JPH07177887A - 固相抽出によるｄｎａ精製に有用な修飾グラスファイバー膜 - Google Patents

固相抽出によるｄｎａ精製に有用な修飾グラスファイバー膜

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JPH07177887A
JPH07177887A JP6229442A JP22944294A JPH07177887A JP H07177887 A JPH07177887 A JP H07177887A JP 6229442 A JP6229442 A JP 6229442A JP 22944294 A JP22944294 A JP 22944294A JP H07177887 A JPH07177887 A JP H07177887A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 固相抽出によるＤＮＡの精製に関し、より特
定すれば、適当な条件下でＤＮＡを結合でき、かつ、Ｄ
ＮＡを溶出できる修飾グラスファイバー膜を提供する。 【構成】 修飾グラスファイバー膜は、ＤＮＡ含有懸濁
液においてＤＮＡを結合し、該物質からＤＮＡを溶出す
るのに十分な親水性および陽性荷電性を示す。通常、親
水性および陽性荷電性は、修飾グラスファイバー膜の表
面において見いだされる。修飾グラスファイバー膜は、
特に、ＤＮＡを他の細胞成分から生成する工程において
有用である。それらの工程においては、細胞成分の懸濁
液を修飾グラスファイバー膜に接触させて、修飾グラス
ファイバー膜を洗浄して、該膜に結合したＤＮＡ以外の
すべての細胞成分を除去し、結合したＤＮＡを該膜から
溶出する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般的には固相抽出に
よるＤＮＡの精製に関し、より特定すれば、適当な条件
下でＤＮＡを結合でき、かつ、ＤＮＡを溶出できる修飾
グラスファイバー膜に関する。
【０００２】
【従来技術】高度に精製された二本鎖（ｄｓ）プラスミ
ドＤＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ファージＤＮＡ、染色体ＤＮ
Ａおよびアガロースゲルから精製されたＤＮＡ断片は、
分子生物学の分野において決定的に重要である。理想的
には、ＤＮＡを精製する方法は、簡単、迅速であり、か
つ、あるとしても付加的なサンプル操作をほとんど必要
としないべきである。そのような方法により得られたＤ
ＮＡは、即座に形質転換、制限分析、連結または配列決
定に供しやすいものであるべきである。このような特徴
すべてを有する方法は、ＤＮＡサンプル調製の自動化、
研究の目標到達および診断試験において極めて興味を引
き付けるはずである。典型的には、粗アルコール沈殿物
からのプラスミドＤＮＡの調製は労力を要し、ほとんど
の場合、ＣｓＣｌグラジエント、ゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、またはＲＮａｓｅ、プロティナー
ゼＫおよび繰り返しのアルコール沈殿工程を利用する。
これらの方法は、ＣｓＣｌおよび他の塩、エチジウムブ
ロマイドおよびアルコールを除去するために、その後に
さらにサンプル調製を必要とする。同様な議論は、ＤＮ
Ａ断片を精製するためのこれらあらゆる方法を用いる場
合にあてはまる。これらの方法におけるさらなる問題
は、小さく、かつ、陰性に荷電した細胞成分がＤＮＡと
共に精製されうることである。即ち、ＤＮＡは不所望の
レベルの汚染物を含みうる。
【０００３】ＤＮＡは固相を用いても精製されうる。慣
用的固相抽出技術は、（１）溶出の間にＤＮＡを容易に
回収するためにデザインされた表面のために、十分な量
のＤＮＡを確保および保持しがたく、または（２）過剰
にＤＮＡを表面に結合させるために溶出の間にＤＮＡ分
子の回収を妨害する表面を利用してきた。固相抽出にお
いて利用される場合にこれらの問題を引き起こす慣用的
