DE102004059357A1

DE102004059357A1 - Antikörper, welcher die Interaktion von humanem Thy-1 und dessen Liganden blockiert, sowie dessen Verwendung

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Publication number: DE102004059357A1
Application number: DE102004059357A
Authority: DE
Inventors: Anne Dr.rer.nat.habil. Saalbach; Anne Dipl.-Biol. Wetzel; Ulf Dr.rer.nat.habil. Anderegg
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2004-12-03
Filing date: 2004-12-03
Publication date: 2006-06-14
Anticipated expiration: 2024-12-04
Also published as: DE102004059357B8; DE102004059357B4

Abstract

Die Erfindung betrifft Antikörper, welche die Interaktion von humanem Thy-1 (CD90) und dessen Liganden blockieren, sowie deren Verwendung. DOLLAR A Die Interaktion des humanen Thy-1 (CD90) mit seinen Liganden spielt eine entscheidende Rolle bei der Entzündungsreaktion und Tumormetastasierung. Substanzen, die diese Interaktion blockieren können, sind potentielle Wirkstoffe für die Behandlung von Entzündungskrankheiten (Psoriasis, Rheumatoide Arthritis) und Krebs (Melanoma).

Description

Die Erfindung betrifft Antikörper, welche die Interaktion von humanem Thy-1 (CD90) und dessen Liganden blockieren, sowie deren Verwendung.
Die Interaktion des humanen Thy-1 (CD90) mit seinen Liganden spielt eine entscheidende Rolle bei der Entzündungsreaktion und Tumormetastasierung. Substanzen, die diese Interaktion blockieren können, sind daher potentielle Wirkstoffe für die Behandlung von Entzündungskrankheiten (Psoriasis, Rheumatoide Arthritis) und Krebs (Melanoma).
Thy-1 und CD90 sind alternative Bezeichnungen für ein relativ kleines Glycoprotein, (112 Aminosäuren nach Abspaltung des Signalpeptis), welches aus einer einzigen Immunoglobulin-ähnlichen Domaine aufgebaut und über einen GPI-Anker in die Zellmembran integriert ist (Protein ID-Nr. NP_006279). Sein Gen lokalisiert im Menschen auf Chromosom 11 (UniGene Nr. Hs. 134643).
Murines Thy-1 ist ein charakteristischer Oberflächenmarker für T-Lymphozyten und ist vermutlich an Zell-Zell-Interaktionen insbesondere zwischen T-Zellen bzw. Thymozyten und Stromazellen der Maus beteiligt. Weiterhin wurde gezeigt, dass das murine Thy-1 mit dem αβ3 (CD51/CD61) auf Astrozyten interagiert. Die physiologische Bedeutung dieser Interaktion ist jedoch noch nicht aufgeklärt.
Diese im Modellsystem Maus gewonnenen Ergebnisse lassen sich jedoch nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen. Eine Hauptursache dafür ist, dass sich das Expressionsmuster von Thy-1 in der Maus grundlegend von dem im Menschen unterscheidet. So wird humanes Thy-1 im Gegensatz zu murinem Thy-1 so gut wie gar nicht auf T-Lymphozyten exprimiert. Stattdessen wird Thy-1 im Menschen auf der Oberfläche von Fibroblasten, Nervenzellen, aktivierten mikrovaskulären Endothelzellen und in einer Subpopulation von CD34+ Blutstammzellen exprimiert.
Über die Funktion des humanen Thy-1 ist nur sehr wenig bekannt. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass das humane Thy-1 auf aktivierten Endothelzellen über die Interaktion mit dem Mac-1 (CD11b/CD18) an der Adhäsion und Transmigration von Monozyten und neutrophilen Granulozyten beteiligt ist (Wetzel et al 2004).
Die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel ist von außerordentlicher Bedeutung für die Extravasation von Entzündungszellen, die bei akuten und chronischen Entzündungen beobachtet wird. Der Nachweis, dass das humane Thy-1 mit dem Mac-1 auf Monozyten und neutrophilen Granulozyten interagiert, zeigt, dass das humane Thy-1 ein wichtiges Adhäsionsmolekül auf aktivierten Endothelzellen ist, welches entscheidend zur Rekrutierung von Leukozyten in das umliegende Gewebe beiträgt.
Weiter konnte gezeigt werden, dass das humane Thy-1 auch an der Adhäsion von Melanomzellen an das Endothel beteiligt ist und daher eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung spielen könnte (Saalbach et al 2002). Der Interaktionspartner von Thy-1 auf den Melanomzellen ist bisher noch nicht identifiziert.

