DE102017125019B4

DE102017125019B4 - PDCD1 als epigenetischer Marker zur Identifizierung von Immunzellen, insbesondere PD1+ Zellen

Info

Publication number: DE102017125019B4
Application number: DE102017125019.0A
Authority: DE
Inventors: Sven Olek; Udo Baron
Original assignee: Epiontis GmbH
Current assignee: Precision for Medicine GmbH
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2019-10-17
Anticipated expiration: 2037-10-26
Also published as: DE102017125019A1; EP3669003B1; CA3080060A1; AU2018356436A1; CN111212920A; US20210123100A1; JP2021502061A; US11597975B2; WO2019081590A1; EP3669003A1

Abstract

Verfahren zur Identifizierung von PD1+-Zellen in einer Probe, umfassend das Analysieren des Methylierungsstatus von mindestens einer CpG-Position in der Säuger-Genregion für Programmed cell death 1 (PDCD1), wobei vorzugsweise die analysierte Genregion gemäß der SEQ ID Nr. 1 positioniert ist, wobei eine Demethylierung oder fehlende Methylierung der Genregion für eine PD1+-Zelle im Vergleich zu einer nicht-PD1+-Zelle indikativ ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, insbesondere ein in vitro Verfahren, zur Identifizierung von PD1+-Zellen, umfassend die Analyse epigenetischer Modifikationen/Eigenschaften (einschließlich des Methylierungsstatus) von mindestens einer CpG-Position in der Säuger-Genregion für den Programmed Cell Death 1 (PDCD1), wobei eine Demethylierung oder fehlende Methylierung dieser Genregion für eine PD1+-Zelle indikativ ist, wenn diese mit einer nicht-PD1+-Zelle verglichen wird. Die Analysen gemäß der Erfindung können PD1+-Zellen auf epigenetischer Ebene identifizieren und von allen anderen Zellen in komplexen Proben unterscheiden, wie zum Beispiel anderen Blut- oder Immunzellen. Zudem stellt die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung von PD1+-Zellen, insbesondere in komplexen Proben, zur Verfügung. Das Verfahren kann ohne einen Schritt der Aufreinigung und/oder Anreicherung der Zellen, vorzugsweise durch Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe, durchgeführt werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung der oben genannten Verfahren sowie deren jeweilige Anwendung. Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein neuartiges, robusteres Mittel zum quantitativen Nachweis und zur Messung von PD1+-Zellen des Blutes in allen soliden Organen, Geweben oder Körperflüssigkeiten eines Säugers bereitzustellen.
Hintergrund der Erfindung
Im allgemeinen werden PD1+-Zellen als Zellen definiert, die aktiv das Protein synthetisieren, das durch das Gen Programmed Cell Death 1 codiert wird. In der vorliegenden Anmeldung werden PD1+-Zellen als Zellen definiert, die in der Lage sind, PD1 zu exprimieren, indem sie eine zugängliche unmodifizierte primäre DNA-Sequenz bereitstellen, wie durch das Fehlen von Modifikationen in CpG-Motiven in der nachfolgend beschriebenen und definierten intronischen Region gezeigt.
PD1+-Zellen sind Zellen, die das Programmed Cell Death Protein-1 (PDCD1, auch PD-1 genannt) exprimieren. PDCD1 wird auf einer Vielzahl von Immunzelltypen exprimiert, wie zum Beispiel aktivierten Thymus-Lymphozyten (T-Lymphozyten, T-Zellen), Pro-B-Zellen, Myeloid-abgeleiteten dendritischen Zellen und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). PDCD1 wird während verschiedener Stadien der Immunentwicklung und Entzündung exprimiert, und PDCD1 dient als wichtiger Kontrollpunkt-Rezeptor, der an der Regulierung der Immunität und Selbsttoleranz beteiligt ist. PDCD1-Expression verlangsamt die Immunantwort während der ersten akuten Antigenerkennung, durch Reduzierung von Geweberesidenz und Zytokinproduktion, ebenso wie durch die Verringerung der Bildung von Helfer-Zellen während der frühen Immunantwort. Interessanterweise begünstigt PDCD1 die Apoptose (programmierter Zelltod) in antigenspezifischen T-Zellen, während gleichzeitig die Apoptose in regulatorischen T-Zellen, die entzündungshemmende T-Zellen sind, unterbunden wird. Somit ist PDCD1 ein wichtiger Regulator einer effektiven adaptiven Immunantwort.
Obwohl nahezu alle Zellen in einem Individuum das exakt gleiche Komplement des DNA-Codes enthalten, müssen höhere Organismen unterschiedliche Muster der Genexpression in den verschiedenen Gewebetypen aufweisen und aufrechterhalten. Die meisten Genregulationen sind vorübergehend, abhängig vom aktuellen Zustand der Zelle und Veränderungen der äußeren Reize. Persistente Regulation hingegen ist eine primäre Rolle der Epigenetik - vererbbare Regulationsmuster, die die grundlegende genetische Codierung der DNA nicht verändern. Die DNA-Methylierung ist die archetypische Form der epigenetischen Regulation; sie dient als stabiles Gedächtnis für Zellen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der langfristigen Identität verschiedener Zelltypen. Kürzlich wurden andere Formen der epigenetischen Regulation entdeckt. Neben der „fünften Base“ 5-Methylcytosin (mC), finden sich eine sechste (5-Hydroxymethylcytosin, hmC), siebte (5-Formylcytosin, fC) und achte (5-Carboxycytosin, cC) (Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937).
