JP2001066308A - ＩｇＧ抗体の不可逆的損傷の検出 - Google Patents
ＩｇＧ抗体の不可逆的損傷の検出Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＩｇＧ抗体の損傷を検出することができる方
法を提供すること。 【解決手段】 ＩｇＧ抗体の不可逆的損傷を検出するた
めの方法であって、(a) Fcγ受容体RII及び／又はRIII
を発現している細胞株上の表面抗原に対するＩｇＧ抗体
であって、Fcγ受容体RII又はRIIIに結合する能力を有
するものを、懸濁培養中で増殖し且つFcγ受容体RII及
び／又はRIIIと該表面抗原とを発現している細胞株と接
触させるステップと、(b) Fcγ受容体RII又はRIIIのリ
ガンド結合部位に対する第２の抗体を(a)で得られた混
合物に加えるステップと、(c)該ＩｇＧ抗体に生じてい
る可能性のある損傷の測定のため細胞の凝集挙動を分析
するステップとを含み、α）該細胞の凝集が該ＩｇＧ抗
体の損傷を示し、β）凝集のないこと又は可逆的で非特
異的な凝集が該ＩｇＧ抗体が無傷であることを示すもの
である方法。
法を提供すること。 【解決手段】 ＩｇＧ抗体の不可逆的損傷を検出するた
めの方法であって、(a) Fcγ受容体RII及び／又はRIII
を発現している細胞株上の表面抗原に対するＩｇＧ抗体
であって、Fcγ受容体RII又はRIIIに結合する能力を有
するものを、懸濁培養中で増殖し且つFcγ受容体RII及
び／又はRIIIと該表面抗原とを発現している細胞株と接
触させるステップと、(b) Fcγ受容体RII又はRIIIのリ
ガンド結合部位に対する第２の抗体を(a)で得られた混
合物に加えるステップと、(c)該ＩｇＧ抗体に生じてい
る可能性のある損傷の測定のため細胞の凝集挙動を分析
するステップとを含み、α）該細胞の凝集が該ＩｇＧ抗
体の損傷を示し、β）凝集のないこと又は可逆的で非特
異的な凝集が該ＩｇＧ抗体が無傷であることを示すもの
である方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＩｇＧ抗体の不可
逆的損傷の検出のための方法に関する。
逆的損傷の検出のための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】診断分野において及び治療方法として、
モノクローナル抗体は益々ヒトに使用されるようになっ
ている。モノクローナル抗体をたびたび使用する場合に
起こりうる重大な問題は、タンパク質Ａ又はＧを用いた
ワンステップ・アフィニティークロマトグラフィーのよ
うな通常の精製方法が、抗体の結合特性を損なうことで
ある。近年の熱力学的研究は、進化の過程で、多数のタ
ンパク質が、低い安定性に関して選択されたことを明ら
かにするに至った。同じことがイムノグロブリンにも当
てはまり、（例えば酸等による）変性に対する弱さを説
明する。更には、変性の後には、元々折り畳まれていた
構造への復元過程が、in vitroでは必ずしも完全なもの
にならないということが、ある種の精製操作がモノクロ
ーナル抗体の結合活性の完全喪失をもたらすことを説明
できるかも知れない。抗体の不完全な復元はまた、抗体
の結合特性に直接には影響を及ぼさない分子領域にも関
連し得る。この関係は、タンパク質のドメインが相互に
独立して折り畳まれ得るという観察結果から明らかであ
る。同じことが抗体分子のドメインについても当てはま
る〔生化学の教科書例えば、Biochemistry of Lubert S
tryerを参照〕。もしも例えば、抗体のFc部がこれらの
不規則性によって影響を受けていると、これは、遺伝性
免疫の執行細胞である、Fc受容体担持エフェクター細胞
（単球、マクロファージ、顆粒球、濾胞状樹状細胞、ナ
チュラルキラー細胞、マスト細胞）と相互作用する能力
に影響を及ぼし得る。このエフェクター機能は、非常に
重要である。というのは最近の殆どの研究結果は、Ｉｇ
Ｇ抗体がin vivoでは専らそれらの生物学的活性をFcγ
受容体担持細胞（これらは、一旦活性化されると、貪
食、炎症及び細胞溶解において出現する）を介して行っ
ているとの結論に至っているからである〔J.V. Ravetch
and R.A. Clynes, Annu. Rev. Immunol., 16:421-432
(1998)〕。
モノクローナル抗体は益々ヒトに使用されるようになっ
ている。モノクローナル抗体をたびたび使用する場合に
起こりうる重大な問題は、タンパク質Ａ又はＧを用いた
ワンステップ・アフィニティークロマトグラフィーのよ
うな通常の精製方法が、抗体の結合特性を損なうことで
ある。近年の熱力学的研究は、進化の過程で、多数のタ
ンパク質が、低い安定性に関して選択されたことを明ら
かにするに至った。同じことがイムノグロブリンにも当
てはまり、（例えば酸等による）変性に対する弱さを説
明する。更には、変性の後には、元々折り畳まれていた
構造への復元過程が、in vitroでは必ずしも完全なもの
にならないということが、ある種の精製操作がモノクロ
ーナル抗体の結合活性の完全喪失をもたらすことを説明
できるかも知れない。抗体の不完全な復元はまた、抗体
の結合特性に直接には影響を及ぼさない分子領域にも関
連し得る。この関係は、タンパク質のドメインが相互に
独立して折り畳まれ得るという観察結果から明らかであ
る。同じことが抗体分子のドメインについても当てはま
る〔生化学の教科書例えば、Biochemistry of Lubert S
tryerを参照〕。もしも例えば、抗体のFc部がこれらの
不規則性によって影響を受けていると、これは、遺伝性
免疫の執行細胞である、Fc受容体担持エフェクター細胞
（単球、マクロファージ、顆粒球、濾胞状樹状細胞、ナ
チュラルキラー細胞、マスト細胞）と相互作用する能力
に影響を及ぼし得る。このエフェクター機能は、非常に
重要である。というのは最近の殆どの研究結果は、Ｉｇ
Ｇ抗体がin vivoでは専らそれらの生物学的活性をFcγ
受容体担持細胞（これらは、一旦活性化されると、貪
食、炎症及び細胞溶解において出現する）を介して行っ
ているとの結論に至っているからである〔J.V. Ravetch
and R.A. Clynes, Annu. Rev. Immunol., 16:421-432
(1998)〕。
【０００３】患者にとって危険を最小限に保つために、
ヒトでの使用を意図した抗体製剤についての特別の品質
基準を要求している規制が、10年以上も前から当局によ
って課されてきた〔Haase, M., Behoerdliche Anforder
ungen an die Herstellung und Pruefung von monoklon
alen Antikoerpern. Pharma Technol., 4:32-35(198
7)〕。最終製品中において、所望のモノクローナル抗体
