CN115053133A - 用于分析组织样本的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对得自组织样本的细胞的表型和/或基因型进行分析的方法和装置。具体地，本发明涉及分析所获得细胞对暴露于药物化合物或其组合的应答。本发明的方法提供高效且适于自动化的特别优点。

Description

用于分析组织样本的方法和装置
技术领域
本发明涉及对得自组织样本的细胞的表型和/或基因型进行分析的方法和装置。特别地，本发明涉及分析所获得细胞对暴露于药物化合物或其组合的应答。本发明的方法提供高效且适于自动化的特别优点。
背景技术
一般而言，处于治疗目的研发中的药物在常规筛选系统中进行药效筛选，其中来自库中的药物在适当的细胞类检定中进行测试。通常地，研究细胞的活性和/或候选药物的细胞毒性。这些方法通常以所谓的高通量形式进行，但仍存在着在这些途径中被识别为有希望的药物在之后的临床检测中令人失望的较高风险。
此外，已发现，在特定的适应症领域，药物组合的使用日益增加，以例如避免耐药性的发生，或者探索协同效应。
迄今为止，几乎还没有公开过成体系的用于在早期筛选潜在药物组合的方法。通常地，由医师根据经验对药物进行组合，并在患者中测试。然而，仍缺失真正研究这些药物组合的联合效用的系统性方法。这意味着，存着着大量潜在有希望的药物组合，由于系统性研究的缺失，从未到达患者端。
Sobrino等人(3D microtumors in vitro supported by perfused vascularnetworks，Sci-entific Reports volume 6，Article number：31589(2016))公开了，对于开发一种能够用于体外构建正常和病理性人器官模型的微生理系统的兴趣渐浓。这种“器官芯片”的方式意在捕获目标组织的关键结构和生理特征。他们描绘出体外血管化微肿瘤(VMT)。这样的“肿瘤芯片”平台结合了人肿瘤与在3D胞外基质中生长且依赖于遍布的成活微血管而存活的基质细胞。结直肠癌细胞和乳癌细胞均在该平台中生长良好，并对标准治疗有反应，显示出生长减弱和/或回缩。也可以区分出以不同作用机制靶向血管的药物，他们发现，仅靶向VEGFR的药物(阿帕替尼和凡德他尼)没有效果，而靶向VEGFR、PDGFR和Tie2的药物(利尼伐尼和卡博替尼)确实使血管退化。在VMT中的肿瘤，当用NADH荧光寿命成像显微术成像时，显示出较强的代谢异质性，且与它们周围的基质相比，很多显示出更高的自由/结合NADH比，与已知的它们对于有氧糖酵解的偏好相一致。VMT平台被公开为一种独特的用于研究体外血管化实体瘤的模型。
Benton等人(In Vitro Microtumors Provide a Physiologically PredictiveTool for Breast Cancer Therapeutic Screening，Plos One，April 9，2015，https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0123312)公开了使用肿瘤支持ECM、肿瘤支持介质、MCF-7和MDA-MB-231乳癌球体、人脐带静脉内皮状细胞、和人基质细胞的体外微肿瘤模型，以重复出生长中的入侵型肿瘤的组织架构、化学环境和细胞结构。他们在肿瘤支持胞外基质中检测到了微肿瘤的细胞增殖以及侵入，表现为胶原沉淀、酸化、葡萄糖缺乏、和缺氧。
同时，需要改善早期实验在未来体内情形下的可预测性，以减少已在临床前表现出希望的药物联用的失败风险。
因此，本发明的目标是，提供新的改进的用于对得自组织样本的细胞在暴露于药物或药物组合时的表型和/或基因型进行分析的方法和装置，特别是为了精简装置，并提供更加高效的患者特定的治疗方法。
发明内容
总体而言，本发明涉及以治疗目的筛选药物或其组合，特别是患者特定的药物或其组合。特别地，本发明涉及筛选能够治疗性地在有需要个体中用于治疗和/或预防以及减缓赘生性细胞或肿瘤细胞生长进程的药物或组合。
在第一个方面，本发明通过提供一种用于识别患者特定的，特别是个性化的药物或药物组合的方法，特别是自动化方法，来达成上述目标，其中患者罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤，该方法包括a)分离得自患者的组织样本的细胞，以获得分离细胞，b)基于步骤a)的分离细胞，制备3D微组织(例如微肿瘤)阵列，c)使该3D微组织阵列与至少两种药物和/或其组合接触，d)确定该药物和/或其组合对该3D微组织阵列的作用，以及e)基于所确定的作用，识别出患者特定的药物或药物组合。
本发明对罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤的患者或预选患者群的生物活检组织样本进行分析。该样本用于制备3D微组织，特别是所谓的“微肿瘤”，其用于测试对治疗和/或预防该赘生性疾病或肿瘤有功效的、且理想状态下有患者特定的功效的治疗性药物或药物组合。该方法和系统使得可以快速分析并搜寻药物，特别是筛选对实际患者和/或特定患者群有效的药物和药物组合。该方法和系统还具有例如通过添加细胞来构建由使用基于单个细胞的筛选的普通筛选方法无法达到的微肿瘤-环境，来紧密地模拟出体内实际情况。在如下阐释的一个方面中，除得自患者的样本外，方法可以“伴随有”所谓子样本的分析，并对该子样本施行分子特征分析、组织学分析、和组织化学分析中的至少一种，这些也在本文中进一步阐释。
在本发明的背景下，3D微组织将指定为体外制备的含有所需细胞的细胞团块。因此，微肿瘤是指至少部分地由得自细胞系或赘生性组织例如肿瘤的所选癌细胞生成的3D微组织(参见，例如Rimann et al.，An in vitro osteosarcoma 3D microtissue model fordrug development，Volume 189，10 November2014，Pages 129-135)。本文中的这两个术语交替使用。
在本发明的背景下，“阵列”是一套分离的待测试/分析的3D微组织，例如在多孔板中的3D微肿瘤。阵列为至少2个或更多个，或3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，12、48、96、128、384或更多个，或甚至200、300、400或更多个3D微肿瘤/微组织。
优选根据本发明的方法还包括选择所识别出的患者特定的药物或药物组合的步骤，即分离出某套患者特定的的药物，不论是作为数据集，或者甚至通过物理性地提供患者特定的药物混合物。
另一个方面涉及一种治疗罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤的患者的方法，包括施行根据本发明的方法，以及用所识别出的患者特定的，特别是个性化的药物或药物组合，适当地治疗该患者的步骤。
优选的是根据本发明的方法，其中该方法提供有关患者特定的或患者群特定的药物或药物组合的合理建议，以更加有效地治疗罹患或诊断为特定赘生性疾病或肿瘤的患者。
在优选的方面，本发明涉及根据本发明的方法，其中分离组织样本包括i)如果需要的话，将组织样本分成更小的含有细胞的块，例如将组织样本分成小块，和/或使得样本通过(微型)筛，ii)用含有至少一种能够分离组织样本中细胞的酶的溶液处理该组织样本，优选至少一种酶选自蛋白酶、胶原蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I、和中性蛋白酶(分散酶)，制备含有分离细胞的上清液，以及ii)移除含有分离细胞的上清液，并适当地收集该细胞，其中步骤(ii)和(iii)重复至少一次。该步骤可以完全自动化。
根据本发明的方法的另一个方面，在步骤ii)之前，用超声(例如脉冲超声)对组织样本进行超声处理。实施这个步骤，以引起溶血，其中超声的能量设置在合适的水平，不破坏和/或损坏大量的待分析细胞，例如设置在约1MHz，0.5-5，优选2Wcm-2，即，比从细胞样本制备DNA或RNA更加温和。使用超声的溶血步骤，最佳地，持续约5分钟，并靶向未嵌入组织环境中的细胞。
