JP2016189726A - ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｕｂｅｒｉｓ）を検出するためのプライマー及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、Streptococcus uberisを簡便かつ迅速に検出するためのプライマーセット、及び方法を提供することを解決課題とする。【解決手段】Streptococcus uberisに特異的な塩基配列から設計したプライマーセット、及び該プライマーセットを用いるStreptococcus uberisの検出方法。【選択図】なし
Description
本発明は、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を検出するためのプライマー、及びStreptococcus uberisの検出法に関する。
乳房炎は乳腺組織が炎症を生ずる疾患である。乳牛が乳房炎に罹患すると搾乳量の減少や個体の衰弱等をもたらし、酪農家に大きな経済的損失を与えることが知られている。乳房炎の主な原因は細菌やウイルスの感染であり、病原体の早期検出による感染拡大防止と、適切な処置による早期の搾乳再開が望まれている。特に、Streptococcus uberisにより生じる乳房炎は、再発率が高く慢性化し易いことから、より強く早期検出が望まれている。しかし、一般的な乳房炎検査方法である培養法は、病原体の培養に1日〜数週間と長い時間を必要することや、治療方針等を決定するために重要な、病原体種の詳細な同定が不可能であるといった課題を有している。
Streptococcus uberisのワクチン及び診断に関する文献として特許文献1〜2が知られているが、特許文献1〜2に記載されたStreptococcus uberisの検出法は、検出に必要な時間や特異性の面で十分とは言えないものであった。
本発明は、乳房炎を起因する病原体の一種であるStreptococcus uberisを簡便かつ迅速に検出するためのプライマーセットを提供することを目的とする。また、本発明は、Streptococcus uberisの簡便かつ迅速な検出方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者はStreptococcus uberisに特異的な塩基配列から設計したプライマーを用いることで、Streptococcus uberisを特異的に検出し得ることを見出し、本願発明を完成するに至った。
したがって、本発明は以下の態様（１）〜（１８）を包含する。
（１）等温核酸増幅法によってストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を検出するためのプライマーセットであって、
該セットが、標的配列である、配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列において、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、それぞれの相補的配列をF3配列、F2配列、F1配列、R1c配列、R2c配列、及びR3c配列としたときに、下記の（a）及び（b）のプライマーを含み、かつ、下記の（c）〜（e）のプライマーのいずれか一つ以上を含む、プライマーセット：
（a）プライマーの3’末端側にF2配列を含み、5’末端側にF1c配列を含むプライマー；
（b）プライマーの3’末端側にR2配列を含み、5’末端側にR1c配列、又は相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列、を含むプライマー；
（c）前記標的配列におけるF2c配列の3'末端の塩基から、F1c配列の3'末端の3'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列A又は配列Aに相補的な配列Bを含むプライマー及び／又は前記標的配列におけるR2配列の5'末端の塩基から、R1配列の5'末端の5'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列C又は配列Cに相補的な配列Dを含むプライマー；
（d）F3配列を含むプライマー；
（e）R3配列を含むプライマー。
（２）等温核酸増幅法が、LAMP法又はSmartAmp法である、（１）に記載のプライマーセット。
（３）（a）のプライマーにおいて、F2配列が、配列番号2若しくは12によって表される塩基配列、又は配列番号2若しくは12によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（４）（a）のプライマーにおいて、F1c配列が、配列番号21若しくは22によって表される塩基配列、又は配列番号21若しくは22によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（３）に記載のプライマーセット。
（５）（a）のプライマーにおいて、F2配列が、配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（６）（a）のプライマーにおいて、F1c配列が、配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（５）に記載のプライマーセット。
（７）（b）のプライマーにおいて、R2配列が、配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列、又は配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（６）のいずれかに記載のプライマーセット。
（８）（b）のプライマーにおいて、R1c配列又は折り返し配列が、配列番号7〜10のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号7〜10のいずれかによって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（７）のいずれかに記載のプライマーセット。
（９）（c）のプライマーが、配列番号4若しくは14によって表される塩基配列、又は配列番号4若しくは14によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載のプライマーセット。
（１０）（d）のプライマーにおいて、F3配列が配列番号5によって表される塩基配列、又は配列番号5によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（９）のいずれかに記載のプライマーセット。
（１１）（e）のプライマーにおいて、R3配列が配列番号6によって表される塩基配列、又は配列番号6によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（１０）のいずれかに記載のプライマーセット。
（１２）（１）に記載の（a）〜（e）のプライマーにおいて、F1c配列、F2配列、R1c配列又は折り返し配列、R2配列、配列A、B、C、又はD、F3配列、及びR3配列の組合せが、以下の表の組合せ1〜20のいずれかである、（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載のプライマーセットを含む、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を検出するためのキット。
（１４）（１）〜（１２）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて等温核酸増幅法によりサンプル由来の核酸を増幅する工程、及び増幅産物の量又は存在を測定する工程を含む、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）の検出方法。
（１５）等温核酸増幅法がLAMP法又はSmartAmp法である、（１４）に記載の方法。
（１６）配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列、又はその部分配列からなる核酸の量又は存在を測定する工程を含む、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を特異的に検出する方法。
（１７）前記核酸を増幅する工程を含む、（１６）に記載の方法。
（１８）増幅を等温核酸増幅法により行う、（１６）又は（１７）に記載の方法。
（１）等温核酸増幅法によってストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を検出するためのプライマーセットであって、
該セットが、標的配列である、配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列において、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、それぞれの相補的配列をF3配列、F2配列、F1配列、R1c配列、R2c配列、及びR3c配列としたときに、下記の（a）及び（b）のプライマーを含み、かつ、下記の（c）〜（e）のプライマーのいずれか一つ以上を含む、プライマーセット：
（a）プライマーの3’末端側にF2配列を含み、5’末端側にF1c配列を含むプライマー；