Das primäre Ziel der genannten DNA-Modifikationen ist die Zwei-Nukleotidsequenz Cytosin-Guanin (eine ‚CpG Position‘); in diesem Zusammenhang kann Cytosin (C) einer einfachen chemischen Modifikation unterzogen werden, um formyliert, methyliert, hydroxymethyliert oder carboxyliert zu werden. Im menschlichen Genom ist die CG-Sequenz viel seltener als erwartet, außer in bestimmten, relativ dichten Clustern, den sogenannten ,CpG-Inseln‘. CpG-Inseln sind häufig mit Gen-Promotern assoziiert, und es wird geschätzt, dass mehr als die Hälfte der menschlichen Gene CpG-Inseln aufweisen (Antequera und Bird, Proc Natl Acad Sci USA 90: 11995-9, 1993).
Eine abweichende Methylierung der DNA ist häufig mit der Transformation von gesunden zu kanzerogenen Zellen verbunden. Zu den beobachteten Effekten gehören genomweite Hypomethylierung, erhöhte Methylierung von Tumorsuppressorgenen, und Hypomethylierung vieler Onkogene (zusammengefasst, zum Beispiel, von Jones und Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999; Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002; und Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003). Methylierungsprofile wurden als tumorspezifisch erkannt (d.h. Veränderungen im Methylierungsmuster bestimmter Gene oder sogar einzelner CpGs sind diagnostisch für bestimmte Tumorarten), und es gibt jetzt eine umfassende Sammlung an diagnostischen Markern für Blut-, Brust-, Darm-, Speiseröhren-, Magen-, Leber-, Lunge-, und Prostata-Krebs (z.B. zusammengefasst von: Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003).
Für eine der kürzlich beschriebenen Modifikationen des Cytosins, 5-Hyroxymethylierung, wurde der Nutzen einer oxidativen Bisulfit-Sequenzierung zur Kartierung und Quantifizierung von 5hmC in den CpG-Inseln gezeigt (Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937). Hohe Konzentrationen von 5hmC wurden in CpG-Inseln in Verbindung mit Transkriptionsregulatoren und in langgestreckten Kernelementen gefunden. Es wird vermutet, dass sich diese Regionen epigenetischer Reprogrammierung in embryonalen Stammzellen unterziehen können.
WO 2012/162660 beschreibt Verfahren unter Verwendung von DNA-Methylierungs-Assays zur Identifizierung einer Zelle oder eines Zellgemisches und zur Quantifizierung von Veränderungen in der Verteilung der Zellen im Blut oder in Geweben sowie zur Diagnose, Prognose und Behandlung von Krankheiten, insbesondere Krebs. Diese Verfahren verwenden frische und archivierte Proben.
Youngblood et al. (in: Youngblood et al. Chronic virus infection enforces demethylation of the locus that encodes PD-1 in antigen-specific CD8+ T cells. 2011 Sep 23;35(3):400-12) offenbarten, dass die PDCD1 Expression von der Methylierung einer CpG-reichen Region stromaufwärts des Transkriptionsstarts abhängt. Diese Region überschneidet sich mit den zuvor identifizierten konservierten Regionen C und B (CR-C & CR-B) des PDCD1-Gens. Die Methylierung dieses PDCD1 CpG-reichen Lokus korreliert invers mit der PDCD1 mRNA-Expression, und ist somit an der Regulation der Immunantwort beteiligt. Beispielsweise ist der PDCD1-Lokus während der Differenzierung von naiven in Effektor-CD8-T-Zellen als Reaktion auf eine akute Infektion hypomethyliert. Dieses Ereignis löst dann eine erhöhte Expression der PDCD1-mRNA aus. Wenn sich die Effektor-CD8-T-Zellen weiter in funktionale Gedächtnis-Zellen differenzieren, wird der PDCD1-Lokus remethyliert. So bietet die Methylierung von PDCD1 eine Möglichkeit, die Immunantwort über die PDCD1-Expression zu regulieren.
Ferner untersuchten Bally et al. (in: Bally et al. NF-κB regulates PD-1 expression in macrophages. 2015 May 1;194(9):4545-54.) den Methylierungszustand der PDCD1-stromaufwärts-Regionen CR-C und CR-B in Makrophagen. Sie entdeckten keine Veränderungen der Methylierung von PDCD1 nach der LPS-Stimulierung von Knochenmarkderivierten Makrophagen (BMDMs).
Goltz et al. (in: Goltz et al. Promoter methylation of the immune checkpoint receptor PD-1 (PDCD1) is an independent prognostic biomarker for biochemical recurrence-free survival in prostate cancer patients following radical prostatectomy. Oncoimmunology. 2016 Sep 2;5(10):e1221555) zeigten weiterhin, dass der Methylierungszustand des PDCD1-stromaufwärts-Lokus im Vergleich zu normalen Prostataepithel mit Karzinomen korreliert.
Vor diesem Hintergrund ist es Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes und vor allem robusteres Verfahren basierend auf der DNA-Methylierungsanalyse als überlegenes Werkzeug bereitzustellen, um PD1+-Zellen komfortabler und zuverlässiger nachzuweisen, zu identifizieren, zu unterscheiden und zu quantifizieren.
Die vorliegende Erfindung löst das oben genannte Problem durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von PD1+-Zellen in einer Probe, umfassend Analysieren des Methylierungsstatus (Bisulfit-Konvertibilität) von mindestens einer CpG-Position in einer Säuger- (z.B. Mensch) Genregion für Programmed Cell Death 1 (PDCD1), wobei die analysierte Genregion vorzugweise basierend auf/gemäß SEQ ID Nr. 1 positioniert ist, wobei eine Demethylierung der Genregion für eine PD1+-Zelle indikativ ist, wenn diese mit einer nicht-PD1+-Zelle verglichen wird.