此外优选的是根据本发明的方法，其中步骤b)包括向分离细胞添加、或从分离细胞移除基质细胞、基质成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。细胞的添加或移除帮助控制微组织环境。特别优选的是，添加已知在体内与肿瘤和肿瘤中细胞相互作用和/或侵入肿瘤的免疫细胞，例如所谓的肿瘤浸润免疫细胞。实例为PBMC、淋巴细胞、重组T细胞等。这些设置和策略对于癌症免疫疗法下的测试和检定特别有利，且还可以涉及向微组织环境添加其他因子，例如细胞因子等。细胞和因子也可以在形成微组织后添加。
本发明的方面涉及这一事实，即当前在市场上没有预测在癌症治疗中使用免疫调节剂例如免疫检查点抑制剂(例如，PD1、PD-L1、CTLA-4等)情况下的患者的临床结局的自动化标准功能测试方法。对这类药物的临床功效的评价特别难，因为不适用当前的实体瘤疗效评价标准(RECIST)，因为最初对这些药物的反应通常为肿瘤膨大。在根据本发明的装置中(特别是在POC装置中)对这些药物的初步测试可减少有关治疗效果的不确定性，因而使得特定疗法能够更好地适应患者。
为评估免疫调节剂的有效性，本发明的测试系统需要至少两个组分：(i)癌细胞、和(ii)免疫细胞。本文所述的技术也适用于并入和添加额外的由免疫学测试系统所需的细胞类型，例如外周血单核细胞(PBMC)，或从患者新鲜分离、或来自冻存样本。技术的可扩大化也使得可以测试效应细胞(例如T细胞)及其相对于癌细胞数量的数量(比例)，以检测各疗法/多个疗法/组合的效力，以及甚至对其分类。
优选的是根据本发明的方法，其中在步骤b)中，对于各个3D微组织，提供预定数量的细胞，例如约500、约1000、约2000、约5000、或约10000个细胞，特别是活细胞。这还可以包括在制备该微组织前，适当地对细胞计数，优选地使用合适的自动细胞计数组件(例如购自Logos Biosystems，韩国)。
根据本发明的方法的另一个方面，在步骤b)中，3D微组织在选自悬滴系统、和b)多孔系统(优选地包括超低附着(ULA)孔)中的至少一个系统中制备。
优选的是根据本发明的方法，其中3D微组织的制备不需要使用溶解的基底膜制品，例如
Figure BDA0003721805720000041
这具有的优势是，整个方法可以在高于4℃的温度下，例如室温，进行。
优选的是根据本发明的方法，其中该3D微组织的制备包括包含在该分离细胞中的细胞的自组装。
另外优选的是根据本发明的方法，其中该3D微组织的制备包括约6小时-7天的成熟时间，优选为约1-6天，更优选约2-5天。
另外优选的是根据本发明的方法，其中所制备的3D微组织具有约350μm+/-100μm的大小。所需的和优选的是适于恰当分析的大小，特别是适用于本文所述的光学分析法的大小。
根据本发明的方法的另一个方面，步骤c)中的接触包括持续暴露于至少两种药物和/或其组合，和/或暴露于至少两种药物和/或其组合以及之后移除的循环，任选地至少一个循环，优选两个和更多个循环。
根据本发明的方法的另一个方面，步骤c)中与3D微组织接触的药物或组合选自细胞毒性剂、细胞(生长)抑制剂、和/或化疗剂，靶向药，免疫治疗剂和/或其组合。细胞毒性剂、细胞(生长)抑制剂、和/或化疗剂的例子是阿那曲唑、硫唑嘌呤、卡介苗(Bcg)、毕卡鲁胺、氯霉素、环孢素、西多福韦、含煤焦油的产品、秋水仙碱、达那唑、己烯雌酚、地诺前列酮、含地蒽酚的产品、度他雄胺、雌二醇、依西美坦、非那雄胺、氟他胺、更昔洛韦、绒毛促性腺激素、戈舍瑞林、含干扰素的产品(包括聚乙二醇干扰素)、来氟米特、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、甲羟孕酮、甲地孕酮、尿促性素、米非司酮、麦考酚酸酯、那法瑞林、含雌激素的产品、催产素(包括因托西农和麦角新碱)、鬼臼脂、含黄体酮的产品、雷洛西芬、三氮唑核苷、西罗莫司、链佐星、他克莫司、他莫昔芬、睾酮、沙利度胺、托瑞米芬、曲氟尿苷、曲普瑞林、缬更昔洛韦、和齐多夫定。靶向药是增加身体一些部位相对于其他部位的浓度的药物，例如抗体。实例为，针对脑癌的贝伐单抗、依维莫司；针对乳癌的贝伐单抗、依维莫司、拉帕替尼、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗及其抗体药物结合物；针对结直肠癌的阿柏西普、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、瑞戈菲尼；和针对隆突性皮肤纤维肉瘤的伊马替尼。免疫治疗剂用在免疫疗法中，免疫疗法是一种使用身体免疫系统的力量来预防、控制和消除癌症的癌症治疗方式。实例是，治疗癌症的单克隆抗体、CAR-T细胞疗法、治疗癌症的免疫检查点抑制剂、癌疫苗、免疫调节剂(IMiD)、和细胞因子。
根据本发明的方法的另一个方面，步骤d)中作用的确定，选自3D微组织的大小确定、3D微组织中内部报告基因表达的定量、3D微组织中胞内ATP含量的确定、以及3D微组织中预选定的生物标记物的确定。
根据本发明的方法的另一个方面，3D微组织的大小确定包括选自直径、周长、体积、和光学截面面积中的至少一个参数。
根据本发明的方法的另一个方面，3D微组织的大小确定包括光学方法的使用，例如使用成像设备。特别有用的是高分辨率扫描电子显微镜(HR-SEM)。
根据本发明的方法的另一个方面，方法还包括分析细胞和微组织的生长动力学。生长动力学是表明生长速率与细胞浓度直接成比例的自催化反应。细胞浓度可以通过本领域技术人员已知的、以及在文献中描述(例如，如上所述的细胞计数)的直接和间接方法测定。
根据本发明的方法的另一个方面，得自患者的组织样本选自得自原代组织样本、原发肿瘤样本、和转移瘤样本的子样本。
优选的是根据本发明的方法，其中该组织样本通过包括空芯针穿刺活检、肿瘤切除、液体活检、和/或针吸活组织检查，以及其他活组织检查、手术和灌洗的方法获得。组织样本可以从选自已确定的或疑似的赘生性组织或癌组织中的肿瘤获得，赘生性组织或癌组织包括赘生性肝组织、赘生性肾组织、赘生性皮肤组织、赘生性前列腺组织、赘生性乳房组织、赘生性卵巢组织、赘生性脑组织等，特别地由赘生性肝组织得到，特别地由原发或转移肝肿瘤得到。
优选的是根据本发明的方法，其中该组织样本和/或分离细胞是冷冻的，且在制备3D微组织前解冻。
根据本发明的方法的另一个方面，该方法包括提供原代组织样本，获得除得自患者的样本之外的子样本，并对该子样本进行分子特征分析、组织学分析和组织化学分析中的至少一种。在这个方面，与3D微组织平行的，可以通过在分析开始时“分割”材料来收集额外的患者特定的或肿瘤特定的信息，例如，患者既往病史、关于患者的遗传学信息、和患者基因信息。
根据本发明的方法的另一个方面，该方法还包括生成包含基于步骤a)至e)产生的信息、和/或包含有关于药物或药物组合对治疗指定赘生性疾病或肿瘤的患者特定的效果和/或疗效的信息的数据库的步骤。优选地，这包括向数据库添加其他数据，其他数据选自i)关于该组织样本的分子特征分析的数据，ii)该组织样本的组织学分析结果，iii)该组织样本的组织化学分析结果，iv)患者既往病史，例如选自检查/确定生命机能、患者病史、抽烟习惯、体育运动、激素水平、之前或当前的药物治疗等，v)有关患者的遗传学信息，和vi)患者的基因信息。
本发明的另一个方面涉及一种针对使用患者特定的药物或药物组合的治疗而对患者分类的方法，包括如上执行本发明的方法，还包括基于所识别的患者特定的药物或药物组合，对患者分类，优选分成不同的患者和/或治疗组。
本发明的另一个方面涉及一种用于识别与在患者中用患者特定的药物或药物组合治疗相关的不利影响的方法，包括如上执行本发明的方法，还包括测试和分析患者特定的药物或药物组合在该患者中的不利影响的步骤。药物不良反应(ADR)形式的不利影响是明显有害的或令人不愉快的反应，由与药物产品(药品)的使用相关的干预引起，其预测未来给药的危险，并为预防或特定治疗、或给药方案的改变、或撤回产品提供根据(参见，例如，Edwards and Aronson，The Lancet，356，1255-1259)。
