JP2005304504A

JP2005304504A - 核酸精製用組成物及び方法

Info

Publication number: JP2005304504A
Application number: JP2005146671A
Authority: JP
Inventors: Vikas V Padhye; ビカス・ブイ・パデイ; Chuck York; チヤツク・ヨーク; Adam Burkiewicz; アダム・ブルツキイウイツツ
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1993-08-30
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2005-11-04
Anticipated expiration: 2025-06-16
Also published as: US5658548C1; AU689815B2; US5808041A; AU8010094A; CA2170604A1; EP0723549B1; JPH09505724A; WO1995006652A1; EP0723549A4; DE69433425T2; JP3696238B2; CA2170604C; EP0723549A1; ATE256735T1; JP4480622B2; DE69433425D1; US5658548A

Abstract

【課題】ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで核酸と結合している他の物質から５０塩基長以上の核酸を分離し、その後の処理又は分析に適した状態で核酸を単離する為の組成物及び方法の提供。
【解決手段】シリカ材料、シリカゲルとガラス粒子、特にガラス繊維の混合物；塩酸グアニジウム又はチオシアン酸グアニジウムなどのカオトロピック塩のこの様な混合物；及び、カオトロピック塩中の水溶液中のこのような混合物の懸濁液。核酸を含有する水溶液をカオトロピック塩の水溶液と混合し、得られた溶液をシリカ材料の混合物に接触させ、核酸をシリカ材料と結合させ、核酸以外の材料をシリカ材料から洗い流した後、シリカ材料から遊離させることで核酸を得る。
【効果】その後の処理又は分析を妨げるいかなる塩又は高分子に汚染されていない核酸の水溶液を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏで核酸と結合している他の物質から核酸を分離し、その後の処理又は分析に適した状態で核酸を単離するための組成物及び方法に関する。

ＲＮＡ及びＤＮＡを含む核酸に逆転写、クローニング、制限分析、配列決定などの分子生物学的技術を適用するには、ある種の汚染物質を実質的に含有しない核酸を提供することが必要である。このような汚染物質としては特に、分子生物学的技術で使用される核酸ハイブリダイゼーション、酵素触媒反応及び他の型の反応を含む化学反応を阻止ないし阻害する物質；対象核酸の分解ないし解重合を触媒する物質；又はサンプル中に実際には存在しない所定量の対象核酸がサンプル中に存在することを示す「バックグラウンド」を提供する物質が挙げられる。これらの汚染物質には、酵素、他の型のタンパク質、多糖類又はポリヌクレオチドなどの高分子量物質と、脂質、低分子量酵素阻害剤又はオリゴヌクレオチドなどの低分子量物質がある。

分子生物学的方法を適用するために十分な程度に汚染物質を含有しない対象ＤＮＡ又はＲＮＡを得るという問題は、ＤＮＡ又はＲＮＡが典型的には複合系に存在するので複雑になっている。これらの系は組織からの細胞や、体液（例えば血液、リンパ液、乳汁、尿、糞便、精液等）からの細胞や、培養物、アガロースゲル若しくはポリアクリルアミドゲル中の細胞、又はターゲット核酸増幅を実施した溶液などであり、有意量の汚染物質を含有しているのが典型であり、分子生物学的手順を実施する前に対象ＤＮＡ又はＲＮＡを無傷で取り出さなければならない。

細胞からＤＮＡ又はＲＮＡを得るための慣用プロトコルは当業者に周知であり、例えばＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）の第２章（ＤＮＡ）及び第４章（ＲＮＡ）に記載されている。これらのプロトコルによりＤＮＡを得るには、一般に細胞を温和に溶解させてＤＮＡを可溶化させ、タンパク質、ＲＮＡ及び他の物質などの汚染性物質をＤＮＡから酵素的又は化学的に実質的に除去する（即ち対象分子生物学的手順を実施できるような十分低いレベルまでＤＮＡと同一溶液中のこれらの汚染物質の濃度を低下させる）。ＲＮＡを単離するには、溶解及び可溶化手順はＲＮＡから分離すべきリボヌクレアーゼ及びＤＮＡを含む汚染物質を阻害するための手段が含まれていなければならない。

慣用プロトコルは更に、一般に（ＤＮＡを得るためには）ＤＮＡを用いる分子生物学的手順を妨げる汚染物質を実質的に含有しないフェノール／クロロホルム抽出（即ちフェノール／クロロホルム又はフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによる抽出）及びエタノール（又はイソプロパノール）沈殿を使用する。しかしながら、フェノール／クロロホルム抽出には大きな欠点がある。これらの欠点は、抽出に多段階が必要なため長時間を要することや、フェノール又はクロロホルムの使用に危険を伴うことである。フェノールに接触すると重度火傷を生じる。クロロホルムは高揮発性、毒性且つ引火性である。これらの危険により、ヒュームフード中でフェノールを取り扱ったりフェノール／クロロホルム抽出を行わなければならない。フェノール／クロロホルム抽出の別の望ましくない特徴は、フェノールの酸化生成物が核酸を損傷する恐れがあるという点である。新たに再蒸留したフェノールしか実際に使用することができず、核酸をフェノールの存在下に置くことができない。また、一般にはフェノール／クロロホルム抽出後にＲＮＡを単離するためには、多段階手順が必要である。ＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出水溶液からＤＮＡを沈殿させ、ＤＮＡから残留フェノール及びクロロホルムを除去するためには、エタノール（又はイソプロパノール）沈殿を使用しなければならない。更に、ある種のヌクレオシド三リン酸及び短い（約３０塩基又は塩基対以下の）１本鎖又は２本鎖オリゴヌクレオチド汚染物質をＤＮＡから除去するためにもエタノール（又はイソプロパノール）沈殿が必要である。

分子生物学的手順を使用する操作に十分な程度までＤＮＡを精製するために、フェノール／クロロホルム抽出／エタノール沈殿よりも簡単、安全又は有効な方法が業界で必要とされている。

また、操作に十分な純度でＲＮＡを単離する改善方法も業界で必要とされている。

多くの分子生物学的手順には、細胞から回収したＤＮＡのサイズによる分画が必要であり、このような分画は典型的にはアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動により実施される。分画後に分子生物学的手順により分析又は処理するためには、このような電気泳動で使用したゲル中のアガロース、他の多糖類、ポリアクリルアミド、アクリルアミド又はアクリル酸などの汚染物質から対象フラクション中のＤＮＡを分離しなければならない。そこで、このような分離を実施するための方法が業界で必要とされている。

周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（例えば米国特許第４，６８３，２０２号参照）などの核酸又はそのセグメントの増幅方法では、酵素、ヌクレオシド三リン酸、オリゴヌクレオチド及び他の核酸類の複合混合物の溶液が生成される。通常上記方法は、著しく多量の単一核酸セグメント（「ターゲットセグメント」）を得るために行なわれる。多くの場合には増幅プロセスの実施後に溶液中の他の成分からこの核酸を分離することが必要である。そこで、これらの分離を実施する簡単な方法が必要とされている。この点でＰＣＲ法による増幅で特に問題となるのは、プロセスで増幅しようとする核酸（通常は２本鎖ＤＮＡ）を同様にプロセスで高レベルまで増幅された「プライマー二量体」から分離する問題である。「プライマー二量体」は、別のプライマー上のＰＣＲ増幅で鋳型として使用されるプライマーの１つによるＤＮＡ合成のプライミングにより生成されるＤＮＡである。プライマー二量体はＰＣＲ増幅で高濃度まで増幅し得る。

ＤＮＡを他の物質から分離し、分子生物学的手順でのＤＮＡの使用を妨げる汚染物質をＤＮＡから実質的に除去することによりＤＮＡをこのような手順に適応させるために、例えばガラス粉末、シリカ粒子及びガラス繊維濾紙を粉砕することにより作成されるガラス微細繊維などのガラス粒子や、珪藻土を含むシリカ材料がカオトロピック塩の水溶液と併用されてきた。米国特許第５，０７５，４３０号と、Ｍａｒｋｏら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１，３８２−３８７（１９８２）及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７６，６１５−６１９（１９７９）を含むその引用文献参照。更にＢｏｏｍら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，４９５−５０３（１９９０）も参照。ＤＮＡを他の物質から分離するためにカオトロピック塩の水溶液と併用する無傷のガラス繊維濾紙については、ＣｈｅｎとＴｈｏｍａｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，３３９−３４１（１９８０）を参照されたい。前出のＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎらは、シリカゲルがＤＮＡ分離で使用するのに適していないと示唆している。シリカ材料とカオトロピック物質を使用するＲＮＡの分離については、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら，米国特許第５，１５５，０１８号を参照されたい。