表面分子は、シリカ表面、例えばガラスおよびセライト
（Ｃｅｌｉｔｅ）を含む。これらの種の表面へのＤＮＡ
の十分な結合は、高濃度のカオトロプまたは一般的に毒
性であり、危険であり、および／または高価であるアル
コールの利用によってのみ達成されうる。例えば、ＤＮ
Ａはカオトロプの存在下でガラス砕片粉末およびグラス
ファイバーフィルターに結合することが知られている。
カオトロピックイオンは典型的にはアルコールを用いて
洗浄され、そしてＤＮＡは低塩濃度溶液または水により
溶出される。重要なこととして、ＲＮＡおよび蛋白質は
結合しない。しかしながら、ガラス砕片粉末の使用にお
ける重大な短所は、結合許容量が低いことである。さら
に、ガラス粉末は、しばしば、完全に回収されず、硼酸
緩衝液と適合せず、そして大きいＤＮＡにニックを入れ
る傾向を有する。同様に、グラスファイバーフィルター
は低いＤＮＡ結合許容量を有する非孔性表面を提供す
る。他のシリカ、例えばシリカゲルおよびガラスビーズ
は、ＤＮＡの結合および回収には不適当である。現在、
ＤＮＡの固相抽出のために選択された固相は、セライ
ト、例えばバイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅ
ｎｅ（商標名）に見いだされるものである。破砕ガラス
粉末を用いた場合のように、高濃度のカオトロプがセラ
イトへのＤＮＡの十分な結合に必要とされる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】慣用的ＤＮＡ精製法に
おけるこれらの問題は、ＤＮＡを含む懸濁液中のＤＮＡ
を結合し、そしてＤＮＡを溶出させるのに十分な親水性
および十分な陽性荷電性（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｓｉｔｉ
ｖｉｔｙ）を示す、修飾グラスファイバー膜に関する本
発明により解決される。一般的に、親水性および陽性荷
電性は、修飾グラスファイバー膜の表面において示さ
れ、そして、フーリエ変換赤外線分光分析法（ＦＴＩ
Ｒ）により測定される酸素の存在として、および電子表
面組成分析（ＥＳＣＡ）により検出される置換原子の存
在として、定量される。本発明の好ましい修飾グラスフ
ァイバー膜は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＢＣ
ｌ3、ＳｉＣｌ4、ＮａＯＨ、Ｆ-、ＡｌＣｌ3を単独また
は混合して処理して、さらに水で処理するかあるいは処
理せずに修飾されたグラスファイバー膜を含む。
【０００５】本発明の修飾グラスファイバー膜は、他の
細胞成分からＤＮＡを精製するための方法において特に
有用である。これらの方法においては、細胞成分の懸濁
液を修飾グラスファイバー膜に接触させ、修飾グラスフ
ァイバー膜を洗浄して該膜に結合したＤＮＡ以外の細胞
成分を除去し、そして、結合したＤＮＡを該膜から溶出
する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、修飾グラスフ
ァイバー膜に関するが、該膜は細胞成分の懸濁液中のＤ
ＮＡを結合し、そして該膜からＤＮＡを溶出させるのに
十分な親水性および十分な陽性荷電特性を示す。極めて
低濃度のカオトロプまたはアルコールを利用して、本発
明の修飾グラスファイバー膜を用いてＤＮＡを精製する
ことができることが見いだされた。修飾グラスファイバ
ー膜へのＤＮＡの結合により、そのような膜が自動化Ｄ
ＮＡ単離方法において、およびＤＮＡプローブ試験に関
するサンプル加工工程において使用可能となる。
【０００７】ＤＮＡは２つの方法により固相表面に相互
作用する。第１に、ＤＮＡは、ＤＮＡのヒドロキシル基
と固相の表面成分との間の水素結合を通して表面に相互
作用する。第２の相互作用は、陰性に荷電したＤＮＡの
リン酸と陽性に荷電した固相表面の要素との間で生じ
る。固相表面の親水性および陽性荷電特性は、細胞成分
の懸濁液、核酸および他の物質の懸濁液、および／また