（b）プライマーの3’末端側にR2配列を含み、5’末端側にR1c配列、又は相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列、を含むプライマー；
（c）前記標的配列におけるF2c配列の3'末端の塩基から、F1c配列の3'末端の3'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列A又は配列Aに相補的な配列Bを含むプライマー及び／又は前記標的配列におけるR2配列の5'末端の塩基から、R1配列の5'末端の5'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列C又は配列Cに相補的な配列Dを含むプライマー；
（d）F3配列を含むプライマー；
（e）R3配列を含むプライマー。
（２）等温核酸増幅法が、LAMP法又はSmartAmp法である、（１）に記載のプライマーセット。
（３）（a）のプライマーにおいて、F2配列が、配列番号2若しくは12によって表される塩基配列、又は配列番号2若しくは12によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（４）（a）のプライマーにおいて、F1c配列が、配列番号21若しくは22によって表される塩基配列、又は配列番号21若しくは22によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（３）に記載のプライマーセット。
（５）（a）のプライマーにおいて、F2配列が、配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（６）（a）のプライマーにおいて、F1c配列が、配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（５）に記載のプライマーセット。
（７）（b）のプライマーにおいて、R2配列が、配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列、又は配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（６）のいずれかに記載のプライマーセット。
（８）（b）のプライマーにおいて、R1c配列又は折り返し配列が、配列番号7〜10のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号7〜10のいずれかによって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（７）のいずれかに記載のプライマーセット。
（９）（c）のプライマーが、配列番号4若しくは14によって表される塩基配列、又は配列番号4若しくは14によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載のプライマーセット。
（１０）（d）のプライマーにおいて、F3配列が配列番号5によって表される塩基配列、又は配列番号5によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（９）のいずれかに記載のプライマーセット。
（１１）（e）のプライマーにおいて、R3配列が配列番号6によって表される塩基配列、又は配列番号6によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（１０）のいずれかに記載のプライマーセット。
（１２）（１）に記載の（a）〜（e）のプライマーにおいて、F1c配列、F2配列、R1c配列又は折り返し配列、R2配列、配列A、B、C、又はD、F3配列、及びR3配列の組合せが、以下の表の組合せ1〜20のいずれかである、（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（１４）（１）〜（１２）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて等温核酸増幅法によりサンプル由来の核酸を増幅する工程、及び増幅産物の量又は存在を測定する工程を含む、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）の検出方法。
（１５）等温核酸増幅法がLAMP法又はSmartAmp法である、（１４）に記載の方法。
（１６）配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列、又はその部分配列からなる核酸の量又は存在を測定する工程を含む、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を特異的に検出する方法。
（１７）前記核酸を増幅する工程を含む、（１６）に記載の方法。
（１８）増幅を等温核酸増幅法により行う、（１６）又は（１７）に記載の方法。
本発明により、Streptococcus uberisの簡便かつ迅速な検出及び同定が可能となる。
＜標的配列＞
一態様において、本発明は、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis、以下、「S. uberis」とも称する）を検出するためのプライマーセットに関する。本発明において、S. uberisを検出するための標的配列は、特に配列番号1によって表される、S. uberisの23S rRNA配列をコードするDNA配列である。
一態様において、本発明は、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis、以下、「S. uberis」とも称する）を検出するためのプライマーセットに関する。本発明において、S. uberisを検出するための標的配列は、特に配列番号1によって表される、S. uberisの23S rRNA配列をコードするDNA配列である。
本発明の標的配列は、S. uberisに特異的である限り上記配列番号1によって表される配列に限定されず、配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列を含む。本明細書において、「１若しくは数個」の範囲は、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個又は2個である。
また、本発明の標的配列は、S. uberisに特異的である限り上記配列番号1によって表される配列に限定されず、配列番号1によって表される塩基配列と70%以上の同一性、好ましくは80%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、最も好ましくは95%以上の同一性、例えば97%以上、98%以上若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列を含む。本明細書において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。
同様に、本発明の標的配列は、S. uberisに特異的である限り上記配列番号1によって表される配列に限定されず、配列番号1によって表される塩基配列に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってよい。
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が40〜68℃、好ましくは40〜65℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、1〜7×SSC、0.02〜3% SDS、温度40℃〜60℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば0.1〜2×SSC、0.1〜0.3% SDS、温度50〜65℃で行うことができる。
また、本発明の標的配列は、S. uberisに特異的である限り上記配列番号1によって表される塩基配列、配列番号1において、1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列、配列番号1と70%以上の同一性、好ましくは80%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、最も好ましくは95%以上の同一性、例えば97%、98%若しくは99%の同一性を有する塩基配列、又は配列番号1に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する配列に限定されず、上記標的配列の部分配列であってよい。該部分配列は、例えば、配列番号1の配列の連続する少なくとも50塩基、60塩基、70塩基、80塩基、90塩基、又は100塩基を含む塩基配列、例えば、配列番号1の50番目〜650番目の塩基配列、100番目〜600番目の塩基配列、150番目〜550番目の塩基配列、200番目〜500番目の塩基配列、好ましくは250番目〜450番目の塩基配列、特に好ましくは278番目〜438番目の塩基配列、又はこれらの配列において、1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列を含む、又はからなるものであってよい。
＜プライマー＞
一態様において、本発明は、上記標的配列から設計されたプライマー又はプライマーセットに関する。例えば、本発明は、上記標的配列の一部と同一又は相補的な塩基配列を含むか若しくはからなるプライマー、又は該プライマーを二種以上含むプライマーセットに関する。