ガラス粒子とシリカゲルの混合物、カオトロピック物質の水溶液中のこのような混合物の懸濁液、及びＤＮＡもしくはＲＮＡを他の物質から分離するため、又はこうして分離したＤＮＡもしくはＲＮＡを単離するためにこのような懸濁液を使用することは本発明以前には知られていなかった。

発明の要約
ＤＮＡ又はＲＮＡを他の物質から分離し、分子生物学的手順で使用するのに適切な程度まで十分にＤＮＡ又はＲＮＡから汚染物質を除去し、このような用途に適したＤＮＡ又はＲＮＡを単離するために、シリカゲルとガラス粒子の混合物をカオトロピック塩の水溶液と併用すると有利であることが茲に知見された。このような混合物はＲＮＡを分離及び単離するのに使用しても有利である。

従って、本発明はシリカゲルとガラス粒子の混合物、これらの混合物とカオトロピック塩及びカオトロピック塩の水溶液の組み合わせ、カオトロピック塩の水溶液中のシリカゲルとガラス粒子の混合物の懸濁液、並びにＤＮＡ又はＲＮＡを含む水溶液からＤＮＡ又はＲＮＡを分離し、こうして分離したＤＮＡ又はＲＮＡを単離する際におけるこのような組み合わせ及び懸濁液の使用方法を提供する。本発明のこれらの使用方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡのこのような分離及び単離において、珪藻土単独又はガラス粒子単独をカオトロピック塩と併用又はカオトロピック塩水溶液中懸濁液として使用する方法を、予想外に改善するものである。

発明の詳細な説明
１態様において、本発明はシリカゲルとガラス粒子の混合物である。

別の態様では、本発明は１種以上のカオトロピック塩を含有する水溶液中のシリカゲルとガラス粒子の懸濁液を包含する。

更に別の態様では、本発明はＤＮＡ又はＲＮＡを含有する第１の水溶液からＤＮＡ又はＲＮＡを分離する方法であり、該方法は、（１）１種以上のカオトロピック塩を含有する第３の水溶液と前記第１の水溶液のアリコートを混合することにより第２の水溶液を調製する段階と、（２）前記第２の水溶液のアリコートをシリカゲルとガラス粒子の混合物に接触させる段階とを含む。

ＤＮＡ又はＲＮＡを含有する水溶液からＤＮＡ又はＲＮＡを分離するための本発明の方法は、段階（２）の後に、（３）段階（２）で第２の水溶液の前記アリコートと接触させたシリカゲルとガラス粒子の混合物の第１の部分から、前記混合物の前記第１の部分に結合していない前記アリコートの実質的に全部を分離する段階と、（４）シリカゲルとガラス粒子の前記混合物の前記第１の部分の一部である前記混合物の第２の部分を、シリカゲルとガラス粒子の前記混合物の前記第２の部分からカオトロピック塩の実質的に全部を除去するのに有効であり且つ短いオリゴヌクレオチド以外のＤＮＡ（又は場合によりＲＮＡ）を除去するのには実質的に無効な第４の水溶液で洗浄する段階と、段階（４）の後に（５）シリカゲルとガラス粒子の前記混合物の前記第２の部分の一部である前記混合物の第３の部分を水又は第５の水溶液で洗浄し、前記第３の部分からＤＮＡ（又は場合によりＲＮＡ）を溶離させる段階とを加えることにより、ＤＮＡ又はＲＮＡを単離するための本発明の方法になる。第５段階で溶離したＤＮＡ又はＲＮＡは本発明に従って単離されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、分子生物学的手順でそれ以上精製せずに使用するのに適している。

本明細書中で使用する「シリカ材料」なる用語は、大部分がシリカであるシリカゲル又はガラス粒子を意味する。本発明で使用するシリカゲルは慣用シリカゲルであり、好ましくは少なくとも「クロマトグラフィーグレード」である。

シリカゲルは広く市販されている。シリカゲルは「細孔径」、「粒度」及び比表面積により特徴を表すことができる。本発明に適切なシリカゲルは、約３０〜約３００Å、好ましくは約６０Åの細孔径と、約５μｍ〜約３００μｍ、好ましくは約１０μｍの粒度と、約１００ｍ^２／ｇ〜約１０００ｍ^２／ｇ、好ましくは約５００ｍ^２／ｇの比表面積を有する。本発明に最適なシリカゲルは細孔径約６０Å、粒度９〜１１μｍ及び比表面積約４５０〜５５０ｍ^２／ｇを有する。

本明細書中で使用する「ガラス粒子」なる用語は、結晶質シリカ（例えばα石英、ガラス質シリカ）の粒子を意味し、結晶質シリカは非晶質でないために正しくは「ガラス」でないものや、主にシリカから構成されるガラスの粒子であってもよい。ガラス粒子は一般に少なくとも７５重量％のＳｉＯ_２を含有し、通常のシリカガラスに典型的な他の成分、例えば酸化ナトリウム、酸化カリウム、酸化アルミニウム、酸化ホウ素、酸化カルシウムなども含有し得る。ガラス粒子の組成は、例えばα石英、通常のソーダ石灰ガラス又はホウケイ酸ガラス［例えばＰｙｒｅｘ（登録商標）］のように、本発明によりＤＮＡを分離又は単離する際に本発明により粒子と併用する全水溶液が受ける全条件下で、粒子がこのような水溶液中約１０^−３気圧〜数気圧で少なくとも１００℃まで固体又は固体様に維持されるようなものである。また、本発明のシリカ混合物中のガラス粒子は、α石英、通常のソーダ石灰ガラス又はホウケイ酸ガラスと同様に、本発明によりＤＮＡを分離又は単離する際に本発明により粒子と併用する水溶液が受ける全条件下でこのような水溶液にほとんど溶けない。この「ほとんど溶けない」という表現は、通常のガラスと同様に、ガラス粒子から浸出する成分の量が本発明の方法の実施に影響を与えないような少量であることを意味する。

ガラス粒子は、粉砕結晶質シリカ粉末；ガラスを粉砕することにより得られるソーダ石灰及びホウケイ酸ガラス粉末を含むガラス粉末；及び下記のようにガラス繊維濾紙から得られるガラス繊維を含めてガラス繊維を粉砕することにより得られるガラス微細繊維を含む。下記のように得られるガラス微細繊維が好適である。ＤＮＡ分離でカオトロピック塩溶液と併用するガラス粒子の使用及びこのような粒子の寸法については、Ｂｏｏｍら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，４９５−５０３（１９９０）；Ｍａｒｋｏら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１，３８２−３８７（１９８２）；及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）７６，６１５−６１９（１９７９）を参照されたい。

シリカゲル又はガラス粒子は、クロマトグラフィーグレード以上で市販されているのでそれ以上精製せずに本発明の混合物又は懸濁液中で使用できるが、低純度の粒子のように使用前に洗浄してもよい。

本発明の混合物中のシリカゲルとガラス粒子の重量比は１：１〜１００：１の範囲であり、より好適な範囲は約５：１〜約５０：１、最適範囲はＤＮＡでは約１０：１（約９：１〜約１１：１）であり、ＲＮＡでは約３０：１（約２５：１〜３５：１）である。

本発明のシリカゲルとガラス粒子の混合物は、乾燥状態又は液体に懸濁したシリカゲルを同様に乾燥状態又は液体に懸濁したガラス粒子と単に混合することにより調製される。同様に、本発明のシリカゲル、ガラス粒子及びカオトロピック塩の混合物も、乾燥状態、液体懸濁状態又は塩の場合には溶液の形態であり得る成分を単に混合することにより調製される。カオトロピック塩の懸濁液又は溶液に好適な「液体」は水又は水溶液である。

蒸留水を用いて調製する樹脂のｐＨは、グアニジニウム塩の存在により５．５〜６．５である。純水の代わりに緩衝液を調製物に加えることにより樹脂のｐＨを変えることができ、例えばクエン酸塩を加えるとｐＨ４．０〜５．０、酢酸塩を加えるとｐＨ５．５〜６．５、Ｔｒｉｓを加えるとｐＨ７．０〜９．０になる。

シリカゲルとガラス粒子の混合物又は懸濁液がシリカゲルと特定型のガラス粒子（例えばガラス微細繊維）「から主に構成される」という場合には、混合物中のシリカ材料が主にシリカゲルと特定型のガラス粒子だけから構成されることを意味する。このような混合物又は懸濁液中にはシリカ材料以外の型の材料（例えば水、緩衝液、塩類）が存在していてもよく、シリカ材料中には微量の非必須又は無意味な成分（例えば不純物）が存在していてもよい。