は核酸の懸濁液からＤＮＡを結合させ、そして上記固相
物質からＤＮＡを溶出させるようなものでなければなら
ない。即ち、固相物質の陽性荷電（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ
ｓｉｔｉｖｅ）特性は、はるかに高い陽性電荷（ｐｏｓ
ｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ）を有し得ず、または、ＤＮ
Ａが表面に固着して溶出され得ない。この特性は多くの
金属基材表面に関しても真実であり、該表面はＤＮＡの
精製に関して利用不可能性をもたらす。
【０００８】ケイ素含有物質、例えば、シリカ、セライ
ト、ガラス粉末等は混ざった結果を伴ってＤＮＡの精製
に用いられてきた。これら表面のいくつかは、低い結合
特性を有し、および／またはＤＮＡの結合に関して、高
濃度のカオトロプまたはアルコールの使用を必要とす
る。即ち、ＤＮＡの精製に関して適切な親水性および陽
性荷電特性を示し、および／またはより低い濃度のカオ
トロプまたはアルコールを用いたＤＮＡの精製のための
固相表面、特に修飾グラスファイバー膜の固相表面を生
産することが望まれる。固相表面において、親水性の特
性は、水分子を引き付ける基の存在により達成される。
適切な基は、−ＯＨ，−ＮＨ，−Ｆ，−Ｈまたは二重結
合酸素を含む基、例えばカルボニル、スルフォニルまた
はホスフォニルを含む。陽性荷電特性は、陽性に荷電し
た原子の存在により達成される。適切な陽性荷電原子
は、Ｓｉ，ＢまたはＡｌを含む。本発明によれば、適切
な親水性基を導入して親水性の特性が達成され、そして
Ｓｉおよび他の適切な陽性荷電原子を導入して陽性荷電
特性が達成されることにより、修飾グラスファイバー膜
が調製される。本発明の好ましい修飾グラスファイバー
膜は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＢＣｌ3、ＳｉＣ
ｌ4、ＮａＯＨ、Ｆ-、ＡｌＣｌ3を単独または混合して
処理して、さらに水で処理するかあるいは処理せずに修
飾されたグラスファイバー膜を含む。
【０００９】通常、本発明の修飾グラスファイバー膜
は、グラスファイバー膜をＴＦＡまたは０．２Ｎ Ｎａ
ＯＨのいずれかと一晩、１５℃から３０℃、好ましくは
２０℃から２５℃、もっとも好ましくは室温において処
理することにより調製される。ＴＦＡまたはＮａＯＨに
より処理されたグラスファイバー膜は直接使用可能であ
り、あるいは、さらに、ＮａＯＨ、ＢＣｌ3、ＳｉＣ
ｌ4、ＡｌＣｌ3、またはＦ-で処理することができ、そ
して必要であれば、さらに０．２Ｎ ＮａＯＨまたは水
で処理することができる。これらの付加的処理は、一般
的には、ＡｌＣｌ3およびＳｉＣｌ4の処理が２２℃から
３５℃において最も好ましい点を除いて、前に記載され
たとおりに実施される。修飾グラスファイバー膜のいく
つかは、未修飾表面に比較して優れた性能（即ち、より
優れたＤＮＡ回収）を提供し、その他のものは同じＤＮ
Ａ回収特性を提供する。不所望の親水性および／または
陽性荷電特性をもたらすように修飾されたグラスファイ
バー膜は何らＤＮＡの回収を提供しない。
【００１０】以下の物質で処理されたグラスファイバー
膜、例えば、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｇ／Ｆ Ｂ
またはＣ膜は、ＤＮＡの回収を提供した。
【００１１】ＴＦＡ ＴＦＡ、ＢＣｌ3およびＮａＯＨ ＮａＯＨ、ＳｉＣｌ4およびＮａＯＨ ＮａＯＨ、ＢＣｌ3およびＨ2Ｏ ＮａＯＨ、ＰＣｌ3およびＨ2Ｏ ＮａＯＨ ＴＦＡおよびＮａＯＨ ＴＦＡおよびＦ- ＴＦＡおよびＢＣｌ3 ＮａＯＨ、ＢＣｌ3およびＮａＯＨ ＮａＯＨ、ＡｌＣｌ3およびＮａＯＨ 以下の物質で処理されたグラスファイバー膜、例えば、
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｇ／Ｆ ＢまたはＣ膜
