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Die Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter spezifischer Gene als Marker zur Identifizierung einer eosinophilen Myokarditis (EOM) in Abgrenzung zu den bisher diagnostizierbaren fulminanten Myokarditiden, nämlich der kardialen Sarkoidose (CS) und der idiopathischen Riesenzellmyokarditis (IGCM) gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1, die Verwendung eines diagnostischen Systems zur Unterscheidung einer EOM von einer IGCM und/oder einer CS gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 5, ein Verfahren zur Unterscheidung einer EOM von einer IGCM und/oder einer CS gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 9 sowie ein Medikament zur Behandlung einer EOM, einer IGCM und/oder einer CS gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 11.
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Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind heute in den westlichen Ländern die mit Abstand häufigste Todesursache. Die Inzidenz für Herzinsuffizienzen in Europa und den USA liegt bei 15 bzw. 12 Mio. Erkrankten. Mit ca. 5 Mio. (30%) erkrankten Patienten in Europa ist die dilatative Kardiomyopathie (DCM) die häufigste Ausprägung der nicht-ischämischen Kardiomyopathie. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei dieser viral-entzündlich-induzierten Herzerkrankung liegt ohne spezifische Behandlung bei 50 %. Weiterhin entwickelte sich diese schwere Herzschädigung bei 45% aller transplantationspflichtigen Patienten auf der Grundlage einer vorliegenden DCM. Die hohe Inzidenz der nicht-ischämischen Kardiomyopathie und die enormen gesundheitsökonomischen Folgen dieser Erkrankungen erfordern eine frühzeitige und spezifische Diagnostik und eine darauf basierende zielführende Therapie.
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Unter einer Kardiomyopathie versteht man Erkrankungen der Herzmuskulatur selbst, die primär nicht als Folge von anderen Erkrankungen des kardiovaskulären Systems entstanden sind. Diese Erkrankungen beruhen also weder auf einer mechanischen Überlastung (z.B. durch zu hohen Blutdruck oder einem Klappenfehler), noch auf einer Mangeldurchblutung der Herzkranzgefäße (koronare Herzerkrankung).
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Im Gegensatz zu den koronaren Herzerkrankungen mit vielfältigen Diagnosemöglichkeiten gibt es für die verschiedenen Formen der nicht-ischämischen Kardiomyopathien bisher kaum spezifische, nicht-invasive Diagnoseparameter. Aufgrund ihrer vielfältigen Entstehungsursachen können nicht-ischämische Kardiomyopathien bisher vorrangig mit invasiven Methoden (Myokardbiopsie) exakt diagnostiziert werden, mit dem Ziel, eine weitere Therapie-relevante Differenzierung der einzelnen Krankheitsbilder zu erreichen.
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Derzeit geht man davon aus, dass neben den rein genetisch bedingten Formen Herzmuskelerkrankungen häufig durch eine Virusinfektion und/oder eine damit verbundene Entzündungsreaktion bedingt sind, wobei genetische Veranlagungen für den Verlauf der Erkrankung bedeutsam sein können. Diese sich überlappenden Krankheitsbilder sind bis heute pathogenetisch unzureichend aufgeklärt. Aus diesem Grund ist es wichtig, eine diagnostische Methodik zu entwickeln, die frühzeitig die unterschiedlichen Formen der klinisch nicht zu unterscheidenden Gruppen nicht-ischämischer Kardiomyopathien und Speichererkrankungen des Herzens diagnostizieren kann, um so frühestmöglich eine dem Patienten adäquate Therapie einleiten zu können.
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Der Goldstandard für die Kardiomyopathie-Diagnostik ist die Herzmuskelbiopsie, welche aber nur in einzelnen kardiologischen Zentren und in wenigen Ländern und auch dort nur bei einer stark begrenzten Anzahl von Patienten durchgeführt wird. Zusätzlich erfolgt häufig nur eine histologische Begutachtung des Herzmaterials, ohne die notwendige immunhistochemische Entzündungsdifferenzierung und die molekularbiologischen Untersuchungen auf virale Infektionen oder differentiell exprimierte Biomarker.
