JP6224631B2

JP6224631B2 - Ｃｄ３ｃｄ４陽性ｔリンパ球の同定用のエピジェネティックマーカー

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Publication number: JP6224631B2
Application number: JP2014561342A
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Inventors: オレク，スフェン
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Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2013-02-14
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Description

本発明は、配列番号１によるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化バイサルファイト変換性領域における少なくとも１つのＣｐＧ位置のバイサルファイト変換性を分析することを含み、その試料における少なくとも１つのＣｐＧ位置の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは少なくとも９５％のバイサルファイト変換性がＣＤ４^＋Ｔリンパ球細胞、特にＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔリンパ球細胞の指標となる、哺乳動物のＣＤ３ＣＤ４陽性Ｔリンパ球を同定する方法、特にｉｎｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明は、全血においてＣＤ４発現細胞を確実に同定することが可能であり、ＣＤ４陽性ＣＤ３陽性細胞とＣＤ８陽性ＣＤ３陽性細胞とを分離する遺伝子ＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のバイサルファイト変換性の分析に更に関する。さらに、本発明は、上記の方法の実行用のキット及びそのそれぞれの使用に関する。

さらに、本発明は、上記の方法の実行用のキット及びそのそれぞれの使用に関する。本発明の一目的は、哺乳動物の任意の固形臓器若しくは組織内の血液又は任意の体液のＴリンパ球の特定のサブセットを定量的に検出及び測定する、新規のより確実な手段を提供することである。この方法を利用することによって、本発明者らは、ＣＤ４Ｔリンパ球を決定、定量及び定期的に測定する新規のこれまで知られていなかった手段を提供する。

Ｔリンパ球は哺乳動物免疫系の主要な成分である。ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の両方が上記免疫系の適切な機能に関与する。ＣＤ８Ｔ細胞は細胞傷害性免疫防御を調節するが、ＣＤ４細胞（いわゆるヘルパーＴ細胞）は、体液性免疫防御及び細胞性免疫防御の両方を補助する。

ＣＤ４（分化抗原群４）は、ヘルパーＴ細胞、単球、マクロファージ及び樹状細胞の表面上に発現される糖タンパク質である。ヒトにおいては、ＣＤ４タンパク質はＣＤ４遺伝子によってコードされる。

高等生物は、個体のほとんどの細胞がＤＮＡコードの全く同じ相補体を含有するにもかかわらず、様々な組織型において異なるパターンの遺伝子発現を行い、維持する必要がある。大抵の遺伝子調節は細胞の現状に応じた一時的なものであり、外部刺激によって変化する。一方で、持続的な調節は、エピジェネティクス（ＤＮＡの基本的な遺伝コードを変更しない遺伝的な調節パターン）の基本的法則（role）である。ＤＮＡメチル化は後成的調節の典型的な形態であり、安定な細胞記憶として機能し、様々な細胞型の長期同一性を維持するうえで重要な役割を果たす。近年、後成的調節の他の形態が発見された。「５番目の塩基」である５−メチルシトシン（ｍＣ）に加えて、６番目の塩基（５−ヒドロキシメチルシトシン、ｈｍＣ）、７番目の塩基（５−ホルミルシトシン、ｆＣ）及び８番目の塩基（５−カルボキシシトシン、ｃＣ）を見出すことができる（非特許文献１）。

したがって、本願の定義を目的として、ＤＮＡ配列における後成的修飾は、（ｉ）非バイサルファイト変換性シトシン（５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含む）及び（ｉｉ）バイサルファイト変換性シトシン（５−ホルミルシトシン（ｆＣ）及び／又は５−カルボキシシトシン（ｃＣ））という専門用語で称される。どちらの種のメチル化、すなわちｍＣ及びｈｍＣもバイサルファイト変換性でないことから、これらの２つを区別することは可能ではない。同様に、ｆＣ、ｃＣ及び非修飾シトシンはバイサルファイト変換性であるが、同じく互いを区別することはできない。メチル化ＤＮＡという用語はｍＣ及びｈｍＣを包含する。非メチル化ＤＮＡという用語はｆＣ、ｃＣ及び非修飾ＤＮＡを包含する。

ＤＮＡ修飾の新規の変形が今後発見されることが更に予想される。いずれのタイプの修飾もバイサルファイト変換性又は非変換性である。しかしながら、本方法によってこれら２つの群を確実に区別することができることから、これらの新規の修飾も本発明による方法に使用可能である。

上述のＤＮＡ修飾の主要な標的は、２ヌクレオチド配列であるシトシン−グアニン（「ＣｐＧ部位」）であり、この状況でシトシン（Ｃ）は簡単な化学修飾を受けてホルミル化、メチル化、ヒドロキシメチル化又はカルボキシル化し得る。ヒトゲノムにおいては、ＣＧ配列は、「ＣｐＧアイランド」と呼ばれる或る特定の比較的密なクラスター以外については予想されるよりもはるかに稀である。ＣｐＧアイランドは遺伝子プロモーターと関連することが多く、半数を超えるヒト遺伝子がＣｐＧアイランドを有すると推定されている（非特許文献２）。

