KR100356044B1

KR100356044B1 - 개질된 수정미세섬유막 및 그 이용

Info

Publication number: KR100356044B1
Application number: KR1020000038956A
Authority: KR
Inventors: 이상민
Original assignee: 주식회사 지노타인
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2002-10-12
Also published as: KR20010034995A

Abstract

본 발명은 개질된 수정미세섬유막 및 그 이용에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수정미세섬유막에 NaOH 또는 NaOH와 PCl₃로 조합처리하여 막 표면의 친수성(hydrophilicity)과 전기양성도(electropositivity)를 DNA나 RNA를 추출하기에 유용하도록 개질된 수정미세섬유막(modified quartz microfiber membrane)에 관한 것이다. 이러한 본 발명에 따르면 보다 간단하고 신속하게 고순도의 두 가닥 사슬 플라스미드 DNA, 람다 DNA, 염색체(chromosomal) DNA, 단일 가닥사슬 파아지 DNA를 정제할 수 있으며, PCR 생성물로부터 여러가지 조요소(cofactor), 완충용액 구성물 그리고 프라이머를 제거할 수 있으며, 아가로오즈 젤 또는 폴리아크릴아마이드 젤로부터 DNA 단편을 효과적으로 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 정제된 플라스미드 DNA의 제한효소 분석, 형질감염(transfection), 매뉴얼 서열분석(mannual sequencing) 그리고 자동서열분석(automatic sequencing)에서도 보다 우수한 효과를 얻을 수 있다.

Description

개질된 수정미세섬유막 및 그 이용{A Modified Quartz microfiber membrane and the Use there of}

본 발명은 개질된 수정미세섬유막 및 그 이용에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수정미세섬유막에 NaOH 또는 NaOH와 PCl₃로 조합처리하여 막 표면의 친수성(hydrophilicity)과 전기양성도(electropositivity)를 DNA나 RNA를 추출하기에 유용하도록 개질된 수정미세섬유막(modified quartz microfiber membrane)에 관한 것이다.

일반적으로, 분자생물학에 있어서 높은 순도의 두 가닥 사슬 플라스미드 DNA, 단일 가닥사슬 파아지(phage) DNA, 람다(lamda) DNA, 염색체(chromosomal) DNA, PCR 생성물, RNA 그리고 아가로오즈 젤 또는 폴리아크릴아마이드로부터 정제된 DNA 단편의 준비는 매우 중요한 작업이다. 따라서, 이러한 핵산을 정제하기 위한 방법은 빠르고 간편하여야 하며 어떠한 부수적인 조작이 없을 수록 좋으며, 이렇게 정제된 DNA나 RNA는 형질전환이나 제한효소 분석, 연결(ligation), 서열분석(sequencing), 형질감염(transfection) 등을 위하여 즉시 사용할 수 있다.

이러한 특징을 만족시킬 수 있는 핵산을 얻기 위한 방법으로는 현재 자동화된 DNA 정제장치가 있다. 그러나, 이러한 장치들은 고가이며 유지비가 너무 많이 소요되는 문제점이 있어왔다.

그래서, 많은 실험실에서는 전통적으로 사용되는 알콜 침전법을 사용하는데이 방법 역시 많은 노동력과 시간을 필요로 할 뿐만 아니라, 정제된 DNA의 순도가 너무 낮은 문제점이 있다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하여 좀 더 높은 순도를 가진 DNA를 정제하기 위하여 CsCl 구배, 겔 여과(gel filtration), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography) 등을 사용하여 왔다. 그런데 이러한 방법들은 음전하된 세포구성물질들이 DNA와 함께 정제되어 원하지 않은 수준의 불순물이 포함될 수도 있기 때문에 별도의 정제과정이 필요하거나 순도가 매우 떨어지는 문제점이 있어왔다.