一態様において、本発明は、上記標的配列から設計されたプライマー又はプライマーセットに関する。例えば、本発明は、上記標的配列の一部と同一又は相補的な塩基配列を含むか若しくはからなるプライマー、又は該プライマーを二種以上含むプライマーセットに関する。
本発明のプライマー及びプライマーセットは、等温核酸増幅法によって、上記標的配列を増幅し得るものであってよい。等温核酸増幅法とは、標的核酸配列を等温で増幅する方法である。本明細書において、等温核酸増幅法における「等温」とは、酵素及びプライマー等が機能し得る一定の温度、例えば40℃〜75℃、好ましくは50℃〜72℃、特に55℃〜70℃を意味する。代表的な等温核酸増幅法であるLAMP法及びSmartAmp法について、以下に説明する。
LAMP法は、プライマーとして、好ましくは少なくとも4種類のオリゴヌクレオチドを用いる核酸増幅法であり、2本鎖DNA、プライマー、鎖置換型DNA polymerase、基質等を同一容器に入れ、一定温度(65℃付近)で保温することにより、検出までを１ステップの工程で行う。LAMP法は、増幅効率が高く、DNAを15分〜１時間程度で約109〜1010倍に増幅することができ、増幅産物の有無によって、短時間で標的DNA配列の有無を判定することが可能である（例えば、国際特許公開WO 00/28082号公報）。
LAMP法では、標的遺伝子に対して、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、この6領域に対して、プライマーを設計する。プライマーとして、FIP（forward inner primer）及びBIP(back inner primer)を含むインナープライマーを用い、好ましくはさらにF3プライマー及びB3プライマーを含むアウタープライマーを用いる。FIPは、標的遺伝子のF2c領域と相補的なF2領域を3’末端側に有し、5’末端側に標的遺伝子のF1c領域と同一の配列を含む。F3プライマーは、標的遺伝子のF3c領域と相補的なF3領域を含む。BIPは、標的遺伝子のR2領域を3’末端側に有し、5’末端側に標的遺伝子のR1領域と相補的なR1c領域を含む。B3プライマーは、標的遺伝子のR3配列を含む。LAMP法では、ループプライマーと呼ばれるプライマーを用いて、反応をさらに促進することもできる。ループプライマーは、LAMP法の反応中間体として生じる構造の両端に存在するループ構造の一部の配列に相補的な配列を含む。
SmartAmp法は、LAMP法と類似する方法であるが、フォールディングプライマーと呼ばれる、5’側が自己相補的な配列、すなわち、相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列であるプライマーを用いる点で、LAMP法と相違する。また、上記の通りLAMP法では両端にループ構造を有する中間体が形成されるのに対し、SmartAmp法では、一方がループ構造、もう一方が折りたたみ構造を有する中間体が形成される点でも相違する。さらに、各プライマーの名称も、LAMP法とSmartAmp法では異なる。LAMP法とSmartAmp法の相違点の概略を図1に示す。
本発明のプライマーセットは、上記「標的配列」の項目で記載した標的配列において、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、それぞれの相補的配列をF3配列、F2配列、F1配列、R1c配列、R2c配列、及びR3c配列としたときに、少なくとも以下の(a)及び(b)のプライマーを含む：（a）プライマーの3’末端側がF2配列を含むか又はからなり、5’末端側がF1c配列を含むか又はからなるプライマー；及び（b）プライマーの3’末端側がR2配列を含むか若しくはからなり、5’末端側がR1c配列、又は相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列、を含むか若しくはからなるプライマー。ここで、(b)のプライマーが5’末端側にR1c配列を含む場合には、該プライマーセットはLAMP法に用いることができ、(b)のプライマーが5’末端側に折り返し配列を含む場合には、該プライマーセットはSmartAmp法に用いることができる。
上記（a）及び（b）のプライマーにおいて、「5’末端側」とは、二つの配列の相対的な位置関係を表し、「5’末端側」の配列が他方の配列に対して、5’末端により近いことを意味する。「5’末端側に含む」とは、好ましくは「5’末端」に含むことを意味する。同様に、「3’末端側」とは、二つの配列の相対的な位置関係を表し、「3’末端側」の配列が他方の配列に対して、3’末端により近いことを意味する。「3’末端側に含む」とは、好ましくは「3’末端」に含むことを意味する。
限定するものではないが、F2c配列の3’末端〜R2配列の5’末端の塩基長は60〜500塩基であってよく、F2cとF3c配列間、及びR2とR3配列間の塩基長は、0〜20塩基であってよい。また、限定するものではないが、F2cとF1c配列間、及びR2とR1の配列間の塩基長は、0〜60塩基であってよい。
本発明のプライマーセットは、上記（a）及び（b）のプライマーに加えて、さらに以下の（c）〜（e）のいずれか一つ以上を含んでもよい：（c）標的配列におけるF2c配列の3'末端の塩基から、F1c配列の3'末端の3'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列A又は配列Aに相補的な配列Bを含む（好ましくは3'末端に含む）か若しくはからなるプライマー及び／又は標的配列におけるR2配列の5'末端の塩基から、R1配列の5'末端の5'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列C又は配列Cに相補的な配列Dを含む（好ましくは3'末端に含む）か若しくはからなるプライマー；（d）F3配列を含む（好ましくは3'末端に含む）か又はからなるプライマー；及び（e）R3配列を含む（好ましくは3'末端に含む）か又はからなるプライマー。
LAMP法において用いる場合には、本発明のプライマーセットは、上記（a）及び（b）のプライマーに加えて、好ましくは上記（d）及び（e）のプライマーを含む。LAMP法において用いる場合には、本発明のプライマーセットは、さらに好ましくは、上記（c）のプライマーをさらに含む。
上記（a）〜（b）のプライマーの長さは、プライマーセットが標的配列を増幅可能であれば特に限定しない。上記F3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列の長さは、それぞれ例えば12〜32ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドであり、上記折り返し配列の長さは、例えば4〜60ヌクレオチド、好ましくは6〜40ヌクレオチドである。また、（a）のプライマーは、F2配列とF1c配列の間に、反応に影響を与えない0〜50ヌクレオチドからなる任意のオリゴヌクレオチドを含んでいてよく、同様に（b）のプライマーは、R2配列とR1c配列又は折り返し配列の間に、反応に影響を与えない0〜50ヌクレオチドからなる任意のオリゴヌクレオチドを含んでいてよい。したがって、（a）及び（b）のプライマーの長さは、例えば30〜100ヌクレオチド、好ましくは30〜50ヌクレオチド、特に好ましくは30〜40ヌクレオチドである。同様に、（c）〜（e）のプライマーの長さは、プライマーセットが標的配列を増幅可能であれば特に限定しないが、例えば12〜32ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドである。
上記（a）〜（b）のプライマーの長さは、プライマーセットが標的配列を増幅可能であれば特に限定しない。上記F3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列の長さは、それぞれ例えば12〜32ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドであり、上記折り返し配列の長さは、例えば4〜60ヌクレオチド、好ましくは6〜40ヌクレオチドである。また、（a）のプライマーは、F2配列とF1c配列の間に、反応に影響を与えない0〜50ヌクレオチドからなる任意のオリゴヌクレオチドを含んでいてよく、同様に（b）のプライマーは、R2配列とR1c配列又は折り返し配列の間に、反応に影響を与えない0〜50ヌクレオチドからなる任意のオリゴヌクレオチドを含んでいてよい。したがって、（a）及び（b）のプライマーの長さは、例えば30〜100ヌクレオチド、好ましくは30〜50ヌクレオチド、特に好ましくは30〜40ヌクレオチドである。同様に、（c）〜（e）のプライマーの長さは、プライマーセットが標的配列を増幅可能であれば特に限定しないが、例えば12〜32ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドである。
