DE3932784C3 - Verfahren zur Gewinnung nichtflüchtiger Substanzen als analytisches Probenmaterial aus der menschlichen Atemluft - Google Patents

Description

Mit zunehmender Umweltbelastung kommt dem Pro­ blem der Früherkennung von Schädigungen der Lunge und der Atemwege wachsende Bedeutung zu. Die frü­ hen Stadien einer pathologischen Veränderung des Ge­ webes sind diagnostisch schwer faßbar, chronische Er­ krankungen werden oft erst in einem relativ späten Sta­ dium, wenn bereits eine eindeutige Funktionsstörung vorliegt, diagnostiziert.

An Anfang eines derartigen Krankheits- oder Entzün­ dungsprozesses steht die Schädigung einzelner Lungen­ zelltypen, z. B. der verschiedenen Zelltypen des Lunge­ nepithels (Pneumocyten Typ I und II) oder des Intersti­ tiums.

Erste Indikatoren auf zellulärer Ebene können dabei die Beeinträchtigung spezifischer Stoffwechselleistun­ gen bestimmter Zellen (z. B. Surfactant-Ausschüttung von Pneumocyten Typ II) oder die Aktivierung körper­ eigener Abwehrmechanismen (Ausschüttung von Me­ diatoren) sein.

In der klinischen Diagnostik wird daher unter ande­ rem versucht Veränderungen des Lungenstatus durch die Bestimmung der Konzentration einzelner Stoff­ wechselprodukte und Mediatoren (z. B. Immunglobuli­ ne, Lymphokine) in der bronchoalveolären Grenzflüs­ sigkeit zu erfassen. Zur Gewinnung von Probenmaterial wird dabei zur Zeit, in der Klinik die Technik der bron­ cho-alveolären Lavage (BAL) eingesetzt. Dabei werden die Patienten narkotisiert und mit Hilfe eines Broncho­ skops ganze Lungensegmente mehrmals mit Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung (bis zu 300 ml) durchgespült. Die Spülflüssigkeiten werden anschlie­ ßend analysiert (Reynolds, H. Y.: Bronchoalveoläre La­ vage; American Review of Respir. Diseases 135, (1987), 250-263).

Dieses Verfahren belastet den Patienten in erhebli­ chem Maße und ist daher nicht präventiv einsetzbar. Eine on-line-Messung ist nicht möglich, die Probennah­ me ist nur bedingt reproduzierbar, aufgrund der Irrita­ tion des Gewebes kann nur unter Vorbehalt auf die Verhältnisse in situ rückgeschlossen werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand so­ mit darin, ein Verfahren anzugeben um Probenmaterial für die Bestimmung diagnostisch relevanter Bestandtei­ le der broncho-alveolären Grenzflüssigkeit unter Bedin­ gungen zu gewinnen, die für den Patienten nicht bela­ stend und gegebenenfalls auch im Rahmen einer Vor­ sorgeuntersuchung zumutbar sind.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß hochmo­ lekulare, nichtflüchtige Biopolymere wie z. B. Proteine aus der broncho-alveolären Grenzflüssigkeit in der Atemluft nachweisbar sind und für die Diagnose von Krankheiten genutzt werden können.

Damit wird in vielen Fällen ein Ersatz der aufwendi­ gen und den Patienten belastenden Probennahme mit Hilfe der bronchoalveolären Lavage durch ein nicht-in­ vasives, den Patienten nicht belastendes Verfahren möglich. Die Analyse kann entweder direkt durch on-li­ ne-Analyse der Exspirationsluft oder aber nach vorher­ gehender Anreicherung der Substanzen aus einem grö­ ßeren Volumen Exspirationsluft erfolgen.

