ES2223814T3 - Dispositivo de analisis y/o de tratamiento con un vastago flexible. - Google Patents
Dispositivo de analisis y/o de tratamiento con un vastago flexible.Info
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Abstract
Un dispositivo para el análisis y/o el tratamiento in situ en el cual un sistema de investigación y/o de tratamiento se desliza en un instrumento médico, caracterizado porque comprende: (i) un microsistema de investigación de un sustrato distinto que por análisis de una señal fluorescente, y/o de liberación de agentes activos a nivel de un sustrato, (ii) un vástago flexible en un extremo del cual se fija el microsistema y cuyo otro extremo se destina a la maniobra sobre dicho microsistema, (iii) un instrumento médico que posee una luz interna en la cual se desliza dicho vástago flexible, (iv) un sistema de protección del microsistema amovible a nivel del sustrato, y (v) a nivel de dicho microsistema, un sistema de dilaceración de tejidos o células.
Description
Dispositivo de análisis y/o de tratamiento con un
vástago flexible.
La presente invención se refiere a un dispositivo
que permite realizar a distancia una investigación y/o un
tratamiento in situ a nivel de un sustrato por ejemplo de
tejidos u órganos, constituido por un vástago flexible en un extremo
del cual se fija un microsistema de investigación y/o de
tratamiento.
Se describen en el estado de la técnica anterior
microsistemas de investigación que emplean una disposición de
moléculas biológicas dispuestas en posiciones determinadas de una
superficie. Estos sistemas conocidos bajo la denominación
"biopastillas" o pastillas de ADN son útiles para la
investigación de secuencias polinucleotídicas o aminoácidas. Se
describen algunos ejemplos de dichos sistemas por ejemplo en las
solicitudes de patentes europeas publicadas bajo los nº 619321, nº
373203 y nº 691978. Otros microsistemas de investigación son por
ejemplo los ensayos de microanálisis que emplean reacciones del
tipo ligando/receptor o microinmunoanálisis que emplea reacciones
del tipo antígeno/anticuerpo.
Se conocen también en el estado de la técnica
anterior dispositivos de investigación in vivo de los órganos
o tejidos del tipo de un catéter constituido de un tubo flexible
insertado en los vasos o por las vías naturales, asociados por
ejemplo a un láser, una fibra óptica, una sonda o un captador.
Igualmente, estos dispositivos pueden permitir la administración de
sustancias activas tal como medicamentos o agentes de diagnóstico,
tal como, por ejemplo, el dispositivo descrito en la patente
americana nº US-5.938.595.
Este documento se refiere a un dispositivo de
análisis y de tratamiento que comprende una fibra óptica uno de
cuyos extremos se cubre de un envolvente que comprende anticuerpos
marcados con una molécula fluorescente. En el caso en que este
dispositivo se utilice con fines de tratamiento (por ejemplo de
enfermedades vasculares), dicha fibra óptica se integra en un
catéter que se lleva a través del sistema vascular hasta el sitio de
oclusión y se puedan liberar algunos agentes trombolíticos
directamente en el coágulo. Este sistema puede asociarse a otro
dispositivo de tratamiento, como láser, utilizado para destruir
mejor el coágulo.
La patente americana nº
US-5.837.196 describe un biocaptador constituido por
fibras ópticas que se puede eventualmente utilizar in situ en
el hombre y en el animal con fines de detección de una multitud de
analitos. Este documento describe un método de fijación de una
sustancia biológica a una superficie sólida por medio de una matriz
polimérica. Así pues, este biocaptador se prepara por fijación al
extremo de cada una de las fibras ópticas del haz una sustancia
biológica que permitirá la detección de los analitos dianas.
Los inventores ahora han concebido un dispositivo
de análisis y/o de tratamiento in situ que se puede maniobrar
a distancia que asocia las dos tecnologías descritas más arriba.
Parece en efecto útil disponer de nuevos medios de investigación y/o
de tratamiento in situ a nivel de un sustrato de un organismo
in vivo o in vitro lo menos traumático posible
especialmente en el caso de un paciente humano y que permite acceder
(i) a información útil en cuanto a materia diagnóstico tal como de
escrutinio por ejemplo para indicaciones terapéuticas, o (ii) a
nuevos modos de administración de agentes activos drogas,
directamente a nivel de un sustrato constituido por ejemplo de
células dianas.
Este objetivo se alcanza según la presente
invención gracias a un dispositivo para el análisis y/o el
tratamiento in situ en el cual un sistema de investigación
y/o de tratamiento corredera en un instrumento médico, caracterizado
porque comprende (i) un microsistema de investigación de un sustrato
distinto que por análisis de una señal fluorescente, y/o de
liberación de agentes activos a nivel de un sustrato, (ii) un
vástago flexible en un extremo del cual se fija el microsistema y
cuyo otro extremo se destina a maniobrar dicho microsistema, (iii)
un instrumento médico que posee una luz interna en la cual dicho
vástago flexible puede deslizar, (iv) un sistema de protección del
microsistema amovible a nivel del sustrato, y (v) a nivel de dicho
microsistema, un sistema de dilaceración de tejido o de célula.
Ventajosamente, dicho microsistema y dicho
vástago flexible se mantienen solidarios in situ. Así pues,
según la invención, dicho microsistema y dicho vástago flexible
permanecen conectados uno con el otro durante su utilización in
situ y no se separan más que antes o después de la intervención
in situ de modo que el microsistema no constituya un sistema
que se puede implantar o alargar in situ.
En una primera forma de realización, el
microsistema es del tipo que comprende un soporte en la superficie
del cual se realizan regiones predefinidas que contienen cada una
distintas sustancias químicas o biológicas de investigación o de
tratamiento del sustrato al contacto del cual se pone el
microsistema gracias al vástago flexible. Dicha superficie comprende
al menos dos, preferentemente más de 100 y muy preferentemente más
de 1000 regiones predefinidas sobre una superficie del orden de
algunos cm^{2} preferentemente del orden de 1 cm^{2} o menos.