上記（a）のプライマーにおいて、F2配列は、配列番号2若しくは12によって表される塩基配列、又は配列番号2若しくは12によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に、配列番号2若しくは12によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、F2配列は、配列番号2若しくは12によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、F2配列は、配列番号2若しくは12に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。F2配列はまた、配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号2又は12によって表される塩基配列と、配列番号2又は12によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。ここで、（a）のプライマーにおいて、F1c配列は、配列番号21若しくは22によって表される塩基配列、又は配列番号21若しくは22によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号21若しくは22によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、F1c配列は、配列番号21若しくは22によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、F1c配列は、配列番号21若しくは22に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。F1c配列はまた、配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号21又は22によって表される塩基配列と、配列番号21又は22によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。
上記（a）のプライマーにおいて、F2配列は、配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、F2配列は、配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、F2配列は、配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかに相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。F2配列はまた、配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列と、配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。ここで、（a）のプライマーにおいて、F1c配列は、配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、F1c配列は、配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、F1c配列は、配列番号15、16、及び23〜27のいずれかに相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。F1c配列はまた、配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列と、配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。
上記（b）のプライマーにおいて、R2配列は、配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列、又は配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、R2配列は、配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、R2配列は、配列番号3、11、若しくは13に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。R2配列はまた、配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列と、配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。
上記（b）のプライマーにおいて、折り返し配列は、相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する配列であれば、特に限定しない。折り返し配列中に存在する相互にハイブリダイズする2つの核酸配列は、他の配列を介さずに直接隣接していてもよいし、他の配列を介して接していてもよい。折り返し構造を形成する各核酸の長さは、限定するものではないが、例えば2〜30塩基、好ましくは2〜20塩基である。また、折り返し構造を形成する2つの核酸配列の間に存在し得る他の配列の長さは、限定するものではないが、例えば1〜40塩基、好ましくは1〜20塩基又は1〜10塩基である。
上記（b）のプライマーにおける折り返し配列は、配列番号7〜9のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号7〜9のいずれかによって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号7〜9のいずれかによって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、折り返し配列は、配列番号7〜9のいずれかによって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、折り返し配列は、配列番号7〜9のいずれかに相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。
上記（b）のプライマーにおいて、R1c配列は配列番号10によって表される塩基配列、又は配列番号10によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号10によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、R1c配列は、配列番号10によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、R1c配列は、配列番号10に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。R1c配列はまた、配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号10によって表される塩基配列と、配列番号10によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。
上記（c）のプライマーは、例えば、標的配列におけるF2c配列とF1c配列の間の部分配列又は該部分配列に相補的な配列を含む（好ましくは3'末端に含む）か若しくはからなるプライマー及び／又は標的配列におけるR1配列とR2配列の間の部分配列若しくは該配列に相補的な配列を含む（好ましくは3'末端に含む）か若しくはからなるプライマーであってよい。
上記（c）のプライマーは、配列番号4若しくは14によって表される塩基配列、又は配列番号4若しくは14によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列を含む、又はからなるものであってよく、特に配列番号4若しくは14によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、（c）のプライマーは、配列番号4若しくは14によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列を含むか又はからなるものであってよい。また、（c）のプライマーは、配列番号4若しくは14に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列を含むか又はからなるものであってよい。
特に、（b）のプライマーにおいて、R2配列が、配列番号3若しくは11によって表される塩基配列、配列番号3若しくは11によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列、配列番号3若しくは11によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、若しくは97%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号3若しくは11に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列である場合、（c）のプライマーは、配列番号4によって表される塩基配列、配列番号4によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列、配列番号4によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、若しくは97%以上の同一性を有する塩基配列、配列番号4に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列を含むか又はからなるものであるのが好ましい。また、（b）のプライマーにおいて、R2配列が、配列番号13によって表される塩基配列、配列番号13によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列、配列番号13によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、若しくは97%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号13に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列である場合、（c）のプライマーは、配列番号14によって表される塩基配列、配列番号14によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列、配列番号14によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、若しくは97%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号14に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列を含むか又はからなるものであるのが好ましい。