は90％を超えて濃縮されていなければならず、且つ少な
くとも95％のイムノグロブリンが単量体又は二量体の形
で存在しなければならない。更には、結合定数及び補体
依存性細胞溶解等のような機能的特性が、各抗体につい
て確認されて文書化されなければならない。
ヒトでの使用を意図した抗体製剤についての特別の品質
基準を要求している規制が、10年以上も前から当局によ
って課されてきた〔Haase, M., Behoerdliche Anforder
ungen an die Herstellung und Pruefung von monoklon
alen Antikoerpern. Pharma Technol., 4:32-35(198
7)〕。最終製品中において、所望のモノクローナル抗体
は90％を超えて濃縮されていなければならず、且つ少な
くとも95％のイムノグロブリンが単量体又は二量体の形
で存在しなければならない。更には、結合定数及び補体
依存性細胞溶解等のような機能的特性が、各抗体につい
て確認されて文書化されなければならない。
【０００４】これまでのところ、ＩｇＧ抗体の不可逆的
損傷の検査は、品質管理の規定項目でなく、ヒトでの使
用を意図した抗体製剤において行われてこなかった〔例
えば、Panorex, Red List, OKT3参照〕。
損傷の検査は、品質管理の規定項目でなく、ヒトでの使
用を意図した抗体製剤において行われてこなかった〔例
えば、Panorex, Red List, OKT3参照〕。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｉｇ
Ｇ抗体の品質を信頼性をもって試験するための方法、特
に、ＩｇＧ抗体の損傷を検出することができる方法を提
供することである。
Ｇ抗体の品質を信頼性をもって試験するための方法、特
に、ＩｇＧ抗体の損傷を検出することができる方法を提
供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記目
的は、ＩｇＧ抗体の不可逆的損傷を検出するための、請
求項１に一層詳細に規定した方法によって解決される。
該方法は次のステップすなわち： （ａ）Fcγ受容体RII及び／又はRIIIを発現している細
胞株上の表面抗原に対するＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体調
製物であって、本来の状態においてFcγ受容体RII又はR
IIIに結合する能力を有するものを、懸濁培養中で増殖
しており且つFcγ受容体RII及び／又はRIIIと該表面抗
原とを発現している細胞株と接触させるステップと、
（ｂ）Fcγ受容体RII又はRIIIのリガンド結合部位に対
する第２の抗体を、ステップ（ａ）において得られた混
合物に加えるステップと、（ｃ）該ＩｇＧ抗体に又はＩ
ｇＧ抗体調製物に生じている可能性のある損傷を測定す
るために細胞の凝集挙動を分析するステップとを含んで
なり、ここに、 α）該細胞の凝集が、該ＩｇＧ抗体の又はＩｇＧ抗体調
製物の損傷を示すものであり、そして β）凝集のないこと又は可逆的で非特異的な凝集が、該
ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体調製物が無傷であることを示
す。
的は、ＩｇＧ抗体の不可逆的損傷を検出するための、請
求項１に一層詳細に規定した方法によって解決される。
該方法は次のステップすなわち： （ａ）Fcγ受容体RII及び／又はRIIIを発現している細
胞株上の表面抗原に対するＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体調
製物であって、本来の状態においてFcγ受容体RII又はR
IIIに結合する能力を有するものを、懸濁培養中で増殖
しており且つFcγ受容体RII及び／又はRIIIと該表面抗
原とを発現している細胞株と接触させるステップと、
（ｂ）Fcγ受容体RII又はRIIIのリガンド結合部位に対
する第２の抗体を、ステップ（ａ）において得られた混
合物に加えるステップと、（ｃ）該ＩｇＧ抗体に又はＩ
ｇＧ抗体調製物に生じている可能性のある損傷を測定す
るために細胞の凝集挙動を分析するステップとを含んで
なり、ここに、 α）該細胞の凝集が、該ＩｇＧ抗体の又はＩｇＧ抗体調
製物の損傷を示すものであり、そして β）凝集のないこと又は可逆的で非特異的な凝集が、該
ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体調製物が無傷であることを示
す。
【０００７】本発明の更なる好ましい具体例は、従属請
求項及び以下の記述並びに実施例より明らかである。但
し、実施例は、本発明の方法の特定の具体例を表してお
り、本発明はこれに限定されない。
求項及び以下の記述並びに実施例より明らかである。但
し、実施例は、本発明の方法の特定の具体例を表してお
り、本発明はこれに限定されない。
【０００８】添付の図１中、Ａ及びＢは以下を示す。S4
9.1細胞（50μｌ培地中）を96ウェルマイクロタイター
プレートのウェルにピペットで加え、100μｌのMmT1希
釈液（Ａ）又は同量のMmT1及び2.4G2ukの混液（Ｂ）と
共に終夜インキュベートした。光学顕微鏡による視覚的
評価に先立って、プレートを激しく揺すった。
9.1細胞（50μｌ培地中）を96ウェルマイクロタイター
プレートのウェルにピペットで加え、100μｌのMmT1希
釈液（Ａ）又は同量のMmT1及び2.4G2ukの混液（Ｂ）と
共に終夜インキュベートした。光学顕微鏡による視覚的
評価に先立って、プレートを激しく揺すった。
【０００９】図１においてＡは、抗Thy-1抗体MmT1によ
って惹起されたS49.1細胞のホモタイプの凝集の典型例
を示す。図１におけるＢでは、S49.1細胞が、単一細胞
としてマイクロタイタープレートの底を覆っているのが
明らかに分かる。このバッチにおいて、典型的なMmT1誘
導性の凝集体形成は、反応混合液中に抗体2.4G2ukが同
時に存在することにより、阻害された。
って惹起されたS49.1細胞のホモタイプの凝集の典型例
を示す。図１におけるＢでは、S49.1細胞が、単一細胞
としてマイクロタイタープレートの底を覆っているのが
明らかに分かる。このバッチにおいて、典型的なMmT1誘
導性の凝集体形成は、反応混合液中に抗体2.4G2ukが同
時に存在することにより、阻害された。
【００１０】ＩｇＧ抗体の不可逆的損傷を検出するため
に、本発明によりin vitro試験を確立した。それは、懸
濁培養中で増殖する細胞株（指標細胞）より出発し、該
細胞株は、一方では該ＩｇＧ抗体の標的である表面抗原
を発現し、他方ではFcγ受容体RII（CD32）及び／又はR
III（CD16）を発現している。Fcγ受容体の数が、抗原
との組み合わせで明瞭に検出可能な凝集物を形成するも
