KR102346671B1

KR102346671B1 - 반응 시약의 장기 보관이 가능한 폴더블 타입의 마이크로디바이스

Info

Publication number: KR102346671B1
Application number: KR1020200009602A
Authority: KR
Inventors: 이내윤
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-28
Filing date: 2020-01-28
Publication date: 2021-12-31
Also published as: KR20210096337A

Abstract

반응 시약의 장기 보관이 가능한 폴더블 타입의 마이크로디바이스가 개시된다. 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로디바이스는 복수의 반응 챔버가 형성되고 상기 반응 챔버에는 2-하이드록시에틸 아가로스 내에 루프-매개 등온증폭 시약이 봉입된 형태를 갖는 제1 아가로스 혼합물이 도입되는 제1 기재와, 복수의 검출 챔버가 형성되고 상기 검출 챔버에는 2-하이드록시에틸 아가로스 내에 질산은이 봉입된 형태를 갖는 제2 아가로스 혼합물이 도입되는 제2 기재와, 제1 기재와 제2 기재가 나란히 상부에 배치되어 제2 기재를 제1 기재쪽으로 폴딩시킬 수 있도록 형성되는 지지필름을 포함한다.

Description

반응 시약의 장기 보관이 가능한 폴더블 타입의 마이크로디바이스{FOLDABLE MICRODEVICE FOR LONG-TERM STORAGE OF REAGENT}

본 발명은 타겟 유전자를 검출하기 위한 마이크로디바이스에 관한 것으로, 보다 상세하게는 타겟 유전자와 반응하는 반응 시약의 장기 보관이 가능한 폴더블 타입의 마이크로디바이스에 관한 것이다.

박테리아 병원균(bacterial pathogens)을 검출하기 위한 많은 방법들이 개발되어 왔고, 대표적으로는 배양 기반 방법(culture-based method), 면역 분석 방법(immunoassays), 핵산 기반 접근법(nucleic acid-based approaches) 등이 있다. 이 중 최근에는 PCR(polymerase chain reaction; 중합효소 연쇄반응)로 대표되는 핵산 기반 접근법이 널리 활용되고 있다. 그런데 PCR을 이용한 핵산 기반 접근법에서는 증폭 반응을 위해 써모사이클러(thermocycler)가 요구되어 현장진단에서는 적합하지 않은 한계를 보이고 있다. 현장진단(point-of-care testing) 기술에서 등온 증폭 기술에 대한 관심이 높아지는 이유다.

루프-매개 등온 증폭법(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)은 단일 히터를 사용 가능하고, 높은 특이성 및 민감도, 신속성 등의 측면에서 많은 장점을 갖는다. 나아가 다른 방법들에 비해 복잡하지 않아 특히 현장진단용 검출 디바이스에 적합한 특성이 있다. 이에 따라 LAMP에 기반한 병원균 현장진단용 디바이스에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있는 실정이다. 현장진단용 검출 디바이스는 제조가 용이하고 사용이 간편하고 검출 결과를 육안으로 확인할 수 있도록 하는 것이 중요한데, 아직까지 이를 충족하는 기기는 공개된 바 없다.

핵산 기반 분석을 수행하기 위해서는 증폭 단계가 필수적으로 요구된다. 증폭 단계가 없으면 저농도로 추출된 핵산이 검출되지 않기 때문이다. 따라서 휴대성 및 사용 편의성을 증진시키기 위한 증폭 시약(amplification reagents)의 준비는 매우 중요하며, 이를 용이하게 하기 위한 개발 전략이 요구되고 있다.

한국공개특허 제10-2017-0078456호(2017.7.7 공개)

본 발명은 타겟 유전자와 반응하는 반응 시약의 장기 보관을 가능케 하여 현장진단에 적합한 폴더블 타입의 마이크로디바이스를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 복수의 반응 챔버가 형성되고 상기 반응 챔버에는 2-하이드록시에틸 아가로스(2-hydroxyethyl agarose) 내에 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification) 시약이 봉입된 형태를 갖는 제1 아가로스 혼합물이 도입되는 제1 기재와, 복수의 검출 챔버가 형성되고 상기 검출 챔버에는 2-하이드록시에틸 아가로스 내에 질산은(silver nitrate)이 봉입된 형태를 갖는 제2 아가로스 혼합물이 도입되는 제2 기재와, 제1 기재와 제2 기재가 나란히 상부에 배치되어 제2 기재를 제1 기재쪽으로 폴딩시킬 수 있도록 형성되는 지지필름을 포함하고, 상기 검출 챔버는 제2 기재가 제1 기재쪽으로 폴딩되었을 때 반응 챔버와 상응하도록 위치되는 폴더블 타입의 마이크로디바이스가 제공될 수 있다.