Das Programmed Cell Death Protein-1 (PDCD1, auch PD-1 genannt) gehört zur Immunglobulin-Superfamilie und ist ein 288 Aminosäuren langer Zelloberflächen-Rezeptor, der auf einer Vielzahl von Immunzelltypen exprimiert wird. Wichtig ist, dass die Bildung eines Komplexes zwischen PDCD1 und seinem Liganden Programmed death ligand 1 (PD-L1) oder Programmed death ligand 2 (PD-L2) ein inhibitorisches Signal überträgt, das die Proliferation und inflammatorische Aktivität der PDCD1 exprimierenden Zellen reduziert und dadurch die Immunantwort unterdrückt. So ermöglicht die Expression von PDCD1 die regulierte Aktivierung und Expansion von Immunzellen, die für eine effektive adaptive Immunantwort erforderlich sind. Das Gen für humanes PDCD1 befindet sich auf Chromosom 2, 241849881-241858908 reverser Strang; Ensembl-ID: ENSG00000188389.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst die Genregion die gesamte genomische Region, die sich auf PDCD1 bezieht und dieses kodiert. Dazu gehören Enhancer-Regionen, Promoter-Region(en), Introns, Exons und nicht-kodierende Regionen (5'- und/oder 3'-Regionen), die zu PDCD1 gehören. Bevorzugt ist also ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die mindestens eine CpG-Position in der 5'-Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart, der Promoterregion, den 5'- oder 3'- nicht-translatierten Regionen, Exon, Intron, Exon/Intron-Grenzen und/oder in der 3'-Region stromabwärts vom Transkriptionsstopp des analysierten Gens vorhanden ist.
Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf der überraschenden Identifizierung einer Region des PDCD1-Gens durch die Erfinder als spezifischer epigenetischer Marker, der die Identifizierung von PD1+-Zellen, ebenso wie die klinische Routineanwendung dieser Analyse, erlaubt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ermöglicht die genomische Region von PDCD1, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 1, vorzugsweise SEQ ID Nr. 2 (Amp 1876), 3 (Amp 1877) oder 4 (Amp 1878), die Identifizierung von PD1+-Zellen. Überraschenderweise ist das unterscheidende Muster der Bisulfit-konvertierbaren und nicht-konvertierbaren Cytosine für PD1+-Zellen besonders und sogar ausschließlich auf die genomische Region gemäß SEQ ID Nr. 1 beschränkt, wie durch Verwendung des Amplikons gemäß SEQ ID Nr. 1, und insbesondere der Bisulfit-konvertierten Sequenz gemäß der SEQ ID Nr. 12 und/oder 13 (TpG-konvertierten und CpG-konvertierten Sequenz für AMP 1877) gezeigt wird.
Die Erfinder konnten zeigen, dass in PD1+-Zellen die CpG-Motive, wie offenbart, nahezu vollständig demethyliert sind (d.h. zu mehr als 70%, vorzugsweise 80%, vorzugsweise mehr als 90% und am meisten bevorzugt mehr als 95%), wobei die gleichen Motive in PD1-Zellen vollständig methyliert sind.
Die differentielle Methylierung der CpG-Motive innerhalb der zuvor genannten Regionen ist ein wertvolles Werkzeug zur Identifizierung von PD1+-Zellen, wie es benötigt wird/oder zumindest wertvoll ist zur Identifizierung und Quantifizierung dieser Zellen bei Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungen, Krebs, Allergien, primären und sekundären Immundefekten, wie z.B. HIV-Infektionen und AIDS, Graft versus Host (GvH), hämatologischen Malignomen, rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose, oder einem zytotoxischen T-Zell-abhängigen Immunstatus in jedem vorstellbaren diagnostischem Zusammenhang. Der Assay ermöglicht die Messung von PD1+-Zellen ohne Aufreinigung oder Färbeverfahren.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst dann weiterhin eine Quantifizierung der relativen Menge an PD1+-Zellen, basierend auf dem Vergleich der relativen Menge der Methylierungsfrequenz in der analysierten Region mit der relativen Menge der Methylierungsfrequenz in einem Kontrollgen, wie z.B. GAPDH. Diese Quantifizierung wird somit auf der Grundlage des Verhältnisses der Bisulfit-konvertierbaren DNA zur nicht-konvertierbaren DNA in der genetischen Region von PDCD1 (z.B. von SEQ ID Nr. 1), wie hierin beschrieben und analysiert, erreicht. Weiter bevorzugt ist eine Quantifizierung der relativen Menge an PD1+-Zellen, basierend auf einer (vorzugsweise parallelen oder gleichzeitigen) Analyse der relativen Menge an Bisulfit-konvertierbarer DNA der zellspezifischen Region für PDC1 und der relativen Menge an Bisulfit-konvertierbarer DNA der nicht-zellspezifischen Gene (vorzugsweise ausgewählte „Kontrollgene“ oder „Kontrollregionen“, wie z.B. das Gen für GAPDH).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse der Bisulfit-Konvertibilität die Amplifikation mit mindestens einem Primer passender Primerpaare, die basierend auf SEQ ID Nr. 1 geeignet gestaltet werden können, vorzugsweise Oligomere gemäß einer der SEQ ID Nrn. 6 bis 11.
Im Gegensatz zu FACS- und mRNA-Messungen können durch Anwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung die Messung(en) und Analysen unabhängig von der Aufreinigung, Lagerung - und bis zu einem gewissen Grad auch in Bezug auf die Gewebequalität - durchgeführt werden.
Vorzugsweise erfolgt die Amplifikation durch ein Polymerase-Enzym, eine PCR oder eine chemische Amplifikationsreaktion oder andere Amplifikationsverfahren, die dem Fachmann wie nachfolgend beschrieben bekannt sind, d.h. im Rahmen von MSP, HeavyMethyl, Scorpion, MS-SNUPE, MethylLight, Bisulfit-Sequenzierung, methylspezifische Restriktionsassays, und/oder digitalen PCR (siehe, zum Beispiel Kristensen und Hansen PCR-Based Methods for Detecting Single-Locus DNA Methylation Biomarkers in Cancer Diagnostics, Prognostics, and Response to Treatment Clinical Chemistry 55:8 1471-1483 (2009)).
