KR102574893B1 - Vre(반코마이신 내성 장구균)의 신속한 스크리닝을 위한 마이크로 디바이스 - Google Patents

Vre(반코마이신 내성 장구균)의 신속한 스크리닝을 위한 마이크로 디바이스 Download PDF

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Abstract

VRE(반코마이신 내성 장구균)의 신속한 스크리닝을 위한 마이크로 디바이스가 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스는 중앙에는 소정 길이의 절개선이 형성되고, 절개선을 기준으로 일측면에 마련되는 1 이상의 전처리 챔버와 타측면에 마련되는 1 이상의 반응 챔버를 포함하는 고정부; 및 상기 절개선에 삽입되어 절개선을 기준으로 좌우 방향으로 폴딩되거나 회전 가능하도록 배치되는 회전부를 포함하며, vanA 및 vanB 유전자를 운반하는 반코마이신 내성 장구균(VRE)을 간단한 방식으로 비색 검출함으로써 VRE를 빠르게 스크리닝 할 수 있다.

Description

VRE(반코마이신 내성 장구균)의 신속한 스크리닝을 위한 마이크로 디바이스{MICRODEVICE FOR RAPID SCREENING OF VANCOMYCIN-RESISTANT ENTEROCOCCUS}
본 발명은 분자 진단용 마이크로 디바이스에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 VRE(반코마이신 내성 장구균)의 신속한 스크리닝을 위한 마이크로 디바이스에 관한 것이다.
반코마이신 내성 장구균(Vancomycin-resistant Enterococci, 이하 VRE)은 그람 양성 박테리아(Gram-positive bacteria)에 의한 감염 치료에 사용되는 가장 효과적인 글리코펩티드 항생제 중 하나인 반코마이신에 내성을 갖는 병원성 박테리아다. VRE는 1986년 처음 보고되었으며 메티실린 내성 황색포도알균(MRSA)와 함께 병원 감염의 중요한 원인균이며, 치료가 어려운 감염 관리의 주요 대상 세균이다. 요로 감염을 흔히 일으키며, 요로나 복강 또는 간담도 쪽을 수술한 후에 VRE 균혈증이 발생할 수 있다. 또한 복부 수술 후에는 창상(수술 시 절개한 부위) 감염이나 복강 내 감염을 일으킬 수 있다. 그 외에도 심내막염, 호흡기 감염, 뇌수막염 등을 일으킬 수 있다. VRE는 환경에 대한 적응력이 강하여 생물체에 기생하지 않고도 장기간 생존 가능하다. 따라서 환자 장관에 정착한 균에 의한 내인성 감염(환자 장내에 원래 있던 장구균이 질병을 유발)뿐 아니라, 환자나 보균하고 있는 의료 종사자의 손, 의료기기, 병원 환경으로부터 감염될 수 있다. VRE의 신속한 스크리닝이 VRE 감염을 방지하는데 중요시 되는 이유다.
장구균의 반코마이신 내성 표현형은 vanA, vanB, vanC, vanD, vanE, vanG가 있으며 이 중 vanA 및 vanB가 임상적으로 의미 있는 것으로 알려져 있다. vanA를 운반하는 장구균은 반코마이신 및 테이코플라닌(teicoplanin) 모두에 내성이 있고, vanB를 운반하는 장구균은 반코마이신에만 내성이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 VRE 스크리닝에 있어 이들 vanA, vanB 유전자를 검출하는 것이 제일 중요하다. 잘 알려진 VRE 스크리닝 방법은 항생제 감수성 검사(antimicrobial susceptibility test)로, 항생제 내성 박테리아를 스크리닝하는 표준 검사다. 그러나 결과를 제공받기까지 수 일 이상이 걸리는 등 상당한 시간이 소요되며 구체적인 내성 표현형을 구별하기 어려운 한계가 있다. 이러한 한계 극복을 위해 최근에는 핵산 증폭 기반 방법과 같은 분자 진단 방법이 주목받고 있다. 분자 진단 방법은 검출 시간이 상대적으로 빠르고 내성 표현형의 구별도 가능하기 때문이다. 그러나 아직까지 분자 진단 방법은 샘플 분석을 위해 복잡한 장비 및 절차가 요구되는 한계가 있다.
한국등록특허 제10-2267968호(2021.06.16 등록) 한국등록특허 제10-2245743호(2021.04.22 등록)
본 발명은 분자 진단 방법에 기반하여 vanA 및 vanB 유전자를 운반하는 반코마이신 내성 장구균(VRE) 검출함에 있어, 샘플 시료의 전처리, 증폭 및 검출 기능을 하나의 디바이스에 제공하는 마이크로 디바이스를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 중앙에는 소정 길이의 절개선이 형성되고, 절개선을 기준으로 일측면에 마련되는 1 이상의 전처리 챔버와 타측면에 마련되는 1 이상의 반응 챔버를 포함하는 고정부; 및 상기 절개선에 삽입되어 절개선을 기준으로 좌우 방향으로 폴딩되거나 회전 가능하도록 배치되는 회전부를 포함하고, 상기 회전부는 절개선을 기준으로 구분되는 상부 반원부와 하부 반원부를 포함하고, 상부 반원부는 전처리 챔버와 상응하는 위치에 마련되어 DNA의 추출 챔버로 기능하는 제1 필터디스크를 포함하고, 하부 반원부는 반응 챔버와 상응하는 위치에 마련되어 타겟 물질의 검출 영역으로 기능하는 제2 필터디스크를 포함하는 마이크로 디바이스가 제공될 수 있다.