이 때, 상기 루프-매개 등온증폭(LAMP) 시약은 반응 챔버로 도입되는 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 함유할 수 있다.

또한, 상기 제1 기재 및 제2 기재는 폴리카보네이트(Polycarbonate)로 형성될 수 있다.

또한, 제1 기재의 상부를 덮어 반응 챔버를 밀봉하는 제1 실링필름과, 제2 기재의 상부를 덮어 검출 챔버를 밀봉하는 제2 실링필름을 더 포함할 수 있고, 상기 제1 실링필름 또는 제2 실링필름은 교체 가능하다.

한편, 루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 히터부를 더 포함할 수 있고, 상기 히터부는 구리 가열 블록, 박막 히터, 고무 히터, 적외선 히터, 할로겐 히터, 마이크로웨이브 또는 유도 가열 장치일 수 있다.

또한, 상기 히터부는, 기재와, 기재 상부 양측에 각각 마련되는 제1 전극부와, 양 단부가 제1 전극부에 각각 접촉되어 제1 전극부를 상호 연결하는 형태로 형성되는 제2 전극부를 포함하고, 제1 전극부는 구리 테이프로 형성되고, 제2 전극부는 탄소 페이스트(carbon paste)로 형성될 수 있다.

이 때, 상기 제2 전극부와 접촉하는 제1 전극부의 상부는 은 페이스트(silver paste)로 코팅될 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로디바이스는 아가로스를 사용하여 LAMP 시약을 봉입하여 마이크로디바이스의 반응 챔버에 보관함으로써 최대 45일 동안 LAMP 시약의 활성을 유지할 수 있다. 따라서 휴대성 및 장기 보관성을 높여 현장진단에 적합한 마이크로디바이스를 제공할 수 있다.

또한 단순한 폴딩 동작에 의해 비색 검출이 이루어지도록 함으로써 시료 이송을 위한 별도의 복잡한 구성(밸브, 펌프 등)이 요구되지 않을 뿐더러 루프-매개 등온증폭을 기반으로 하므로 복잡한 가열 장치도 요구되지 않아 전체 마이크로 디바이스를 간략하게 구성 가능하고, 실링필름의 교체를 통해 재사용도 가능한 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 폴더블 타입의 마이크로디바이스의 개념도이다.
도 2는 도 1의 마이크로디바이스에 적용되는 히터부의 일 구체예를 도시한 개념도이다.
도 3은 도 1의 마이크로디바이스의 동작을 나타내는 개념도이다.
도 4는 2-하이드록시에틸 아가로스에 저장된 LAMP 시약의 성능을 나타내는 이미지다.
도 5는 질산은을 사용하여 LAMP 앰플리콘의 비색 검출 결과를 나타내는 이미지다.
도 6은 특이성 시험 결과를 나타내는 개념도 및 이미지이다.
도 7은 다중 검출 시험 결과를 나타내는 이미지이다.

이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하도록 한다.

본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 위치관계나 방향은 특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에 첨부된 도면을 기준으로 한다.

본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 공간에 대한 설명이나 위치관계에 대한 설명은 본 발명을 이루는 구성요소들 간의 상대적인 위치를 의미한다. 또한 특별히 언급하지 않는 한, 하나의 구성요소와 다른 구성요소 사이의 공간에는 또 다른 구성요소가 존재할 수 있다. 예를 들어 본 명세서에서 하나의 구성요소의 "상부에" 또는 "위에" 다른 구성요소가 위치함을 언급하는 경우, 하나의 구성요소의 바로 위에 다른 구성요소가 위치하는 경우뿐만 아니라, 하나의 구성요소와 다른 구성요소들 사이에 또 다른 구성요소가 위치하는 경우까지를 포함한다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 폴더블 타입의 마이크로디바이스(100, 이하 마이크로디바이스)의 개념도이다.