Cada zona predefinida incluye una sustancia química o biológica
diferente, pero el procedimiento según la invención admite
igualmente que varios o incluso que todas las dichas regiones
predefinidas incluyan la misma sustancia química o biológica por
ejemplo en el caso del mismo análisis o la liberación de la misma
sustancia activa en el tiempo.
El soporte puede incluir varias caras una de las
cuales al menos está constituida por una superficie activa. Ésta es
la base de uno o varios agentes de unión biológicos. En medio de
dicha superficie activa se realizan las regiones predefinidas.
Esta superficie del orden de un cm^{2} puede
ser plana y se sitúa en un único plano, también se puede conformar
en banda y enrollarse en espiral alrededor de un soporte rígido que
prolonga el vástago flexible y que presenta entonces el microsistema
de la misma naturaleza que el precedente, pero de conformación más
elaborada. La figura 1 representa un ejemplo de realización de un
dispositivo según la invención constituido de un vástago flexible
(1), tal como, por ejemplo, un catéter deformable, al extremo del
cual se inserta, en la luz del vástago flexible el microsistema (2)
constituido de un soporte (3) sobre el cual se enrolla una banda (4)
o se fijan anticuerpos específicos de un antígeno presente a nivel
del sustrato analizado. El soporte (3) es rígido mientras que el
vástago flexible (1) es relativamente deformable. El vástago
flexible (1) se puede asociar a un sistema de exploración
endovascular (5) como, por ejemplo, a un endoscopio.
El dispositivo de la invención se puede asociar a
un sistema de exploración endocavitaria o endovascular que permite
llevar el microsistema a ponerse en contacto o estar próximo al
sustrato diana.
En una segunda forma de realización, el
dispositivo de la invención se puede componer de un vástago
flexible, eventualmente asociado a un sistema de exploración
endocavitaria o endovascular. Éste se termina por un microsistema
constituido de un segmento articulado compuesto de una alternancia
de sustancias rígidas (tipo bolas de platino) y de gel más o menos
hidrófilo (hidrogel) sobre el cual se fijan los grupos, moléculas o
sustancias reactivas. La capa activa que rodea el soporte rígido
puede ser una banda plana o una cuerda redonda sobre los cuales se
depositan y se fijan los reactivos. Se puede tratar de ligandos, y
en particular, de antígenos o de anticuerpos, pero también de
nucleótidos. Así pues, en este modo de realización, el microsistema
está constituido por un soporte que se presenta en forma de una
banda enrollada alrededor de un extremo del vástago flexible. Un
ejemplo de esta forma de realización está representado en la figura
1 de los dibujos adjuntos.
Tal como se indica anteriormente, cada zona
predefinida puede incluir la misma sustancia activa química o
biológica, por ejemplo en el caso del mismo análisis o de la
liberación de la misma sustancia activa reproducidos con el tiempo.
Cada zona predefinida puede también incluir una sustancia química o
biológica diferente, y el microsistema que soporta entonces una
pluralidad de sustancias químicas o biológicas diferentes está
destinado a efectuar un análisis múltiple.
El dispositivo según la invención es útil en:
- -
- el ámbito terapéutico, para liberar in situ agentes activos a nivel de un sustrato, y
- -
- el ámbito del diagnóstico para el análisis in situ de un sustrato.
En particular, el dispositivo de la invención es
útil para aplicaciones terapéuticas, realizadas en el marco de la
terapia guiada, tal como se propone para la terapia génica
intracardiaca destinada a llevar in situ células automiodes
después de haber evaluado a partir de la sonda endocavitaria el
estado de los tejidos celulares de la zona miocárdica que se debe
tratar. Esto con la ayuda de distintos sistemas y más
particularmente microsistemas de diagnóstico o de seguimiento
terapéutico de la invención.
En el marco terapéutico de las aplicaciones, las
sustancias biológicas y o químicas dispuestas a nivel de cada región
predefinida de la superficie del microsistema son agentes activos,
en particular, sustancias terapéuticas. Los agentes activos pueden
ser cualquier sustancia útil en el tratamiento de las enfermedades
que requieren una intervención a nivel de células o tejidos dianas,
tal como células cancerosas, focos infecciosos, etc.
En el marco de las aplicaciones diagnósticas, las
sustancias biológicas y o químicas dispuestas a nivel de cada región
predefinida de la superficie del microsistema son sustancias que
permiten detectar analitos específicos del sustrato donde se lleva
el microsistema, o también sustancias radiomarcadas que permiten la
visualización a distancia del órgano específico, por cualquier
técnica conocida de imágenes médicas.
Dichas sustancias se pueden fijar, en cada región
predefinida del soporte bien sea de manera reversible, para
eventualmente ser liberadas por el microsistema para que ejerzan su
función in vivo, después de la retirada de dicho
microsistema, o bien de manera irreversible, a dicha superficie. La
fijación se puede realizar por simple adsorción o por medio de un
producto de acoplamiento.
Se liberan los agentes activos a nivel del
sustrato:
- -
- por simple contacto con éste, en cuyo caso, se protegen físicamente tal como se describe más adelante, hasta que el microsistema esté colocado a nivel de dicho sustrato, o
- -
- gracias a un sistema complementario de liberación en el microsistema.
Una forma de empleo preferida de la aplicación
terapéutica del dispositivo de la invención consiste en utilizar
sustancias activas que son ácidos nucleicos, tal como ADN desnudos,
oligonucleótidos antisentido, fijados en la superficie del soporte
del microsistema por hibridación. Pero las sustancias activas pueden
ser también proteínas o anticuerpos fijados en cada región
predefinida gracias a una unión inmunológica. Como ejemplo de un
microsistema que forma parte de la constitución de un dispositivo de
tratamiento según la invención, se pueden citar las pastillas
biónicas que controlan eléctricamente la actividad de las células de
tal modo que liberen agentes terapéuticamente activos.
Para las aplicaciones de diagnóstico y más
ampliamente de análisis de un sustrato, el microsistema del
dispositivo de la invención es un microsistema de investigación.
