KR102221289B1 - 폴더블 타입의 등온 증폭 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법 - Google Patents

폴더블 타입의 등온 증폭 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴더블 타입의 동은 증폭 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법이 제공한다. 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스는 샘플 영역, 반응 영역 및 검출 영역으로 구획되고 샘플 영역과 검출 영역이 반응 영역 쪽으로 폴딩 가능한 메인 기재; 샘플 영역 상에 배치되고 복수의 샘플 챔버가 형성되며 분석 대상을 포함하는 샘플이 샘플 챔버로 도입되는 제1 필름; 반응 영역 상에 배치되고 메인 기재의 샘플 영역을 반응 영역으로 폴딩하였을 때 샘플 챔버와 상응하는 위치에 복수의 반응 챔버가 형성되며, 샘플이 반응 챔버로 이동한 후 반응 챔버에서 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 제2 필름; 및 검출 영역 상에 배치되고 메인 기재의 검출 영역을 반응 영역으로 폴딩하였을 때 반응 챔버와 상응하는 위치에 복수의 검출부가 형성되고, 검출부는 샘플 내의 타겟 유전자의 존재 유무를 검출하되 각 검출부는 푹신(fuchsin)으로 염색되는 제3 필름을 포함한다.

Description

폴더블 타입의 등온 증폭 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법{FOLDABLE TYPED ISOTHERMAL AMPLIFICATION MICRODEVICE FOR DETECTION OF PATHOGENS AND METHOD THE SAME}
본 발명은 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 등온 증폭 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법에 관한 것이다.
식품 매개 질환은 식중독을 비롯하여 식품매개전염병과 같이 음식물 섭취와 직접적으로 관련되어 발생하는 모든 질환을 의미한다. 이러한 식품 매개 질환의 확산을 통제하고 안전한 식품 공급원의 보장을 위해서는 식품 매개 병원균의 존재를 검출하는 것이 매우 중요하다. 현재 식품 매개 병원균(foodborne pathogens)을 검출하기 위한 방법은 크게 생화학적 방법과 분자 기반 방법(molecular-based method)이 있다. 이 중 분자 기반 방법은 일반적으로 매우 민감하고 특이적인 핵산 증폭과 같이 기존의 분자 기술을 통해 해로운 미생물을 검출하는데 널리 사용되고 있다.
핵산 기반의 검출 방법은 표적이 되는 병원체의 게놈(genome) 내의 특이적 DNA 또는 RNA 시퀀스를 증폭시키는 기술을 이용한다. 증폭 기술은 대표적으로 PCR(polymerase chain reaction), 실시간 또는 정량적 PCR 방법이 이용되고 있다. 그런데 이러한 PCR 방법들은 복합적인 온도 제어가 요구될 뿐더러, 비용이 많이 드는 단점이 있다. 이런 가운데 PCR 방법의 한계를 극복하기 위한 대안적인 기술들이 개발되고 있으며 그 중 하나로는 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification: 루프-매개 등온 증폭법)가 있다. LAMP를 이용한 핵산 증폭은 프라이머 2~3쌍이 요구되므로 매우 특이적이고 높은 증폭 효율을 보일 뿐더러 DNA 폴리머라제만을 이용하여 지수 증폭을 달성할 수 있어, 칩 형태의 마이크로 디바이스에 적용되기에 매우 적합한 장점이 있다. LAMP 기술의 장점을 감안하여 식품 매개 병원균의 핵산 검출을 위한 등온 증폭 방법을 통합시킨 마이크로 디바이스들이 연구개발되고 있다.
한편 LAMP 반응의 검출을 위한 직접 검출 방식의 기술로는 EtBr(ethidium bromide) 및 SYBR Green Ⅰ와 같은 형광제를 이용한 젤 전기영동법 및 형광 탐지 방법이 있다. 하지만 젤 전기 영동법은 복잡한 장치들이 요구될뿐더러 시간이 많이 소요된다. 게다가 EtBr 및 SYBR Green Ⅰ은 모두 유전자독성을 가지고 돌연변이 유발물질로 알려져 있어 인체친화적이지 못한 단점이 있다.
한국공개특허 제10-2017-0078456호 (2017.7.7 공개)
본 발명은 LAMP 반응에서 DNA 증폭물을 검출하기 위하여 푹신(fuchsin) 염료를 이용함으로써 매우 간단한 방식으로 신속히 병원균의 존재 여부를 스크리닝 할 수 있는 등온 증폭 마이크로 디바이스와 이를 이용한 병원균 검출방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 샘플 영역, 반응 영역 및 검출 영역으로 구획되고 샘플 영역과 검출 영역이 반응 영역 쪽으로 폴딩 가능한 메인 기재; 샘플 영역 상에 배치되고 복수의 샘플 챔버가 형성되며 분석 대상을 포함하는 샘플이 샘플 챔버로 도입되는 제1 필름; 반응 영역 상에 배치되고 메인 기재의 샘플 영역을 반응 영역으로 폴딩하였을 때 샘플 챔버와 상응하는 위치에 복수의 반응 챔버가 형성되며, 샘플이 반응 챔버로 이동한 후 반응 챔버에서 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 제2 필름; 및 검출 영역 상에 배치되고 메인 기재의 검출 영역을 반응 영역으로 폴딩하였을 때 반응 챔버와 상응하는 위치에 복수의 검출부가 형성되고, 검출부는 샘플 내의 타겟 유전자의 존재 유무를 검출하되 각 검출부는 푹신(fuchsin)으로 염색되는 제3 필름을 포함하는 마이크로 디바이스가 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 마이크로 디바이스를 이용한 병원균 검출 방법으로서, a) 샘플 챔버에 샘플을 도입하는 단계; b) 샘플 영역을 반응 영역으로 폴딩시켜 샘플을 반응 챔버로 이동시키는 단계; c) 반응 챔버에서 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계; d) 샘플을 산 가수분해시키고 반응 챔버에 아황산나트륨을 첨가하는 단계; 및 e) 검출 영역을 반응 영역으로 폴딩시켜 검출부를 반응 챔버에 침지시키는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 샘플에 대해 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계; 샘플을 산 가수분해시키고 아황산나트륨을 첨가하는 단계; 및 푹신(fuchsin)을 추가적으로 첨가하고 (ⅰ) 샘플 내 타겟 유전자가 존재하는 경우 상기 푹신이 자색으로 발색되고, (ⅱ) 샘플 내 타겟 유전자가 존재하지 않는 경우 상기 푹신이 무색으로 탈색되는 현상을 통해 타겟 유전자의 존재유무를 판독하는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 구체예들에 따른 마이크로 디바이스는 푹신을 이용하여 타겟 유전자의 유무를 신속하게 판독할 수 있으므로 매우 간단한 방식으로 병원균의 존재 여부를 스크리닝 할 수 있다.
