DE19944995C1 - Nachweis einer irreversiblen Schädigung von IgG Antikörpern - Google Patents

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Nachweis einer irreversiblen Schädigung von IgG Antikörpern.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer irreversiblen Schädigung von IgG Antikörpern.

Im diagnostischen Bereich und als therapeutische Maßnahme wer­ den monoklonale Antikörper immer häufiger beim Menschen ein­ gesetzt. Ein gravierendes Problem, das im Umgang mit monoklo­ nalen Antikörpern immer wieder auftreten kann, besteht darin, daß gebräuchliche Aufreinigungsprozeduren, wie die Ein- Schritt-Affinitätschromatographie mit Protein A oder G, das Bindungsverhalten des Antikörpers beeinträchtigen. Thermodyna­ mische Untersuchungen der letzten Jahre konnten nun aufdecken, daß im Verlaufe der Evolution viele Proteine auf geringe Sta­ bilität hin selektiert wurden. Das gilt auch für Immunglobuli­ ne und erklärt deren Anfälligkeit gegenüber Denaturierung, z. B. durch Säuren. Die Tatsache, daß der Rückfaltungsprozess zum nativ gefalteten Protein nach Denaturierung in vitro nicht immer vollständig verläuft, kann darüber hinaus erklären, daß gewisse Reinigungsprozeduren zu einem Totalverlust der Bin­ dungsaktivität des monoklonalen Antikörpers führen. Eine un­ vollständige Rückfaltung des Antikörpers kann aber auch Regio­ nen des Moleküls betreffen, die nicht direkt Einfluß auf das Bindungsverhalten des Antikörpers nehmen. Dieser Zusammenhang erschließt sich zwangsläufig aus der Beobachtung, daß Domänen eines Proteins sich unabhängig voneinander falten können; dies gilt auch für Domänen von Antikörpermolekülen. (Literatur sie­ he Lehrbücher der Biochemie, z. B. Biochemie von Lubert Stryer). Wenn z. B. der Fc-Teil des Antikörpers von diesen Un­ regelmäßigkeiten betroffen ist, kann sich das auf seine Fähig­ keit auswirken, mit Fc-Rezeptor-tragenden Effektorzellen (Mo­ nozyten/Makrophagen, Granulozyten, follikuläre dendritische Zellen, natürliche Killerzellen, Mastzellen), den Exekutoren der angeborenen Immunität, zu interagieren. Dieser Effektor­ funktion kommt umsomehr Bedeutung zu, als jüngste Untersuchun­ gen zu dem Schluß kommen, daß IgG Antikörper in vivo aus­ schließlich über die Interaktion mit FcγRezeptor-tragenden Zel­ len biologische Wirksamkeit entfalten, die, einmal aktiviert, sich in Phagozytose, Entzündung und Zelllyse manifestiert. (J. V. Ravetch and R. A. Clynes. 1998. Annu Rev Immunol 16: 421-432).

Um das Risiko für den Patienten so gering wie möglich zu hal­ ten, gibt es seit mehr als 10 Jahren behördliche Auflagen, die besondere Qualitätskriterien für diejenigen Antikörperpräpara­ tionen vorschreiben, die für den Gebrauch im Menschen bestimmt sind (Haase M., 1987. Behördliche Anforderungen an die Her­ stellung und Prüfung von monoklonalen Antikörpern. Pharma Technol 4: 32-35). Im Endprodukt soll der gewünschte monoklona­ le Antikörper zu mehr als 90% angereichert sein, wobei minde­ stens 95% des Immunglobulins in Form von Monomeren und Dimeren vorliegen. Des weiteren müssen für jeden Antikörper funktio­ nelle Eigenschaften wie Bindungskonstante und komplementabhän­ gige Zytoloyse bekannt und dokumentiert sein.

Eine Überprüfung auf eine irreversible Schädigung von IgG An­ tikörpern ist bisher kein fester Bestandteil der Qualitätskon­ trolle, auch nicht bei denjenigen Antikörperpräparationen, die für den Einsatz im Menschen vorgesehen sind (z. B. Panorex, siehe Rote Liste; OKT3).