여기에서 상부 반원부는 전처리 챔버와 상응하는 위치에 마련되는 제1 관통홀을 더 포함하고, 수산화나트륨으로 처리된 유리 섬유로 제조되는 제1 필터디스크가 제1 관통홀에 삽입 배치되고, 하부 반원부는 반응 챔버와 상응하는 위치에 마련되는 제2 관통홀을 더 포함하고, 페놀프탈레인으로 처리된 유리 섬유로 제조되는 제2 필터디스크가 제2 관통홀에 삽입 배치될 수 있다.
한편, 각 반응 챔버에는 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification) 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트가 저장될 수 있고, 상기 프라이머 세트는 반코마이신(Vancomycin)에 내성을 보이는 VanA 및/또는 VanB 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트일 수 있다.
또한, 상기 루프-매개 등온증폭 시약 및 프라이머 세트는 상온을 초과하는 특정 온도 이상에서 겔화 되는 아가로즈에 봉입된 채로 반응 챔버에 내장될 수 있다.
한편, 상기 고정부 및 회전부의 소재는 여과지, 종이, 셀룰로오스 종이 및 유리섬유 여과지로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 상기 전처리 챔버에는 분석 대상이 되는 샘플 시료, 수산화나트륨 및 황산 도데실 나트륨(SDS, Sodium dodecyl sulfate)이 도입될 수 있다.
또한, 상기 반응 챔버는 상부에 탈부착 되는 실링 필름을 더 포함할 수 있고, 상기 마이크로 디바이스는 루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 가열부를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 마이크로 디바이스는 vanA 및 vanB 유전자를 운반하는 반코마이신 내성 장구균(VRE)을 간단한 방식으로 비색 검출함으로써 VRE를 빠르게 스크리닝 할 수 있다.
특히 본 발명의 실시예들에 따른 마이크로 디바이스는 전처리 챔버와 반응 챔버가 마련되는 고정부와, 고정부에 삽입 배치되어 좌우로 회전하는 회전부를 포함하여 구성됨으로써 샘플 시료의 전처리, 증폭 및 검출 기능을 하나의 디바이스에서 제공 가능하다.
또한 회전부의 간단한 회전 동작을 통해 시료의 이송 등을 가능케 하여 전처리-증폭-검출이 신속하고 용이하게 이루어질 수 있도록 하였는바, 밸브나 펌프 등의 복잡한 추가 구성이 요구되지 않고 LAMP(루프-매개 등온증폭) 기반의 분자 진단 방식을 사용함으로써 복잡한 가열 장치(열원)도 요구되지 않는바 사용편의성이 크게 향상된 마이크로 디바이스를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 실시예들에 따른 마이크로 디바이스는 종이 기반으로 제조됨으로써 디바이스의 제작 비용을 크게 줄일 수 있으며, 휴대성이 높아 현장진단(point-of-care diagnostics)에 적극 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스의 평면도이다.
도 2는 도 1의 마이크로 디바이스에서 고정부와 회전부가 결합한 형태를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 도 2의 마이크로 디바이스에서 DNA 추출 단계를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 4는 도 2의 마이크로 디바이스에서 증폭 단계를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 5는 도 2의 마이크로 디바이스에서 검출 단계를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스의 특이성 시험 결과를 나타내는 이미지이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스의 민감성 시험 결과를 나타내는 이미지 및 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 하기의 설명은 본 발명을 구체적인 예시를 들어 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 기술적 사상이 하기의 설명에 한정되는 것은 아니다. 그리고 첨부된 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 기술적 사상은 첨부된 도면에 한정되지 않는다. 또한 도면에서 각 부재의 두께나 크기 등은 설명의 편의 등을 위해 과장, 생략, 개략적으로 도시될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 위치관계나 방향은 특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에 첨부된 도면을 기준으로 한다.
1. 마이크로 디바이스의 구조
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스(100)의 평면도이고, 도 2는 도 1의 마이크로 디바이스(100)에서 고정부(110)와 회전부(120)가 결합한 형태를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 마이크로 디바이스(100)는 고정부(110)와 회전부(120)를 포함한다. 고정부(110)와 회전부(120)의 소재는 여과지, 종이, 셀룰로오스 종이 및 유리섬유 여과지(glass microfiber)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같이 마이크로 디바이스(100)의 몸체(고정부 및 회전부)는 종이 기반으로 제조됨으로써 디바이스의 제작 비용을 크게 줄일 수 있으며, 휴대성이 높아 현장진단(point-of-care diagnostics)에 적극 활용될 수 있다. 나아가 고정부(110)와 회전부(120)는 방수를 위하여 네일 폴리시(Nail polish) 용액으로 표면이 코팅될 수 있다.