Según una forma de realización muy preferida del
dispositivo según la invención, las sustancias químicas o biológicas
son capaces de reaccionar con sustancias correspondientes
eventualmente presentes a nivel del sustrato donde se lleva el
microsistema de investigación gracias al vástago flexible.
Así pues, el microsistema es preferentemente un
microsistema receptor/ligando que emplea pares de sustancias
químicas o biológicas uno u otro de los cuales o, en particular,
para aplicaciones terapéuticas, se fijan los dos miembros del par
sobre cada región predefinida.
Ventajosamente, el microsistema según la
invención emplea sustancias biológicas que son secuencias
polinucleotídicas o aminoácidos. La invención prevé como sustancias
químicas o biológicas presentes en cada región predefinida,
sustancias químicas o biológicas que constituyen:
- -
- una disposición de secuencias polinucleotídica capaz de hibridarse con ácidos nucleicos presentes a nivel del sustrato que constituye, en particular, el sitio de investigación, o
- -
- una disposición de péptidos, polipéptidos o proteínas capaces de reaccionar con un receptor correspondiente o inmunológicamente con anticuerpos o antígenos presentes en el sustrato que constituye, en particular, el sitio de investigación.
Pero, el microsistema de investigación puede
también emplear sustancias químicas capaces de reaccionar según
reacciones químicas variadas con sustancias químicas
correspondientes presentes a nivel del sustrato analizado. Así pues,
el microsistema de investigación según la invención permite el
análisis simultáneo de varios factores fisiológicos in
situ.
Habida cuenta de la diversidad de los tipos de
reacciones biológicas o químicas susceptibles de ser empleadas en el
microsistema de investigación, el dispositivo de la invención
permite la identificación de genes o sus componentes de ADN, de ARN,
de secuencias nucleotídicas pertinentes o de sus productos proteicos
específicos, pero también de agonistas y sus receptores. Permite
igualmente in vitro e in vivo la identificación de
virus, de bacterias, de parásitos o de sus componentes específicos,
así como de los agentes patógenos de tipo prión.
El dispositivo de la invención se puede así
utilizar:
- -
- con fines de análisis de los distintos tipos de genomas y, en particular, a su secuenciado,
- -
- para la identificación de células, de tejidos y de órganos o de distintos tipos de receptores específicos normales o patológicos,
- -
- con fines de diagnóstico, tal como, por ejemplo, gracias a la identificación de genes, de su componente o de su producto,
- -
- con fines de escrutinio de moléculas o de sustancias químicas o biológicas de características terapéuticas conocidas o potenciales,
- -
- para el seguimiento de la actividad de nuevos agentes terapéuticos o ya conocidos (posibilidad de exámenes orientados escalonados y repetidos).
La lista anteriormente descrita no es exhaustiva
y el experto en la técnica es capaz con la ayuda de las presentes
indicaciones de extender el empleo del dispositivo de la invención a
cualquier otro tipo de análisis, tal como los que hacen intervenir
la unión antígeno-anticuerpo o los sistemas ligando
en la medida en que al menos para parte de las uniones que
intervienen in vivo son detectables con la ayuda de los
microsistemas descritos, aunque se realizan uniones suplementarias
posteriormente para la revelación ex vivo o in vitro
de una reacción que se produce in vivo e in
situ.
El dispositivo de la invención ofrece muy
especialmente una mejora significativa de los métodos de
diagnóstico, de indicación terapéutica, de tratamiento y de
seguimiento terapéutico así como de escrutinio de los medicamentos
que son resultantes del genómico y del proteinómico (o
proteómico).
El dispositivo de la invención es destacable
porque no es invasivo o microinvasivo no destructivo y que permite
la identificación a distancia de cualquiera de las sustancias
químicas o biológicas capaces de reaccionar más o menos
específicamente con las sustancias activas fijadas sobre el
microsistema de investigación. Se puede tratar, en particular, de
moléculas o de sustancias presentes exclusivamente in situ en
el órgano, en el tejido, o a nivel de las células (fusión
intracelular). Esta presencia exclusiva está unida al hecho de que
estas moléculas o sustancias se metabolizan rápidamente fuera del
tejido estudiado en cuanto salgan de su medio ambiente local. Esto
da cuenta del interés de operar in situ con la ayuda del
microsistema descrito.
Por lo tanto, se adapta a un análisis o a un
tratamiento:
- -
- in vitro: sobre cultivos de células, de tejidos u de órganos naturales o modificados procedente genéticamente de extracciones efectuadas sobre seres vivos.
- -
- in vivo: en condiciones invasivas o microinvasivas. Permite el guiado, la orientación y el posicionamiento del microsistema destinado, en particular, a la hibridación molecular in situ a nivel de células, de tejidos u de órganos dianas.
El dispositivo de la invención es por otro lado
especialmente notable ya que permite alcanzar, para el análisis o el
tratamiento, lugares no accesibles o difícilmente accesibles por las
técnicas convencionales.
El vástago flexible permite llevar y luego
posicionar el microsistema al ponerse en contacto con el sustrato
que se debe analizar, ya se trate de un material biológico vivo o
que tuvo vida (fresco, fijado, congelado, momificado o fosilizado),
constituido de células idénticas o comparables, de mono tejidos o
pluricelulares, de órganos, directamente o después de la
microafectación del mesotelio o del epitelio de recubrimiento y de
la cápsula conjuntiva ya sea como de los endotelios vasculares en
caso de exploración endovascular. El vástago flexible garantiza la
solidez y la cohesión del dispositivo y garantiza su flexibilidad y
la transmisibilidad de los movimientos impresos a distancia
manualmente o de manera robotizada. Por supuesto el dispositivo debe
ser biocompatible y ventajosamente estéril, por lo menos en su parte
terminal puesta en contacto con el sustrato que se debe tratar o
analizar.
Por lo tanto, el dispositivo de la invención
comprende, además del microsistema donde se realizan las reacciones
químicas biológicas, un vástago que permite el control manual o
robotizado del dispositivo.