Mit der Amplifikation wird ein Amplikon der PDCD1-Genregion erzeugt, das ein besonders bevorzugtes Werkzeug zur Durchführung des/der Verfahren(s) gemäß der vorliegenden Erfindung ist. Folglich stellen Oligomere gemäß einer der SEQ ID Nrn. 6 bis 11 oder ein amplifiziertes Amplikon unter Verwendung eines Primerpaars basierend auf SEQ ID Nr. 6 und 7 oder 9 und 10, wie hierin erwähnt, eine bevorzugte Ausführung der vorliegenden Erfindung dar. So können die SEQ ID Nrn. 1 bis 4 (und, sofern benötigt, die dazu komplementäre Sequenzen) verwendet werden, um Primer für die Amplifikation zu gestalten, d.h. in der relevanten Sequenz als „beacons“ dienen. Gleichermaßen können zusätzliche Primer und Sonden basierend auf dem Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1 aufgebaut werden. Die Amplifikation kann entweder in der genomischen und/oder der Bisulfit- (d.h. „konvertierten“) DNA-Sequenz erfolgen.
Der Fachmann wird darüber hinaus in der Lage sein, spezifische Untergruppen der CpG-Positionen auszuwählen, um so die Anzahl der zu analysierenden Stellen zu minimieren, beispielsweise mindestens eine der CpG-Positionen, die aus einer CpG-Position in einem Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1 ausgewählt ist, und vorzugsweise aus den CpG-Positionen 27, 47, 82, 136, 194, 197, 249, 285, 290, 303, 336, 354 und 369 im Amplikon 1876 gemäß der SEQ ID Nr. 2, CpG-Positionen 31, 60, 75, 86, 114, 138, 142, 171, 184, 210, 217 und 241 im Amplikon 1877 gemäß der SEQ ID Nr. 3, CpG-Positionen 35, 56, 74, 104, 118, 130, 150, 182, 196 und 212 im Amplikon 1878 gemäß der SEQ ID Nr. 4, und vorzugweise ausgewählt aus den CpG-Positionen 60, 75, 86, 114, 138, 142, 171, 184, 210, 217 und 241 in einem Fragment des Amplikons 1877 gemäß SEQ ID Nr. 3 ausgewählt. Bevorzugt sind Kombinationen aus 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Positionen, deren Analyse ausreichend Daten und/oder Informationen liefert, um im Kontext der vorliegenden Erfindung aussagekräftig zu sein.
Der Fachmann wird darüber hinaus im Stande sein, spezifische Untergruppen der CpG-Positionen auszuwählen, um die Anzahl der zu analysierenden Stellen zu minimieren, beispielsweise mindestens eine der CpG-Positionen 60, 75, 86, 114, 138, 142, 171, 184, 210, 217 und 241 im Amplikon Nr. 1877 der PDCD1-spezifischen Bisulfit-konvertierbaren Region (SEQ ID Nr. 1), oder alle in den Bisulfit-konvertierbaren Region gemäß SEQ ID Nr. 1 vorhandenen Positionen. Eine oder mehrere der Positionen 60 und/oder 138 im AMP 1877 können ausgeschlossen werden.
Um die Bisulfit-Konvertibilität der CpG-Positionen zu analysieren, kann jedes bekannte Verfahren zur Analyse der DNA-Methylierung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse des Methylierungsstatus ein Verfahren ausgewählt aus Methylierungs-spezifischem enzymatischem Verdau, Bisulfit-Sequenzierung, einer Analyse ausgewählt aus Promotermethylierung, CpG-Insel-Methylierung, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE oder anderen Methoden, die auf dem Nachweis amplifizierter DNA beruhen. Diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und finden sich in der entsprechenden Literatur.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren für Routineanwendungen, beispielsweise auf einem DNA-Chip, geeignet. Basierend auf den obigen Informationen und der entsprechenden Literatur kann der Fachmann das obere Verfahren wie oben beschrieben an diese Einstellungen anpassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird dieses Verfahren ohne einen Aufreinigungs- und/oder Anreicherungsschritt der zu identifizierenden Zellen durchgeführt, vorzugsweise durch Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Identifikation eine Unterscheidung der PD1+-Zellen von allen wesentlichen peripheren Blutzelltypen und/oder nicht-Blutzellen, vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf zytotoxische T-Zellen, Granulozyten, Monozyten, B-Zellen, CD56++ NK-Zellen, T-Helfer-Zellen und NKT-Zellen und andere Zelltypen die von anderen Organen als Blut stammen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wird die Probe aus einer Körperflüssigkeit eines Säugers, einschließlich menschlicher Blutproben, oder einem Gewebe, Organ oder einer Probe von Leukozyten oder einer aufgereinigten oder separierten Fraktion eines solchen Gewebes, Organs oder Leukozyten oder einer Zelltypprobe, ausgewählt. Vorzugsweise ist der Säuger eine Maus, Ziege, Hund, Schwein, Katze, Kuh, Ratte, Affe oder Mensch. Die Proben können bei Bedarf entsprechend gepoolt werden.
Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst dann weiter den Schritt des Schlussfolgerns auf den Immunstatus des Säugers, basierend auf den PD1+-Zellen. Die PD1+-Zellen können quantifiziert werden und als Richtwert zur relativen Quantifizierung weiterer detaillierter Unterpopulationen verwendet werden oder sie können als prädiktiver und/oder Screening und/oder diagnostischer und/oder prognostischer und/oder unerwünschter Ereignisfaktor verwendet werden oder sie können verwendet werden, um diese Population schließlich zur Bestimmung des gesamten Immunaktivierungsstatus nachzuweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung leidet der Säuger oder leidet wahrscheinlich an Autoimmunkrankheiten, Transplantatabstoßungen, Infektionskrankheiten, Krebs und/oder Allergien, wie unter anderem an Trypansosoma Cruzi-Infektion, Malaria und HIV-Infektion, hämatologischen Malignomen, wie chronischer myeloischer Leukämie, Multiplem Myelom, Non-Hodgkin-Lymphom, Hodgkin-Krankheit, chronischer lymphatischer