DE3932784C2 - Verfahren zur Gewinnung nichtflüchtiger Substanzen als analytisches Probenmaterial aus der menschlichen Atemluft - Google Patents

Description

Mit zunehmender Umweltbelastung kommt dem Problem der Früh­ erkennung von Schädigungen der Lunge und der Atemwege wach­ sende Bedeutung zu. Die frühen Stadien einer pathologischen Veränderung des Gewebes sind diagnostisch schwer faßbar, chronische Erkrankungen werden oft erst in einem relativ späten Stadium, wenn bereits eine eindeutige Funktionsstö­ rung vorliegt, diagnostiziert.

An Anfang eines derartigen Krankheits- oder Entzündungspro­ zesses steht die Schädigung einzelner Lungenzelltypen, z. B. der verschiedenen Zelltypen des Lungenepithels (Pneumocyten Typ I und II) oder des Interstitiums.

Erste Indikatoren auf zellulärer Ebene können dabei die Be­ einträchtigung spezifischer Stoffwechselleistungen bestimm­ ter Zellen (z. B. Surfactant-Ausschüttung von Pneumocyten Typ II) oder die Aktivierung körpereigener Abwehrmechanismen (Ausschüttung von Mediatoren) sein.

In der klinischen Diagnostik wird daher unter anderem ver­ sucht, Veränderungen des Lungenstatus durch die Bestimmung der Konzentration einzelner Stoffwechselprodukte und Media­ toren (z. B. Immunglobuline, Lymphokine) in der broncho­ alveolären Grenzflüssigkeit zu erfassen. Zur Gewinnung von Probenmaterial wird dabei zur Zeit, in der Klinik die Technik der broncho-alveolären Lavage (BAL) eingesetzt. Dabei werden die Patienten narkotisiert und mit Hilfe eines Bronchoskops ganze Lungensegmente mehrmals mit Wasser oder physiologi­ scher Kochsalzlösung (bis zu 300 ml) durchgespült. Die Spül­ flüssigkeiten werden anschließend analysiert (Reynolds, H.Y.: Bronchoalveoläre Lavage; American Review of Respir. Diseases 135, (1987), 250-263).

Dieses Verfahren belastet den Patienten in erheblichem Maße und ist daher nicht präventiv einsetzbar. Eine on-line-Mes­ sung ist nicht möglich, die Probennahme ist nur bedingt re­ produzierbar, aufgrund der Irritation des Gewebes kann nur unter Vorbehalt auf die Verhältnisse in situ rückgeschlossen werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand somit darin, ein Verfahren anzugeben um Probenmaterial für die Bestimmung diagnostisch relevanter Bestandteile der broncho-alveolären Grenzflüssigkeit unter Bedingungen zu gewinnen, die für den Patienten nicht belastend und gegebenenfalls auch im Rahmen einer Vorsorgeuntersuchung zumutbar sind.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß hochmolekulare, nichtflüchtige Biopolymere wie z. B. Proteine aus der broncho-alveolären Grenzflüssigkeit in der Atemluft nach­ weisbar sind und für die Diagnose von Krankheiten genutzt werden können.

Damit wird in vielen Fällen ein Ersatz der aufwendigen und den Patienten belastenden Probennahme mit Hilfe der broncho­ alveolären Lavage durch ein nicht-invasives, den Patienten nicht belastendes Verfahren möglich. Die Analyse kann entwe­ der direkt durch on-line-Analyse der Exspirationsluft oder aber nach vorhergehender Anreicherung der Substanzen aus einem größeren Volumen Exspirationsluft erfolgen.