도 1을 참조하면, 마이크로디바이스(100)는 제1 기재(110), 제2 기재(120) 및 지지필름(130)을 포함한다. 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)는 박막 필름형으로 형성될 수 있고, 지지필름(130)은 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)를 동시에 하부에서 지지한다. 즉, 지지필름(130)의 상부면 일부에는 제1 기재(110)가 배치되고, 다른 일부에는 제2 기재(120)가 배치된다. 이 때 지지필름(130)은 내외측으로 폴딩 가능하게 형성된다. 따라서 지지필름(130)을 폴딩함으로써 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)가 서로 겹칠 수 있다. 일 구체예에 있어서 지지필름(130)은 40mm 가량의 폭(도 1에서 세로 방향)과 50mm 가량의 길이(도 1에서 가로 방향)를 갖는 크기로 형성될 수 있고, 이 때, 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)는 각각 40mm 가량의 폭과 25mm 가량의 길이를 갖는 크기로 형성될 수 있다.

제1 기재(110) 및 제2 기재(120)는 열가소성 플라스틱 소재로 형성될 수 있다. 예를 들어 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)는 PC(폴리카보네이트), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트) 또는 PP(폴리프로필렌) 소재를 필름형으로 가공함으로써 형성될 수 있으며, PC 소재가 바람직하다.

제1 기재(110)는 반응 영역(reaction zone)으로 기능하는 것으로, 제1 기재(110)에는 복수의 반응 챔버(111)가 형성될 수 있다. 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같이 제1 기재(110)에는 원형의 반응 챔버(111)가 8개 형성될 수 있으며, 반응 챔버(111)의 수는 이보다 많거나 적을 수 있다. 일 구체예에 있어서 반응 챔버(111)는 5mm 가량의 직경을 가지며, 높이는 약 500㎛ 가량의 크기를 가질 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다(부피는 대략 10㎕). 반응 챔버(111)는 제1 기재(110)에 관통홀을 형성함으로써 형성될 수 있으며, 반응 챔버(111)의 하부는 지지필름(130)에 의해 밀봉될 수 있다.

제2 기재(120)는 검출 영역(detection zone)으로 기능하는 것으로, 제2 기재(120)에는 복수의 검출 챔버(121)가 형성될 수 있다. 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같이 제2 기재(120)에는 원형의 검출 챔버(121)가 8개 형성될 수 있으며, 이 때 각 검출 챔버(121)는 제2 기재(120)를 제1 기재(110) 쪽으로 폴딩하였을 때(혹은 그 반대의 경우도 마찬가지임) 반응 챔버(111)와 상응하는 위치에 형성될 수 있다. 검출 챔버(121)의 수는 반응 챔버(111)의 수와 상응하도록 형성될 수 있다. 일 구체예에 있어서 검출 챔버(121)는 2.5mm 가량의 직경을 가질 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 검출 챔버(121)는 반응 챔버(111)와 마찬가지로 제2 기재(120)에 관통홀을 형성함으로써 형성될 수 있으며, 검출 챔버(121)의 하부는 지지필름(130)에 의해 밀봉될 수 있다.

지지필름(130)은 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)의 하부면에 일체로 부착됨으로써 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)를 하부에서 지지할 수 있다. 지지필름(130)은 필름 형태를 가질 수 있으며, 폴딩(folding) 가능한 소재로 형성될 수 있다. 예를 들어 지지필름(130)은 PC(폴리카보네이트), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트) 또는 PP(폴리프로필렌) 소재를 필름형으로 가공함으로써 형성될 수 있고 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)의 하부면에 결합(접착, 점착 등)될 수 있다(이상 도 1a 참고).

제1 기재(110)의 반응 챔버(112)에는 제1 아가로스 혼합물(112)이 도입되고, 제2 기재(120)의 검출 챔버(121)에는 제2 아가로스 혼합물(122)이 도입될 수 있다.