は、ＤＮＡの回収を提供しなかった。
【００１２】ＴＦＡ、ＡｌＣｌ3およびＨ2Ｏ ＴＦＡ、ＳｉＣｌ3およびＨ2Ｏ ＴＦＡおよびＳｉＣｌ4 ＴＦＡおよびＡｌＣｌ3 ＮａＯＨ、ＡｌＣｌ3およびＨ2Ｏ ＮａＯＨ、ＳｉＣｌ4およびＨ2Ｏ 本発明の修飾グラスファイバー膜は、他の細胞成分また
は潜在的汚染物からＤＮＡを精製するのに用いられる。
ＤＮＡはあらゆる源から得ることができ、そのような源
としてはそれらに限定されないが、粗細胞抽出物、生物
学的流体、ファージ懸濁液、アガロースゲルおよび放射
性標識反応物を含む。ＤＮＡは、二本鎖、一本鎖、環状
または直鎖状であり得、またあらゆるサイズであり得
る。あらゆる源からＤＮＡを得るための当該分野におい
て公知の慣用的技術を利用して、精製のためにＤＮＡを
調製する。ＤＮＡを得るための典型的な方法は、ＤＮＡ
の懸濁液を得ることにより終了する。生物学的サンプル
からのＤＮＡの単離に関しては、例えば、Ｈａｒｄｉｎ
ｇ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：６９４７（１９８９）お
よびＭａｒｋｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２１：３８２
（１９８２）を参照されたい。プラスミドＤＮＡの単離
方法は、Ｌｕｔｚｅ，Ｌ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０：６１５０
（１９９０）に見いだされうる。生物学的サンプルから
の二本鎖ＤＮＡの抽出は、Ｙａｍａｄａ，Ｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７：２０３（１９９０）に見いださ
れうる。ほとんどのＤＮＡ溶液は、適当な緩衝液、例え
ばＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ＴＥＡ（４０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液中のＤＮＡ、ま
たは溶解物からなる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８９）を参照さ
れたい。
【００１３】ＤＮＡが適当な溶液または懸濁液中に得ら
れたら、本発明の修飾グラスファイバー膜を該溶液また
は懸濁液に加える。別法として、フィルターを通して懸
濁液を引っ張るドットブロット装置を用いて、ＤＮＡ溶
液または懸濁液を本発明の修飾グラスファイバー膜に加
えることができる。ＤＮＡ溶液または懸濁液を本発明の
修飾グラスファイバー膜に接触させた後、典型的には結
合緩衝液を加えて修飾グラスファイバー膜へのＤＮＡの
結合を助ける。適当な結合緩衝液は、公知のカオトロ
プ、例えばＮａＣｌＯ4およびＮａＩ、および他の薬
品、例えば塩酸グアニジン、ＮａＣｌまたはイソプロパ
ノールを含む。ＤＮＡを修飾グラスファイバー膜に結合
させた後、純化ＤＮＡを該膜から溶出する。適当な溶出
剤は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０または水を含
む。通常、結合ＤＮＡを含む修飾グラスファイバー膜
は、例えば遠心分離または濾過、およびＤＮＡ溶出前の
洗浄により分離される。適当な洗浄剤は、８０／２０エ
タノール／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０、および他
の低分子量アルコールを含む。
【００１４】本発明の修飾グラスファイバー膜を用いた
精製により得られたＤＮＡは、さらなる操作を必要とせ
ずに、制限酵素消化、クローニング、配列決定、診断等
に用いられる。本発明により調製された多量のＤＮＡ、
およびそのあとの最小限の工程によりＤＮＡを精製する
ためのスピードは、本発明の修飾グラスファイバー膜が
ＤＮＡサンプルの調製の自動化に有用でありうることを
意味する。
【００１５】本発明の修飾グラスファイバー膜は、生物