Atemgasanalysen, z. B. mit Hilfe massenspektrometrischer Me­ thoden sind bisher lediglich an flüchtigen, niedermolekula­ ren, zumeist organischen Verbindungen, wie z. B. Aceton, Me­ thylethylketon, Propanol (Gordon, S.M., et al.: Volatile organic compounds in exhaled air from patients with lung cancer; Clinical Chemistry, Vol. 31, Nr. 8 (1985), 1278- 1282), Pyridin (Kostelc, J.G., et al.: Salivary Volatiles as Indicators of Periodontitis; Journal of Periodontic Research 15, (1980), 185-192), Dichlormethan, Toluol, Styrol (Wilson, H.K., Offenleg., T.W.: The use of a transportable mass spectrometer for the direct measurement of industrial solvents in breath; Biomedical Mass Spectrometry, Vol. 8, Nr. 12, (1981), 606- 610), Ammoniak, Acetaldehyd sowie Ethanol (Lovett, A.M., et al.: Real-time analysis of breath using an atmospheric pressure ionization mass spectrometer; Biomedical Mass Spectrometry, Vol. 6, Nr. 3, (1979), 91-97) durchgeführt worden (vgl. hierzu auch die US 4 772 559).

Die Bestimmung hochmolekularer Substanzen, die in Form von z. B. Tröpfchen, Aerosolen und Clustern in der Atemluft transportiert werden, eröffnet zusätzlich zur Analyse von flüchtigen, niedermolekularen Verbindungen (Barkley, J., et al.: Gas chromatography mass spectrometry, computer analysis of volatile halogenated hydrocarbons in man and his environment - a multimedia environmental study; Biomedical Mass Spectrometry, Vol. 7, Nr. 4, (1980) 139-147; Benoit, F.M.: Breath analysis by atmospheric pressure ionization mass spectrometry; Analytical Chemistry, Vol. 55, Nr. 4 (1983), 805-807; Benoit, F.M., et al.: Breath analysis by API/MS - human exposure to volatile organic solvents; International Archives of Occupational and Environmental Health, 55 (1985), 113-120; Wilson, H.K. : Breath analysis - Physiological basis and sampling techniques; Scand. J. Work Environ. Health 12 (1986), 174-192) ein völlig neues Poten­ tial in der Atemluftanalytik.

Vorzugsweise wird zur Kühlung gemäß Anspruch 2 flüssiger Stickstoff eingesetzt. Ferner erfolgt vorzugsweise die Energiezufuhr gemäß Anspruch 4 mittels Beheizung, Ultraschallanregung, Bestrahlung mit elektromagnetischen Wellen, wie Mikrowellen, kohärentem oder divergierendem Licht bzw. Infrarotlicht.

Ferner werden in dem Verfahren gemäß Anspruch 5 Massen größer 1000 vorzugsweise mittels Time-of-Flight-Massenspektrome­ trie bestimmt.

Das Verfahren wird in der Folge mit Hilfe von Zeichnungen sowie anhand von Beispielen erläutert.

Fig. 1 zeigt gefriergetrocknete Substanz aus ca. 750 l Atem­ luft. Die nichtflüchtigen Bestandteile der Atemluft wurden aus 250 Atemstößen eines Probanden zunächst in einer Kühl­ falle bei -196°C ausgefroren (→ 15 ml wäßriges Kondensat) und anschließend gefriergetrocknet.

Fig. 2 zeigt Sekundärionen-Massenspektren nichtflüchtiger Substanzen aus menschlicher Exspirationsluft (oberes Spek­ trum) und Umgebungsluft (unteres Spektrum). Ca. 1 cm² große, frisch mit Silber bedampfte Indiumplättchen wurden auf einen Kühltisch (-196°C) gebracht und a) durch ein Glasrohr mit 6 Atemstößen behaucht bzw. b) für die gleiche Zeit der Umge­ bungsluft ausgesetzt. Die Proben wurden auf dem Cryotisch durch Anlegen eines Ultrahochvakuums gefriergetrocknet und anschließend im Sekundärionen-Massenspektrometer vermessen.

Fig. 3 zeigt das Ergebnis einer Auftrennung der Proteine aus Atemluft und Speichel eines Probanden durch eine zweidimen­ sionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

• 1. Dimension, horizontal: Isoelektrische Fokussierung
• 2. Dimension, vertikal: SDS-Elektrophorese.

Oberes Gel: Exspirationsluft; Unteres Gel: Speichel.