제1 아가로스 혼합물(112)은 대략 1% 농도의 2-하이드록시에틸 아가로스(2-hydroxyethyl agarose)과 LAMP 시약(루프-매개 등온 증폭 시약)이 혼합되어 형성될 수 있다. LAMP 시약은 Bst DNA 폴리머라제(중합효소), 등온 증폭 버퍼(1x), 1.4mM dNTPs, 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트 등을 포함할 수 있다. 이러한 루프-매개 등온증폭 시약은 통상의 방법을 통해 입수 가능하다. 프라이머는 샘플에 포함되는 분석 대상, 즉 표적 미생물의 유전자에 특이적으로 혼성화 된다. 프라이머는 자유 3'말단 하이드록시기를 포함하는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 이와 같은 프라이머는 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 표적 미생물의 타겟 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 프라이머는 표적 미생물의 존부를 판단할 수 있도록 표적 미생물의 특징적인 유전자에 혼성화되도록 제조될 수 있으며, 샘플 내에 목적하는 미생물이 존재하는 경우 루프-매개 등온증폭 반응에 의해 상기 특징적인 유전자의 염기서열이 증폭된다. 따라서 반응 후 앰플리콘(amplicon)을 검출함으로써 표적 미생물의 존부를 확인할 수 있다. 이러한 프라이머는 증폭하고자 하는 타겟 유전자의 종류에 따라 설계될 수 있으며, 본 발명에서는 각 표적 미생물의 타겟 유전자에 따라 알려진 방법에 의해 설계된 프라이머를 사용할 수 있다. 또한 각 반응 챔버(112)에 채워지는 제1 아가로스 혼합물(112)에서 LAMP 시약에 함유되는 프라이머들은 서로 다른 타겟 유전자에 특이적으로 혼성화되도록 설계될 수 있다. 이 경우 반응 챔버(112)의 수가 늘어날수록 마이크로디바이스(100)에서 한 번의 샘플 도입을 통해 검출할 수 있는 표적 미생물의 수가 증가할 수 있어 다중 검출이 가능해 진다.

보다 구체적으로, 제1 아가로스 혼합물(112)은 65℃에서 액상(liquid state)으로 존재하며 이 상태로 반응 챔버(112)에 채워질 수 있으며, 이후 상온에서 자연스럽게 고상(solid state)으로 변화할 수 있다(겔 형태를 가짐). 상온에서 제1 아가로스 혼합물(112)을 이루는 2-하이드록시에틸 아가로스는 LAMP 시약에 대하여 고상 저장체(solid state storage)로 기능할 수 있다. 2-하이드록시에틸 아가로스는 약 65℃의 녹는점을 가지며, 약 26℃~30℃ 범위에서 겔 포인트(gel point)를 갖는다. 고체 겔 상의 2-하이드록시에틸 아가로스는 다공성(porous) 구조를 가지므로 LAMP 시약을 내부에 봉입하기에 유리하다. 이후 승온되어 2-하이드록시에틸 아가로스의 녹는점(melting point)에 이르면, 2-하이드록시에틸 아가로스는 액상(liquid state)으로 변하므로 반응 및 검출에 적합한 상태가 될 수 있다. 나아가 2-하이드록시에틸 아가로스는 생체 적합성이 우수하므로 증폭 반응에서 대부분의 생체 분자를 방해하지 않는 장점이 있다. 본 발명에서는 이와 같이 2-하이드록시에틸 아가로스내부에 LAMP 시약을 봉입함으로써 LAMP 시약의 활성이 장기간에 걸쳐 유지될 수 있도록 하였으며(최대 45일간 장기 보관 가능함을 확인함), 별도의 장치를 요구하지 않는 간단한 방법으로 타겟 유전자를 검출할 수 있도록 하였다.

제2 아가로스 혼합물(122)은 대략 1% 농도의 2-하이드록시에틸 아가로스와 질산은(silver nitrate)이 혼합되어 형성될 수 있다. 질산은(AgNO₃)은 은(Ag)의 질산염으로, 은 이온은 이중 가닥의 DNA를 구성하는 성분 중에서 염기(base) 부분에 해당하는 푸린(purine) 및/또는 피리미딘(pyrimidine)과 복합체를 형성할 수 있다. 이어 UV 조사 하에서, 은 이온 및 복합체의 양이 감소되고 용액의 색이 갈색(brown)으로 변화하므로 육안 검출을 가능케 한다(이상 도 1b 및 도 1c 참고).

마이크로디바이스(100)는 제1 기재(110)의 상부를 덮는 제1 실링필름(113)과, 제2 기재(120)의 상부를 덮는 제2 실링필름(123)을 더 포함할 수 있다. 제1 실링필름(113) 및 제2 실링필름(123)은 모두 박막 필름형으로 형성될 수 있고, 각각 제1 기재(110), 제2 기재(120)의 상부에 탈부착 가능하도록 결합(접착/점착 등)될 수 있다. 제1,2 실링필름(113,123)은 지지필름(130)과 마찬가지로 PC(폴리카보네이트), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트) 또는 PP(폴리프로필렌) 소재를 필름형으로 가공함으로써 형성될 수 있다(이상 도 1d 참고). 한편, 마이크로디바이스(100)에서 제1 실링필름(113) 또는 제2 실링필름(123)은 소모품으로써 사용 후 폐기하고, 다른 실링필름으로 교체 가능하다. 이 경우 마이크로디바이스(100)의 재사용이 가능하다.