学的サンプルからの極めて迅速かつ十分なＤＮＡの単離
を可能にする。該膜は、現在用いられている技術に比較
して、生物学的サンプルからの純化したＤＮＡを加工す
るのに必要な時間を減少させ、そしてある場合には、極
めて大量の純化ＤＮＡを生じる。これらの利点により、
本発明の修飾グラスファイバー膜はＤＮＡプローブ試験
に関するサンプル加工工程の一部において有用である。
一つの例としては、１回に９６サンプルを迅速に加工す
るためのドットブロット装置における修飾グラスファイ
バー膜の使用である。
【００１６】本発明は、以下の実施例を参照して説明さ
れるが、実施例は例示の目的で示されたものであり、如
何なる意味においても本発明を限定するものではない。
当分野において公知の標準的技術または以下に特定して
記載される技術を用いた。
【００１７】
【実施例】
実施例１ Ａ．ＴＦＡを用いた処理 グラスファイバー膜、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｇ
／Ｆ ＢまたはＣ膜は、２０ｍｌのＴＦＡを５０ｍｌの
ビーカーに加えることにより、ＴＦＡで処理した。膜を
一度にビーカーに加えた。ＴＦＡおよび膜を含むビーカ
ーを室温にて一晩おいた。ＴＦＡ処理された膜を次に、
デシケーター内におき、ＫＯＨトラップを付け、そして
一晩減圧下においてＴＦＡを除去した。
【００１８】Ｂ．ＮａＯＨを用いた処理 グラスファイバー膜、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｇ
／Ｆ ＢまたはＣ膜への０．２Ｎ ＮａＯＨ処理は、２
０ｍｌのＮａＯＨを５０ｍｌのビーカーに加えることに
よりおこなった。膜を一度にビーカーに加えた。ＮａＯ
Ｈおよび膜を含むビーカーを低温（３５℃）にて２時間
加熱し、次に、室温において一晩静置した。ＮａＯＨ処
理された膜は２０ｍｌの水で４回洗浄し、次に２０ｍｌ
のアセトンで３回洗浄した。ＮａＯＨ処理された膜は２
０分間空気乾燥し、１００℃において１時間オーブン乾
燥し、そして、デシケーター内に保存した。
【００１９】上記のとおりに調製されたＴＦＡ処理グラ
スファイバー膜も、ＴＦＡ処理膜を４０ｍｌのＮａＯＨ
に加えて低温（３５℃）にて一晩加熱した以外は、上記
のとおりに０．２Ｎ ＮａＯＨで処理した。
【００２０】以下のとおりに調製されたＳｉＣｌ4−、
ＢＣｌ3−、またはＡｌＣｌ3−処理されたＮａＯＨ処理
グラスファイバー膜は、４０ｍｌのＮａＯＨを１００ｍ
ｌビーカーに加えることにより０．２Ｎ ＮａＯＨで処
理して、塩素基を水酸基で置換した。該膜を各ビーカー
に加えて低温（３５℃）にて一晩加熱した。ＮａＯＨ処
理された膜を濾過し、ガラス濾過器中におき、２ｍｌの
水で３回そして２ｍｌのアセトンで３回洗浄し、１５分
間空気乾燥し、そして３５℃において１時間オーブン乾
燥した。ＮａＯＨ処理された、ＳｉＣｌ4−処理−Ｎａ
ＯＨ−処理された（以後、ＮａＯＨ／ＳｉＣｌ4／Ｎａ
ＯＨ処理と言う）グラスファイバー膜、ＮａＯＨ処理さ
れた、ＢＣｌ3−処理−ＮａＯＨ−処理された（以後、
ＮａＯＨ／ＢＣｌ3／ＮａＯＨ処理と言う）グラスファ
イバー膜、およびＮａＯＨ処理された、ＡｌＣｌ3−処
理−ＮａＯＨ−処理された（以後、ＮａＯＨ／ＡｌＣｌ
3／ＮａＯＨ処理と言う）グラスファイバー膜は、デシ
ケーター中で保存した。
【００２１】Ｃ．フッ化物を用いた処理 上記のとおりに調製されたＴＦＡ処理グラスファイバー
膜は、（ａ）５ｍｌのテトラアンモニウムフルオリド
（ＴＢＡＦ）および５ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨ
Ｆ）（５ｍＭ）、または（ｂ）１０ｍｌのＴＢＡＦ（１
０ｍＭ）を５０ｍｌのビーカーに加えることにより、フ
ッ素処理した。ＴＢＡＦ処理されたグラスファイバー膜
を各ビーカーに加えて低温（３５℃）において一晩加熱
した。フッ化物処理された膜はガラス濾過器中におき、
水に次いでアセトンで繰り返し洗浄し、約３０分間空気