또한 샘플 영역과 검출 영역이 반응 영역 쪽으로 폴딩되는 구조를 취하고 있어 시료 이송을 위한 밸브, 펌프 등의 복잡한 추가 구성이 요구되지 않고, LAMP를 기반으로 하는 방식이어서 복잡한 가열 장치도 요구되지 않아 전체 마이크로 디바이스를 간략하게 구성할 수 있는 바, 현장진단에 적극 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스를 개략적으로 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 마이크로 디바이스에서 푹신 기반의 DNA 검출 매커니즘을 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스의 사용을 개념적으로 도시한 도면이다.
도 4는 푹신 기반의 DNA 검출 시험 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스에서의 온-칩 단일 병원균 검출 시험의 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스에서의 온-칩 다중 병원균 검출 시험의 결과를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 하기의 설명은 본 발명을 구체적인 예시를 들어 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 기술적 사상이 하기의 설명에 한정되는 것은 아니다. 그리고 첨부된 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 기술적 사상은 첨부된 도면에 한정되지 않는다. 또한 도면에서 각 부재의 두께나 크기 등은 설명의 편의 등을 위해 과장, 생략, 개략적으로 도시될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 위치관계나 방향은 특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에 첨부된 도면을 기준으로 한다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 공간에 대한 설명이나 위치관계에 대한 설명은 본 발명을 이루는 구성요소들 간의 상대적인 위치를 의미한다. 또한 특별히 언급하지 않는 한, 하나의 구성요소와 다른 구성요소 사이의 공간에는 또 다른 구성요소가 존재할 수 있다. 예를 들어 본 명세서에서 하나의 구성요소의 "상부에" 또는 "위에" 다른 구성요소가 위치함을 언급하는 경우, 하나의 구성요소의 바로 위에 다른 구성요소가 위치하는 경우뿐만 아니라, 하나의 구성요소와 다른 구성요소들 사이에 또 다른 구성요소가 위치하는 경우까지를 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스(100)를 개략적으로 도시한다. 도 1을 참조하면, 마이크로 디바이스(100)는 메인 기재(110), 제1 필름(120), 제2 필름(130) 및 제3 필름(140)을 포함한다. 제1 필름(120), 제2 필름(130) 및 제3 필름(140)은 메인 기재(110) 상에 배치된다.
메인 기재(110)는 마이크로 디바이스(100)의 하부 층으로 사용된다. 메인 기재(110)는 밀봉된 필름 형태를 가질 수 있으며, 벤딩(bending) 가능한 소재로 형성될 수 있다. 예컨대 메인 기재(110)는 벤딩 가능한 플라스틱 기재로 형성될 수 있다. 일 구체예에 있어서 메인 기재(110)의 상부면은 접착면을 가질 수 있다. 이에 따라 메인 기재(110)의 상부면에 제1 필름(120), 제2 필름(130) 및 제3 필름(140)이 부착될 수 있다. 물론 다른 방법을 사용하여 제1 필름(120), 제2 필름(130) 및 제3 필름(140)을 메인 기재(110) 상에 결합시키는 것도 가능하다. 메인 기재(110)의 크기는 특정되지 않는다. 예를 들어 메인 기재(110)는 40mm 가량의 길이와 90mm 가량의 폭을 갖는 필름형으로 형성될 수 있다.
메인 기재(110)는 샘플 영역(111; sample zone), 반응 영역(112; reaction zone) 및 검출 영역(113; detection zone)으로 구획될 수 있다. 예를 들어 메인 기재(110)는 중앙부 영역을 반응 영역(112)으로 하고, 반응 영역(112)의 일측 영역을 샘플 영역(111)으로 하고, 반응 영역(112)의 타측 영역을 검출 영역(113)으로 할 수 있다. 이 때, 메인 기재(110)는 샘플 영역(111)과 검출 영역(113)이 반응 영역(112) 쪽으로 폴딩 가능하도록 형성된다. 예컨대 샘플 영역(111), 반응 영역(112), 검출 영역(113)은 하나의 메인 기재(110)에 존재하되, 샘플 영역(111)과 반응 영역(112)의 경계에는 접이선(미표기)이 구비되고, 반응 영역(112)과 검출 영역(113)의 경계에도 접이선(미표기)이 구비될 수 있다. 경우에 따라 접이선은 생략될 수 있으며, 메인 기재(110)는 벤딩 가능한 소재로 형성되므로 접이선이 없는 경우에도 샘플 영역(111) 및 검출 영역(113)은 반응 영역(112) 쪽으로 폴딩 될 수 있다. 이와 같이 샘플 영역(111)과 검출 영역(113)이 반응 영역(112)으로 접힘 가능하다는 점에서 본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)는 폴더블 타입의 마이크로 디바이스로 칭해질 수 있다.
제1 필름(120)은 샘플 영역(111) 상에 배치된다. 예를 들어 제1 필름(120)은 샘플 영역(111)의 전체를 커버하는 형태로 형성되어 샘플 영역(111) 상에 결합(접착, 점착 등)될 수 있다. 예컨대 메인 기재(110)가 40mm 가량의 길이와 90mm 가량의 폭을 갖도록 형성되었을 때, 제1 필름(120)은 메인 기재(110)와 동일한 40mm 가량의 길이를 갖되 메인 기재(110) 폭의 1/3에 해당하는 30mm 가량의 폭을 갖도록 형성될 수 있다. 제1 필름(120)은 열가소성 플라스틱 소재로 형성될 수 있다. 예를 들어 제1 필름(120)은 PC(폴리카보네이트), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트) 또는 PP(폴리프로필렌) 소재를 필름형으로 가공함으로써 형성될 수 있다. 제1 필름(120)의 두께는 대략 400㎛ ~ 600㎛ 일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.