異常なＤＮＡメチル化は、しばしば健常細胞から癌性細胞への形質転換を伴う。観察される影響には、ゲノム規模での低メチル化、腫瘍抑制遺伝子のメチル化の増大及び多くの癌遺伝子の低メチル化がある（例えば非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５に概説される）。メチル化プロファイルは腫瘍特異的である（すなわち、特定の遺伝子又は更には個々のＣｐＧのメチル化パターンの変化は、特定の腫瘍型の診断に用いられる）ことが認識されており、現在では、膀胱がん、乳がん、結腸がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、肺がん及び前立腺がんの大規模な診断マーカー群が存在する（例えば非特許文献５に要約される）。

近年記載されているシトシンの修飾の１つである５−ヒドロキシメチル化については、ＣｐＧアイランドの５ｈｍＣをマッピング及び定量する酸化バイサルファイトシークエンシングの有用性が示されている（非特許文献１）。高レベルの５ｈｍＣが、転写調節因子と関連するＣｐＧアイランド及び長鎖散在反復配列（long interspersed nuclear elements）に見られた。これらの領域が胚性幹細胞において後成的リプログラミングを受ける可能性があることが示唆されている。

特許文献１には、細胞、組織又は核から単離したＤＮＡのメチル化パターンについての情報を収集することと、得られた情報を分析することとを含む、細胞、組織又は核を同定する方法が記載されている。

特許文献２は、Ｔ細胞の亜群を記載しており、それらを調節性Ｔ細胞として規定する調節性Ｔ細胞の特徴に関する。該出願には、かかるＴ細胞、かかるＴ細胞を含む組成物及び免疫応答調節の際にかかるＴ細胞を動員するケモカインの使用も記載されている。

最後に、特許文献３には、遺伝子ＦＯＸＰ３、又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、哺乳動物のＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞、好ましくはＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋調節性Ｔ細胞を同定する方法、特にｉｎｖｉｔｒｏ方法、並びに調節性Ｔ細胞の検出及び品質保証及び制御のための、転写因子ＦＯＸＰ３の遺伝子のＤＮＡメチル化分析の使用が記載されている。

上述のように、近年、３つの新たなシトシン修飾が発見された。したがって、更なる科学的所見によってこれまでに記載された修飾の後成的パターンが訂正され、覆されることが予想される。これらの過去のシトシン修飾のパターンは、バイサルファイト変換性（非メチル化、非修飾）及び非変換性（メチル化、修飾）シトシンを包含する。新規の科学的所見によると、（ｉ）非バイサルファイト変換性シトシンが５−メチルシトシン（ｍＣ）及び５−ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を包含し、（ｉｉ）バイサルファイト変換性シトシンが５−ホルミルシトシン（ｆＣ）、５−カルボキシシトシン（ｃＣ）及び非修飾シトシンを包含するため、両方の語を再定義及び訂正する必要がある。

さらに、これまでの発明は、（ｉ）全クロマチン量（細胞型に依存しない、１００％のバイサルファイト変換性ＤＮＡ遺伝子座）に対するバイサルファイト変換性シトシンの比率、又は（ｉｉ）非バイサルファイト変換性シトシン（ｈｍＣ及びｍＣ）に対するバイサルファイト変換性シトシン（ｆＣ、ｃＣ、非修飾シトシン）の比率に基づく。これらの比率は細胞型、細胞分化、細胞段階及び病的細胞段階を特徴付ける。したがって、新たな技法は新規のより具体的な比率をもたらし、現在の細胞特異的、細胞状態特異的及び病理学的な後成的修飾のパターンを補完し、それにより潜在的な新規のバイオマーカーを規定し得る。バイオマーカーとして発見される新規の比率は以下のように規定することができる：
バイオマーカー比＝ａ／ｂ
ａ＝Σ（Ｃ及び／又はｍＣ及び／又はｈｍＣ及び／又はｆＣ及び／又はｃＣ）
ｂ＝Σ（Ｃ及び／又はｍＣ及び／又はｈｍＣ及び／又はｆＣ及び／又はｃＣ）
ここでａ及びｂは１種〜４種の修飾が互いに異なる。新規のＤＮＡ修飾の発見はこの数（enumeration）を拡大する。