のであることが重要である。この目的のためには、懸濁
培養中で増殖している指標細胞上に、抗原が特定コピー
数で発現されなければならない。本発明によれば、該Ｉ
ｇＧ抗体の標的である抗原が指標細胞株上に高い、又は
非常に高い密度で発現されるのが適している一方でFcγ
受容体はより低いコピー数で発現されてよい、というこ
とが見出された。
に、本発明によりin vitro試験を確立した。それは、懸
濁培養中で増殖する細胞株（指標細胞）より出発し、該
細胞株は、一方では該ＩｇＧ抗体の標的である表面抗原
を発現し、他方ではFcγ受容体RII（CD32）及び／又はR
III（CD16）を発現している。Fcγ受容体の数が、抗原
との組み合わせで明瞭に検出可能な凝集物を形成するも
のであることが重要である。この目的のためには、懸濁
培養中で増殖している指標細胞上に、抗原が特定コピー
数で発現されなければならない。本発明によれば、該Ｉ
ｇＧ抗体の標的である抗原が指標細胞株上に高い、又は
非常に高い密度で発現されるのが適している一方でFcγ
受容体はより低いコピー数で発現されてよい、というこ
とが見出された。
【００１１】好ましくは、抗原：Fcγ受容体比率は、例
えば、＞１：１ないし０．５：１である。凝集体を形成
することのできる抗原：Fcγ受容体比率を有する細胞株
が選択されなければならない。抗原：Fcγ受容体比率
は、細胞株間で異なっているため、本発明の方法を確立
するに先立って、凝集体形成能力について指標細胞株を
試験しなければならない。本明細書の記述により、当業
者は更なる発明的ステップを要さずして試験を行うこと
ができる。
えば、＞１：１ないし０．５：１である。凝集体を形成
することのできる抗原：Fcγ受容体比率を有する細胞株
が選択されなければならない。抗原：Fcγ受容体比率
は、細胞株間で異なっているため、本発明の方法を確立
するに先立って、凝集体形成能力について指標細胞株を
試験しなければならない。本明細書の記述により、当業
者は更なる発明的ステップを要さずして試験を行うこと
ができる。
【００１２】該細胞は、例えば、標準の栄養培地中で10
5〜106個／ｍｌの密度で培養される。
5〜106個／ｍｌの密度で培養される。
【００１３】指標細胞は、試験すべきＩｇＧ抗体が標的
とする抗原をFcγ受容体RII及び／又はRIIIと共に発現
している動物細胞である。該細胞は、該抗原及びFcγ受
容体を天然に発現するものであってもよく、また該抗原
及び／又はFcγ受容体をコードする遺伝子が組換えＤＮ
Ａ技術により該細胞内に導入されているものであっｔて
もよい。本発明によって使用できる細胞の例は、全て、
非接着性の増殖細胞株であり、好ましくはＢリンパ球又
はＴリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、及びマ
スト細胞が挙げられる。特に好ましい細胞株は、非常に
高い密度でThy-1抗原を発現すると同時に明らかに低い
コピー数でFcγ受容体RIII（CD16）を発現する細胞株、
S49.1 である
とする抗原をFcγ受容体RII及び／又はRIIIと共に発現
している動物細胞である。該細胞は、該抗原及びFcγ受
容体を天然に発現するものであってもよく、また該抗原
及び／又はFcγ受容体をコードする遺伝子が組換えＤＮ
Ａ技術により該細胞内に導入されているものであっｔて
もよい。本発明によって使用できる細胞の例は、全て、
非接着性の増殖細胞株であり、好ましくはＢリンパ球又
はＴリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、及びマ
スト細胞が挙げられる。特に好ましい細胞株は、非常に
高い密度でThy-1抗原を発現すると同時に明らかに低い
コピー数でFcγ受容体RIII（CD16）を発現する細胞株、
S49.1 である
【００１４】細胞株S49.1は、非営利組織であるアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に、
AW Harris博士〔Salk Institute, San Diego, Californ
ia〕によって受託番号ATCC TIB 28のもとに寄託されて
おり、特別の制約なしにそこから入手できる。該細胞株
についての参考文献は、Ralph, P. (1973) 及び Burgeo
is, S. et al. (1977) である。
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に、
AW Harris博士〔Salk Institute, San Diego, Californ
ia〕によって受託番号ATCC TIB 28のもとに寄託されて
おり、特別の制約なしにそこから入手できる。該細胞株
についての参考文献は、Ralph, P. (1973) 及び Burgeo
is, S. et al. (1977) である。
【００１５】Thy-1（θ）抗原（CD90）マウスＴ細胞の
マーカーとして機能する表面抗原である。Thy-1抗原に
ついての参考文献は、例えば、Schlesinger, M. et a
l., 1989, Thierfelder, S. et al., 1989, Cobbold,
S.P. et al., 1983, Kummer, U.et al., 1993 及び Wil
liams, A.F. 1989である。
マーカーとして機能する表面抗原である。Thy-1抗原に
ついての参考文献は、例えば、Schlesinger, M. et a
l., 1989, Thierfelder, S. et al., 1989, Cobbold,
S.P. et al., 1983, Kummer, U.et al., 1993 及び Wil
liams, A.F. 1989である。
【００１６】再び、細胞株S49.1が、本発明によって好
ましく使用できる指標細胞株であることを指摘しなけれ
ばならないが、しかし、本発明はこの細胞株に限定され
るものではない。ホモタイプの細胞凝集の誘導のために
は、細胞株S49.1は、他の細胞株に置き換えてもよい。
但し、該選ばれた細胞株が、懸濁培養として増殖するも
のでなければならない、すなわち接着性の細胞は、本発
明に従って採用される指標細胞株としては不適当であ
る。更には、該細胞株は、２種の低親和性Fcγ受容体RI
I及びRIIIのうち１つを発現しなければならない。但
し、細胞株として、両方のFcγ受容体を担持するものを
用いてよい。
ましく使用できる指標細胞株であることを指摘しなけれ
ばならないが、しかし、本発明はこの細胞株に限定され
るものではない。ホモタイプの細胞凝集の誘導のために
は、細胞株S49.1は、他の細胞株に置き換えてもよい。
但し、該選ばれた細胞株が、懸濁培養として増殖するも
のでなければならない、すなわち接着性の細胞は、本発
明に従って採用される指標細胞株としては不適当であ