Antikörper, die das humane Thy-1 erkennen, sind bereits bekannt. Es steht jedoch ausser Zweifel, dass sich verschiedene monoklonale Antikörper gleicher nomineller Spezifität, d.h. auch wenn sie gegen ein und dasselbe Antigen gerichtet sind, in der Feinstruktur ihrer Epitope sowie in ihren weiteren Eigenschaften, die für ihre Eignung in einem bestimmten Test oder für eine bestimmte Anwendung wichtig sein können, unterscheiden.

Der monoklonale anti-Thy-1-Antikörper AS02 ( DE 44 07 242 C2 ) ist ein Maus-Antikörper vom Typ IgG₁. Er wurde durch Immunisierung von Balb c-Mäusen mit einer Fraktion eines Extrakts humaner Fibroblasten erhalten. Die Bindung von AS02 an Thy-1 ist konformationsabhängig, da nach Reduktion der Disulfidbrücke der Antikörper das Thy-1 nicht mehr erkennt.

Dieser Antikörper ist jedoch nicht in der Lage, die Interaktion von Thy-1 mit seinen Liganden bzw. die Interaktion von Zellen, die Thy-1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, mit Thy-1 Ligand-exprimierenden Leukozyten bzw. Melanomzellen zu blockieren. Offensichtlich erkennt der Antikörper AS02 ein Thy-1-Epitop, das nicht Bestandteil der Liganden-Bindungsstelle ist.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der Erfindung einen Antikörper bereitzustellen, welcher die Interaktion von humanem Thy-1 und dessen Liganden blockiert.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch einen Antikörper, welcher spezifisch humanes Thy-1 (CD90) erkennt und die Bindung von humanem Thy-1 (CD90) an dessen Liganden blockiert. Der erfindungsgemäße Antikörper erkennt dabei die Integrin-Interaktionsseite auf der Oberfläche des Thy-1-Moleküls und blockiert somit die Interaktion des Thy-1 mit seinen Liganden, wie z. B. dem humanen Leukozyten-Integrin Mac-1 (CD11b/CD18) bzw. die Interaktion von Thy-1 exprimierenden Zellen mit Zellen, die Thy-1 Liganden exprimieren.

Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass die Interaktion des Thy-1 auf aktivierten Endothelzellen mit Oberflächenmolekülen (Integrine wie z.B. Mac-1) auf Leukozyten eine wichtige Rolle in der Rekrutierung von Leukozyten zu lokalen entzündeten Geweben und in der Transmigration von Tumorzellen durch die Endothelzellen-Barriere darstellt.

Da der erfindungsgemäße Antikörper in der Lage ist,

(1) eine der Interaktionen von humanem Thy-1 mit seinen Liganden bzw.
(2) die Interaktion von Zellen, die Thy-1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, mit Leukozyten bzw. Melanomzellen

zu blockieren, kann er vorteilhaft als Arzneimittel zur Behandlung von Entzündungs- und Tumorerkrankungen eingesetzt werden.

Zur Herstellung funktionsblockierender monoklonaler Antikörper gegen das humane Thy-1 werden Mäuse mit Thy-1-transfizierten CHO-Zellen immunisiert und die Milzzellblasten mit einer Myelomzelllinie nach dem Prinzip von Köhler und Milstein fusioniert (Köhler und Milstein, 1975). Die Antikörper produzierenden Hybridome werden daraufhin getestet, ob die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper an die Thy-1-transfizierten, aber nicht an die nur mit dem Vektor transfizierten CHO-Zellen binden. Ausserdem werden die monoklonalen Antikörper daraufhin untersucht, ob sie nicht nur das rekombinante Thy-1-Protein auf den transfizierten CHO-Zellen erkennen, sondern ob sie auch Fibroblasten erkennen können, die bekanntermaßen das Thy-1 konstitutiv exprimieren.