Leukämie, Graft versus Host- und Host versus Graft-Krankheit, Mycosis fungoides, extranodalem T-Zell-Lymphom, kutanen T-Zell-Lymphomen, anaplastischem Großzell-Lymphom, Angioimmunoblastisches T-Zell-Lymphom und anderen T-Zell-, B-Zell- und NK-Zell-Neoplasien, T-Zell-Mangel, wie Lymphozytopenie, schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID), Omenn-Syndrom, Knorpel-Haar-Hypoplasie, erworbenem Immundefizienz-Syndrom (AIDS) und Erbkrankheiten, wie DiGeorge-Syndrom (DGS), Chromosomenbruchsyndrom (CBS), Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus Erythematodes, Sjögren-Syndrom, systemische Sklerose, Dermatomyositis, primärer biliärer Zirrhose, primärer sklerosierender Cholangitis, Colitis Ulcerosa, Morbus Crohn, Psoriasis, Vitiligo, bullösem Pemphigoid, Alopecia Areata, idiopathischer dilatativer Kardiomyopathie, Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Basedow, Hashimoto-Thyreoiditis, Myasthenia gravis, IgA-Nephropathie, membranöser Nephropathie und periziöser Anämie; und B-Zell- und T-Zell-Kombinationsstörungen wie Ataxie-Telangiektasien (AT) und Wiskott-Aldrich-Syndrom (WAS); und Karzinomen wie Brustkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberzellkarzinom, Cholangiokarzinom, Melanom sowie Kopf- und Halskrebs.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren wie oben, das weiterhin die Messung und/oder Überwachung der Menge an PD1+-Zellen als Reaktion auf chemische und/oder biologische Substanzen, die dem Säuger verabreicht werden, d.h. als Reaktion auf eine Behandlung des Patienten, umfasst. Das Verfahren umfasst die Schritte wie oben und den Vergleich der relativen Menge der identifizierten Zellen mit einer früher oder gleichzeitig genommenen Probe von demselben Säuger und/oder mit einer Kontrollprobe. Basierend auf den Ergebnissen wie erhalten durch die/das Verfahren der Erfindung, kann der behandelnde Arzt auf den Immunstatus des Patienten schließen und eine Behandlung der zugrunde liegenden Erkrankung anpassen.
Vorzugsweise wird das Verfahren ohne einen Schritt der Aufreinigung und/oder Anreicherung von Zellen durchgeführt, vorzugsweise durch Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe oder jeder anderen biologischen Probe, die potentiell die PD1+-Zellen enthält, wie z.B. einer Probe für den Zelltransfer in einen Patienten.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren wie oben, das weiterhin die Formulierung der identifizierten PD1+-Zellen für die Transplantation in einen Patienten umfasst. Pharmazeutische Präparate für diese Zwecke und Verfahren zu ihrer Herstellung werden nach den bekannten Verfahren in der Transplantationsmedizin durchgeführt.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Oligomer gemäß einer der SEQ ID Nrn. 6 bis 11, oder ein Amplikon gemäß SEQ ID Nrn. 2 bis 5.
Noch ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Kit zur Identifizierung, Quantifizierung, und/oder Überwachung von PD1+-Zellen in einem Säuger, basierend auf der Analyse der Bisulfitzugänglichkeit von CpG-Positionen in der Genregion von PDCD1, umfassend Komponenten zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der hier beschriebenen Erfindung, insbesondere ein Kit, umfassend a) ein Bisulfitreagenz und b) Materialien zur Analyse des Methylierungsstatus der CpG-Positionen ausgewählt aus den CpG-Positionen in der Region gemäß SEQ ID Nr: 1, wie etwa ein Oligomer ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nrn. 6 bis 11.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Oligomeren oder Amplikons, oder eines Kits gemäß der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung und/oder Überwachung der PD1+-Zellen in einem Säuger, wie hier beschrieben.
Wie bereits erwähnt wurden kürzlich drei neue Cytosin-Modifikationen entdeckt. Deshalb wird erwartet, dass zukünftige wissenschaftliche Erkenntnisse die in der Vergangenheit beschriebenen epigenetischen Modifikationsmuster korrigieren. Diese bisherigen Muster der Cytosin-Modifikationen umfassen Bisulfit-konvertierbares (nicht-methyliertes, nicht-modifiziertes) und nicht-konvertierbares (methyliertes, modifiziertes) Cytosin. Beide Termini müssen wie beschrieben korrigiert werden. Nach den neueren wissenschaftlichen Erkenntnissen (i) umfasst nicht-konvertierbares Cytosin 5-Methylcytosin (mC) und 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), und (ii) Bisulfit-konvertierbares (d.h. die „Bisulfit-Konvertibilität“) Cytosin 5-Formylcytosin (fC), 5-Carboxycytosin (cC), ebenso wie nicht modifiziertes Cytosin.
Zusätzlich basieren die bisherigen Erfindungen auf i) dem Verhältnis von Bisulfitkonvertierbarem Cytosin zur gesamten Chromatinmenge (Zelltyp-unabhängiger, 100 % Bisulfit-konvertierbarer DNA-Lokus) oder ii) auf dem Verhältnis von Bisulfitkonvertierbarem Cytosin (fC, cC, nicht-modifiziertes Cytosin) und nicht-Bisulfitkonvertierbarem Cytosin (hmC und mC). Diese Verhältnisse charakterisieren Zelltyp, Zelldifferenzierung, Zellstadium sowie pathologische Zellstadien. Daher werden neue Techniken zu neuartigen spezifischeren Ergebnisse führen und könnten aktuelle zellspezifische, Zellstadium-spezifische sowie pathologische Muster epigenetischer Modifikationen ergänzen und somit potenzielle neue Biomarker definieren. Es können neue Verhältnisse, die als Biomarker bestimmt werden sollen, definiert werden als: $Biomarker Verhältnis = a / b$