또한, 유리 또는 셀라이트(celite)와 같은 실리카(silica) 표면을 지닌 고체상을 이용하여 DNA를 정제하는 방법도 있다. 그러나, 이들 방법은 과량의 DNA를 고체상 표면에 부착시킬 수 있거나 추출에 의하여 DNA 분자를 회수하기에 적합한 표면을 가지고 있지 않을 뿐만 아니라, 이러한 형태의 DNA 결합은 독성이 있으며 가격이 비싼 높은 농도의 차오트로피스(chaotropes)이나 알콜을 필요로 한다. 예를 들어 차오트로피스(chaotropes)가 존재하는 상태에서 유리분말 또는 유리섬유막에 DNA를 결합시킨 후 알콜로 차오트로픽 이온(chaotropic ion)을 제거하고 낮은 농도의 완충용액 또는 물로 DNA를 추출할 수 있다. 하지만 유리분말은 DNA 결합 능력이 낮으며 큰 DNA인 경우에 잘라지는 경향이 있다. 따라서, 보다 간단 신속하면서도 저렴하고, 불순물 없이 DNA나 RNA만을 고순도로 분리하는 방법의 개발 필요성이 절실히 대두되고 있는 실정이었다.

이에, 본 발명의 별명자는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 수정미세섬유막(quartz microfiber membrane)의 표면을 NaOH 단독으로 처리하거나, 또는 NaOH와 Cl₃P를 조합하여 처리함으로써 DNA나 RNA만을 추출하기에 유용한 친수성(hydrophilicity)과 전기양성도(electropositivity)를 갖도록 조절함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 NaOH 단독처리 또는 NaOH와 PCl₃로 조합처리한 개질된 수정미세섬유막을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기한 개질된 수정미세섬유막을 핵산정제용 충진제로 사용하는 방법을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

도 1a는 개질된 수정미세섬유막 컬럼의 분해도이다.

도 1b는 콜렉팅 튜브의 분해도이다.

도 2는 미개질된 수정미세섬유막과, 다양한 개질제를 사용하여 개질화된 수정미세섬유막에서 DNA의 수득율을 비교한 그림이다.

도 3은 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 플라스미드 DNA를 정제한 그림이다.

도 4는 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 정제한 플라스미드 DNA의 제한효소분석을 나타낸 그림이다.

도 5는 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 정제한 플라스미드 DNA를 제한효소로 절단한 후 아가로오즈 젤로부터 정제한 그림이다.

도 6a는 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 사람의 혈액으로부터 게놈 DNA를 정제한 그림이다.

도 6b는 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 원핵세포와 사람의 혈액으로부터 게놈 DNA를 정제하고 그것을 주형으로 하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그림이다.

도 7은 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 여러 크기의 DNA와 단일 가닥사슬의 M13 파아지 DNA를 정제한 그림이다.

도 8a는 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 DNA 칩을 위해 사용하는 여러 가지 PCR 생성물을 정제한 그림이다.

도 8b는 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 PCR 생성물로부터 프라이머, 염 등의 제거를 나타내는 그림이다.

도 9a는 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 정제된 DNA를 사용하여 형질감염(transfection)한 그림이다.

도 9b는 CsCl를 사용하여 정제된 DNA를 사용하여 형질감염(transfection)한 그림이다.

도 10은 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 정제된 pCR2.1-AK3 플라스미드 DNA를 M13 역방향 프라이머를 사용하여 매뉴얼 시퀀싱(manual sequencing)한 결과이다.

도 11은 개질된 수정미세섬유막 컬럼을 사용하여 정제된 pCR2.1-AK3 플라스미드 DNA를 T7 프라이머를 사용하여 자동 염기서열분석을 한 결과이다.