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem zuverlässig die Qualität von IgG An­ tikörpern getestet werden kann, insbesondere eine Schädigung von IgG Antikörpern nachweisbar ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das im Anspruch 1 nä­ her gekennzeichnete Verfahren zum Nachweis einer irreversiblen Schädigung von IgG Antikörpern mit den nachfolgenden Schritten gelöst:

• a) Inkontaktbringen von IgG Antikörpern oder IgG Antikörper­ präparationen, die gegen ein Oberflächenantigen auf einer Fcγ-Rezeptor RII und/oder RIII exprimierenden Zellinie ge­ richtet sind und die im nativen Zustand an den Fcγ- Rezeptor RII oder RIII binden können, mit einer in Sus­ pensionskultur wachsenden, Fcγ Rezeptor RII und/oder RIII und das Oberflächenantigen exprimierenden Zellinie;
• b) Zugabe eines zweiten Antikörpers, der gegen die Liganden­ bindungsstelle des Fcγ-Rezeptors RII oder RIII gerichtet ist, zur im Schritt (a) erhaltenen Mischung;
• c) Analyse des Aggregationsverhaltens der Zellen zur Bestim­ mung einer möglichen Schädigung der IgG Antikörper oder der IgG Antikörperpräparation, wobei
  • 1. α) eine Aggregation der Zellen eine Schädigung des IgG Antikörpers oder der IgG Antikörperpräparation an­ zeigt; und
  • 2. β) keine Aggregation oder eine reversible, unspezifi­ sche Aggregation die Unversehrtheit des IgG Anti­ körpers oder der IgG Antikörperpräparation anzeigt.

Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung im Zusammenhang mit den Ausführungsbeispielen. Die Ausfüh­ rungsbeispiele geben eine spezielle Ausgestaltungsform des er­ findungsgemäßen Verfahrens wieder, auf das die Erfindung je­ doch nicht beschränkt ist.

Die beiliegenden Abb. 1A und B zeigen

S49.1 Zellen (in 50 µl Kulturmedium) wurden in die Kavitäten einer 96 well Mikrotiterplatte pipettiert und mit 100 µl einer MmT1-Verdünnung (A) oder dem gleichen Volumen eines Gemisches aus MmT1 und 2.4G2uk (B) über Nacht inkubiert. Vor der visuel­ len Auswertung mit Hilfe eines Durchlichtmikroskops wurde die Platte kräftig geschüttelt.

Abb. 1A zeigt das typische Beispiel einer homotypischen Aggregation von S49.1 Zellen, die durch den anti-Thy-1 Anti­ körper MmT1 ausgelöst wurde. Im Abb. 1B ist eindeutig er­ kennbar, daß S49.1 Zellen als Einzelzellen den Boden der Mi­ krotiterplatte bedecken. Im diesem Ansatz wurde die typische MmT1-induzierte Aggregatformation durch die gleichzeitige An­ wesenheit des Antikörpers 2.4G2uk im Reaktionsgemisch inhi­ biert.

Für den Nachweis einer irrversiblen Schädigung von IgG Anti­ körpern wurde erfindungsgemäß ein in vitro Test etabliert, der von einer in Suspensionskultur wachsenden Zellinie (Indikator­ zellen) ausgeht, die zum einen ein Oberflächenantigen expri­ miert, gegen welches der IgG Antikörper gerichtet ist und zum anderen die Fcγ-Rezeptoren RII (CD32) und/oder RIII (CD16). Wichtig ist, daß die Anzahl der Fcγ-Rezeptoren im Zusammenspiel mit dem Antigen ausreichend ist, um deutlich nachweisbare Ag­ gregate auszubilden. Hierzu müssen die Antigene in einer be­ stimmten Kopienanzahl auf der in Suspensionskultur wachsenden Indikatorzellinie exprimiert sein. Es hat sich erfindungsgemäß als günstig herausgestellt, daß das Antigen, gegen welches der IgG Antikörper gerichtet ist, auf der Indikatorzellinie in ho­ her oder sogar sehr hoher Dichte exprimiert wird, während die Fcγ-Rezeptoren in geringerer Kopienzahl exprimiert sein können.

Das Verhältnis Antigen: Fcγ-Rezeptoren liegt beispielsweise bevorzugt im Bereich von < 1 : 1 bis 0,5 : 1. Es sind solche Zel­ linien auszuwählen, die ein Verhältnis von Antigen zu Fcγ- Rezeptoren aufweisen, daß eine Aggregatbildung möglich ist. Da das Verhältnis von Antigen: Fcγ-Rezeptoren von Zellinie zu Zel­ linie unterschiedlich ist, ist vor Etablierung des erfindungs­ gemäßen Verfahrens die Indikatorzellinie auf ihre Fähigkeit zur Aggregatbildung vorab zu testen. Aufgrund der vorliegenden Beschreibung ist ein Austesten für den Fachmann ohne weitere erfinderische Schritte möglich.