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Bei der Häufigkeit der nicht-ischämischen Kardiomyopathien und den enormen gesundheitsökonomischen Folgen wäre es aber wünschenswert, durch weniger invasive Untersuchungsmethoden frühzeitig gute von schlechter Prognose für die entsprechenden Patienten zu differenzieren und sie bei Bedarf dann einer spezifischen Therapie zuführen und irreversible Myokardschäden vermeiden zu können.
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Weiterhin ist es wichtig zu wissen, welcher Patient auf welche Therapie anspricht. Erste Untersuchungen weisen darauf hin, dass das Vorliegen individueller Genexpressionsmuster möglicherweise mit einer genetischen Prädisposition assoziiert ist, welche die individuell erforderliche und wirksame Behandlung des Patienten beeinflussen kann.
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Aus der
WO 2013/127782 A2 ist die Verwendung spezifischer Nukleinsäuren als Marker zur Identifizierung einzelner Formen nicht-ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens bekannt. In jener internationalen Patentanmeldung wird jedoch nicht auf eine Möglichkeit zur Diagnose einer eosinophilen Myokarditis in Abgrenzung zu anderen fulminanten Myokarditiden hingewiesen.
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Die eosinophile Myokarditis (EOM) ist eine seltene Erkrankung, die durch die Aktivierung eosinophiler Granulozyten (häufig auch als Eosinophile bezeichnet) verursacht wird, die ihre eosinophilen Granula freisetzen. Einige der freigesetzten Substanzen, besonders die eosinophilen kationischen Proteine, wirken auch am Myokard gewebszerstörend. Die Erhöhung der Anzahl Eosinophiler wird auch als Eosinophilie bezeichnet. Die Eosinophilie selbst kann Folge unterschiedlicher Ursachen sein, z. B. einer allergischen Reaktion, einer Infektion durch Parasiten usw. Bei der Löffler-Endokarditis ist die Ursache der Eosinophilie noch immer ungeklärt, somit gehört sie zu den idiopathischen Formen. Das klinische Spektrum korreliert eng mit dem Ausmaß der Eosinophilenaktivierung. Eine applizierte immunsuppressive Therapie reduziert die Eosinophilie dramatisch und führt zur Verbesserung der Myokardfunktion des Patienten.
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Eine Riesenzellmyokarditis (IGCM) ist durch das Auftreten von mehrkernigen Riesenzellen begleitend zu einer akuten Myokarditis im Herzmuskel gekennzeichnet. Da unbehandelte Riesenzellmyokarditiden meist einen fatalen Verlauf nehmen, muss diese Form der akuten Myokarditiden genau bestimmt werden, was bisher nur durch histologische Begutachtung von Paraffinschnitten möglich ist. Allerdings gelingt der Nachweis der mehrkernigen Riesenzellen nur selten. In Verdachtsfällen müssten 10 und mehr Herzmuskelbiopsien aufgeschnitten werden, damit ein histologischer Beleg gefunden werden kann, was fast kein kardiologisches Zentrum weltweit durchführt. Weiterhin ist auch die kardiale Sarkoidose (CS) durch das Auftreten von mehrkernigen Riesenzellen und begleitender Granulome charakterisiert.
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Bei einer Riesenzellmyokarditis kommt es oft auch zum Auftreten von einigen Eosinophilen im Myokard. Die Abgrenzung einer EOM von einer IGCM ist histologisch oft kaum möglich, da die charakteristischen Riesenzellen oft verpasst werden. Somit ist eine differential-diagnostische Abgrenzung beider Formen von aktiven entzündlichen Prozessen im Myokard essentiell, weil nur eine angepasste Therapie den Patienten vor einer schlechten Prognose oder sogar dem baldigen Tod, insbesondere bei der IGCM, schützen kann.
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine diagnostische Möglichkeit zur Unterscheidung der eosinophilen Myokarditis von einer Riesenzellenmyokarditis und/oder von einer kardialen Sarkoidose bereitzustellen.