본 발명의 NaOH 단독처리 또는 NaOH와 PCl₃로 조합처리한 개질된 수정미세섬유막에 대하여 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

본 발명은 개질된 수정미세섬유막에 관한 것으로, 수정미세섬유막을 NaOH 단독으로 처리하거나, 또는 NaOH와 Cl₃P를 조합처리하여 막 표면의 전기적 성질을 DNA나 RNA를 추출하는 데에 유용하도록 조절하여 개질화된 수정미세섬유막을 포함한다. 즉, 수정미세섬유막의 표면을 NaOH로 단독처리하거나 또는 NaOH와 Cl₃P를 조합처리하여 막 표면의 친수성(hydrophilicity)과 전기양성도(electropositivity)를 조절하여 음성의 전기적 성질을 나타내는 핵산이 용이하게 결합할 수 있도록 한 것이다.

수정미세섬유막의 표면처리를 위해서는 NaOH 용액에 수정미세섬유막을 넣고 15 ∼ 37 ℃ 온도로 2 시간 정도 방치시킨다. 상기 NaOH 용액 표면처리 후에 전기양성도를 증가시키기 위하여 추가로 Cl₃P 용액에서 15 ∼ 37 ℃ 온도로 1 시간 정도 방치시킬 수도 있다. 또한, 표면처리는 0.2 N NaOH를 수정미세섬유막이 완전히 잠길 정도로 하여 2 시간 정도 처리하거나 0.2 N NaOH로 처리된 수정미세섬유막을 증류수로 3번 세척한 후 2M 디클로로메탄과 10 mM PCl₃로 구성된 용액에서 12 시간 정도 처리한 후 아세톤과 증류수로 세척하는 것이 바람직하다.

이상의 표면처리 방법에 의해 개질화된 수정미세섬유막을 세포구성물질들과 접촉하게 되면, 이러한 개질된 수정미세섬유막은 세척에 의하여 모든 세포구성물질들을 제거할 수 있으며 DNA 또는 RNA만 개질된 수정미세섬유막에 결합되며 결합된 DNA나 RNA는 개질된 수정미세섬유막으로부터 추출할 수 있다.

한편, 본 발명은 이상에서 설명한 개질된 수정미세섬유막이 적용된 핵산정제용 충진제를 포함한다. 즉, DNA 또는 RNA와 같은 핵산만을 분리추출하기 위한 칼럼 충진제로서 본 발명의 개질된 수정미세섬유막을 사용하는 것을 포함한다.

첨부도면 도 1a는 개질된 수정미세섬유막이 충전제로 충진된 핵산정제용 칼럼의 분해도이고, 도 1b는 콜렉팅 튜브의 분해도이다. 개질된 수정미세섬유막을 7 mm 원형을 만든 후 도 1a의 핵산정제용 칼럼에 넣고 7.25 mm의 링으로 개질된수정미세섬유막을 고정시킨 후 도 1b의 콜렉팅 튜브와 결합시켜서 핵산 정제용 칼럼을 완성하였다.

이와 같은 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의하여 개질된 수정미세섬유막(modified Quartz microfiber membrane)을 제조하는 단계, 개질된 수정미세섬유막을 충진한 컬럼의 제조 및 이를 이용하여 두 가닥 사슬 플라스미드 DNA, 단일 가닥사슬 M13 파아지 DNA, 람다 DNA, 염색체 DNA, PCR 생성물 그리고 아가로오즈 젤 또는 폴리아크릴아마이드 젤로부터 DNA 단편의 정제 및 정제된 플라스미드 DNA의 제한효소 분석, 형질감염(transfection), 매뉴얼 서열분석(mannual sequencing) 그리고 자동서열분석(automatic sequencing)을 수행하는 단계로 더욱 상세히 설명하고자 한다.