상술한 바와 같이 형성되는 마이크로디바이스(100)는 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)의 경계를 기준으로 내외측으로 폴딩 가능하게 형성되므로 반응 챔버(111)에 샘플 유체를 도입시켜 반응시키고, 다시 검출 챔버(121)로 이동시켜 검출을 수행할 수 있는 간단한 구조를 갖는다.

마이크로디바이스(100)는 루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 히터부(140)를 더 포함할 수 있다. 히터부(140)는 특정 종류로 제한되지 않는다. 예를 들어 히터부(140)는 구리 가열 블록, 박막 히터, 고무 히터, 적외선 히터, 할로겐 히터, 마이크로웨이브, 유도 가열 장치 등 다양한 장치를 사용할 수 있다.

도 2는 도 1의 마이크로디바이스에 적용되는 히터부(140)의 일 구체예를 도시한 개념도이다. 도 2를 참조하면, 일 구체예에 있어서 히터부(140)는 기재(141), 제1 전극부(142) 및 제2 전극부(143)를 포함한다.

기재(141)는 제1,2 전극부(142,143)를 하부에서 지지하는 역할을 하며, 예컨대 PET(폴리에틸렌테레프탈레이트) 필름을 사용할 수 있다. 기재(141)의 크기는 특정되지 않으며, 현장진단에 적합한 소형 크기를 가질 수 있다. 예를 들어 기재(141)는 도 2에 예시된 바와 같이 길이 3.5cm, 너비 5cm, 높이 0.1mm 가량의 크기를 갖도록 형성될 수 있다.

제1 전극부(142)는 기재(141) 상부 양측에 각각 마련되는 것으로 예를 들어 구리 테이프로 형성될 수 있다(폭은 약 1cm). 제2 전극부(143)는 양 단부가 기재(141) 상부 양측에 각각 마련된 제1 전극부(142)에 각각 접촉되어 제1 전극부(142)를 상호 연결하는 형태로 형성될 수 있으며(도 2 참고), 제1 전극부(142)에 의해 가열되어 마이크로디바이스(100)로 열을 제공하는 기능을 한다. 제2 전극부(143)는 탄소 페이스트(carbon paste)로 형성될 수 있다. 제2 전극부(143)의 크기는 특정되지 않으며, 예컨대 4cm 가량의 길이와 0.1mm 가량의 두께를 갖도록 형성될 수 있다.

이와 같이 형성되는 히터부(140)의 제조방법은 도 2에 도시된 바와 같다. 우선 기재(141) 상부 양측에 각각 구리 테이프를 부착시켜 제1 전극부(142)를 형성하고, 스파크 완화를 위해 제1 전극부(142) 상부를 은 페이스트(silver paste, 도 2에서 부호 142a로 표기)로 코팅할 수 있다. 이어 로(furnace)를 이용하여 제작된 히터 구조체를 150℃에서 30분 동안 베이킹 할 수 있다. 다음으로 상온에서 히터 구조체를 냉각시킨 후에, 두께 100㎛ 가량의 마스크(mask)를 사용하여 탄소 페이스트로 한 쌍의 제2 전극부(143)를 형성할 수 있다. 이후 상기 마스크를 제거하고 제작된 히터 구조체를 다시 150℃에서 30분 동안 베이킹 함으로써 제작을 완료할 수 있다. 히터부(140)의 구동은 제1 전극부(142)를 휴대용 파워뱅크(power bank, 예컨대 5V 용량)와 전기 클램프 등으로 연결시킴으로써 이루어질 수 있다.

이하, 마이크로디바이스(100)의 동작에 대하여 설명한다.

도 3은 도 1의 마이크로디바이스(100)의 동작을 나타내는 개념도이다. 도 3을 참조하면, 제작된 마이크로디바이스(100)를 준비하고, 타겟 샘플을 제1 기재(110)의 반응 챔버(111)에 도입한다. 타겟 샘플의 도입 전에 반응 챔버(111)는 제1 실링필름(113)으로 밀봉되어 있을 수 있으며, 제1 실링필름(113)을 벗겨낸 후에 타겟 샘플을 도입할 수 있다. 타겟 샘플의 도입 후에는 반응 챔버(111)의 증발을 방지하고 외부 오염으로부터 보호하기 위해 제1 실링필름(113)을 재부착하거나 실링필름을 새 것으로 교체하여 덮을 수 있다.