제1 필름(120)에는 복수의 샘플 챔버(121)가 형성된다. 샘플 챔버(121)의 형태 및 개수는 한정되지 않는다. 도 1에서는 원형의 샘플 챔버(121)가 9개 형성된 경우를 도시하고 있으나, 샘플 챔버(121)는 이와 다른 형태로 형성될 수 있고 개수도 이보다 많거나 적을 수 있다. 예를 들어 샘플 챔버(121)는 직경 5mm 가량의 원형으로 형성될 수 있으며, 샘플 챔버(121)의 높이는 제1 필름(120)의 두께에 상응한다. 이와 같은 샘플 챔버(121)의 부피를 기준으로 볼 때 샘플 챔버(121)는 대략 10㎕의 유체를 수용할 수 있는 크기를 가질 수 있다. 샘플 챔버(121)들은 제1 필름(120) 상에 행과 열을 맞추어 배열될 수 있다. 일 구체예에 있어서 샘플 챔버(121)는 제1 필름(120)에 복수의 관통 부분을 형성함으로써 생성될 수 있다. 이 경우 제1 필름(120)이 메인 기재(110)에 결합되었을 때 샘플 챔버(121)는 메인 기재(110)에 의해 밀봉되고, 샘플 챔버(121)에 분석 대상을 포함하는 샘플이 도입될 수 있다.
샘플 챔버(121)에 도입되는 샘플은 분석 대상을 포함한다. 여기에서 분석 대상은 표적 미생물일 수 있다. 표적 미생물의 예로는 바이러스, 세균, 원생동물, 효모, 곰팡이, 버섯, 조류, 리케차, 동식물의 분화되지 않은 세포, 조직 배양물 등을 포함한다. 보다 구체적으로 표적 미생물은 식중독을 유발할 수 있는 다양한 종류의 식품매개 병원균(foodborne pathogens)을 포함할 수 있다. 식품매개 병원균의 대표적인 예로는 대장균(E.coli: Escherichia coli), 살모넬라 종(Salmonella spp.) 등이 있다. 샘플은 분석 대상을 포함하는 유체(fluid)일 수 있다. 샘플의 예로는 혈액, 전혈과 같은 바이오 샘플, 또는 우유, 주스와 같은 음료 액적 등이 있다.
각 샘플 챔버(121)에는 샘플 챔버(121)로 도입되는 샘플로부터 타겟 유전자만을 통과시켜 정제시키는 제1 여과지(122)가 배치될 수 있다. 이를 위해 제1 여과지(122)는 샘플 챔버(121)에 삽입될 수 있는 크기와 형태를 가질 수 있다. 제1 여과지(122)는 샘플 챔버(131)에 빈틈 없이 삽입되는 것이 보다 바람직하다. 일 구체예에 있어서 제1 여과지(122)는 재생 샐룰로오즈 페이퍼(셀룰로오즈 멤브레인 필터)일 수 있다. 이 때 제1 여과지(122)의 포어사이즈(pore size)는 0.1㎛ ~ 0.3㎛, 보다 구체적으로는 0.2㎛ 일 수 있다. 제1 여과지(122)는 폴리도파민(polydopamine)이 코팅된 여과지일 수 있다. 도파민(Dopamine)은 폴리도파민의 단량체 형태로서, 신경전달물질로 잘 알려져 있다. 도파민은 바다 속 홍합류에서 발견되는 3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌(3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine : L-DOPA) 분자의 모방 분자이다. 특히 도파민의 산화제-유도 자체 고분자화(Oxidant-induced self-polymerization)와 전기화학적 고분자화 반응(Electrochemical polymerization)들에 의해 생성된 폴리도파민은 카테콜(Catechol), 아민(Amine) 및 이민(Imine) 작용기를 가지고 있어 생체물질, 합성 고분자 등의 유기질뿐만 아니라 고체 표면들에서도 강한 결합을 형성하므로 표면 개질(Surface reforming), 표면 변환(Surface modification), 자기조립 다층박막(Self-assembled multilayer), 나노복합체 박막(Nanocomposite thin film)의 형성 등이 가능하다. 도파민의 카테콜 작용기는 산소의 존재하에서 쉽게 산화되며 자체-고분자화(Self-polymerization)에 의해 폴리도파민을 형성할 수 있다.
폴리도파민이 코팅된 제1 여과지(122)는 표면 개질이 되므로, 샘플 챔버(121)로 도입된 샘플 내에 포함된 DNA를 통과시키고 나머지 부산물들(세포파쇄 부산물 등)은 쉬프 염기 반응(Schiff base reaction) 및 킬레이션 반응(chelation reaction)을 통해 반응하여 포집할 수 있다. 즉 폴리도파민이 코팅된 제1 여과지(122)에 의해 샘플 내의 단백질, 칼슘, 기타 박테리아 세포막 등이 폴리도파민에 의해 포집되고, 이에 따라 DNA 만이 제1 여과지(122)를 통과하게 되므로 DNA 정제가 수행될 수 있다. 만약 마이크로 디바이스(100)로 도입되는 샘플이 DNA 정제가 수행된 샘플일 경우에, 제1 여과지(122)는 생략될 수도 있다. 제1 여과지(122)는 도파민 용액 또는 도파민 유도체가 용해된 혼합액에 담궈져(예컨대 24시간) 상기 용액 또는 혼합액으로 여과지의 표면을 적신 후에 상온에서 건조 처리하는 방식으로 형성될 수 있다.