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Die Aufgabe wird mit einer Verwendung eines diagnostischen Profils als Marker gemäß dem Anspruch 1 gelöst. Es werden mindestens 5 definierte Gene als diagnostisches Profil zur Identifizierung einer eosinophilen Myokarditis in Abgrenzung zu einer Riesenzellmyokarditis und/oder zu einer kardialen Sarkoidose eingesetzt. Dabei sind die Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Genen: ADIPOR2 (SEQ ID NO: 1), CCR5 (SEQ ID NO: 2), CCR6 (SEQ ID NO: 3), CPT1 (SEQ ID NO: 4), CYB (SEQ ID NO: 5), DHODH (SEQ ID NO: 6), FOXP3 (SEQ ID NO: 7), IFNB1 (SEQ ID NO: 8), IL10 (SEQ ID NO: 9), ND1 (SEQ ID NO: 10) und ND4 (SEQ ID NO: 11).
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Diese Gene sind in der Literatur bereits hinlänglich beschrieben. Ihre jeweilige Struktur und Funktion kann beispielsweise der frei zugänglichen Datenbank „Gene“ des „National Center for Biotechnology Information“ (NCBI) entnommen werden, die unter der Internetadresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene erreicht werden kann. Bislang nicht bekannt war jedoch die vorliegend beanspruchte neuartige Verwendung dieser Gene zur Identifizierung einer eosinophilen Myokarditis.
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Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass einige, bei weitem jedoch nicht alle Gene, die in der internationalen Patentanmeldung
WO 2013/127782 A2 beschrieben werden, zur Differentialdiagnose der eosinophilen Myokarditis in Abgrenzung zur Riesenzellmyokarditis und/oder zur kardialen Sarkoidose geeignet sind. Damit betrifft die vorliegende Erfindung eine neuartige Verwendung einer Auswahl bereits zuvor im Zusammenhang mit der Identifizierung einzelner Formen nicht-ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens bekannter Gene. Während zahlreiche Gene, die beispielsweise in der vorgenannten internationalen Patentanmeldung beschrieben sind, nicht zur differentialdiagnostischen Identifizierung einer eosinophilen Myokarditis geeignet sind, konnte für die vorliegend beanspruchten Gene überraschenderweise eine derartige Eignung nachgewiesen werden.
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Die beanspruchte Erfindung beruht auf dem Konzept, mehrere Gene in Form eines Profils als Marker zu verwenden, um das Vorhandensein einer eosinophilen Myokarditis zu identifizieren.
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Werden die vorgenannten Gene im Rahmen einer Genexpressionsanalyse eingesetzt, ist es möglich, Patienten mit einer eosinophilen Myokarditis, auch ohne eine histologischen Nachweis frühzeitig zu identifizieren und diese Patienten gegebenenfalls frühzeitig dem jeweiligen Krankheitsbild entsprechend gezielt zu behandeln.
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Dazu werden vorzugsweise die Expressionsraten der vorgenannten Gene in quantitativer oder semi-quantitativer Weise bestimmt. Aus einer erhöhten Expression bestimmter Gene und/oder einer verminderten Expression anderer bestimmter Gene lässt sich dann eine eosinophile Myokarditis diagnostizieren.
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Die vorgenannten Nukleinsäuren (Gene) haben sich dabei als besonders gut geeignet für die spezifische Diagnostik der eosinophilen Myokarditis herausgestellt. Einige der Nukleinsäuren sind für die eosinophile Myokarditis derart spezifisch, dass sie bereits allein als spezifischer Marker eingesetzt werden könnten. Zur Verfeinerung der Diagnostik werden die vorgenannten Gene jedoch nicht einzeln, sondern in einer Gruppe von zumindest 5 Genen als Marker zur Diagnostik eingesetzt. Diese Gruppe wird als diagnostisches Profil bezeichnet. Auf diese Weise lässt sich die Aussagekraft eines entsprechenden diagnostischen Tests erhöhen.
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Ein diagnostisches Profil kann beispielsweise aus mindestens oder genau 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder allen 11 Genen der obigen Liste bestehen
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Statt der Gene können auch synthetische Nukleinsäuremoleküle eingesetzt werden, die eine identische oder komplementäre Sequenz zu den vorgenannten Genen aufweisen.
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Als „identisch“ wird eine Sequenz dann angesehen, wenn sie zu mindestens 90 %, insbesondere mindestens 95 %, insbesondere mindestens 97 %, insbesondere mindestens 98 %, insbesondere mindestens 99 %, insbesondere mindestens 99,5 % und ganz besonders zu mindestens 99,9 % mit der jeweils betrachteten Sequenz übereinstimmt.