고정부(110)는 1 이상의 전처리 챔버(111)와 1 이상의 반응 챔버(112)를 포함한다. 고정부(110)의 중앙에는 소정 길이의 절개선(L)이 형성되고 절개선을 기준으로 일측면에는 1 이상의 전처리 챔버(111)가, 타측면에는 1 이상의 반응 챔버(112)가 각각 마련될 수 있다. 관련하여 본 명세서에 첨부된 도면들에서는 고정부(110)에 형성된 절개선(L)을 기준으로 좌측 면에 전처리 챔버(111)가 우측 면에 반응 챔버(112)가 마련된 경우를 도시하고 있다. 또한 본 명세서에 첨부된 도면들에서는 전처리 챔버(111)와 반응 챔버(112)가 각각 3개씩 마련되어 있는 경우를 도시하고 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 전처리 챔버(111)와 반응 챔버(112)의 수는 이보다 많거나 적을 수 있다.
전처리 챔버(111) 및 반응 챔버(112)는 PDMS(폴리디메틸실록산, polydimethylsiloxane)를 성형하여 제작될 수 있다. 예를 들어 고정부(110)에서 챔버가 위치하는 곳에 개구부를 형성한 후, 고정부(110)의 후면에 매트 블랙 알루미늄 포일 테이프를 붙여 개구부에 노출된 테이프 표면에 PDMS로 제작된 챔버를 고정시킬 수 있다. 전처리 챔버(111)는 샘플 시료가 도입되어 전처리 되며, 예컨대 전처리 챔버(111)에서 샘플 시료는 세포 용해(cell lysis)되어 타겟 DNA가 추출될 수 있다. 추출(Extraction) 과정에 대해서는 구체적으로 후술하기로 한다. 반응 챔버(112)는 추출 된 타겟 DNA가 도입되어 DNA 증폭 반응을 수행한다. 증폭(Amplification) 과정에 대해서도 구체적으로 후술하기로 한다. 한편 샘플 시료는 다양한 경로를 통해 수집될 수 있다. 예컨대 일반적으로 반코마이신 내성 장구균은 감염된 사람에 의해 오염된 물, 토양, 임의 물체의 표면, 의료 종사자의 신체 표면, 의료기기 및 장비 등을 통해 확산될 수 있으므로 다양한 소스를 통해 샘플 시료가 수집될 수 있다.
회전부(120)는 전체적으로 원형으로 형성될 수 있으며, 회전부(120)의 몸체는 고정부(110)에 형성된 절개선(L)에 삽입 배치될 수 있다. 회전부(120)는 상부 반원부(121)와 하부 반원부(122)를 포함한다. 구체적으로 도 2에서와 같이 회전부(120) 몸체의 절반이 절개선(L)에 삽입됨으로써, 마이크로 디바이스(100)를 위에서 바라보았을 때 절개선(L)을 기준으로 회전부(120) 몸체의 절반은 고정부(110)의 상부에 노출되고, 몸체의 다른 절반은 고정부(110)의 하부에 노출된다. 이 때, 고정부(110)의 상부에 노출되는 회전부(120) 몸체 부분을 상부 반원부(121)라 칭하고, 고정부(110)의 하부에 노출되는 회전부(120) 몸체 부분을 하부 반원부(122)라 칭한다. 한편 회전부(120)의 일측부에는 사용자가 파지할 수 있도록 파지부(123)가 마련될 수 있다. 예컨대 본 명세서에 첨부된 도면들에 도시된 바와 같이, 파지부(123)는 회전부(120)의 몸체의 바깥 방향으로 돌출된 형태로 형성될 수 있다.
상부 반원부(121)는 제1 필터디스크(121b)를 포함한다. 구체적으로 상부 반원부(121)에는 고정부(110)의 전처리 챔버(111)와 상응하는 위치에 제1 관통홀(121a)이 마련되고 제1 관통홀(121a)에 제1 필터디스크(121a)가 삽입 배치된다. 제1 필터디스크(121a)는 수산화나트륨으로 처리된 유리 섬유(유리 극세사 필터 섬유, glass microfiber)로 제조될 수 있다.
하부 반원부(122)는 제2 필터디스크(122b)를 포함한다. 구체적으로 하부 반원부(122)에는 고정부(110)의 반응 챔버(112)와 상응하는 위치에 제2 관통홀(122a)이 마련되고 제2 관통홀(122a)에 제2 필터디스크(122b)가 삽입 배치된다. 제2 필터디스크(122b)는 페놀프탈레인으로 처리된 유리 섬유(유리 극세사 필터 섬유, glass microfiber)로 제조될 수 있다.