カオトロピック塩はカオトロピックイオンの塩である。このような塩は水溶液によく溶ける。このような塩によりタンパク質又は核酸の水溶液中に十分高濃度で提供されるカオトロピックイオンは、タンパク質を変性させ、核酸の二次構造を失わせ、あるいは２本鎖核酸の場合には融解（即ち鎖分離）させる。カオトロピックイオンがこれらの効果を有するのは、液体水中に存在する水素結合の網目を破壊し、変性タンパク質及び核酸を正しい折り畳み又は構造のものよりも熱力学的に安定にするためであると考えられる。カオトロピックイオンはグアニジニウムイオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン及びトリクロロ酢酸イオンを含む。本発明ではグアニジニウムイオンが好適である。カオトロピック塩は塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム（場合によりイソチオシアン酸グアニジニウムとも言う）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム及びトリクロロ酢酸ナトリウムを含む。グアニジニウム塩が好適である。

シリカ材料と接触させるか又はこのような材料の懸濁液を調製するために本発明で使用するカオトロピック塩水溶液中のカオトロピックイオン濃度は好ましくは約２Ｍ以上である。ＤＮＡを含有する水溶液と混合してＤＮＡを導入する以前のカオトロピック塩水溶液中のカオトロピックイオン濃度は好ましくは約４Ｍ以上、より好ましくは約５Ｍ以上である。更に、（ＤＮＡ又はＲＮＡの導入以前の）カオトロピック塩水溶液の容量と本発明のＤＮＡ分離方法を実施する際にカオトロピック塩溶液と混合するＤＮＡ又はＲＮＡの水溶液の容量の比は好ましくは１以上である。ＲＮＡ分離法では約４：１（３：１〜５：１）が好ましい。従って、それぞれＤＮＡ又はＲＮＡを分離しようとするＤＮＡ又はＲＮＡ溶液と混合する以前のカオトロピック塩水溶液中にシリカゲルとガラス粒子を含有する本発明の懸濁液中のカオトロピック塩濃度は、カオトロピック塩が塩酸グアニジニウムである場合には好ましくは６Ｍ〜８Ｍであり、カオトロピック塩がチオシアン酸グアニジニウムである場合には好ましくは５Ｍ〜７Ｍである。

シリカゲル、ガラス粒子及びチオシアン酸グアニジニウム溶液を含有する組成物には、組成物が調製後数日以内に肉眼で明らかに識別可能な黄色に変色するという問題があった。このような変色は商業的に許容できない。本発明に関連して、クエン酸塩、ＥＧＴＡ又はＥＤＴＡなどのキレート化剤を加えることによりこれらの組成物の変色を回避できることが予想外にも判明した。この点では組成物の溶液中に約５ｍＭ〜約１５ｍＭのＥＤＴＡ又はＥＧＴＡを加えると好適である。溶液にＥＤＴＡを加えるにはＥＤＴＡの２ナトリウム塩として加えると好適である。更に、懸濁液の調製に使用する固体（シリカ材料）をキレート化剤含有溶液で洗浄することにより、チオシアン酸グアニジニウムを含有する本発明の懸濁液の変色を回避できることが予想外にも判明した。

本発明を実施する際には溶液中で塩を使用するが、本発明で使用する全カオトロピック塩に関してこのような全溶液中の塩の濃度は、本発明を実施する際にこのような溶液が受ける全条件下で溶液中の塩の溶解度未満に維持されることが望ましい。

本発明の組成物及び方法は、約５０塩基〜約５０〜６０キロベースの長さを有するＤＮＡを他の成分から分離又は単離するのに特に適している。本発明の組成物及び方法は、細胞、ウイルス等に天然に存在する実質的に任意の長さのＲＮＡを分離又は単離するのにも適している。従って、本発明の方法は例えばベクターＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡ、λＤＮＡ）をゲノムＤＮＡから分離するため、及び約２００塩基長以上のＰＣＲ増幅ターゲット又は被分析ＤＮＡをこれよりも著しく短い（典型的には約２０〜約１００塩基長の）プライマー又はプライマー二量体ＤＮＡから分離するために適している。ＤＮＡは直鎖状、環状、１本鎖、２本鎖又は部分的２本鎖など任意の形態で本発明の方法に提供され得る。

本発明の方法を定義する際に、溶液の「アリコート」という場合には溶液の容量の全部又は一部を表し、シリカゲルとガラス粒子の混合物の「一部」という場合には混合物の重量の一部又は全部を表す。

ＤＮＡ又はＲＮＡを分離又は単離するための本発明の方法では、まず第１段階で分離又は単離しようとするＤＮＡ又はＲＮＡを含有する水溶液（第１の溶液）のアリコートをカオトロピック塩の水溶液（第３の溶液）と混合して第２の溶液を形成し、第１段階後又は場合によっては第１段階と同時に、第２の溶液のアリコートをシリカゲルとガラス粒子の混合物に接触させる第２段階を行う。第２の溶液中のカオトロピックイオン濃度は好ましくは少なくとも２Ｍであり、第３の溶液中のカオトロピックイオン濃度が４Ｍ以下の場合には第２の溶液の容量を第３の溶液の容量の２倍未満にすることが好ましい。

シリカゲルとガラス粒子の混合物は好ましくは均質である（即ちシリカゲル粒子とガラス粒子が混合物全体に可能な限り均質に混ざり合っている）。混合物は乾燥状態でカラムに充填又は膜に封入され、カラム又は膜に第２の溶液を通じることにより第２の溶液と接触し得る。例えば米国特許第５．０７５，４３０号参照。より好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含有する水溶液のアリコートをカオトロピック塩の水溶液中の本発明のシリカゲルとガラス粒子の懸濁液と混合することにより、本発明の方法の第１段階と第２段階を同時に実施する。

本発明の方法により分離又は単離するＤＮＡ又はＲＮＡは実質的に任意のＤＮＡ又はＲＮＡ源から得られる。本発明の方法を実施する前に、本発明の方法を実施するＤＮＡ又はＲＮＡの水溶液を提供するように処理を行ってもよい。従って、ＤＮＡ又はＲＮＡは培養真核もしくは原核細胞から得てもよいし、組織、動物及び植物を含む多細胞生物、体液（例えば血液、リンパ液、尿、糞便又は精液）、胚又は胎児、食料品、化粧品又は任意の他の細胞源から抽出ないし取得した細胞から得てもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは細胞に感染するオルガネラ、ウイルス、ファージ、プラスミド、ウイロイドなどのＤＮＡ又はＲＮＡでもよい。細胞を溶解させ、通常は当業者に周知の種々の方法で溶解物を処理してＤＮＡ又はＲＮＡの水溶液を得、これに本発明の分離又は単離方法を適用する。このような溶液中のＤＮＡ又はＲＮＡは典型的にはタンパク質、ＲＮＡ（ＤＮＡ分離の場合）、ＤＮＡ（ＲＮＡ分離の場合）、又は他の型の成分などの他の成分と併存している。

本発明の方法により処理可能なＤＮＡの別の例は、溶液を用いてＰＣＲなどの増幅法を実施した後の溶液中のＤＮＡであり、通常はこのような溶液を本発明の方法で直接使用する。

本発明の方法により処理するＤＮＡの別の例は、アガロース又はポリアクリルアミドゲルなどのサイズ分画ゲルから得られるＤＮＡである。本発明の方法を適用するＤＮＡの水溶液を調製する際には、ＤＮＡをゲルのスライスから溶液中に溶離させるか又は溶液中でゲルもしくはそのスライスを融解もしくは他の方法で分解させるなどの方法によりＤＮＡをゲルマトリックスから分離する。

本発明の方法では、最初の２段階を実施したことにより、ＤＮＡ又はＲＮＡがシリカ材料に結合することにより分離される。分離したＤＮＡ又はＲＮＡを分子生物学的手順でそれ以上精製する必要なしに使用できるように単離するためには、後続段階が必要である。

そこで第３段階として、少なくとも一部（典型的には全部）のシリカ材料（ＤＮＡ又はＲＮＡが結合している）から、ＤＮＡ又はＲＮＡを分離するシリカ材料と混合した第２の溶液のアリコートの実質的に全部を、シリカ材料の前記一部と結合しなかったものを除き、分離する。第２の溶液／シリカ材料の組み合わせを（実施例に記載するように）カラム内又は膜間（米国特許第５，０７５，４３０号参照）に維持する場合には、カラム内のシリカ材料／第２の溶液の組み合わせの最上部に第４の溶液を積層し、室温で真空を使用してシリカ材料から第２の溶液及び第４の溶液の液体を吸引することにより、第２の溶液の前記アリコートの実質的に全部を分離する前記第３段階を下記第４段階と部分的に同時に実施することができる。あるいは、第４段階を開始する前に第２の溶液の液体をシリカ材料から吸引してもよい。更に別の方法では、第２の溶液／シリカ材料の組み合わせを遠心し、上清をペレットから十分に除去した後にペレットを用いて第４段階を開始してもよい。シリカ材料から第２の溶液の液体を分離するには液体を蒸発乾涸する。当業者に理解されるように、結合していない第２の溶液の成分からシリカ材料を分離するこの工程は、シリカ材料に強く結合していないカオトロピック塩、タンパク質及び他の汚染物質の大部分を除去する。