제2 필름(130)은 반응 영역(112) 상에 배치된다. 예를 들어 제2 필름(130)은 반응 영역(112)의 전체를 커버하는 형태로 형성되어 반응 영역(112) 상에 결합(접착, 점착 등) 될 수 있다. 제1 필름(120)과 마찬가지로 메인 기재(110)가 메인 기재(110)가 40mm 가량의 길이와 90mm 가량의 폭을 갖도록 형성되었을 때, 제2 필름(130)은 메인 기재(110)와 동일한 40mm 가량의 길이를 갖되 메인 기재(110) 폭의 1/3에 해당하는 30mm 가량의 폭을 갖도록 형성될 수 있다. 제2 필름(130)은 열가소성 플라스틱 소재로 형성될 수 있다. 예를 들어 제2 필름(130)은 PC(폴리카보네이트), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트) 또는 PP(폴리프로필렌) 소재를 필름형으로 가공함으로써 형성될 수 있다. 제2 필름(130)의 두께는 대략 400㎛ ~ 600㎛ 일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.
제2 필름(130)에는 복수의 반응 챔버(131)가 형성된다. 이 때, 반응 챔버(131)는 샘플 영역(111)과 반응 영역(112) 사이의 가상의 경계선을 기준으로 샘플 영역(111)에 형성된 샘플 챔버(121)과 대칭되도록 형성될 수 있다. 예를 들어 도 1에서와 같이 샘플 챔버(121)와 반응 챔버(131)는 원형으로 형성되고 3ⅹ3 형태로 배치될 수 있다. 반응 챔버(131)는 직경 5mm 가량의 원형으로 형성될 수 있으며, 반응 챔버(131)의 높이는 제2 필름(130)의 두께에 상응한다. 샘플 챔버(121)와 마찬가지로 반응 챔버(131)는 제2 필름(130)에 복수의 관통 부분을 형성함으로써 생성될 수 있다. 이 경우 제2 필름(130)이 메인 기재(120)에 결합되었을 때 반응 챔버(131)는 메인 기재(120)에 의해 밀봉될 수 있다.
샘플 챔버(121)에 도입된 샘플은 메인 기재(110)의 폴딩에 의해 반응 챔버(121)로 이동될 수 있다. 예를 들어 도 1b에서와 같이 샘플 챔버(121)에 샘플을 도입한 후, 메인 기재(110)의 샘플 영역(111)을 반응 영역(112) 쪽으로 폴딩시킨다. 샘플 영역(111)이 폴딩되었을 때 샘플 챔버(121)와 반응 챔버(131)는 상호 마주하므로 샘플 챔버(121)에 도입된 샘플이 반응 챔버(131)로 전달될 수 있다. 이와 같이 메인 기재(110)의 폴딩을 통해 샘플이 반응 챔버(121)로 이동될 수 있으므로, 종전 마이크로 디바이스에서 샘플(시료) 이송을 위해 요구되는 밸브 구성, 펌프 구성 등이 필요하지 않으므로 보다 간단하고 현장진단에 적합한 마이크로 디바이스를 제공할 수 있는 이점이 있다. 반응 챔버(131)에서는 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification) 방법에 의해 타겟 유전자가 증폭된다. 루프-매개 등온증폭 방법은 일정한 온도에서 접합 및 신장이 이루어지는 핵산 증폭법의 일 종류다. 루프-매개 등온증폭 방법의 개념 및 원리 등은 당업계에 알려져 있으므로 구체적인 설명은 생략한다.
각 반응 챔버(131)에는 루프-매개 등온증폭 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 함유하는 제2 여과지(132)가 배치될 수 있다. 이를 위해 제2 여과지(132)는 반응 챔버(131)에 삽입될 수 있는 크기와 형태를 가질 수 있다. 제2 여과지(132)는 반응 챔버(131)에 빈틈 없이 삽입되는 것이 보다 바람직하다. 일 구체예에 있어서 제2 여과지(132)는 재생 샐룰로오즈 페이퍼(셀룰로오즈 멤브레인 필터)일 수 있다. 이 때 제2 여과지(132)의 포어사이즈(pore size)는 0.1㎛ ~ 0.3㎛, 보다 구체적으로는 0.2㎛ 일 수 있다. 제2 여과지(132)는 루프-매개 등온증폭 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 포함하는 용액에 담궈져 상기 용액을 흡수한 후에 상온에서 건조 처리하는 방식으로 형성될 수 있다. 이 때, 루프-매개 등온증폭 시약은 Bst DNA 폴리머라제(중합효소), 등온 증폭 버퍼(10x), dNTPs, 100 mM MgSO4 등을 포함할 수 있다. 이러한 루프-매개 등온증폭 시약은 통상의 방법을 통해 입수 가능하다. 프라이머는 샘플에 포함되는 분석 대상, 즉 표적 미생물의 유전자에 특이적으로 혼성화 된다. 프라이머는 자유 3' 말단 하이드록시기를 포함하는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 이와 같은 프라이머는 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 표적 미생물의 타겟 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 프라이머는 표적 미생물의 존부를 판단할 수 있도록 표적 미생물의 특징적인 유전자에 혼성화되도록 제조될 수 있으며, 샘플 내에 목적하는 미생물이 존재하는 경우 루프-매개 등온증폭 반응에 의해 상기 특징적인 유전자의 염기서열이 증폭된다. 따라서 반응 후 앰플리콘(amplicon)을 검출함으로써 표적 미생물의 존부를 확인할 수 있다. 이러한 프라이머는 증폭하고자 하는 타겟 유전자의 종류에 따라 설계될 수 있으며, 본 발명엥서는 각 표적 미생물의 타겟 유전자에 따라 알려진 방법에 의해 설계된 프라이머를 사용할 수 있다. 나아가 제2 여과지(132)는 각 반응 챔버(131)마다 배치되며, 이 때 각 제2 여과지(132)에 함유되는 프라이머들은 서로 다른 타겟 유전자에 특이적으로 혼성화되도록 설계될 수 있다. 이 경우 반응 챔버(131) 및 제2 여과지(132)의 수가 늘어날수록 마이크로 디바이스(100)에서 한 번의 샘플 도입을 통해 검출할 수 있는 표적 미생물의 수가 늘어날 수 있다. 즉 마이크로 디바이스(100)에서 다중 검출이 가능하다.