Bevorzugt ist der Antikörper ein monoklonaler Maus-Anti-Mensch-Antikörper vom Typ IgG₃.

Ein besonders bevorzugter Antikörper, der spezifisch humanes Thy-1 (CD90) erkennt und die Bindung von humanem CD90 an die Thy-1- Liganden blockiert, ist ein Antikörper mit der Bezeichnung „BC9-G2", erhältlich aus der Hybridoma-Zelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2690, wie am 06.09.2004 bei der DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH – in Braunschweig (Deutschland) hinterlegt.

Der monoklonale Antikörper BC9-G2 erkennt die Thy-1-transfizierten CHO-Zellen und die Thy-1-exprimierenden Fibroblasten, aber nicht die vektor-transfizierten Kontrollzellen Die Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers BC9-G2, die Bindung von Thy-1 an seine Liganden zu blockieren, kann dadurch getestet werden, dass Thy-1 exprimierende CHO-Zellen und vektortransfizierte Kontrollzellen mit dem monoklonalen Antikörper BC9-G2 vorinkubiert werden. Anschliessend wird die Bindung von neutrophiten Granulozyten und Melanomzellen an die so vorinkubierten CHO-Thy-1-Zellen und vektor-transfizierte Kontrollzellen bestimmt.

Der monoklonale Antikörper BC9-G2 ist dabei in der Lage, die Adhäsion von neutrophilen Granulozyten und Melanomzellen an die Thy-1-transfizierten Zellen deutlich zu hemmen (60–80% Hemmung). Sowohl der bereits beschriebene anti-Thy-1-Antikörper AS02 als auch ein IgG-Kontrollantikörper sind nicht in der Lage, die Thy-1-spezifische Adhäsion direkt zu hemmen.

Erfindungsgemäß umfasst der Begriff „Antikörper" auch die von dem monoklonalen Antikörper, welcher spezifisch humanes Thy-1 (CD90) erkennt und die Bindung von humanem CD90 an die Thy-1- Liganden blockiert, abgeleiteten Produkte wie humanisierte Antikörper und Antikörper-Fragmente.

Ein humanisierter monoklonaler Antikörper umfasst die Thy-1 bindenden hypervariablen Regionen des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers und die Framework-Regionen der variablen und konstanten Regionen der leichten und schweren Ketten eines humanen Antikörpers. Verfahren zur Herstellung von humanisierten Antikörpern sind bekannt und u.a. in Morrison et al. (1984), Jones et al. (1986), Verhoeyen et al. (1988), Riechmann et al. (1988), Queen et al. (1989) und Tempest (1991) beschrieben.

Antikörperfragmente sind vorzugsweise Antigen bindende Fragmente des Antikörpers, die Thy-1 bindende Regionen enthalten wie F(ab₂) oder F(ab). Verfahren zur Herstellung von F(ab₂) oder F(ab)-Fragmenten sind bekannt und in Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, http://www.wiley.com/legacy/cp/cpi/) beschrieben.

Die Erfindung umfasst auch die hinterlegte Hybridoma-Zelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2690.

Teil der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Thy-1 (CD90), erzeugt durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit humanem Thy-1 (CD90), Fusion ihrer Milzzellen, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridome in einem Selektivmedium, Klonierung und Weitervermehrung der reaktiven und spezifischen Hybridome durch Kultivierung (Prinzip von Köhler und Milstein), bei dem zu Kultivierung und Antikörperproduktion die Hybridoma-Zelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2690 eingesetzt wird.

Der erfindungsgemäße Antikörper oder ein davon abgeleitetes Produkt eignet sich für den qualitativen und quantitativen Nachweis von humanem Thy-1 (CD90) bzw. Thy-1-exprimierenden Zellen, beispielsweise mittels Durchflusszytometrie, Western Blot, Immunoblots, Immunopräzipitation, FACS-Analyse und der Immunhistologie.