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Es ist dabei möglich, das diagnostische Profil, dessen Verwendung vorliegend beansprucht wird, als Teil eines komplexeren diagnostischen Profils unterschiedlicher Gene für die gleichzeitige Diagnose verschiedener zu diagnostizierender Erkrankungen einzusetzen. Dies hat den Vorteil, dass mit einem einzigen diagnostischen Profil unterschiedlichste Diagnosen erstellt werden können, ein derartiges Profil also universell innerhalb der gegebenen Fragestellung einsetzbar ist.
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Die beanspruchte Verwendung betrifft einen Einsatz des diagnostischen Profils in einem In-vitro-Verfahren. Zu diesem Zweck wird einem Patienten, dem eine Diagnose gestellt werden soll, vor der Durchführung dieses Verfahrens zunächst eine Organ- oder Gewebsprobe entnommen. Beispielsweise kann es sich bei der Probe um eine Herzmuskelbiopsie handeln. Diese Probe wird anschließend in einem In-vitro-Verfahren unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Gene analysiert. Anschließend kann ermittelt werden, ob der Patient an einer eosinophilen Myokarditis, einer Riesenzellmyokarditis oder einer kardialen Sarkoidose leidet.
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In einer Variante sind die als diagnostisches Profil einzusetzenden Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus all denjenigen Genen, denen für die Diagnose einer eosinophilen Myokarditis, einer Riesenzellmyokarditis oder einer kardialen Sarkoidose in der Untersuchung, die in dem unten dargestellten Beispiel erläutert wird, der Punktwert 1 zugeordnet wurde. Hierbei handelt es sich um die folgenden Gene: CCR6 (SEQ ID NO: 3), CPT1 (SEQ ID NO: 4), CYB (SEQ ID NO: 5), DHODH (SEQ ID NO: 6), FOXP3 (SEQ ID NO: 7), IFNB1 (SEQ ID NO: 8), IL10 (SEQ ID NO: 9), ND1 (SEQ ID NO: 10) und ND4 (SEQ ID NO: 11).
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In einer Variante sind die als diagnostisches Profil einzusetzenden Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus all denjenigen Genen, die sich in der Untersuchung, die in dem unten dargestellten Beispiel erläutert wird, als besonders geeignet für die Diagnose einer eosinophilen Myokarditis in Abgrenzung zu einer Riesenzellmyokarditis oder einer kardialen Sarkoidose herausgestellt haben. Die besonders gute Eignung hat sich durch eine hohe Signifikanz der Unterschiede der Expression der jeweiligen Gene bei den einzelnen Kardiomyopathien gezeigt. Hierbei handelt es sich um die folgenden Gene: ADIPOR2 (SEQ ID NO: 1), CCR6 (SEQ ID NO: 3), CPT1 (SEQ ID NO: 4), CYB (SEQ ID NO: 5), DHODH (SEQ ID NO: 6), IFNB1 (SEQ ID NO: 8), ND1 (SEQ ID NO: 10), ND4 (SEQ ID NO: 11).
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In einer Variante sind die als diagnostisches Profil einzusetzenden Gene ausgewählt aus der Gruppe von Genen, die nur zur Unterscheidung der eosinophilen Myokarditis von der Riesenzellmyokarditis geeignet sind. Eine entsprechende Eignung ergibt sich durch den Eintrag „IGCM“ in der vorletzten Spalte der unten stehenden Tabelle 1.
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In einer Variante sind die als diagnostisches Profil einzusetzenden Gene ausgewählt aus der Gruppe von Genen, die nur zur Unterscheidung der eosinophilen Myokarditis von der kardialen Sarkoidose geeignet sind. Eine entsprechende Eignung ergibt sich durch den Eintrag „CS“ in der vorletzten Spalte der unten stehenden Tabelle 1.
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In einer Variante umfasst die Gruppe der Gene, die für das diagnostische Profil eingesetzt werden können, zusätzlich zu den in den beiden vorgenannten Varianten enthaltenen Genen auch die Gene, die zur Unterscheidung der eosinophilen Myokarditis von der kardialen Sarkoidose und der Riesenzellenmyokarditis gleichermaßen geeignet sind. Eine entsprechende Eignung ergibt sich durch den Eintrag „CS/IGCM“ in der vorletzten Spalte der unten stehenden Tabelle 1.