本发明的另一个重要的方面涉及适合于以及适应于执行本发明方法的装置。特别优选的本发明系统的实施方式在附图和以下实施例中描述。
具体地，本发明涉及一种用于识别患者特定的，特别是个性化的药物或药物组合的系统，其中该患者罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤，该系统包括a)用于分离得自患者的组织样本以获得分离细胞的组织样本分离单元，b)基于步骤a)的分离细胞制备3D微组织(例如微肿瘤)阵列的单元，c)使该3D微组织阵列与至少两种药物和/或其组合接触的药物测试单元，d)确定药物和/或其组合对该3D微组织阵列的作用的第一分析单元，和e)基于所确定的作用来识别患者特定的药物或药物组合的第二分析单元。可选地，该系统还可以包含显示、存储、保存结果信息的报告单元。
优选根据本发明的系统还包含用于选择所识别的患者特定的药物或药物组合的单元。
优选的是根据本发明的系统，其中该组织样本分离单元包含i)移液设备、ii)酶库、iii)细胞培养基库、iv)清洗液库、v)可选地，超声设备、以及vi)离心设备中的至少一个。
优选的是根据本发明的系统，其中基于分离细胞制备3D微组织例如微肿瘤的阵列的单元包含i)移液设备、ii)细胞计数设备、和iii)微量滴定板处理器中的至少一个。
优选的是根据本发明的系统，其中药物测试单元包含i)微量滴定板处理器、ii)移液设备、iii)细胞培养基库、iv)包含至少两种不同药物或其组合的库的阵列、和iv)孵育设备中的至少一个。
另外优选的是根据本发明的系统，其中该第一和/或第二分析单元包含i)微量滴定板处理器、和/或ii)包含显微镜和相机、以及任选的HR扫描仪的成像系统。
另外优选的是根据本发明的系统，其中选择所识别的患者特定的药物或药物组合的单元，包含计算机数据库，该数据库包含患者数据和药物和/或其组合对3D微组织阵列的作用的数据。
另外优选的是根据本发明的系统，其中组织样本分离单元和制备3D微组织阵列的单元共用同一移液设备。这提供特别紧凑的系统。
另外优选的是根据本发明的系统，其中该药物测试单元和第一分析单元共同同一微量滴定板处理器。这提供特别紧凑的系统。
根据本发明的系统的特别重要的方面是自动化，其提供快速且可重复的结果。因此，优选的是根据本发明的系统，其中其至少一个单元，优选其几乎所有单元，以自动化的方式运作。
另外优选的是根据本发明的系统，其中该组织样本分离单元、和制备3D微组织阵列的单元位于同一壳体中。这提供特别紧凑的系统。
另外还优选的是根据本发明的系统，其中药物测试单元和第一分析单元位于同一壳体内。这提供特别紧凑的系统。
另外还优选的是根据本发明的系统，其中两个壳体相连接，形成独立系统。优选地，这包括，壳体连接到单一系统中。
根据本发明的系统的另一个方面，系统可以作为整体、或以分开部件进行灭菌，和/或包含用于建立和/或保持灭菌条件的构件，例如通过UV照射、臭氧处理、射线来灭菌，和/或包括使用平流的部件等。
根据本发明的系统的另一重要方面，该系统可以垂直地安装，作为整体、或各部件分开。这提供特别紧凑的系统，特别适用于保健设施。
本发明的另一重要方面涉及根据本发明的系统，其中该系统包含至少一个装载端口(1)，其包含具有锁系统(L)的装载系统，用于在系统中使用的材料或消耗品的无菌装载，和/或卸载系统中产生的废弃物和/或产物。锁系统可以附着于系统，或者整合到系统中，例如作为壳体中整体的一部分。
优选的是本发明的系统，其中该装载端口(1)包含分开的装载(L1)和卸载(L2)锁系统。这使得可以分开地同时在系统中、或从系统中，装载和/或卸载材料和产物。
另外优选的是根据本发明的系统，其中该锁系统具有门、封盖、和/或开口，以打开和关闭安装在锁的各端(特别是在其各个相对端)的系统。总的来说，锁系统以进/出的方式运行，打开外部的封盖或门或开口，将材料装载到锁空间中(最优地，以盘或盒的方式，例如以下所述的)，关闭外部的封盖或门或开口。之后，通过各自的机构、或者通过形成内部系统的一部分的机械臂(15)，打开内部的封盖或门或开口，将材料运送至装置空间，存储或使用。当从系统卸载材料时，通过各自的机构、或通过机械臂(15)，打开内部的封盖或门或开口，将材料，例如产物或消耗品/废弃品，装载到锁空间(最优地，以盘或盒的形式，例如以下所述)，关闭内部的封盖或门或开口。之后，打开外部的封盖或门或开口，将材料移出系统外。
优选的是根据本发明的系统，其中该门、封盖、和/或开口用于往复地打开或关闭。这确保系统在任何既定的装载和/或卸载时间不对外开放。
另外优选的是根据本发明的系统，其中该锁系统还包含用于材料灭菌的构件，例如通过UV照射。在该实施方式中，材料(和/或)盒或盘在进入或离开系统前灭菌。在灭菌过程中，优选同时关闭封盖或门或开口，以避免UV射线或气体(臭氧)离开锁，并确保必要程度的有效灭菌。门和用于灭菌的构件可以包含控制单元，最优地包含计时器，作为系统的不可分割的部分、或作为单独构件存在。
另外优选的是根据本发明的系统，其中该锁系统还包含对待装载或待卸载材料进行解冻或冷却/冷冻的构件。在该实施方式中，材料(和/或)盒或盘在进入或离开系统前加热或冷却。在加热或冷却过程中，优选同时关闭封盖或门或开口，以保持所需的温度，并确保必要程度的有效加热或冷却。门、封盖或开口以及用于加热或冷却的构件可以包含控制单元，最优地包括计时器，作为系统的不可分割的部分、或作为单独的构件。锁也可以包括单独的温度区，例如用于冷却/解冻以及冷冻的4℃和-20℃，或37℃和环境温度。温度区可以包含可逐步控制加热和冷却，例如从4℃至-20℃、或从4℃至37℃(所有温度均为所给定的大概值)的控制单元。
此外优选的是根据本发明的系统，其中将该锁系统配置为特定地与运送盒或容器相匹配。这使得产物或材料可以密封运送入或出系统，或在系统或其部件之间密封运送。运送盒或容器也可以用于存储，特别是当其隔热时。运送盒或容器可以用常见材料制成，例如塑料、金属、铝、铁或玻璃。盒可以具有用于操作的把手、和/或用于标记的支撑物。
此外优选的是根据本发明的系统，其中该运送盒或容器包含至少一个可以在系统内部打开和关闭的口。这为系统内部的装载或卸载所需。
另外优选的是根据本发明的系统，其中该运送盒或容器包含至少两个不同的分开的温度区，例如保持在-20℃、4℃或常温的区，其中可选地，该运送盒或溶液为隔热的。该盒可以具有一体化的温度计。
另外优选的是根据本发明的系统，其中该运送盒或容器包含至少两个不同的分开的个体隔间或合并隔间，各个隔间构成独立的温度区。这使得可以例如用4℃的介质或-20℃的酶于37℃运输和使用细胞。
另外优选的是根据本发明的系统，其中该材料和/或产物选自微肿瘤、活体检测材料、消化酶、培养基、细胞、癌细胞、支持细胞、癌种类特异的维持培养基、药物、和预制的药物矩阵。
本发明的另一重要方面涉及具有如上所述本发明锁系统、或本发明的运送盒或容器的装载系统。
本发明的另一重要方面涉及一种使用如上所述的本发明锁系统或本发明运送盒或容器来将材料装载入和/或卸载出本发明系统的方法。根据本发明的将材料装载入和/或卸载出本发明系统的方法，可以与本文所述的有关化合物和细胞检测的方法相结合。
本发明的另一重要方面涉及根据本发明的系统、或根据本发明的锁系统或运送盒或容器在根据本发明的方法中的用途。这些用途涉及识别患者特定的，特别是个性化的药物或药物组合，其中该患者罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤；选择所识别的患者特定的药物或药物组合；针对使用患者特定的药物或药物组合的治疗而对患者分类；识别出与在患者中使用患者特定的药物或药物组合治疗相关的不利影响；以及治疗方法。
本发明的另一重要方面涉及一种用于治疗罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤的患者的方法，包括如本文所述执行根据本发明的方法，以及用所识别的患者特定的，特别是个性化的药物或药物组合治疗该患者。