제3 필름(140)은 검출 영역(113) 상에 배치된다. 제3 필름(140)은 검출 영역(113) 상에 결합(접착, 점착 등) 될 수 있다. 일 구체예에 있어서 제3 필름(140)은 제1 필름(120) 및 제2 필름(130)과는 달리 띠(strip) 형태로 형성되어 검출 영역(113) 상에 결합(접착, 점착 등)될 수 있다. 예컨대 메인 기재(110)가 40mm 가량의 길이와 90mm 가량의 폭을 갖도록 형성되었을 때, 제3 필름(140)은 메인 기재(110)와 동일한 40mm 가량의 길이를 갖되 5mm 가량의 폭을 갖도록 형성될 수 있다. 제3 필름(140)은 종이 소재로 형성될 수 있다.
제3 필름(140)에는 복수의 검출부(141)가 형성된다. 이 때, 검출부(141)는 반응 영역(112)과 검출 영역(113) 사이의 가상의 경계선을 기준으로 반응 영역(112)에 형성된 반응 챔버(131)와 대칭되도록 형성될 수 있다. 검출부(141)는 푹신(fuchsin)으로 염색된 라인 형태를 가질 수 있다. 예를 들어 제3 필름(140)에서 반응 챔버(131)와 상응하는 부위에 푹신으로 염색되고 폭 방향으로 형성되는 라인 형태로 검출부(141)가 마련될 수 있다. 이는 검출부(141)에 마이크로 피펫 등을 이용하여 푹신을 염색하는 방식으로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)는 루프-매개 등온증폭 반응에 있어 타겟 앰플리콘(타겟 유전자)의 존재 유무를 판독하기 위해 푹신(fuchsin) 염료를 사용하는 것을 일 특징으로 한다. 푹신은 트리페닐메탄 염료(triphenylmethane dye)로 화학식은 C20H19N3ㆍHCl이다. 푹신은 "Magenta Ⅱ"로 불리기도 하는데, 이는 푹신이 마젠타 색(Magenta color)을 띠기 때문이다. 푹신 염료는 DNA 염색에도 이용이 되고 있는데, 유전자 증폭시 DNA를 가수분해 하여 생기는 알데히드 기와 푹신 염료가 포일겐 반응(Feulgen reaction)을 일으켜 DNA만을 마젠타 색으로 염색할 수 있기 때문이다. 그런데 이러한 푹신 염료는 샘플(시료) 내에 DNA가 존재하지 않는 경우, 첨가되는 아황산 나트륨(Na2SO3; Sodium Sulfite)와 반응하여 탈색되는 특성이 있다. 본 발명의 발명자들은 이와 같은 특성에 착안하여 푹신 염료를 이용하여 샘플(시료) 내에 DNA가 존재하는지 여부를 빠르게 스크리닝 할 수 있는 마이크로 디바이스를 개발하게 된 것이다. 나아가 푹신 염료는 상대적으로 비용이 저렴하고 수득이 용이하므로 비용 효율적인 마이크로 디바이스를 제조하는 데에도 기여할 수 있다. 또한 별도의 판독 장치(광검출기 등)를 적용하지 않아도 육안으로 변색을 관찰함으로써 검출 결과를 확인할 수 있으므로 본 발명에 따른 마이크로 디바이스가 현장진단에 유용하게 적용될 수 있게 한다.
도 2는 본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)에서 푹신 기반의 DNA 검출 매커니즘을 설명하기 위해 제공된다.
도 2를 참조하면, 앰플리콘이 존재하지 않는 LAMP 용액에서 아황산나트륨 및 푹신을 첨가하면 아무런 색이 나타나지 않는다. 이는 우선 아황산나트륨 분자가 푹신 분자의 중앙 C 원자를 공격하여 푹신 류코설폰산(fuchsin leucosulfonic acid, 류코푹신 leucofuchsin 이라고도 함)을 형성하고, 이어서 SO2기(SO2 group)가 류코설폰산의 방향족 아민 중 하나에 결합하고 이어서 다른 SO2기와 결합하여 이중 설포네이트 생성물(N-sulfinic acid)을 형성하기 때문인 것으로 추측된다. 이러한 반응은 푹신의 발색 구조(chromophoric structure)를 잃게 하여 푹신 고유의 색인 마젠타 색을 탈색시킨다(무색).
반면 산 가수분해(acid-hydrolyzed) 된 DNA 앰플리콘이 존재하는 LAMP 용액에서 최종 생성물은 자색(purple color)을 띤다. 이는 산 가수분해 된 DNA의 알데히드 기가 설포네이트 기(sulfonate group)에 결합하고, 이로 인해 중앙 C 원자에 결합하고 있던 HSO3 - 가 탈착하기 때문이다. 그래서 중앙 C 이중 결합이 다시 형성되고 푹신의 발색 구조가 재형성된다.
정리하자면 푹신 고유의 색은 마젠타 색이고, 샘플(시료)에 단일 또는 다중 타겟이 존재하는 경우 푹신 및 아황산나트륨을 첨가하면 자색을 띨 수 있다. 그러나 샘플(시료)에 타겟이 존재하지 않는 경우 푹신 및 아황산나트륨을 첨가하면 탈색되어 무색으로 변한다. 따라서 푹신의 이와 같은 특성을 병원균 검출을 위한 마이크로 디바이스에 적용할 경우 매우 간단한 방식으로 병원균의 존재 여부를 스크리닝 할 수 있게 된다.
마이크로 디바이스(100)는 루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 가열부(미도시)를 더 포함할 수 있다. 가열부는 특정 종류로 제한되지 않는다. 예를 들어 가열부는 구리 가열 블록, 박막 히터, 고무 히터, 적외선 히터, 할로겐 히터, 마이크로웨이브, 유도 가열 장치 등 다양한 장치를 사용할 수 있다.