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines diagnostischen Systems zur Unterscheidung einer eosinophilen Myokarditis von einer Riesenzellmyokarditis und/oder von einer kardialen Sarkoidose. Ein solches System weist mindestens 5 verschiedene Sonden auf, die jeweils eine Sequenz aufweisen, welche einer der Sequenzen der Gene aus der Gruppe gemäß den obigen Erläuterungen entspricht oder zu diesen komplementär ist. Hinsichtlich des Begriffs „entsprechen“ wird auf die obigen Erläuterungen in Bezug auf den Begriff „identisch“ verwiesen, die in analoger Weise anzuwenden sind.
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Vorzugsweise weist das diagnostische System mindestens oder genau 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 11 derartige Sonden auf, die jeweils in mehreren Kopien in dem diagnostischen System enthalten sein können. Es ist also möglich, dass sämtliche Gene der obigen Liste in identischer oder komplementärer Sequenz im diagnostischen System als Sonde enthalten sind. Das diagnostische System weist stets eine bestimmbare Anzahl diagnostisch relevanter Gensequenzen auf, die im System ein diagnostisch relevantes Genprofil darstellen.
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In einer weiteren Variante weist das diagnostische System ein Mittel zur Detektion eines zusätzlichen prognostischen Markers auf. Dadurch ist es möglich, ergänzende Aussagen über eine bei einem Patienten vorhandene Krankheit zu treffen.
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Vorzugsweise liegt das diagnostische System in Form eines Kits zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vor, wobei die Sonden als Primer in Lösung bereitgestellt werden. Auf diese Weise ist es besonders einfach möglich, in quantitativer Weise zu arbeiten, da mit Hilfe des Kits eine quantitative PCR durchgeführt werden kann. Durch den Einsatz von Trägerplatten mit einer großen Anzahl an Vertiefungen (beispielsweise 384 Vertiefungen) können mit einem derartigen System zahlreiche PCRs gleichzeitig durchgeführt werden, so dass sich dieses System auch für eine große Anzahl an Sonden eignet.
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In einer alternativen, bevorzugten Ausgestaltung liegt das diagnostische System in Form eines Nukleinsäure-Chips vor. Dabei kann insbesondere vorgesehen sein, dass mindestens 5 Sonden für jede nachzuweisende Nukleinsäure auf den Chip aufgetragen sind. Auf diese Weise lässt sich die Expression von Genen bevorzugt semi-quantitativ messen. Ein Chip weist den Vorteil auf, dass das Vorhandensein zahlreicher verschiedener Gene in der untersuchten Probe gleichzeitig detektiert werden kann. Dabei ist die Anzahl gleichzeitig detektierbarer Gene noch weitaus größer als im Falle einer PCR. Insbesondere bei einer größeren Anzahl an Sonden (beispielsweise mehr als 25, insbesondere aber mehr als 100 oder mehr als 1000 Sonden), bietet sich die Verwendung eines Chips aus Effizienzgründen besonders an.
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Die beanspruchte Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Unterscheidung einer eosinophilen Myokarditis von einer Riesenzellmyokarditis und/oder von einer kardialen Sarkoidose, das die nachfolgend erläuterten Schritte umfasst. Zunächst wird eine Probe bereitgestellt, die von einem Patienten, bei dem ein Verdacht auf das Vorliegen einer nicht-ischämischen Kardiomyopathie vorliegt, gewonnen wurde. Anschließend wird die Probe direkt oder nach vorangegangener biochemischer Modifikation mit mindestens 5 Sonden in Kontakt gebracht, wobei die Sonden jeweils eine Sequenz aufweisen, welche den Sequenzen der Gene aus den obigen Listen entspricht oder zu diesen komplementär ist. Dieses Inkontaktbringen erfolgt unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren (beispielsweise Genen oder Transkripten von Genen) auf der einen Seite und den Sonden auf der anderen Seite erlauben. Danach wird ermittelt, ob eine Hybridisierung zwischen den Nukleinsäuren der Probe und der Sonde erfolgt ist. Anschließend wird anhand dieses Hybridisierungsergebnisses bestimmt, welche Nukleinsäuren in der Probe vorhanden sind.