本願の定義を目的として、ＤＮＡ配列における「後成的修飾」は、（ｉ）バイサルファイト変換性シトシン（５−ホルミルシトシン（ｆＣ）及び／又は５−カルボキシシトシン（ｃＣ））及び（ｉｉ）非バイサルファイト変換性シトシン（５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含む）という専門用語で称される。どちらの種のメチル化、すなわちｍＣ及びｈｍＣもバイサルファイト変換性でないことから、これらの２つを区別することは可能ではない。同様に、ｆＣ、ｃＣ及び非修飾シトシンはバイサルファイト変換性であるが、同じく互いを区別することはできない。「メチル化」ＤＮＡという用語はｍＣ及びｈｍＣを包含する。「非メチル化」ＤＮＡという用語はｆＣ、ｃＣ及び非修飾ＤＮＡを包含する。ＤＮＡ修飾の新規の変形が今後発見されることが更に予想される。いずれのタイプの修飾もバイサルファイト変換性又は非変換性である。しかしながら、本方法によってこれら２つの群を確実に区別することができることから、これらの新規の修飾もマーカーとして使用可能である。

さらに、ＤＮＡの修飾とは別に、ヒストンもＤＮＡ及び核タンパク質との相互作用を変化させる翻訳後修飾を受ける。修飾はメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、シトルリン化及びＡＤＰリボシル化を含む。ヒストンのコアであるＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ及びＨ３も修飾され得る。ヒストン修飾は遺伝子調節、ＤＮＡ修復、染色体凝縮（有糸分裂）及び精子形成（減数分裂）等の多様な生物学的プロセスで作用を示す。これらの修飾についても、特定の修飾パターンが異なる細胞型、細胞段階、分化状態に特異的であり、かかるパターンは或る特定の細胞及び細胞段階を同定するためにバイサルファイト変換性又は同様の方法で分析することができる。本発明はこれらの修飾の使用も包含する。

欧州特許第１２１３３６０号国際公開第２００４／０５０７０６号欧州特許第１８２６２７９号

Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosineand 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol.336 no. 6083 pp. 934-937 Antequera and Bird, Proc Natl Acad Sci USA 90: 11995-9, 1993 Jones and Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999 Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002 Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003

ＣＤ４細胞の測定及び決定は概して容易であり、通常は細胞表面上の上記抗原の発現を分析することによって臨床的に達成されるが、その発現がＣＤ４^＋Ｔ細胞のみに特異的ではないことから、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を特異的に検出、同定、識別及び定量することは依然として困難である。したがって、ＣＤ４^＋ヘルパーＴリンパ球の検出は所望されているが、特に日常的適用にとって問題をはらんでいる。

上記を鑑みると、ＣＤ４^＋Ｔリンパ球をより便利かつ確実に検出、同定、識別及び定量するための優れた手段（tool）として、シトシンのバイサルファイト変換性分析に基づく改善された、特に確実な方法を提供することが本発明の一目的である。

本発明は、哺乳動物、特に哺乳動物に由来する試料においてＣＤ４^＋ヘルパーＴリンパ球を同定する方法であって、配列番号１によるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化バイサルファイト変換性領域における少なくとも１つのＣｐＧ位置のバイサルファイト変換性を分析することを含み、上記試料における少なくとも１つのＣｐＧ位置の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは少なくとも９５％のバイサルファイト変換がＣＤ４^＋Ｔリンパ球細胞、特にＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔリンパ球細胞の指標となる、方法を提供することによって上記の目的を解決するものである。

本発明は、特異的エピジェネティックマーカーとしてのＣＤ４遺伝子の領域の同定によって、上記のマーカーの分析の臨床的な日常的適用が非常に容易となり得るという本発明者らの驚くべき発見に基づく。本発明において、このゲノム領域（配列番号１を参照されたい）は、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化バイサルファイト変換性領域と表される。驚くべきことに、バイサルファイト変換性及び非変換性シトシンの差別的パターンは、単位複製配列１２５５番及び１９９９番〜２００１番で表され、示されるこのゲノム領域（配列番号１による）のみに限定される。結果として、５’末端（ＡＭＰ３２番、３３番、１９８０番）及び３’末端（ＡＭＰ１９８１番、１９８２番）のいずれかで領域の直接外側に位置する単位複製配列（ＡＭＰ）は、差別的シトシン修飾パターンを示さない。したがって、本発明者らは、ＡＭＰ１２５５番及び１９９９番〜２００１番を含む高度にＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞特異的なシトシン調節領域を同定した。本発明において、「バイサルファイト変換性」は、元の配列中のメチル化されていない（及び／又は別の形で本明細書に記載のように修飾された）、したがって好ましい実施の形態ではバイサルファイト変換されたシトシンの代わりのチミジン塩基（「Ｔ」）に対する、元のゲノム配列中のメチル化された（及び／又は別の形で本明細書に記載のように修飾された）シトシン塩基（「Ｃ」）を検出するための個々の及び／又は幾つかのシトシン修飾の分析の両方を含む。

