CN111378772A

CN111378772A - 检测乳房链球菌的特异性lamp引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111378772A
Application number: CN202010229898.5A
Authority: CN
Inventors: 邓光存; 马臣杰; 吴晓玲; 王雯雯
Original assignee: Ningxia University
Current assignee: Ningxia University
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2020-07-07

Abstract

本发明公开了一种检测乳房链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法。所述试剂盒包括6条环介导等温扩增引物：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LB和LF，6条引物针对乳房链球菌KX389960.1基因的保守序列设计；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。本发明解决了现有的乳房链球菌检测技术周期长、检测成本高、不能应用于现场快速检测等问题。

Description

检测乳房链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，更具体地，涉及检测乳房链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法。

背景技术

乳房链球菌(Streptococcus uberis)是引起奶牛乳腺炎最常见的致病菌之一，可引起牛的临床、亚临床性乳腺炎，造成乳腺组织慢性感染，具有高度传染性，最终导致奶牛产奶量下降甚至停乳。严重制约奶牛养殖业、乳品加工业的发展，并危害公共卫生安全及人类健康。

通常,临床样本中乳房链球菌的检测仍是通过细菌分离、生化试验和CAMP试验等经典方法。但是，由于经典方法有操作繁琐、耗时长、检出率低等缺点，影响对该菌快速准确检测及所致乳房炎的治疗；现有检测乳房链球菌的聚合酶链反应(polymerase chainreaction,PCR)技术有普通PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR等，其中这些方法特异性、灵敏度较高，但需要昂贵的仪器设备、对检测人员技术要求较高而使其不适于基层普及和推广应用。因此，建立一种简便、快速、特异、灵敏、经济可靠的乳房链球菌检测方法对奶牛乳房炎的防控非常重要。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)是由日本学者Notomi等人在2000年建立的一种新型核酸扩增技术，其原理是链置换型聚合酶在合成新链的同时置换出原链，从而为下一轮扩增制备模板，因此扩增不需要变性步骤，在等温条件下即可完成。经过二十年的发展，该技术具备了特异性强、灵敏度高、反应时间短、可视化判读检测结果、便携式操作等优势，在致病菌或疾病的临床快速检测诊断中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明建立的可视化LAMP检测方法不仅灵敏度高，特异性强，而且反应完成后无需开盖，直接裸眼观察反应结果即可。另外，本发明的方法可避免气溶胶污染，快速得到检测结果，操作简便，只需按建立的体系加样在恒温条件下孵育30min即可裸眼判读反应结果。

本发明提供了一种检测乳房链球菌的环介导等温扩增(LAMP)引物，6条引物针对乳房链球菌KX389960.1基因的保守序列设计；包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LB和LF，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

本发明还提供了一种检测乳房链球菌的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，包括：10×thermpol Amplification buffer、8U反应Bst DNA聚合酶、10mM dNTPs、100mM MgSO₄、5M甜菜碱、40uM F3、40uM B3、100uM FIP、100uM BIP、80uM LF、80uM LB以及16mM钙黄绿素荧光试剂；10×thermpol Amplification buffer包括：20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mMKCl、2mM MgSO₄、0.1％Ttiton X-100；

FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

在上述检测乳房链球菌的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒中，包括：2uL(10×)thermpol Amplification buffer、1.0uL 8U/反应Bst DNA聚合酶、2.4uL 10mM dNTPs、1uL100mM MgSO₄、0.8uL 5M甜菜碱、0.08uL 40mM F3、0.08uL 40mM B3、0.32uL 100mM FIP、0.32uL 100mM BIP、0.1uL 80mM LB、0.1uL 80mM LF以及1uL钙黄绿素荧光试剂。

本发明提供了一种检测乳房链球菌的方法，包括：

提取待检测样品基因组DNA；

构建包括以下引物的反应体系：F3和B3、FIP和BIP以及LB和LF，其中，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；

进行扩增反应；

通过荧光染料的颜色变化来确定是否存在乳房链球菌。

本发明具有以下优点：本发明针对乳房链球菌的KX389960.1基因保守序列设计筛选得到特异性LAMP引物组，对乳房链球菌的目标基因进行检测。在所检测非目标菌株中均未出现非特异性扩增，说明该发明具有高特异性；灵敏度比普通PCR高100倍；且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场快速检测，检测成本远低于PCR技术；检测结果可视化，肉眼判定即可(阳性结果为翠绿色，阴性结果为浅橘色)。