Die Erfindung umfasst auch ein immunologisches Testkit, das mindestens einen Antikörper oder ein davon abgeleitetes Produkt enthält.

Ausserdem kann der erfindungsgemäße Antikörper oder ein davon abgeleitetes Produkt auch zur Isolierung von Thy-1 (CD90) verwendet werden, beispielswiese über die Entfernung von Thy-1 aus Lösungen mittels affinitätschromatographischer Methoden. Z. B. kann man durch Kopplung des Antikörpers an bekannte Matrices, wie Protein A-Sepharose oder mit anti-Maus-IgG-gekoppelte Sepharose, ein Affinitätsgel herstellen, auf dem der erfindungsgemäße Antikörper verankert ist. Leitet man dann die Thy-1 haltige Lösung, beispielsweise ein Fibroblastenextrakt, über eine derartige Matrix, wird Thy-1 an ihr selektiv gebunden.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers oder der davon abgeleiteten Produkte zur Blockierung der Interaktion von humanem Thy-1 (CD90) mit seinen Liganden, insbesondere mit dem Liganden MacI (CD11b/CD18).

Eine weitere erfindungsgemäße Verwendung der Antikörper oder der davon abgeleiteten Produkte ist die Blockierung der Interaktion von Zellen, die Thy-1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, mit Zellen, die einen Thy-1-Liganden auf ihrer Oberfläche exprimieren.

Thy-1 auf ihrer Oberfläche exprimierende Zellen sind dabei beispielsweise Fibroblasten, Nervenzellen, aktivierte mikrovaskuläre Endothelzellen und CD34+ Blutstammzellen.

Zellen, die einen Thy-1-Liganden auf ihrer Oberfläche exprimieren, sind beispielsweise Monozyten, neutrophile Granulozyten, dendritische Zellen und Melanomzellen.

Bevorzugt ist dabei die Verwendung der Antikörper oder davon abgeleiteter Produkte zur Blockierung der Interaktion von Tumorzellen oder Immunzellen mit Endothelzellen bzw. Endothelgewebe. Die Tumorzellen sind dabei bevorzugt Melanomzellen. Die Immunzellen sind insbesondere Leukozyten, beispielsweise Monozyten und neutrophile Granulozyten.

Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der Antikörper oder davon abgeleiteter Produkte zur Behandlung von Entzündungskrankheiten, wie z.B. Psoriasis, Rheumatoide Arthritis, oder Tumorerkrankungen, wie z. B. Melanoma oder dessen Metastasen.

Die Erfindung beinhaltet auch eine pharmazeutische Zubereitung, welche einen Antikörper oder ein davon abgeleitetes Produkt enthält. Mit besonderem Vorteil kommt ein entsprechender humanisierter monoklonaler Antikörper zur prophylaktischen und therapeutischen Anwendung.