ＦＡＣＳ及びｍＲＮＡ測定とは対照的に、それぞれの測定（複数の場合もあり）は精製、貯蔵、更には相当程度組織品質に依存せずに行うことができる。

本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置は、配列番号２による単位複製配列１２５５番、配列番号３による１９９９番、配列番号４による２０００番及び配列番号５による２００１番の群から選択される単位複製配列に存在する。

本発明による方法の別の好ましい実施の形態では、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置は、配列番号２による単位複製配列１２５５番の位置２６、８１、２７４、３３５、３４１及び３７４、配列番号３による単位複製配列１９９９番の位置４２、６０、１５１、２５９、２６２、２９９及び３１２、配列番号４による単位複製配列２０００番の位置６６、８４、１７５、２８３、２８６、３２３及び３３６、並びに配列番号５による単位複製配列２００１番の位置４５、５３、９６、１２５、１３３、１６３、２０５、２５９、２６３、３４５、３４９及び３８２から選択される。

発明概念は、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球におけるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な領域の特異的なバイサルファイト変換性（好ましくは脱メチル化又は非メチル化）に基づく。単純かつ正確な定量ＰＣＲ方法を用いて、本発明者らはＣＤ４遺伝子領域の特定のシトシン修飾パターンが血液又は組織中のＣＤ４Ｔリンパ球数の特異的マーカーとなることを示す。好ましい一実施の形態では、非常に良好な一領域は、ＣＤ４^＋を発現する細胞を他の全ての細胞と比較した際に異なる、ひいては差別的な（differentiating）バイサルファイト変換性を示す配列番号１によるヌクレオチド配列で表される。

本発明者らは、ＣＤ４^＋細胞においてＣｐＧモチーフがほぼ完全に（すなわち７０％を超えて、好ましくは８０％、好ましくは９０％を超えて、最も好ましくは９５％を超えて）バイサルファイト変換性である一方で、全てのＣＤ４⁻細胞においては同じモチーフが完全にメチル化されていることを実証することができた。したがって、ＣＤ４遺伝子座のバイサルファイト変換性の決定は、ヘルパーＴ細胞を同定するうえで有益な手段となり得、例えば任意の想定され得る診断状況下での自己免疫疾患、移植片拒絶反応、がん、アレルギー、原発性免疫不全及び続発性免疫不全、例えばＨＩＶ感染及びＡＩＤＳ、又はヘルパーＴ細胞関連免疫状態においてヘルパーＴ細胞を測定するのに必要とされるか、又は少なくとも幾らか有用であり得る。このアッセイは、精製又は任意の染色手順なしにヘルパーＴ細胞の測定を可能にする。固形腫瘍又は他の固形組織において、上記領域中のバイサルファイト変換性細胞の数も更に報告され、それによりＣＤ４陽性腫瘍浸潤Ｔリンパ球の総量が示される。

本発明者らは、全ての主要な末梢血細胞型について試験し、非血液細胞を選択したところ、ヒトのＣＤ４遺伝子座でのバイサルファイト変換性がヘルパーＴ細胞に限定されることを見出した。これらのデータによって、ＣＤ４遺伝子座における後成的修飾が、ＣＤ４の発現にかかわらず、Ｔリンパ球の表現型を有する細胞の同定に対する有益なマーカーとなることが示された。

本発明による方法の別の好ましい態様では、ＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２、又はＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８の遺伝子の少なくとも１つのバイサルファイト変換性を分析する。このため、これらの遺伝子のバイサルファイト変換性のパターンによって、全てのＣＤ４陽性Ｔリンパ球の明確な同定も可能となる。したがって、本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置は、ＣＤ３及び／又はＣＤ８、特にＣＤ８βの遺伝子（複数の場合もあり）、又はＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２、若しくはＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８の遺伝子内の転写開始部位、プロモーター領域、イントロン、及び／又はエクソン／イントロン境界より上流の５’領域に存在する。

同様に、ＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８によって、全血においてＣＤ４発現細胞を確実に同定することが可能である。

本発明による方法の別の好ましい態様は次に、検出されるＣＤ４Ｔ細胞の相対量をＣＤ３Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、ＧＡＰＤＨ、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ、ＮＫＴ及びＮＫ、最も好ましくはＣＤ３Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ及びヘルパーＴ細胞と比較する工程を更に含む。この工程を用いると、診断上及び治療上有用なマーカー及びそれぞれの細胞の比率を、ＣＤ３Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、ＧＡＰＤＨ、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ、ＮＫＴ及びＮＫの細胞特異的遺伝子から選択される遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のバイサルファイト変換性の分析に基づいて決定及び確立することができる。ＣＤ４及びＣＤ３、ＣＤ−４及びＣＤ−８、ＣＤ−４及び制御性Ｔ細胞マーカー、ＣＤ−４／ヘルパーＴ細胞マーカーの比率が好ましい。