る。更には、該細胞株は、２種の低親和性Fcγ受容体RI
I及びRIIIのうち１つを発現しなければならない。但
し、細胞株として、両方のFcγ受容体を担持するものを
用いてよい。
【００１７】試験を行うためには、指標細胞の懸濁物
を、該指標細胞株によって発現されている抗原に対する
抗体又は抗体調製物と直接に接触させ、そして起こり得
る凝集を実際に起こさせるに十分な時間、混合物を反応
させる。抗体又は抗体調製物としては、それぞれ、モノ
クローナル抗体でもポリクローナル抗体でも使用するこ
とができる。本発明において使用されるＩｇＧ抗体又は
ＩｇＧ抗体調製物が、指標細胞株上に存在する表面抗原
を標的とするものであることが重要である。一つの例
は、従って、上述のThy-1抗原である。例えば、マウス
及び／又はラット及び／又はヒト特異的な抗体特異性を
使用することができる。他の抗体特異性もまた用いるこ
とができることが理解されなければならない。しかしな
がら、封鎖用抗Fcγ受容体抗体の不存在下に、該抗体が
明瞭に検出できる凝集物を形成することが保証されなけ
ればならない。適した抗体は、それ自身既知の試験方法
によって検出することができる。ここに、それぞれの抗
原が、明瞭な凝集体形成を可能にするコピー数で指標細
胞株上に発現されているという事実に注意しなければな
らない。そのような細胞株は、例えば、本発明によって
用いられる細胞株S49.1である。更なる可能な細胞株
は、本発明の記述に基づいて当業者が簡単な実験のみで
検出することができる。
を、該指標細胞株によって発現されている抗原に対する
抗体又は抗体調製物と直接に接触させ、そして起こり得
る凝集を実際に起こさせるに十分な時間、混合物を反応
させる。抗体又は抗体調製物としては、それぞれ、モノ
クローナル抗体でもポリクローナル抗体でも使用するこ
とができる。本発明において使用されるＩｇＧ抗体又は
ＩｇＧ抗体調製物が、指標細胞株上に存在する表面抗原
を標的とするものであることが重要である。一つの例
は、従って、上述のThy-1抗原である。例えば、マウス
及び／又はラット及び／又はヒト特異的な抗体特異性を
使用することができる。他の抗体特異性もまた用いるこ
とができることが理解されなければならない。しかしな
がら、封鎖用抗Fcγ受容体抗体の不存在下に、該抗体が
明瞭に検出できる凝集物を形成することが保証されなけ
ればならない。適した抗体は、それ自身既知の試験方法
によって検出することができる。ここに、それぞれの抗
原が、明瞭な凝集体形成を可能にするコピー数で指標細
胞株上に発現されているという事実に注意しなければな
らない。そのような細胞株は、例えば、本発明によって
用いられる細胞株S49.1である。更なる可能な細胞株
は、本発明の記述に基づいて当業者が簡単な実験のみで
検出することができる。
【００１８】もしも表面抗原を標的とする抗体が指標細
胞のサンプルに添加されると、抗体が結合した遊離細胞
が安定な凝集体を形成する。指標細胞のこれらのホモタ
イプの凝集が、結合した抗体のFc部と細胞上のFcγ受容
体との特異的相互作用を介して達成できるということの
検出されたは、細胞上のFcγ受容体のリガンド結合部位
に結合する抗体の存在下では凝集体形成が起こらないと
いう観察の結果によるものである。細胞上のFcγ受容体
RII又はRIIIのリガンド結合部位へのそのような抗体結
合は、それらの機能を遮断する、すなわち、Fcγ受容体
RII又はRIIIは、その後の指標反応（抗体−Fcγ受容体
相互作用）には利用されない。その代わり、そのような
試験バッチ中で、指標細胞が個々の細胞として明瞭に見
られる状態に留まるのが観察される。当然のことなが
ら、低親和性Fcγ受容体RII又はRIIIと相互作用するＩ
ｇＧ抗体サブクラスのみが、凝集反応において検出でき
る。
胞のサンプルに添加されると、抗体が結合した遊離細胞
が安定な凝集体を形成する。指標細胞のこれらのホモタ
イプの凝集が、結合した抗体のFc部と細胞上のFcγ受容
体との特異的相互作用を介して達成できるということの
検出されたは、細胞上のFcγ受容体のリガンド結合部位
に結合する抗体の存在下では凝集体形成が起こらないと
いう観察の結果によるものである。細胞上のFcγ受容体
RII又はRIIIのリガンド結合部位へのそのような抗体結
合は、それらの機能を遮断する、すなわち、Fcγ受容体
RII又はRIIIは、その後の指標反応（抗体−Fcγ受容体
相互作用）には利用されない。その代わり、そのような
試験バッチ中で、指標細胞が個々の細胞として明瞭に見
られる状態に留まるのが観察される。当然のことなが
ら、低親和性Fcγ受容体RII又はRIIIと相互作用するＩ
ｇＧ抗体サブクラスのみが、凝集反応において検出でき
る。
【００１９】細胞上のFcγ受容体RII又はRIIIのリガン
ド結合部位へ結合してその機能を遮断する第２の抗体の
存在は、結合した抗体のFc部と細胞上のFcγ受容体との
特異的相互作用によるホモタイプの細胞凝集体形成と、
細胞に結合した抗体同志の相互作用による非特異的抗体
作用との識別（本発明において重要である）を可能にす
る。抗体の精製に際して例えば行う必要のある酸処理の
後のタンパク質復元における不規則性の結果として、分
子間のホモフィリック（homophilic）な相互作用が起こ
り、それにより指標細胞株が凝集して、ＩｇＧ抗体又は
ＩｇＧ抗体調製物の損傷があることを示す。損傷を受け
た抗体又は抗体調製物と損傷を受けていないそれらとの
間の挙動の相違は、元のように折り畳まれていたタンパ
ク質への復元過程が、酸、例えばｐＨ２．７による変性
後はもはや完全には行われないという事実によって説明
することができる。そしてこのタンパク質における不可
逆的損傷は、細胞に結合した、無傷であるか否かを調べ
ようとしているＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体調製物の望ま
しからざる分子間のホモフィリックな相互作用の結果と
して、「非特異的」細胞凝集物の形成の引き金となる。
ド結合部位へ結合してその機能を遮断する第２の抗体の
存在は、結合した抗体のFc部と細胞上のFcγ受容体との
特異的相互作用によるホモタイプの細胞凝集体形成と、
細胞に結合した抗体同志の相互作用による非特異的抗体
作用との識別（本発明において重要である）を可能にす
る。抗体の精製に際して例えば行う必要のある酸処理の
後のタンパク質復元における不規則性の結果として、分
子間のホモフィリック（homophilic）な相互作用が起こ
り、それにより指標細胞株が凝集して、ＩｇＧ抗体又は
ＩｇＧ抗体調製物の損傷があることを示す。損傷を受け
た抗体又は抗体調製物と損傷を受けていないそれらとの
間の挙動の相違は、元のように折り畳まれていたタンパ
ク質への復元過程が、酸、例えばｐＨ２．７による変性
後はもはや完全には行われないという事実によって説明