Die Zellen werden beispielsweise in einem Standard-Nährmedium in einer Dichte von 10⁵-10⁶ Zellen/ml gezogen.

Bei den Indikaktorzellen handelt es sich um tierische Zellen, die das Antigen, gegen den der zu testende IgG Antikörper ge­ richtet ist, zusammen mit den Fcγ RII und/oder RIII Rezeptoren exprimieren. Die Zellen können entweder natürlicherweise das Antigen und die Fcγ-Rezeptoren exprimieren oder die für das An­ tigen und/oder die Fcγ-Rezeptoren kodierenden Gene wurden durch rekombinante DNA-Techniken in die Zelle eingeführt. Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Zellen sind alle nicht­ adhärent wachsenden Zellinien, bevorzugt B-Lymphozyten oder T-Lymphozyten, Granulozyten, natürliche Killerzellen und Mastzellen. Eine besonders bevorzugte Zellinie ist die Zelli­ nie S49.1, die in sehr großer Dichte das Thy-1 Antigen und gleichzeitig, in deutlich geringerer Kopienzahl, den Fcγ- Rezeptor RIII (CD16) exprimiert.

Die Zellinie S49.1 ist bei der Non-profit Organisation Ameri­ can Type Culture Collection (ATCC) unter der Bezeichnung ATCC TIB 28 von Dr. AW Harris (Salk Institute, San Diego, Califor­ nia) hinterlegt worden und kann von dort ohne besondere Aufla­ gen bezogen werden. Referenzen zu dieser Zellinie sind Ralph, P. (1973) und Burgeois, S. et al (1977).

Beim Thy-1 (Theta)-Antigen (CD 90) handelt es sich um ein Oberflächenantigen, welches als Marker für murine T-Zellen fungiert. Referenzen zum Thy-1 Antigen sind beispielsweise Schlesinger, M. et al, 1989, Thierfelder, S. et al, 1989, Cob­ bold, S. P. et al, 1983, Kummer, U. et al, 1993 und Williams, A. F., 1989.

Es ist nochmals darauf hinzuweisen, daß die Zellinie S49.1 zwar eine erfindungsgemäß bevorzugt einsetzbare Indikatorzel­ linie ist, die Erfindung jedoch nicht auf diese Zellinie be­ schränkt ist. Zur Induktion einer homotypischen Zellaggregati­ on kann die Zellinie S49.1 auch durch andere Zellinien ersetzt werden. Allerdings muß gewährleistet sein, daß die ausgewählte Zellinie als Suspensionskultur wächst, d. h. adhärente Zellen sind für die erfindungsgemäß einzusetzende Indikatorzellinie ungeeignet. Weiterhin muß die Zellinie mindestens einen der beiden niedrig-affinen Fcγ-Rezeptoren RII oder RIII exprimie­ ren. Es sind jedoch auch Zellinien einsetzbar, die beide Fcγ- Rezeptoren aufweisen.

Zur Durchführung des Tests bringt man eine Suspension der In­ dikatorzellen mit einem Antikörper oder einer Antikörperpräpa­ ration, die gegen das von der Indikatorzellinie exprimierte Antigen gerichtet ist, zusammen und läßt das Reaktionsgemisch für einen Zeitraum aufeinander einwirken, der ausreichend ist, um eine mögliche Aggregation zu erhalten. Als Antikörper bzw. Antikörperpräparation können monoklonale oder polyklonale An­ tikörper eingesetzt werden. Entscheidend ist, daß die IgG An­ tikörper oder IgG Antikörperpräparationen, die im erfindungs­ gemäßen Verfahren eingesetzt werden, gegen ein Oberflächenan­ tigen gerichtet sind, welches auf der Indikatorzellinie vor­ kommt. Ein Beispiel hierfür ist das oben genannte Thy-1- Antigen. Beispielsweise können Antikörper-Spezifitäten einge­ setzt werden, die maus- und/oder ratte- und/oder human­ spezifisch sind. Selbstverständlich können auch andere Anti­ körper-Spezifitäten eingesetzt werden. Es muß jedoch sicherge­ stellt werden, daß diese Antikörper in Abwesenheit des bloc­ kierenden, anti-Fcγ-Rezeptor-Antikörpers deutlich nachweisbare Aggregate ausbilden. Geeignete Antikörper können durch an sich bekannte Testverfahren ermittelt werden. Es ist hierbei darauf zu achten, daß das betreffende Antigen in einer Kopienanzahl auf der Indikatorzellinie exprimiert wird, die eine deutliche Aggregatformation zuläßt. Eine derartige Indikatorzellinie ist beispielsweise die erfindungsgemäß eingesetzte Zellinie S49.1. Weitere mögliche Zellinien können vom Fachmann aufgrund der vorliegenden Beschreibung mit Hilfe einfacher Versuche ermit­ telt werden.