他方、シリカ材料にある程度強く結合している汚染物質や他の物質を十分に除去するためには、本発明の単離方法で第４段階を実施する。この段階は、対象ＤＮＡ又はＲＮＡと結合しており且つ第２の溶液の未結合成分の実質的に全部を除去したシリカ材料の一部（典型的には全部）を第４の水溶液で洗浄することからなる。この第４の水溶液は、この第４の水溶液で洗浄したシリカ材料の前記一部からカオトロピックイオンの実質的に全部を除去するのに有効であり且つ短いオリゴヌクオチド（約２００ヌクレオチド未満であるが、本発明の方法では約４０ｂｐ程度のＤＮＡ又はＲＮＡも低収率で分離することができる）以外のＤＮＡ又はＲＮＡを除去するのには実質的に無効な容量及び組成を有する。典型的には、第４の溶液は第２の溶液の液体の除去後に残っているカオトロピック塩を除去するのに有効である以外に、この除去後に残っているタンパク質及び短いオリゴヌクレオチドを除去するのにも有効である。当業者に自明の通り、この溶液はＤＮＡ又はＲＮＡをシリカ材料からさほど溶離させない。本発明の方法のこの洗浄段階に適した多くの洗浄溶液が当業者に公知である。典型的にはこれらの溶液は、アルキル部分中に１〜４、好ましくは２又は３個の炭素を有するアルカノール約２０容量％〜約９５容量％の水溶液である。溶液は例えば０．０５Ｍ〜０．２０ＭＮａＣｌ；ｐＨをほぼ中性に維持するための低濃度緩衝液（例えば５ｍＭ〜２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）；及び低濃度キレート化剤（１ｍＭ〜５ｍＭＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ等）など他の成分も含み得る。

第４段階では任意の標準洗浄手順を使用することができる。上述のように、第４段階は少なくとも部分的に第３段階と同時に実施することができる。実施例に示すように、第４の溶液をシリカ材料から真空吸引する場合には、第４の溶液を蒸発乾涸せずに、残留している第４の溶液を含むシリカ材料を遠心し、残留している第４の溶液をシリカ材料から除去すると好適である。シリカ材料をクロマトグラフィーカラムに充填する場合には、適切な容量の第４の溶液をカラム内の材料に通じてカオトロピック塩及び他の対象汚染物質を実質的に完全に除去する。カオトロピック塩及び他の対象汚染物質を実質的に完全に除去するために必要な回数だけ反復し得る別の手順では、シリカ材料を第４の溶液に懸濁した後、遠心によりペレット化してペレットから上清を除去することにより溶液から除去する。第５段階前に、第４の溶液を蒸発乾涸せずに例えば実施例に示すように遠心により第４の溶液の実質的に全部をシリカ材料から分離すると好適である。

ＤＮＡ又はＲＮＡを単離するための本発明の方法の第５段階では、分離したＤＮＡ又はＲＮＡと結合しており且つ上記のように第４の溶液で洗浄した後のシリカ材料の一部を水又は第５の溶液で洗浄してＤＮＡ又はＲＮＡを材料から溶離させる。次に、単離したＤＮＡ又はＲＮＡを水又は第５の水溶液に溶解する。洗浄は、遠心、加圧又は真空吸引によりＤＮＡ又はＲＮＡと結合したシリカ材料を保持するカラムに第５の溶液を通じるなど当業者に周知の種々の方法の任意のものにより実施することができる。第５の溶液は「低塩」（即ち下記実施例に記載するＴＥ緩衝液の約２倍未満の低イオン強度を有する）であり、好ましくはｐＨ約６．５〜８．５、より好ましくは７．０〜８．０に緩衝する。ＤＮＡ又はＲＮＡを単離するための本発明の方法で使用するのに特に好適な第５の水溶液は当業者に周知のＴＥ緩衝液である。

実施例に示すように、ＴＥ緩衝液を使用して本発明の方法により単離したＤＮＡ又はＲＮＡは使用まで緩衝液中で保存することができる。

本発明の方法の記載に関連して使用する「実質的に全部」、「実質的に完全」、「実質的に無効」などの表記は必然的に機能的に定義され、第５段階で溶離後に実施しようとする対象分子生物学的手順に適切な分離ＤＮＡ又はＲＮＡを得るために十分であることを意味する。当業者は、本発明の方法によりこのような分離ＤＮＡを得るために洗浄溶液の容量と組成及び洗浄手順に関する要件を容易に決定することができる。

上述のように、シリカゲルとガラス粒子を含むシリカゲル材料混合物を使用する本発明のＤＮＡ及びＲＮＡ分離及び単離方法は、予想外にも従来技術の方法よりもそれぞれＤＮＡ及びＲＮＡを有効に回収することができる。

ＤＮＡ又はＲＮＡをそれぞれ単離するための本発明の方法により提供される溶離ＤＮＡ又はＲＮＡは、それ以上精製せずに分子生物学的手順により分析又は更に処理するのに適している。溶離核酸は例えば配列決定、制限分析又は核酸プローブハイブリダイゼーションにより分析することができる。従って、本発明の方法はＤＮＡ又はＲＮＡの分析に基づく方法、特に病気の診断；病原体の同定；食品、化粧品、血液もしくは血液製品又は他の製品の病原体汚染試験；法廷試験；実父確定試験；及び胎児又は胚の性別鑑定方法の一部として適用することができる。

本発明の方法により提供される溶離ＤＮＡ又はＲＮＡは、それぞれＤＮＡ又はＲＮＡとの反応を触媒する種々のエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼの任意のものにより処理することができ、ＤＮＡの場合にはＤＮＡ中に存在する制限部位で切断する制限酵素で消化することができる。溶離ＤＮＡからの制限フラグメントをベクターに連結し、クローニング又は発現に適した宿主に形質転換することができる。溶離ＤＮＡ又はＲＮＡのセグメントはターゲット核酸セグメントを増幅するために当業者に公知の種々の方法の任意のものにより増幅することができる。溶離ＤＮＡがプラスミド又は別の型の自律複製ＤＮＡである場合には、形質転換宿主中で発現することが可能なＤＮＡ上の遺伝子のクローニング又は発現に適した宿主に形質転換することができる。本発明の方法により単離したプラスミドＤＮＡは、従来技術の方法（珪藻土が本発明の適用方法のシリカゲルの代わりに使用される）により単離したものよりも有効に真核細胞にトランスフェクトできることが判明した。以下、非限定的な実施例により本発明の種々の態様を教示する。実施例とその他の明細書及び請求の範囲に記載する容量及びモル濃度は特に指定しない限り室温値である。

塩酸グアニジニウムを用いた懸濁液の調製
超純粋グアニジン−ＨＣｌ（米国、オハイオ州、クリーブランドに所在のＡｍｒｅｓｃｏ製ＡｍｒｅｓｃｏＵｌｔｒａｐｕｒｅ）２０ｋｇを脱イオン蒸留水３０Ｌに溶解することにより７Ｍグアニジン−ＨＣｌ（即ち塩酸グアニジニウム）溶液を調製した。

次に樹脂用ガラス粒子（即ち本実施例ではガラス微細繊維）を次のように作成した。１２．５ｃｍのガラス繊維濾紙（多数の実験室科学装置販売業者を通してＷｈａｔｍａｎから広く販売されているＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ａ，ＣａｔａｌｏｇＮｏ．１８２０−１２５）６３枚（総重量約４１．７ｇ）を４分の１に切断した。次に中〜高速ポリトロンで分散しながら濾紙を５ＭＮａＣｌ６Ｌに漸次加えた。濾紙の全部を加えた後、残留している紙が見えなくなるまで均質スラッジ状に均質化し、この均質化を約５分間続けた。次にスラッジをブフナー漏斗で集め、脱イオン蒸留水約２４Ｌで洗浄した。

本実施例ではＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ａ濾紙を特定しているが、ＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｂ、ＧＦ／Ｃ及びＧＦ／Ｆ濾紙、並びに本明細書に記載するガラス微細繊維作成過程により除去可能な結合剤を含有する任意のガラス繊維濾紙も同様に適切である。

次に懸濁液（本明細書では「樹脂」又は「スラリー」とも呼ぶ）を次のように調製した。洗浄したガラス微細繊維スラッジ４１．７ｇとシリカゲル６０−１０（米国、メリーランド州、ボルチモアに所在のＷ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ，ＤａｖｉｓｏｎＣｈｅｍｉｃａｌＤｉｖｉｓｉｏｎ製、細孔径６０Å、粒度９〜１１μｍ）４５０ｇを７Ｍグアニジン−ＨＣｌ溶液３０Ｌに加えた。