a = ∑ (C und/oder mC und/oder hmC und/oder fC und/oder cC)
b = ∑ (C und/oder mC und/oder hmC und/oder fC und/oder cC),

Für die Zwecke der Definition für die vorliegende Anwendung beziehen sich „epigenetische Modifikationen“ in der DNA-Sequenz durch die Terminologie auf (i) Bisulfit-konvertierbares Cytosin (5-Formylcytosin, (fC) und/oder 5-Carboxycytosin (cC)) und (ii) nicht-Bisulfit-konvertierbares Cytosin ((einschließlich 5-Methylcytosin (mC), 5-Hydroxymethylcytosin, (hmC)). Da beide Methylierungsarten, mC und hmC, nicht Bisulfit-konvertierbar sind, ist es nicht möglich, zwischen diesen beiden zu unterscheiden. Ebenso sind fC, cC und nicht-modifiziertes Cytosin Bisulfit-konvertierbar und können auch nicht voneinander unterschieden werden. Die Bezeichnung „methylierte“ DNA umfasst sowohl mC als auch hmC. Die Bezeichnung „nicht-methylierte“ DNA umfasst fC, cC, und nicht-modifizierte DNA. Es wird erwartet, dass in Zukunft neue Varianten von DNA-Modifikationen entdeckt werden. Jede Art der Modifikation wird entweder Bisulfit-konvertierbar sein oder nicht. Da die vorliegende Erfindung jedoch zuverlässig zwischen den beiden Gruppen unterscheidet, werden diese neuartigen Modifikationen auch als Marker einsetzbar sein.
Darüber hinaus werden neben den DNA-Modifikationen auch Histone post-translational modifiziert, die die Interaktion mit der DNA und nuklearen Proteinen verändern. Zu den Modifikationen gehören Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, Sumoylierung, Citrullinierung und ADP-Ribosylierung. Der Kern der Histone H2A, H2B und H3 kann ebenfalls modifiziert werden. Histon-Modifikationen sind an verschiedenen biologischen Prozessen, wie der Genregulation, DNA-Reparatur, Chromosomenkondensation (Mitose) und Spermatogenese (Meiose) beteiligt. Auch für diese Modifikationen ist ein spezifisches Modifikationsmuster spezifisch für verschiedene Zelltypen, Zellstadien, Differenzierungsstatus und ein solches Muster kann analysiert werden für Bisulfit-Konvertibilität oder ähnliche Verfahren, um bestimmte Zellen und Zellstadien zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung dieser Modifikationen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Erfinder unter Verwendung der genetischen Region PDCD1 und insbesondere des hier beschriebenen Amplikons als Marker sehr spezifisch PD1+-Zellen und in ihrem Verhältnis zu anderen Zelltypen in einer Probe, zum Beispiel zu anderen Blutzellen, identifiziert, quantifiziert und besonders unterschieden haben.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren und das Sequenzprotokoll näher beschrieben, ohne darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden alle hier zitierten Referenzen in ihrer Gesamtheit aufgenommen.