Wird nun zu einer Probe der Indikatorzellen ein gegen das Oberflächenantigen gerichteter Antikörper zugegeben, lagern sich die mit dem Antikörper beladenen Einzelzellen zu stabilen Aggregaten zusammen. Der Nachweis, daß diese homotypische Ag­ gregation der Indikatorzellen über die spezifische Interaktion des Fc-Teils des gebundenen Antikörpers mit dem zellständigen Fcγ-Rezeptor erfolgt, ergibt sich aus der Beobachtung, daß in Gegenwart eines Antikörpers, der an die Ligandenbindungsstelle des zellständigen Fcγ-Rezeptors bindet, eine Aggregatbildung ausbleibt. Ein derartiger Antikörper, der an die Ligandenbin­ dungsstelle des zellständigen Fcγ-Rezeptors RII oder RIII bin­ det, blockiert dessen Funktion, d. h. für eine nachfolgende In­ dikatorreaktion (Antikörper-Fcγ-Rezeptor-Interaktion) steht der Fcγ-Rezeptor RII oder RIII nicht mehr zur Verfügung. Stattdes­ sen beobachtet man, daß in einem solchen Testansatz die Indi­ katorzellen eindeutig erkennbar als Einzelzellen verbleiben. In der Aggregationsreaktion können natürlich nur solche IgG Antikörper-Subklassen erfaßt werden, die mit dem niedrig- affinen Fcγ-Rezeptor RII oder RIII interagieren.

Die Anwesenheit des zweiten Antikörpers, der an die Liganden­ bindungsstelle des zellständigen Fcγ-Rezeptors RII oder RIII bindet und dessen Funktion blockiert, erlaubt die erfindungs­ gemäß wichtige Unterscheidung zwischen der Bildung von homoty­ pischen Zell-Aggregaten aufgrund einer spezifischen Interakti­ on des Fc-Teils des gebundenen Antikörpers mit dem zellständi­ gen Fcγ-Rezeptor und einer unspezifischen Antikörperwirkung aufgrund von Wechselwirkungen zwischen den zellgebundenen An­ tikörpern. Als Folge von Unregelmäßigkeiten bei der Protein­ rückfaltung nach einer Säurebehandlung, wie sie beispielsweise während einer Aufreinigung von Antikörpern durchgeführt werden muß, kommt es nämlich zu intermolekularen homophilen Wechsel­ wirkungen und damit zu einer Aggregation der Indikatorzellini­ en, die eine Schädigung des IgG Antikörpers bzw. der IgG Anti­ körperpräparation anzeigen. Das unterschiedliche Verhalten von geschädigten und nicht geschädigten Antikörpern bzw. Antikör­ perpräparationen ist so erklärbar, daß der Rückfaltungsprozess zum nativ gefalteten Protein nach einer Säure-Denaturierung bei beispielsweise pH 2,7 nicht mehr vollständig verläuft und diese irreversible Schädigung des Proteins Auslöser für die Bildung von "unspezifischen" Zellaggregaten als Folge uner­ wünschter intermolekularer homophiler Wechselwirkungen zwi­ schen den zellgebundenen, auf ihre Unversehrtheit zu untersu­ chenden IgG Antikörpern oder IgG Antikörperpräparationen ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nicht zwingend not­ wendig, daß der tatsächlich aufzureinigende Antikörper, der häufig teuer ist und nur in geringen Mengen zur Verfügung steht, untersucht wird. Stattdessen kann ein Indikator- Antikörper, beispielsweise der in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Antikörper MmT1, stellvertretend für den tatsäch­ lich zu reinigenden Antikörper den gesamten Manipulationen ei­ nes ausgewählten Reinigungsverfahrens unterzogen werden. Hier­ bei hat der Indikator-Antikörper die gleiche Subklasse wie der tatsächlich zu reinigende Antikörper. Bevorzugte Subklassen sind Maus 2a und Ratte 2b. Der Indikator-Antikörper, der dem ausgewählten Reinigungsverfahren unterzogen wurde, wird dann im erfindungsgemäßen, rasch und extrem einfach durchzuführen­ den Aggregationstest, beispielsweise mit den S49.1-Zellen, un­ terworfen und auf mögliche reinigungsbedingte unspezifische, homophile Wechselwirkungen hin untersucht.