이하에서는 마이크로 디바이스(100)의 사용 방법에 대해 설명한다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스(100)의 사용을 개념적으로 도시한 도면이다. 도 3을 참조하면, 우선 샘플(시료)이 샘플 영역(111)에 배치된 샘플 챔버(121)로 도입된다. 샘플 도입 후에 샘플 챔버(121)는 탈부착 가능한 밀봉 필름으로 밀봉될 수 있다. 샘플의 증발 및 오염을 방지하기 위함이다. 샘플 도입 후에는 일정 시간(예컨대 30분)동안 상온에서 배양될 수 있다. 다음으로 샘플 챔버(121)를 밀봉하는 밀봉 필름을 벗겨낸 후에 샘플 영역(111)을 반응 영역(112) 쪽으로 폴딩시켜 샘플을 반응 영역(112)으로 이동시킨다. 샘플 챔버(121)와 반응 챔버(131)는 동일한 형태로 형성되고 치수(dimension)도 동일하므로 샘플 챔버(121)를 폴딩시키면 샘플 챔버(121)와 반응 챔버(131)가 직접 접촉하게 된다. 반응 챔버(131)에는 LAMP 시약 및 타겟 유전자를 증폭시키는 프라이머가 기 저장되어 있다. 다음으로 반응 챔버(131)는 탈부착 가능한 밀봉 필름으로 밀봉될 수 있다. 이후 메인 기재(110)를 가열부(예컨대 핫 플레이트) 상에 배치하고 반응 영역(112)을 가열하여 LAMP 반응을 수행할 수 있다. 일 구체예에 있어서 LAMP 반응은 65℃에서 30분간 수행될 수 있다. LAMP 반응이 종료된 후에는 반응 챔버(131)를 밀봉하는 밀봉 필름을 벗겨낸 후에 적정량의 HCl을 첨가하고 가열하여 샘플을 산 가수분해 시킨 후에(예를 들어 산 가수분해는 65℃에서 5분간 수행될 수 있음), 아황산나트륨을 첨가할 수 있다. 마지막으로 검출 영역(113)을 반응 영역(112) 쪽으로 폴딩시켜 검출부(141)를 반응 챔버(131)에 침지시키고 검출부(141)의 변색을 확인함으로써 타겟 유전자의 존재 유무를 확인할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 도 3에 도시된 바와 같이 샘플(시료)이 살모넬라 균(Salmonella spp.)과 대장균(E.coli O157:H7)을 포함하는 우유 샘플인 경우를 가정한다. 이 때 마이크로 디바이스(100)의 반응 챔버(131) 중 1열에는 LAMP 시약 및 살모넬라 균을 증폭시키는 프라이머 세트가 도입되고, 2열에는 LAMP 시약 및 황색포도상구균(S.aureus)을 증폭시키는 프라이머 세트가 도입되고, 3열에는 LAMP 시약 및 대장균(E.coli O157:H7)을 증폭시키는 프라이머 세트가 도입되었다고 가정한다. 샘플이 샘플 챔버(121)에 도입되고 배양된 후에 샘플 영역(111)을 반응 영역(112) 쪽으로 폴딩시키면 샘플에 포함된 유전자들이 반응 챔버(131)로 이동된다. 이 때 샘플 챔버(121)에 배치되는 제1 여과지(122)는 샘플로부터 DNA만을 통과시켜 반응 챔버(131)로 이동시킬 수 있다(이상 도 3a). 다음으로 LAMP 반응을 수행하면 샘플 내의 DNA를 타겟으로 하는 프라이머 세트가 도입되어 있는 1열 및 3열의 반응 챔버(131)에서는 LAMP 반응이 일어날 것이고, 그렇지 않은 2열의 반응 챔버(131)에서는 LAMP 반응이 일어나지 않을 것이다. LAMP 반응 후에 샘플을 산 가수분해 시킨 후 아황산나트륨을 첨가하고, 검출 영역(113)을 반응 영역(112) 쪽으로 폴딩시켜 검출부(141)를 반응 챔버(131)에 침지시키면 타겟 앰플리콘이 존재하는 1열 및 3열의 검출부(141)에서는 푹신으로 염색된 검출부가 보라색으로 발색될 것이며, 타겟 앰플리콘이 존재하지 않는 2열의 검출부(141)에서는 푹신으로 염색된 검출부가 탈색될 것이다. 이와 같은 비교적 간단한 사용을 통해 샘플 내 타겟 유전자가 존재하는지 하지 않는지를 판독할 수 있게 된다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)는 첫째, 푹신을 이용하여 타겟 유전자의 유무를 신속하게 판독할 수 있으므로 매우 간단한 방식으로 병원균의 존재 여부를 스크리닝 할 수 있다. 둘째, 샘플 영역과 검출 영역이 반응 영역 쪽으로 폴딩되는 구조를 취함으로써 시료 이송을 위한 별도의 복잡한 구성(밸브, 펌프 등)이 요구되지 않을 뿐더러 LAMP를 기반으로 하므로 복잡한 가열 장치도 요구되지 않아 전체 마이크로 디바이스를 간략히 구성할 수 있다. 이에 따라 본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)는 현장진단에 적극 활용될 수 있다.
한편, 본 발명은 병원균 검출 방법을 추가적으로 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 병원균 검출 방법은 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 샘플에 대해 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계; 샘플을 산 가수분해시키고 아황산나트륨을 첨가하는 단계; 및 푹신(fuchsin)을 첨가하고 변색을 확인하여 타겟 유전자의 존재유무를 판독하는 단계를 포함한다. 각 단계의 구체적인 내용은 앞에서 설명한 것과 동일하므로 중복 설명은 생략하도록 한다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로 디바이스를 이용한 병원균 검출 방법을 추가적으로 제공한다. 본 발명의 일 구체예에 따른 병원균 검출 방법은 a) 샘플 챔버에 샘플을 도입하는 단계; b) 샘플 영역을 반응 영역으로 폴딩시켜 샘플을 반응 챔버로 이동시키는 단계; c) 반응 챔버에서 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계; d) 샘플을 산 가수분해시키고 반응 챔버에 아황산나트륨을 첨가하는 단계; 및 e) 검출 영역을 반응 영역으로 폴딩시켜 검출부를 반응 챔버에 침지시키는 단계를 포함한다. 각 단계의 구체적인 내용은 앞에서 설명한 것과 동일하므로 중복 설명은 생략하도록 한다.
이하 본 발명의 시험예들에 대해 설명한다. 다만 본 발명이 하기 시험예들에 의해 제한되지 않음을 밝혀둔다.