회전부(120)가 고정부(110)에 삽입 배치된 상태에서 사용자가 회전부(120)의 파지부(123)를 잡고 반시계 방향으로 회전시키면, 회전부(120)가 절개선(L)을 기준으로 회전되어 상부 반원부(121)가 전처리 챔버(111)로 접근하고 이에 따라 제1 필터디스크(121a)의 후면이 전처리 챔버(111)와 접촉할 수 있다. 반대로 사용자가 회전부(120)의 파지부(123)를 잡고 시계 방향으로 회전시키면, 상부 반원부(121)가 반응 챔버(112)로 접근하여 제1 필터디스크(121a)의 전면이 반응 챔버(112)와 접촉할 수 있다. 이러한 동작에 따라 전처리 챔버(111)에서 전처리 된 샘플 시료가 반응 챔버(112)로 이동할 수 있다. 또는 사용자가 절개선(L)을 기준으로 상부 반원부(121)를 좌우 방향으로 폴딩(folding)시킴으로써 제1 필터디스크(121a)를 전처리 챔버(111) 또는 반응 챔버(112)와 접촉시킬 수 있다.
2. 마이크로 디바이스의 동작
(1) DNA 추출(Extraction)
도 3은 도 2의 마이크로 디바이스(100)에서 DNA 추출(Extraction) 단계를 개략적으로 도시한 도면이다. 도 3을 참조하면, DNA 추출을 위하여 전처리 챔버(111)에 샘플 시료, 수산화나트륨 및 황산 도데실 나트륨(SDS, Sodium dodecyl sulfate)을 첨가하고 일정 온도 및 시간 하에서 배양할 수 있으며(예컨대 65℃에서 10분), 이후 용액의 pH가 대략 7로 조정될 수 있다(도 3에서 ①로 표기함). 수산화나트륨은 다양한 소스(그람-양성 및 음성 박테리아 세포 및 효모)로부터 DNA 추출에 이용되며, 그람-양성 세포벽을 용해시키고 DNA를 방출하는 기능을 한다. SDS는 DNA 추출에 사용되는 세정제(detergent)로 세포벽을 파괴하고 대부분의 막 단백질과 지질을 변성시키는 기능을 한다. 상술한 과정을 거치면서 전처리 챔버(111) 내의 샘플 시료로부터 DNA가 추출될 수 있다.
다음으로 회전부(120)의 상부 반원부(121)를 폴딩하여, 제1 필터디스크(121b)의 후면을 전처리 챔버(111)에 접촉시킨다(도 3에서 ②로 표기함). 이 때 제1 필터디스크(121b)에 DNA가 흡착되어 포획될 수 있다. 제1 필터디스크(121b)는 수산화나트륨으로 처리되었는바 제1 필터디스크(121b)의 표면에 처리된 수산화기가 DNA의 수산화기와 상호 작용하기 때문이다(수소 결합 형성). 이어 제1 필터디스크(121b)를 에탄올 용액 등으로 세정하면, 제1 필터디스크(121b)에 정제된 DNA만 남는다.
(2) DNA 증폭(Amplification)
도 4는 도 2의 마이크로 디바이스(100)에서 증폭(Amplification) 단계를 개략적으로 도시한 도면이다. 도 4를 참조하면, 본 발명의 실시예들에 따른 마이크로 디바이스(100)에서는 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification) 방법을 통해 타겟 DNA를 증폭시킨다. 루프-매개 등온증폭 방법은 일정한 온도에서 접합 및 신장이 이루어지는 핵산 증폭법의 일 종류다. 루프-매개 등온증폭 방법의 개념 및 원리 등은 당업계에 알려져 있으므로 구체적인 설명은 생략한다. 이를 위해 고정부(110)의 반응 챔버(112)에는 LAMP 반응 시약 및 타겟 유전자를 증폭시키는 프라이머가 내장된다. LAMP 반응 시약은 Bst DNA 폴리머라제(중합효소), 등온 증폭 버퍼(10x), dNTPs, 100 mM MgSO4 등을 포함할 수 있다. 이러한 LAMP 반응 시약은 통상의 방법을 통해 입수 가능하다. 한편 본 발명의 실시예들에 따른 마이크로 디바이스(100)에서는 타겟 DNA의 비색 검출을 위해 LAMP 반응 시약의 pH가 9.5 이상 10 미만으로 제어될 수 있으며, 검출의 민감도를 향상시키기 위하여 반응 완충액(reaction buffer)의 농도를 통상의 수준보다 낮출 수 있다. 프라이머는 타겟 DNA의 존부를 판단할 수 있도록 타겟 DNA에 혼성화되도록 제조될 수 있으며, 본 발명에서 프라이머는 Enterococcus Faecium vanA 및 vanB 유전자를 증폭하기 위해 알려진 방법에 의해 설계될 수 있다. 또한 LAMP 시약 및 프라이머는 상온에서는 고체이지만 약 65℃에서 겔화 되는 아가로즈에 봉입된 채로 반응 챔버(112)에 내장될 수 있으며, LAMP 반응 시약 및 프라이머가 반응 챔버(112)에 내장된 후에, 반응 챔버(112)의 상부는 탈부착 가능한 필름(실링 필름)으로 실링될 수 있다.