另外，常规的LAMP方法，需在反应结束后开盖加入SYBRGreen1荧光染料达到可视化显色(阳性结果为亮绿色，阴性结果为浅橘色)，容易出现假阳性结果。而本发明使用反应体系中加入钙黄绿素作荧光染料，65℃恒温条件下孵育30min即可通过颜色变化来判读反应结果。

本发明解决了现有检测技术所需时间长、工作量大、操作复杂等不足，且有比普通检测方法更特异、灵敏的特点，适用于现场检测，具有较好的应用前景。

附图说明

图1是应用本发明乳房链球菌可视化LAMP检测方法特异性试验结果图。图中：1.阳性质粒(PUC57-KX389960.1)；2.乳房链球菌ATCC700407；3.停乳链球菌ATCC12388；4.无乳链球菌ATCC13813；5.金黄色葡萄球菌CVCC545；6.肺炎链球菌ATCC13883；7.表皮葡萄球菌ATCC12228；8.白色念珠球菌ATCC10231；9.白色念珠菌ACTT90028；10.奇异变形杆菌CVCC1969；11.大肠杆菌ATCC 8739；12.大肠杆菌ETECC83922；13.绿脓假单胞菌ATCC15442；14.伤寒沙门氏菌ATCC14028；15.军团菌ATCC33152；16.宋内志贺菌ATCC 25931；17.乙型溶血性链球CMCC 3221；18.副溶血弧菌CICC 21528；19.沙门氏菌CICC 2150；20.产气荚膜梭菌ATCC13124；21.单细胞增生李斯特菌ATCC 19114；N.阴性对照(去核酸的无菌水)；

图2是应用本发明乳房链球菌可视化LAMP检测方法灵敏度试验(pUC57-KX389960.1阳性质粒为模板)结果图，图中：1-7分别不同浓度乳房链球菌阳性质粒，依次为：5.0×10⁶copies/uL、5.0×10⁵copies/uL、5.0×10⁴copies/uL、5.0×10³copies/uL、5.0×10²copies/uL、5.0×10¹copies/uL、5.0×10⁰copies/uL，N阴性对照(去核酸的无菌水)。

图3是PCR方法检测乳房链球菌灵敏度试验(pUC57-KX389960.1阳性质粒为模板)结果图，图中：1-7分别不同浓度乳房链球菌阳性质粒，依次为：5.0×10⁶copies/uL、5.0×10⁵copies/uL、5.0×10⁴copies/uL、5.0×10³copies/uL、5.0×10²copies/uL、5.0×10¹copies/uL、5.0×10⁰copies/uL，N阴性对照(去核酸的无菌水)。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明提供一种特异性强、灵敏度高、对仪器设备要求低、操作快速简单且成本低的可视化LAMP试剂盒检测乳房链球菌，以满足基层现场快速检测乳房链球菌的需要。

本发明第一个目的在于提供一种乳房链球菌特异性LAMP检测引物组。

本发明第二个目的在于提供一种乳房链球菌可视化LAMP检测试剂盒。

本发明第三个目的在于提供一种乳房链球菌可视化LAMP检测方法。不仅降低检测成本，同时提高检测的准确性。

本发明采用以下技术方案：乳房链球菌可视化LAMP检测试剂盒，包括：10×thermpol Amplification buffer，8U/reaction Bst DNA聚合酶，10mM dNTPs，100mM Mg²⁺，5M甜菜碱，40uM F3，40uM B3，100uM FIP，100uM BIP，80uM LF，80uM LB以及钙黄绿素；10×thermpol Amplification buffer包括：20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mM KCl、2mMMgSO₄、0.1％Ttiton X-100。

本发明的检测乳房链球菌的特异性LAMP引物组包括以下3对引物：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物LB和LF；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

检测乳房链球菌LAMP引物组序列如下：

SEQ.ID.NO.1：AGCGGGCATCGGGATGTCAATTTTAGCGGTGGAGCATGTGGTT

SEQ.ID.NO.2：AGATAGAGCTTTACTTCGGTACATCGGTTTTACATCTCACGACACGAGCTGAC

SEQ.ID.NO.3：GCAAGGTTGAAACTCAAAGGAA

SEQ.ID.NO.4：GATGGCAACTAACAATAGGGGTT

SEQ.ID.NO.5：CAGGTGGTGCATGGTTGTCG

SEQ.ID.NO.6：CCTGGTAAGGTTCTTCGCGTT

检测乳房链球菌的LAMP检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品基因组DNA；

(2)将以下组份进行混合，构建包括3对引物包括F3和B3、FIP和BIP以及LB和LF的20μL LAMP反应体系：

表1：乳房链球菌可视化LAMP最优检测体系

(3)加样进行扩增反应；

(4)将LAMP反应体系在65℃加热30min即可完成扩增；反应于PCR仪或水浴锅或恒温金属浴。

(5)待反应完成后进行结果的判定：

扩增完成，通过观察LAMP反应体系是否有颜色变化来判断是否是乳房链球菌，若LAMP反应体系颜色发生变化(浅橘色变为翠绿色)则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到乳房链球菌；若LAMP反应体系颜色未发生变化(仍为浅橘色)则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到乳房链球菌。