푹신 기반의 DNA 검출 시험
DNA 주형을 함유하는 LAMP 용액을 준비하고 튜브 A에 넣은 후에 DNA 산 가수분해를 위해 65℃에서 0.5 mM HCl로 5분 동안 처리하였다. 다음으로 아황산나트륨(농도는 51 μM) 및 푹신(농도는 9μM)을 첨가하여 시험 용액의 변색을 관찰하고 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 비교를 위해 튜브 B에는 DNA 주형을 함유하지 않은 LAMP 용액을 넣고 동일하게 처리하였고, 튜브 C에는 단백질을 넣고 동일하게 처리하였다. 튜브 D에는 푹신과 아황산나트륨만을 첨가하였다. 한편, 동일한 시험을 종이에 적용해 보았다. 먼저 LAMP 산물을 산 가수분해 한 후에 아황산나트륨을 첨가하고, 푹신으로 염색된 띠 형태의 종이를 상기 용액에 담궈 변색을 육안으로 관찰하고 이미지를 취하여 ImageJ 소프트웨어로 추가 분석하였다.
도 4는 푹신 기반의 DNA 검출 시험 결과를 나타낸다. 도 4a에서는 튜브 A 내지 튜브 D의 결과 이미지와 첨가물을 정리하고 있고, 도 4b는 각 튜브의 흡광도 그래프를 나타낸다. 도 4c는 종이에서의 변색 관찰 결과를 나타낸다. 도 4를 참조하면, 튜브 A에서 용액이 보라색 외관을 나타냄을 확인할 수 있고 상대적으로 강한 흡광도를 보임을 알 수 있다. 그 외 튜브 B 내지 튜브 D에서는 색 변화가 거의 없고 매우 낮은 흡광도를 보임을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 푹신 기반의 DNA 검출 방법이 유의미함을 확인하였다. 이는 종이에 적용한 결과를 통해서도 확인되었다.
샘플의 준비
E.coli O157:H7(대장균)과 Salmonella spp.(살모넬라 종)이 200rpm의 교반 환경 하에 LB(Luria-Bertani broth) 및 NB(nutrient broth)에서 각각 밤새 배양되었다(온도는 37℃). 그리고 gDNA 정제 키트(Promega社)를 사용하여 배양액으로부터 2mL gDNA를 추출하였다. 추출된 gDNA는 2~8℃에서 보관되었다. 한편 프라이머 세트는 각각 E.coli O157:H7(대장균), Salmonella spp.(살모넬라 종), S.aureus(황색포도상구균)를 타겟으로 하여 설계되었다. 루프-매개 등온증폭 시약(LAMP reagents)은 New England BioLabs社의 제품을 이용하였으며, 25μL 시약을 기준으로 1x 등온 증폭 버퍼, 6mM MgSO4, 1.4mM dNTPs, 1.6 μM inner primer(FIP, BIP), 0.2 μM outer primer(F3, B3), 0.8 μM loop primer(LF, LB), 8 유닛의 Bst 2.0 WarmStart DNA 폴리머라제 및 0.5μL의 주형 DNA를 함유하였다.
마이크로 디바이스의 제조
도 1에 도시된 것과 동일 또는 유사한 형태의 마이크로 디바이스를 시험적으로 제조하였다. 메인 기재로는 종이를 이용하였고(길이 40mm, 폭 90mm), PC 필름(길이 40mm, 폭 30mm)을 각각 메인 기재의 샘플 영역과 반응 영역에 부착하였다. PC 필름에는 직경 5mm 가량의 관통 구멍 9개를 형성하여 샘플 챔버와 반응 챔버를 각각 형성하였다. 샘플 챔버와 반응 챔버에는 시험에 따라 재생 셀룰로오즈 멤브레인 필터(CHMLAB Group)를 배치하였다.
마이크로 디바이스의 온-칩 단일 병원균 검출 시험
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스에서의 온-칩 단일 병원균 검출 시험의 결과를 나타낸다. 도 5a는 마이크로 디바이스에서의 검출 결과를 나타내는 이미지이고, 도 5b는 비교를 위해 각 반응 챔버의 LAMP 앰플리콘들을 아가로스 겔 전기영동에 적용한 결과를 나타내는 이미지다.
도 5를 참조하면, 우유를 준비하고 인위적으로 살모넬라 균(Salmonella spp.)을 투입하여 샘플을 제조하였다. 한편 마이크로 디바이스의 반응 챔버 9개를 윗 라인, 중간 라인, 아랫 라인의 3종으로 구분하였다. 윗 라인의 반응 챔버(도 4에서 1로 표시)에는 양성 대조군으로 LAMP 시약과 정제된 살모넬라 종 DNA가 함유된 여과지가 배치되었다. 중간 라인의 반응 챔버(도 4에서 2로 표시)는 음성 대조군으로 주형 DNA가 없는 LAMP 시약이 함유된 여과지가 배치되었다. 아랫 라인의 반응 챔버(도 4에서 3으로 표시)는 시험군으로 음성 대조군과 동일한 여과지가 배치되었다. 이어 윗 라인의 샘플 챔버 및 중간 라인의 샘플 챔버에는 물을 투입하였고, 아랫 라인의 샘플 챔버에는 준비된 샘플(열적 용해됨)을 투입하였다. 모든 반응 챔버에서의 LAMP 반응은 30분 간 수행되었다. LAMP 반응 수행 후에는 각 반응 챔버에 아황산나트륨이 첨가되었고 검출 영역을 폴딩시켜 검출부를 반응 챔버에 접촉시키고 검출부의 변색을 관찰하였다.
본 시험 결과, 양성 대조군(1) 및 시험군(3)에서는 일광 하에서 마이크로 디바이스의 검출부가 보라색을 나타내었으며 이는 육안으로도 관찰되었다. 반면 음성 대조군(2)에서는 검출부가 무색으로 탈색된 것을 확인하여 본 발명에 따른 마이크로 디바이스가 신뢰성 있게 동작함을 알 수 있었다. 한편 도 4b에서와 같은 전기영동 시험 결과에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
마이크로 디바이스의 온-칩 다중 병원균 검출 시험
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스에서의 온-칩 다중 병원균 검출 시험의 결과를 나타낸다. 도 6a는 LAMP 반응 전 검출부를 나타내는 이미지이고, 도 6b는 마이크로 디바이스에서의 검출 결과를 나타내는 이미지이고, 도 6c는 비교를 위해 각 반응 챔버의 LAMP 앰플리콘들을 아가로스 겔 전기영동에 적용한 결과를 나타내는 이미지다.