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Vorzugsweise geschieht die Ermittlung einer erfolgten Hybridisierung in semi-quantitativer oder in quantitativer Weise.
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Bei der Probe handelt es sich vorzugsweise um einen Total-RNA-Extrakt, der aus einer Gewebeprobe des Patienten stammt. Die Gewebeprobe kann ein vollständiges Gewebe des Patienten wie etwa Herzmuskelgewebe oder Blut umfassen. Aus dieser Probe wird dann vor Beginn des Verfahrens ein RNA-Extrakt gewonnen, der als Probe im vorliegend beanspruchten Verfahren verwendet wird.
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Die Erfindung betrifft auch ein Medikament zur Behandlung einer eosinophilen Myokarditis,, das als pharmazeutisch aktive Substanz mindestens eine Nukleinsäure enthält, die eine Sequenz aufweist, die identisch oder komplementär zu der Sequenz eines der Gene gemäß den obigen Erläuterungen ist.
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Ein solches Medikament kann dazu dienen, den Gehalt eines bestimmten Gens im Blut bzw. in den Zellen eines Patienten zu erhöhen, um so die positiven Eigenschaften dieses Gens in Bezug auf die eosinophile Myokarditis zu verstärken. Es kann auch dazu dienen, ein bestimmtes Gen, dessen Gehalt bei der eosinophilen Myokarditis erhöht ist, durch Hybridisierung oder eine vergleichbare Interaktion zu eliminieren, um dem negativen Effekt dieses Gens auf die eosinophile Myokarditis entgegenzuwirken.
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Vorzugsweise stellt die ausgewählte Nukleinsäure oder Gruppe von Nukleinsäuren den einzigen pharmazeutisch aktiven Bestandteil des entsprechenden Medikaments dar.
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Das Medikament eignet sich vorzugsweise nicht nur zur therapeutischen Zwecken, sondern auch zu diagnostischen Zwecken.
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Bevorzugte Ausgestaltungen der oben dargestellten und nachfolgend in Zusammenhang mit den Beispielen erläuterten Verwendung der Gene sind in analoger Weise auch auf das beanspruchte Medikament übertragbar. Dies betrifft insbesondere die Auswahl entsprechender Nukleinsäure-Sequenzen oder Untergruppen von Sequenzen anhand der Gene, die als bevorzugt einzusetzen dargestellt sind.
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Die Erfindung betrifft auch die therapeutische Nutzung der dargestellten Gene oder Nukleinsäure-Sequenzen, die zu diesen Genen identisch oder komplementär sind, insbesondere zu Behandlung bzw. Therapie der eosinophilen Myokarditis.
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Bevorzugte Ausgestaltungen der oben dargestellten und nachfolgend in Zusammenhang mit dem Beispiel erläuterten Verwendung der Gene sind in analoger Weise auch auf eine entsprechende therapeutische Anwendung übertragbar.
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Die Erfindung betrifft auch ein in vitro oder in vivo durchgeführtes Diagnoseverfahren, bei dem ein diagnostisches Profil zur Unterscheidung einer eosinophilen Myokarditis von einer Riesenzellmyokarditis und/oder von einer kardialen Sarkoidose eingesetzt wird. Dieses Diagnoseverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das diagnostische Profil mindestens 5 Gene oder synthetische Nukleinsäuren mit identischen oder komplementären Sequenzen umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus den folgenden menschlichen Genen ausgewählt sind: ADIPOR2 (SEQ ID NO: 1), CCR5 (SEQ ID NO: 2), CCR6 (SEQ ID NO: 3), CPT1 (SEQ ID NO: 4), CYB (SEQ ID NO: 5), DHODH (SEQ ID NO: 6), FOXP3 (SEQ ID NO: 7), IFNB1 (SEQ ID NO: 8), IL10 (SEQ ID NO: 9), ND1 (SEQ ID NO: 10) und ND4 (SEQ ID NO: 11).
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Bevorzugte Ausgestaltungen der oben dargestellten und nachfolgend in Zusammenhang mit dem Beispiel erläuterten Verwendung der Gene sind in analoger Weise auch auf ein solches Diagnoseverfahren übertragbar.