シリカゲル６０−１０が好ましいが、細孔径６０Å、粒度３０μｍ〜１０５μｍのシリカゲル、細孔径１００Å、粒度３０μｍ〜１０５μｍのシリカゲル、細孔径２５０Å、粒度３０μｍ〜５０μｍのシリカゲル、細孔径１００Å、粒度７０μｍ〜２００μｍのシリカゲルグレード２２、細孔径６０Å、粒度７０μｍ〜２００μｍのシリカゲルグレード６２も許容できる。

均質懸濁液が得られるまで混合物を撹拌した。この懸濁液が本発明の懸濁液である。

均質懸濁液のｐＨは５．５であり、脱イオン蒸留水１０ｍｌに樹脂１０μｌを混合することにより得られた懸濁液の導電率は１１５０μｍｈｏであった。

本実施例の懸濁液を調製するために使用したシリカゲル：ガラス繊維濾紙の重量比は約１０：１であり、５：１〜２０：１の範囲の比が許容できる。

シリカゲルの量を塩酸グアニジニウム溶液１Ｌ当たり１ｇからグアニジニウム塩溶液１Ｌ当たり２０ｇまで変化させた以外は本実施例に記載したと同様に各々調製した種々の懸濁液で実施した一連の実験によると、ＤＮＡをその水溶液から回収するのに最も有効な懸濁液は本実施例に記載した塩酸グアニジニウム溶液１Ｌ当たり１５ｇの濃度の懸濁液であることが判明した。

撹拌後、放置すると材料は非常に迅速に懸濁液から沈殿した。沈殿した材料を上清と十分に撹拌又は混合することにより、使用直前に均質懸濁液（樹脂）を再構成しなければならない。

チオシアン酸グアニジニウムを用いた樹脂の調製
７Ｍグアニジン−ＨＣｌの代わりにチオシアン酸グアニジニウム（米国、オハイオ州、クリーブランドに所在のＡｍｒｅｓｃｏ製結晶ＡｍｒｅｓｃｏＵｌｔｒｏｐｕｒｅ）の６Ｍ溶液を使用した以外は実施例１の手順に従って本実施例の標記樹脂を調製した。ＥＤＴＡ（米国、ミズーリ州、セントルイスに所在のＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ製ＥＤＴＡ２ナトリウム塩）を最終濃度１０ｍＭまで加えることによりチオシアン酸グアニジニウムが変色しないように安定化した。

チオシアン酸グアニジニウムは高融点及び低融点のどちらのアガロース組成物も有効に溶解するので、核酸フラグメントをアガロース及び他のゲルから単離するために本発明を使用する場合にはチオシアン酸グアニジニウムを使用するのが好適である。

プラスミド精製プロトコル
本実施例は、大腸菌培養物１〜３ｍｌから出発して実施例１の樹脂を使用する標準プラスミド単離手順について記載する。

Ａ．緩衝液組成
１．細胞再懸濁溶液：
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５
１０ｍＭＥＤＴＡ
１００μｇ／ｍｌＲＮアーゼＡ（リボヌクレアーゼＡ）（ＤＮアーゼ非含有）
２．カラム洗浄溶液：
（ａ）２００ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５
（ｂ）（ａ）１：１．４を９５％ＥｔＯＨ（エタノール）で希釈
３．ＴＥ緩衝液：
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５
１ｍＭＥＤＴＡ
４．中和用溶液：
１．３２ＭＫＯＡｃ（酢酸カリウム），ｐＨ４．８
５．細胞溶解溶液：
０．２ＭＮａＯＨ
１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
Ｂ．清澄溶解物の生成
１．細胞１〜３ｍｌをマイクロ遠心機で１〜２分間最高速度で遠心することによりペレット化する。細胞ペレットを細胞再懸濁溶液２００μｌに再懸濁する。再懸濁細胞をマイクロ遠心管に移す。

２．細胞溶解溶液２００μｌを加え、管を数回反転することにより混合する。細胞懸濁液はほとんどすぐに清澄になる。すぐに清澄にならない場合には清澄になるまで反転を続ける。

３．中和用溶液２００μｌを加え、管を数回反転することにより混合する。

４．マイクロ遠心機を最高速度で５分間回転させる。

５．清澄上清を新しいマイクロ遠心管にデカントする。清澄上清はＤＮＡを含有する水溶液であり、この水溶液から本発明の方法によりＤＮＡを分離又は単離することができる。

真空マニホールドを使用できる場合には、下記Ｃを実施する。真空マニホールドを使用できない場合には、下記Ｄを実施する。

Ｃ．真空マニホールドを使用するプラスミド精製
１．実施例１の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．５からの上清に加え、管を反転することにより混合する。アリコートを取り出す前に実施例１の樹脂を十分に混合する。必要であれば樹脂を２５〜３７℃まで（１０分以下）昇温させ、結晶を溶解させる。３０℃を越える温度では樹脂を使用しない。シリカゲル樹脂が多少沈降するが、シリカゲルの粒度が微細であるため、粒子はシリカゲルでなく珪藻土から作成した樹脂より長時間溶液に懸濁し続ける。

２．各プラスミドミニプレップ毎に１本のＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐミニカラムを使用する。もっと大きい調製物にはＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｉｄｉｐｒｅｐ、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍａｘｉｐｒｅｐ又はＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｅｇａｐｒｅｐカラムを使用できる。Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐ、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｉｄｉｐｒｅｐ、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍａｘｉｐｒｅｐ又はＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｅｇａｐｒｅｐカラムは米国、ウィスコンシン州、マディソンに所在のＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．から市販されており、クロマトグラフィー樹脂を充填せずに供給され、核酸を含有する水溶液から核酸を回収するのに好都合に使用できるように設計されたクロマトグラフィーカラムである。当業者は、核酸を分離又は単離するための本発明の方法で使用するのに同様に適切な類似のカラムをＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．以外からも容易に入手できることを理解されよう。本実施例に記載する手順ではＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐミニカラムを使用しているが、当業者は大型のカラムで使用する場合の手順の改変方法を容易に理解されよう。３ｍｌ容使い捨て注射器からプランジャーを取り外しておく。３ｍｌ容使い捨てルア−ロック注射器筒を各ミニカラムのルア−ロック伸長部に装着し、ミニカラム／注射器筒アセンブリの先端を真空マニホールド（例えばＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，ＣａｔａｌｏｇＮｏ．Ａ７２３１のＶａｃ−ＭａｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙＶａｃｕｕｍＭａｎｉｆｏｌｄ）に挿入する。

３．樹脂／ＤＮＡ混合物を注射器筒にピペットで移し、真空を加えることにより樹脂（スラリー）をミニカラムに吸引する。樹脂／ＤＮＡ混合物がカラムに入ったら真空を遮断する。

４．カラム洗浄溶液２ｍｌを注射器筒に加えることによりミニカラムを真空下に洗浄した後、再び真空を加えて溶液をミニカラムから吸引する。

５．真空を更に０．５〜２分間持続することにより樹脂を乾燥する。本発明の方法に関して、段階Ｃ．４及びＣ．５はシリカ材料の混合物からカオトロピックイオン（及びヌクレオチド又は短いオリゴヌクレオチドなどの他の低分子量物質）の「実質的に全部」を分離すると同時に、前記シリカ材料からタンパク質を実質的に完全に溶離させる第４の（例えばアルカノールの）水溶液で前記シリカ材料混合物を洗浄する方法である。

６．注射器筒を取り外し、ミニカラムを１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に移す。ミニカラムをマイクロ遠心機で２分間最高速度で回転させ、残留カラム洗浄溶液を除去する。

７．ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。ミニカラムに水又はＴＥ緩衝液５０μｌを加えて１分間待機する。大きいプラスミド（１０ｋｂ以上）の場合には予熱（６５〜７０℃）した水又はＴＥ緩衝液を使用すると収率を高めることができる。２０ｋｂ以上のプラスミドでは８０℃の水又はＴＥ緩衝液を使用する。

８．ＤＮＡを溶離させるためにマイクロ遠心管に入れたミニカラムを０．５〜１．０分間最高速度で回転させる。ミニカラムを取り出して廃棄する。プラスミドＤＮＡはマイクロ遠心管内の水又はＴＥ緩衝液中で４℃又は−２０℃で保存することができる。各回の単離毎のプラスミドＤＮＡの収量は１０μｇに及ぶ。収量に影響する因子［即ち使用する細菌培養物の容量（１〜３ｍｌ）、プラスミドのコピー数及び使用する細菌種］を一定に保つと、プラスミドＤＮＡの収量は非常に安定する。細菌培養物１．５ｍｌを各々使用する連続試験の結果、４．１μｇ±０．４μｇという予想外に安定したプラスミドＤＮＡ収量が得られた。シリカゲルの代わりに珪藻土を使用すると、収量の変動幅が広くなり、細菌培養物１．５ｍｌから得られるプラスミドＤＮＡの収量は５．４μｇ±１．５μｇであった。得られたプラスミドＤＮＡは、分析（例えば制限分析、配列決定）又は他の分子生物学的手順（例えば形質転換、特定制限フラグメントの取得）に適した状態である。