그러나, 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: NaOH를 사용하여 개질된 수정미세섬유막 및 DNA 정제용 컬럼의 제조

수정미세섬유막(Quartz microfiber membrane)을 50 ㎖ 비이커에 넣고 20 ㎖의 0.2N NaOH 20 ㎖을 처리하여 35 ℃에서 12 시간동안 방치한 후 25 ℃에서 12 시간동안 방치하였다. NaOH로 처리된 수정미세섬유막은 증류수로 4번 세척한 후 아세톤으로 4번 세척하였다. 개질된 수정미세섬유막을 공기중에서 1 시간동안 방치한 후 100 ℃ 오븐에서 1 시간동안 건조시킨 후 데시케이터(desicator)에 보관하였다.

그런 다음, 이렇게 개질된 수정미세섬유막(Modified Quartz microfiber)을 직경이 7 mm인 원형을 만든 후 3 개를 겹쳐서 스핀 미니 컬럼(spin mini column)(도 1a)에 삽입한 후 링을 삽입하여 고정하고 에틸렌 옥사이드(Etylene Oxide)가스로 멸균하여 제조하였다. 대장균(E. coli) 부유액을 10 ㎖ 사용시 개질된 수정미세섬유막을 3장 이상 겹쳐서 사용하여도 DNA 수득율은 더 이상 증가하지 않는다.

실시예 2: NaOH와 PCl ₃ 를 사용하여 개질된 수정미세섬유막 및 DNA 정제용 컬럼의 제조

실시예 1에서 준비된 NaOH가 처리된 수정미세섬유막을 PCl₃에 2M 디클로로메탄이 함유된 용액에 12 시간동안 25 ℃에서 담근 후 아세톤으로 세 번 세척하고, 다시 증류수로 3번 세척하여 개질된 수정미세섬유막을 만든 다음, 진공 데시케이터(desicator)에서 건조시켰다.

이렇게 개질된 수정미세섬유막(Modified Quartz microfiber)를 도 1a에서와 같이 직경이 7 mm인 원형을 만든 후 3 개를 겹쳐서 스핀 미니 컬럼(spin mini column)에 삽입한 후 링을 삽입하여 고정하고 에틸렌 옥사이드(Etylene Oxide) 가스로 멸균하여 제조하였다. 역시, 대장균(E. coli) 부유액을 10 ㎖ 사용시 개질된 수정미세섬유막을 3장 이상 겹쳐서 사용하여도 DNA 수득율은 더 이상 증가하지 않는다.

실험예 1:플라스미드 DNA의 분리

상기 실시예 1에서 제조된 개질된 수정미세섬유막 DNA 정제 컬럼을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리 제조하였다. 플라스미드 DNA(pCR2.1)을 함유하는 TOP 10 대장균(E. coli) 균주를 배양하고 이 균주 배양액을 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 이 펠렛을 A용액(20 mM EDTA와 100 ㎍/㎖ RNAse A를 함유하는 30 mM Tris/HCl pH 7.5)에 부유시킨 다음, B용액(0.2 N NaOH, 1% 소디움 도데실 설페이트(SDS)(w/v))으로 세포를 용균시킨 후, C용액(3.1 mM 아세트산 칼륨, 아세트산, 4 M 구아니딘 티오시아네이트 pH 4.2)를 사용하여 중화시킨 후, 원심분리하여 상층액을 개질된 수정미세섬유막 컬럼에 DNA를 결합시킨 후, D용액(20 mM Tris/HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 50% 에탄올)으로 세척한 후 증류수로 용출시켜 고순도의 플라스미드 DNA를 얻었다.

실험예 2: 수정미세섬유막과 개질된 수정미세섬유막의 DNA 수득율의 비교

수정미세섬유막과 개질된 수정미세섬유막의 플라스미드 DNA의 수득율을 비교하기 위하여, 각각의 개질화제(modifier)를 사용하여 제조된 개질된 수정미세섬유막을 사용하여 상기 실시예 1 및 실시예 2와 동일한 방법으로 컬럼을 제조하고, 대장균(E. coli) 배양액 10 ㎖으로부터 3,000 rpm으로 10 분동안 원심분리하여 대장균 침전물을 회수한 후 상기 실험예 1과 같은 방법으로 플라스미드 DNA를 각각 제조하여 수득율과 순도를 비교 분석하였다. 그리고, 그 결과를 다음 표 1과 도2에 요약하여 나타내었다.