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Die vorliegende Erfindung soll anhand eines Beispiels näher erläutert werden.
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Beispiel 1: Diagnose einer eosinophilen Myokarditis mittels einer Biopsieprobe
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Mehreren an einer eosinophilen Myokarditis, an einer Riesenzellmyokarditis oder an einer kardialen Sarkoidose erkrankten menschlichen Patienten wurden Herzmuskelbiopsien entnommen. Aus den einzelnen Biopsieproben wurde mittels dem Fachmann allgemein bekannter Standardverfahren jeweils ein Total-RNA-Extrakt (also ein Extrakt der gesamten RNA der jeweiligen Biopsie) gewonnen. Dieser Total-RNA-Extrakt wurde anschließend mittels zweier Varianten auf das Vorhandensein bestimmter Gene untersucht.
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Variante 1 (RNA-Chip)
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Die RNA des Total-RNA-Extrakts wurde mit Biotin markiert, auf einen RNA-Chip aufgebracht und 16 Stunden inkubiert. Ein solcher RNA-Chip wird mitunter auch als DNA-Chip bezeichnet, da er DNA-Sonden enthält. Diese sind jedoch zum RNA-Nachweis vorgesehen, weshalb vorliegend die Bezeichnung „RNA-Chip“ verwendet wird. Während der Inkubation erfolgte eine Hybridisierung der in dem Total-RNA-Extrakt enthaltenen Gene mit komplementären DNA-Sonden auf dem RNA-Chip. Hybridisierte Gen-Moleküle wurden anschließend mit dem Fluoreszenzfarbstoff Streptavidin-Phycoerythrin, welcher an Biotin bindet, detektiert. Durch Bestimmung der Fluoreszenzintensität des gebundenen Streptavidin-Phycoerythrins konnte die Menge der hybridisierten Gene in semi-quantitativer Weise bestimmt werden.
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Für die einzelnen Verfahrensschritte wurden vom jeweiligen Hersteller der RNA-Chips empfohlene Standardpuffer verwendet. Diese sind dem Fachmann allgemein geläufig. Für den mRNA-Nachweis wurden „Whole Genome Chips“ der Fa. Affymetrix verwendet.
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Variante 2 (PCR-Genkarte)
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Die im Total-RNA-Extrakt enthaltenen Gentranskripte wurden zur Synthese von cDNA verwendet. Je nach Menge der erhaltenen cDNA wurde diese bei Bedarf präamplifiziert. Anschließend wurde die cDNA auf eine Karte aufgetragen und eine quantitative PCR durchgeführt. Auf diese Weise konnte eine relative Quantifizierung der einzelnen cDNAs in Echtzeit über die relative Fluoreszenz zu mitamplifizierten Haushaltsgenen (also zu konstitutiv exprimierten Genen) erfolgen.
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Für die einzelnen Verfahrensschritte wurden vom jeweiligen Anbieter der Genkarten empfohlene Standardpuffer verwendet. Diese sind dem Fachmann allgemein geläufig. Unter anderem wurden Genkarten der Firma Applied Biosystems verwendet.
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Durch eine ergänzende Anwendung der Verfahren nach Variante 1 und Variante 2 wurden zahlreiche Gene identifiziert, deren Expression im Vergleich zu Proben, die von Patienten mit anderen Formen entzündlicher Kardiomyopathien stammten, modifiziert war.
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Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt eine Auflistung der quantitativ bestimmten Genexpression verschiedener Gene bei den untersuchten Proben. Dabei wurden Proben von Patienten ohne nachweisbare Virusinfektion und ohne myokardiale Entzündung (Kontrolle), von Patienten mit einer eosinophilen Myokarditis (EOM), von Patienten mit einer kardialen Sarkoidose (CS) und von Patienten mit einer Riesenzellenmyokarditis (IGCM) untersucht. Die Auflistung betrifft Gene, welche zur Differentialdiagnose der eosinophilen Myokarditis in Abgrenzung zur Riesenzellmyokarditis und zur kardialen Sarkoidose genutzt werden können. Diese Gene bieten im Rahmen der vorliegenden Erfindung die beste diagnostische Nutzung hinsichtlich einer Diagnose einer eosinophilen Myokarditis.