本発明による方法の別の好ましい態様は、Ｔリンパ球の検出及び品質保証及び制御のための遺伝子ＣＤ３、又はＳＬＡ２、ＣＨＲＮＡ３、Ｃ１６ｏｒｆ２４、ＬＣＫ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７、ＳＩＴ１、ＩＬ３２、ＣＸＣＲ６、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＲＡＰ２、ＩＴＧＢ７及びＴＸＫ、又はＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２、又はＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８のシトシン修飾の分析の使用に関する。

本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記バイサルファイト変換性の分析は、配列番号１に基づいて好適に設計することのできる好適なプライマー対の少なくとも１つのプライマー、好ましくは配列番号６〜配列番号１３のいずれかによるオリゴマーを用いた増幅を含む。

好ましくは、例えばＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ、ＭＳ−ＳＮＵＰＥ、ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ、バイサルファイトシークエンシング、メチル特異的制限アッセイ及び／又はデジタルＰＣＲ（例えば、Kristensen and Hansen PCR-Based Methods for DetectingSingle-Locus DNA Methylation Biomarkers in Cancer Diagnostics, Prognostics, andResponse to Treatment Clinical Chemistry 55:8 1471–1483 (2009)を参照されたい）の状況における増幅には、ポリメラーゼ酵素、ＰＣＲ増幅反応若しくは化学的増幅反応、又は下に記載されるような当業者に既知の他の増幅方法が含まれる。増幅によって、本発明による方法（複数の場合もあり）を行うための特に好ましい「手段」である、ＣＤ４遺伝子又は本明細書中に記載されるような任意のパラログ若しくはオーソログの単位複製配列が生成される。結果として、配列番号６若しくは配列番号７のいずれかによるオリゴマー、又は上で言及されるような配列番号１に基づくプライマー対によって増幅される単位複製配列は、本発明の好ましい実施の形態を構成する。

当業者であれば、分析すべき部位、例えばＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化バイサルファイト変換性領域（配列番号１）のＣｐＧ位置１、２、３、４、５及び６の少なくとも１つ、又は配列番号１によるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的なバイサルファイト変換性領域上に存在する全ての部位の量を最小限にするために、ＣｐＧ位置の特異的サブセットを更に選択することが可能である。これらの位置は、生成及び分析される単位複製配列（例えば１２５５番、１９９９番、２０００番又は２００１番）の５’末端から数値的に数えられる。４、５、６又は７の位置の組合せが好ましく、これらは本発明において有益となるほど十分に情報を生み出す。ここで、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置は配列番号２による単位複製配列１２５５番の位置２６、８１、２７４、３３５、３４１及び３７４、配列番号３による単位複製配列１９９９番の位置４２、６０、１５１、２５９、２６２、２９９及び３１２、配列番号４による単位複製配列２０００番の位置６６、８４、１７５、２８３、２８６、３２３及び３３６、並びに配列番号５による単位複製配列２００１番の位置４５、５３、９６、１２５、１３３、１６３、２０５、２５９、２６３、３４５、３４９及び３８２から選択される。

ＣｐＧ位置のバイサルファイト変換性を分析するために、ＤＮＡメチル化を分析する任意の既知の方法を用いることができる。本発明による方法の好ましい実施の形態では、メチル化状態の分析は、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧアイランドメチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥから選択される分析、又は増幅ＤＮＡの検出に基づく他の方法を含む。これらの方法は当業者に既知であり、それぞれの文献中に見ることができる。

本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記方法は日常的適用、例えばＤＮＡチップ上で好適である。当業者であれば、上記の情報及びそれぞれの文献に基づいて上記の方法をかかる状況に適応させることができる。

本発明による方法の別の好ましい実施の形態では、同定には、上記ＣＤ４^＋Ｔリンパ球を全ての主要な末梢血細胞型及び／又は非血液細胞、好ましくはＣＤ１９^＋リンパ球、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ１５^＋顆粒球、ＣＤ１４^＋単球、ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞及びＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋ナチュラルキラーＴ細胞、更には例えば肝細胞、筋細胞、軟骨細胞（chondrocytes）、ケラチノサイト、及び血液以外の器官に由来する多くの他の細胞型（これらに限定されない）から区別することが含まれる。

本発明による方法の更に別の好ましい実施の形態では、試料はヒト血液試料を含む哺乳動物の体液、又は組織、器官若しくは白血球の試料、又はかかる組織、器官若しくは白血球の精製画分若しくは分離画分、又は細胞型試料から選択される。好ましくは、上記哺乳動物はマウス、ラット、サル又はヒトである。試料は必要に応じて好適にプールすることができる。