Die Bildung von Aggregaten erfolgt im allgemeinen bereits kurz nach dem Ansetzen des Tests, beispielsweise nach bereits 30 Minuten. Um eine sichere Aussage zu machen, sollte jedoch ab­ gewartet werden, bis sich große, deutlich sichtbare Zellaggre­ gate, zumindest in dem mitgeführten Kontrollansatz, gebildet haben. Dies ist üblicherweise nach 2 bis 3 Stunden der Fall, wobei jedoch auch über Nacht abgewartet werden und die Auswer­ tung am nächsten Tag erfolgen kann.

Um Falschaussagen zu vermeiden, ist die Durchführung eines Kontrollansatzes notwendig, der mit einem mit Sicherheit unge­ schädigten Antikörper durchgeführt wird. Da die verwendeten Indikatorzellen sich auch zufällig zusammenlagern können und so Zellaggregate vortäuschen, ist es empfehlenswert, am Ende der Inkubationszeit kräftig zu schütteln, um zufällige Aggre­ gationen wieder aufzulösen. Durch dieses Schütteln können je­ doch Aggregationen, die aufgrund einer Schädigung der IgG An­ tikörper entstanden sind, nicht beseitigt werden.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispie­ len näher erläutert.

Beispiele

Im vorliegenden Beispiel wurden S49.1 Zellen als in Suspen­ sionskultur permanent wachsende Indikatorzellinie eingesetzt, die auf ihrer Oberfläche in sehr großer Dichte das Thy-1 Anti­ gen und gleichzeitig, in deutlich geringerer Kopienzahl, den Fcγ-Rezeptor RIII exprimiert.

Es zeigte sich, daß bei Zugabe eines anti-Thy-1 Antikörpers zu einer Probe dieser Zellen eine stabile Aggregatbildung durch Zusammenlagerung der Antikörper beladenen Einzelzellen erfolg­ te.

Der Nachweis, daß diese homotypische Aggregation der S49.1 Zellen über die spezifische Interaktion des Fc-Teils des ge­ bundenen Antikörpers mit dem zellständigen Fcγ-Rezeptor er­ folgt, ergibt sich aus der Beobachtung, daß in Gegenwart des Antikörpers 2.4G2uk eine Aggregatformation ausbleibt. Der An­ tikörper 2.4G2uk bindet an die Ligandenbindungsstelle des zellständigen Fcγ-Rezeptors RIII und blockiert dessen Funktion. Für eine nachfolgende Indikatorreaktion (Antikörper-Fcγ- Rezeptor-Interaktion) steht der Fcγ-Rezeptor RIII dann nicht mehr zur Verfügung. Statt dessen beobachtet man, daß in einem solchen Testansatz S49.1 Zellen eindeutig erkennbar als Ein­ zelzellen den Boden der Mikrotiterplatte bedecken. In der Ag­ gregationsreaktion können natürlich nur solche IgG Antikörper- Subklassen erfaßt werden, die mit dem niedrig-affinen Fcγ- Rezeptor RIII interagieren.

Neben dieser spezifischen, durch den Antikörper 2.4G2uk inhi­ bierbaren Aggregation der S49.1 Zellen sind grundsätzlich wei­ tere Möglichkeiten der Formation von Zell-Aggregaten durch An­ tikörper vorstellbar. Auslöser für die Bildung solcher Zell- Zellaggregate könnten z. B. intermolekulare Interaktionen zwi­ schen Zell-gebundenen Antikörpermolekülen sein, die auf die veränderte Eigenschaft von Antikörper/Antikörperpräparationen zurückgehen und z. B. im Verlaufe von Aufreinigungsprozeduren als Folge von Unregelmäßigkeiten bei der Rückfaltung des Pro­ teins akquiriert werden. Für die Richtigkeit dieser Interpre­ tation spricht auch die Tatsache, daß Antikörper-Aggregate als weitere mögliche Auslöser solcher Zell-Aggregate durch vorhe­ rige Ultrazentrifugation (100000 xg für 30 min) aus der Probe entfernt wurden. Basierend auf dem erfindungsgemäß etablierten in vitro Test ist es möglich, solche unerwünschten Eigen­ schaften von Antikörpern/Antikörperpräparationen gezielt zu untersuchen, die beispielsweise bei den nachfolgend ausgeführ­ ten Reinigungsverfahren entstehen können.