乾燥し、そして３５℃において１時間オーブン乾燥し
た。Ｆ-処理−ＴＦＡ処理された（以後、ＴＦＡ／Ｆ-処
理と言う）グラスファイバー膜はデシケーター中で保存
した。
【００２２】Ｄ．ＳｉＣｌ4、ＢＣｌ3、ＡｌＣｌ3また
はＰＣｌ3を用いた処理 上記のとおりに調製されたＴＦＡ処理されたグラスファ
イバー膜は、（ａ）１０ｍｌのＢＣｌ3（ＣＨ2Ｃｌ
2（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）中１
Ｍ）および５ｍｌのＴＨＦ；（ｂ）１０ｍｌのＡｌＣｌ
3（ニトロベンゼン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．）中１Ｍ）；または（ｃ）２０ｍｌのＳｉＣ
ｌ4（Ｐｅｔｒａｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を５０ｍｌの
ビーカーに加えることにより、ＳｉＣｌ4、ＢＣｌ3また
はＡｌＣｌ3処理した。ＴＨＦ処理されたグラスファイ
バー膜を各ビーカーに加えて低温（３５℃）において一
晩加熱した。ＳｉＣｌ4、ＢＣｌ3またはＡｌＣｌ3処理
された膜はアセトンで繰り返し洗浄し、約３０分間空気
乾燥し、そして３５℃において１時間オーブン乾燥し
た。ＳｉＣｌ4処理−ＴＦＡ処理された（以後、ＴＦＡ
／ＳｉＣｌ4処理と言う）グラスファイバー膜、ＡｌＣ
ｌ3処理−ＴＦＡ処理された（以後、ＴＦＡ／ＡｌＣｌ3
処理と言う）グラスファイバー膜、およびＢＣｌ3処理
−ＴＦＡ処理された（以後、ＴＦＡ／ＢＣｌ3処理と言
う）グラスファイバー膜をデシケーター中で保存した。
【００２３】上記のとおりに調製されたＮａＯＨ処理さ
れたグラスファイバー膜は、（ａ）２０ｍｌのＳｉＣｌ
4（Ｐｅｔｒａｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；（ｂ）２０ｍ
ｌのＢＣｌ3（ＣＨ2Ｃｌ2（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．）中１Ｍ）；（ｃ）２０ｍｌのＡｌＣ
ｌ3（ニトロベンゼン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．）中１Ｍ）；または（ｄ）２０ｍｌのＰＣ
ｌ3を１００ｍｌのビーカーに加えることにより、Ｓｉ
Ｃｌ4、ＢＣｌ3、ＡｌＣｌ3またはＰＣｌ3処理した。Ｎ
ａＯＨ処理されたグラスファイバー膜を各ビーカーに加
えた。これらの膜およびＳｉＣｌ4、ＢＣｌ3、ＡｌＣｌ
3またはＰＣｌ3を含むビーカーを低温（３５℃）におい
て一晩加熱した。膜およびＢＣｌ3またはＰＣｌ3を含む
ビーカーは一晩室温において静置した。ＳｉＣｌ4、Ｂ
Ｃｌ3、ＡｌＣｌ3またはＰＣｌ3処理された膜は、
（ａ）１０ｍｌの水で３回、そして１０ｍｌのアセトン
で３回、または（ｂ）１０ｍｌのアセトンで３回、１０
ｍｌの水で３回、そして１０ｍｌのアセトンで３回の何
れかにより洗浄し、空気乾燥し、そして３５℃において
１時間オーブン乾燥した。ＳｉＣｌ4処理−ＮａＯＨ処
理された（以後、ＮａＯＨ／ＳｉＣｌ4処理と言う）グ
ラスファイバー膜、ＢＣｌ3処理−ＮａＯＨ処理された
（以後、ＮａＯＨ／ＢＣｌ3処理と言う）グラスファイ
バー膜、およびＡｌＣｌ3処理−ＮａＯＨ処理された
（以後、ＮａＯＨ／ＡｌＣｌ3処理と言う）グラスファ
イバー膜をデシケーター中で保存した。
【００２４】Ｅ．水を用いた処理 上記のとおりに調製されたＴＦＡ／ＳｉＣｌ4−、ＴＦ
Ａ／ＢＣｌ3−、ＴＦＡ／ＡｌＣｌ3−、ＮａＯＨ／Ｓｉ
Ｃｌ4−、ＮａＯＨ／ＢＣｌ3−、ＮａＯＨ／ＡｌＣｌ3
−またはＮａＯＨ／ＰＣｌ3−処理されたグラスファイ
バー膜は、２０ｍｌの水を５０ｍｌのビーカーに加える
ことにより水で処理して、塩素基を水酸基で置換した。
修飾されたグラスファイバー膜を別々のビーカーに加え
て、ＴＦＡ処理された群に関しては低温（３５℃）にお
いて一晩加熱するか、または、ＮａＯＨ処理された群に