することができる。そしてこのタンパク質における不可
逆的損傷は、細胞に結合した、無傷であるか否かを調べ
ようとしているＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体調製物の望ま
しからざる分子間のホモフィリックな相互作用の結果と
して、「非特異的」細胞凝集物の形成の引き金となる。
【００２０】本発明の方法においては、抗体を高度に精
製することは必ずしも必要でない。そのような精製はし
ばしば経費を要するものであり、少量を検査しなければ
ならない場合にのみ利用できる。その代わり、本発明に
おいて用いられる指標抗体、例えば抗体MmT1が、実際に
精製されるべき抗体の代表として、選んだ精製方法の全
操作に付される。そこでは、指標抗体は、実際に精製さ
れるべき抗体と同じサブクラスを有する。好ましいサブ
クラスは、マウス2a及びラット2bである。選択んだ精製
方法に付された指標抗体は、次いで、迅速且つ非常に簡
単である本発明の凝集試験において、例えばS49.1細胞
を用いて試験され、続いて、精製に起因する非特異的な
ホモフィリックな相互作用について調べられる。
製することは必ずしも必要でない。そのような精製はし
ばしば経費を要するものであり、少量を検査しなければ
ならない場合にのみ利用できる。その代わり、本発明に
おいて用いられる指標抗体、例えば抗体MmT1が、実際に
精製されるべき抗体の代表として、選んだ精製方法の全
操作に付される。そこでは、指標抗体は、実際に精製さ
れるべき抗体と同じサブクラスを有する。好ましいサブ
クラスは、マウス2a及びラット2bである。選択んだ精製
方法に付された指標抗体は、次いで、迅速且つ非常に簡
単である本発明の凝集試験において、例えばS49.1細胞
を用いて試験され、続いて、精製に起因する非特異的な
ホモフィリックな相互作用について調べられる。
【００２１】凝集体の形成は、試験開始後、通常短時
間、例えば30分後までには起こっている。確実性のある
陳述のためには、少なくとも、平行して行う対照サンプ
ルにおいて大きな明瞭に見られる細胞凝集物が形成され
るまで待つべきである。通常、これは２ないし３時間後
であり、試験を終夜放置して、翌日に評価を行ってもよ
い。
間、例えば30分後までには起こっている。確実性のある
陳述のためには、少なくとも、平行して行う対照サンプ
ルにおいて大きな明瞭に見られる細胞凝集物が形成され
るまで待つべきである。通常、これは２ないし３時間後
であり、試験を終夜放置して、翌日に評価を行ってもよ
い。
【００２２】偽の結果を避けるために、損傷を受けてい
ないことが確実な抗体を用いて行われる対照アッセイが
必要である。使用した指標細胞はまた、ランダムに凝集
し得それにより細胞凝集物に紛らわしいことがあるた
め、ランダムな凝集物を再び解離させるようインキュベ
ーション時間の後で激しく撹拌することが推奨される。
しかしながら、この撹拌によって、ＩｇＧ抗体の損傷に
よって生じた凝集物が除去されてはならない。
ないことが確実な抗体を用いて行われる対照アッセイが
必要である。使用した指標細胞はまた、ランダムに凝集
し得それにより細胞凝集物に紛らわしいことがあるた
め、ランダムな凝集物を再び解離させるようインキュベ
ーション時間の後で激しく撹拌することが推奨される。
しかしながら、この撹拌によって、ＩｇＧ抗体の損傷に
よって生じた凝集物が除去されてはならない。
【００２３】以下において、実施例を参照して本発明を
更に説明する。
更に説明する。
【００２４】
【実施例】本実施例においては、懸濁培養において永久
的に増殖し、その表面に非常に高密度にThy-1抗原を発
現していると同時に顕著に低いコピー数でFcγ受容体RI
IIを発現しているS49.1細胞が、指標細胞株として用い
られた。
的に増殖し、その表面に非常に高密度にThy-1抗原を発
現していると同時に顕著に低いコピー数でFcγ受容体RI
IIを発現しているS49.1細胞が、指標細胞株として用い
られた。
【００２５】抗Thy-1抗体を該細胞のサンプルに加えた
とき、安定な凝集体形成が、抗体の結合した遊離細胞の
凝集によって起こるのが見出された。
とき、安定な凝集体形成が、抗体の結合した遊離細胞の
凝集によって起こるのが見出された。
【００２６】S49.1細胞のこれらのホモタイプの凝集の
検出が、結合した抗体のFc部と細胞上のFcγ受容体との
特異的相互作用によって達成されることは、抗体2.4G2u
kの存在下では凝集体形成が起こらないことから明らか
である。抗体2.4G2ukは、細胞上のFcγ受容体RIIIのリ
ガンド結合部位に結合してその機能を遮断する。その後
の指標反応（抗体−Fcγ受容体相互作用）のためには、
Fcγ受容体RIIIはもはや利用できない。その代わりに、
そのような試験においては、S49.1細胞は個々の細胞と
してマイクロタイタープレートの底を覆っているのが明
瞭に見える。この凝集反応においては、低親和性Fcγ受
容体RIIIと相互作用するＩｇＧ抗体サブクラスのみが検
出できる。
検出が、結合した抗体のFc部と細胞上のFcγ受容体との
特異的相互作用によって達成されることは、抗体2.4G2u
kの存在下では凝集体形成が起こらないことから明らか
である。抗体2.4G2ukは、細胞上のFcγ受容体RIIIのリ
ガンド結合部位に結合してその機能を遮断する。その後
の指標反応（抗体−Fcγ受容体相互作用）のためには、
Fcγ受容体RIIIはもはや利用できない。その代わりに、
そのような試験においては、S49.1細胞は個々の細胞と
してマイクロタイタープレートの底を覆っているのが明
瞭に見える。この凝集反応においては、低親和性Fcγ受
容体RIIIと相互作用するＩｇＧ抗体サブクラスのみが検
出できる。
【００２７】基本的に、抗体2.4G2ukによって阻害でき
るこれらの特異的な凝集に加えて、抗体による細胞凝集
体の形成の更なる可能性が考えられる。そのような細胞
凝集体の形成の引き金としては、例えば、精製過程にお
いてタンパク質の復元の不規則性の結果として抗体／抗
体調製物の変化した特徴に起因する、細胞に結合した抗
体分子同志の分子間相互作用があり得る。この解釈の正
しさは、そのような細胞凝集の更なる有り得べき引き金
としての抗体凝集物が、予め超遠心（100,000×ｇ、30
分）を行うことによって除去されたという事実によって
裏付けられる。本発明によって確立されたin vitro試験
に基づけば、下記の精製方法において生じ得る抗体／抗
体調製物の望ましからざる特性を具体的に検討すること
が可能である。
るこれらの特異的な凝集に加えて、抗体による細胞凝集
体の形成の更なる可能性が考えられる。そのような細胞
凝集体の形成の引き金としては、例えば、精製過程にお
いてタンパク質の復元の不規則性の結果として抗体／抗
体調製物の変化した特徴に起因する、細胞に結合した抗
体分子同志の分子間相互作用があり得る。この解釈の正