그 결과, 표 1 및 도 2에서 보는 바와 같이 수정미세섬유막 보다 개질된 수정미세섬유막, 특히 NaOH 또는 NaOH/PCl₃로 처리한 수정미세섬유막이 월등한 DNA 결합능력을 보여주고 있으며, 순도는 개질된 수정미세섬유막이나 개질되지 않은 수정미세섬유막 모두 OD₂₆₀=1.6 ∼ 1.8을 나타내었다.

개질된 수정미세섬유막에 따른 플라스미드 DNA 순도 및 수득율

개질제	E. coliTOP 10 배양액^*	OD₂₆₀/OD₂₈₀(순도)	수득량
비개질화(NON)	10 ㎖	1.60 ∼ 1.75	0.3 ∼ 0.5 ㎍
0.2N NaOH	10 ㎖	1.65 ∼ 1.82	10 ∼ 12 ㎍
10N NaOH	10 ㎖	1.59 ∼ 1.81	4 ∼ 6 ㎍
PCl₃	10 ㎖	1.61 ∼ 1.80	0.2 ∼ 0.4 ㎍
0.2N NaOH/PCl₃	10 ㎖	1.60 ∼ 1.80	11 ∼ 13 ㎍
^* E. coliTOP 10 배양액 : LB 배지

실험예 3: 여러 콜로니 배양액으로부터 플라스미드 DNA의 제조

pCR2.1-AK3로 형질전환된 9개의 대장균(E. coil TOP 10)을 각각 10 ㎖ LB 배지에서 12 시간 동안 37 ℃에서 250 rpm으로 키운 후, 상기 실험예 1에서 나타낸 방법과 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 정제한 결과 각각의 콜로니로부터 15 ㎍ 이상의 프라스미드 DNA를 추출할 수 있었다.

실험예 4: 플라스미드 DNA의 제한효소 절단

AK3에 대한 오픈리딩프레임(Open reading frame)을 중합효소반응(PCR)을 사용하여 증폭시키고 pCR 2.1 벡터와 결합시킨 다음, 대장균(E. coli TOP 10)에 형질전환시켜 엠피실린 배지에서 키운 후 상기 실험예 1과 같은 방법으로 플라스미드 DNA를 추출한 후 제한효소 EcoRI으로 절단해 본 결과 도 4에서 알 수 있듯이 효과적인 DNA 절단이 이루어 졌다.

실험예 5: 아가로오즈 젤로부터 DNA 단편의 분리

TAE 또는 TBE 아가로즈 젤에서 DNA를 전기영동하여 DNA를 분리하고, 밴드를 잘라서 에펜도르프 튜브에 넣고 젤 용해(Gel lysis) 용액[50 mM Tris/HCl pH 7.0, 6 M 구아니딘 티오시아네이트]을 젤 200 mg당 500 ㎕를 넣고 42 ℃에서 젤을 완전히 녹인 후 개질된 수정미세섬유막 컬럼에 DNA를 결합시킨 후 세척용액[20 mM Tris/HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 50% 에탄올]으로 세척한 후 증류수로 DNA를 용출하였다. 그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이 우수한 DNA 분리 성능을 발휘하였다. 이때, 용출수득율은 85 ∼ 95%에 이른다.