Ｄ．（真空を用いずに）使い捨て注射器を使用するプラスミド精製
１．実施例１の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．５からの上清に加え、管を反転することにより混合する。アリコートを取り出す前に実施例１の樹脂を十分に混合する。必要であれば樹脂を２５〜３７℃まで（１０分以下）昇温させ、結晶を溶解させる。３０℃を越える温度では樹脂を使用しない。２．各ミニプレップ毎に１本のミニカラム（上記Ｃ参照）を使用する。３ｍｌ容使い捨て注射器からプランジャーを取り外しておく。使い捨て注射器筒をミニカラムのルア−ロック伸長部に装着する。

３．樹脂／ＤＮＡ混合物を注射器筒にピペットで移す。注射器プランジャーを挿入し、注射器プランジャーでスラリーをミニカラムに静かに押し込む。

４．注射器をミニカラムから取り外し、プランジャーを注射器から取り外す。注射器筒をミニカラムに再装着する。カラム洗浄溶液２ｍｌをピペットで注射器に移す。注射器プランジャーを注射器に挿入し、注射器プランジャーを用いてカラム洗浄溶液をミニカラムに静かに押し込む。

５．注射器を取り外してミニカラムを１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に移し、マイクロ遠心機に入れる。ミニカラムをマイクロ遠心機で最高速度で２分間回転させ、樹脂を乾燥する。

６．ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。

７．プラスミドＤＮＡを溶離させるために、ミニカラムに水又はＴＥ緩衝液５０μｌを加え、１分間待機する。もっと大きいプラスミド（１０ｋｂ以上）の場合には予熱（６５〜７０℃）した水又はＴＥ緩衝液を使用すると収率を高めることができる。２０ｋｂ以上のプラスミドでは８０℃の水又はＴＥ緩衝液を使用する。

８．ミニカラムを入れたマイクロ遠心管をマイクロ遠心機で０．５〜１．０分間回転させる。ミニカラムを取り出して廃棄する。プラスミドＤＮＡは遠心管内で４℃又は−２０℃で保存することができる。各回の単離毎のプラスミドＤＮＡの収量は１０μｇに及ぶ。収量に影響する因子［即ち使用する細菌培養物の容量（１〜３ｍｌ）、プラスミドのコピー数及び使用する細菌種］を一定に保つと、プラスミドＤＮＡの収量は非常に安定する。得られたプラスミドＤＮＡは分析（例えば制限分析、配列決定）又は別の分子生物学的手順（例えば形質転換、特定制限フラグメントの取得）に適した状態にある。

カオトロピック塩として過塩素酸ナトリウムを使用することが米国特許第５，０７５，４３０号に教示され、塩の水溶液と共に珪藻土を単独使用する市販のＤＮＡ精製用キットではこの塩を用しているが、本実施例に記載する方法でカオトロピック塩として塩酸グアニジニウムの代わりに過塩素酸ナトリウムを使用するのは望ましくないことが判明した。理由は不明であるが、過塩素酸ナトリウム含有懸濁液を細菌溶解物からのＤＮＡを含有する溶液と混合すると沈殿が形成される。この沈殿の形成により、シリカ材料に結合可能なＤＮＡの量が著しく減少し、本実施例に記載する手順では、ＤＮＡ溶液とカオトロピック塩溶液中のシリカ材料の懸濁液の組み合わせをミニカラムに充填すると、ミニカラムが目詰まりを起こす。有利且つ予想外なことに、カオトロピック塩として塩酸グアニジニウムを使用すると沈殿は形成されない。

低ゲル化／融解温度アガロースゲルからのＤＮＡフラグメント単離
本実施例は、実施例２の樹脂（懸濁液）を使用する標準ＤＮＡフラグメント精製プロトコルについて記載する。

Ａ．緩衝液の組成
カラム洗浄溶液：
水中８０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール
ＴＥ緩衝液：
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５
１ｍＭＥＤＴＡ
Ｂ．低融点／ゲル化点アガロース電気泳動
１．標準プロトコルを使用して低融点／ゲル化点アガロースゲル中でＤＮＡサンプルを電気泳動及び染色する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）参照。

２．清潔な滅菌した剃刀の刃又は解剖刀を使用して所望のＤＮＡフラグメントを切り出す。フラグメントのＵＶ光照射を最小限にするように迅速に、中波長又は長波長ＵＶ光でフラグメントを可視化する。フラグメントはアガロース≦３００ｍｇ（約３００μｌ）中で単離すべきである。

３．アガローススライスを１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に移し、アガロースが完全に融解するまで約２分間サンプルを７０℃でインキュベートする。本発明のＤＮＡ分離／単離方法に関して、ＤＮＡを含有する融解ゲルスライスは、本発明の方法を適用できるＤＮＡを含有する水溶液の１例である。

Ｃ．真空マニホールドを使用するフラグメント精製
１．実施例２の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．３からの融解アガローススライスに加え、２０秒間渦形成することにより混合する。

２．各ゲルスライス毎に１本のミニカラム（実施例３参照）を使用する。３ｍｌ容使い捨てルア−ロック注射器からプランジャーを取り外し、注射器筒を各ミニカラムのルア−ロック伸長部に装着し、カラムアセンブリの先端を真空マニホールドに挿入する。

３．結合したＤＮＡを含有する樹脂を注射器筒にピペットで移し、真空を加えることにより樹脂をミニカラムに吸引する。

４．カラム洗浄溶液２ｍｌを注射器筒に加えることによりミニカラムを真空下に洗浄する。

５．真空を更に０．５〜２分間持続することによりミニカラムを乾燥する。

６．注射器筒を取り外し、ミニカラムをマイクロ遠心管に移す。

７．ミニカラムを２分間回転させ、残留カラム洗浄溶液を除去する。

８．ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。

９．結合したＤＮＡを溶離させるために、水又はＴＥ緩衝液５０μｌをミニカラムに加え、１分間待機する。ＤＮＡは３０分間までミニカラム上で無傷に維持される。

１０．マイクロ遠心管でミニカラムを０．５〜１．０分間１２，０００×ｇで回転させる。ミニカラムを取り出して廃棄する。単離したＤＮＡは、分析又は他の分子生物学的手順に適した状態でマイクロ遠心管内の水又はＴＥ緩衝液中４℃又は−２０℃で保存することができる。

Ｄ．真空を用いずに使い捨て注射器を使用するフラグメント精製
１．実施例２の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．３からの融解アガローススライスに加え、２０秒間渦形成する。

２．各ゲルスライス毎に１本のミニカラム（実施例３参照）を使用する。３ｍｌ容使い捨てル注射器からプランジャーを取り外しておく。注射器筒を各ミニカラムのルア−ロック伸長部に装着する。

３．結合したＤＮＡを含有する樹脂をピペットで注射器筒に移す。注射器プランジャーを挿入し、注射器プランジャーでスラリーをミニカラムに静かに押し込む。

４．ミニカラムを注射器から取り外し、溶液を注射器に入れ、注射器をミニカラムに再装着してカラム洗浄溶液を注射器プランジャーでミニカラムに静かに押し込むことにより、ミニカラムをカラム洗浄溶液２ｍｌで洗浄する。

５．注射器筒を取り外し、ミニカラムをマイクロ遠心管に移す。ミニカラムを１２，０００×ｇで２分間回転させ、樹脂を乾燥する。

６．ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。

７．結合したＤＮＡを溶離させるために、水又はＴＥ緩衝液５０μｌをカラムに加え、１分間待機する。

８．ミニカラムを入れたマイクロ遠心管を０．５〜１．０分間１２，０００×ｇで回転させる。ミニカラムを取り外して廃棄する。単離したＤＮＡは、分析又は他の分子生物学的手順に適した状態でマイクロ遠心管内の水又はＴＥ緩衝液中４℃又は−２０℃で保存することができる。

Ｍ１３ファージからの１本鎖ＤＮＡの単離
本実施例は、Ｍ１３ファージに感染した大腸菌の培養物１ｍｌから出発して実施例１の樹脂を使用する１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の精製用プロトコルについて記載する。

Ａ．緩衝液の組成
１．カラム洗浄溶液：
ａ）２００ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５。

ｂ）（ａ）を９５％エタノールで１：１．４に希釈。
Ｂ．Ｍ１３ファージに感染した大腸菌培養物からの上清
１．感染培養物１．５ｍｌをマイクロ遠心管に移し、５分間回転させる。