El vástago flexible de maniobra del dispositivo
permite garantizar al menos las dos siguientes funciones:
- -
- el guiado del microsistema hasta el nivel del sustrato analizado o tratado.
- -
- la orientación y el posicionamiento del microsistema a nivel del sustrato analizado o tratado, incluido el cebado en un catéter flexible que se guiará él mismo al principio por un sistema de exploración endocavitaria
- o endovascular. En algunos casos el microsistema se puede cebar directamente en el extremo hueco del sistema de exploración endocavitaria o endovascular.
El vástago flexible se concibe ventajosamente
para cooperar con distintos instrumentos médicos utilizados con
fines diagnósticos, terapéuticos o experimentales, se trata de
dispositivos:
- -
- no invasivos, destinados a la exploración de cavidades naturales puestos en contacto con el medio exterior, tal como instrumentos de exploración ORL, broncopulmonar, digestiva, urológica o ginecológica;
- -
- microinvasivos, en vista de la exploración de las cavidades naturales sin contacto directo con el medio exterior, se trata entonces de los instrumentos utilizados en artroscopia, colonoscopia, etc, o de sistema de exploración endovascular, o también de útil de biopsia de tejidos o de órganos superficiales, en particular, por vía transcutánea, como sistemas de afectación parenquimatosa, tales como agujas, puntas aceradas, dispositivos cortantes, etc.
El vástago flexible se asocia así a uno de estos
instrumentos médicos. Según una forma preferida de realización, el
vástago flexible se microadapta de tal modo que se puede introducir
en los instrumentos anteriormente mencionados que poseen una luz
interna. El vástago flexible se puede entonces deslizar
eventualmente en esta luz interna con la ayuda de una ranura de
guiado realizada especialmente a tal efecto y así permitir la
maniobra del dispositivo de la invención in vivo durante
distintas etapas de una exploración con objetivo diagnóstico o
terapéutica.
Pero el vástago flexible puede también consistir
en estos distintos instrumentos médicos mismos, que entonces se
utilizan como vástago de maniobra del microsistema de investigación
o de tratamiento.
El microsistema se fija en uno de los extremos
del vástago flexible, bien sea en el exterior de éste, o bien
insertado en la luz de dicho vástago flexible, mediante cualquier
medio de unión. Este medio de unión puede ser un sistema de pivote
que permite la orientación y el posicionamiento a partir del vástago
flexible en el espacio y a distancia del microsistema. El medio de
unión puede estar constituido por un material deformable controlado
electrónicamente y a distancia. Se puede tratar también de un
pegamento biológico y, en particular, de un tipo de pegamento
utilizado para la reparación de tejidos óseos.
En todos los casos, el medio de unión debe
responder a los siguientes criterios: adherencia, solidez y
flexibilidad (resistencia a las manipulaciones y a las puestas en
tensión unidas a los movimientos impresos a distancia),
biocompatibilidad y esterilidad.
El dispositivo de la invención se puede realizar
a partir de un molde de configuración adaptiva en el cual se vierten
uno o varios materiales homogéneos o de componentes electrónicos con
el fin de tomar la forma deseada. El dispositivo destinado a
realizar el sistema pivote y eventualmente una funda temporal se
puede verter en un lugar elegido del molde bien sea en forma de
dispositivo intermedio, o bien en forma de material adaptado con el
fin de permitir la realización del conjunto del dispositivo que se
describe más arriba. Gana así en eficacia guardando al mismo tiempo
su coherencia funcional.
El medio de unión puede ser accionable a
distancia para liberar el microsistema in situ. Así pues, el
dispositivo de la invención comprende los dos modos de realización
que se describen a continuación.
Según un primer modo de realización del
dispositivo de la invención, el vástago de maniobra permite
introducir, posicionar y luego extraer el microsistema después de
que las reacciones químicas biológicas buscadas se hayan producido a
nivel del sustrato.
Con el fin de mejorar el contacto entre el
microsistema dispuesto in situ y el sustrato, se puede dar
localmente un movimiento de rotación o de vaivén al microsistema con
la ayuda del vástago flexible de guiado, que éste sea llena (el
microsistema se fijado entonces en su extremo por un sistema
adecuado, eventualmente una rótula robotizada) o que éste sea hueco,
tubular, con el fin de recibir la base del microsistema que se
encuentra por lo tanto parcialmente insertado. El objetivo consiste
en dilacerar el tejido, o incluso en lisar las células por la
aportación de sustancias reactivada adecuadas, llevadas por el
catéter hasta el microsistema.
Estas operaciones se controlan bien sea
manualmente o bien por medio de una asistencia robótica. Para
aplicaciones de análisis de un sustrato, una vez recuperado el
microsistema se analiza en el laboratorio por las técnicas clásicas
de revelación de las reacciones químicas, en particular, del tipo
receptor/ligando que se producen, eventualmente después de las
etapas preparativas tal como una reacción de polimerización en
cadena. En este modo de realización, el microsistema se libera del
vástago flexible después de la extracción y el medio de unión no
requiere ser accionable a distancia. El medio de unión debe sin
embargo garantizar una cohesión y una flexibilidad suficiente para
permitir el control a distancia en vista del guiado, la orientación,
y el posicionamiento y eventualmente la extracción del microsistema
in situ.
Según un segundo modo de realización del
dispositivo de la invención, el medio de unión entre el vástago
flexible y el microsistema es accionable a distancia de tal modo que
posicione el dispositivo a nivel del lugar que se debe analizar. El
transporte y el posicionamiento del microsistema se pueden realizar
con la ayuda de un pequeño globo compatible estéril. En este modo de
realización, el microsistema se puede analizar a distancia gracias a
sistemas de captadores que permiten el análisis de las reacciones
químicas o biológicas que se producen eventualmente en el
microsistema de investigación. Cualquier microprocesador o cualquier
dispositivo susceptible de aumentar la sensibilidad, la eficacia y
en consecuencia la eficacia del microsistema o el control a
distancia de la instauración (guiado, orientación y posicionamiento)
de la micropastilla entra en el marco y se puede emplear en el marco
del dispositivo según la invención.
