikel.
76. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 75, wobei die kompetitive Bindung der Peptidfragment- Population an die die erste immobilisierte Kette aufweisenden. Nanopartikel mittels Inkubation der Peptidfragment-Population mit den Nanopartikeln in einem geeigneten Puffer unter geeigneten Bedingun- gen erfolgt.
77. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 76, wobei die Nanopartikel nach Bindung des die höchste Affinität aufweisenden Peptid-Fragmentes der Population und der zweiten Kette unter Bildung eines immobilisierten Peptidfragment-präsentierenden MHC- Moleküls mittels Zentrifugation und Waschen vom Puffer und den nicht gebundenen Peptid-Fragmenten abgetrennt werden.
78. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 77, wobei die das immobilisierte Peptidfragment- präsentierende MHC-Molekül aufweisenden Nanopartikel mit einem geeigneten Puffer zur Freisetzung des gebundenen Peptid-Fragmentes behandelt werden.
79. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 78, wobei das freigesetzte Peptid-Fragment isoliert und seine Aminosäuresequenz ermittelt wird.
80. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 79, wobei auf der Basis der ermittelten Aminosäuresequenz des freigesetzten Peptid-Fragmentes eine die ermittelte Aminosäuresequenz codierende Nucleinsäure erzeugt und in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert, der die Nucleinsäure enthaltende Vektor in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der Aminosäuresequenz überführt und ein Peptid mit der Aminosäuresequenz des Peptid-Fragmentes in der Wirtszelle, vorzugsweise in größerer Menge, expri- miert und daraus isoliert wird.
81. Verfahren nach einem der Ansprüche 55 bis 79, wobei auf der Basis der ermittelten Aminosäurese- quenz des freigesetzten Peptid-Fragmentes eine geeignete Menge eines Peptids mit der Aminosäuresequenz des Peptid-Fragmentes chemisch synthetisiert wird.
82. Verfahren zur Qualitätskontrolle von Rezeptor- Ligand-Komplexen und/oder deren Bestandteilen, umfassend die Herstellung oder Bereitstellung eines Rezeptor-Ligand-Komplexes in Lösung aus zwei Rezeptor-Einheiten, wobei mindestens eine Rezeptor- Einheit eine erste funktionelle Gruppe aufweist, und eines Liganden, die Immobilisierung des Rezep- tor-Ligand-Komplexes an Nanopartikeln, die an ihrer Oberfläche mindestens eine die erste funktionelle Gruppe bindende zweite funktionelle Gruppe aufweisen, und Analyse der den immobilisierten Rezeptor- Ligand-Komplex aufweisenden Nanopartikel unter Verwendung eines MALDI-Verfahrens .
83. Verfahren nach Anspruch 82, wobei der Rezeptor ein MHC-Molekül, der Ligand ein an den Rezeptor bindendes Peptid bekannter Sequenz und definierter Länge und der Rezeptor-Ligand-Komplex ein Peptid- präsentierendes MHC-Molekül ist.
84. Verfahren nach Anspruch 82 oder 83, wobei der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse I, eine Rezeptor-Einheit eine schwere Kette von etwa 45 kDa und die Rezeptor-Einheit eine leichte Kette von etwa 12 kDa ist.
85. Verfahren nach Anspruch 84, wobei die schwere Kette ein HLA-A-, HLA-B- oder HLA-C-Monomer und die leichte Kette ß-2-Microglobulin ist.
86. Verfahren nach Anspruch 82 oder 83, wobei der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse II, eine Rezeptor-Einheit eine α-Kette von etwa 34 kDa und eine Rezeptor-Einheit eine ß-Kette von etwa 30 kDa ist.
87. Verfahren nach Anspruch 86, wobei die α-Kette und die ß-Kette HLA-DR-, HLA-DQ- oder HLA-DP-
Monomere sind.
88. Verfahren nach einem der Ansprüche 82 bis 87, wobei das MALDI-Verfahren ein MALDI-TOF-Verfahren ist.
89. Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln, die an ihrer Oberfläche mindestens eine immobilisierte Rezeptor-Einheit oder einen immobilisierten Rezeptor aufweisen, umfassend
a) Herstellung eines Rezeptor-Ligand-Komplexes durch Inkubation einer ersten Rezeptor- Einheit mit einer ersten funktionellen Gruppe, einer zweiten Rezeptor-Einheit, die mit der ersten Rezeptor-Einheit einen Re- zeptor bilden kann, und eines Liganden in
Lösung,
b) Immobilisierung des gebildeten Rezeptor- Ligand-Komplexes an Nanopartikeln, die mindestens eine die erste funktionelle Gruppe bindende zweite funktionelle Gruppen an der
Oberfläche aufweisen, und
c) Behandlung der den immobilisierten Rezeptor-Ligand-Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem sauren Puffer zur Freisetzung mindestens des gebundenen Liganden, wobei
Nanopartikel mit immobilisierten Rezeptor- Einheiten erhalten werden.