関しては室温において一晩保存した。次に、ＴＦＡ処理
された群に関してはガラス濾過器中において１５ｍｌの
アセトンで３回洗浄し、１５分間空気乾燥し、そして３
５℃において１時間オーブン乾燥した。ＮａＯＨ処理さ
れた群に関しては１０ｍｌの水で３回洗浄した。Ｈ2Ｏ
処理−ＴＦＡ／ＳｉＣｌ4処理された（以後、ＴＦＡ／
ＳｉＣｌ4／Ｈ2Ｏ処理と言う）グラスファイバー膜、Ｈ
2Ｏ処理−ＴＦＡ／ＢＣｌ3処理された（以後、ＴＦＡ／
ＢＣｌ3／Ｈ2Ｏ処理と言う）グラスファイバー膜、Ｈ2
Ｏ処理−ＴＦＡ／ＡｌＣｌ3処理された（以後、ＴＦＡ
／ＡｌＣｌ3／Ｈ2Ｏ処理と言う）グラスファイバー膜、
Ｈ2Ｏ処理−ＮａＯＨ／ＳｉＣｌ4処理された（以後、Ｎ
ａＯＨ／ＳｉＣｌ4／Ｈ2Ｏ処理と言う）グラスファイバ
ー膜、Ｈ2Ｏ処理−ＮａＯＨ／ＢＣｌ3処理された（以
後、ＮａＯＨ／ＢＣｌ3／Ｈ2Ｏ処理と言う）グラスファ
イバー膜、Ｈ2Ｏ処理−ＮａＯＨ／ＡｌＣｌ3処理された
（以後、ＮａＯＨ／ＡｌＣｌ3／Ｈ2Ｏ処理と言う）グラ
スファイバー膜、およびＨ2Ｏ処理−ＮａＯＨ／ＰＣｌ3
処理された（以後、ＮａＯＨ／ＰＣｌ3／Ｈ2Ｏ処理と言
う）グラスファイバー膜をデシケーター中で保存した。
【００２５】実施例２ 修飾グラスファイバー膜を用いたＤＮＡ回収の分析 バイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のバイオドット（Ｂ
ｉｏ−Ｄｏｔ）装置を用いて、膜を試験した。以下の各
膜の小さいストリップを、装置の１または２ウエルが十
分に覆われるように大きく切った。
【００２６】
【表１】 ワットマンＧ／Ｆ膜の番号 グラスファイバー膜 修飾 １ Ｂ ＮａＯＨ ２ Ｃ ＴＦＡ ３ Ｃ ＴＦＡ／ＮａＯＨ ４ Ｃ ＴＦＡ／Ｆ-（５ｍＭ） ５ Ｃ ＴＦＡ／Ｆ-（１０ｍＭ） ６ Ｃ ＴＦＡ／ＡｌＣｌ3／Ｈ2Ｏ ７ Ｃ ＴＦＡ／ＳｉＣｌ4／Ｈ2Ｏ ８ Ｃ ＴＦＡ／ＢＣｌ3／Ｈ2Ｏ ９ Ｃ ＴＦＡ／ＢＣｌ3 １０ Ｃ ＴＦＡ／ＳｉＣｌ4 １１ Ｃ ＴＦＡ／ＡｌＣｌ3 １２ Ｃ ＮａＯＨ／ＳｉＣｌ4／ＮａＯＨ １３ Ｃ ＮａＯＨ／ＢＣｌ3／ＮａＯＨ １４ Ｃ ＮａＯＨ／ＡｌＣｌ3／ＮａＯＨ １５ Ｂ ＮａＯＨ／ＡｌＣｌ3／Ｈ2Ｏ １６ Ｂ ＮａＯＨ／ＢＣｌ3／Ｈ2Ｏ １７ Ｂ ＮａＯＨ／ＰＣｌ3／Ｈ2Ｏ １８ Ｂ ＮａＯＨ／ＳｉＣｌ4／Ｈ2Ｏ （未処理の膜を対照として用いた） 膜をボックスの中に正確に並べ、クランプによりきつく
絞め、そして未使用のウエルをテープで覆い真空圧を維
持した。
【００２７】各ウエルに、０．７ｍｌの６Ｍ ＮａＣｌ
Ｏ4および０．７８μｇのλＤＮＡ（ＢＲＬカタログ番
号５６１２５Ａ）を入れた。水の吸引により緩い真空を
適用して膜が破壊されるのを防いだ。ＤＮＡ／カオトロ
プ溶液を抜いた後、膜を３５０μｌの８０％エタノール
／５０μＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。
膜７、１０および１８は、ＤＮＡカオトロプ溶液を通過
させなかったが、洗浄前に手で操作して吸い上げた。次
に、膜を装置から取り出し、ウエルの形に切り（それを
濾過器上に押し付けた）、そして０．６５ｍｌの微小遠
心分離管中においた。３５μｌの溶出緩衝液（ＴＥ＝１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）を
各管に加えて４０℃において１０分間インキュベートし
た。次に、サンプルを約３分間遠心分離した。２５μｌ
の緩衝液を別の管に入れ、約１μｌのＴｙｐｅＩＩロー
ディング染料（２５％ Ｆｉｃｏｌｌ，０．２５％ブロ
ムフェノールブルー、０．２５％キシレングリコール）
を加えた。ゲル電気泳動を１％アガロース、１×ＴＡＥ
ゲル上で１３０ボルトにて２５分間実施した。ゲルは、
水中のエチジウムブロマイド（１０ｍｇ／ｍｌ保存液の
１：１００希釈液）で１０分間染色し、そして１５分間
脱色した。紫外線下でＴｙｐｅ５７ポラロイドフィルム
を用いて写真を撮った。