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren ist von eminent prakti­ scher Bedeutung, da bei der Reinigung von IgG Antikörpern die­ se häufig sauren Bedingungen ausgesetzt werden, die oft zu Schädigungen führen.

Die erfindungsgemäß zu testenden Antikörper werden von Hybri­ domen produziert und als Kulturüberstand dieser Hybridome ge­ erntet. Sie können dann z. B. mit dem Standardverfahren der Af­ finitätschromatographie gereinigt werden. Die Affinitätschro­ matographie gehört zu den Reinigungsverfahren mit der höchsten Selektivität. Die Probe (Antikörper im Kulturüberstand) wird dabei an die mit Protein A oder alternativ mit Protein G sub­ stitutierte chromatographische Matrix gebunden und anschlie­ ßend mit einem geeigneten Eluenten desorbiert. Protein A- und Protein G-substituierte Matrices werden bereits in Säulen ge­ packt kommerziell vertrieben.

In den letzten 15 Jahren hat Protein A eine große Bedeutung in der schnellen Ein-Schritt-Affinitätschromatographie zur Reini­ gung von IgG Antikörpern aus unterschiedlichsten Ressourcen (Aszites, Kulturüberstand) gewonnen. Das bakterielle Polypep­ tid bindet mit seinem Immunglobulin-bindenden Bereichen mit sehr unterschiedlicher Affinität selektiv an den Fc-Teil aller Säugetier IgG Antikörper. Mit Ausnahme der IgG1 Subklasse ver­ fügen die übrigen Maus IgG Antikörper über eine mittlere Affi­ nität gegenüber Protein A. Aus praktischen Gründen wird meist mit einem einzigen Puffer im Bereich von pH 4,0 eluiert.

Für die Präparation von schlecht Protein A-bindenden IgG Anti­ körpern (z. B. fast allen Ratten IgG Subklassen) steht neuer­ dings mit Protein G ein weiterer bakterieller Rezeptor zur Verfügung, der sich besonders für die Aufreinigung von Ratten Immunglobulinen eignet. Wegen der hohen Bindungskonstante zwi­ schen IgG Antikörpern und Protein G erfordert die Ablösung der gebundenen Antikörper relativ saure Bedingungen. Aus prakti­ schen Gründen erfolgt die Elution bei Protein G bei einem pH von 2,7. Gerade diese pH Werte sind jedoch nachteilig.

Durchführung des Aggregationstests

Zur Durchführung des Tests bringt man eine Suspension von S49.1 Zellen (typischerweise 5 × 10⁴ Zellen in 50 µl Kulturmedi­ um) mit eine(m)r Antikörper/Antikörperpräparation (monoklonal oder polyklonal), der/die gegen das Thy-1 Antigen gerichtet ist, in der Kavität einer 96 well Mikrotiterplatte zusammen und läßt das Reaktionsgemisch für mehrere Stunden stehen. Da­ bei sind weder die Reihenfolge der Zugabe der Reaktanden noch das Volumen des Inkubationssansatzes (zwischen 100-200 µl) kritische Größen. Nach dieser Zeit sind in den Ansätzen cha­ rakteristische Zell-Aggregate am Boden der Vertiefung der Mi­ krotiterplatte entstanden, die visuell unter Zuhilfenahme ei­ nes Durchlichtmikroskops beurteilt werden (Abb. 1). Kräf­ tiges Schütteln der Platte am Ende der Inkubationszeit beugt möglichen Schwierigkeiten bei der Auswertung vor, wobei diese darauf beruhen könnten, daß sich S49.1-Zellen zufällig zusam­ menlagern und so Zell-Aggregate vortäuschen.

Für den Test werden üblicherweise Verdünnungsreihen (1 Teil Antikörper plus 1 Teil Kulturmedium) hergestellt, wobei in der stärkeren Verdünnung eines anti-Thy-1 Antikörpers keine Zell- Aggregate mehr auftreten.