方法还可以将根据本发明的方法考虑在内，其中该方法提供关于患者特定的或患者群特定的药物或药物组合的合理建议，以更加有效地治疗罹患或诊断为指定赘生性疾病或肿瘤的患者。方法还包括生成包含有基于步骤a)至e)产生的信息、和/或包含有关于药物或药物组合对治疗指定赘生性疾病或肿瘤的患者特定的效果和/或疗效的信息的数据库的步骤。优选地，这包括向数据库添加其他数据，其他数据选自i)关于该组织样本的分子特征分析的数据，ii)该组织样本的组织学分析结果，iii)该组织样本的组织化学分析结果，iv)患者既往病史，例如选自检查/确定生命机能、患者病史、抽烟习惯、体育运动、激素水平、之前或当前的药物治疗等，v)有关患者的遗传学信息，和vi)患者的基因信息。
方法还可以将根据本发明的针对使用患者特定的药物或药物组合治疗而对患者分类的方法考虑在内，包括如上所述执行根据本发明的方法，还包括基于所识别的患者特定的药物或药物组合对患者分类，优选分为不同的患者和/或治疗群，和/或将识别出与在患者中用患者特定的药物或药物组合治疗相关的不良影响的方法考虑在内，包括如上所述执行根据本发明的方法，还包括测试并分析患者特定的药物或药物组合在该患者中的不良影响的步骤。
如本文所用的，术语“本发明的”、“依照本发明”、“根据本发明”等，是指本发明所述的和/或本文所要保护的所有方面和实施方式。
术语“约”和“大致”是指本领域技术人员所理解的仍能确保所关注特征的技术效果的准确性区间。该术语通常表明从所指定数值偏离±20％、±15％、±10％，以及例如±5％。正如本领域技术人员所意识到的，针对指定的技术效果，数值的特定偏离将取决于技术效果的本质特征。例如，自然的或生物学的技术效果大体上可以具有比人工或工程技术效果具有更大的偏差。正如本领域技术人员所意识到的，针对给定的技术效果，数值的特定偏差将取决于技术效果的本质特征。例如，自然的或生物学的技术效果大体上可以具有比人工或工程技术效果具有更大的偏差。
当对单数名词使用不定冠词或定冠词，例如“一个”、“一种”、或“该”时，这包括多个的所述名词，除非具体指出其他情况。
将理解的是，根据本文所包含的教导，本发明的教导在特定问题或环境中的应用，以及将本发明变体或附加于其的额外特征(例如其他方面和实施方式)包括在内，将在本领域技术人员的能力范围内。
除非上下文指出相反的情况，上述特征的描述和定义，不限于本发明的任何特定方面或实施方式，将同等地适用于所描述的所有方面和实施方式。
所有本文引用的文献、专利和公开物，均通过引用的方法整体并入本文。
如本文所用的，术语“样本”是指可从疑似患有赘生性疾病例如肿瘤/癌症的患者、或经确诊患有赘生性疾病例如肿瘤/癌症的患者得到的临床样本。该样本可以通过任何已知的生物活体检查类型，例如本领域已知的针吸活组织检查、液体活检、空芯针穿刺活检、肿瘤切除、针刺吸取、赘生性实体组织的手术摘除，而获得。
如本文所用的，术语“治疗”是指任何类型的治疗性干预，包括治愈疾病、减轻疾病、改善疾病、减缓疾病进展等，以及减轻或改善或抑制疾病症状如疼痛等，特别是与赘生性疾病/癌症相关的那些。
如本文所用的，术语“预防”是指任何类型的适于防止疾病(特别是赘生性疾病)的发生，或能够减缓、抑制疾病或疾病症状(特别是赘生性疾病/癌症)的恶化的干预。
如本文所用的，术语“赘生性”是指任何组织的丧失了生长控制的生长，包括实体瘤或液体瘤、疣、转移瘤生长等。
如本文所用的，术语“肿瘤”是指在任何特定器官系统或组织，例如肝、肾、脑、乳房、前列腺、皮肤等中的任何良性或恶性组织。
如本文所用的，术语“微孔板”是指任何排布的能够用作反应容器或培养容器的多腔室，例如24孔板、48孔板、96孔板、384孔板等，如领域内已知的。其也包含个体容器的使用和排布，其不必要排布在板上，也可以是以非正式条带排布的个体容器等。
如本文所用的，术语“超声处理”涉及用超声处理组织或细胞，从而破坏某些目标结构的完整性，例如在称为溶血的过程中破坏血红细胞的结构完整性。这使得可以移除组织样本中的血红蛋白，血红蛋白可能会因为其对检测装置的干扰，而干扰所获细胞的分析，特别是细胞的光学分析。也可以通过在非常高或非常低渗透浓度的溶液中孵育组织，引发血红细胞的破裂或收缩，通过用某些溶血酶处理等，从而实现溶血。
如本文所用的，术语“患者”是指人或非人患者。非人患者可以优选地为哺乳动物，例如，马、狗、猫等，其已经确诊为或者疑似患有赘生性疾病/癌症。
如本文所用的，术语“药物”是指任何活性剂，小分子或生物技术制备的分子、或分子组合，核酸构建体，例如用于基因疗法的载体，其作用可以使用本文所述方法和装置进行体外测试。
如本文所用的，术语“分类”是指将指定个体/患者划分到以特定方式治疗的组中的过程。
如本文所用的，术语“不良影响”在上下文中是指与将本文定义的微组织暴露于指定化合物或药物或其组合相关的任何不需要的副作用，可以包括，尤其是，促进细胞生长、对给定药物的耐受性的发生、丧失MHC的表达、下调免疫系统的因子的表面表达和/或分泌等，所有这些均表明得自样本的细胞似乎不太受指定化合物的影响/变得对指定化合物的暴露具有耐受性。
本发明的元素如本文所述。这些元素与具体实施方式列在一起，但是，应当理解的是，它们可以以任何形式、以任意数量组合，以创建出其他实施方式。多样化描述的实例和优选实施方式，不应当解读为，将本发明仅限制于明确描述的实施方式。本说明书应当理解为，支持并包括组合两个或更多个明确表述的实施方式、或组合一个或更多个明确描述的实施方式与任意数量的公开的和/或优选的元素，的实施方式。此外，本申请中所有所述元素的任何置换和组合，应当理解为由本申请的说明书所公开，除非上下文指出相反情况。
本发明涉及以下项。
项1.一种用于识别患者特定的，特别是个性化的，药物或药物组合的优选自动化的方法，其中患者罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤，该方法包括a)分离得自患者的组织样本的细胞，以获得分离细胞，b)基于步骤a)的分离细胞，制备3D微组织例如微肿瘤的阵列，c)将该3D微组织的阵列与至少两种药物和/或其组合接触，d)确定该药物和/或其组合对该3D微组织的阵列的作用，以及e)基于所确定的作用，识别出患者特定的药物或药物组合。
项2.根据项1的方法，还包括选择所识别出的患者特定的药物或药物组合的步骤。
项3.根据项1或2的方法，其中分离组织样本包括
i)若需要的话，将组织样本分成更小的包含细胞的块，
ii)用含有至少一种能够分离组织样本中细胞的酶的溶液处理组织样本，优选至少一种酶选自蛋白酶、胶原蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I、和中性蛋白酶(分散酶)，制备含有分离细胞的上清液，以及
ii)移除含有分离细胞的上清液，并适当地收集该细胞，
其中步骤(ii)和(iii)重复至少一次。
项4.根据项3的方法，其中在步骤(ii)前，用超声对组织样本进行超声处理，其中超声的能量设置在不破坏大量细胞的适当水平。
项5.根据项1-4中任一项的方法，其中步骤b)包括向分离细胞添加、或从分离细胞移除基质细胞、基质成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。
项6.根据项1-5中任一项的方法，其中在步骤b)中，对于各个3D微组织，提供预定数量的细胞，例如500-10000个活细胞。
项7.根据项1-6中任一项的方法，其中在步骤b)中，在选自悬滴系统、和b)多孔系统(优选地包括超低附着(ULA)孔)的至少一个系统中制备3D微组织。
项8.根据项1-7中任一项的方法，其中3D微组织的制备不需要使用溶解的基底膜制品，例如
Figure BDA0003721805720000111
项9.根据项1-8中任一项的方法，其中该3D微组织的制备包括包含在分离细胞中的细胞的自组装。
项10.根据项1-9中任一项的方法，其中该3D微组织的制备包括约6小时-7天的成熟时间，优选为约1-6天，更优选约2-5天。
项11.根据项1-10中任一项的方法，其中所制备的3D微组织具有约350μm+/-100μm的大小。
项12.根据项1-11中任一项的方法，其中步骤c)中的接触包括持续暴露于至少两种药物和/或其组合，和/或暴露于至少两种药物和/或其组合以及在之后移除。