２．清澄化上清１ｍｌをピペットで新しい管に移す。

Ｃ．真空マニホールドを使用するＤＮＡ精製
１．実施例１の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．２からの上清に加え、反転により混合する。

２．各サンプル毎に１本のミニカラムを使用する。３ｍｌ容使い捨て注射器筒を各ミニカラムのルア−ロック伸長部に装着し、カラムアセンブリの先端を真空マニホールドに挿入する。

３．結合したＤＮＡを含有する樹脂をピペットで注射器筒に移し、真空を加えることによりスラリーをミニカラムに吸引する。樹脂ベッドのみを残して完全なスラリー容量がカラムに吸引された後に真空源を遮断する。

５．真空を更に０．５〜２分間持続することにより樹脂を乾燥する。

６．注射器筒を取り外し、ミニカラムをマイクロ遠心管に移す。ミニカラムをマイクロ遠心機で最高速度で２分間遠心し、残留カラム洗浄溶液を除去する。

７．ＤＮＡを溶離させるために、ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。８０℃に予熱した水又はＴＥ緩衝液１００μｌを加える。

８．ミニカラムをマイクロ遠心機で０．５〜１．０分間回転させる。ミニカラムを取り出して廃棄する。こうして得られたＤＮＡは、分析又は他の分子生物学的手順に適した状態でマイクロ遠心管内の水又はＴＥ緩衝液中４℃又は−２０℃で保存することができる。

Ｄ．（真空を用いずに）使い捨て注射器を使用するＤＮＡ精製
１．実施例１の樹脂１ｍｌを段階Ｂ．２からの上清に加え、反転により混合する。

２．各サンプル毎に１本のミニカラムを使用する。３ｍｌ容使い捨て注射器筒を各ミニカラムのルア−ロック伸長部に装着する。

４．ミニカラムを注射器から取り外して溶液を注射器に入れることにより、ミニカラムをカラム洗浄溶液２ｍｌで洗浄する。注射器をミニカラムカラムに再装着して、カラム洗浄溶液を注射器プランジャーでミニカラムに静かに押し込む。

５．ミニカラムをマイクロ遠心管に移し、マイクロ遠心機に入れる。ミニカラムを２分間回転させて樹脂を乾燥する。

６．ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。

７．ＤＮＡを溶離させるために、８０℃に予熱した水又はＴＥ緩衝液１００μｌをミニカラムに加える。

８．ミニカラムを入れたマイクロ遠心管を遠心機で０．５〜１．０分間回転させる。ミニカラムを取り出して廃棄する。こうして得られたＤＮＡは、分析又は他の分子生物学的手順に適した状態でマイクロ遠心管内の水又はＴＥ緩衝液中４℃又は−２０℃で保存することができる。

λＤＮＡの単離
標準手順により得たファージ溶解物から得たλファージのペレットを標準ファージ緩衝液（例えば１５０ｍＭＮａＣｌ，４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１０ｍＭＭｇＳＯ_４）０．５ｍｌに再懸濁する。次に再懸濁したファージを１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に移し、１２，０００×ｇで１０秒間遠心して不溶性粒子を除去する。ペレットを撹乱しないように注意しながら上清を吸引し、新しい１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に移す。上清は、本発明の分離及び単離方法を適用するＤＮＡ（この場合はパッケージλＤＮＡ）の水溶液である。実施例１の懸濁液１ｍｌを加え、管を反転することにより混合する。

真空マニホールドを使用する場合には、実施例５の段階Ｃ．２に従う。次にファージ懸濁液をピペットで注射器筒に移し、真空を加えて懸濁液をミニカラムに吸引する。８０％イソプロパノール（カラム洗浄溶液）２ｍｌを注射器筒に加え、真空を加えてこの溶液をミニカラムに吸引する。更に０．５〜２分間真空に引き続けることにより懸濁液を乾燥する。注射器筒を取り外し、ミニカラムを１．５ｍｌ容遠心管に移す。ミニカラムを１２，０００×ｇで２分間遠心し、残留イソプロパノール溶液を除去する。ミニカラムを新しいマイクロ遠心管に移す。８０℃に予熱した水又はＴＥ緩衝液１００μｌを加え、その直後に１２，０００×ｇで０．５〜１．０分間ミニカラムを遠心し、精製λＤＮＡを溶離する。ミニカラムを取り出して廃棄する。精製λＤＮＡはマイクロ遠心管内で４℃又は−２０℃で保存することができる。

真空マニホールドを使用しない場合には、注射器プランジャーを使用してファージ懸濁液をゆっくり且つ静かにミニカラムに押し込んだ後、注射器をミニカラムから取り外し、プランジャーを取り外して注射器をミニカラムに再装着し、８０％イソプロパノール２０ｍｌをピペットで注射器に移し、プランジャーを再挿入し、イソプロパノール溶液をカラムに静かに押し込む以外は前項と同様に操作する。次にミニカラムを１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に移し、１２，０００×ｇで２分間遠心してイソプロパノール溶液を樹脂から除去する。カラムを新しいマイクロ遠心管に移す。８０℃に予熱した水又はＴＥ緩衝液１００μｌを加え、その直後にミニカラムを０．５〜１．０分間１２，０００×ｇで遠心し、精製λＤＮＡを溶離させる。ミニカラムを取り出して廃棄する。λＤＮＡはマイクロ遠心管内で４℃又は−２０℃で保存することができる。

ＰＣＲにより増幅したＤＮＡの精製
５００ｂｐＰＣＲ産物５０ｎｇ〜１５μｇを実施例１又は実施例２の懸濁液１ｍｌに加えると、９５％を越える回収率が得られる。

低ゲル化／融解温度アガロースゲルバンドスライスからの精製を使用した回収率（５００ｂｐ産物で７０〜９０％）は直接精製を使用した回収率（９５％まで）よりも低い。非特異的増幅産物の存在が望ましくない場合にはアガロース法が推奨される。

７Ｍユリアポリアクリルアミドゲルのスライスからは並の回収率が得られる。３７℃で少なくとも３０分間にわたるゲルからＴＥ緩衝液へＤＮＡの受動的溶離を使用することができる。本発明の方法を適用するＤＮＡ溶液としてＴＥ溶液中のＤＮＡを使用することができる。

直接精製では、ＰＣＲ反応からの水（下層）相を清潔なマイクロ遠心管に移す。サンプル中の鉱油が多すぎると、ＰＣＲ産物精製の収率が低下する恐れがある。５０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８），１．５ｍＭＭｇＣｌ_２，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶液のアリコート１００μｌを１２ｍｍ×７５ｍｍポリプロピレン管又は１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に加える。ＰＣＲ反応混合物３０〜３００μｌを加える。短時間渦形成して混合する。実施例１又は実施例２の懸濁液１ｍｌを加え、１分間に３回短時間渦形成する。次に実施例６又はこのような手順に関する他の実施例に記載するように、真空マニホールド手順又はマニホールドを使用しない手順を実施する。

ＲＮＡ精製
ＲＮＡは実施例１の樹脂の代わりに下記樹脂を使用して実施例３の手順に従うことにより精製することができる。超純粋グアニジン−ＨＣｌ（米国、オハイオ州、クリーブランドに所在のＡｍｒｅｓｃｏ製ＡｍｒｅｓｃｏＵｌｔｒｏｐｕｒｅ）２０ｋｇを脱イオン蒸留水３０Ｌに溶解することにより７Ｍグアニジン−ＨＣｌ（即ち塩酸グアニジニウム）溶液を調製した。

次に下記のように樹脂用ガラス粒子（即ち本実施例ではガラス微細繊維）を作成した。１２．５ｃｍのガラス繊維濾紙（多数の実験室科学装置販売業者を通してＷｈａｔｍａｎから広く販売されているＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ａ，ＣａｔａｌｏｇＮｏ．１８２０−１２５）６３枚（総重量約４１．７ｇ）を４分の１に切断した。次に中〜高速ポリトロンで分散しながら濾紙を５ＭＮａＣｌ６Ｌに漸次加えた。濾紙の全部を加えた後に、残っている紙が見えなくなるまで均質スラッジに均質化し、この均質化を約５分間続けた。次にスラッジをブフナー漏斗で集め、脱イオン蒸留水２４Ｌで洗浄した。

本実施例ではＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ａ濾紙を特定しているが、ＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｂ、ＧＦ／Ｃ及びＧＦ／Ｆ濾紙、並びに本明細書中に記載するガラス微細繊維作成工程により除去可能な結合剤を含有する任意のガラス繊維濾紙も同様に適切である。