DNA 증폭을 위하여 우선 반응 챔버(112)의 상부를 덮고 있는 필름을 제거한 후 고정부(110)의 상부 반원부(121)를 반응 챔버(112) 쪽으로 폴딩하여, 제1 필터디스크(121b)의 전면을 반응 챔버(112)에 접촉시킨다(도 4에서 ③으로 표기함). 다음으로 제1 필터디스크(121b)에 포획된 DNA를 용출시키기 위해 정제수를 제1 필터디스크(121b)에 첨가하여 세척하면 타겟 DNA가 반응 챔버(112)로 용출될 수 있다. DNA의 충분한 용출을 위해 일정 시간(예컨대 10분)이 경과하면, 다시 상부 반원부(121)를 언폴딩하고 반응 챔버(112)의 상부는 필름으로 실링될 수 있다(도 4에서 ④로 표기함). 이후 LAMP 반응을 수행하여 DNA를 증폭시킬 수 있다. 예를 들어 LAMP 반응은 65℃에서 45분 가량 수행될 수 있다. 앞서 설명한 것처럼 반응 챔버(112)에는 LAMP 반응 시약이 약 65℃에서 겔화 되는 아가로즈에 봉입되어 있으므로, LAMP 반응이 수행되면 아가로즈가 겔화되면서 봉입된 LAMP 반응 시약이 분출되면서 LAMP 반응이 일어날 수 있다.
한편 본 명세서에 첨부된 도면에는 도시되지 않았으나 본 발명의 실시예들에 따른 마이크로 디바이스(100)는 LAMP 반응을 수행하기 위한 열원을 제공하는 가열부(미도시)를 더 포함할 수 있다. 가열부는 특정 종류로 제한되지 않는다. 예를 들어 가열부는 구리 가열 블록, 박막 히터, 고무 히터, 적외선 히터, 할로겐 히터, 마이크로웨이브, 유도 가열 장치 등 다양한 장치를 사용할 수 있다.
도 5는 도 2의 마이크로 디바이스(100)에서 검출 단계(Detection)를 개략적으로 도시한 도면이다. 도 4에서 설명한 것과 같은 LAMP 반응이 종료되면, 회전부(120)를 고정부(110)의 평면 상에서 회전(Spinning, 도 5에서 ⑤로 표기함) 시켜, 하부반원부(122)의 제2 필터디스크(122b)를 반응 챔버(112)에 접촉시킨다. 이 때, 제2 필터디스크(122b)는 상술한 것처럼 페놀프탈레인으로 처리된 유리 섬유로 제조되고, 여기에서 페놀프탈레인이 지시약으로 기능하여 제2 필터디스크(122b)의 색 변화를 통해 타겟 DNA를 비색 검출할 수 있다.
보다 구체적으로, 페놀프탈레인 지시약은 pH 0~8 미만에서는 투명하지만, pH 8~10 이하에서는 상온에서 대략 30초 이내에 분홍색(pink)으로 발색되는 특성이 있다. 따라서 페놀프탈레인으로 처리된 제2 필터디스크(122b)가 반응 챔버(112)와 접촉하면 반응 챔버(112)의 pH에 따라 제2 필터디스크(122b)가 투명해지거나 또는 분홍색으로 발색되며 이에 따라 타겟 DNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 상술한 것처럼 반응 챔버(112)에 도입되는 LAMP 반응 시약의 초기 pH는 9.5 이상 10 미만으로 제어된다. 그리고 LAMP 반응이 수행되면, 타겟 DNA가 존재하는 경우에는 산성 부산물로 인해 pH가 8 미만으로 낮아지며, 타겟 DNA가 부존재하는 경우에는 pH의 변화가 거의 없다. DNA 증폭 반응시, 새로운 DNA 가닥(DNA strands)이 합성되면 피로인산(pyrophosphate) 및 양성자(proton)을 포함하는 부산물이 대량으로 방출되기 때문이다. 한편 통상적으로 사용되는 LAMP 반응 시약에서는 반응 완충액(reaction buffer)을 통해 반응물의 pH를 일정하게 유지되도록 하나, 본 발명의 실시예들에 따른 마이크로 디바이스(100)에서 사용되는 LAMP 반응 시약은 인위적으로 반응 완충액의 농도(약 25~400μM)를 통상 수준(일반적으로 약 20mM) 보다 소정 정도 낮춤으로써 반응에 따른 pH의 변동성을 보다 높였다. 따라서 제2 필터디스크(122b)를 반응 챔버(112)에 접촉시켰을 때, 반응 챔버(112) 내에 타겟 DNA가 존재하는 경우에는 pH가 8 미만이 되어 제2 필터디스크(122b)가 투명해지며, 타겟 DNA가 부존재하는 경우에는 pH가 9.5 이상으로 유지되므로 제2 필터디스크(122b)가 분홍색으로 발색된다. 따라서 제2 필터디스크(122b)의 상술한 것과 같은 색 변화를 통해, 육안으로 타겟 DNA의 비색 검출이 가능하다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스(100)는 전처리 챔버(111)와 반응 챔버(112)가 마련되는 고정부(110)와, 고정부(110)에 삽입 배치되어 좌우로 회전하는 회전부(120)를 포함하여 구성됨으로써 샘플 시료의 전처리, 증폭 및 검출 기능을 하나의 디바이스에서 제공 가능하다. 또한 회전부(120)의 간단한 회전 동작을 통해 시료의 이송 등을 가능케 하여 전처리-증폭-검출이 신속하고 용이하게 이루어질 수 있도록 하였는바, 밸브나 펌프 등의 복잡한 추가 구성이 요구되지 않고 LAMP(루프-매개 등온증폭) 기반의 분자 진단 방식을 사용함으로써 복잡한 가열 장치(열원)도 요구되지 않는바 사용편의성이 크게 향상된 마이크로 디바이스(100)를 제공할 수 있다.