项13.根据项1-12中任一项的方法，其中与3D微组织接触的药物选自细胞毒性剂、细胞(生长)抑制剂、化疗剂、靶向药、免疫治疗剂、和其组合。
项14.根据项1-13中任一项的方法，其中步骤d)中作用的确定选自3D微组织的大小确定、3D微组织中内部报告基因表达的定量、3D微组织中胞内ATP含量的确定、以及3D微组织中预选定的生物标记物的确定。
项15.根据项14的方法，其中3D微组织的大小确定包括选自直径、周长、体积、和光学截面面积中的至少一个参数。
项16.根据项14或15的方法，其中3D微组织的大小确定包括成像设备的使用。
项17.根据项14-16中任一项的方法，还包括生长动力学的分析。
项18.根据项1-17中任一项的方法，其中得自患者的组织样本选自得自原代组织样本、原发肿瘤样本、和转移瘤样本的子样本。
项19.根据项1-18中任一项的方法，其中该组织样本通过包括空芯针穿刺活检、肿瘤切除、液体活检、和/或针刺吸取的方法获得。
项20.根据项1-18中任一项的方法，其中组织样本和/或分离细胞是冷冻的，且在制备3D微组织前解冻。
项21.根据项1-20中任一项的方法，包括提供原代组织样本，获得除得自患者的样本之外的子样本，并对该子样本进行分子特征分析、组织学分析和组织化学分析中的至少一种。
项22.根据项1-21中任一项的方法，还包括生成包含基于步骤a)至e)而产生的信息、和/或包含有关于药物或药物组合对治疗指定赘生性疾病或肿瘤的患者特定的效果和/或疗效的信息的数据库的步骤。
项23.根据项22的方法，包括向数据库添加其他数据，其他数据选自i)关于组织样本的分子特征分析的数据，ii)组织样本的组织学分析结果，iii)组织样本的组织化学分析结果，iv)患者既往病史，v)有关患者的遗传学信息，和vi)患者的基因信息。
项24.一种针对使用患者特定的药物或药物组合的治疗而对患者分类的方法，包括执行项1-23中任一项的方法，还包括基于所识别的患者特定的药物或药物组合对患者分类。
项25.一种用于识别与在患者中用患者特定的药物或药物组合治疗相关的不利影响的方法，包括执行项1-23中任一项的方法，还包括测试和分析患者特定的药物或药物组合在患者中的不利影响的步骤。
项26.一种用于识别患者特定的，特别是个性化的，药物或药物组合的系统，其中该患者罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤，该系统包含a)分离得自患者的组织样本以获得分离细胞的组织样本分离单元，b)基于步骤a)的分离细胞制备3D微组织例如微肿瘤的阵列的单元，c)使该3D微组织的阵列与至少两种药物和/或其组合接触的药物测试单元，d)确定药物和/或其组合对3D微组织阵列的作用的第一分析单元，和e)基于所确定的作用来识别患者特定的药物或药物组合的第二分析单元。
项27.根据项26的系统，还包含用于选择所识别的患者特定的药物或药物组合的单元。
项28.根据项26或27的系统，其中该组织样本分离单元包含i)移液设备、ii)酶库、iii)细胞培养基库、iv)清洗液库、v)可选地，超声设备、以及vi)离心设备中的至少一个。
项29.根据项26-28中任一项的系统，其中基于分离细胞制备3D微组织例如微肿瘤的阵列的单元包含i)移液设备、ii)细胞计数设备、和iii)微量滴定板处理器中的至少一个。
项30.根据项26-30中任一项的系统，其中药物测试单元包含i)微量滴定板处理器、ii)移液设备、iii)细胞培养基库、iv)包含至少两种不同药物或其组合的库的阵列、和iv)孵育设备中的至少一个。
项31.根据项26-30中任一项的系统，其中第一和/或第二分析单元包含i)微量滴定板处理器、和/或ii)包含显微镜和相机、以及任选的HR扫描仪的成像系统、。
项32.根据项27-31中任一项的系统，其中选择所识别的患者特定的药物或药物组合的单元包含计算机数据库，该数据库包含患者数据以及药物和/或其组合对3D微组织阵列的作用的数据。
项33.根据项26-32中任一项的系统，其中组织样本分离单元和制备3D微组织阵列的单元共用移液设备。
项34.根据项26-33中任一项的系统，其中药物测试单元和第一分析单元共用微量滴定板处理器。
项35.根据项26-34中任一项的系统，其中其至少一个单元，优选其几乎所有单元，以自动化方式运行。
项36.根据项26-35中任一项的系统，其中组织样本分离单元、和制备3D微组织阵列的单元位于同一壳体中。
项37.根据项26-36中任一项的系统，其中药物测试单元和第一分析单元位于同一壳体内。
项38.根据项37的系统，其中两个壳体相连接，形成独立系统。
项39.根据项26-38中任一项的系统，其中系统可以作为整体、或分开部件进行灭菌。
项40.根据项26-39中任一项的系统，其中系统包含用于建立和/或保持灭菌条件的构件。
项41.根据项26-40中任一项的系统，其中该系统至少部分地垂直安装。
项42.根据项26-41中任一项的系统，其中该系统包含至少一个装载端口(1)，其包含具有锁系统(L)的装载系统，用于在系统中使用的材料或消耗品的无菌装载，和/或卸载系统中产生的废弃物和/或产物。
项43.根据项42的系统，其中装载端口(1)包含分开的装载(L1)和卸载(L2)锁系统。
项43.根据项42或43的系统，其中锁系统具有门、封盖、和/或开口，以打开和关闭安装在锁的各端(特别是在其各个相对端)的系统。
项44.根据项43的系统，其中该门、封盖、和/或开口用于往复地打开或关闭。
项45.根据项42-44中任一项的系统，其中锁系统还包含用于材料灭菌的构件，例如通过UV照射。
项46.根据项42-45中任一项的系统，其中锁系统还包含对于待装载或卸载材料进行解冻或冷却/冷冻的构件。
项47.根据项42-46中任一项的系统，其中锁系统配置为特定地与运送盒或容器相匹配。
项48.根据项47的系统，其中运送盒或容器包含至少一个在系统内部打开和关闭的口。
项49.根据项47或48的系统，其中运送盒或容器包含至少两个不同的分离的温度区，例如保持在-20℃、4℃或常温的区，其中可选地，运送盒或容器为隔热的。
项50.根据项47-49中任一项的系统，其中运送盒或容器包含至少两个不同的分离的个体隔间或合并的隔间，各个隔间构成独立的温度区。
项51.根据项42-50中任一项的系统，其中材料和/或产物选自微肿瘤、活体检测材料、消化酶、培养基、细胞、癌细胞、支持细胞、癌种类特异的维持培养基、药物、和预制的药物矩阵。
项52.一种装载系统，具有项42-51中任一项的锁系统、或根据项47-50中任一项的运送盒或容器。
项53.根据项26-51中任一项的系统、或根据项52的运送盒或容器在项1-25中任一项的方法中的用途，特别是用于在患者中测试免疫疗法对癌症的作用。
项54.一种治疗罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤的患者的方法，包括执行根据项1-25中任一项的方法，以及用所识别的患者特定的，特别是个性化的药物或药物组合治疗患者。
附图说明
图1示出根据本发明的方法的优选实施方式的大致流程。例如通过手术、空芯针穿刺活检、细针抽吸活检、空芯针穿刺活检、肿瘤切除、液体活检、和/或针吸活组织检查，从患者获得肿瘤组织样本(1)。组织样本仅通过酶降解或借助超声法进一步加工成单细胞溶液(2)。将得到的单细胞混悬液用于在非附着型多孔板(3)中制备微肿瘤。在成熟后，用目标药物对组织处理一段有限的时间，通过合适的非破坏性技术，随时间观察对微肿瘤生长的影响(4)。因为测试不破坏微肿瘤，可以在处理后的微肿瘤上进行其他测试，以证实药物的功效(4.1)。将应答于不同处理的患者特定的生长动力学转移至中央药物反应数据库(5)，以分析结果，并将它们置于更宽泛的患者背景中。在数据分析后，将测试结果(6)传输至各机构。