1 zeigt die Analyse der CpG-Positionen auf den Amplikons Nrn. 1876, 1877, und 1878 (entsprechend SEQ ID Nrn. 2 bis 4) gemäß der Erfindung. Die horizontalen Kästchen in der Tabelle entsprechen den CpG-Positionen im analysierten Amplikon (z.B. CpG 1, 2, etc.) mit den angegebenen Positionen (AMP1876:27 entsprechend CpG 1 von Amplikon 1876 ...etc.), und die Spalten entsprechen den analysierten Zelltypen.
2 zeigt die Spezifizität des TpG-spezifischen PCR-Systems gemäß der Erfindung unter Verwendung von Test-Templates (Plasmid-DNA).
3 zeigt die genomische Region der Amplikons gemäß der vorliegenden Erfindung, Amplikon-Sequenzen sind unterstrichen.
4 zeigt die Positionen der Amplikons der Erfindung im Genom.

SEQ ID Nr. 1 zeigt die genomische Region der Amplikons mit Nrn. 1876, 1877, 1878, und 1879 gemäß der vorliegenden Erfindung (siehe 3).
SEQ ID Nrn. 2 bis 5 zeigen die Sequenzen der entsprechenden Amplikons 1876, 1877, 1878, und 1879.
SEQ ID Nrn. 6 bis 11 zeigen die Sequenzen der spezifischen Oligomere (Primer und Sonden) gemäß der vorliegenden Erfindung.
SEQ ID Nrn. 12 bis 13 zeigen die TpG-konvertierten und CpG-konvertierten Sequenzen entsprechend des AMP1877 der Erfindung.
BEISPIELE
Beispiel 1
Um PD1+-Zellen zu identifizieren, wurde eine qPCR mit Bisulfit-konvertierten Proben aus dem humanen Genombereich entsprechend der Sequenz SEQ ID Nr. 1 (siehe 3) durchgeführt, insbesondere den Regionen AMP 1876, AMP 1877, AMP 1878, und AMP 1879 (unterstrichen).
Für die eigentliche epigenetische Profilerstellung der Amplikon-Region in Blutzell-Subtypen wurden die Immunzellpopulation wie in 1 gezeigt analysiert.
Die Bisulfit-konvertierten Zielregionen des bevorzugten qPCR-Assay-Systems wurden wie folgt entwickelt:

1877 Primer (qPCR30 FW_T) - GTTTAGATTAGATTTGGTATTTTTGATT (SEQ ID Nr: 6) qPCR30_RV_T - CAAATCCTCTAAAAACAAACTCA (SEQ ID Nr: 7) qPCR30 Sonde_T und C: - TCCCAACACAACCCATAAAACAATTTC (SEQ ID Nr: 8) qPCR30_FW_C - AGATTAGATTCGGTATTTTTGATCG (SEQ ID Nr: 9) qPCR30_RV_C - CAAATCCTCTAAAAACAAACTCG (SEQ ID Nr: 10) qPCR30_P_C - CCCAACACAACCCGTAAAACGATTTC (SEQ ID Nr: 11)
1877-TpG-konvertiert (SEQ ID Nr: 12) TTaggtTTtTtagggaTaagTtTgTtgtTTtTatTTTagTaTagTTTgtgggaTggtttTTttgtTTTtaatgggaTT aTggtTagagatgTTgggtTtggtTtgggTTagTaggttTTtTTgTTTggggTaggTagTTttTttTtgtgTgTttTt ggaaagTaatgtTTtgtaatgTggtTtTtTtgTgggagTaTTTTTaTTgTTaTTtTaTaggTTtgttTTaTagTTT TgggatgggTtTtgtTtTTTtTTtgaTTTtgT
1877 -CpG-konvertiert (SEQ ID Nr: 13) TTaggtTTtTtagggaTaagTtCgTtgtTTtTatTTTagTaTagTTCgtgggaCggtttTTttgtTTTtaatgggaTT aCggtTagagatgTCgggtTtggtTtgggTTagTaggttTTtTCgTTCggggTaggTagTTttTttTtgtgCgTttTt ggaaagTaatgtTTtgtaatgCggtTtTtTtgCgggagTaTTTTTaTCgTTaTTtTaTaggTTtgttTTaTagTTT CgggatgggTtTtgtTtTTTtTTtgaTTTtgT

Die Spezifität des TpG-spezifischen PCR-System wurde anhand von Test-Templates (Plasmid-DNA) demonstriert, wie in 2 dargestellt.