El dispositivo de la invención puede comprender
un sistema de protección del microsistema de investigación que se
desprotege una vez llevado y posicionado sobre el lugar que se debe
analizar. Este sistema de protección, por ejemplo una cortina
amovible, una red deformable puede cubrir todo el microsistema o
solamente su superficie activa. Este sistema de protección se puede
situar a nivel del medio de unión o se coloca a nivel del propio
microsistema.
El dispositivo de la invención puede comprender,
a nivel del extremo donde se fija el microsistema, cualquier sistema
de ayuda al funcionamiento del microsistema, tal como un sistema de
calefacción y/o de enfriamiento, de liberación de sustancia
biológica o química tal como tampones, reactivos de revelación,
cualquier producto de modificación biológica o cualquiera de las
moléculas del medio ambiente celular.
Puede ser completado por cualquier sistema
susceptible de dilacerar el tejido examinado o por un sistema que
aporta sustancias susceptibles de lisar sobre el terreno las células
con el fin de tener acceso al contenido de éstas, manteniéndose al
mismo tiempo in situ el tiempo necesario para una reacción de
fijación óptima de las moléculas del sustrato sobre las de la capa
reactiva.
El dispositivo de la invención se puede asociar a
cualquier dispositivo que permite a distancia:
- -
- la vigilancia por receptores sensorios (táctiles, ópticos, físicos-químico y, en particular, electrónicos o informáticos numerizados) o mediante cualquier sistema de captura o tratamiento de la señal,
- -
- la realización de biopsias cualquiera que sea el tamaño,
- -
- el tratamiento, por ejemplo de tumores,
- -
- la inyección local de productos químicos o biológicos (células o tejidos transportadores o no transportadores de vectores de genes o componentes de éstos así como vectores independientes), productos celulares o de los tejidos, agentes moleculares químicos o fisicoquímicos, agentes de marcado de cualquier clase radioactivos o no radioactivos).
El dispositivo de la invención se puede utilizar
de manera concomitante o sucesiva con dispositivos basados en
reacciones químicas o biológicas distintas que las empleadas a nivel
del microsistema, o con dispositivos complementarios de dilaceración
celular, de lisis celular, biopsia, de inyección o de capturas
sensorias.
El dispositivo de la invención es destacable
porque se puede utilizar sobre cualquier tipo de sustrato biológico
o químico que pertenece a seres vivos o que tuvo vida, humanos,
animales y vegetales.
Por ejemplo, es útil en el animal, en las
condiciones normales o en condiciones experimentales para el estudio
de afección patológica o en los animales transgénicos que presentan
tumores malignos o distintos desórdenes patológicos así como durante
injertos de células, tejidos o de órganos con el fin de supervisar
la tolerancia o el rechazo. Permite seguir la evolución biológica de
los animales para la puesta a punto de tratamientos selectivos, la
selección de las razas animales, la vigilancia de las enfermedades
víricas microbianas, parasitarias y enfermedades a agentes de tipo
priones. El dispositivo de la invención permite mejorar en el animal
las técnicas de clonación reproductiva o destinadas a obtener razas
celulares de actividad terapéutica regenerativa procedentes de
células cepas embrionarias o de células cepas extraídas después del
nacimiento de dichas células cepas "adultas". Se trata de
células de los vasos del cordón umbilical, pero también de células
adultas autoactivadas in vitro y que presenta las
características de las células cepas capaces de diferenciarse
posteriormente in situ, en particular, después de la terapia
regeneradora guiada a nivel del miocardio.
En el ser humano, el dispositivo de la invención
permite de manera no invasiva o microinvasiva preparar el
aislamiento y el secuenciado de genes y/o de la identificación de su
producto funcional, precisar un diagnóstico por métodos químicos o
biológicos, identificar con más pertinencia las indicaciones
terapéuticas, ensayar nuevas preparaciones biológicas o nuevas
moléculas de actividad terapéutica, seguir la eficacia terapéutica
gracias a exámenes orientados escalonados, repetidos sin riesgo
mayor dado el carácter no invasivo o microinvasivo de la utilización
del dispositivo. El dispositivo de la invención se aplica así al
análisis de patología tumoral benigna o maligna, interesante para
los tumores sólidos o líquidos tal como cánceres o leucemias, de
patologías neurológicas, musculares, hematológicas,
cardiovasculares, metabólicas o degenerativas, en particular, que
estén o no unidas a una anomalía genética identificada así como a
una predisposición patológica de componente genético. El dispositivo
de la invención también se adapta a la práctica y a la vigilancia de
la terapia celular, la terapia génica, los tratamientos
regeneradores efectuados a partir de cultivos de células cepas
embrionarias, o de células cepas extraídas después del nacimiento o
también al diagnóstico preimplantación después de la fecundación
in vitro (FIV). El dispositivo de la invención es tan útil
sobre el ser humano en desarrollo, por ejemplo en el embrión después
de FIV en cumplimiento de las normas éticas en vigor, en el feto en
el marco del Diagnóstico Prenatal en vista, en particular, del
diagnóstico de anomalías genéticas, como también en el marco de
terapéuticas prenatales llevadas in utero cuya utilización
del dispositivo podría ampliar las indicaciones. El dispositivo de
la invención encuentra también una aplicación en cuanto a la
medicina forense y durante las investigaciones propias de la
policía
científica.
científica.
En las plantas o en el ámbito del medio ambiente,
el dispositivo de la invención puede ser un útil precioso para la
identificación y la selección de variedades vegetales, la
realización de organismos genéticamente modificados, la vigilancia
de enfermedades virales o parasitarias la vigilancia de los suelos,
la vigilancia de los desequilibrios ecológicos de carácter biológico
o químico gracias a las aplicaciones in vitro e in
vivo, en particular, para la identificación de los agentes
contaminantes biológicos o químicos de los ecosistemas.