Atemgasanalysen, z. B. mit Hilfe massenspektrome­ trischer Methoden sind bisher lediglich an flüchtigen, niedermolekularen, zumeist organischen Verbindungen, wie z. B. Aceton, Methylethylketon, Propanol (Gordon, S. M., et al.: Volatile organic compounds in exhaled air from patients with lung cancer; Clinical Chemistry, Vol. 31, Nr. 8 (1985), 1278-1282), Pyridin (Kostelc, J. G., et al.: Salivary Volatiles as Indicators of Periodontitis; Journal of Periodontic Research 15, (1980), 185-192), Dichlor­ methan, Toluol, Styrol (Wilson, H. K., Offenleg., T. W.: The use of a transportable mass spectrometer for the direct measurement of industrial solvents in breath; Bio­ medical) Mass Spectrometry, Vol. 8, Nr. 12, (1981), 606-610), Ammoniak, Acetaldehyd sowie Ethanol (Lo­ vett, A. M., et al.: Real-time analysis of breath using an atmospheric pressure ionization mass spectrometer; Biomedical Mass Spectrometry, Vol. 6, Nr. 3, (1979), 91-97) durchgeführt worden (vgl. hierzu auch die US 4 772 559).

Die Bestimmung hochmolekularer Substanzen, die in Form von z. B. Tröpfchen, Aerosolen und Clustern in der Atemluft transportiert werden, eröffnet zusätzlich zur Analyse von flüchtigen, niedermolekularen Verbin­ dungen (Barkley, J., et al.: Gas chromatography mass spectrometry, computer analysis of volatile halogenated hydrocarbons in man and his environmnent - a multime­ dia environmental study; Biomedical Mass Spectrome­ try, Vol. 7, Nr. 4, (1980) 139-147; Benoit, F. M.: Breath analysis by atmospheric pressure ionization mass spec­ trometry; Analytical Chemistry, Vol. 55, Nr. 4 (1983), 805-807; Benoit, F. M., et al.: Breath analysis by API/­ MS - human exposure to volatile organic solvents; International Archives of Occupational and Environ­ mental Health, 55 (1985), 113-120; Wilson, H. K.: Bre­ ath analysis - Physiological basis and sampling techni­ ques; Scand. J. Work Environ. Health 12 (1986), 174-192) ein völlig neues Potential in der Atemluftana­ lytik.

Vorzugsweise wird zur Kühlung gemäß Anspruch 2 flüssiger Stickstoff eingesetzt. Ferner erfolgt vorzugs­ weise die Energiezufuhr gemäß Anspruch 4 mittels Be­ heizung, Ultraschallanregung, Bestrahlung mit elektro­ magnetischen Wellen, wie Mikrowellen, kohärentem oder divergierendem Licht bzw. Infrarotlicht.

Ferner werden in dem Verfahren gemäß Anspruch 5 Massen größer 1000 vorzugsweise mittels Time-of- Flight-Massenspektrometrie bestimmt.

Das Verfahren wird in der Folge mit Hilfe von Zeich­ nungen sowie anhand von Beispielen erläutert.

Fig. 1 zeigt gefriergetrocknete Substanz aus ca. 750 l Atemluft. Die nichtflüchtigen Bestandteile der Atemluft wurden aus 250 Atemstößen eines Probanden zunächst in einer Kühlfalle bei -196°C ausgefroren (→ 15 ml wäßriges Kondensat) und anschließend gefriergetrock­ net.

Fig. 2 zeigt Sekundärionen-Massenspektren nicht- flüchtiger Substanzen aus menschlicher Exspirationsluft (oberes Spektrum) und Umgebungsluft (unteres Spek­ trum). Ca. 1 cm² große, frisch mit Silber bedampfte Indi­ umplättchen wurden auf einen Kühltisch (-196°C) ge­ bracht und a) durch ein Glasrohr mit 6 Atemstößen behaucht bzw. b) für die gleiche Zeit der Umgebungsluft ausgesetzt. Die Proben wurden auf dem Cryotisch durch Anlegen eines Ultrahochvakuums gefriergetrocknet und anschließend im Sekundärionen-Massenspektro­ meter vermessen.

Fig. 3 zeigt das Ergebnis einer Auftrennung der Pro­ teine aus Atemluft und Speichel eines Probanden durch eine zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophore­ se.

• 1. Dimension, horizontal: Isoelektrische Fokussie­ rung
• 2. Dimension, vertikal: SDS-Elektrophorese.