이하에서는 본 발명의 시험예들에 대해 설명한다. 다만 본 발명이 하기 시험예들에 의해 제한되지 않음을 밝혀둔다. 또한 설명의 편의를 위해 아래 시험예에서는 마이크로 디바이스(100)의 각 구성에 대하여 도 1 및 도 2의 도면부호를 병기하여 기재하였다.
시험예
(1) 마이크로 디바이스의 제조
고정부(110) 제조를 위해 종이 3.7×3.7cm 조각을 구비하고(중앙에 절개선이 형성됨) 상부에는 챔버 형성을 위해 1.5cm 길이 및 0.7cm 너비를 갖는 개구부 한 쌍을 생성하였다. 이후 방수를 위하여 상기 종이를 농축된 네일 폴리시 용액으로 코팅하였다. 다음으로 PDMS를 성형하여 1.5cm 길이, 0.7cm 너비 및 0.25cm의 높이를 갖는 한 쌍의 챔버 틀을 각각 제조하고, 각 챔버 틀에는 직경 0.25cm 가량의 관통홀을 3개씩 형성하였다. 고정부(110)의 후면에는 매트 블랙 알루미늄 포일 테이프를 붙이고 챔버 틀을 개구부에 삽입 배치하여 상기 테이프를 통해 고정부(110)에 고정시킴으로써 고정부(110) 제조가 완료되었다.
각 반응 챔버(112)에는 약 65℃에서 겔화 되는 아가로스 내에 봉입된 LAMP 반응 시약이 첨가되었다. 각 반응 챔버(112)의 부피는 12.25 μL 이었으며, 외부 오염으로부터 보호하기 위해 반응 챔버(112)의 상부를 필름으로 실링하였다.
다음으로 회전부(120) 제조를 위해 직경 2.8cm의 크기를 갖는 원형의 종이 조각을 구비하고 직경 0.2cm의 관통홀(121a,122a)을 형성하였다. 회전부(120)의 상부 반원부(121)에 위치한 제1 관통홀(121a)에는 수산화나트륨으로 처리된 제1 필터디스크(121b)를 삽입하였고, 하부 반원부(122)에 위치한 제2 관통홀(122a)에는 페놀프탈레인으로 처리된 제2 필터디스크(122b)를 삽입하고, 네일 폴리시 용액으로 고정하였다. 한편 제1 필터디스크(121b)는 유리 극세사 필터 섬유를 디스크 모양으로 자르고 수산화나트륨 용액(0.5M)에 담그고 2시간 동안 반응시켰고, 제2 필터디스크(122b)는 유리 극세사 필터 섬유를 디스크 모양으로 자르고 페놀프탈레인 용액(2mM)에 담그고 2시간 동안 반응시켜 마련하였다.
마지막으로 회전부(120)의 몸체를 고정부(110)에 형성된 절개선(L)에 삽입 배치함으로써 마이크로 디바이스(100)의 제조가 완료되었다.
(2) 마이크로 디바이스의 작동
본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스(100)의 성능을 시험하기 위해 특이성 및 민감도 시험을 수행하였고, 아래와 같은 방식으로 마이크로 디바이스(100)의 작동이 이루어졌다.
마이크로 디바이스(100)의 고정부(110)에서 3개의 전처리 챔버(111) 중 1개 챔버에는 물이 주입되었고(음성 대조군), 나머지 2개 챔버에는 박테리아 세포 배양물이 주입되었다. 이어 각 전처리 챔버(111)에는 수산화나트륨(0.5M) 및 황산 도데실 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS, 0.1%)이 첨가되었으며, 이후 65℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 후, 회전부(120)의 상부 반원부(121)를 전처리 챔버(111) 쪽으로 폴딩하여 제1 필터디스크(121b)를 전처리 챔버(111)에 접촉시켰다. 상온에서 10분 동안 반응시킨 후에, 제1 필터디스크(121b)에 포획된 DNA의 세정을 위하여 에탄올 용액으로 제1 필터디스크(121b)를 세정하고, 회전부(120)의 상부 반원부(121)를 반응 챔버(112) 쪽으로 폴딩하였다. 반응 챔버(112)의 상부를 실링하고 있는 필름을 제거하고, 제1 필터디스크(121b)에 물을 첨가하여 포획된 DNA를 각 반응 챔버(112)로 용출하였다. 10분 가량 경과 후, 상부 반원부(121)가 언폴딩 되었으며, 반응 챔버(112)의 상부를 필름으로 실링한 후에 LAMP 반응이 65℃에서 45분 가량 수행되었다. 열원을 제공하는 가열부로는 핫플레이트가 이용되었다. LAMP 반응 후에는 회전부(120)를 고정부(110)의 평면 상에서 회전(Spinning)시켜 하부 반원부(122)의 제2 필터디스크(122b)를 반응 챔버(112)에 접촉시키고 일정 시간 경과 후, 색 변화를 육안 및 소프트웨어(Image J)를 이용하여 관찰하였다.