本発明による方法の別の好ましい態様は次に、同定された上記Ｔリンパ球に基づいて、上記哺乳動物の免疫状態を決定する工程を更に含む。ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団は定量することができ、更に詳細な亜集団（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｒｅｇ、Ｔｆｈ等）を相対的に定量するための基準として使用するか、又は予測因子及び／又はスクリーニング因子及び／又は診断因子及び／又は予後因子及び／又は有害事象検出因子として使用するか、又は最終的にこの集団を検出して、全体的な免疫活性状態を決定するために使用することができる。

本発明による方法の更に別の好ましい実施の形態では、哺乳動物は原発性免疫不全若しくは続発性免疫不全、例えばＡＩＤＳ、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、がん、感染症及び／又はアレルギー、例えば特発性ＣＤ４＋リンパ球減少症、ＨＩＶ、胃炎、糖尿病、大腸炎及び紅斑性狼瘡（これらに限定されない）を患っているか、又はそれらを患う可能性がある。

本発明による方法の別の好ましい態様は、哺乳動物においてＣＤ４^＋Ｔリンパ球のレベルをモニタリングする方法であって、上記の方法と、ＣＤ３^＋、すなわち同定された全Ｔリンパ球の量を、同じ哺乳動物から先に又は同時に採取した試料及び／又は対照試料と比較することとを含む、方法に関する。本発明による方法の更に別の好ましい実施の形態では、哺乳動物は原発性免疫不全若しくは続発性免疫不全、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、がん、及び／又はアレルギー、例えば特発性ＣＤ４＋リンパ球減少症、ＨＩＶ、胃炎、糖尿病、大腸炎及び紅斑性狼瘡（これらに限定されない）を患っているか、又はそれらを患う可能性がある。

本発明による方法の別の好ましい態様は次に、上記ＣＤ^＋Ｔリンパ球の量を、上記哺乳動物に与える化学物質及び／又は生物学的物質に応じて、すなわち上記患者の治療に応じて測定及び／又はモニタリングすることを更に含む、上記の方法に関する。本発明の方法（複数の場合もあり）によって得られる結果に基づき、主治医は患者の免疫状態を決定し、それに応じて基礎疾患の治療を調整することが可能である。

本発明による方法の別の好ましい態様は、配列番号６若しくは配列番号７のいずれかによるオリゴマー、配列番号１に基づき設計されたオリゴマー、配列番号１によるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化バイサルファイト変換性領域、又は配列番号２〜配列番号５のいずれかから選択される単位複製配列に関する。

本発明の更に別の好ましい態様は次に、哺乳動物においてＣＤ４^＋Ｔリンパ球、特にＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔリンパ球を、配列番号１によるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化バイサルファイト変換性領域、及び／又は配列番号２〜配列番号５のいずれかから選択される少なくとも１つの単位複製配列における少なくとも１つのＣｐＧ位置のバイサルファイト変換性の分析に基づいて同定及び／又はモニタリングするキットであって、本明細書中に記載されるような本発明による方法の実行用の材料を含む、キットに関する。好ましくは、該キットはａ）バイサルファイト試薬と、ｂ）配列番号２による単位複製配列１２５５番の位置２６、８１、２７４、３３５、３４１及び３７４、配列番号３による単位複製配列１９９９番の位置４２、６０、１５１、２５９、２６２、２９９及び３１２、配列番号４による単位複製配列２０００番の位置６６、８４、１７５、２８３、２８６、３２３及び３３６、並びに配列番号５による単位複製配列２００１番の位置４５、５３、９６、１２５、１３３、１６３、２０５、２５９、２６３、３４５、３４９及び３８２から選択される少なくとも１つのＣｐＧ位置のバイサルファイト変換性分析のための材料とを含む。更に好ましくは、位置は上記ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化領域及び／又は上記単位複製配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０からなる。ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化領域及び／又は上記単位複製配列の５若しくは６、又は全ての位置であるのが最も好ましい。

最後に、本発明は、哺乳動物においてＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔリンパ球を同定及び／又はモニタリングするための、本発明によるオリゴマー若しくは単位複製配列、又はキットの使用も包含する。

要約すると、本発明者らは、ＣＤ４マーカーを使用して、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球をそれ自体で、更には試料中の他の細胞型、例えばＣＤ３のエピジェネティックマーカーを用いて全Ｔリンパ球との関連で、又はＣＤ８β及び／又はＣＤ８αのマーカーを用いてＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞との関連で非常に特異的に同定し、定量し、特に分化させた。ここで、かかる手段によって、例えばＣＤ８陽性Ｔリンパ球をＣＤ４リンパ球から更に区別することができた。このため、本発明のマーカー（複数の場合もあり）とＣＤ８βマーカーとの組合せを使用すると、ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞とを特異的に区別することができる。マーカーＣＤ４のタンパク質発現をＣＤ４Ｔリンパ球の確実な同定及び定量には使用することができず、特定の保存手段なしには、（新鮮、包埋又は凍結）全血又は組織試料からこれらの細胞型を定量する日常技術を提供することができないため、このことは本発明以前には可能ではなかった。