En el ámbito agroalimentario, el dispositivo de
la invención es útil para la elaboración y el seguimiento del OGM
(acrónimo de la expresión Organismos Genéticamente Modificados), en
particular, para la vigilancia de la regulación y la expresión de
los genes, para la vigilancia de eventuales contaminaciones durante
el conjunto de la cadena alimentaria sin desnaturalización previa de
los productos alimenticios, por ejemplo para la identificación de
microorganismos, de parásitos, de los virus, de las rickettsias o de
proteínas de tipo prión. Así pues, el dispositivo de la invención es
útil para la vigilancia de las distintas etapas de los
procedimientos de conservación, en particular, por el frío.
El dispositivo de la invención encuentra también
un interés en el ámbito paleontológico para la identificación y el
análisis de las características químicas o biológicas de células, de
tejidos y de órganos momificados o fosilizados con la ventaja de no
destruir los objetos analizados, y permite mejorar los útiles de
identificación de las distintas etapas de la evolución de las
especies.
La invención se comprenderá mejor por la lectura
de los ejemplos que se refieren a la colocación particular del
dispositivo de la invención en la cual:
- -
- la figura 1 representa un ejemplo de realización de un dispositivo según la invención.
- -
- las figuras 2 y 6 representan un esquema del principio de inmunocaptura por la técnica ELISA, con un anticuerpo antimanano y con un anticuerpo antilaminina respectivamente,
- -
- la figura 3 muestra un modelo de sistema flexible utilizado para el guiado del soporte,
- -
- la figura 4 representa un esquema del soporte que presenta una pluralidad de regiones sensibilizadas por un anticuerpo,
- -
- la figura 5 muestra un dispositivo piloto en el cual el soporte plástico rígido se inserta en el sistema de guiado.
Estos trabajos se realizaron con un sistema de
extracción in situ de un analito para su caracterización
posterior in vitro. La extracción del analito fue realizada
por inmuno o afino captura y el sistema de extracción presentaba las
siguientes características:
- -
- rigidez,
- -
- dirección por un sistema flexible,
- -
- compuesto de un polímero que permite el acoplamiento del anticuerpo (Ac) o del ligando para un inmuno o un afino captura del analito.
Se retuvieron dos modelos para estos
trabajos:
- -
- Un primer modelo que incluye el análisis de una candidiasis diseminada en el ratón por la puesta en evidencia de los antígenos (Ag) de tipo mananos de Candida albicans en los riñones o el hígado.
- -
- Un segundo modelo se basa en el análisis del tumor Engelbreth-Holm-Swarm (E. H. S.) en el ratón por la puesta en evidencia de la laminina a nivel del tumor del muslo.
Para el estudio de estos 2 modelos, se utilizó un
sistema de inmunocaptura con la ayuda de Ac anti-Candida o de
Ac anti-laminina.
De antemano, los distintos parámetros descritos
más arriba se estudiaron en un sistema de microplacas:
- -
- la concentración del Ac para la inmunocaptura
- -
- la especificidad del Ac para la inmunocaptura
- -
- el marcado del Ac reveladora por la biotina
- -
- la detección del Ag biotinalado por el complejo estreptavidina-enzima.
Las características siguientes de los soportes se
estudiaron en un sistema de inmunocaptura in vitro:
- -
- su naturaleza: poliestireno u otro
- -
- la activación por distintos agentes
- -
- el acoplamiento del Ac en los soportes.
Los resultados obtenidos en estos trabajos ponen
de manifiesto que es posible (i) fijar en un soporte rígido
(conectado a un vástago flexible) dos anticuerpos de especificidades
diferentes (anti-Candida y anti-laminina)
(ii) extraer los analitos correspondientes (antígenos Candida
y laminina), y (iii) identificar estos analitos por anticuerpos
marcados por la biotina que se revela a continuación por un complejo
estreptavidina-enzima.
Se trata de una inmunocaptura por la técnica
ELISA en microplaca o sobre soportes plásticos. (ELISA: Enzyme
Linked Immuno Sorbent Assay) donde el principio está representado en
la figura 2 adjunta.
El anticuerpo monoclonal antimanano fue
purificado y proporcionado por la SR2B.
Se dializa el anticuerpo, a 3 mg/ml, durante una
noche a 4ºC contra el tampón borato 0,1 M a pH 8,8. Entonces, se
añade una solución de biotina (éster de ácido
6-biotinamidocaproilamido-caproico y
de N-hidroxisucinamida; SIGMA®) a 10 mg/ml en DMSO a
razón de 50 \mum/mg de anticuerpo. Después de la incubación
durante 4 h a temperatura ambiente y bajo agitación, se añade
cloruro de amonio 1 M, a razón de 20 \mul/250 \mug de biotina, y
se incuba de nuevo la solución obtenida durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
Después de bloqueo de la reacción, se precipita
el anticuerpo marcado con sulfato de amonio 2M y después de la
centrifugación, se recoge el poso con un tampón TBS
(TRIS-HCl 20 mM, a pH 7,5, NaCl 150 mM) y se dializa
durante 24 horas a +4ºC contra este mismo tampón.
Este anticuerpo marcado se conserva bajo la forma
de alícuotas a -20ºC.
Las distintas etapas de preparación son las
siguientes:
- -
- Obtención de blastosporos de Candida Albicans ATCC 66396, durante 48 horas sobre Sabouraud Dextrosa Agar a 22ºC.
- -
- Liofilización de las levaduras.
- -
- Se recoge el liofilizado con un tampón citrato a pH 7,2 y 0,2 M.
- -
- Tratamiento en autoclave durante 2 horas a 131ºC (1,3 bar).
- -
- Centrifugación de la suspensión durante 15 minutos a 3000 g.
- -
- Adición de 2 volúmenes de etanol absoluto al sobrenadante y precipitación durante una noche a +4ºC.
- -
- Centrifugación durante 15 minutos a 3000 g y lavado del poso con etanol al 60%;
- -
- Centrifugación durante 15 minutos a 3000 g y adición de acetona para deshidratar el poso.