次に懸濁液（本明細書中では「樹脂」又は「スラリー」とも言う）を以下のように調製した。洗浄したガラス微細繊維スラッジ４０ｇとシリカゲル６０−１０（米国、メリーランド州、ボルチモアに所在のＷ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ，ＤａｖｉｓｏｎＣｈｅｍｉｃａｌＤｉｖｉｓｉｏｎ製、細孔径６０Å、粒度９〜１１μｍ）９００ｇを７Ｍグアニジン−ＨＣｌ溶液３０Ｌに加えた。この溶液にクエン酸塩（４００ｍＭ，ｐＨ４．０）（米国、ミズーリ州、セントルイスに所在のＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙの分子生物学グレードクエン酸）１７６４．６ｇを加えた。

あるいは、（２００ｍＭクエン酸緩衝液を使用して）７Ｍ塩酸グアニジン，ｐＨ４．０中で０．１４％（ｗ／ｖ）ＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ａガラス微細繊維スラッジ、４％（ｗ／ｖ）シリカゲル６０−１０からＲＮＡ単離用樹脂を調製した。

これらの樹脂のいずれか一方１ｍｌを実施例３の手順に従って使用し、ＲＮＡを単離した。

組織からのＲＮＡ精製
本実施例は、実施例８の樹脂を使用する動物組織からのＲＮＡ単離手順について記載する。

Ａ．精製用調製物
１．５０ｍｌ容厚壁ポリプロピレン遠心管を０．０５％ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）中に室温で１時間置いた後、管を３０分間オートクレーブに入れ、残留ＤＥＰＣを分解させた。

２．フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１ｖ／ｖ／ｖ）溶液１００ｍｌを室温で１５分間放置し、相を分離させた。

３．変性用溶液を次のように調製した。チオシアン酸グアニジン（最終濃度４Ｍ）２５ｇをＣＳＢ緩衝液［脱イオン水中４２ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２ｍＭβメルカプトエタノール及び０．８３％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン］３３ｍｌに加え、成分が完全に溶解するまで十分に混合した。変性用溶液を６５℃水浴中で加熱し、４℃で保存した。

Ｂ．組織破壊
最適性能を得るために、サンプルを得た直後にＲＮＡを単離した。他方、サンプルを得た直後にＲＮＡを単離しない場合には、サンプルを液体窒素中で凍結し、将来の使用に備えて−７０℃で保存することができる。

１．変性用溶液１２ｍｌを５０ｍｌ容滅菌細胞培養管に分配し、５分間氷冷した。

２．組織（新鮮又は凍結）１ｇを５０ｍｌ容滅菌円錐形細胞培養管に入れ、段階Ｂ．１からの変性用溶液を加えた。高レベルに設定した高速ホモジナイザー（ＢｒｉｎｋｍａｎｎＰｏｌｙｔｒｏｎ）で組織を１５〜３０秒間破壊した。あるいは、組織を細断し、Ｄｏｕｎｃｅガラス−Ｔｅｆｌｏｎホモジナイザーで破壊してもよい。

Ｃ．ＲＮＡ抽出
１．破壊したサンプルに２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１．２ｍｌを加え、反転により十分に混合した。

２．段階Ａ．２からのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合物の下層有機相１２ｍｌを段階Ｃ．１のサンプルに加え、反転により混合した。次にサンプルを１０秒間震盪し、１５分間氷冷した。

３．段階Ｃ．２の混合物を５０ｍｌ容ＤＥＰＣ処理管（段階Ａ．１で準備）に移し、１０，０００×ｇで２０分間４℃で遠心した。固定角度型遠心機又はスイングバケット型遠心機のいずれを使用してもよい。

Ｄ．ＲＮＡ沈殿
１．等容量のイソプロピルアルコールを段階Ｃ．３の混合物に加え、少なくとも３０分間−２０℃でインキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡ含量が比較的少ないサンプルからＲＮＡを沈殿させるには長時間沈殿（一晩まで）を使用すべきである。

２．段階Ｄ．１の沈殿ＲＮＡを１０，０００×ｇで１５分間４℃で遠心することによりペレット化した。

３．ＲＮＡペレットを変性用溶液５ｍｌに再懸濁し、ＲＮＡが溶解するまで渦形成した。場合によっては、ペレットを再懸濁させるために６５℃までの加熱が必要な場合もある。加熱はできるだけ短時間にすべきである。

４．段階Ｄ．３の再懸濁ＲＮＡ溶液に等容量のイソプロピルアルコールを加え、上記段階Ｄ．１に記載したようにＲＮＡを沈殿させた。

Ｅ．ＲＮＡ洗浄
１．段階Ｄ．４の沈殿ＲＮＡを１０，０００×ｇで１５分間４℃で遠心することによりペレット化し、ペレットを氷冷７５％エタノールで洗浄し、上記のように遠心した（段階Ｅ．１）。この段階には最低１０ｍｌの７５％エタノールを使用すべきである。

２．段階Ｅ．１で調製したペレットを真空デシケーターで１５〜２０分間乾燥した。ＲＮＡペレットは完全に乾燥すると次段階で再懸濁しにくくなるので完全に乾燥すべきではない。

３．段階Ｅ．２のＲＮＡペレットをＲＮアーゼ非含有水（米国、ウィスコンシン州、マディソンに所在のＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．）１〜３ｍｌに再懸濁し、−２０℃で保存した。長期間保存するためには、ｐＨ５．０の０．２５Ｍ酢酸ナトリウム溶液をエタノール２．５容量に加えることにより調製した溶液を使用してＲＮＡを再沈殿させ、−７０℃で保存すべきである。

Ｆ．ＲＮＡ精製
その後、実施例３の段階Ｃ及びＤのプロトコルに従って実施例８のＲＮＡ樹脂のいずれか一方１ｍｌを使用することにより、ＲＮＡを精製することができる。

樹脂成分最適化
ＧＦ／Ａ粉砕ガラス繊維、シリカゲル６０−１０及び７Ｍ塩酸グアニジン水溶液を使用して実施例１に記載したように対照樹脂を調製した。樹脂は０．３５％（ｗ／ｖ）ＧＦ／Ａと３．５％（ｗ／ｖ）シリカゲルを含有していた。この樹脂は培養物１００〜１０００ｍｌからプラスミドＤＮＡを単離するのに適している。

この樹脂を対照として使用し、ＤＮＡの単離における樹脂の成分の各々の機能範囲を示すために成分の各々を一度に１種類ずつ変化させ、他の成分は一定に維持して一連の実験を実施した。

１．樹脂のシリカ含量の変化

２．樹脂のＧＦ／Ａ繊維含量の変化

３．樹脂の塩酸グアニジンモル濃度の変化

樹脂成分最適化
ＧＦ／Ａ粉砕ガラス繊維、シリカゲル６０−１０及び７Ｍ塩酸グアニジン水溶液を使用して実施例１に記載したように対照樹脂を調製した。樹脂は０．１４％（ｗ／ｖ）ＧＦ／Ａと１．４％（ｗ／ｖ）シリカゲルを含有していた。この樹脂は培養物１〜３ｍｌからプラスミドＤＮＡを単離するのに適している。

１．樹脂のシリカ含量の変化

２．樹脂のＧＦ／Ａ繊維含量の変化

３．樹脂の塩酸グアニジンモル濃度の変化

以上、本発明を多少特定的に説明した。当業者は発明の趣旨の範囲内で上記態様の多数の変形及び変更が存在することを理解されよう。本発明はこのような変形及び変更を包含するものである。

Claims

（ａ）水溶液中に含まれる核酸をシリカゲルおよびガラス粒子よりなる組成物に結合させることを含み、シリカゲルのガラス粒子に対する比が重量で１：１〜１００：１である、核酸を精製または分離する方法。
（ｂ）核酸が結合されたシリカゲルとガラス粒子の少なくとも１部分を水溶液から分離し；
（ｃ）分離したシリカゲル、ガラス粒子および結合核酸を、結合核酸以外の汚染物質を効果的に除去する第２溶液で洗浄し；および
（ｄ）結合核酸をシリカゲルおよびガラス粒子から溶離すること、を更に含む請求項１に記載の方法。
ガラス粒子が実質的にガラス微細繊維よりなり、ガラス微細繊維１重量部に対してシリカゲルの重量比が５〜５０重量部である請求項２に記載の方法。
水溶液がカオトロピック塩を更に含む請求項２に記載の方法。
水溶液がキレート化剤を更に含む請求項４に記載の方法。
段階（ｄ）がＴＥ緩衝液を使用して実施される請求項２に記載の方法。
分離される核酸がＤＮＡである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
分離される核酸がＲＮＡである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
５０塩基より大きい長さの核酸を優先的に単離する請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
段階（ｃ）が、メタノール、エタノールおよびイソプロパノールからなる群から選択された２０〜９５容量％のアルコールを含む第２溶液で結合核酸を洗浄することを更に含み；および段階（ｄ）が、６．５および８．５の間のｐＨを有する低塩緩衝液を含む第３溶液で結合核酸を溶離することを更に含む、請求項２に記載の方法。