실험예 6: 혈액으로부터 염색체(chromosomal) DNA의 제조

사람으로부터 채혈한 혈액에 7.5%가 되게 끔 EDTA를 첨가한 후, 이중 300 ㎕를 취한 후 적혈구 분해용액(0.5% NH₄Cl)을 처리하고 원심분리하여 백혈구만을 얻었다. 여기에 1% 소디움 도데실 설페이트(SDS) 용액을 첨가하여 백혈구를 분해한 후 2.5M 암모늄 아세테이트를 첨가하여 단백질들을 침전시킨 후 차오트로픽염(chaotropic salt) 존재하에서 개질된 수정미세섬유막 컬럼에 염색체(chromosomal) DNA를 부착시킨 후 50% 에탄올로 세척한 후 증류수로 DNA를 용출시켰다[도 6a]. 그리고, 용출된 염색체(chromosomal) DNA를 주형으로 하여 PCR를 수행하였을 때 PCR 생성물이 잘 생성되었다[도 6b].

실험예 7: 다양한 크기의 플라스미드 DNA 와 단일 가닥사슬 DNA의 제조

다양한 크기의 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 형질전환된 대장균으로부터 상기 실험예 1과 같은 방법으로 플라스미드 DNA를 제조한 결과 플라스미드 DNA의 크기에 관계없이 플라스미드 DNA의 정제 효율이 좋으며 또한 M13 페이지(phage) DNA를 30% PEG로 침전시킨 후 1 ㎖ 증류수로 페이지(phage)를 용해시키고 여기에 50 mM Tris/HCl pH 7.0, 4 M 구아니딘 티오시아네이트 500 ㎕를 넣고 개질된 수정미세섬유막 컬럼에 DNA를 결합시킨 후 세척용액[20 mM Tris/HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 70% 에탄올]으로 세척한 후 증류수로 단일가닥사슬 DNA를 용출하였다. 그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이 우수한 단일가닥사슬 DNA 분리 성능을 발휘하였다.

실험예 8: 중합효소반응(PCR) 반응물의 정제

다양한 크기의 유전자를 함유하고 있는 벡터 DNA 5 ㎕를 주형으로 하여, 2.5 mM 디엔티피(dNTPs) 8 ㎕, 5 units/㎕ 이엑스 텍 DNA 폴리머레이즈(Ex taq DNA polymerase) 1 ㎕, 10X 이엑스 텍 버퍼(Ex taq buffer) 10 ㎕, T7 프라이머 와 T3프라이머 (100 pmol/㎕) 각각 1.5 ㎕, 증류수 73 ㎕를 섞어 총 부피를 100 ㎕로 하였다. 반응은 94 ℃에서 5 분간 변성, 98 ℃에서 10 초간 변성, 60 ℃에서 30 초간 시발체 결합, 72 ℃에서 40 초간 확장과정으로 35cycle을 수행한 후 다시 72 ℃에서 5 분간 확장하여 4 ℃에서 저장하였다. 이렇게 생성된 중합효소반응 반응물에 DNA 결합용액[50 mM Tris/HCl pH 7.0, 4 M 구아니딘 티오시아네이트]을 500 ㎕를 넣고 개질된 수정미세섬유막 컬럼에 DNA를 결합시킨 후 세척용액[20 mM Tris/HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 50% 에탄올]으로 세척한 후 증류수로 중합효소반응 반응물를 용출하였다. 그 결과, 도 8a에서 볼 수 있듯이 우수한 DNA 분리 성능을 발휘하였으며, 도 8b에서 나타낸 바와 같이 중합효소반응 후 반응을 하지 않고 남아 있는 플라이머도 제거되었다.

실험예 9: 세포 형질감염(Cell transfection)

상기 실시예 1에서 제조된 개질된 수정미세섬유막 컬럼과 CsCl 구배를 사용하여 리포터 플라스미드(reporter plasmid (GFP))를 인간배 신장세포주(human embryo kidney cell line)인 293세포에 칼슘포스페이트(Calcium Phosphate) 방법으로 형질감염(transfection) 시킨 후 36 시간 후 관찰하였으며, 그 결과를 도 9a 및 도 9b에 나타내었다. 그 결과, 도 9a 및 9b에서 보는 바와 같이, 본 발명의 개질된 수정미세섬유막으로 제조된 플라스미드 DNA를 형질감염하였을 시에 CsCl 구배로 정제된 플라스미드 DNA와 유사하게 거의 모든 세포내에서 효과적인 단백질 발현이 이루어졌음을 확인하였다.