Anhand der nachfolgenden Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert.
Ausführungsbeispiel 1:
Herstellung eines funktionsblockierenden monoklonalen anti-Thy-1-Antikörpers
Mit Thy-1 transfizierte CHO (chinese hamster ovary)-Zellen werden durch Behandlung mit einer Protease von der Kulturfläche abgelöst, durch radioaktive Bestrahlung getötet und zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen verwendet. Die Balb/c Mäuse werden dazu neun Wochen und drei Wochen vor der Booster-Injektion intraperitoneal mit 1 × 10⁷ Zellen der Thy-1 transfizierten CHO-Zelllinie immunisiert. Die Mäuse werden getötet und die Milz entfernt. Aus der Milz werden Antkörper produzierende Maus-Lymphozyten präpariert, die nach der Methode von Köhler und Milstein (Köhler und Milstein, 1975) unter Einsatz von Polyethylenglycol mit X63-Ag.8.653 Myelomzellen fusioniert werden.
Die Zellüberstände der erhaltenen Hybridomazellen werden durchflusszytometrisch auf Antikörper getestet, die Thy-1 transfizierte CHO-Zellen, aber nicht die lediglich mit leerem Vektor transfizierten Kontrollzellen binden können. Diese Antikörper werden weiterhin getestet, ob sie nicht nur das rekombinante Thy-1-Protein auf den transfizierten CHO-Zellen erkennen, sondern auch Fibroblasten, die Thy-1 konstitutiv exprimieren.
1 zeigt die durchflusszytometrisch bestimmte Bindung des monoklonalen Antikörpers BC9-G2 an Thy-1 transfizierte CHO-Zellen und Fibroblasten. Der monoklonale Antikörper BC9-G2 bindet an Thy-1 transfizierte CHO-Zellen (schwarze Linie, grau hinterlegt) und Fibroblasten (schwarze Linie, schwarz hinterlegt), aber nicht an die vektortransfizierten Kontrollzellen (graue Linie, weißer Hintergrund). Ein Isotypantikörper (schwarze Linie, weißer Hintergrund) wird als Kontrolle der unspezifischen Bindung verwendet und bindet nicht an die CHO-Thy-1 Zellen und nicht an die Fibroblasten.
Ausführungsbeispiel 2
Kreuzimmunpräzipitationsversuche mit BC9-G2 und AS02
2 zeigt das Ergebnis des Kreuzimmunopräzipitationsversuchs mit den monoklonalen Antikörpern BC9-G2 und AS02 (eigenes Labor bzw. erhältlich von IBFB PHARMA GmbH, Leipzig).
Der monoklonale anti-Thy-1 Antikörper AS02 (10 μg) wird dazu bei 4°C über Nacht an 1 × 10⁸ der Ziege-anti-Maus IgG-DYNABEADS^R M450 (Dynal/Oslo, Norwegen) – Magnetbeads gebunden. Die Beads werden mit PBS (phosphate buffered saline) gewaschen und anschließend mit einem Rohextrakt von 5 × 10⁶ Thy-1 exprimierenden humanen Fibroblastenzellen für 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Die an die Magnetbeads gebundenen Proteine werden extensiv mit PBS/0,3 % Tween 20 gewaschen und mit SDS-Gelbeladungspuffer von den Beads eluiert. Die so gereinigten Proteine werden mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Die isolierten Proteine werden mit dem monoklonalen Antikörper BC9-G2 (Spur 4) bzw. einem irrelevanten IgG-Kontrollsantikörper (Spur 3) (Immunotech, Hamburg) und einem sekundären Ziege-anti-Maus-Antikörper, der mit alkalische Phosphatase konjugiert ist, detektiert.
Ein irrelevanter IgG-Kontrollantikörper (Spur 1) (Immunotech, Hamburg) und der monoklonale Antikörper anti-Thy-1 Antikörper BC9-G2 (10 μg) (Spur 2) werden ebenfalls bei 4°C über Nacht an 1 × 10⁸ der Ziege-anti-Maus IgG-DYNABEADS^R M450 (Dynal/Oslo, Norwegen) -Magnetbeads gebunden. Die Beads werden mit PBS (phosphate buffered saline) gewaschen und anschließend mit einem Rohextrakt von 5 × 10⁶ Fibroblastenzellen für 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Die an die Magnetbeads gebundenen Proteine werden extensiv mit PBS/0,3 % Tween 20 gewaschen und mit SDS-Gelbeladungspuffer von den Beads eluiert. Die isolierten Proteine wurden mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Die isolierten Proteine werden mit dem Thy-1 spezifischen monoklonalen Antikörper AS02 und einem sekundären Ziege-anti-Maus-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, detektiert.
Der monoklonale Antikörper BC9-G2 präzipitiert also ein Antigen aus dem Fibroblastenextrakt, das durch einen etablierten anti-Thy-1-Antikörper (mAK AS02) erkannt wird. Der monoklonale Antikörper BC9-G2 erkennt das humane Thy-1-Protein.
Ausführungsbeispiel 3:
Blockierung der Bindung von Thy-1 an seine Liganden durch BC9-G2
Der monoklonale Antikörper BC9-G2 wird auf seine Fähigkeit getestet, die Adhäsion von neutrophilen Granulozyten und Melanomzellen an Thy-1-transfizierte Zellen zu hemmen. Dazu wird die Bindung von neutrophilen Granulozyten bzw. Melanomzellen an die Thy-1-transfizierten CHO-Zellen und vektor-transfizierte Kontrollzellen nach Vorinkubation mit dem Antikörper bestimmt.
Vektor-transfizierte CHO-Zellen und Thy-1 transfizierte CHO-Zellen werden auf Chamber Slides (NUNC, Wiesbaden) ausgesät und 24 Stunden kultiviert. Die Bildung eines komplett dichten Zellrasens wird mikroskopisch kontrolliert.
Melanomzellen bzw. neutrophile Granulocytenzellen werden mit D-Biotinoyl-e-aminocapronsäurehydroxysuccinimidester (Roche Biohemicals, Mannheim) nach Herstellervorschrift biotinyliert.
Für Blockierungsexperimente mit dem monoklonalen Antikörper BC9-G2 werden die Thy 1-transfizierten CHO-Zellen bzw. die vektor-transfizierten Kontrollzellen vor dem Zelladhäsionsversuch für 30 Minuten mit dem Antikörper BC9-G2 inkubiert. Anschliessend wird der Zelladhäsionsversuch wie unten beschrieben durchgeführt.
Als Kontrolle werden die jeweiligen Zellen vor dem Zelladhäsionsversuch mit dem monoklonalen Antikörper AS02 bzw. mit Igel inkubiert. Anschliessend werden die Zelladhäsionsversuche wie unten beschrieben durchgeführt.
Für die Zelladhäsionsversuche werden zu jedem Well der Chamber Slides 5 × 10⁵ biotinylierte Zellen gegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C werden die ungebundenen Zellen mit mehreren Waschschritten mit PBS entfernt. Adhärente Zellen werden mit eiskaltem Methanol für 10 Minuten bei 20°C fixiert, luftgetrocknet und durch Inkubation mit PBS/1% BSA blockiert. Anschließend werden die adhärenten biotinylierten Zellen mit CY3^TM-konjugiertem Streptavidin (Beckman Coulter, 1:5000 in PBS/1% BSA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mehrmals mit PBS gewaschen. Die adhärenten biotinylierten Melanomzellen bzw. Granulozyten sind danach im Fluoreszenzmikroskop nachweisbar und werden in je 10 mikroskopischen Feldern ausgezählt.
Wie in 3 gezeigt, ist der monoklonale Antikörper BC9-G2 in der Lage, die Adhäsion von neutrophilen Granulozyten und Melanomzellen an die Thy-1-transfizierten Zellen deutlich zu hemmen (60–80% Hemmung). Sowohl der anti-Thy-1-Antikörper AS02 als auch ein IgG-Kontrollantikörper sind nicht in der Lage, die Thy-1-spezifische Adhäsion zu hemmen. Das Balkendiagramm stellt die prozentuale Hemmung der Adhäsion der Melanomzellen (Balken 1, 2, 3) und der neutrophilen Granulozyten (Balken 4, 5, 6) durch die verschiedenen Antikörper (Igel, AS02, BC9-G2) an das Thy-1 dar.
Ausführungsbeispiel 4:
Die monoklonalen anti-Thy-1-Antikörper AS02 und BC9-G2 erkennen unterschiedliche Epitope auf dem Thy-1.
Der monoklonale Antikörper AS02 wird mit D-Biotinoyl-e-aminocapronsäurehydroxysuccinimidester (Roche Biohemicals, Mannheim) nach Herstellervorschrift biotinyliert. Fibroblasten, die konstitutiv das Thy-1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, werden mit dem monoklonalten Antikörper AS02, mit dem monoklonalen Antikörper BC9-G2 bzw. mit einem irrelevanten IgG-Kontrollantikörper für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen gewaschen und der biotinylierte mAK AS02 zugegeben. Die Bindung des biotinylierten AS02 wird mittels fluoreszenz-markiertem Streptavidin im Durchflußzytometer bestimmt.
Wie in 4 zu sehen, ist der AS02 (grau gestrichelte Linie) selbst in der Lage, die Bindung des biotinylierten AS02 zu hemmen, da beide Antikörper an das gleiche Epitop binden. Im Gegensatz dazu ist weder der Kontrollantikörper (graue Linie) noch der monoklonale Antikörper BC9-G2 (schwarze Linie) in der Lage, die Bindung des biotinylierten AS02 zu beeinflussen. Diese Daten zeigen, dass der monoklonale Antikörper BC9-G2 ein anderes Epitop als der monoklonale Antikörper AS02 erkennt, da die Bindung des einen Antikörpers nicht die Bindung des anderen beeinflusst.
Literatur

Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons) Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober Series Editor: Richard Coico; link: http: //www.wiley.com/legacy/cp/cpi/
Jones PT, Dear PH, Foote J, Neuberger MS, Winter G. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5.
Köhler und Milstein Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256: S. 495 – 497
Morrison SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi VT. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Nov;81(21):6851-5.
Queen C, Schneider WP, Selick HE, Payne PW, Landolfi NF, Duncan JF, Avdalovic NM, Levitt M, Junghans RP, Waldmann TA. A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Dec;86(24):10029-33.
Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G. Reshaping human antibodies for therapy. Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7.
Saalbach A, Hildebrandt G, Haustein UF, Anderegg U. The Thy-1/Thy-1 ligand interaction is involved in binding of melanoma cells to activated Thy-1- positive microvascular endothelial cells. Microvasc Res. 2002 Ju1;64(1):86-93.
Tempest PR, Bremner P, Lambert M, Taylor G, Furze JM, Carr FJ, Harris WJ. Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respiratory syncytial virus infection in vivo. Biotechnology (NY). 1991 Mar;9(3):266-71.
Verhoeyen M, Milstein C, Winter G. Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity. Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6.
Wetzel A, Chavakis T, Preissner KT, Sticherling M, Haustein UF, Anderegg U, Saalbach A. Human Thy-1 (CD90) on activated endothelial cells is a counterreceptor for the leukocyte integrin Mac-1 (CD11b/CD18). J Immunol. 2004 Mar 15;172(6):3850-9.