本発明をここで、以下の実施例に基づき、添付の図面及び配列表を参照して（これらに限定されない）更に説明する。本発明の目的上、本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。図面及び配列については以下のとおりである。

単位複製配列１２５５番（配列番号２）、１９９９番（配列番号３）、２０００番（配列番号４）及び２００１番（配列番号５）、並びに白血球集団の対照（陰性）単位複製配列３２番、３３番、１９８０番、１９８１番及び１９８２番（左側の番号）上のＣｐＧ部位の分析を示す図である。分析するそれぞれの単位複製配列のＣｐＧ位置は以下のとおりである（上から下、１つのＣｐＧ当たり１つのボックス）：ＡＭＰ１２５５；２６、８１、２７４、３３５、３４１、３７４；ＡＭＰ１９８０：６４、７４、１０９、１３６、２１２、２３０、２４３、２７２、２８５、３０６；ＡＭＰ１９８１：９６、１０５、１２３、１３６、２３１、２３３、２４６、２５０、３２１、３６０、３９７；ＡＭＰ１９８２：７７、７９、９４、９６、１６７、２０６、２４３、２７３；ＡＭＰ１９９９：４２、６０、１５１、２５９、２６２、２９９、３１２；ＡＭＰ２０００：６６、８４、１７５、２８３、２８６、３２３、３３６；ＡＭＰ２００１：４５、５３、９６、１２５、１３３、１６３、２０５、２５９、２６３、３４５、３４９、３８２；ＡＭＰ３２：２５０、２７１、２８４、３１３、３２６、３４４、４１８、４４７；及びＡＭＰ３３：６５、９４、１２９、１３９。下部の略語は、ＢＬＣ１５−ＣＤ１９^＋Ｂリンパ球、ＣＤ４−ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、ＣＴＬ−ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＧＲＣ−ＣＤ１５^＋顆粒球、ＭＯＣ−ＣＤ１４^＋単球、ＮＫＣ−ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞；及びＮＫＴ−ＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋ナチュラルキラーＴ細胞を意味する。色の濃い部分は高メチル化を示し、薄い部分は低メチル化を示す。本発明によるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化領域の位置、及びこの領域に対する分析される単位複製配列（下部のバー）のアラインメントを示す図である。

配列番号１は、本発明によるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化バイサルファイト変換性領域のゲノム配列を示す。

配列番号２は単位複製配列１２５５番のゲノム配列を示す。

配列番号３は単位複製配列１９９９番のゲノム配列を示す。

配列番号４は単位複製配列２０００番のゲノム配列を示す。

配列番号５は単位複製配列２００１番のゲノム配列を示す。

配列番号６〜配列番号１３は単位複製配列１２５５、１９９９、２０００及び２００１のそれぞれの増幅に使用するオリゴヌクレオチドの配列を示す。

実施例１
ＣＤ４−分析
ＣＤ３^＋／ＣＤ４^＋、ＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋ナイーブ及び記憶Ｔリンパ球、ＣＤ５６^＋ナチュラルキラー細胞、ＣＤ１９^＋ナイーブ及び記憶Ｂ細胞、ＣＤ１４^＋単球並びにＣＤ１５^＋顆粒球を含む様々な血液サブセットを精製した。精製した細胞に由来するＤＮＡをバイサルファイト処理して、様々なＣｐＧジヌクレオチドモチーフにおいて分析した。次いで、非バイサルファイト変換性を比較した（元の配列においてメチル化しなかった、ひいてはバイサルファイト変換したシトシンについてＴが見られるのに対し、元の配列においてメチル化したシトシンについてＣが見られる）。

データから、全てのＣＤ３ＣＤ４Ｔ細胞においてメチル化せず、他の全ての血液細胞型においてメチル化した、ＣＤ４領域中の様々なＣｐＧ位置が示された。ＣＤ４に見られる差次的にシトシン修飾した遺伝子領域を配列番号１に示す。

この領域の例として、幾つかの単位複製配列が明らかな非メチル化を示すことが見出され（すなわち１２５５番、１９９９番、２０００番及び２００１番、図１を参照されたい）、本発明によるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的な非メチル化バイサルファイト変換性領域以外の領域がメチル化した（単位複製配列３２番、３３番及び１９８０〜８２番で示される、同様に図１を参照されたい）。

データは精製した細胞型について明確であった。全てのＣＤ４Ｔリンパ球が分析した全てのＣＧ位置で圧倒的に非メチル化を示す一方で（図１を参照されたい）、分析した他の全ての細胞型は同一位置でメチル化した。