90. Verfahren nach Anspruch 89, wobei die Immobilisierung des Rezeptor-Ligand-Komplexes an der Nano- partikel-Oberfläche allein über die Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor- Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nanopartikel erfolgt.
91. Verfahren nach Anspruch 89 oder 90, wobei nach Behandlung der den immobilisierten Rezeptor-Ligand- Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem sauren Puffer neben dem Liganden auch die zweite Rezeptor- Einheit freigesetzt und Nanopartikel mit der immobilisierten ersten Rezeptor-Einheit erhalten wer- den.
92. Verfahren nach Anspruch 89, wobei die zweite Rezeptor-Einheit eine dritte funktionelle Gruppe aufweist und die Nanopartikel an ihrer Oberfläche eine die dritte funktionelle Gruppe der zweiten Re- zeptor-Einheit bindende vierte funktionelle Gruppe aufweisen, so dass die Immobilisierung des Rezeptor-Ligand-Komplexes an den Nanopartikeln über die Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nanopartikel und die Bindung der dritten funktionellen Gruppe der zweiten Rezeptor-Einheit an die vierte funktionelle Gruppe der Nanopartikel erfolgt.
93. Verfahren nach Anspruch 92, wobei nach Behand- lung der den immobilisierten Rezeptor-Ligand- Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem sauren Puffer allein der Ligand freigesetzt und Nanopartikel mit der immobilisierten ersten und zweiten Rezeptor-Einheit erhalten werden.
94. Verfahren nach Anspruch 92 oder 93, wobei die erste und zweite Rezeptor-Einheit gerichtet immobilisiert vorliegen und einen Rezeptor bilden, der einen Liganden binden kann.
95. Verfahren nach einem der Ansprüche 89 bis 94, wobei der Rezeptor ein MHC-Molekül, der Ligand ein an den Rezeptor bindendes Peptid bekannter Sequenz und definierter Länge und der Rezeptor-Ligand- Komplex ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül ist.
96. Verfahren nach Anspruch 95, wobei der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse I ist.
97. Verfahren nach Anspruch 95 oder 96, wobei die erste Rezeptor-Einheit eine schwere Kette von etwa 45 kDa und die zweite Rezeptor-Einheit eine leichte Kette von etwa 12 kDa ist oder die erste Rezeptor- Einheit eine leichte Kette von etwa 12 kDa und die zweite Rezeptor-Einheit eine schwere Kette von etwa 45 kDa ist.
98. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die schwere Kette ein HLA-A-, HLA-B- oder HLA-C-Monomer und die leichte Kette ß-2-Microglobulin ist.
99. Verfahren nach Anspruch 95, wobei der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse II ist.
100. Verfahren nach Anspruch 99, wobei die erste Rezeptor-Einheit eine α-Kette von etwa 34 kDa und die zweite Rezeptor-Einheit eine ß-Kette von etwa 30 kDa ist oder die erste Rezeptor-Einheit eine ß- Kette von etwa 30 kDa und die zweite Rezeptor- Einheit eine α-Kette von etwa 34 kDa ist.
101. Verfahren nach Anspruch 100, wobei die α-Kette und die ß-Kette HLA-DR-, HLA-DQ- .oder HLA-DP-
Monomere sind.
102. Verfahren nach einem der Ansprüche 89 bis 101, wobei sich die erste funktionelle Gruppe und die dritte funktionelle Gruppe voneinander unterscheiden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Biotin-Gruppen, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag I- Gruppen, Strep-Tag II-Gruppen, Histidin-Tag-Gruppen und FLAG-Tag-Gruppen.
103. Verfahren nach einem der Ansprüche 89 bis 102, wobei sich die zweite funktionelle Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche, die die erste funktionelle Gruppe bindet, und die vierte funktionelle Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche, die die dritte funktionelle Gruppe bindet, voneinander unterscheiden und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Maleinimido- Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen, Neutravidin-Gruppen und Metallchelatkomplex.
104. Verfahren nach einem der Ansprüche 89 bis 103, wobei die den immobilisierten Rezeptor-Peptid- Komplex aufweisenden Nanopartikel zur Entfernung des gebundenen Peptids mit einem Stripping-Puffer, pH-Wert 3,0, enthaltend 50 mM Natriumcitrat, über einen Zeitraum von weniger als 20 s, vorzugsweise 10 s, behandelt werden.
105. Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln mit immobilisierten Peptid-präsentierenden MHC- Molekülen, wobei Nanopartikel mit mindestens einer ersten immobilisierten Kette eines MHC-Moleküls, herstellbar nach einem Verfahren nach 'einem der Ansprüche 89 bis 104, in Gegenwart einer zweiten Ket- te, die mit der ersten Kette ein MHC-Molekül bilden kann, mit einem Peptid, das an das MHC-Molekül bin- den kann, inkubiert und ein an den Nanopartikeln immobilisierter Peptid-präsentierendes MHC-Molekül erhalten wird.
106. Verfahren nach Anspruch 105, wobei das MHC- Molekül ein Molekül der Klasse I ist und das Peptid eine Länge von etwa 8 bis etwa 10 Aminosäuren aufweist .
107. Verfahren nach Anspruch 105, wobei das MHC- Molekül ein Molekül der Klasse II ist und das Pep- tid eine Länge von etwa 15 bis etwa 24 Aminosäuren aufweist.
108. Verfahren zur Anreicherung und/oder Isolierung spezifischer CD4+-T-Lymphocyten oder CD8+-T- Lymphocyten aus peripheren mononuclearen Blutzellen (PBMCs), umfassend
a) Herstellung von Nanopartikeln mit immobilisierten Peptid-präsentierenden MHC-Molekülen nach einem der Ansprüche 105 bis 107, wobei das Peptid ein T-Zell-Epitop ist
b) Isolierung peripherer mononucleärer Blutzellen aus einem geeigneten Ausgangsmaterial,
c) Inkubation der isolierten mononucleärer Blutzellen mit den die immobilisierten Peptid- präsentierenden MHC-Molekülen aufweisenden Nanopartikeln, wobei T-Lymphozyten an das T- Zell-Epitop der immobilisierten Peptid- präsentierenden MHC-Moleküle binden, d) Abtrennung der Nanopartikel mit den an die immobilisierten Peptid-präsentierenden MHC- Molekülen gebundenen T-Lymphozyten von den nicht-gebundenen peripheren mononuclearen Zellen.
109. Verfahren nach Anspruch 108, wobei die gebundenen T-Lymphozyten von den Nanopartikeln freigesetzt werden.
110. Verfahren nach Anspruch 109, wobei die freige- setzten T-Lymphozyten in vitro clonal vermehrt werden.
111. Verfahren nach Anspruch 109 oder 110, wobei die freigesetzten und/oder clonal vermehrten T- Lymphozyten in einen Organismus eingeführt werden.
112. Verfahren nach einem der Ansprüche 108 bis 111, wobei das Peptid-präsentierende MHC-Molekül ein Molekül der Klasse I ist und die gebundenen T- Lymphozyten CD8+-T-Lymphocyten sind.
113. Verfahren nach einem der Ansprüche 108 bis 111, wobei das Peptid-präsentierende MHC-Molekül ein Molekül der Klasse II ist und die gebundenen T- Lymphozyten CD4+-T-Lymphocyten sind.
114. Verfahren zum Primen und/oder Restimulieren eeiinneerr CCDD44++--TT-- ooder CD8+-T-Lymphocyten-Reaktion in vitro, umfassend
a) Identifizierung eines T-Zell-Epitops nach einem der Ansprüche 1 bis 54 und Bestimmung von dessen Aminosäuresequenz, b) Herstellung einer Nucleinsäure, die ein Peptid mit der Aminosäuresequenz des T-Zell- Epitops codiert,
c) Einführung der bei b) hergestellten Nuclein- säure in einen geeigneten Vektor,
d) Einführung des bei c) erhaltenen Vektors in dendritische Zellen, die -' gegebenenfalls aus kultivierten peripheren mononuclearen Blutzellen isoliert wurden,
e) Vermehrung der bei d) resultierenden, den Vektor aufweisenden dendritischen Zellen in vitro, und
f) Stimulation autologer CD4+ und/oder CD8+- Zellen in vitro unter Verwendung der bei d) oder e) erhaltenen dendritischen Zellen.
115. Nanopartikel, enthaltend an der Oberfläche mindestens eine Rezeptor-Einheit, insbesondere eine immobilisierte Kette eines MHC-Moleküls.
116. Nanopartikel nach Anspruch 115, wobei die im- mobilisierte Kette durch Bindung eines Peptids von
8 bis 24 Aminosäuren und einer zweiten Kette eines MHC-Moleküls ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül bilden kann.