しさは、そのような細胞凝集の更なる有り得べき引き金
としての抗体凝集物が、予め超遠心（100,000×ｇ、30
分）を行うことによって除去されたという事実によって
裏付けられる。本発明によって確立されたin vitro試験
に基づけば、下記の精製方法において生じ得る抗体／抗
体調製物の望ましからざる特性を具体的に検討すること
が可能である。
【００２８】ＩｇＧ抗体の精製において該ＩｇＧ抗体
が、損傷をもたらす酸性条件にしばしば付されることか
ら、本発明の検出方法は、実際面で非常に重要である。
が、損傷をもたらす酸性条件にしばしば付されることか
ら、本発明の検出方法は、実際面で非常に重要である。
【００２９】本発明によって試験されるべき抗体は、ハ
イブリドーマによって産生され、そして該ハイブリドー
マの培養上清として回収される。それらは次いで、例え
ばアフィニティークロマトグラフィー等の標準的方法に
よって、精製される。アフィニティークロマトグラフィ
ーは、最も高い選択性をもった精製方法の一つである。
サンプル（培養上清中の抗体）を、タンパク質Ａ又はタ
ンパク質Ｇで置換したクロマトグラフィーマトリクスに
結合させ、次いで適当な溶離液で溶出される。タンパク
質Ａ及びタンパク質Ｇ置換マトリクスは、既にカラムに
充填した形で市販されている。
イブリドーマによって産生され、そして該ハイブリドー
マの培養上清として回収される。それらは次いで、例え
ばアフィニティークロマトグラフィー等の標準的方法に
よって、精製される。アフィニティークロマトグラフィ
ーは、最も高い選択性をもった精製方法の一つである。
サンプル（培養上清中の抗体）を、タンパク質Ａ又はタ
ンパク質Ｇで置換したクロマトグラフィーマトリクスに
結合させ、次いで適当な溶離液で溶出される。タンパク
質Ａ及びタンパク質Ｇ置換マトリクスは、既にカラムに
充填した形で市販されている。
【００３０】過去15年間に、タンパク質Ａは、種々の起
源（腹水、培養上清）からのＩｇＧ抗体の精製のための
迅速一段階アフィニティークロマトグラフィーにおい
て、一層重要なものとなっている。この細菌のポリペプ
チドは、イムノグロブリン結合性領域で、種々の親和性
をもって、全ての哺乳類ＩｇＧ抗体のFc部に選択的に結
合する。ＩｇＧ１サブクラスを例外として、他の全ての
マウスＩｇＧ抗体は、タンパク質Ａに対して、中等度の
親和性を有する。実際上の理由から、溶出は、ｐＨ4.0
の範囲の単一の緩衝液中において行われる。
源（腹水、培養上清）からのＩｇＧ抗体の精製のための
迅速一段階アフィニティークロマトグラフィーにおい
て、一層重要なものとなっている。この細菌のポリペプ
チドは、イムノグロブリン結合性領域で、種々の親和性
をもって、全ての哺乳類ＩｇＧ抗体のFc部に選択的に結
合する。ＩｇＧ１サブクラスを例外として、他の全ての
マウスＩｇＧ抗体は、タンパク質Ａに対して、中等度の
親和性を有する。実際上の理由から、溶出は、ｐＨ4.0
の範囲の単一の緩衝液中において行われる。
【００３１】タンパク質Ａに緩く結合するＩｇＧ抗体
（例えば、殆ど全てのラットＩｇＧサブクラス）の調製
のためには、更なる細菌受容体が、ラットのイムノグロ
ブリンの精製に特に適しているタンパク質Ｇの形で今や
入手可能である。ＩｇＧ抗体とタンパク質Ｇとの間の高
い結合定数のために、結合した抗体の遊離には、比較的
酸性の条件が必要である。実際上の理由により、タンパ
ク質Ｇを用いた溶出はｐＨ2.7にて行われる。しかしな
がら、実際上は、これらのｐＨ値は不利である。
（例えば、殆ど全てのラットＩｇＧサブクラス）の調製
のためには、更なる細菌受容体が、ラットのイムノグロ
ブリンの精製に特に適しているタンパク質Ｇの形で今や
入手可能である。ＩｇＧ抗体とタンパク質Ｇとの間の高
い結合定数のために、結合した抗体の遊離には、比較的
酸性の条件が必要である。実際上の理由により、タンパ
ク質Ｇを用いた溶出はｐＨ2.7にて行われる。しかしな
がら、実際上は、これらのｐＨ値は不利である。
【００３２】凝集試験の実施：試験は、96ウェルのマイ
クロタイタープレートのウェル中、S49.1細胞の懸濁液
（典型的には５×104個／50μｌ培地）を、Thy-1抗原に
対する抗体／抗体調製物（モノクローナル又はポリクロ
ーナル）と接触させ、反応混合物を数時間放置する。こ
の目的のためには、反応体の添加の順序もインキュベー
ションアッセイの液量（100ないし200μｌ）も需要な値
ではない。この時間の後、サンプル中において、光学顕
微鏡によって視覚的に評価できる特徴的な細胞凝集体
が、マイクロタイタープレートのウェルの底に形成され
る（図１を参照）。S49.1細胞はランダムに凝集する可
能性がありそれにより凝集体に似たものを生じうるが、
インキュベーション最終時のプレートの激しい撹拌は、
評価において起こり得るこの困難を防止する。
クロタイタープレートのウェル中、S49.1細胞の懸濁液
（典型的には５×104個／50μｌ培地）を、Thy-1抗原に
対する抗体／抗体調製物（モノクローナル又はポリクロ
ーナル）と接触させ、反応混合物を数時間放置する。こ
の目的のためには、反応体の添加の順序もインキュベー
ションアッセイの液量（100ないし200μｌ）も需要な値
ではない。この時間の後、サンプル中において、光学顕
微鏡によって視覚的に評価できる特徴的な細胞凝集体
が、マイクロタイタープレートのウェルの底に形成され
る（図１を参照）。S49.1細胞はランダムに凝集する可
能性がありそれにより凝集体に似たものを生じうるが、
インキュベーション最終時のプレートの激しい撹拌は、
評価において起こり得るこの困難を防止する。
【００３３】典型的には、段階希釈（抗体１体積部＋培
地１体積部）が試験用に準備される。ここにおいて、高
い希釈の抗Thy-1抗体では細胞凝集体は観察されない。
抗体2.4G2uk（過剰）の存在下に平行して行われるアッ
セイは、特異的な抗体作用（結合した抗体のFc部と細胞
上のFcγ受容体との相互作用）と非特異的な抗体作用
（細胞に結合した抗体同志の相互作用）とによる、ホモ
タイプの細胞凝集体の間の重要な識別を可能にする。
地１体積部）が試験用に準備される。ここにおいて、高
い希釈の抗Thy-1抗体では細胞凝集体は観察されない。
抗体2.4G2uk（過剰）の存在下に平行して行われるアッ
セイは、特異的な抗体作用（結合した抗体のFc部と細胞
上のFcγ受容体との相互作用）と非特異的な抗体作用
（細胞に結合した抗体同志の相互作用）とによる、ホモ
タイプの細胞凝集体の間の重要な識別を可能にする。
【００３４】これらの実験においては、２つの対照アッ
セイが典型的には平行して行われる。一方のアッセイに
おいては、S49.1細胞は、S49.1細胞に対して反応性を有
しないが試験対象である抗Thy-1抗体のＩｇＧサブクラ
スに属する任意の対照抗体と共に用いられるが、他方、
第２のインキュベーションアッセイにおいては、抗体2.