上記（d）のプライマーにおいて、F3配列は、配列番号5によって表される塩基配列、又は配列番号5によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号5によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、F3配列は、配列番号5によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、F3配列は、配列番号5に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。F3配列はまた、配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号5によって表される塩基配列と、配列番号5によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。
上記（e）のプライマーにおいて、R3配列は、配列番号6によって表される塩基配列、又は配列番号6によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号6によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、R3配列は、配列番号6によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、R3配列は、配列番号6に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。R3配列はまた、配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号6によって表される塩基配列と、配列番号6によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。
また、一態様において、本発明は、上記（a）〜（e）のプライマーにおいて、F1c配列、F2配列、R1c配列又は折り返し配列、R2配列、配列A、B、C、又はD、F3配列、及びR3配列の組合せが、以下の表2の組合せ1〜20のいずれかである、プライマーセットに関する。
ここで、組合せ1〜20において、各プライマーは、表中に記載された配列を含むか又はからなる。
本発明の他の一態様では、上記表2に示す組合せ1〜20のいずれかのプライマーセットにおいて、配列番号X（Xは表中の各組合せにおける配列番号の1つ以上を指す）によって表される塩基配列が、
配列番号Xによって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された塩基配列；
配列番号Xによって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列；
配列番号Xに相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列（特に配列番号Xによって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列）；或いは
配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列又は配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号X（ただし配列番号Xが配列番号7、8又は9である場合を除く）によって表される塩基配列と、配列番号Xによって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列
に置き換えられてもよい。これらの塩基配列については、 (a)〜(e)のプライマーに関して説明した通りである。
配列番号Xによって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された塩基配列；
配列番号Xによって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列；
配列番号Xに相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列（特に配列番号Xによって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列）；或いは
配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列又は配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号X（ただし配列番号Xが配列番号7、8又は9である場合を除く）によって表される塩基配列と、配列番号Xによって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列
に置き換えられてもよい。これらの塩基配列については、 (a)〜(e)のプライマーに関して説明した通りである。
本発明の方法において増幅される配列は、LAMP法の場合、例えば、F1c配列とR1配列及びF1c配列とR1配列の間の配列、又はF1配列とR1c配列及びF1配列とR1c配列の間の配列を含む配列である。ここで、F1c配列とR1配列の間、又はF1配列とR1c配列の間の塩基長は、例えば0〜60塩基又は5〜50塩基であってよい。また、本発明の方法において増幅される配列は、SmartAmp法の場合、例えば、F1c配列とR2配列及びF1c配列とR2配列の間の配列、又はF1配列とR2c配列及びF1配列とR2c配列の間の配列を含む配列である。ここで、F1c配列とR2配列の間、又はF1配列とR2c配列の間の塩基長は、例えば0〜60塩基又は5〜50塩基であってよい。
＜キット＞
一態様において、本発明は、本発明のプライマー又はプライマーセットを含む、S. uberisを検出するためのキットに関する。本発明のキットは、上記プライマー又はプライマーセットに加えて、例えば、バッファー、酵素、及び／又は使用説明書等を含んでもよい。
一態様において、本発明は、本発明のプライマー又はプライマーセットを含む、S. uberisを検出するためのキットに関する。本発明のキットは、上記プライマー又はプライマーセットに加えて、例えば、バッファー、酵素、及び／又は使用説明書等を含んでもよい。
＜方法＞
一態様において、本発明は、上記標的配列、例えば配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列、又はその部分配列からなる核酸の量又は存在を測定する工程を含む、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を特異的に検出する方法に関する。特に、該方法は、該核酸を増幅する工程を含み、増幅は等温核酸増幅法により行われるのが好ましいが、PCR法等の公知の核酸増幅法により行ってもよい。ここで、該部分配列は、例えば、連続する少なくとも50塩基、60塩基、70塩基、80塩基、90塩基、又は100塩基を含む塩基配列、例えば、配列番号1の50番目〜650番目の塩基配列、100番目〜600番目の塩基配列、150番目〜550番目の塩基配列、200番目〜500番目の塩基配列、好ましくは250番目〜450番目の塩基配列、特に好ましくは278番目〜438番目の塩基配列、又はこれらの配列において、1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列を含む、又はからなるものであってよい。
一態様において、本発明は、上記標的配列、例えば配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列、又はその部分配列からなる核酸の量又は存在を測定する工程を含む、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を特異的に検出する方法に関する。特に、該方法は、該核酸を増幅する工程を含み、増幅は等温核酸増幅法により行われるのが好ましいが、PCR法等の公知の核酸増幅法により行ってもよい。ここで、該部分配列は、例えば、連続する少なくとも50塩基、60塩基、70塩基、80塩基、90塩基、又は100塩基を含む塩基配列、例えば、配列番号1の50番目〜650番目の塩基配列、100番目〜600番目の塩基配列、150番目〜550番目の塩基配列、200番目〜500番目の塩基配列、好ましくは250番目〜450番目の塩基配列、特に好ましくは278番目〜438番目の塩基配列、又はこれらの配列において、1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列を含む、又はからなるものであってよい。