下面结合具体的实例进行说明，以更好地理解本发明。

(1)BLAST分析：从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载乳房链球菌KX389960.1基因序列，对所选的基因序列保守性进行比对分析。

(2)根据乳房链球菌保守基因序列(GenBank号：KX389960.1)，在NCBI上进行BLAST比对分析后，基于KX389960.1基因选取一段高度保守区域，利用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer5(http://primerexplorer.jp/e/index.html/)包括4条特异性引物和2条环引物。引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具体序列见SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6。

(3)实验用菌株

包括1株乳房链球菌(ATCC 700407)；19株其他非目标菌株：停乳链球菌(ATCC12388)；无乳链球菌(ATCC 13813)；金黄色葡萄球菌(CVCC 545)；肺炎链球菌(ATCC13883)；表皮葡萄球菌(ATCC 12228)；白色念珠球菌(ATCC 10231)；白色念珠菌(ACTT90028)；奇异变形杆菌(CVCC 1969)；大肠杆菌(ATCC 8739)；大肠杆菌(ETEC C83922)；绿脓假单胞菌(ATCC 15442)；伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)；军团菌(ATCC 33152)；宋内志贺菌(ATCC 25931)；乙型溶血性链球(CMCC 3221)；副溶血弧菌(CICC 21528)；沙门氏菌(CICC2150)；产气荚膜梭菌(ATCC 13124)；单细胞增生李斯特菌(ATCC 19114)；本发明所用所有ATCC菌株均购自美国菌种保藏中心，CVCC菌株均购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，CMCC菌株均购自中国医学微生物菌种保藏管理中心，CICC菌株均购自中国微生物菌种保藏管理中心。

(4)重组质粒的构建与扩增

根据GenBank中公布的乳房链球菌的KX389960.1基因序列，由上海生工公司进行基因合成，并该将目的基因连接至pUC57载体，质粒命名为pUC57-KX389960.1，并通过双酶切和测序验证构建质粒的准确性。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，于添加100mg/mL Amp抗性的LB固体平板上过夜培养，挑取单克隆，并在添加100mg/mL Amp抗性的LB液体培养基中37℃、180r/min培养，一部分保存于灭菌甘油中，于-80℃保存，其余用于质粒提取。

(5)细菌DNA提取

A.取1.0mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，弃上清液；

B.加入1.0mL去核酸的无菌水，混匀，12000r/min离心5min，弃上清液；

C.加入100uL去核酸的无菌水，混匀，100℃沸水浴10min；

D.12000r/min离心10min，取上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA。

(6)乳房链球菌可视化检测试剂盒配制

表2:乳房链球菌可视化LAMP检测体系

其中，10×thermpol Amplification buffer包括：20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mM KCl、2mM MgSO₄、0.1％Ttiton X-100；

内引物FIP序列为AGCGGGCATCGGGATGTCAATTTTAGCGGTGGAGCATGTGGTT(序列表SEQ.ID.NO.1)

内引物BIP序列为AGATAGAGCTTTACTTCGGTACATCGGTTTTACATCTCACGACACGAGCTGAC(序列表SEQ.ID.NO.2)

外引物F3序列为GCAAGGTTGAAACTCAAAGGAA(序列表SEQ.ID.NO.3)

外引物B3序列为GATGGCAACTAACAATAGGGGTT(序列表SEQ.ID.NO.4)

环引物LB序列为CAGGTGGTGCATGGTTGTCG(序列表SEQ.ID.NO.5)

环引物LF序列为CCTGGTAAGGTTCTTCGCGTT(序列表SEQ.ID.NO.6)

(7)乳房链球菌可视化LAMP反应

按照上述配制含有10×thermpol Amplification buffer 2uL、引物MIX 1uL、MgSO4(100mM)1uL、dNTPs(10mM)2.4uL、甜菜碱(5M)0.8uL、钙黄绿素荧光试剂1uL、Bst2.0DNA聚合酶1uL、模板DNA 1uL、去核酸的无菌水9.8uL，构建20uL反应体系，涡旋混匀、瞬时离心；LAMP反应程序如下：65℃反应30min。根据LAMP反应体系是否有颜色变化来判断是否有乳房链球菌。若LAMP反应体系颜色发生变化(浅橘色变为翠绿色)则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到乳房链球菌；若LAMP反应体系颜色未发生变化(仍为浅橘色)则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到乳房链球菌。