다음으로 마이크로디바이스(100)를 히터부(140) 상에 배치하고 가열하여 LAMP 반응을 수행할 수 있다. 일 구체예에 있어서 LAMP 반응은 65℃에서 30분 동안 수행될 수 있다. 이 때 반응챔버(111)에 채워진 제1 아가로스 혼합물(112)은 고상으로 존재하다가 히터부(140)로 가열되어 액상으로 변화하면서 내부에 봉입된 LAMP 시약이 흘러 나와 타겟 샘플과 반응할 수 있다. LAMP 반응 수행 후, 반응 챔버(111) 내에는 증폭이 완료된 LAMP 생성물이 잔존한다. 이후 제1 실링필름(113)을 다시 벗겨낸 후, 제2 기재(120)를 제1 기재(110) 쪽으로 폴딩시켜 검출 챔버(121)가 반응 챔버(111)에 완전히 침지되도록 한다. 다음으로 UV 광을 조사하면 검출 챔버(121)에 채워진 제2 아가로스 혼합물(122) 내부에 봉입된 은 이온이 흘러 나와 증폭된 DNA와 반응하고, 용액의 색 변화를 통해 타겟 DNA의 존재 여부를 확인할 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따른 폴더블 타입의 마이크로디바이스(100)는 폴더블 형태를 갖도록 하여 LAMP 반응 및 검출이 간편하고 용이하게 이루어질 수 있도록 하였다. 또한 반응 챔버(111)에 아가로스 혼합물을 채우되 상온에서 고상으로 존재하는 아가로스의 특성을 이용하여 아가로스 내부에 LAMP 시약을 봉입함으로써 비교적 장기간 동안 LAMP 시약의 활성을 유지시킬 수 있다. 따라서 전체 장치를 매우 간단하게 구성할 수 있고 신속한 검출이 가능한 바, 현장진단에 적합한 마이크로디바이스를 제공할 수 있다.

이하 본 발명의 시험예들에 대해 설명한다. 다만 본 발명이 하기 시험예들에 의해 제한되지 않음을 밝혀둔다.

LAMP 시약의 저장 능력 시험

도 4는 2-하이드록시에틸 아가로스에 저장된 LAMP 시약의 성능을 나타내는 이미지다. 구체적으로 앞서 설명한 바와 같이 2-하이드록시에틸 아가로스에 LAMP 시약을 봉입하고, 2일, 3일, 7일, 14일, 20일, 25일, 30일 및 45일 동안 보관한 후에 반응시켜 활성을 확인하였다. 관련하여 도 4a는 전기영동 시험 결과를 나타내며, 도 4b는 비색 검출 결과를 나타낸다. 도 4c는 저장 시간에 따른 색의 강도(color intensity)를 나타내는 그래프이다.

시험 결과, 도 4a에서 확인되듯이 2-하이드록시에틸 아가로스 내에 LAMP 시약을 봉입하고 45일 동안 장기 보관한 후에도 충분히 식별할 수 있는 정도의 LAMP 반응이 일어남을 알 수 있었다. 또한 도 4b 및 도 4c에서 확인되듯이 은 이온(질산은 사용)을 이용한 비색 검출 결과, 장기간 저장할수록 색의 강도는 낮아지는 경향을 보이긴 했으나, 45일 동안 장기 보관한 후에도 충분히 육안으로 식별할 수 있는 비색 검출 결과를 얻을 수 있었다.