图2示出根据本发明的-无超声处理的实施方式-的优选微组织制备装置(系统)的排布。该系统由两个单元构成，即自动制备单元和药物特征分析单元。在一个实施方式中，微组织/微肿瘤制备装置由完全包含的(封装的)无菌环境(包括装载活组织检测切片的装载端口(1))以及用于自动化制备工序的消化酶(例如胶原蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I、中性蛋白酶(分散酶))、培养基和任选的支持细胞(免疫细胞、基质细胞、基质成纤维细胞、内皮细胞)构成。酶和培养基存储在4℃区(2)。液体用中心化自动液体操作系统(5)进行处理，例如(i)抽吸培养基或酶溶液、(ii)添加新鲜培养基、或(iii)添加其他支持细胞。除4℃区外，存在用于组织样本的酶消化的37℃区(6)。(9)指代消耗品例如多孔板和离心管所需的空间。为确定用于每孔所需细胞量的进程内计算的细胞数量，将细胞计数器整合到设备(4)中，其具有用于所需消耗品的存储空间(8)。将填充有细胞混悬液的多孔板放置到保持37℃和5-10％CO2环境的孵育器(3)中。将机械臂(7)设置在中心，以服务于装置内的所有操作单元。整个装置经数字界面(10)加以控制，以运行各个试验，并将生产数据传送到外部数据存储设备，以用于质量控制评估。计算机控制的装置使得可以基于所操作的组织类型来运行多种生产试验，并使得活细胞的数量最大化。在图2B中示例的是3个不同的可以在装置内进行的分离程序，(i)使用一种固定浓度的单酶(A)的多步骤按序孵育，在各个消化步骤后，将细胞混悬液转移至停止溶液，将新鲜酶加至组织样本；(ii)使用一种浓度递增的单酶的多步按序孵育；或(iii)应用多种酶。
图3示出与图2类似的根据本发明-带超声处理的实施方式-的优选微组织制备装置(系统)的排布。该系统由两个单元构成，即自动制备单元和药物特征分析单元。在一个实施方式中，微肿瘤制备装置由完全包含的(封装的)无菌环境(包括装载活组织检测切片的装载端口(1))以及用于自动化制备工序的消化酶(如上所述)、培养基和任选的支持细胞(如上所述)构成。酶和培养基存储在4℃区(2)。液体用中心化自动液体操作系统(5)进行处理，例如(i)抽吸培养基或酶溶液、(ii)添加新鲜培养基、或(iii)添加补充支持细胞(同样如上所述)。除4℃区外，存在用于组织样本的酶消化的37℃区(6)。37℃区还配置有进一步促进细胞分离过程(增加效率以及降低处理时间)的超声处理系统(11)。(9)指代消耗品例如多孔板和离心管所需的空间。为确定用于每孔所需细胞量的进程内计算的细胞数量，将细胞计数器整合到设备(4)中，其具有用于所需消耗品的存储空间(8)。将填充有细胞混悬液的多孔板放置到保持37℃和5-10％CO2环境的孵育器(3)中。将机械臂(7)设置在中心，以服务于装置内的所有操作单元。计算机控制的装置使得可以基于所操作的组织类型来运行多种生产程序，并使得活细胞的数量最大化。在图3B中示例的是3种不同的分离程序，可以使用具有超声处理系统的装置以及多种酶促策略进行处理。
图4示出根据本发明-带超声处理的实施方式-的另一优选微组织制备装置(系统)的排布。在该实施方式中，微组织药物特征分析单元由完全包含的(封装的)无菌环境(包括装载含有微肿瘤的微孔板的装载端口(1))以及癌种类特定的维持培养基、预制备的药物矩阵、以及可选的测试所需的其他细胞。药物、培养基和细胞存储在4℃区(2)。液体用中心化自动液体操作系统(5)进行处理，例如(i)将药物从基质转移至微肿瘤、(ii)移除药物、(iii)培养基更换、或(iv)添加补充细胞。将填充有细胞混悬液的多孔板放置到保持37℃和5-10％CO2环境的孵育器(3)中。检测设备(4)对微孔板进行成像，以生成处理特定的生长动力学。将机械臂(7)设置在中心，以服务于装置内的所有操作单元。将原始数据转移到中央数据库银行(7)，进行分析。
图5示出与药物特征分析单元相组合的根据本发明的微组织制备系统的排布。该装置由两个单元构成，即自动化制备单元和药物特征分析单元。在一个实施方式中，装置由完全包含的(封装的)无菌环境(包括装载活组织检测切片的装载端口(1))以及用于自动化制备和药物测试工序的消化酶(如上所述)、培养基、药物、和任选的支持细胞(如上所述)构成。酶、药物、和培养基存储在4℃区(2)。液体用中心化自动液体操作系统(5)进行处理，例如(i)抽吸培养基或酶溶液、(ii)添加新鲜培养基、(iii)药物添加和移除、或(iv)添加补充细胞。除4℃区外，存在用于组织样本的酶消化的37℃区(6)。(9)指代消耗品例如多孔板和离心管所需的空间。为确定用于每孔所需细胞量的进程内计算的细胞数量，将细胞计数器整合到设备(4)中，其具有用于所需消耗品的存储空间(8)。将填充有细胞混悬液的多孔板放置到保持37℃和5-10％CO2环境的孵育器(3)中。将机械臂(7)设置在中心，以服务于装置内的所有操作单元。整个装置经数字界面(10)控制，以运行各个程序，并将生产数据传送到外部数据存储设备，以用于质量控制评估和数据分析。
图6示出垂直安装的根据本发明优选实施方式的系统的排布。在一个实施方式中，各工作单元和阶段垂直排布，以使得装置所需的空间占用量降至最低。在该实施方式中，液体操作隔室可以设置在装置的顶部(1)，接下来为在中段(2)的检测隔室。孵育设备可以设置在装置的底部(3)。所有层级均用机械臂(4)操作。
图7示出根据本发明的用于测试化疗剂的示例性示意流程图。此处，自动测试化疗剂的流程基于肿瘤生长动力学。
图8示出用于用于检测免疫调节剂的示例性示意流程图。与图7类似，自动地测试免疫调节剂的示例流程图基于肿瘤生长动力学。
图9示出从4个NSCLC患者(#001至#004)和1个胰腺癌患者(PC#004)分离组织4天后的NSCLC微肿瘤形成图。每个患者示出3个代表性微组织。比例尺为250μm。
图10示出由非小细胞肺癌患者的原代肿瘤组织制备出的微肿瘤的制备稳定性和大小分布。将5000个细胞在非附着型96孔板的各孔中铺板，孵育4天(实施例2)。
图11示出单化合物对胰腺癌PDX微肿瘤12558的定量分析(Cmax)。由PDX来源的胰腺微肿瘤分析单药和药物组合的药物功效。在x轴上，比较各个处理组织在处理前和处理后的微肿瘤药物作用(t11/t0)，y轴上是比较经处理的与未处理的微肿瘤之间的药物作用(t11处理/t11对照)。有反应的药物与没有反应的药物之间的区别定义为，与未处理对照相比，具有至少20％的差异，以及在t11与t0之间有20％差异(体外RESIST)。根据体内Cmax值关注所有药物。
图12示出3D3装置效用结果反映出体内疗效。为比较体外效用分析是否与获得的体内(小鼠)疗效药物反应数据相匹配，制备出得自胰腺癌患者的异种移植物(PDX-小鼠模型)和得自PDX肿瘤组织的胰腺微肿瘤。测试两种单药(吉西他滨和
Figure BDA0003721805720000171
)以及两种药物组合(吉西他滨：厄洛替尼、以及吉西他滨：
Figure BDA0003721805720000172
)。体内数据点反映出5个动物个体的平均反应。在两个装置模型中，吉西他滨具有最高的疗效，以及其他三种处理表现出类似的效率状况。
图13示出所测试的协同组合效用(1/2Cmax)的评估。基于IC50值对药物组合进行的评估是复杂的程序(Wilson et al.，SLAS Techn.2019)。测试至少6×6药物测试矩阵(通常为10×10)，至少三组重复，以生成IC50矩阵。进一步通过Chou Talalay法(TC Chou-Cancerresearch，2010-AACR)确定潜在的协同效应。体外长期疗效测试使得可以直接评估两种药物组合是否显示出更高的疗效，如奥拉帕尼(PARP抑制剂)和曲美替尼(MEK抑制剂)(A)所示出的。根据文献，显示出两种药物在KRAS突变癌中具有协同效应(Sun et al，2018 SciTransl Med)并对得自PDX组织的KRAS突变胰腺微肿瘤表现出协同效应。针对奥沙利铂和5FU，示出阴性样本(B)，其没有显示出任何协同疗效。
图14示出，筛选技术可以跨越不同药物开发阶段，即(i)药物研发、(ii)临床前、(iii)药物开发/临床，生成一致的数据。在该图中，以胰腺癌为示例。使用不同细胞来源的微肿瘤，即(i)胰腺癌细胞系(研发)；(ii)PDX来源(临床前)和患者来源(临床)，分别用顺铂和奥沙利铂处理。PDX和患者来源的微肿瘤的生长在相似的范围内，Panc-1微肿瘤大小翻倍。