核酸の増幅を等温核酸増幅法により行う場合には、上記プライマーセットのいずれかを用いればよいが、核酸の増幅をPCR法等の公知の核酸増幅法で行う場合には、例えば以下のプライマーセット：
配列番号2の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号2の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号11の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号12の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号11の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号17の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号18の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号19の配列を含む、又はからなるプライマー及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；又は
配列番号20の配列を含む、又はからなるプライマー及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；
を使用することができる。
本発明の方法において使用するプライマーは、上記プライマーセットに限定されず、標的配列に基づいて、公知の方法に従って作製してもよい。
配列番号2の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号2の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号11の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号12の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号11の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号17の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号18の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号19の配列を含む、又はからなるプライマー及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；又は
配列番号20の配列を含む、又はからなるプライマー及び配列番号13の配列を含む、又はからなるプライマー；
を使用することができる。
本発明の方法において使用するプライマーは、上記プライマーセットに限定されず、標的配列に基づいて、公知の方法に従って作製してもよい。
本発明の他の一態様では、上記のいずれかのプライマーセットにおいて、配列番号X（Xは各プライマーセットにおける配列番号の1つ以上を指す）の配列が、
配列番号Xによって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された塩基配列；
配列番号Xによって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列；
配列番号Xに相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列（特に配列番号Xによって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列）；或いは
配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列又は配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号Xによって表される塩基配列と、配列番号Xによって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列
に置き換えられてもよい。これらの塩基配列については、 (a)〜(e)のプライマーに関して説明した通りである。
配列番号Xによって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された塩基配列；
配列番号Xによって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列；
配列番号Xに相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列（特に配列番号Xによって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列）；或いは
配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列又は配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号Xによって表される塩基配列と、配列番号Xによって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列
に置き換えられてもよい。これらの塩基配列については、 (a)〜(e)のプライマーに関して説明した通りである。
本発明の方法は、設計したプライマー、DNAポリメラーゼ、増幅しようとする標的遺伝子を含むサンプル、及びバッファーを混合する工程、並びに該混合物をインキュベーションする工程を含む。この方法により、遺伝子増幅反応が進行し、増幅産物を得ることができる。
核酸増幅法に用いる酵素としては、例えば、Aac Polymerase、Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント)、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、KOD DNAポリメラーゼ等の鎖置換型DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
本発明における「サンプル」としては、例えば単離されたDNAを含む懸濁液、又は単離されていないDNAを含む懸濁液、例えば菌体を含む懸濁液が挙げられる。また、本発明におけるサンプルは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の哺乳動物の体液（例えば乳汁、唾液、血液、糞便等）又は組織（例えば、乳房近傍の皮膚組織等）等の生体由来サンプルであってよい。また、本発明におけるサンプルは、食品及び乳業の加工機器、装置、器具、及び用具等から採取してもよい。サンプルは、必要に応じて増幅の前に分離及び／又は濃縮等の前処理を行うことができる。
核酸増幅法に用いられ得るバッファーとして、例えばトリス塩酸バッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等のバッファーが挙げられる。これらのバッファーには、必要に応じて、塩化マグネシウム等の塩やdNTPs等の基質を加えても良い。本発明の等温核酸増幅法に用い得るバッファーの具体例として、例えばDnaform社のReaction bufferが挙げられる。
上記インキュベーション工程は、プライマーのアニーリング温度等を考慮して適宜定めることができる。例えば、等温増幅の場合には、使用する酵素の活性を維持できる温度により保つことで実施することができ、温度は、用いるプライマーの融解温度（Tm）又はそれ以下にすることが好ましい。等温増幅法におけるインキュベーション温度として、例えば40℃〜75℃、好ましくは50℃〜72℃、特に55℃〜70℃が挙げられ、インキュベート時間として、増幅産物の量又は存在を測定可能であれば特に限定しないが、例えば15分〜120分、好ましくは30〜90分が挙げられる。
一態様において、本発明は、本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅法、特に等温核酸増幅法によりサンプル由来の核酸を増幅する工程、及び増幅産物の量又は存在を測定する工程を含む、S. uberisの検出方法に関する。