Die Zelltyp-Spezifität (gemessen mittels qPCR) wurde wie folgt ermittelt (Tabelle 1):

Zelltyp	Beschreibung	Demethylierung (%)
T-Helfer-Zellen	CD3+CD4+	4.7
Zytotoxische T Zellen	CD3+CD8+	0.8
NK Zellen	CD56+	0.1
Granulozyten	CD15+	0.7
Monozyten	CD14+	0.4
B-Zellen	CD19+	0.3
TFH-Zellen	CD3+CD4+CXCR5+Bcl+PD1+	76.6

Claims

Verfahren zur Identifizierung von PD1+-Zellen in einer Probe, umfassend das Analysieren des Methylierungsstatus von mindestens einer CpG-Position in der Säuger-Genregion für Programmed cell death 1 (PDCD1), wobei vorzugsweise die analysierte Genregion gemäß der SEQ ID Nr. 1 positioniert ist, wobei eine Demethylierung oder fehlende Methylierung der Genregion für eine PD1+-Zelle im Vergleich zu einer nicht-PD1+-Zelle indikativ ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine CpG-Position in der 5'-Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart, der Promotorregion, den 5'- oder 3'- nicht-translatierten Regionen, Exon, Intron, Exon/Intron-Grenze und/oder in der 3'-Region stromabwärts vom Transkriptionsstop der analysierten Genregion vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine CpG-Position ausgewählt ist aus einem CpG der CpG-Positionen 27, 47, 82, 136, 194, 197, 249, 285, 290, 303, 336, 354 und 369 im Amplikon 1876 gemäß SEQ ID Nr. 2, CpG-Positionen 31, 60, 75, 86, 114, 138, 142, 171, 184, 210, 217 und 241 im Amplikon 1877 gemäß SEQ ID Nr. 3, CpG-Positionen 35, 56, 74, 104, 118, 130, 150, 182, 196 und 212 im Amplikon 1878 gemäß der SEQ ID Nr. 4, und ist vorzugsweise ausgewählt aus den CpG-Positionen 60, 75, 86, 114, 138, 142, 171, 184, 210, 217 und 241 in einem Fragment des Amplikons 1877 gemäß der SEQ ID Nr. 3.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Analyse der Bisulfit-Konvertibilität ein Verfahren ausgewählt aus Methylierungs-spezifischen enzymatischen Verdau, Bisulfitsequenzierung, einer Analyse ausgewählt aus Promotermethylierung, CpG-Inselmethylierung, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE, und anderen Verfahren, die auf dem Nachweis amplifizierter DNA beruhen, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter umfassend eine Quantifizierung der relativen Menge an PD1+-Zellen basierend auf einem Vergleich der relativen Mengen der Methylierungsfrequenz in der analysierten Region, mit relativen Menge der Methylierungsfrequenz in einem Kontrollgen, wie zum Beispiel GAPDH.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Probe aus einer Körperflüssigkeit eines Säugers, einschließlich menschlicher Blutproben, oder einer Gewebe-, Organ- oder Zelltyp-Blutprobe, einer Probe von Blutlymphozyten oder einer Fraktion davon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiter umfassend die Unterscheidung von PD1+-Zellen von allen oder mindestens einem der Zelltypen, ausgewählt aus PD1-follikulären-Zellen, zytotoxischen T-Zellen, Granulozyten, Monozyten, B-Zellen, CD56++ NK-Zellen, T-Helfer-Zellen, und NKT-Zellen und anderen Zelltypen, die von anderen Organen als Blut stammen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren ohne einen Schritt der Aufreinigung und/oder Anreicherung der zu identifizierenden Zellen durchgeführt wird, vorzugsweise unter Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiter umfassend den Schritt des Schlussfolgerns auf den Immunstatus des Säugers basierend auf den identifizierten PD1+-Zellen.
Verfahren zu Überwachung der Menge an PD1+-Zellen in einem Säuger, umfassend die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 5 bis 9, und weiterhin einen Vergleich der relativen Menge der identifizierten Zellen mit einer früher oder gleichzeitig genommenen Probe aus demselben Säuger, und/oder mit einer Kontrollprobe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, weiter umfassend das Messen und/oder Überwachen der Menge der PD1+-Zellen als Reaktion auf chemische und/oder biologische Substanzen, die dem Säuger verabreicht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Säuger an Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungen, Infektionskrankheiten, Krebs, und/oder Allergien leidet oder wahrscheinlich daran leidet.
Kit zur Identifizierung, Quantifizierung, und/oder Überwachung von PD1+-Zellen in einem Säuger, basierend auf der Analyse der Bisulfit-Zugänglichkeit von CpG-Positionen in der Genregion von PDCD1, umfassend Komponenten zur Durchführung eines Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, insbesondere ein Kit umfassend a) ein Bisulfitreagenz und b) Materialien zur Analyse des Methylierungsstatus von CpG-Positionen, ausgewählt aus den CpG-Positionen in der Region gemäß SEQ ID Nr: 1, sowie ein Oligomer, ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nrn: 6 bis 11.
Oligomer gemäß einer der SEQ ID Nrn. 6 bis 11 oder Amplikon gemäß SEQ ID Nrn. 2, 3, 4 oder 5.
Verwendung des Kits nach Anspruch 13, oder des Oligomers oder Amplikons gemäß Anspruch 14 zur Identifizierung, Quantifizierung und/oder Überwachung von PD1+-Zellen in einem Säuger.