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In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die identifizierten Gene, deren Expression bei einer eosinophilen Myokarditis modifiziert ist, aufgelistet. Ferner ist in dieser Tabelle angegeben, welcher Art diese Modifikation ist (Expression hochreguliert oder Expression herunterreguliert).
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Ferner wurde ein für die beobachtete Expressionsmodifikation und die sich daraus ergebende Eignung des Gens zum Einsatz bei der Diagnose der eosinophilen Myokarditis aussagekräftiger Punktwert (eine Punktzahl) berechnet.
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Ein Punktwert von 1 bedeutet, dass die beobachtete Expressionsmodifikation spezifisch für die eosinophile Myokarditis ist und nur bei dieser deutlich verändert auftritt. Gene, denen ein Punktwert von 1 zugeordnet ist, sind daher spezifische Marker für eine eosinophile Myokarditis. Ihre Markerfunktion können diese Gene durch eine erhöhte Expression (Hochregulation) oder eine verminderte Expression (Herunterregulation) ausüben. Ein Punktwert von 1 bezeichnet mit anderen Worten Gene, die eine eindeutige Identifizierung der eosinophilen Myokarditis ermöglichen, selbst wenn nicht bekannt ist, welcher Art die beobachtete Modifikation der Expression ist.
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Ein Punktwert von 2 bedeutet, dass die beobachtete Expressionsmodifikation spezifisch für zwei der betrachteten entzündlichen Kardiomyopathien ist und nur bei diesen beiden Erkrankungen auftritt. Dabei ist die Expression im Falle der ersten dieser beiden Erkrankungen erhöht und im Falle der zweiten dieser beiden Erkrankungen erniedrigt. Gene, denen ein Punktwert von 2 zugeordnet ist, sind daher spezifische Marker für eine eosinophile Myokarditis, sofern zusätzlich bekannt ist, ob ihre Expression hochreguliert oder aber herunterreguliert ist. Ein Punktwert von 2 bezeichnet mit anderen Worten Gene, die eine eindeutige Identifizierung eines Krankheitsbildes ermöglichen, sofern zusätzlich bekannt ist, welcher Art die beobachtete Modifikation der Expression ist. Tabelle 1: Zur diagnostischen Unterscheidung einer eosinophilen Myokarditis (EOM) von einer Riesenzellenmyokarditis (IGCM) und/oder von einer kardialen Sarkoidose (CS) geeignete Gene
| SEQ ID NO | Gen | Genexpression EOM vs. Kontrolle | p-Wert EOM vs. Kontrolle | Genexpression CS vs. Kontrolle (p-Wert CS vs. EOM) | Genexpression IGCM vs. Kontrolle (p-Wert IGCM vs. EOM) | Gen geeignet zur Unterscheidung von EOM zu | Punktwert |
| 1 | ADIPOR2 | Herunter | < 0,05 | och H(< 0,05) | Hoch | CM CS/IG | 2 |
| 2 | CCR5 | Hoch | < 0,01 | Hoch | Hoch | IGCM | 2 |
| 3 | CCR6 | Herunter | ns | Hoch | Hoch (< 0,05) | IGCM | 1 |
| 4 | CPT1 | Herunter | < 0,01 | och H(< 0,01) | t Unveränder | CS | 1 |
| 5 | CYB | Hoch | ns | Hoch | Herunter | IGCM | 1 |
| 6 | DHODH | Herunter | ns | Hoch(< 0,001) | erunter H | CS | 1 |
| 7 | FOXP3 | Hoch | < 0,05 | Hoch | Hoch | IGCM | 1 |
| 8 | IFNB1 | Hoch | ns | Herunter (< 0,05) | Hoch | CS/IGCM | 1 |
| 9 | IL10 | Hoch | < 0,001 | Hoch | Hoch | CS | 1 |
| 10 | ND1 | Hoch | ns | Hoch | runter He(< 0,05) | IGCM | 1 |
| 11 | ND4 | Hoch | < 0,05 | Hoch | Hoch | CS | 1 |
ns = nicht signifikant
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In einer Variante werden nur solche Gene in einem diagnostischen Profil verwendet, denen in der Tabelle 1 eine Punktzahl von 1 oder 2 zugeordnet wurde.
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
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