- -
- Recogida del poso con agua destilada.
La dosificación de los hidratos de carbono se
realiza por el método de Dubois. La concentración de hidratos de
carbono obtenida es de 21 mg/ml.
Ha sido elegido entre los distintos sistemas
flexibles ensayados para el guiado del soporte, el representado en
las fotografías presentadas en las figuras 3 y 5 en anexo. Se trata
de un tubo hueco flexible plástico en el cual se encaja el
soporte.
Se eligieron y se utilizaron tres tipos de
soportes plásticos para la puesta a punto del sistema, uno
calificado de plástico "amarillo", uno calificado de plástico
"azul" y el último calificado de plástico "blanco". Para
cada uno, se ensayaron tres métodos de acoplamiento tal como se
representa en la figura 4 en anexo: acoplamiento sin tratamiento
(\phi), acoplamiento con tratamiento con agente de acoplamiento 1
(A1) y acoplamiento con tratamiento con agente de acoplamiento 2
(A2). Los tres tipos de soporte se ensayaron no tratado o tratado
con A1 o A2 y para cada sistema, se utilizaron los soportes
sensibilizados por la Ac anti-M (U). Los soportes
"blanco" y "azul" dieron resultados similares. Solamente
el soporte constituida por el plástico "blanco", de longitud 2
cm, y tratada con el agente de acoplamiento A2 se eligió para la
continuación de las experiencias.
La técnica se realizó en microplaca para ELISA
(Greiner®). Los parámetros elegidos para una sensibilidad máxima
son: concentración del Ac anti-M para la
inmunocaptura a 1 \mug/ml, saturación en PBS-leche
a 10% durante una noche a +4ºC, concentración del Ac
anti-M biotinilado a 0,01 mg/ml con estos
parámetros, la sensibilidad es de 0,01 \mug/ml para la
concentración en hidratos de carbono (y no en mananos).
La técnica se realizó en microtubos de hemólisis
(Fisher®). Los parámetros elegidos para una sensibilidad máxima son:
concentración del Ac anti-M para la inmunocaptura a
10 \mug/ml, saturación PBS-leche a 10% durante una
noche a +4ºC, concentración del Ac anti-M
biotinilado a 0,02 mg/ml con estos parámetros, la sensibilidad es de
0,01 \mug/ml para la concentración en hidratos de carbono (y no
en mananos).
- -
- Utilización de las cepas de Candida Albicans ATCC 66396, cultivo sobre Sabouraud Dextrosa Agar durante 24 a 37ºC.
- -
- Concentración de levaduras inicial 10^{7}/ml en NaCl 0,15M.
- -
- Inoculación de 100 \mul por vía IV a nivel de la vena caudal al ratón.
- -
- Obtención de la candidiasis diseminada con presencia de abscesos renales y hepáticos.
En el día J = 0: inoculación a los ratones por
vía intravenosa de blastosporos de C. albicans ATCC
66396.
En J = 2, se sacrifican los ratones.
Se recoge la sangre por extracción periorbital en
tubos de vidrio y después de la decantación, se ensaya el suero para
la búsqueda de Ag manano circulan-
te.
te.
Se extraen los riñones o el hígado, se colocan en
un bote de Pétri estéril. La inmunocaptura se realiza insertando el
soporte plástico "blanco" sensibilizado con el Ac
anti-M en estos órganos.
Después de una incubación de 15 minutos, la
búsqueda de Ag manano sobre los soportes se hace según el principio
descrito in vitro.
Los riñones, el hígado o la sangre de ratones
sanos constituyen los testigos negativos.
Los resultados se expresan en densidad óptica
(DO) después de la sustracción de la DO de los testigos que son los
ratones sanos.
En lo que se refiere a los riñones, el riñón
derecho y el riñón izquierdo de ratones alcanzados por candidiasis
se ensayaron independientemente con respecto a riñones de ratón
sano. Se observa una diferencia significativa entre la señal
obtenida por la presencia del Ag mananos en los riñones
"enfermos" y la señal obtenida por los riñones de ratones sanos
(a título de ejemplo la diferencia de densidad óptica es de
aproximadamente 0,4).
En lo que se refiere al hígado, el Ag mananos se
detecta también por la sonda con una diferencia significativa
(diferencia de densidad óptica 0,6).
En la sangre (diluida a 1/10) de ratones sanos o
alcanzados por candidiasis, los Ag mananos circulantes no se han
detectado.
Se trata de una inmunocaptura por la técnica
ELISA en microplaca o sobre soportes plásticos. (ELISA: Enzyme
Linked Immuno Sorbent Assay) donde el principio está representado en
la figura 6 en anexo.
El anticuerpo elegido para la puesta a punto de
la detección del laminina es un anticuerpo policlonal producido en
el conejo y purificado por afinidad (Rockland®). La técnica de
marcado con la biotina es idéntica a la utilizada para el
anti-M.
La laminina elegida para la puesta a punto in
vitro es la laminina purificada de ratón (Sigma®).
- -
- Sistemas flexibles tal como se describen anteriormente para Candida albicans.
- -
- Soportes plásticos rígidos tal como se describen anteriormente para Candida albicans.
La técnica se realizó en microplaca para ELISA
(Greiner®). Los parámetros elegidos para una sensibilidad máxima
son:
- \bullet
- Concentración del Ac anti-L para la inmunocaptura a 5 \mug/ml.
- \bullet
- Saturación PBS-leche a 10%, durante una noche a +4ºC.
- \bullet
- Concentración del Ac anti-L biotinilado a 5 \mug/ml.
Con estos parámetros, la sensibilidad es de 0,01
mg/ml para la concentración en laminina.
La técnica se realizó en microtubos de hemólisis
(Fisher®). Los parámetros elegidos para una sensibilidad máxima son
los mismos que en microplaca, a saber:
- \bullet
- Concentración del Ac anti-L para la inmunocaptura a 5 \mug/ml.
- \bullet
- Saturación PBS-leche a 10%, durante una noche a +4ºC.