Die Anwesenheit des Antikörpers 2.4G2uk (im Überschuß) in ei­ nem mitgeführten Parallelansatz erlaubt die wichtige Unter­ scheidung zwischen der Formation von homotypischen Zell- Aggregaten aufgrund von spezifischer (Interaktion des Fc-Teils des gebundenen Antikörpers mit dem zellständigen Fcγ-Rezeptor) oder unspezifischer (Wechselwirkungen zwischen den zell­ gebundenen Antikörpern) Antikörperwirkung.

Bei diesen Experimenten werden üblicherweise zwei Kontrollan­ sätze mitgeführt. In einem Ansatz befinden sich S49.1 Zellen zusammen mit einem beliebigen Kontroll-Antikörper, der keine Reaktivität gegenüber der S49.1-Zellen aufweist, aber der IgG Subklasse des zu untersuchenden anti-Thy-1 Antikörpers zugehö­ rig ist, während in den zweiten Inkubationsansatz nur der An­ tikörper 2.4G2uk zugegeben wird.

Im Anschluß wurden vergleichende Versuche durchgeführt, bei denen verschiedene Präparationen eines anti-Thy-1 Antikörpers (MmT1; Maus IgG Subklasse 2a) im S49.1-Aggregationstest unter­ sucht wurden. Es handelt sich dabei um Antikörper Präpara­ tionen, die einem sauren Milieu von pH 2,7 bzw. 4,0 ausgesetzt wurden. Diese Manipulation entspricht jenen Bedingungen, die bei der Ein-Schritt-Affinitätschromatographie mit Protein G (pH 2,7) bzw. A (pH 4,0) verwendet werden, um gebundene maus- Antikörper der Subklasse IgG2a vom Liganden abzulösen.

Bei diesen Versuchen zeigte sich, daß MmT1-Präparationen, die einem pH Wert von 2,7 ausgesetzt waren (entspricht den Ver­ hältnissen bei der Aufreinigung mit Protein G), Zell-Aggregate ausbilden, die durch den Antikörper 2.4G2uk nicht inhibier­ bar sind. Nachdem die Antikörperpräparation zuvor durch Ultra­ zentrifugation von Protein-Aggregaten geklärt wurde, erfolgt die Formation von Zell-Aggregaten hier ganz offensichtlich durch unspezifische Wechselwirkungen zwischen den zell­ gebundenen Antikörpern. Im Gegensatz dazu ist die Formation von Zell-Aggregaten durch MmT1-Präparationen, die einem pH Wert von 4,0 ausgesetzt waren (entspricht den Verhältnissen bei der Aufreinigung mit Protein A), durch den Antikörper 2.4G2uk hemmbar und muß infolgedessen auf spezifischen Inter­ aktionen der Fc-Teile der gebundenen Antikörper mit den zell­ ständigen Fcγ-Rezeptoren beruhen.

Das unterschiedliche Verhalten der beiden Antiköper- Präparationen kann nur so erklärt werden, daß der Rückfal­ tungssprozess zum nativ gefalteten Protein nach Säure- Denaturierung bei pH 2,7 nicht mehr vollständig verläuft. Die­ se irreversible Schädigung des Proteins ist der Auslöser für die Bildung von "unspezifischen" Zell-Aggregaten als Folge von unerwünschten intermolekularen homophilen Wechselwirkungen zwischen den Zell-gebundenen MmT1 Antikörpern.

Mit Hilfe des S49.1-Aggregationstests konnte dann der überaus wichtige Nachweis erbracht werden, daß nicht nur der Antikör­ per MmT1 durch Säure-Denaturierung irreversibel geschädigt wird. Vielmehr trifft diese Eigenschaft auch auf andere Anti­ körper der Maus IgG2a Subklasse zu. In diese Untersuchungen wurden zwei weitere anti-Thy-1 Antikörper der Maus IgG2a Sub­ klasse (MmT5 und MmTC) mit aufgenommen (siehe Tabelle). Aus den Ergebnissen dieser Untersuchungen läßt sich die folgende Regel ableiten: Die Zugehörigkeit eines Antikörpers zu einer bestimmten IgG-Subklasse scheint im Hinblick auf irreversible Veränderungen/Beeinträchtigungen (z. B. durch Säure- Denaturierung) eine bestimmende Größe zu sein.