4G2ukのみが添加される。
セイが典型的には平行して行われる。一方のアッセイに
おいては、S49.1細胞は、S49.1細胞に対して反応性を有
しないが試験対象である抗Thy-1抗体のＩｇＧサブクラ
スに属する任意の対照抗体と共に用いられるが、他方、
第２のインキュベーションアッセイにおいては、抗体2.
4G2ukのみが添加される。
【００３５】続いて、S49.1凝集試験において、抗Thy-1
抗体（MmT1；マウスＩｇＧサブクラス２ａ）の種々の調
製物を検討する比較実験が行われた。これらは、ｐＨ2.
7又は4.0の酸性媒質にそれぞれ暴露させた抗体調製物で
ある。この操作は、タンパク質Ｇ（ｐＨ2.7）又はタン
パク質Ａ（ｐＨ4.0）について、一段階親和性クロマト
グラフィーにおいて、結合したサブクラスＩｇＧ２ａの
マウス抗体をリガンドから遊離させるために使用される
条件にそれぞれ対応するものである。
抗体（MmT1；マウスＩｇＧサブクラス２ａ）の種々の調
製物を検討する比較実験が行われた。これらは、ｐＨ2.
7又は4.0の酸性媒質にそれぞれ暴露させた抗体調製物で
ある。この操作は、タンパク質Ｇ（ｐＨ2.7）又はタン
パク質Ａ（ｐＨ4.0）について、一段階親和性クロマト
グラフィーにおいて、結合したサブクラスＩｇＧ２ａの
マウス抗体をリガンドから遊離させるために使用される
条件にそれぞれ対応するものである。
【００３６】これらの実験において、ｐＨ2.7の条件
（タンパク質Ｇの精製における条件に対応する）に付し
たMmT1調製物は、抗体2.4G2ukによっては阻止できない
細胞凝集体を形成することが見出された。この抗体調製
物は、先に超遠心によってタンパク質凝集体を除去して
あることから、ここに生じた細胞凝集体の形成は、明ら
かに、細胞に結合した抗体同志の非特異的相互作用によ
るものである。対照的に、ｐＨ4.0の条件（タンパク質
Ａの精製における条件に対応する）に付したMmT1調製物
による細胞凝集体の形成は、抗体2.4G2ukによって阻止
された。従って、これは結合した抗体のFc部と細胞上の
Fcγ受容体との特異的相互作用に基づくものであるに違
いない。
（タンパク質Ｇの精製における条件に対応する）に付し
たMmT1調製物は、抗体2.4G2ukによっては阻止できない
細胞凝集体を形成することが見出された。この抗体調製
物は、先に超遠心によってタンパク質凝集体を除去して
あることから、ここに生じた細胞凝集体の形成は、明ら
かに、細胞に結合した抗体同志の非特異的相互作用によ
るものである。対照的に、ｐＨ4.0の条件（タンパク質
Ａの精製における条件に対応する）に付したMmT1調製物
による細胞凝集体の形成は、抗体2.4G2ukによって阻止
された。従って、これは結合した抗体のFc部と細胞上の
Fcγ受容体との特異的相互作用に基づくものであるに違
いない。
【００３７】これら２つの抗体調製物の挙動の差違は、
ｐＨ2.7という酸性変性の後では、元々折り畳まれてい
たタンパク質への復元過程が、完全でないという事実に
よってのみ説明できる。タンパク質のこの不可逆的こそ
が、細胞に結合したMmT1抗体同志の望ましからざる分子
間のホモフィリックな相互作用の結果としての、「非特
異的」細胞凝集体の形成の引き金である。
ｐＨ2.7という酸性変性の後では、元々折り畳まれてい
たタンパク質への復元過程が、完全でないという事実に
よってのみ説明できる。タンパク質のこの不可逆的こそ
が、細胞に結合したMmT1抗体同志の望ましからざる分子
間のホモフィリックな相互作用の結果としての、「非特
異的」細胞凝集体の形成の引き金である。
【００３８】S49.1凝集試験によって、抗体MmT1のみが
酸変性によって不可逆的に損傷を受けるのではないとい
う、非常に重要な検出をなし得る。更には、この特性は
また、マウスのサブクラスＩｇＧ２ａに属する他の抗体
にも適用される。２つの更なるマウスＩｇＧ２サブクラ
スのａ抗Thy-1抗体（MmT5及びMmTc）も、これらの検討
に含まれた（表を参照）。
酸変性によって不可逆的に損傷を受けるのではないとい
う、非常に重要な検出をなし得る。更には、この特性は
また、マウスのサブクラスＩｇＧ２ａに属する他の抗体
にも適用される。２つの更なるマウスＩｇＧ２サブクラ
スのａ抗Thy-1抗体（MmT5及びMmTc）も、これらの検討
に含まれた（表を参照）。
【００３９】表１ 使用したモノクローナル抗体一覧
【表１】
【００４０】これらの検討の結果から、次の規則が推論
できる。すなわち、抗体が特定のサブクラスのメンバー
であることが、不可逆的な変化／障害（例えば、酸変
性）に関して決定的な意味を有する、と思われるという
ことである。
できる。すなわち、抗体が特定のサブクラスのメンバー
であることが、不可逆的な変化／障害（例えば、酸変
性）に関して決定的な意味を有する、と思われるという
ことである。
【００４１】正にこのサブクラスに限定された特徴が、
他の個々の抗体の代わりにMmT1等のような抗体が代表と
して、精製により起こり得るホモフィリックな相互作用
について迅速で極度に簡単な凝集試験によって後で検討
するために、選んだ精製方法の全ての操作に付される、
ということを可能にしている。この事実は、マウスのＩ
ｇＧ２ａ抗体（Panorex; OKT3）が所謂保護的サブクラ
スとしてヒトにおいて治療に用いられていることから、
一層重要である。
他の個々の抗体の代わりにMmT1等のような抗体が代表と
して、精製により起こり得るホモフィリックな相互作用
について迅速で極度に簡単な凝集試験によって後で検討
するために、選んだ精製方法の全ての操作に付される、
ということを可能にしている。この事実は、マウスのＩ
ｇＧ２ａ抗体（Panorex; OKT3）が所謂保護的サブクラ
スとしてヒトにおいて治療に用いられていることから、
一層重要である。
【００４２】上記実験で用いられた抗体は、マウス中に
産生させたものであり、ＩｇＧクラスに属しＩｇＧ２ａ
サブクラスに属する。この抗体サブクラスは、ラットＩ
ｇＧ２ｂサブクラスがそうであるように、所謂「保護抗
体」として分類されている。この用語は、両抗体サブク
ラスが例えば腫瘍細胞をin vivoで排除するのに最適で
あることを示した動物モデルにおける研究から来てい
る。更なる実験において、本発明の凝集試験は、ラット
ＩｇＧ２ｂ抗体（やはり抗Thy-1特異性を有する３種の
異なったＩｇＧ２ｂ抗体）を検討するのにも用いられ
た。それにおいて、マウスＩｇＧ２ａ抗Thy-1抗体で得
られた結果が確認できた。すなわち、例えばｐＨ2.7の
ような非常に酸性のｐＨ条件下でのラットＩｇＧ２ｂ抗
体の精製もまた、試験における細胞の凝集をもたらし、
精製された抗体の不可逆的損傷を示した。
産生させたものであり、ＩｇＧクラスに属しＩｇＧ２ａ
サブクラスに属する。この抗体サブクラスは、ラットＩ
ｇＧ２ｂサブクラスがそうであるように、所謂「保護抗