117. Nanopartikel nach Anspruch 115 oder 116, wobei die MHC-Molekül-Kette durch Bindung einer in ihr enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisiert ist.
118. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 115 bis 117, wobei das MHC-Molekül ein Molekül der Klasse I ist und aus einer schweren Kette von etwa 45 kDa und einer leichten Kette von etwa 12 kDa besteht.
119. Nanopartikel nach Anspruch 118, wobei entweder die schwere Kette oder die leichte Kette immobilisiert ist.
120. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 115 bis 117, wobei das MHC-Molekül ein Molekül der Klasse II ist und aus einer α-Kette von etwa 34 kDa und einer ß-Kette von etwa 30 kDa besteht.
121. Nanopartikel nach Anspruch 120, wobei entweder die α-Kette oder die ß-Kette immobilisiert ist.
122. Nanopartikel mit einem immobilisierten MHC- Molekül, wobei das MHC-Molekül eine erste und zweite Kette umfasst und das MHC-Molekül durch Bindung einer in der ersten Kette enthaltenen ersten funk- tionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel- Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe oder durch Bindung der in der ersten Kette enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit der an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funkti- onellen Gruppe und Bindung einer in der zweiten Kette enthaltenen dritten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen vierten funktionellen Gruppe an der Nanopartikel- Oberfläche immobilisiert ist.
123. Nanopartikel mit einem an der Nanopartikel- Oberfläche immobilisierten Peptid-präsentierenden MHC-Molekül, wobei das Peptid-präsentierende MHC- Molekül eine erste Kette, eine zweite Kette und ein Peptid von 8 bis 24 Aminosäuren umfasst und das MHC-Molekül durch Bindung einer in der ersten Kette enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe oder durch Bindung der in der ersten Kette enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit der an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe und Bindung einer in der zweiten Kette enthaltenen dritten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel- Oberfläche vorhandenen vierten funktionellen Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisiert ist.
124. Nanopartikel nach Anspruch 122 oder 123, wobei das MHC-Molekül ein Molekül der Klasse I ist und aus einer schweren Kette von etwa 45 kDa und einer leichten Kette von etwa 12 kDa besteht.
125. Nanopartikel nach Anspruch 124, wobei die erste Kette die schwere Kette und die zweite Kette die leichte Kette ist oder wobei die erste Kette die leichte Kette und die zweite Kette die schwere Ket- te ist.
126. Nanopartikel nach Anspruch 122 oder 123, wobei das MHC-Molekül ein Molekül der Klasse II ist und aus einer α-Kette von etwa 34 kDa und einer ß-Kette von etwa 30 kDa besteht.
127. Nanopartikel nach Anspruch 126, wobei die erste Kette die α-Kette und die zweite Kette die ß- Kette ist oder wobei die erste Kette die ß-Kette und die zweite Kette die α-Kette ist.
128. Peptid-Impfstoff umfassend mindestens ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül, herstellbar nach einem der Ansprüche 55 bis 81 und/oder umfassend mindestens ein Protein-Antigen enthaltend ein gemäß der Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 54 identi- fiziertes T-Zell-Epitop.
129. Peptid-Impfstoff nach Anspruch 128, wobei der Impfstoff als Lyophilisat vorliegt.
130. Peptid-Impfstoff nach Anspruch 128, wobei der Impfstoff als wässrige kolloidale Lösung oder Sus- pension vorliegt.
131. Peptid-Impfstoff nach einem der Ansprüche 128 bis 130, zusätzlich enthaltend mindestens ein Adju- vans .
132. Kit zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein-Antigens in vitro, umfassend einen Behälter mit einer Suspension von Nanopartikeln mit einem immobilisierten MHC- Molekül nach einem der Ansprüche 122 bis 127 oder einen Behälter mit einer Suspension von Nanoparti- kein mit einer immobilisierten ersteh Kette eines MHC-Moleküls nach einem der Ansprüche 115 bis 121 und einen Behälter mit einem Lyophilisat einer zweiten Kette.
133. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 115 bis 127 zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein- Antigens in vitro.
134. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 115 bis 127 zur Herstellung eines Peptid- Impfstoffes .
135. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 115 bis 127 zur Anreicherung und/oder I- solierung spezifischer CD4+-T-Lymphocyten oder CD8+-T-Lymphocyten in vitro.
136. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 115 bis 127 zum Primen oder/und Restimulieren einer CD4+- und/oder CD8+-T-Lymphocyten- Reaktion in vitro.
137. Verwendung eines Peptid-Impfstoffes nach einem der Ansprüche 128 bis 131 zur aktiven Immunisierung eines tierischen oder menschlichen Organismus gegen ein Protein-Antigen.
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