Genau diese Subklassen-restringierte Eigenschaft ermöglicht es, daß Antikörper wie der MmT1 stellvertretend für andere An­ tikörper-Spezifitäten den gesamten Manipulationen eines ausge­ wählten Reinigungsverfahrens unterzogen werden, um sie an­ schließend in dem rasch und extrem einfach durchzuführenden Aggregationstest auf mögliche Reinigungs-bedingte homophile Wechselwirkungen hin zu untersuchen. Diesem Sachverhalt kommt umsomehr Bedeutung zu, als Maus IgG2a Antikörper (Panorex; OKT3) als sog. protektive Subklasse beim Menschen therapeu­ tisch eingesetzt werden.

Die bei den obenstehend beschriebenen Versuchen eingesetzten Antikörper wurden in der Spezies Maus generiert und gehören der IgG-Klasse und der Subklasse IgG2a an. Diese Antikörper- Subklasse wird wie die Ratten IgG2b-Subklasse den sog. "protek­ tiven Antikörpern" zugerechnet. Diese Bezeichnung ergab sich aus Studien im Tiermodell, in denen gefunden wurde, daß sich beide Antikörper-Subklassen optimal dazu eignen, beispielswei­ se in vivo Tumorzellen zu eliminieren. In weiteren Versuchen wurden mit dem erfindungsgemäß bereitgestellten Aggregations­ test auch Ratten IgG2b Antikörper (3 verschiedene IgG2b Anti­ körper, ebenfalls mit anti-Thy-1 Spezifität) untersucht; hier­ bei konnten die bei den Maus IgG2a anti-Thy-1 Antikörpern ge­ wonnenen Ergebnisse bestätigt werden, d. h. auch eine Reinigung eines Ratten IgG2b Antikörpers bei einem stark sauren pH Wert von beispielsweise 2,7 führte im Test zur Aggregation der Zel­ len und zeigte eine irreversible Schädigung des gereinigten Antikörpers an.

LITERATURLISTE

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4. Norman, D. J., Kahana, L., Stuart, F. P. J., Thistlewai­ te, J. R. J.,. Shield, C. F., Manaco, A., Dehlinger, J., Wu, S. C., Van Horn, A., Haverty T. P., 1993. A rando­ mized clinical trial of induction therapy with OKT3 in kidney transplantation. Transplantation 55: 44-50.
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Tabelle: Auflistung der verwendeten monoklonalen Antikörper

Claims (8)

1. Verfahren zum Nachweis einer irreversiblen Schädigung von IgG Antikörpern mit den nachfolgenden Schritten:

• a) Inkontaktbringen von IgG Antikörpern oder IgG Anti­ körperpräparationen, die gegen ein Oberflächenantigen auf einer Fcγ-Rezeptor RII und/oder RIII exprimieren­ den Zellinie gerichtet sind und die im nativen Zu­ stand an den Fcγ-Rezeptor RII oder RIII binden kön­ nen, mit einer in Suspensionskultur wachsenden, Fcγ- Rezeptor RII und/oder RIII und das Oberflächenantigen exprimierenden Zellinie;
• b) Zugabe eines zweiten Antikörpers, der gegen die Li­ gandenbindungsstelle des Fcγ-Rezeptors RII oder RIII gerichtet ist, zur im Schritt (a) erhaltenen Mi­ schung;
• c) Analyse des Aggregationsverhaltens der Zellen zur Bestimmung einer möglichen Schädigung der IgG Anti­ körper oder der IgG Antikörperpräparation, wobei
  • 1. α) eine Aggregation der Zellen eine Schädigung des IgG Antikörpers oder der IgG Antikörperpräpara­ tion anzeigt; und
  • 2. β) keine Aggregation oder eine reversible, unspezi­ fische Aggregation die Unversehrtheit des IgG Antikörpers oder der IgG Antikörperpräparation anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als IgG Antikörper ein Antikörper der Subklasse 2a oder 2b eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als IgG Antikörper ein Human-Antikörper oder Nager-Anti­ körper, beispielsweise Maus- oder Ratten-Antikörper oder ein Inter-Spezies-Antikörper eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der IgG Antikörper gegen ein Oberflächenantigen gerichtet ist, das als Marker für T-Zellen dient.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper ein anti-Thy-1 Antikörper eingesetzt wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Fcγ-Rezeptor RII und/oder RIII exprimierende Zellen B- Lymphozyten, T-Lymphozyten, Granulozyten, natürliche Kil­ lerzellen oder Mastzellen eingesetzt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Zellinie S49.1 (ATCC TIB 28) eingesetzt wird.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der IgG Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler An­ tikörper ist.