Die in einer Kühlfalle bei -196°C ausgefrorenen und an­ schließend gefriergetrockneten Substanzen aus der Exspira­ tionsluft (s. Fig. 1) wurden in Lysispuffer (9M Harnstoff, 4% NONIDET P40, 5% Ampholyte pH 7-9 (LKB)) aufgenommen und auf das Gel aufgetragen.

Die Speichelprobe (ca. 300 µl) wurde ebenfalls zunächst ge­ friergetrocknet, anschließend in Puffer aufgenommen und elektrophoretisiert.

Fig. 4 zeigt einen Vergleich der Proteinmuster (2D-SDS-Gele Fig. 3) von Atemluft- und Speichelproben.

Diejenigen in der Atemluft auftretenden Proteine, die im Speichel nicht oder nur in geringerer Konzentration nach­ weisbar sind, wurden schwarz hervorgehoben. Die weitgehende Übereinstimmung der Gele im Bereich um 50.000 D und pH 5,5 könnte auf das Mitreißen von Aerosolpartikeln aus dem Mund­ bereich zurückzuführen sein. Es ist jedoch auch denkbar, daß der Flüssigkeitsfilm über den Schleimhäuten der Atemwege und des Mundes die gleichen Hauptkomponenten enthält, die dann in Proben unterschiedlicher Herkunft nachgewiesen werden.

Beispiel 1

Sechs Atemstöße eines Probanden wurden auf ein auf -196°C gekühltes, 1 cm² großes Probenträgerplättchen aufgehaucht. Die Probe wurde auf dem Cryotisch durch Anlegen eines Ul­ trahochvakuums gefriergetrocknet und anschließend mit Sekun­ därionenmassenspektrometrie (SIMS) vermessen. Bereits bei diesen geringen Probenmengen konnten mit dieser empfindli­ chen Meßmethode neben anorganischen Ionen auch spezifische organische Gruppen nachgewiesen werden (siehe Fig. 1 und 2).

Beispiel 2

Die nichtflüchtigen Bestandteile aus ca. 750 l (d. h. aus 250 Atemstößen) der Atemluft eines gesunden Probanden wurden durch Auskondensieren in einer Kühlfalle bei -196°C und an­ schließende Gefriertrockung angereichert. Bei der Analyse der so gewonnenen Substanz mit biochemischen Methoden (Proteinauftrennung durch zweidimensionale SDS-Gel­ elektrophorese mit anschließender Coomassie- bzw. Silberfär­ bung) konnten- Proteine bis zu einem Molekulargewicht von 60 000 D nachgewiesen werden (siehe Fig. 1, 3 und 4).

Claims (5)

1. Verfahren zur Gewinnung nichtflüchtiger Substanzen als analytisches Probenmaterial aus der menschlichen Atem­ luft für die Diagnose des Gesundheitszustandes sowie zur Therapieüberwachung und zur Verlaufskontrolle von Krank­ heiten, speziell der Lunge und der Atemwege, wobei die menschliche Exspirationsluft entweder unmittelbar, ohne vorhergehende Anreicherung der nachzuweisenden Substan­ zen, einem Analysensystem zugeführt wird, oder wobei die nichtflüchtigen Substanzen aus der Exspirationsluft vor Zuführung zu einem Analysensystem angereichert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anreicherung durch Kondensation auf gekühlten Oberflächen, die auf einer Temperatur unterhalb des Gefrierpunkts der gesuchten Substanzen gehalten werden, durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Exspirationsluft über ein Molekularstrahlsystem ohne Gas-Wand-Wechselwir­ kung einem Detektorsystem zugeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei die in der Ex­ spirationsluft enthaltenen Cluster oder Aerosole vor Er­ reichen eines Detektorsystems durch Energiezufuhr in ihre molekularen Bestandteile überführt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei als Analysensystem ein geeignetes massenspektrometrisches System, ein infrarotspektroskopisches System oder ein System mit spezifischen Sensoren verwendet wird.