- \bullet
- Concentración del Ac anti-L biotinilado a 5 \mug/ml.
Con estos parámetros, la sensibilidad es de 0,01
mg/ml para la concentración en laminina.
- -
- Descongelación del sarcoma del E. H. S. (Engelbreth - Holm-Swarm) de ratón.
- -
- Inoculación en los muslos de ratón.
- -
- Después de 3 semanas, se sacrifican los ratones, se extraen, se trituran y se inoculan los tumores a otros ratones.
Se sacrifican los ratones y se realiza la
inmunocaptura insertando el soporte plástico "blanco"
sensibilizado con el anti-L en el tumor del muslo.
Los muslos de ratón sanos constituyen los testigos negativos.
Los resultados se expresan en densidad óptica
(DO) después de la sustracción de la DO de los testigos que son los
ratones sanos.
Se observa una diferencia significativa entre la
señal obtenida por la presencia de laminina en el tumor y la señal
obtenida para los muslos de ratones sanos (a título de ejemplo la
diferencia de densidad óptica es de aproximadamente 0,3).
Se sensibiliza el soporte constituido por el
plástico "blanco" y mantenido por el sistema de guiado flexible
con el Ac anti-M y el Ac anti-L a
las concentraciones previamente establecidas.
La inmunocaptura se realiza en:
- -
- ratones sanos (testigos)
- -
- ratones alcanzados por candidiasis
- -
- ratones con un tumor laminina (E. H. S.).
Los soportes están:
- -
- bien sea, en primer lugar, colocados en los riñones o en el hígado de un ratón alcanzado por candidiasis diseminada luego en el tumor (E. H. S.) del muslo de otro ratón.
- -
- o bien, en primer lugar, colocados en el tumor (E. H. S.) del muslo de un ratón luego en los riñones o en el hígado de otro ratón alcanzado por candidiasis diseminada.
A continuación, los soportes se revelan por el
anti-M o el anti-L o una mezcla de
estos 2.
Se realizaron testigos negativos colocando
soportes en los riñones o en el hígado de un ratón sano luego en el
muslo del mismo ratón (e inversamente).
Los resultados se expresan en densidad óptica
(DO) después de la sustracción de la DO de los testigos que son los
ratones sanos.
Cualquiera que sea el orden en el cual se
implanta el soporte en los distintos órganos, el Ag manano o la
laminina se detectan de manera significativa con respecto a los
ratones sanos cuando se revela el sistema por uno sólo de los dos
anticuerpos (DO: 0,4 para el Ag manano y 0,4 para la laminina).
Cuando la mezcla de los dos anticuerpos
biotinilados se utiliza para la revelación, la señal obtenida es
mucho más elevada (a título de ejemplo ratón candidiasis + laminina
DO = 0,7).
No se pudo detectar el Ag manano en la sangre de
los ratones sanos o alcanzados por candidiasis diseminadas.
Claims (13)
1. Un dispositivo para el análisis y/o el
tratamiento in situ en el cual un sistema de investigación
y/o de tratamiento se desliza en un instrumento médico,
caracterizado porque comprende:
- (i)
- un microsistema de investigación de un sustrato distinto que por análisis de una señal fluorescente, y/o de liberación de agentes activos a nivel de un sustrato,
- (ii)
- un vástago flexible en un extremo del cual se fija el microsistema y cuyo otro extremo se destina a la maniobra sobre dicho microsistema,
- (iii)
- un instrumento médico que posee una luz interna en la cual se desliza dicho vástago flexible,
- (iv)
- un sistema de protección del microsistema amovible a nivel del sustrato, y
- (v)
- a nivel de dicho microsistema, un sistema de dilaceración de tejidos o células.
2. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el microsistema y el vástago flexible se
unen uno con el otro durante su utilización in situ y no se
separan más que antes o después de la intervención in
situ.
3. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el microsistema
es del tipo que comprende un soporte en la superficie de la cual se
realizan regiones predefinidas que contienen cada una sustancias
químicas o biológicas, idénticas o diferentes, de investigación o de
tratamiento del sustrato donde se lleva el microsistema gracias al
vástago flexible.
4. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el microsistema
es un microsistema receptor/ligando que emplea pares de sustancias
químicas o biológicas en el cual uno u otro o los dos miembros del
par se fijan sobre cada región predefinida.
5. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el microsistema
es un microsistema receptor/ligando que emplea pares
antígenos/anticuerpo.
6. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque las sustancias
químicas o biológicas son secuencias polinucleotídicas o de
aminoácidos.
7. Dispositivo según la reivindicación 6,
caracterizado porque las sustancias biológicas
constituyen:
- -
- una disposición de polinucleótidos capaz de hibridarse con ácidos nucleicos presentes a nivel del sustrato, o
- -
- una disposición de péptidos, polipéptidos o proteínas capaces de reaccionar con un receptor correspondiente o inmunológicamente con anticuerpos o antígenos presentes a nivel del sustrato.
8. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque se fijan las
sustancias químicas o biológicas en el soporte mediante uniones
susceptibles de ser escindidas in situ.
9. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el vástago
flexible está constituido por un instrumento médico utilizado con
fines diagnósticos, terapéuticos o experimentales.
10. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se fija el
microsistema en uno de los extremos del vástago flexible mediante
cualquier medio de unión constituido de un sistema de pivote que
permite la orientación y el posicionamiento a partir del vástago
flexible en el espacio y a distancia del microsistema.
11. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el microsistema
está constituido por un soporte que se presenta bajo la forma de una
banda enrollada alrededor de un extremo del vástago flexible.
12. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende a
nivel del extremo donde se fija el microsistema, un sistema de ayuda
para el funcionamiento de dicho microsistema, tal como un sistema de
calefacción y/o de enfriamiento o de liberación de sustancia
biológica o química.
13. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se asocia a
uno o varios dispositivos elegidos entre un dispositivo de
vigilancia, de realización de biopsia, de tratamiento, de inyección
local de productos biológicos o químicos.
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