(8)特异性实验

以上述乳房链球菌阳性质粒(PUC57-KX389960.1)、1株乳房链球菌ATCC 700407标准株及其他19株非目标菌株进行特异性试验。采用上述乳房链球菌可视化LAMP试剂盒进行特异性检测，以去核酸的无菌水为阴性对照，按照前述乳房链球菌LAMP反应体系和反应条件进行反应。

结果见图1，可视化结果显示只有乳房链球菌阳性质粒(PUC57-KX389960.1)及乳房链球菌ATCC 700407标准株的基因组DNA检测结果为阳性(呈翠绿色)，其他非目标菌株基因组DNA及阴性对照均为阴性(呈橙黄色)。

(9)灵敏度实验

用质粒提取试剂盒提取乳房链球菌阳性质粒(PUC57-KX389960.1)，Nanodrop8000核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度。根据基因拷贝数计算公式计算初始浓度，并将初始浓度调整为5.0×10⁶copies/uL。然后，用去核酸的无菌水进行10倍倍比梯度稀释得到不同浓度的质粒作为扩增模板进行灵敏度试验，浓度分别为5.0×10⁶copies/uL、5.0×10⁵copies/uL、5.0×10⁴copies/uL、5.0×10³copies/uL、5.0×10²copies/uL、5.0×10¹copies/uL、5.0×10⁰copies/uL。结果见图2。

乳房链球菌可视化LAMP检测方法检出限与PCR方法对比，乳房链球菌PCR反应组成如下：20uL反应体系中2×Ex TaqMix 10uL，上游引物(10uM)0.25uL，下游引物(10uM)0.25uL，模板DNA 1uL，去核酸无菌水8.5uL。扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性20s,65℃退火20s共进行30个循环，最后再经72℃延伸7min。将PCR产物在1％琼脂糖凝电泳中进行电泳，结果见图3。

乳房链球菌LAMP方法的检测限为5.0×10¹copies/uL，常规PCR检测限为5.0×10³copies/uL。LAMP方法灵敏度比普通PCR高100倍。

(10)临床样本的检测

149份牛奶样本采集于宁夏回族自治区银川市周边3家规模化奶牛养殖场。采用上述已建立的可视化LAMP方法和普通PCR方法，分别对所采集的149份牛奶样本进行乳房链球菌核酸检测。如表3所示，结果表明，在149份样本中，可视化LAMP检测方法对乳房链球菌的检出率为18.8％，而普通PCR方法对乳房链球菌的检出率仅为2.7％。

表3：LAMP方法和PCR方法检测实际样品结果

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

序列表

<110> 宁夏大学

<120> 检测乳房链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法

<130> HP191212LZ

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcgggcatc gggatgtcaa ttttagcggt ggagcatgtg gtt 43

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agatagagct ttacttcggt acatcggttt tacatctcac gacacgagct gac 53

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcaaggttga aactcaaagg aa 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatggcaact aacaataggg gtt 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caggtggtgc atggttgtcg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctggtaagg ttcttcgcgt t 21

Claims

1.一种检测乳房链球菌的环介导等温扩增(LAMP)引物，其特征在于，6条引物针对乳房链球菌KX389960.1基因的保守序列设计；包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LB和LF，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

2.一种检测乳房链球菌的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，其特征在于，包括：10×thermpol Amplification buffer、8U反应Bst DNA聚合酶、10mM dNTPs、100mM MgSO₄、5M甜菜碱、40uM F3、40uM B3、100uM FIP、100uM BIP、80uM LF、80uM LB以及16mM钙黄绿素荧光试剂；10×thermpol Amplification buffer包括：20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mMKCl、2mM MgSO₄、0.1％Ttiton X-100；

3.根据权利要求2所述的检测乳房链球菌的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，其特征在于，包括：2uL(10×)thermpolAmplification buffer、1.0uL 8U/反应Bst DNA聚合酶、2.4uL 10mM dNTPs、1uL 100mM MgSO₄、0.8uL 5M甜菜碱、0.08uL 40mM F3、0.08uL 40mMB3、0.32uL 100mM FIP、0.32uL 100mM BIP、0.1uL 80mM LB、0.1uL 80mM LF以及1uL钙黄绿素荧光试剂。

4.一种检测乳房链球菌的方法，包括：

提取待检测样品基因组DNA；

进行扩增反应；

通过荧光染料的颜色变化来确定是否存在乳房链球菌。