图15示出根据本发明的锁系统的无菌开口的实施方式。
图16示出涉及本发明锁系统、以及本发明密封的流程图的实例。
具体实施方式
实施例
本发明的某些方面和实施方式将通过示例的方式，参考说明书、本文列出的附图和表格，而进行说明。本发明的方法、用途和其他方面的实施例仅是代表性的，不应当用来将本发明的范围限制到这些代表性的实施例。
实施例1
组织制备和测试
将从患者处获得的活检组织样本放置到合适的介质中，即含有抗生素的转移液中。任选地，可以添加低渗溶液，以进一步加工。活检组织样本材料于约4℃运输。对于100mg活检组织样本，使用体积1.5ml的含有组织样本的转移介质。
在步骤2中，对于裂解血红细胞的溶血，使用商用超声处理仪，以约1MHz、2Wcm-2对组织样本超声处理5min。小心处理，防止组织样本变热，以大体上保持细胞的完整性，温度保持在约4℃。使用超声处理的溶血步骤持续约5分钟，并靶向未嵌入组织环境中的细胞。
超声处理后，移除介质，取代以组织分离介质(步骤3)。对于此，使用在合适的缓冲体系中的一种或多种合适的裂解酶，进行多个循环，例如4个循环，各循环约10-15分钟。在组织消化的工序中，可以调整循环的次数和时长，例如首先使用很强的以及之后极其温和的条件。组织分离以约1ml的体积，于约37℃的温度，进行约60分钟。
之后，向裂解液中加入包含马血清和溶解的胶原蛋白的停止(STOP)液(6ml)，以终止酶活性。该反应混合物的最终体积为10ml，溶液保持在4℃。清洗获得的细胞，在2×5ml制备培养基(DMEM+10％FCS)中通过10分钟的重力驱使的细胞沉降，来移除细胞碎片。尽管细胞碎片浮在溶液中，细胞沉降到管的底部。之后，通过使5ml包含细胞的溶液通过200μm孔径过滤器进行过滤，并添加5ml制备培养基，移除大的组织碎片。整个步骤进行约10分钟。
将如此获得的细胞转移到微孔板，例如预装载有制备培养基的384孔板，之后于约37℃的温度孵育。在多孔板的各孔中，将25μl包含肿瘤细胞的细胞混悬液加至之前填充至多孔板腔室的50μl制备培养基中。此外，向各孔加入25μl包含支持细胞的溶液。根据本发明，该方法的预计操作时间为约2-3小时。
根据第一个选项，将由此得到的板直接转移至所谓的特征分析装置(单元)，以进行组织成熟(微组织生成)。这样做的优点是，技术配置不会在创建单元和特征分析单元之间重复。但是，这会使特征分析单元的快速药物测试延迟，因为需要成熟2-5天，空间被板占用。
在第二个选项中，在所谓的创建单元中进行单独的组织成熟。这需要额外的孵育器和成像能力，但不会影响特征分析单元的产量，其可以用于测试其他组织。
对于在药物或药物组合存在下所培养细胞的表征(特征分析)(在板装载后第一天的流程：药物施用)，计算为约50分钟，在步骤1中(如果不在该装置中成熟的话)，在384孔板中预装载成熟的微组织。
在步骤2中，使用自动化的机械设备，例如KUKA LBR中轻量机器，将板移至孵育器。
在步骤3中，将板放置在孵育器中，之后将板移至成像单元(步骤4)，以及(步骤5)，384孔板在读板器(例如QC成像仪)中成像分析10分钟。
之后在步骤6中，将板移至液体操作单元/站，以及在步骤7中，更换介质，使得接触/施用化合物/组合。介质更换持续约10分钟，每384孔板需要约30mL。
在步骤8中，将板再次移至成像系统，且在步骤9中，将板在384孔板HD成像系统中成像30分钟。
最后，在步骤10中，将板移回孵育单元，且微组织细胞与药物或组合孵育(在该例子中)8小时。
在板装载后的第一天，在持续约60分钟的过程中移除药物。在步骤11中，在微组织的药物孵育8小时后，将板从孵育单元中移出。在步骤12中，将板移至成像仪(组织形成时为QC)。在步骤13中，使384孔板进行HD成像30分钟。之后，在步骤14中，将板移至液体操作站。在步骤15中，在约20分钟的时间段内，介质更换两次，并再次施用所研究的化合物或组合，并填充至384孔板。在该步骤中总共需要60mL介质加化合物。
在步骤16中，将板移至成像系统，并在步骤17中进行QC成像10分钟。之后，在步骤18中，将板再次移至孵育单元(步骤19)，并在下一个循环开始前孵育24小时。
在确定步骤的第二天，对微组织进行尺寸特征分析，持续约35分钟。在步骤1中，将板从孵育单元移出，并在步骤2中移至成像单元，在该单元处，在步骤3中，进行30分钟HD成像。之后，在步骤4中，将板移回并在之后移入孵育单元中(步骤5)。
作为光学读数选项，尺寸可以作为主要读数，且可以将多个参数选为次要选项，例如至少一个选自直径、周长、体积和光学截面面积的参数。
实施例2
制备得自NSCLC患者的微肿瘤(PMT)的方法
通过移除脂肪组织，来预制备肿瘤组织样本。目标组织大小为约0.2-0.4cm3。关于运输，将肿瘤组织放置在含有转移介质(例如，补充有合适抗生素的DMEM培养基)的管中。在进一步使用前，用补充有合适抗生素的磷酸缓盐缓冲生理盐水(PBS)冲洗肿瘤3次。在除去PBS后，添加溶解于DMEM的胶原酶(0.04-0.08mg/ml)，并于37℃孵育15min。将酶上清液转移至预填充有STOP液(DMEM+40％FCS)的管中。之后，添加酶溶液(胶原酶)，重复孵育和转移。弃去剩余的组织样本，仅使用在STOP液中的细胞。将其移至200μm细胞过滤器中，以移除较大的未分离的组织碎片。在细胞于过滤器中沉降5min后，小心地除去上清液，添加生产培养基(DMEM+10％FCS)。之后，使用显微镜对细胞进行肉眼计数。
对于微肿瘤的制备，将细胞混悬液稀释至每ml 6×104细胞的终浓度，并对非附着型96或384孔板添加75μl(即，约4500个细胞)。之后对板进行孵育，以形成组织，优选2-5天。三个独立的生产运行，得到一致的平均260μm的尺寸，成功率高于90％(图10)。
实施例3
比较例-制备时间
得自患者的类器官vs.得自患者的微肿瘤制备
提供将要包含在决策中的有关于疗效的信息的技术，在常规临床应用中的重要参数是，能够得到信息的时间。患者自己的微肿瘤(PMT)，可以无需中间的细胞培养步骤而制备出来，且可以在取得肿瘤样本后4天内用于药物测试(参见图9)。
与根据本发明而制备的患者自己微肿瘤相对的，类器官需要中间细胞培养过程，例如LGRF5+肿瘤干细胞的扩张，在进入药物测试前从健康组织中移除LGRF5+干细胞。根据最近的公开发表物，制备出足够量的类器官所需的时间可以从最高3个月减少到1个月。然而，还是要显著长于制备PMT所需的时间。另一个问题是，测试类器官是否可用的时间，差异非常大，使得难以将该过程整合到常规的标准化的自动测试过程中。
实施例4
操作实施例-临床前胰腺癌
通常基于使用来自细胞系或患者肿瘤样本的癌细胞的剂量反应曲线来计算IC50(当50％细胞死亡时的浓度)和/或Emax(达到最大细胞死亡的最低浓度)值，从而进行在药物研发、开发和功能性精准医疗中的抗癌药物测试。IC50提供药物效力如何的信息，Emax表示药物效力如何。需要建立这些参数，使得可以进行高通量筛选以及选择进一步测试和开发的候选物。然而，无法在体内(临床前和临床时)测得这两个参数，使得体外-体内的直接关联高度复杂(Chantal Pauli et al.Cancer Discov.2017)。此处呈现的根据本发明的方法，基于相同的临床前和临床疗效判断，使得可以直接关联，并进行药物疗效评分。对于临床前关联，将药物的疗效与经过处理的微肿瘤的t0以及未处理的对照进行比较。对于临床关联，基于处理前和处理后的肿瘤大小变化来比较药物疗效。癌细胞增长动力学对药物敏感度具有巨大影响(Maurice Tubiana，Acta Oncologica 1989；Benjamin Drewinko etal.，Cancer Res June 1981)。所呈现出的延长的测试期(14天)将增殖效果考虑在内，比标准药物筛选模式(1-3天)长得多。
施行临床前研究，以(i)根据体外效率对药物评分(图11)，回溯性地比较体外与体内检测之间的药物效率(图12)，进行药物组合测试(图13)，并跨越整个药物研发和开发过程比较数据(图14)。