민감도 시험

본 발명에 따른 마이크로디바이스의 검출 능력을 확인하기 위해 LAMP 앰플리콘과의 반응 전에 질산은을 2-하이드록시에틸 아가로스에 봉입하였다. 관련하여 도 5는 질산은을 사용하여 LAMP 앰플리콘의 비색 검출 결과를 나타내는 이미지다. 먼저 3개의 튜브를 마련하고 제1 튜브에는 오직 질산은만 도입하였고, 제2 튜브에는 2-하이드록시에틸 아가로스에 봉입된 질산은을 도입하고(LAMP 앰플리콘 없음), 제3 튜브에는 2-하이드록시에틸 아가로스에 봉입된 질산은과 LAMP 앰플리콘을 함께 도입하였다. 이후 UV 광을 조사하여 반응시킨 결과, 제1,2 튜브는 무색인 반면, 제3 튜브만이 갈색으로 변화함을 확인할 수 있었다(도 5a 참고). 도 5b를 참조하면, 제3 튜브의 갈색은 대략 420nm의 파장에서 흡수 피크(absorption peak)를 나타낸 반면, 제1,2 튜브에서는 변화가 발생하지 않았다. 이와 같은 시험 결과로부터 본 발명에 따른 마이크로디바이스에서 은 이온을 이용함으로써 LAMP 앰플리콘의 비색 검출이 민감하게 수행될 수 있음을 알 수 있다.

한편, 식품 매개 병원체(foodborne pathogen)의 검출을 위하여 대장균(Escherichia coli) O157:H7로부터 추출된 DNA의 10배 희석물을 사용하여 본 발명에 따른 마이크로디바이스의 분석 검출 한계를 시험하였다. 도 5c 및 도 5d를 참조하면, 각 반응 챔버에 mL당 0 내지 2.5×10⁵ 카피(copy)를 사용하여 정제된 DNA를 로딩하고, 65℃에서 30분 동안 증폭시켰다. 그리고 각 반응 챔버를 육안으로 관찰하고(도 5c), 전기영동 결과를 얻었다(도 5d). 그 결과 분석 검출 한계는 mL당 2.5×10² 카피 임을 확인하였다. 이와 같은 분석 검출 한계는 종래 보고된 종이 기반 마이크로 디바이스 또는 휴대용 통합 핵산 증폭 마이크로유체칩의 검출 한계와 유사한 수준이다.

특이성 시험

본 발명에 따른 마이크로디바이스의 특이성을 확인하기 위해 대장균(Escherichia coli) O157:H7 또는 살모넬라 종(Salmonella spp.)을 함유하는 샘플을 사용하였다. 관련하여 도 6은 특이성 시험 결과를 나타내는 개념도 및 이미지이다. 먼저 마이크로디바이스를 2세트 준비하고, 제1 세트의 반응 챔버에는 살모넬라 종(Salmonella spp.)을 함유하는 샘플을 도입하고, 제2 세트의 반응 챔버에는 대장균(Escherichia coli) O157:H7을 함유하는 샘플을 도입하였다. 사전에 제1 세트 및 제2 세트의 8개의 반응 챔버에서, 2개의 반응 챔버에는 프라이머를 로딩하지 않았으며(도 6에서 (-)로 표기), 3개의 반응 챔버에는 살모넬라 종(Salmonella spp.)의 프라이머 세트가 로딩되고(도 6에서 1로 표기), 나머지 3개의 반응 챔버에는 대장균(Escherichia coli) O157:H7의 프라이머 세트가 로딩되었다(도 6에서 2로 표기). 샘플의 도입 후에는 65℃에서 30분 동안 증폭시켰다. 그리고 검출 챔버를 반응 챔버에 침지시켜 색 변화를 육안으로 확인하고, 또한 전기영동 시험을 통해 확인하였다. 그 결과 도 6a 내지 도 6d에서 확인되듯이 도입된 샘플과 혼성화되는 프라이머가 로딩된 반응 챔버에서만 색 변화(갈색)가 일어났으며 증폭이 수행됨을 확인할 수 있었다. 이와 같은 시험 결과로부터 본 발명에 따른 마이크로디바이스가 높은 특이성을 보임을 알 수 있다.