体」として分類されている。この用語は、両抗体サブク
ラスが例えば腫瘍細胞をin vivoで排除するのに最適で
あることを示した動物モデルにおける研究から来てい
る。更なる実験において、本発明の凝集試験は、ラット
ＩｇＧ２ｂ抗体（やはり抗Thy-1特異性を有する３種の
異なったＩｇＧ２ｂ抗体）を検討するのにも用いられ
た。それにおいて、マウスＩｇＧ２ａ抗Thy-1抗体で得
られた結果が確認できた。すなわち、例えばｐＨ2.7の
ような非常に酸性のｐＨ条件下でのラットＩｇＧ２ｂ抗
体の精製もまた、試験における細胞の凝集をもたらし、
精製された抗体の不可逆的損傷を示した。
【００４３】参考文献 1. Burgeois, S., Newby, R.F.: Diploid and haploid
states of the glucocorticoid receptor gene of mou
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anti-Thy-1 monoclonal antibodies attributable to a
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gy, Neurology, and Therapeutic Applications,Marcel
Dekker, Inc., New York, Basel 1989, p.49.
【図１】 MmT1とのインキュベーション後のS49.1細胞
の状態を示す光学顕微鏡写真。
の状態を示す光学顕微鏡写真。
Claims (8)
- 【請求項１】ＩｇＧ抗体の不可逆的損傷を検出するため
の方法であって、 （ａ）Fcγ受容体RII及び／又はRIIIを発現している細
胞株上の表面抗原に対するＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体調
製物であって、本来の状態においてFcγ受容体RII又はR
IIIに結合する能力を有するものを、懸濁培養中で増殖
しており且つFcγ受容体RII及び／又はRIIIと該表面抗
原とを発現している細胞株と接触させるステップと、 （ｂ）Fcγ受容体RII又はRIIIのリガンド結合部位に対
する第２の抗体を、ステップ（ａ）において得られた混
合物に加えるステップと、 （ｃ）該ＩｇＧ抗体に又はＩｇＧ抗体調製物に生じてい
る可能性のある損傷を測定するために細胞の凝集挙動を
分析するステップとを含んでなり、ここに、 α）該細胞の凝集が、該ＩｇＧ抗体の又はＩｇＧ抗体調
製物の損傷を示すものであり、そして β）凝集のないこと又は可逆的で非特異的な凝集が、該
ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体調製物が無傷であることを示
すものである方法。 - 【請求項２】ＩｇＧ抗体として、サブクラス２ａ又は２
ｂの抗体が用いられるものである、請求項１の方法。 - 【請求項３】ＩｇＧ抗体として、ヒト抗体、又はマウス
若しくはラット抗体であってよい齧歯類抗体、又は種間
抗体が用いられることを特徴とする、請求項１又は２の
方法。 - 【請求項４】該ＩｇＧ抗体が、Ｔ細胞のマーカーとして
働く表面抗原に対する抗体であることを特徴とする、請
求項１ないし３の何れかの方法。 - 【請求項５】抗体として抗Thy-1抗体が使用されること
を特徴とする、請求項１ないし４の何れかの方法。 - 【請求項６】Fcγ受容体RII及び／又はRIIIを発現して
いる細胞として、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナ
チュラルキラー細胞、又はマスト細胞が使用されること
を特徴とする、請求項１ないし５の何れかの方法。 - 【請求項７】細胞株としてS49.1（ATCC TIB 28）が使用
されることを特徴とする、請求項６の方法。 - 【請求項８】該ＩｇＧ抗体がモノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１な
いし７の何れかの方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19935794 | 1999-07-29 | ||
| DE19944995A DE19944995C1 (de) | 1999-07-29 | 1999-09-20 | Nachweis einer irreversiblen Schädigung von IgG Antikörpern |
| DE19935794:3 | 1999-09-20 | ||
| DE19944995:3 | 1999-09-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001066308A true JP2001066308A (ja) | 2001-03-16 |
Family
ID=26054408
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000223490A Withdrawn JP2001066308A (ja) | 1999-07-29 | 2000-07-25 | ＩｇＧ抗体の不可逆的損傷の検出 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1072891A3 (ja) |
| JP (1) | JP2001066308A (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5641870A (en) * | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
| US5695760A (en) * | 1995-04-24 | 1997-12-09 | Boehringer Inglehiem Pharmaceuticals, Inc. | Modified anti-ICAM-1 antibodies and their use in the treatment of inflammation |
-
2000
- 2000-07-25 JP JP2000223490A patent/JP2001066308A/ja not_active Withdrawn
- 2000-07-27 EP EP00115083A patent/EP1072891A3/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1072891A3 (de) | 2002-06-19 |
| EP1072891A2 (de) | 2001-01-31 |
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