直接从切除自小鼠的新鲜的肿瘤患者来源的异种移植物制备微肿瘤。将组织分离成单细胞，并在非附着型圆底多孔板中制备微肿瘤。在7天后，用单药和多种药物组合处理微肿瘤。在11天中，持续地监控并分析肿瘤生长动力学。
一个特别有意思的分析结果是，吉西他滨显示出最高的疗效，而奥沙利铂疗效最低(图11)。在这两种药物之间，其他单药和组合处理相应地排序。

Claims (20)

1.一种用于识别患者特定的、特别是个性化的药物或药物组合的方法，该方法优选是自动化的，其中患者罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤，该方法包括
a)分离得自患者组织样本的细胞，以获得分离细胞，
b)基于步骤a)的分离细胞，生成3D微组织例如微肿瘤的阵列，
c)使该3D微组织的阵列与至少两种药物和/或其组合接触，
d)确定该药物和/或其组合对该3D微组织的阵列的作用，以及
e)基于所确定的作用，识别出患者特定的药物或药物组合，任选地，还包括选择所识别出的患者特定的药物或药物组合的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中分离组织样本包括
i)若需要的话，将组织样本分成更小的包含细胞的块，
ii)用包含至少一种能够分离组织样本中细胞的酶的溶液处理该组织样本，优选地，至少一种酶选自蛋白酶、胶原蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I、和中性蛋白酶(分散酶)，制备出包含分离细胞的上清液，以及
ii)移除包含该分离细胞的上清液，适当地回收细胞，
其中步骤(ii)和(iii)重复至少一次，其中优选地，在步骤(ii)之前，用超声对组织样本进行超声处理，其中该超声的能量设置为不破坏大量细胞的适当水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)包括向分离细胞添加或从分离细胞移除基质细胞、基质成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞，和/或其中在步骤b)中，对各个3D微组织提供预定量的细胞，例如，500-10000个活细胞，和/或其中在步骤b)中，在选自悬滴系统、和b)多孔系统的至少一种系统中制备该3D微组织，优选地，多孔系统包含超低附着(ULA)孔。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该3D微组织的制备不需要使用溶解的基底膜制品，例如
Figure FDA0003721805710000011
和/或其中该3D微组织的制备包括包含在该分离细胞中的细胞的自组装，和/或其中该3D微组织的制备包括约6小时-7天的成熟时间，优选为约1-6天，更优选约2-5天，和/或其中所制备的3D微组织具有350μm+/-100μm的大小。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤c)中的接触，包括持续暴露于至少两种药物和/或其组合，和/或暴露于至少两种药物和/或其组合并在之后移除。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤d)中作用的确定选自该3D微组织的大小确定、该3D微组织中内部报告基因表达的定量、该3D微组织中胞内ATP含量的确定、以及该3D微组织中预选定的生物标记物的确定，其中优选地，该3D微组织的大小确定包括选自直径、周长、体积、和光学截面面积中的至少一个参数，且其中优选地，该3D微组织的大小确定包括光学设备的使用，任选地还包括生长动力学的分析。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中得自患者的组织样本选自得自原代组织样本、原发肿瘤样本、和转移瘤样本的子样本，其中优选地该组织样本通过包括空芯针穿刺活检、肿瘤切除、液体活检、和/或针吸活组织检查的方法获得，和/或其中该组织样本和/或该分离细胞是冷冻的，并在制备3D微组织前解冻。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，包括提供原代组织样本，获得除得自患者的样本之外的子样本，并对该子样本进行分子特征分析、组织学分析和组织化学分析中的至少一种。
9.一种针对使用患者特定的药物或药物组合治疗而对患者分类的方法，包括施行权利要求1-8中任一项所述的方法，还包括基于所识别的患者特定的药物或药物组合，对患者分类。
10.一种用于识别与在患者中使用患者特定的药物或药物组合进行治疗相关的不利影响的方法，包括施行权利要求1-8中任一项所述的方法，还包括测试和分析患者特定的药物或药物组合在该患者中的不利影响的步骤。
11.一种用于识别患者特定的、特别是个性化的药物或药物组合的系统，其中该患者罹患或确诊为赘生性疾病或肿瘤，该系统包含
a)分离得自患者的组织样本以获得分离细胞的组织样本分离单元，
b)基于步骤a)的分离细胞制备3D微组织例如微肿瘤的阵列的单元，
c)使该3D微组织的阵列与至少两种药物和/或其组合接触的药物测试单元，
d)确定该药物和/或其组合对该3D微组织的阵列的作用的第一分析单元，以及
e)基于所确定的作用来识别患者特定的药物或药物组合的第二分析单元，以及可选地，还包含选择所识别的患者认定的药物或药物组合的单元。
12.根据权利要求11所述的系统，其中该组织样本分离单元包含i)移液设备、ii)酶库、iii)细胞培养基库、iv)清洗液库、v)可选的超声设备、以及vi)离心设备中的至少一个，和/或其中基于分离细胞制备3D微组织例如微肿瘤的阵列的单元包含i)移液设备、ii)细胞计数设备、和iii)微量滴定板处理器中的至少一个，和/或其中药物测试单元包含i)微量滴定板处理器、ii)移液设备、iii)细胞培养基库、iv)包含至少两种不同药物或其组合的库的阵列、和iv)孵育设备中的至少一个，和/或其中该第一和/或第二分析单元包含i)微量滴定板处理器、和/或ii)包含显微镜和相机、以及任选的HR扫描仪的成像系统。
13.根据权利要求11或12所述的系统，其中组织样本分离单元和制备3D微组织的阵列的单元共用同一移液设备，和/或其中药物测试单元和第一分析单元共同同一微量滴定板处理器。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的系统，其中组织样本分离单元、和制备3D微组织的阵列的单元位于同一壳体中，和/或其中药物测试单元和第一分析单元位于同一壳体内，优选地，其中两个壳体相连接，形成独立系统，和/或其中该系统至少部分垂直地安装。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的系统，其中该系统可以作为整体、或以其分开部件进行灭菌，和/或该系统包含用于建立和/或保持灭菌条件的构件。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的系统，其中该系统包含至少一个装载端口(1)，其包含具有锁系统(L)的装载系统，用于在系统中使用的材料或消耗品的无菌装载，和/或卸载系统中产生的废弃物和/或产物。
17.根据权利要求16所述的系统，其中该锁系统还包含用于材料灭菌的构件，例如通过UV，和/或其中该锁系统还包含用于解冻或冷却/冷冻待装载或卸载的材料的构件。
18.根据权利要求16或17所述的系统，其中该锁系统配置成特定地与运送盒或容器相匹配，其中优选地，该运送盒或容器包含至少一个在系统内部打开和关闭的口。
19.根据权利要求18所述的系统，其中该运送盒或容器包含至少两个不同的分开的温度区，例如保持在-20℃、4℃或常温的区，其中可选地，该运送盒或容器为隔热的。
20.一种装载系统，其具有权利要求16-18中任一项所述的锁系统、或权利要求18或19所述的运送盒或容器。
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