도 6을 참조하면, 우유를 준비하고 인위적으로 coli O157:H7(대장균)과 Salmonella spp.(살모넬라 균)을 투입한 후에 95℃에서 5분간 가열하여 샘플을 제조하였다. 샘플은 30분간 배양되었다. 한편 마이크로 디바이스의 반응 챔버 9개를 윗 라인, 중간 라인, 아랫 라인의 3종으로 구분하였다. 윗 라인의 반응 챔버(도 6에서 1로 표시)에는 LAMP 시약과 살모넬라 균을 타겟으로 하는 프라이머 세트가 함유된 여과지가 배치되었다. 중간 라인의 반응 챔버(도 6에서 2로 표시)에는 LAMP 시약과 S.aureus(황색포도상구균)를 타겟으로 하는 프라이머 세트가 함유된 여과지가 배치되었다. 아랫 라인의 반응 챔버(도 6에서 3으로 표시)는 LAMP 시약과 coli O157:H7(대장균)를 타겟으로 하는 프라이머 세트가 함유된 여과지가 배치되었다. 준비된 샘플은 샘플 챔버에 도입된 후, 샘플 영역을 폴딩시켜 샘플들을 반응 챔버로 이동시켰다. 다음으로 마이크로 디바이스를 핫 플레이트에 놓고 65℃에서 30분간 LAMP 반응을 수행하였다. LAMP 반응 수행 후에는 각 반응 챔버에 아황산나트륨이 첨가되었고 검출 영역을 폴딩시켜 검출부를 반응 챔버에 접촉시키고 검출부의 변색을 관찰하였다.
본 시험 결과, 단일 병원균 검출 시험에서와 마찬가지로 타겟 앰플리콘이 존재하는 윗 라인의 반응 챔버(1)와 아랫 라인의 반응 챔버(3)에서는 일광 하에서 마이크로 디바이스의 검출부가 보라색을 나타내었으며 이는 육안으로도 관찰되었다. 반면 타겟 앰플리콘이 존재하는 중간 라인의 반응 챔버(2)에서는 검출부가 무색으로 탈색된 것을 확인하여(이는 LAMP 반응이 일어나지 않았음을 의미) 본 발명에 따른 마이크로 디바이스가 신뢰성 있게 동작함을 알 수 있었다. 한편 도 6c에서와 같은 전기영동 시험 결과에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
이상, 본 발명의 구현예들에 대하여 설명하였다. 그러나 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 기술의 구체적 적용에 따른 단순한 설계변경, 일부 구성요소의 생략, 단순한 용도의 변경 등 본 발명을 다양하게 변형할 수 있을 것이며, 이러한 변형 역시 본 발명의 권리범위 내에 포함됨은 자명하다.
100: 마이크로 디바이스 110: 메인 기재
111: 샘플 영역 112: 반응 영역
113: 검출 영역 120: 제1 필름
121: 샘플 챔버 122: 제1 여과지
130: 제2 필름 131: 반응 챔버
132: 제2 여과지 140: 제3 필름
141: 검출부

Claims (8)

  1. 샘플 영역, 반응 영역 및 검출 영역으로 구획되고 샘플 영역과 검출 영역이 반응 영역 쪽으로 폴딩 가능한 메인 기재;
    샘플 영역 상에 배치되고 복수의 샘플 챔버가 형성되며 분석 대상을 포함하는 샘플이 샘플 챔버로 도입되는 제1 필름;
    반응 영역 상에 배치되고 메인 기재의 샘플 영역을 반응 영역으로 폴딩하였을 때 샘플 챔버와 상응하는 위치에 복수의 반응 챔버가 형성되며, 샘플이 반응 챔버로 이동한 후 반응 챔버에서 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 제2 필름; 및
    검출 영역 상에 배치되고 메인 기재의 검출 영역을 반응 영역으로 폴딩하였을 때 반응 챔버와 상응하는 위치에 복수의 검출부가 형성되고, 검출부는 샘플 내의 타겟 유전자의 존재 유무를 검출하되 각 검출부는 푹신(fuchsin)으로 염색되는 제3 필름을 포함하는 마이크로 디바이스.
  2. 청구항 1에 있어서,
    각 샘플 챔버에는 샘플 챔버로 도입되는 샘플로부터 타겟 유전자만을 통과시켜 정제시키는 제1 여과지가 배치되는 마이크로 디바이스.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 제1 여과지는 폴리도파민(polydopamine)이 코팅되는 마이크로 디바이스.
  4. 청구항 2에 있어서,
    각 반응 챔버에는 루프-매개 등온증폭(LAMP; loop-mediated isothermal amplification) 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 함유하는 제2 여과지가 배치되는 마이크로 디바이스.
  5. 청구항 4에 있어서,
    제2 여과지들 중 적어도 일부는 서로 다른 프라이머를 함유하는 마이크로 디바이스.
  6. 청구항 1에 있어서,
    루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 가열부를 더 포함하는 마이크로 디바이스.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 따른 마이크로 디바이스를 이용한 병원균 검출 방법이고,
    a) 샘플 챔버에 샘플을 도입하는 단계;
    b) 샘플 영역을 반응 영역으로 폴딩시켜 샘플을 반응 챔버로 이동시키는 단계;
    c) 반응 챔버에서 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계;
    d) 샘플을 산 가수분해시키고 반응 챔버에 아황산나트륨을 첨가하는 단계; 및
    e) 검출 영역을 반응 영역으로 폴딩시켜 검출부를 반응 챔버에 침지시키는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법.
  8. 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 샘플에 대해 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계;
    샘플을 산 가수분해시키고 아황산나트륨을 첨가하는 단계; 및
    푹신(fuchsin)을 추가적으로 첨가하고 (ⅰ) 샘플 내 타겟 유전자가 존재하는 경우 상기 푹신이 자색으로 발색되고, (ⅱ) 샘플 내 타겟 유전자가 존재하지 않는 경우 상기 푹신이 무색으로 탈색되는 현상을 통해 타겟 유전자의 존재유무를 판독하는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법.
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