本発明において、増幅産物の量又は存在を測定する工程は特に限定しない。本発明において、増幅産物の量を測定するとは、増幅産物の量を定量的に評価することを意味し、増幅産物の存在を測定するとは、増幅産物の有無を定性的に評価することを意味する。増幅産物の量又は存在の測定は、例えば増幅された遺伝子配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いて行うことができ、さらに増幅反応終了後の反応液をそのまま電気泳動（例えば、アガロース電気泳動、及びポリアクリルアミドゲル電気泳動等）して増幅産物の有無の確認により行うことができる。また、反応液中にあらかじめ二本鎖核酸の分子内に特異的に取り込まれるインターカレーターであるエチジウムブロマイドやSYBR Green（Molecular Probes 社製）等を添加することによっても増幅を検出することが可能である（特開2001-242169）。また、伸長反応の際、副産物としてピロリン酸が生成され、反応液中のマグネシウムイオンと結合し、ピロリン酸マグネシウムの白濁・沈殿が生じるため、これを指標として肉眼又は吸光度計で検出することもできる。さらに、増幅された遺伝子配列を、該配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドを固相化したDNAマイクロアレイやDNAチップを用いて検出することも可能である。また、特開2013-247968に記載の核酸目視検出法によって増幅した核酸を染色することによって検出することも可能である。
本発明の方法によって、乳房炎の原因となるS. uberisを特異的に検出することが可能となり、これによって、簡便かつ迅速に乳房炎の罹患又は罹患リスクの有無を判定することができる。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例1：プライマーの設計＞
高い特異性を有するプライマーを取得するため、本発明者らは、まずS. uberisの23S rRNA遺伝子と、S. uberisの近縁種（13種）の23S rRNA遺伝子の塩基配列を、Genetyx（株式会社ゼネティックス）を用いて比較した。比較を行った生物種と、その23S rRNAの配列のAccession numberを以下の表3に示す。
高い特異性を有するプライマーを取得するため、本発明者らは、まずS. uberisの23S rRNA遺伝子と、S. uberisの近縁種（13種）の23S rRNA遺伝子の塩基配列を、Genetyx（株式会社ゼネティックス）を用いて比較した。比較を行った生物種と、その23S rRNAの配列のAccession numberを以下の表3に示す。
その結果、S. uberisのみに特異的な塩基配列として、配列番号1の配列を見出した。次に、この塩基配列から以下の表5に記載する各プライマーを、Genetyx（株式会社ゼネティックス）を用いて設計した。
＜実施例2：精製DNAを検体とした等温核酸増幅反応＞
以下の方法に従って、設計した各プライマーにより、S. uberis由来精製DNAを等温核酸増幅が可能か、リアルタイム蛍光測定法により評価した。
以下の方法に従って、設計した各プライマーにより、S. uberis由来精製DNAを等温核酸増幅が可能か、リアルタイム蛍光測定法により評価した。
１）試料
S. uberis(ATCC 19436)培養液から、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付の取り扱い説明書に従ってDNAを精製し、精製DNAを鋳型として等温核酸増幅反応を実施した。
S. uberis(ATCC 19436)培養液から、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付の取り扱い説明書に従ってDNAを精製し、精製DNAを鋳型として等温核酸増幅反応を実施した。
２）反応溶液組成及び反応条件
以下の表4に示す反応溶液25 μL中に、各50 μMに調製したプライマーをTP（Turn back Primer）、FP（Folding Primer）、FIP（Foward Inner Primer）、BIP（Back Inner Primer）の場合は1.6 μL、BP（Boost Primer）、LP（Loop Primer）の場合は0.8 μL、OF（Outer Foward primer）、OR（Outer Reverse Primer）、F3プライマー、及びB3プライマーの場合は0.1 μL添加した。
以下の表4に示す反応溶液25 μL中に、各50 μMに調製したプライマーをTP（Turn back Primer）、FP（Folding Primer）、FIP（Foward Inner Primer）、BIP（Back Inner Primer）の場合は1.6 μL、BP（Boost Primer）、LP（Loop Primer）の場合は0.8 μL、OF（Outer Foward primer）、OR（Outer Reverse Primer）、F3プライマー、及びB3プライマーの場合は0.1 μL添加した。
増幅反応は、リアルタイム蛍光測定装置LightCyclerR 96システム（Roche）を用い、60℃、70分間にて実施し、SYBR Greenの蛍光を経時的にモニタリングすることにより解析した。
３）プライマー
以下の表5に示すプライマーを用いた。本実施例で用いた各プライマーは、以下の表に示す配列のみからなる。例えば、組合せ1において、TPは5'末端側のターンバック部及び3'末端側のアニール部からなり、ターンバック部は配列番号21からなり、アニール部は配列番号2からなる。同様に、組合せ1において、FPは5'末端側のフォールディング部及び3'末端側のアニール部からなり、フォールディング部は配列番号7からなり、アニール部は配列番号3からなる。同様に、組合せ1において、BPは配列番号4からなる。表5に示す他の組合せ2〜21についても同様である。
以下の表5に示すプライマーを用いた。本実施例で用いた各プライマーは、以下の表に示す配列のみからなる。例えば、組合せ1において、TPは5'末端側のターンバック部及び3'末端側のアニール部からなり、ターンバック部は配列番号21からなり、アニール部は配列番号2からなる。同様に、組合せ1において、FPは5'末端側のフォールディング部及び3'末端側のアニール部からなり、フォールディング部は配列番号7からなり、アニール部は配列番号3からなる。同様に、組合せ1において、BPは配列番号4からなる。表5に示す他の組合せ2〜21についても同様である。
４）結果
表5に示したように、プライマー組合せ1〜20にて60℃において、60分以内で増幅反応が確認された。SmartAmp法による増幅反応においては、プライマーとしてTP及びFPのみを用いた場合には増幅が検出されなかったが（比較例1、組合せ21）、TP及びFPに加えてBP、OF、及びORのいずれか1種以上があれば、増幅反応が生じることを確認した（組合せ1〜20）。また、5種全てのプライマーを使用した場合、非常に速い増幅反応が確認された（組合せ6〜8）。LAMP法による増幅反応においても、SmartAmp法と同様に増幅が検出された（組合せ9）。
表5に示したように、プライマー組合せ1〜20にて60℃において、60分以内で増幅反応が確認された。SmartAmp法による増幅反応においては、プライマーとしてTP及びFPのみを用いた場合には増幅が検出されなかったが（比較例1、組合せ21）、TP及びFPに加えてBP、OF、及びORのいずれか1種以上があれば、増幅反応が生じることを確認した（組合せ1〜20）。また、5種全てのプライマーを使用した場合、非常に速い増幅反応が確認された（組合せ6〜8）。LAMP法による増幅反応においても、SmartAmp法と同様に増幅が検出された（組合せ9）。
＜実施例３：菌体懸濁液を検体とした等温核酸増幅反応＞
S. uberis菌体懸濁液から直接核酸を増幅することが可能であるか、また、その増幅が菌種に特異的なものであるか検討した。
S. uberis菌体懸濁液から直接核酸を増幅することが可能であるか、また、その増幅が菌種に特異的なものであるか検討した。
１）試料
ヒツジ血液寒天培地にて37℃、24時間培養したS. uberis (ATCC 19436)、Streptococcus agalactiae、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus bovis、Enterococcus faecalis、Aerococcus viridans、及びKlebsiella pneumoniaeのコロニーを10 μLの蒸留水に懸濁し、懸濁液1μLを鋳型として増幅反応を実施した。対照として、菌体懸濁液を含まない反応溶液も作成した。
ヒツジ血液寒天培地にて37℃、24時間培養したS. uberis (ATCC 19436)、Streptococcus agalactiae、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus bovis、Enterococcus faecalis、Aerococcus viridans、及びKlebsiella pneumoniaeのコロニーを10 μLの蒸留水に懸濁し、懸濁液1μLを鋳型として増幅反応を実施した。対照として、菌体懸濁液を含まない反応溶液も作成した。
２）反応溶液組成及び反応条件
表5に記載した、組合せ6のプライマーセット（TP(ターンバック部：配列番号21、アニール部：配列番号2)、FP(フォールディング部：配列番号7、アニール部：配列番号3)、BP(配列番号4)、OF(配列番号5)、OR(配列番号6)）を用いて増幅反応を実施した。以下の表6に示す反応溶液25 μL中に、各50 μMに調製したプライマーをTP、FPは1.6 μL、BPは0.8 μL、OF、ORは0.1 μL添加した。