(3) 특이성 및 민감도 시험
상술한 것처럼 특이성 및 민감도 시험이 수행되었다. 우선 특이성 시험을 위해서, 2개의 수돗물 샘플에 vanA 및 vanB 유전자를 운반하는 반코마이신-내성 E.faecium을 각각 혼합하였다. 구체적으로 수돗물 1번 샘플에는 ATCC 700221(vanA 유전자를 운반)를 혼합하였고, 수돗물 2번 샘플에는 NCPP 11520(vanB 유전자를 운반)를 혼합하였다. 한편, 마이크로 디바이스(100) 고정부(110)의 3개의 반응 챔버(112)에는 각각 LAMP 시약(1번 반응 챔버), LAMP 시약 및 vanA를 위한 프라이머 세트(2번 반응 챔버), LAMP 시약 및 vanB를 위한 프라이머 세트(3번 반응 챔버)를 로딩하였다.
(시험예 1) 고정부(110)의 3개의 전처리 챔버(111) 중 1개 챔버에는 물이 주입되었고(음성 대조군), 나머지 2개 챔버에는 수돗물 1번 샘플(ATCC 700221 혼합)이 주입되었다. 이후, 마이크로 디바이스(100)를 작동시켜 DNA 추출-증폭-검출을 수행하였다.
(시험예 2) 고정부(110)의 3개의 전처리 챔버(111) 중 1개 챔버에는 물이 주입되었고(음성 대조군), 나머지 2개 챔버에는 수돗물 2번 샘플(NCPP 11520 혼합)이 주입되었다. 이후, 마이크로 디바이스(100)를 작동시켜 DNA 추출-증폭-검출을 수행하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스(100)의 특이성 시험 결과를 나타내는 이미지이다.
도 6을 참조하면, 좌측 이미지는 시험예 1의 결과를 보여주는 회전부(130)의 이미지이고, 우측 이미지는 시험예 2의 결과를 보여주는 회전부(130)의 이미지다. 비색 검출을 수행하는 3개의 제2 필터디스크(122b)의 좌측에 숫자가 표기되어 있고, 이는 제2 필터디스크(122b)가 접촉한 반응 챔버(112)의 식별 번호를 의미한다.
시험예 1의 경우, 좌측 이미지에서 확인되듯이 1,3번 제2 필터디스크는 분홍색(pink)을 띠는 반면, 2번 제2 필터디스크는 무색을 나타내고 있다. 이는 2번 반응 챔버(vanA를 위한 프라이머 세트 로딩)에서만 LAMP 반응이 일어났음을 의미하는 것으로, 수돗물 1번 샘플에는 vanA 유전자를 운반하는 반코마이신-내성 E.faecium이 포함되어 있음을 나타낸다. 또한 3번 반응 챔버(vanB를 위한 프라이머 세트 로딩)에서는 LAMP 반응이 일어나지 않았으므로, 수돗물 1번 샘플에는 vanB 유전자를 운반하는 반코마이신-내성 E.faecium이 포함되어 있지 않음을 나타낸다.
시험예 2의 경우, 우측 이미지에서 확인되듯이 1,2번 제2 필터디스크는 분홍색(pink)을 띠는 반면, 3번 제2 필터디스크는 무색을 나타내고 있다. 이는 3번 반응 챔버(vanB를 위한 프라이머 세트 로딩)에서만 LAMP 반응이 일어났음을 의미하는 것으로, 수돗물 2번 샘플에는 vanB 유전자를 운반하는 반코마이신-내성 E.faecium이 포함되어 있음을 나타낸다. 또한 2번 반응 챔버(vanA를 위한 프라이머 세트 로딩)에서는 LAMP 반응이 일어나지 않았으므로, 수돗물 2번 샘플에는 vanA 유전자를 운반하는 반코마이신-내성 E.faecium이 포함되어 있지 않음을 나타낸다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스(100)가 vanA 및 vanB 유전자를 운반하는 반코마이신 내성 장구균(VRE)에 특이성이 있음을 확인할 수 있다.