【００２８】膜２、８、１２、１６および１７は、未修
飾の対照膜を含む他のすべての膜に比べて良好にＤＮＡ
を回収した。膜１７は１００％に近いＤＮＡを回収し
た。膜１、３、４、５、９、１３および１４は、未修飾
の対照膜とほぼ同程度のＤＮＡ回収しかみられなかっ
た。膜６、７、１０、１１、１５および１８は、全くＤ
ＮＡを回収しなかった。
【００２９】本発明の方法および組成物はさまざまな形
態の態様を含むものであり、本明細書において開示され
たもののみに限定されるものでないことは認識されるで
あろう。当業者には、本発明の精神を離れない限り、他
の態様も存在することは明らかであろう。即ち、記載さ
れた態様は例示であり、本発明を限定するものではな
い。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アドリアン・ジーンネル・ハワード アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27606，ローリー，ヴァン・ストリート 5206 (72)発明者 ジェームズ・アーサー・ダウン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27511，キャリー，チャーター・オーク ス・サークル 101

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 修飾グラスファイバー膜であって、ＤＮ
    Ａ含有懸濁液中でＤＮＡを結合し、かつ該膜からＤＮＡ
    を溶出するのに十分な親水性および陽性荷電性を示す、
    上記修飾グラスファイバー膜。
  2. 【請求項２】 親水性および陽性荷電性が上記膜の表面
    において示されることによりＤＮＡが該膜の表面に結合
    する、請求項１記載の膜。
  3. 【請求項３】 トリフルオロ酢酸で処理することにより
    修飾された、請求項１記載の膜。
  4. 【請求項４】 ＮａＯＨで処理することにより修飾され
    た、請求項１記載の膜。
  5. 【請求項５】 トリフルオロ酢酸で処理されたグラスフ
    ァイバー膜が、さらにフッ化物、ＮａＯＨまたはＢＣｌ
    3で処理されることにより修飾されている、請求項３記
    載の膜。
  6. 【請求項６】 トリフルオロ酢酸で処理されたグラスフ
    ァイバー膜が、さらにＢＣｌ3、次いで水で処理される
    ことにより修飾されている、請求項３記載の膜。
  7. 【請求項７】 ＮａＯＨで処理された膜が、さらにＳｉ
    Ｃｌ4、ＢＣｌ3またはＡｌＣｌ3、次いでＮａＯＨで処
    理されていることにより修飾されている、請求項４記載
    の膜。
  8. 【請求項８】 ＮａＯＨで処理された膜が、さらにＰＣ
    ｌ3またはＢＣｌ3、次いで水で処理されていることによ
    り修飾されている、請求項４記載の膜。
  9. 【請求項９】 上記膜が、（ａ）トリフルオロ酢酸（Ｔ
    ＦＡ）で処理されたグラスファイバー膜、（ｂ）最初に
    ＴＦＡ、次いでＢＣｌ3、最後に水で処理されたグラス
    ファイバー膜、（ｃ）最初にＮａＯＨ、次いでＳｉＣｌ
    4、最後にＮａＯＨで処理されたグラスファイバー膜、
    （ｄ）最初にＮａＯＨ、次いでＢＣｌ3、最後に水で処
    理されたグラスファイバー膜、（ｅ）最初にＮａＯＨ、
    次いでＰＣｌ3、最後にＨ2Ｏで処理されたグラスファイ
    バー膜からなる群から選択される、請求項１記載の膜。
  10. 【請求項１０】 （ａ）請求項１ないし９のいずれか１
    項に記載の修飾グラスファイバー膜にＤＮＡを結合させ
    るのに適切な条件下で該膜をＤＮＡ含有懸濁液に接触さ
    せ； （ｂ）結合したＤＮＡを有する該膜を洗浄し；そして （ｃ）該膜からＤＮＡを溶出する； 工程からなる、ＤＮＡ精製法。
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