表5に記載した、組合せ6のプライマーセット（TP(ターンバック部：配列番号21、アニール部：配列番号2)、FP(フォールディング部：配列番号7、アニール部：配列番号3)、BP(配列番号4)、OF(配列番号5)、OR(配列番号6)）を用いて増幅反応を実施した。以下の表6に示す反応溶液25 μL中に、各50 μMに調製したプライマーをTP、FPは1.6 μL、BPは0.8 μL、OF、ORは0.1 μL添加した。
３）結果
結果を以下の表７に示す。
結果を以下の表７に示す。
上記プライマーセットにて増幅反応を行い、核酸検出試薬を添加したところ、S. uberis菌体懸濁液を含むサンプルは、増幅反応が生じたことを示す青色を呈した（表7、A）。一方で、増幅反応前の溶液（データ示さず）及び菌体懸濁液を含まない反応溶液（表7、H）においては、色調変化は確認されなかった。以上より、本発明のプライマーセットを用いれば、特別な解析装置や煩雑な菌体前処理を必要とせずに、S. uberisを検出できることが明らかとなった。
また、S. uberis以外の菌体懸濁液を含むサンプルにおいても、色調変化は確認されなかった（表7、B〜G）。以上より、本発明のプライマーセットは、S. uberisの近縁種や、乳汁中に存在する可能性のある他の微生物と交差反応せずに、S. uberisを特異的に検出できることが明らかとなった。
本発明のプライマー及び方法により、乳房炎原因菌の簡便かつ迅速な検出及び同定が可能となり、酪農家の経済的損失を最小化することができる。
Claims (18)
- 等温核酸増幅法によってストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を検出するためのプライマーセットであって、
該セットが、標的配列である、配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列において、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、それぞれの相補的配列をF3配列、F2配列、F1配列、R1c配列、R2c配列、及びR3c配列としたときに、下記の（a）及び（b）のプライマーを含み、かつ、下記の（c）〜（e）のプライマーのいずれか一つ以上を含む、プライマーセット：
（a）プライマーの3’末端側にF2配列を含み、5’末端側にF1c配列を含むプライマー；
（b）プライマーの3’末端側にR2配列を含み、5’末端側にR1c配列、又は相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列、を含むプライマー；
（c）前記標的配列におけるF2c配列の3'末端の塩基から、F1c配列の3'末端の3'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列A又は配列Aに相補的な配列Bを含むプライマー及び／又は前記標的配列におけるR2配列の5'末端の塩基から、R1配列の5'末端の5'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列C又は配列Cに相補的な配列Dを含むプライマー；
（d）F3配列を含むプライマー；
（e）R3配列を含むプライマー。 - 等温核酸増幅法が、LAMP法又はSmartAmp法である、請求項１に記載のプライマーセット。
- （a）のプライマーにおいて、F2配列が、配列番号2若しくは12によって表される塩基配列、又は配列番号2若しくは12によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
- （a）のプライマーにおいて、F1c配列が、配列番号21若しくは22によって表される塩基配列、又は配列番号21若しくは22によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、請求項３に記載のプライマーセット。
- （a）のプライマーにおいて、F2配列が、配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号3、11、13、及び17〜20のいずれかによって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
- （a）のプライマーにおいて、F1c配列が、配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号15、16、及び23〜27のいずれかによって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、請求項５に記載のプライマーセット。
- （b）のプライマーにおいて、R2配列が、配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列、又は配列番号3、11、若しくは13によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- （b）のプライマーにおいて、R1c配列又は折り返し配列が、配列番号7〜10のいずれかによって表される塩基配列、又は配列番号7〜10のいずれかによって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- （c）のプライマーが、配列番号4若しくは14によって表される塩基配列、又は配列番号4若しくは14によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- （d）のプライマーにおいて、F3配列が配列番号5によって表される塩基配列、又は配列番号5によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- （e）のプライマーにおいて、R3配列が配列番号6によって表される塩基配列、又は配列番号6によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 請求項１に記載の（a）〜（e）のプライマーにおいて、F1c配列、F2配列、R1c配列又は折り返し配列、R2配列、配列A、B、C、又はD、F3配列、及びR3配列の組合せが、以下の表の組合せ1〜20のいずれかである、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を検出するためのキット。
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて等温核酸増幅法によりサンプル由来の核酸を増幅する工程、及び増幅産物の量又は存在を測定する工程を含む、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）の検出方法。
- 等温核酸増幅法がLAMP法又はSmartAmp法である、請求項１４に記載の方法。
- 配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列、又はその部分配列からなる核酸の量又は存在を測定する工程を含む、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を特異的に検出する方法。
- 前記核酸を増幅する工程を含む、請求項１６に記載の方法。
- 増幅を等温核酸増幅法により行う、請求項１６又は１７に記載の方法。
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| JP (1) | JP2016189726A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111378772A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-07-07 | 宁夏大学 | 检测乳房链球菌的特异性lamp引物、试剂盒及方法 |
| KR20200120832A (ko) * | 2019-04-12 | 2020-10-22 | 가천대학교 산학협력단 | 폴더블 타입의 등온 증폭 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법 |
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2015
- 2015-03-31 JP JP2015071609A patent/JP2016189726A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200120832A (ko) * | 2019-04-12 | 2020-10-22 | 가천대학교 산학협력단 | 폴더블 타입의 등온 증폭 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법 |
| KR102221289B1 (ko) * | 2019-04-12 | 2021-03-02 | 가천대학교 산학협력단 | 폴더블 타입의 등온 증폭 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법 |
| CN111378772A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-07-07 | 宁夏大学 | 检测乳房链球菌的特异性lamp引物、试剂盒及方法 |
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