다중 검출 시험

본 발명에 따른 마이크로디바이스의 다중 검출 능력을 확인하기 위해 병원체로 오염된 주스로부터 추출된 대장균(Escherichia coli) O157:H7 및 살모넬라 종(Salmonella spp.)을 함유하는 샘플을 사용하였다. 관련하여 도 7은 다중 검출 시험 결과를 나타내는 이미지이다. 우선 열적 세포 용해(thermal cell lysis)를 위해 두 박테리아를 갖는 주스 용액을 95℃에서 5분간 가열하였다. 다음으로 샘플 정제를 위하여 가열된 용액을 폴리도파민(polydopamine)으로 처리하였으며, 이렇게 처리된 샘플을 마이크로디바이스의 각 반응 챔버에 도입하였다. 이 때, 8개의 반응 챔버에서, 2개의 반응 챔버에는 프라이머를 로딩하지 않았으며(도 7에서 1',2'로 표기), 3개의 반응 챔버에는 살모넬라 종(Salmonella spp.)의 프라이머 세트가 로딩되고(도 7에서 1로 표기), 나머지 3개의 반응 챔버에는 대장균(Escherichia coli) O157:H7의 프라이머 세트가 로딩되었다(도 7에서 2로 표기). 샘플의 도입 후에는 65℃에서 30분 동안 증폭시켰다. 그리고 검출 챔버를 반응 챔버에 침지시켜 색 변화를 육안으로 확인하고, 또한 전기영동 시험을 통해 확인하였다. 그 결과 도 7a 및 7b에서 확인되듯이 도입된 샘플과 혼성화되는 프라이머가 로딩된 반응 챔버에서만 색 변화(갈색)가 일어났으며 증폭이 수행됨을 확인할 수 있었다. 이와 같은 시험 결과로부터 본 발명에 따른 마이크로디바이스가 다중 검출이 가능함을 알 수 있다.

이상, 본 발명의 구현예들에 대하여 설명하였다. 그러나 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 기술의 구체적 적용에 따른 단순한 설계변경, 일부 구성요소의 생략, 단순한 용도의 변경 등 본 발명을 다양하게 변형할 수 있을 것이며, 이러한 변형 역시 본 발명의 권리범위 내에 포함됨은 자명하다.

100: 마이크로 디바이스 110: 제1 기재
111: 반응 챔버 112: 제1 아가로스 혼합물
113: 제1 실링필름 120: 제2 기재
121: 검출 챔버 122: 제2 아가로스 혼합물
123: 제2 실링필름 130: 지지필름
140: 히터부

Claims

복수의 반응 챔버가 형성되고 상기 반응 챔버에는 2-하이드록시에틸 아가로스(2-hydroxyethyl agarose) 내에 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification) 시약이 봉입된 형태를 갖는 제1 아가로스 혼합물이 도입되는 제1 기재와,
복수의 검출 챔버가 형성되고 상기 검출 챔버에는 2-하이드록시에틸 아가로스 내에 질산은(silver nitrate)이 봉입된 형태를 갖는 제2 아가로스 혼합물이 도입되는 제2 기재와,
제1 기재와 제2 기재가 나란히 상부에 배치되어 제2 기재를 제1 기재쪽으로 폴딩시킬 수 있도록 형성되는 지지필름을 포함하고, 상기 검출 챔버는 제2 기재가 제1 기재쪽으로 폴딩되었을 때 반응 챔버와 상응하도록 위치되는 폴더블 타입의 마이크로디바이스.
청구항 1에 있어서,
상기 루프-매개 등온증폭(LAMP) 시약은 반응 챔버로 도입되는 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 함유하는 폴더블 타입의 마이크로디바이스.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 제1 기재 및 제2 기재는 폴리카보네이트(Polycarbonate)로 형성되는 폴더블 타입의 마이크로디바이스.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
제1 기재의 상부를 덮어 반응 챔버를 밀봉하는 제1 실링필름과,
제2 기재의 상부를 덮어 검출 챔버를 밀봉하는 제2 실링필름을 더 포함하는 폴더블 타입의 마이크로디바이스.
청구항 4에 있어서,
상기 제1 실링필름 또는 제2 실링필름은 교체 가능한 폴더블 타입의 마이크로디바이스.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 히터부를 더 포함하는 폴더블 타입의 마이크로디바이스.
청구항 6에 있어서,
상기 히터부는 구리 가열 블록, 박막 히터, 고무 히터, 적외선 히터, 할로겐 히터, 마이크로웨이브 또는 유도 가열 장치인 폴더블 타입의 마이크로디바이스.
청구항 6에 있어서,
상기 히터부는,
기재와, 기재 상부 양측에 각각 마련되는 제1 전극부와, 양 단부가 제1 전극부에 각각 접촉되어 제1 전극부를 상호 연결하는 형태로 형성되는 제2 전극부를 포함하고,
제1 전극부는 구리 테이프로 형성되고, 제2 전극부는 탄소 페이스트(carbon paste)로 형성되는 폴더블 타입의 마이크로디바이스.
청구항 8에 있어서,
상기 제2 전극부와 접촉하는 제1 전극부의 상부는 은 페이스트(silver paste)로 코팅되는 폴더블 타입의 마이크로디바이스.