다음으로 민감성 시험을 위해서, 수돗물 샘플에 vanA 유전자를 운반하는 반코마이신-내성 E.faecium을 혼합하되, 농도를 달리하여 4군의 샘플을 각각 제조하였다. 샘플의 농도는 각각 100 CFU/mL, 101 CFU/mL, 102 CFU/mL, 103 CFU/mL 이었다. 한편 마이크로 디바이스(100) 고정부(110)의 3개의 반응 챔버(112) 모두에는 LAMP 시약 및 vanA를 위한 프라이머 세트를 로딩하였다. 이후, 마이크로 디바이스(100)를 작동시켜 상기 샘플들에 대하여 모두 DNA 추출-증폭-검출을 수행하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스(100)의 민감성 시험 결과를 나타내는 이미지 및 그래프이다. 구체적으로 도 7의 좌측 이미지는 민감성 시험 결과를 나타내는 제2 필터디스크(122b)의 이미지이고, 도 7의 우측 이미지는 각 농도에 따른 제2 필터디스크의 색 강도(color intensity)를 소프트웨어(Image J)를 통해 분석하여 나타낸 그래프이다. 민감성 시험 결과, 도 7의 좌측 이미지에서와 같이 102 CFU/mL, 103 CFU/mL 농도를 갖는 샘플에서는 제2 필터디스크가 무색을 나타내는 반면, 100 CFU/mL, 101 CFU/mL 농도를 갖는 샘플에서는 제2 필터디스크가 분홍색(pink)을 띠고 있음을 확인할 수 있다. 이는 102 CFU/mL, 103 CFU/mL 농도를 갖는 샘플에서 LAMP 반응이 성공적으로 일어났음을 의미하는 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 디바이스(100)가 102 CFU/mL 가량의 낮은 농도에서도 타겟 유전자를 검출할 수 있는 민감성을 가지고 있음을 알 수 있다.
이상, 본 발명의 구현예들에 대하여 설명하였다. 그러나 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 기술의 구체적 적용에 따른 단순한 설계변경, 일부 구성요소의 생략, 단순한 용도의 변경 등 본 발명을 다양하게 변형할 수 있을 것이며, 이러한 변형 역시 본 발명의 권리범위 내에 포함됨은 자명하다.
100: 마이크로 디바이스 110: 고정부
111: 전처리 챔버 112: 반응 챔버
120: 회전부 121: 상부 반원부
121a: 제1 관통홀 121b: 제1 필터디스크
122: 하부 반원부 122a: 제2 관통홀
122b: 제2 필터디스크 123: 파지부

Claims (9)

  1. 중앙에는 소정 길이의 절개선이 형성되고, 절개선을 기준으로 일측면에 마련되는 1 이상의 전처리 챔버와 타측면에 마련되는 1 이상의 반응 챔버를 포함하는 고정부; 및
    상기 절개선에 삽입되어 절개선을 기준으로 좌우 방향으로 폴딩되거나 회전 가능하도록 배치되는 회전부를 포함하고,
    상기 회전부는 절개선을 기준으로 구분되는 상부 반원부와 하부 반원부를 포함하고,
    상부 반원부는 전처리 챔버와 상응하는 위치에 마련되어 DNA의 추출 챔버로 기능하는 제1 필터디스크를 포함하고, 하부 반원부는 반응 챔버와 상응하는 위치에 마련되어 타겟 물질의 검출 영역으로 기능하는 제2 필터디스크를 포함하는 마이크로 디바이스.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상부 반원부는 전처리 챔버와 상응하는 위치에 마련되는 제1 관통홀을 더 포함하고, 수산화나트륨으로 처리된 유리 섬유로 제조되는 제1 필터디스크가 제1 관통홀에 삽입 배치되고,
    하부 반원부는 반응 챔버와 상응하는 위치에 마련되는 제2 관통홀을 더 포함하고, 페놀프탈레인으로 처리된 유리 섬유로 제조되는 제2 필터디스크가 제2 관통홀에 삽입 배치되는 마이크로 디바이스.
  3. 청구항 2에 있어서,
    각 반응 챔버에는 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification) 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트가 저장되는 마이크로 디바이스.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 반코마이신(Vancomycin)에 내성을 보이는 VanA 및/또는 VanB 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트인 마이크로 디바이스.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 루프-매개 등온증폭 시약 및 프라이머 세트는 상온을 초과하는 특정 온도 이상에서 겔화 되는 아가로즈에 봉입된 채로 반응 챔버에 내장되는 마이크로 디바이스.
  6. 청구항 3에 있어서,
    상기 고정부 및 회전부의 소재는 여과지, 종이, 셀룰로오스 종이 및 유리섬유 여과지로 이루어진 군에서 선택되는 마이크로 디바이스.
  7. 청구항 3에 있어서,
    상기 전처리 챔버에는 분석 대상이 되는 샘플 시료, 수산화나트륨 및 황산 도데실 나트륨(SDS, Sodium dodecyl sulfate)이 도입되는 마이크로 디바이스.
  8. 청구항 3에 있어서,
    상기 반응 챔버는 상부에 탈부착 되는 실링 필름을 더 포함하는 마이크로 디바이스.
  9. 청구항 3에 있어서,
    루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 가열부를 더 포함하는 마이크로 디바이스.
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