실험예 10: 정제된 플라스미드 DNA의 ³⁵ S 서열분석(sequencing analysis)

ATP를 이용하여 시쿼네이즈 버젼2.0(SequenaseTM version 2.0) DNA 서열분석 키트(sequencing kit)로서 반응하여 서열분석 겔(sequencing gel)에서 분리한 후 방사선 사진(autoradiography)로 확인 하였다. 그 결과 도 10 에서 보는 바와 같이, 본 발명의 개질된 수정미세섬유막으로 제조된 DNA의 서열분석은 선명하게 DNA 밴드가 분리됨을 확인할 수 있었다.

실험예 11: 정제된 플라스미드 DNA의 자동서열분석

자동 서열(Automatic sequencing) 분석은 ABI PRIM^TMDye terminator cycle sequencing ready reaction kit(Perkin Elmer)를 이용하여 실시하였으며, 터미널 레디 반응혼합물(terminal ready reaction mix) 8 ㎕, 주형 DNA 0.4 ㎍, 프라이머 3 pmole(sense primer : M13 reverse primer anti-sense primer : T7 promoter primer)을 20 ㎕ 반응볼륨(reaction volume)으로 96℃/30min, 50℃/15sec, 60℃/4min 동안 퍼킨 엘머 온도반응기(Perkin Elmer thermalcycler)에서 25 사이클(cycle) 반응하여 에탄올로 침전시켜 회전식 진공 증발기(speed vac.)에서 말린 후 자동서열분석기(automatic sequencer(Applied Biosystem))로 분석하였다.

그 결과, 도 11과 같이 매우 효과적인 DNA 염기 서열 분석이 이루어 졌으며 이때, 상기에서 사용된 주형은 680 bp의 DNA를 함유한 pCR2.1이고 프라이머는 M13역방향 프라이머 또는 T7 프라이머이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이 본 발명은 개질된 수정미세섬유막과 그 이용에 관한 것으로서, 이러한 본 발명에 따르면 보다 간단하고 신속하게 고순도의 두 가닥 사슬 플라스미드 DNA, 람다 DNA, 염색체(chromosomal) DNA, 단일 가닥사슬 파아지 DNA를 정제할 수 있으며, PCR 생성물로부터 여러가지 조요소(cofactor), 완충용액 구성물 그리고 프라이머를 제거할 수 있으며, 아가로오즈 젤 또는 폴리아크릴아마이드 젤로부터 DNA 단편을 효과적으로 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 정제된 플라스미드 DNA의 제한효소 분석, 형질감염(transfection), 매뉴얼 서열분석(mannual sequencing) 그리고 자동서열분석(automatic sequencing)에서도 보다 우수한 효과를 얻을 수 있다.

Claims

수정미세섬유막을 NaOH 단독처리 또는 NaOH와 PCl₃로 조합처리하여 개질화시킨 것임을 특징으로 하는 개질된 수정미세섬유막.
제 1 항에 있어서, 상기 수정미세섬유막을 0.2 ∼ 10 N NaOH 용액을 사용하여 1 시간에서 24시간 동안 개질화시킨 것임을 특징으로 하는 개질된 수정미세섬유막.
제 1 항에 있어서, 상기 수정미세섬유막을 0.2 ∼ 10 N NaOH 용액을 사용하여 개질화시킨 후에, 1 mM ∼ 1 M PCl₃를 사용하여 개질화시킨 것임을 특징으로 하는 개질된 수정미세섬유막.
상기 청구항 1의 개질된 수정미세섬유막이 적용된 것임을 특징으로 하는 핵산정제용 충진제.
제 4 항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것임을 특징으로 하는 핵산정제용 충진제.