Claims

Antikörper, welcher spezifisch humanes Thy-1 (CD90) erkennt, dadurch gekennzeichnet, dass er die Bindung von humanem Thy-1 (CD90) an dessen Liganden blockiert.
Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er ein monoklonaler Maus-Anti-Mensch-Antikörper vom Typ IgG3 ist.
Antikörper erhältlich aus der Hybridoma-Zelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2690.
Von Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 3 abgeleitete humanisierte Antikörper oder F(ab₂)- oder F(ab)-Antikörper-Fragmente.
Hybridoma-Zelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2690.
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Thy-1 (CD90), erzeugt durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit humanem Thy-1 (CD90), Fusion ihrer Milzzellen, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridome in einem Selektivmedium, Klonierung und Weitervermehrung der reaktiven und spezifischen Hybridome durch Kultivierung, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kultivierung und Antikörperproduktion die Hybridoma-Zelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2690 eingesetzt wird.
Verwendung eines Antikörpers oder eines davon abgeleiteten Produkts nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Nachweis oder zur Isolierung von humanem Thy-1 (CD90) bzw. Thy-1 exprimierender Zellen.
Verwendung eines Antikörpers oder eines davon abgeleiteten Produkts nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Blockierung der Interaktion von humanem Thy-1 (CD90) und seinen Liganden.
Verwendung eines Antikörpers oder eines davon abgeleiteten Produkts nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Blockierung der Interaktion von Tumorzellen oder Immunzellen mit Endothelzellen bzw. Endothelgewebe.
Verwendung eines Antikörpers oder eines davon abgeleiteten Produkts nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzellen Melanomzellen sind.
Verwendung eines Antikörpers oder eines davon abgeleiteten Produkts nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunzellen Leukozyten sind.
Verwendung eines Antikörpers oder eines davon abgeleiteten Produkts nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Behandlung von Tumoren oder von entzündlichen Erkrankungen.
Verwendung eines Antikörpers oder eines davon abgeleiteten Produkts nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Tumor um Melanoma oder dessen Metastasen handelt.
Immunologisches Testkit, mindestens enthaltend einen Antikörper oder ein davon abgeleitetes Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Pharmazeutische Zubereitung enthaltend einen Antikörper oder ein davon abgeleitetes Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 4.