例として、分析中に単位複製配列１２５５、１９９９、２０００及び２００１を、以下のオリゴヌクレオチド（プライマー）を用いてそれぞれ増幅した：
１２５５ｒ：（配列番号６）５’−TTCTTACAAAACCAATTTTCCT−３’
１２５５ｑ：（配列番号７）５’−GGTTTAGGAGGGGTTGTATATT−３’
１９９９ｒ：（配列番号８）５’−CCCCTCATAAACTTCTTCTAAA−３’
１９９９ｑ：（配列番号９）５’−TAGTATTAGTGGTGGGAGGAGT−３’
２０００ｒ：（配列番号１０）５’−ACTATCCCCAATATCCTCTACTT−３’
２０００ｑ：（配列番号１１）５’−GGGTTAGAGTTTAGGGTTGTT−３’
２００１ｐ：（配列番号１２）５’−GTGTTAGATAGAGTTTGGGGGT−３’
２００１ｏ：（配列番号１３）５’−TCTAAAATATACAAAACTAACCCAAT−３’

実施例２
療法中のがん患者におけるＣＤ４レベルのモニタリング
ＣＤ３＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の量並びにＣＤ３^＋Ｔ細胞画分の一部としてのＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを、配列番号４による単位複製配列２０００番中のＤＮＡのバイサルファイト変換性の評価によって定量した（表１）。療法の経過観察中の２つの異なる時点での末梢血液試料を使用した。

結果から、ＣＤ４＋Ｔ細胞レベルの患者に特異的な変化、及び薬物有効性と関連するがん療法の経過観察中のＣＤ３^＋Ｔ細胞レベルとの関連のＣＤ４^＋細胞の割合の減少によって、転帰予後診断（outcome prognosis）を示すことができ、及び／又は療法の有効性及び安全性を予測することもできることが示される。

表１：或る特定の療法中の２人の患者（Ｐ１、Ｐ２）のＣＤ４＋及びＣＤ３＋Ｔ細胞レベルの評価。２つの時点を評価した（１及び２）。バイサルファイト変換性ＣｐＧ含有領域の定量後のｑＰＣＲによるＣＤ４＋及びＣＤ３＋細胞レベルの算出。（ＣＰ値）測定する値；（標準単位）標準曲線から算出されたＣＰ値に対応する単位；（％ＣＤ３、％ＣＤ４）細胞の相対量。（ＣＤ４／ＣＤ３％）ＣＤ３の一部としてのＣＤ４のパーセンテージ。

Claims

哺乳動物に由来する血液細胞を含む試料においてＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞を同定する方法であって、配列番号１に示されるＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞特異的なバイサルファイト変換性領域における少なくとも１つのＣｐＧ位置のバイサルファイト変換性を分析することを含み、前記試料における少なくとも１つのＣｐＧ位置の少なくとも９０％のバイサルファイト変換が、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞の指標となり、
前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、配列番号２に示される単位複製配列１２５５番、配列番号３に示される１９９９番、配列番号４に示される２０００番及び配列番号５に示される２００１番の群から選択される単位複製配列に存在する、
方法。
前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、配列番号２に示される単位複製配列１２５５番の位置２６、８１、２７４、３３５、３４１及び３７４、並びに配列番号５に示される単位複製配列２００１番の位置４５、５３、９６、１２５、１３３、１６３、２０５、２５９、２６３、３４５、３４９及び３８２から選択される、請求項１に記載の方法。
メチル化状態の分析が、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧアイランドメチル化、ＭＳＰ又は増幅ＤＮＡの検出に基づく他の方法から選択される分析を含む、請求項１又は２に記載の方法。
ＣＤ３及び／若しくはＣＤ８の遺伝子中、又はＣＤ８α及びＣＤ８βの遺伝子中、又はＧＮＧＴ２の遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のバイサルファイト変換性の分析を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記同定が前記Ｔリンパ球と、全ての主要な末梢血細胞型若しくは非血液細胞又はＢ細胞とを区別することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記試料が、ヒト血液試料を含む哺乳動物の体液、又は組織、器官若しくは細胞型の血液試料、血中リンパ球の試料若しくはその画分から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
ＣＤ４Ｔ細胞の相対量を、分析される前記領域におけるバイサルファイト変換性の相対量と、ＧＡＰＤＨを含む制御遺伝子におけるバイサルファイト変換性の相対量との比較に基づいて定量する工程を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳動物が自己免疫疾患、移植片拒絶反応、がん及び／又はアレルギーを患っているか、又はそれらを患う可能性がある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
哺乳動物においてＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞又はＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔリンパ球のレベルをモニタリングするｉｎｖｉｔｒｏ方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法と、同定された全ＣＤ３^＋Ｔリンパ球の量を、同じ哺乳動物から先に又は同時に採取した試料と比較することとを含む、方法。
前記ヘルパーＴ細胞の量を、前記哺乳動物に与えられた化学物質及び／又は生物学的物質に応じて測定及び／又はモニタリングすることを更に含む、請求項１０に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。