Oberes Gel: Exspirationsluft; Unteres Gel: Speichel.

Die in einer Kühlfalle bei -196°C ausgefrorenen und anschließend gefriergetrockneten Substanzen aus der Exspirationsluft (s. Fig. 1) wurden in Lysispuffer (9 M Harnstoff, 4% NONIDET P40, 5% Ampholyte pH 7-9 (LKB)) aufgenommen und auf das Gel aufgetragen.

Die Speichelprobe (ca. 300 µl) wurde ebenfalls zu­ nächst gefriergetrocknet, anschließend in Puffer aufge­ nommen und elektrophoretisiert.

Fig. 4 zeigt einen Vergleich der Proteinmuster (2D-SDS-Gele Fig. 3) von Atemluft- und Speichelpro­ ben.

Diejenigen in der Atemluft auftretenden Proteine, die im Speichel nicht oder nur in geringerer Konzentration nachweisbar sind, wurden schwarz hervorgehoben. Die weitgehende Übereinstimmung der Gele im Bereich um 50.000 D und pH 5,5 könnte auf das Mitreißen von Aero­ solpartikeln aus dem Mundbereich zurückzuführen sein. Es ist jedoch auch denkbar, daß der Flüssigkeitsfilm über den Schleimhäuten der Atemwege und des Mun­ des die gleichen Hauptkomponenten enthält, die dann in Proben unterschiedlicher Herkunft nachgewiesen wer­ den.

Beispiel 1

Sechs Atemstöße eines Probanden wurden auf ein auf -196°C gekühltes, 1 cm² großes Probenträgerplätt­ chen aufgehaucht. Die Probe wurde auf dem Cryotisch durch Anlegen eines Ultrahochvakuums gefriergetrock­ net und anschließend mit Sekundärionenmassenspek­ trometrie (SIMS) vermessen. Bereits bei diesen gerin­ gen Probenmengen konnten mit dieser empfindlichen Meßmethode neben anorganischen Ionen auch spezifi­ sche organische Gruppen nachgewiesen werden (siehe Fig. 1 und 2).

Beispiel 2

Die nichtflüchtigen Bestandteile aus ca. 750 l (d. h. aus 250 Atemstößen) der Atemluft eines gesunden Proban­ den wurden durch Auskondensieren in einer Kühlfalle bei -196°C und anschließende Gefriertrocknung ange­ reichert. Bei der Analyse der so gewonnenen Substanz mit biochemischen Methoden (Proteinauftrennung durch zweidimensionale SDS-Gelelektrophorese mit anschließender Coomassie- bzw. Silberfärbung) konn­ ten Proteine bis zu einem Molekulargewicht von 60000 D nachgewiesen werden (siehe Fig. 1, 3 und 4).

Claims (5)

1. Verfahren zur Gewinnung nichtflüchtiger Biopolymere als analytisches Probenmaterial aus der menschlichen Atemluft für die Diagnose des Gesundheitszustandes sowie zur Therapieüberwachung und zur Verlaufskontrolle von Krankheiten, speziell der Lunge und der Atemwege, wobei die menschliche Exspirationsluft entweder unmittelbar, ohne vorhergehende Anreicherung der nachzuweisenden Substanzen, einem Analysensystem zugeführt wird, oder wobei die nichtflüchtigen Biopolymere aus der Exspirationsluft vor Zuführung zu einem Analysensystem angereichert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anreicherung durch Kondensation auf gekühlten Oberflächen, die auf einer Temperatur unterhalb des Gefrierpunkts der gesuchten Substanzen gehalten werden, durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Exspirationsluft über ein Molekularstrahlsystem ohne Gas-Wand-Wechselwirkung einem Detektorsystem zugeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei die in der Exspirationsluft enthaltenen Cluster oder Aerosole vor Erreichen eines Detektorsystems durch Energiezufuhr in ihre molekularen Bestandteile überführt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei als Analysensystem ein geeignetes massenspektrometrisches System, ein infrarotspektroskopisches System oder ein System mit spezifischen Sensoren verwendet wird.